Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia kwasu 6-aminopenicylanowego przez enzyma¬ tyczna hydrolize pod wplywem acylazy penicyli¬ nowej. Kwas 6-aminopenicylanowy jest cennym pólproduktem do otrzymywania nowych penicylin pólsyntetycznych.Znany sposób otrzymywania kwasu 6-aminopeni¬ cylanowego na drodze bezposredniej fermentacji Penicillium chrisogenum, bez prekursorów, jest skomplikowany i malo wydajny.W dotychczas stosowanych metodach enzymatycz¬ nych uzywa sie komórki odpowiednich mikroorga¬ nizmów wytwarzajacych acylaze penicylinowa. Po¬ niewaz komórki te moga byc uzyte tylko jednora¬ zowo i to w stosunkowo wysokim stezeniu nie¬ zbednym dla skrócenia czasu hydrolizy, trzeba ciagle przygotowywac nowe ich porcje. Ekstrakcja produktu hydrolizy, to znaczy kwasu 6-AP, z mie¬ szaniny reakcyjnej jest skomplikowanym proble¬ mem. Otrzymuje sie przy tym kwas wymagajacy powtórnej krystalizacji i czesto zawierajacy sub¬ stancje bialkowe, które o ile nie zostana usuniete, na przyklad przez enzymatyczny rozklad przy u- zyciu enzymów proteolitycznych, wywoluja odczy¬ ny alergiczne po podaniu otrzymanych z niego pe¬ nicylin. Podraza to oczywiscie produkcje i kompli¬ kuje technologie wytwarzania.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze enzym, acylaza penicylinowa, osadzona na nosniku o strukturze wlóknistej, zachowuje swoja aktywnosc w ciagu -10 dlugiego okresu uzywania. W czasie prób utrzymy¬ wala ona prawie nie zmniejszona aktywnosc w ciagu 12 miesiecy uzywania.Przedluzona aktywnosc katalizatora enzymatycz¬ nego pozwala uproscic proces oraz obnizyc koszty.Sposób wedlug wynalazku z zastosowaniem en¬ zymu osadzonego na nosniku o strukturze wlókni¬ stej, przynosi wyrazne korzysci polegajace na znacznym polepszeniu jakosci produktu, uproszcze¬ niu operacji technologicznych i obnizeniu kosztów produkcji.Sposób enzymatycznego wytwarzania kwasu 6- -aminopenicylanowego o wzorze 2 polega wedlug wynalazku na tym, ze naturalna penicyline o wzo¬ rze ogólnym 1, w którym R oznacza grupe alkilo¬ wa o 1—10 atomach wegla, grupe alkenylowa o 3—10 atomach wegla, grupe aralkilowa, grupe R'-OCH2- lub grupe R'-SCH2-, w których R' oznacza grupe alkilowa, alkenylowa, fenylowa ewentualnie jednopodstawiona atomem chlorowca, grupa nitrowa, alkilowa, alkenylowa lub alkoksy- lowa, w roztworze wodnym o stezeniu 1^-6% //wa¬ ga/objetosc/ poddaje sie enzymatycznej hydrolizie pod wplywem acylazy penicylinowej osadzonej na polimerycznym nosniku o strukturze wlóknistej, przy wartosci pH okolo 8, w temperaturze do 60°C, korzystnie 37—40°C, i otrzymany produkt hydro¬ lizy wydziela sie. Korzystne jest stosowanie roz¬ tworu soli odpowiedniej penicyliny.Okreslenie penicylina naturalna oznacza penicy- 98 6323 line wytwarzana podczas fermentacji przez Peni- cillium chrisogenum w obecnosci odpowiednich pre¬ kursorów.Enzym, acylaze penicylinowa, mozna otrzymy¬ wac z róznych zródel.W sposobie wedlug wynalazku korzystne jest stosowanie acylazy penicylinowej pochodzacej z ko¬ mórek bakterii Escherichia Coli, zwlaszcza szczepu E. Coli ATCC nr 9637.Nierozpuszczalny katalizator enzymatyczny otrzy¬ muje sie w sposób opisany w patencie wloskim nr 836 462. Wedlug tego patentu wlóknisty nosnik z osadzonym enzymem otrzymuje sie z roztworu polimeru zdolnego do wytwarzania