Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszcza¬ nia dimerycznych alkaloidów indolu, takich jak winblastyna, des-N-metylowinblastyna i winkry- styna.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych 5 Ameryki nr 3097137 przedstawiono sposób oddzie¬ lania winblastyny {winkaleukoblastyny lub VLB) przez ekstrakcje lisci rosliny Vinca etanolem i kwasem octowym, odparowanie rozpuszczalników, ekstrakcje pozostalosci kwasem siarkowym, po- 10 laczenie ekstraktów kwasowych przy doprowadze¬ niu pH do wartosci 4, ekstrakcje benzenem, zo¬ bojetnianie warstwy kwasowej i ponowne pod¬ danie ekstrakcji benzenem, polaczenie ekstraktów benzenowych, przemycie ich 2% wodnym roztwo- 15 rem wodorotlenku sodu a nastepnie woda oraz rozdzielenie otrzymanego, surowego produktu na drodze chromatografii.Sposób oddzielania winkrystyny (leurokrystyny) od innych dimerycznych alkaloidów opisano w 20 opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 3 205 220. Polega on na tym, ze w kolej¬ nych etapach liscie rosliny Vinca odtluszcza sie, zakwaszone liscie poddaje sie ekstrakcji benze¬ nem, benzenowy ekstrakt ponownie poddaje sie 25 ekstrakcji kwasem winowym, sole kwasu wino¬ wego rozpuszcza sie w metanolu, powtórnie pro¬ wadzi sie ekstrakcje kwasem winowym, alkaloidy w postaci soli winianowych poddaje sie ekstrakcji chlorkiem etylenu, kwasny roztwór przeprowadza 30 sie w roztwór o odczynie alkalicznym, po czym dimeryczne alkaloidy poddaje sie ekstrakcji chlorkiem etylenu i frakcje zawierajaca dimerycz¬ ne alkaloidy rozdziela sie na drodze chromato¬ grafii.Sposobem przedstawionym w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 225 030, win- blastyne i towarzyszaca jej leurozyne otrzymuje sie przez zwilzenie lisci rosliny Vinca kwasem wi¬ nowym, które nastepnie poddaje sie ekstrakcji or¬ ganicznym rozpuszczalnikiem, warstwe organiczna oddziela sie i poddaje ekstrakcji kwasem wino¬ wym, warstwe kwasowa po oddzieleniu poddaje sie ekstrakcji organicznym rozpuszczalnikiem, warstwe kwasowa doprowadza sie do odczynu alkalicznego, po czym alkaloidy w postaci wolnych zasad ekstrahuje sie organicznym rozpuszczalni¬ kiem a frakcje zasadowa poddaje sie chromato¬ grafii.Sposób oczyszczania, wykazujacych dzialanie przeciwnowotworowe trzech podstawowych alka¬ loidów wystepujacych w lisciach rosliny Vinca rosea takich jak winblastyna, winkrystyna i leu- rozyna przedstawiono w opisie patentowym RFN DOS nr 2124023 a takze w polskim nr 81722.Liscie rosliny Vinca ekstrahuje sie wodnym roz¬ tworem metanolu. Roztwór ten nastepnie zakwa¬ sza sie w celu wytracenia niepozadanych zwiaz¬ ków. Wyekstrahowane w ten sposób dimeryczne alkaloidy przeprowadza sie w sole addycyjne z 95 57095 570 3 kwasami, korzystnie w sole siarczanowe. Ekstrakt kwasowy poddaje sie nastepnie ekstrakcji benze¬ nem i odrzuca ekstrakty benzenowe. Warstwe kwasowa alkalizuje sie i ekstrahuje alkaloidy benzenem. Ekstrakt benzenowy odparowuje sie do 5 sucha, a pozostale alkaloidy przeprowadza po¬ wtórnie w odpowiednie sole siarczanowe dodajac %-owego kwasu siarkowego. Otrzymana mie¬ szanine krystaliczna siarczanów — trzech dimery- cznych alkoidów, rozdziela sie na drodze chroma- 10 tografii przy uzyciu chlorku metylenu i chlorofor¬ mu jako rozpuszczalników wymywajacych. Ewen¬ tualnie, wodorotlenki alkaloidów rozdziela sie spo¬ sobem chromatograficznym, bez uprzedniego prze¬ prowadzenia ich w sole siarczanowe. 