struktury wlók¬ nistej, w którym zdyspergowany jest preparat en¬ zymatyczny. Z uzyskanej w taki sposób emulsji mozna na mokro hub sucho otrzymac wlókna po¬ siadajace wewnatrz bardzo male pory, w^ których osadzony jest enzym osloniety bardzo cienka mem¬ brana zapobiegajaca przechodzeniu enzymu do sro¬ dowiska reakcji ale z drugiej strony pozwalajaca na oddzialywanie katalityczne.Do polimerów na których mozna osadzac enzym naleza miedzy innymi polimery estrów i azotanów celulozy, poliolefiny, polimery i kopolimery otrzy¬ mywane z akrylonitrylu, akrylanów, metakrylanów, estrów winylowych, chlorku winylu, chlorku wi- nylidenu, styrenu oraz poliamidy, butyral poliwi- nylu i podobne.Nosnik z osadzonym enzymem, po zakonczeniu procesu koagulacji i nadaniu struktury wlóknistej, przemywany jest w celu usuniecia zaabsorbowa¬ nych zanieczyszczen bialkowych, które moglyby przedostac sie do srodowiska. Tak przygotowany katalizator moze byc uzywany do katalizowania reakcji. Otrzymuje sie w ten sposób produkt o wysokiej czystosci pozbawiony calkowicie zanie¬ czyszczen bialkowych stwarzajacych niebezpieczen¬ stwo wywolywania odczynów alergicznych. Kata¬ lizator enzymatyczny moze byc uzywany w spo¬ sób periodyczny, wtedy po hydrolizie penicyliny mieszanine reakcyjna usuwa sie i zastepuje swie¬ za porcja.Ten sam katalizator enzymatyczny mozna wy¬ korzystywac w procesie ciaglym stosujac kolumne.W procesach ciaglych dla unikniecia trudnosci z utrzymywaniem stalego pH na róznych poziomach kolumny stosuje sie buforowany roztwór penicyli¬ ny. Buforowany roztwór penicyliny przepuszcza sie przez kolumne wypelniona katalizatorem enzy¬ matycznym. Utrzymuje sie przy tym wartosc pH= =8 dodajac w sposób automatyczny roztwór zasa¬ dy. Zachowujac odpowiednia szybkosc przeplywu i stosujac odpowiednia ilosc katalizatora otrzymu¬ je sie po wyjsciu z kolumny mieszanine o wyso¬ kim stopniu hydrolizy.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku nie ograniczajac jednak zakresu jego stosowania.. Przyklad I. '20 g trójoctanu celulozy /Fluka/ rozpuszczono podczas mieszania w 280 ml chlorku metylenu /C. Erba/. Osobno przygotowano roztwór enzymu dodajac 60 g /wilgotny produkt/ komórek otrzymanych z fermentacji E. Coli na odpowiedniej pozywce w obecnosci kwasu fenylooctowego, do 632 4 0,01 molarnego buforu fosforanowego o pH 7,0.Otrzymany material ogrzewano w ciagu 3 minut w temperaturze 50°C a nastepnie stracano siar¬ czanem amonu przy pH 5,5 zbierajac frakcje wy- tracajaca sie przy 25—75% nasycenia. Frakcje te rozpuszczono w 0,01 m buforze fosforanowym o pH 8,0 zawierajacym 30% objetosciowych glicery¬ ny. Otrzymany roztwór enzymu dodano do roztwo¬ ru trójoctanu celulozy i emulgowano mieszajac energicznie w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C a nastepnie otrzymana emulsje wlano do malego pojemnika i w temperaturze —6°C cisnieniem azo¬ tu wyciskano wlókna, które koagulowano w . to¬ luenie, w temperaturze pokojowej. Otrzymane wlókna suszono w ciagu jednej godziny pod zmniej¬ szonym cisnieniem celem usuniecia toluenu. 37 g otrzymanego katalizatora umieszczono w kolumnie szklanej o wymiarach 70X3 cm, zaopa¬ trzonej w plaszcz termostatyczny i przemywano woda oraz gliceryna do zaniku protein. Wtedy przepuszczano w zamknietym obiegu 600 ml 2% roztworu wodnego soli potasowej penicyliny G /Sauibb/, utrzymujac pH 8 przy pomocy ciaglego dodawania 0,5n roztworu NaOH. Kolumne termo- statowano w temperaturze 37°C. Po pieciu godzi¬ nach gdy zuzycie NaOH spadlo do 1/20 zuzycia po¬ czatkowego, mieszanine reakcyjna oziebiono do 3°C, zakwaszono do pH 3,0 przy pomocy 33,5 ml 2n kwasu solnego i ekstrahowano 2X200 ml octa- nu butylu. W pierwszym ekstrakcie zawartosc pe¬ nicyliny, oznaczana metoda hydroksylaminowa, wynosila 298 mg zas w drugim/2 mg. W stosunku do 12 g uzytej penicyliny wydajnosc konwersji na kwas 6-AP wyniosla wiec 97%. W produkcie nie stwierdzono chromatograficznie produktów rozkla¬ du.Warstwe wodna o objetosci 800 ml, wolna od resztek penicyliny i kwasu fenylooctowego, zalka- lizowano do pH 7,0 przy pomocy 33 ml 2n NaOH 40 i nastepnie zatezono pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze 37°C, do objetosci 110 ml. Zate- zony roztwór kwasu 6-AP oziebiono do tempera¬ tury 0°C i pH doprowadzono do 4,2 przy pomocy 3n kwasu solnego. Wytracony kwas odsaczono i 45 wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem, w tempe¬ raturze 45°C, do stalej wagi, otrzymujac 6,6 g pro¬ duktu. W lugach macierzystych /130 ml/ pozosta¬ lo jeszcze 0,4% kwasu 6-AP. Czystosc krystalicz¬ nego produktu, oznaczana metoda hydroksylami- 5o nowa, wynosila 97,5%. Widmo w podczerwieni, badania chromatograficzne oraz badanie skrecal- nosci wykazaly, iz jest to praktycznie czysty pro¬ dukt.Postepujac w identyczny sposób wykonano w cia- 55 gu 6 miesiecy 100 preparatyk kwasu 6-AP, wyko¬ rzystujac ciagle ten sam katalizator enzymatycz¬ ny i nie stwierdzajac widocznego zmniejszenia je¬ go aktywnosci.Przyklad II. Powtarzajac postepowanie z M przykladu I przygotowano katalizator enzymatycz¬ ny z komórek E. Coli oczyszczajac go jednak 15- -krotnie w porównaniu z katalizatorem z poprzed¬ niego przykladu, doprowadzilo to do 10-krotnego zwiekszenia aktywnosci. W kolumnie o wymiarach 65 jak w przykladzie I /objetosc 480 ml/ umieszczo-98 632 no 37 g katalizatora enzymatycznego, który prze¬ mywano woda i gliceryna do zaniku protein. W zbiorniku o pojemnosci 5 1 przygotowano 3 litry 2% roztworu wodnego soli potasowej penicyliny G. Stosujac pompe perystaltyczna roztwór penicy¬ liny przepuszczono przez kolumne z szybkoscia 500 ml/min mieszajac jednoczesnie energicznie roz¬ twór w zbiorniku celem zabezpieczenia jednorod¬ nosci podczas hydrolizy. Wartosc pH wynoszaca stale 8,0 utrzymywano przy pomocy pH-statu do¬ dajac 0,5N wodny roztwór Na OH. Kolumne ter¬ mostatowano w temperaturze 37°C. Rejestracja zuzycia roztworu NaOH pozwalala na sledzenie kinetyki hydrolizy.Po 2 godzinach i 10 minutach zuzycie NaOH spadlo do 5°/o poczatkowego, hydrolize wtedy za¬ konczono. Zuzycie 0,5N roztworu wynioslo 310 ml.Otrzymano do dalszego przerobu 3 300 ml wodnego roztworu zawierajacego kwas 6-AP, resztke peni- cyMny oraz powstaly podczas hydrolizy kwas fe¬ nylooctowy. Roztwór ten umieszczono w szescio- litrowym zbiorniku zaopatrzonym w mieszadlo, o- chlodzono do temperatury 5°C, zakwaszono IN kwasem solnym do pH 3 a nastepnie dodano 1 100 nil octanu butylu i mieszano w ciagu 15 minut dodajac IN kwasu solnego by utrzymac niezmie¬ niona wartosc pH. Mieszanine pozostawiono w cia¬ gu 20 minut w temperaturze 5°C do