15 Z wegierskiego opisu patentowego nr 154 715 zdany jest'sposób, w którym na liscie Vinca dzia¬ la sie wodorotlenkiem amonu a nastepnie tolue¬ nem. Ekstrakt toluenowy miesza sie z kwasem solnym a™ pozostala mieszanine alkaloidów eks- 20 trahuje sie chlorkiem etylenu, przy czym utrzy¬ muje sia wartosc pH = 9. Nastepnie frakcje al¬ kaloidu rozdziela sie sposobem chromatograficz¬ nym na obojetnym tlenku glinu. Frakcje zawie¬ rajace winblastyne i leurozyne eluuje sie mie- 25 szanina benzenu z eterem. Sposobem tym od¬ dziela sie tylko winblastyne i leurozyne.Celem wynalazku jest opracowanie nowego spo¬ sobu oczyszczania winkrystyny, des-N-metylowin- blastyny i winblastyny otrzymanych z lisci rosli- 30 ny Vinca rosea z wieksza wydajnoscia i selektyw¬ noscia, o wyzszym stopniu czystosci oraz przy stosowaniu mniej skomplikowanych procesów, w porównaniu ze znanymi sposobami.Sposób oczyszczania dimerycznych alkoloidów 35 indolu wedlug wynalazku polega na ekstrakcji lisci rosliny Vinca rosea lub innego naturalnego zródla dimerycznych alkaloidów wodnym roztwo¬ rem kwasu o wartosci pH = 3, ekstrakcji wod¬ nego ekstraktu rozpuszczalnikiem niemieszajacym *° sie z woda, doprowadzeniu pH wodnego ekstrak¬ tu do wartosci 6, ekstrakcji kwasowej warstwy wodnej rozpuszczalnikiem niemieszajacym sie z woda, odrzuceniu warstwy kwasowej i odparowa¬ niu rozpuszczalnika otrzymujac jako pozostalosc ^ alkaloidy.Ewentualnie alkaloidy oczyszcza sie sposobem chromatograficznym na zelu przy uzyciu roztwo¬ ru buforowego cytrynianu o wartosci pH = 7, a nastepnie dimeryczne alkaloidy ekstrahuje sie z wodnego roztworu cytrynianu niemieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem, przy czym otrzy¬ muje sie wodorotlenki alkaloidów. Bez wzgledu na to czy etap ten stosuje sie, kolejnym etapem oczyszczania przeprowadzonym sposobem wedlug wynalazku, jest wytracenie z roztworu etanolu lub innego odpowiedniego rozpuszczalnika pozo¬ stalych dimerycznych alkaloidów w postaci soli siarczanowych, a nastepnie oczyszczenie dimerycz¬ nych alkaloidów w postaci wolnych wodorotlen¬ ków lub soli siarczanowych sposobem chromato¬ graficznym, korzystnie wysokocisnieniowym.W sposobie wedlug wynalazku liscie roslin za¬ wierajacych surowe alkaloidy vinca, np. Catha- 65 50 55 GO routhus roseus (Vinca rosea), ekstrahuje sie przy utrzymywaniu wartosci pH = 3 za pomoca roztwo¬ ru kwasu siarkowego. Do ekstrakcji kwasowej warstwy wodnej uzywa sie niemieszajacy sie z woda rozpuszczalnik, zwykle benzen, chociaz moz¬ na równiez stosowac inne niemieszajace sie z woda rozpuszczalniki organiczne na przyklad toluen i podobne. Po doprowadzeniu pH kwasowego eks¬ traktu wodnego do wartosci okolo 6, za pomoca