dekantacji.Otrzymano trzy warstwy: wodna, organiczna i emulsje octanu w wodzie. Po rozdzieleniu faz w rozdzielaczu emulsje rozdzielono przez odwirowa¬ nie. Polaczone warstwy wodne ekstrahowano po¬ wtórnie 1 100 ml octanu butylu. Lacznie podczas obu ekstrakcji zuzyto 180 ml IN kwasu solnego.Pierwszy ekstrakt octanowy zawieral, wedlug o- znaczenia hydroksylaminowego, 3 mM/litr penicy¬ liny, w drugim zas ekstrakcie nie stwierdzono o- oecnosci penicyliny.Warstwe wodna zalkalizowano do pH 6,9 przy pomocy 165 ml IN roztworu NaOH a nastepnie za- tezono pod zmniejszonym cisnieniem do 1/8 ob¬ jetosci zachowujac nastepujace warunki: tempe¬ ratura lazni 45°C, temperatura czynnika chlodza¬ cego —5°C, cisnienie 1 mm Hg, czas zatezenia — godzin.Pozostalosc ochlodzono do temperatury 2°C i pH doprowadzono przy pomocy 6N kwasu solnego do 4,2. Wypadl wtedy krystaliczny osad kwasu 6-AP, który po odsaczeniu suszono pod zmniejszonym cisnieniem /0,5 mm Hg, 45°C/ do stalej wagi. O- trzymano 32,4 g kwasu 6-AP. Lugi pokrystaliza- cyjne /450 ml/ zawieraly, wedlug oznaczenia hy¬ droksylaminowego, 180 nM/litr kwasu 6-AP, co stanowi 0,39% wagowych. Krystaliczny kwas 6-AP, oznaczony metoda hydroksylaminowa, wykazywal wobec standartu czystego produktu, czystosc wy¬ noszaca 98,5. Tak wiec z 161 mM penicyliny otrzy¬ mano 32,4X0,985 216 - = 147 mM kwasu 6-AP.Zakladajac wysoka czystosc surowca wyjsciowe¬ go uzyskano 91,4% wydajnosci kwasu 6-AP. Pod¬ czas nastepnych prób hydrolizy stosowano lugi z poprzednich krystalizacji zwiekszajac w ten spo¬ sób wydajnosc do 95%.Przyklad III. Powtarzajac postepowanie z przykladu I przygotowano nierozpuszczalny katali- zator enzymatyczny ze 100 g grzybni /waga wil¬ gotna/ z fermentacji Penicillium chrysogenum. 30 g katalizatora umieszczono w kolumnie o wymiarach 70X3 cm, termostatowanej w temperaturze 37°C.Przepuszczano 600 ml wodnego roztworu soli pota- sowej penicyliny V, utrzymujac pH 8,0. Po 5—7 godzinach uzyskiwano okolo 90% hydrolizy wyjs¬ ciowej penicyliny V. Wykonano szereg kolejnych hydroliz nie obserwujac dostrzegalnego zmniejsze¬ nia sie aktywnosci enzymatycznej.Przyklad IV. 16 g etylocelulozy /typ N-200, produkcji firmy Hercules/ rozpuszczono -w 184 g toluenu. Osobno przygotowano roztwór enzymu mieszajac 60 g /waga wilgotnego materialu/ ko¬ mórek otrzymanych z fermentacji E. Coli, które PO odsaczeniu, rozpuszczeniu i straceniu siarczanem amonu rozpuszczono w 30 ml gliceryny. Otrzyma¬ ny roztwór dodano do roztworu polimeru i emul¬ gowano mieszajac energicznie w temperaturze 0°C w ciagu 30 minut a otrzymana emulsje wlano do malego zbiornika i w temperaturze* —6°C pod cisnieniem azotu wyciskano wlókna, które koagu- lowano w eterze naftowym w temperaturze 20°C.Stosujac 30 g katalizatora enzymatycznego i po¬ stepujac podobnie jak w przykladzie I otrzymywa- no po 5 godzinach hydrolizy zawsze prawie taka sama, wynoszaca 5,15 g, ilosc kwasu 6-AP.Przyklad V. Powtarzajac postepowanie z przykladu IV przygotowano nierozpuszczalny ka¬ ta1izator enzymatyczny stosujac polimetyloglutami- nian /typ PLG-30, produkcji firmy Kjowa Hakko Kogyo Co. Ltd./. Koagulacje prowadzono w tolue¬ nie w temperaturze pokojowej. Stosujac 30 g tak przygotowanego katalizatora enzymatycznego otrzy¬ mano okolo 6 g kwasu 6-AP po 5 godzinach hy- 40 drolizy. PL