wodorotlenku sodu, wodorotlenku amonu lub in¬ nego wodorotlenku, dimeryczne alkaloidy eks¬ trahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym. Jako rozpuszczalnik do powtórnej ekstrakcji stosuje sie benzen, chociaz moga byc stosowane równiez inne rozpuszczalniki niemieszajace sie z woda.Etap oczyszczania sposobem chromatograficznym na zelu przeprowadza sie przy uzyciu usieciowa- nego zelu dekstranu (sephadex G-257) w roztwo¬ rze buforowym cytrynianu. Faza ruchoma jest 0,1 molowy roztwór buforowy cytrynianu amonu o wartosci pH = 3. Ewentualnie do. oczyszczania sposobem chromatograficznym na zelu mozna za¬ miast cytrynianu amonu stosowac inne ogólnie znane uklady roztworów buforowych o wartosci pH = 3. Przy oczyszczaniu sposobem chromatogra¬ ficznym na zelu stosuje sie cisnienie okolo 1,03 at.Przy stosowaniu tego sposobu pierwsza eluuje sie frakcja dimerycznego alkaloidu zawierajaca win- krystyne, winblastyne, des-N-metylowinblastyne, leurozyne i winrozydyne. Dimeryczne alkaloidy ekstrahuje sie z roztworu buforowego o war¬ tosci pH = 3, przez doprowadzenie pH roztworu wodnego do wartosci pH = 7, za pomoca wodoro¬ tlenku amonu i nastepnie zmieszanie wodnego roztworu o wartosci pH = 7 z rozpuszczalnikiem niemieszajacym sie z woda, korzystnie benzenem.Otrzymana po odparowaniu benzenu pozostalosc rozpuszcza sie w etanolu z którego latwo krystali¬ zuje leurozyna. Leurozyne oddziela sie przez de- kantacje, a pH otrzymanego w ten sposób klarow¬ nego roztworu doprowadza sie do wartosci 4,2 za pomoca roztworu etanolowego Z%-owego kwasu siarkowego, przy czym przeprowadza sie pozostale dimeryczne alkaloidy w sole siarczanowe. Wytra¬ cone mieszane sole siarczanowe zbiera sie i prze¬ prowadza w odpowiednie wolne wodorotlenki al¬ kaloidów zwyklymi metodami, np. przez rozpusz¬ czenie soli w wodzie, doprowadzenie pH roztworu za pomoca wodorotlenku amonu do wartosci w przyblizeniu 8 i ekstrakcje dimerycznych alkaloi¬ dów niemieszajacym sie z woda organicznym roz¬ puszczalnikiem, korzystnie chlorkiem metylenu.Po odparowaniu chlorku metylenu otrzymuje sie mieszanine dimerycznych alkaloidów, która rozdziela sie metoda chromatografii wysokocisnie¬ niowej na tlenku glinu o stopniu aktywnosci III uzywajac jako eluenta uklad rozpuszczalników octan metylu-chlorek metylenu-woda w stosunku 48:51:1.Przy przeprowadzaniu tej operacji stosuje sie cisnienia w granicach od 10,5 do 24,5 at. Opiera¬ jac sie na opisanych w literaturze fachowej da¬ nych chromatografie wysokocisnieniowa przepro-5 95 570 6 wadza sie pod cisnieniem od 281,2 do 351,4 at, a takze pod cisnieniem od 527,7 do 562,2 at.Oddzielenie alkaloidów jest bardziej efektyw¬ ne przy uzyciu wyzszych cisnien. Sposób oddzie¬ lenia metoda chromatografii wysokocisnieniowej przeprowadza sie w stalowej aparaturze zlozonej z odpornych na cisnienie urzadzen.Z kolumny chromatograficznej eluuje sie kolej¬ no alkaloidy, takie jak leurozyne, winblastyne, des-N-metylowinblastyne, winkrystyne i winrozy- dyne. Identyfikacje dimerycznych alkaloidów znaj¬ dujacych sie w eluowanych frakcjach przepros wadza sie ogólnie znanymi metodami np. za po¬ moca chromatografii cienkowarstwowej. Frakcje zawierajace winblastyne, des-N-metylowinblastyne lub winkrystyne zbiera sie, odparowuje rozpusz¬ czalniki pod zmniejszonym cisnieniem do sucha i przeprowadza powyzsze alkaloidy w odpowied¬ nie sole siarczanowe przy pH o wartosci 4,2 do¬ dajac etanolowy roztwór kwasu siarkowego, co konczy proces oddzielenia i oczyszczenia.Ponizsze przyklady ilustruja sposoby oczyszcza¬ nia i oddzielania alkaloidów wedlug niniejszego wynalazku.Przyklad I. Oczyszczenie winkrystyny. Dzie¬ siec kilogramów suchych lisci Catharanthus roseus ekstrahuje sie trzykrotnie, co godzine, 32 czesciami objetosciowymi wody o temperaturze 50°C zakwa¬ szonej do wartosci pH = 3,0 przez dodanie 30% (wagowo/objetosci) kwasu siarkowego bedacego czynnikiem ekstrahujacym. Ekstrakty wodne zlewa sie znad wlóknistego materialu, laczy sie i prze¬ sacza. Przesacz dwukrotnie ekstrahuje sie równymi objetosciami benzenu i usuwa ekstrakty benze¬ nowe. pH przesaczu doprowadza sie do wartosci 6 przez dodanie stezonego wodorotlenku amonu.Warstwe wodna o pH = 6,0 ekstrahuje sie trzy¬ krotnie równymi objetosciami benzenu. Ekstrakty benzenowe laczy sie i zateza pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac pozostalosc o wadze 57 g bedaca surowa mieszanina alkaloidu (VRA). 5 g otrzymanego w ten sposób VRA rozpuszcza sie w 250 ml 0,1 molowego roztworu buforowego cytry¬ nianu amonu o pH = 3 i otrzymany przesacz roz¬ dziela sie sposobem chromatograficznym na 600 g usieciowanego zelu dekstranu (sephadex G-25F) umieszczonego w szklanej kolumnie o wymiarach 5X140 cm. Jako faze ruchoma stosuje sie 0,1 mo¬ lowy roztwór cytrynianu amonu o wartosci pH = = 3. Kolumne rozwija sie przy cisnieniu wyno¬ szacym w górnej czesci 1,05 at dajacym szybkosc wyplywu eluatu w granicach od 10 do 14 milili- trów na minute. Frakcje zbiera sie a nastepnie oznacza za pomoca chromatografii cienkowarstwo¬ wej, monomery lub dimery alkaloidów.Frakcje zawierajace dimeryczne alkaloidy wy¬ mywane sa najpierw i zawieraja winblastyne, winkrystyne, leurozyne i winrozydyne, co stwier¬ dza sie za pomoca chromatografii cienkowarstwo¬ wej. Frakcje roztworów wodnych zawierajace glównie dimeryczne alkaloidy laczy sie, doprowa¬ dza pH do wartosci 7,0 za pomoca wodorotlenku amonowego, i otrzymany obojetny roztwór wodny ekstrahuje sie trzykrotnie póltorakrotna w stosun¬ ku do jego objetosci objetoscia benzenu.Polaczone ekstrakty benzenowe laczy sie i sa¬ czy przez bezwodny siarczan sodowy. Przesacz zateza sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac 1,0 g mieszaniny dimerycznych alka¬ loidów. Mieszanine rozpuszcza sie w 7,5 czesciach objetosciowych bezwodnego etanolu. Leurozyne krystalizuje sie i oddziela przez odwirowanie otrzy¬ mujac 157 mg leurozyny. Pozostaly roztwór do¬ prowadza sie do wartosci pH = 4,2 przez dodanie etanolowego roztworu 3%-owego kwasu siarko¬ wego w wyniku czego tworza sie natychmiast w postaci igiel siarczany pozostalych dimerycznych alkaloidów.Krystalizacje prowadzi sie w ciagu dwóch dni.Krysztaly oddziela sie przez odwirowanie, prze¬ mywa etanolem i suszy. Orzymuje sie 241 mg mieszaniny siarczanów winblastyny i winkrystyny wraz z mala iloscia siarczanu leurozyny. Sole prze¬ prowadza sie w odpowiednie wolne zasady przez rozpuszczenie soli w wodzie, doprowadzenie pH wodnego roztworu do wartosci 8 przez dodanie 14 N wodorotlenku amonowego i nastepnie eks¬ trakcje nierozpuszczalnych w wodzie zasad chlor¬ kiem metylenu. Ekstrakt chlorku metylenowego saczy sie i usuwa rozpuszczalnik przez odparowa¬ nie pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana po¬ zostalosc rozdziela sie sposobem chromatograficz¬ nym na 400 g tlenku glinowego o stopniu aktyw¬ nosci III i powierzchni 200 m2/g uzywajac jako eluenta uklad rozpuszczalników octan metylu-chlo- rek metylenu- woda w stosunku 48 :51 :1.Rozdzielanie chromatograficzne prowadzi sie w stalowej kolumnie 8 mm o dlugosci 7 m, pod cis¬ nieniem od 17,6 do 22,8 at. Stosunek tlenku glinu do wprowadzonego materialu wynosi w przyblize¬ niu 2000 :1. Eluat analizuje sie na aparacie 254 mu i poszczególne frakcje rozdziela sie opierajac sie na wykresie wierna w nadfiolecie. Za pomoca chromatografii cienkowarstwowej identyfikuje sie frakcje zawierajace przewazajaca ilosc leurozyny, winblastyny, des-N-metylowinblastyny i winkry¬ styny. Zatezajac do sucha polaczone frakcje za¬ wierajace winkrystyne otrzymuje sie 18,7 mg alkaloidu.Pozostalosc rozpuszcza sie w 20 czesciach obje¬ tosciowych bezwodnego etanolu, oddziela czesci nierozpuszczalne przez odwirowanie i doprowadza pH pozostalego roztworu do wartosci 4,2, za po¬ moca etanolowego roztworu trzyprocentowego kwasu siarkowego, otrzymujac siarczan winkrys¬ tyny. Krystalizujaca mieszanine pozostawia w tem¬ peraturze otoczenia w ciagu dwóch godzin. Nastep¬ nie siarczan winkrystyny oddziela sie przez od¬ wirowanie, przemywa etanolem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. W ten sposób otrzymuje sie 12,3 mg produktu bedacego równowaznikiem 14,1 mg na 1 kg poddanych ekstrakcji lisci. Wlas¬ ciwosci otrzymanego w ten sposób siarczanu win¬ krystyny sa identyczne do opisanych w literaturze.Alternatywnie 10 g VRA rozpuszcza sie w 5 40 45 50 55 6095 570 7 8 czesciach objetosciowych bezwodnego etanolu. Do¬ prowadza sie pH roztworu do wartosci 4,2 przez dodanie etanolowego roztworu %%-owego kwasu siarkowego. Mieszanine siarczanów zaszczepia sie siarczanem winblastyny.Krystalizujaca mieszanine reakcyjna pozostawia sie w ciagu 48 godzin, a nastepnie mieszanine di- merycznego siarczanu alkaloidu odwirowuje sie.Postepujac zgodnie z powyzej opisanym sposobem, stosujac rozdzial wysokocisnieniowa metoda chro¬ matograficzna na deaktywowanym tlenku glinu a nastepnie oczyszczenie chromatograficzne na zelu otrzymuje sie 20,6 mg siarczanu winkrystyny be¬ dace równowaznikiem 11,8 mg/na 1 kg poddanych ekstrakcji lisci.W podobny sposób, z eluowanych frakcji boga¬ tych w okreslone alkaloidy, przy wysokocisnienio¬ wym rozdzielaniu sposobem chromatograficznym na deaktywowanym tlenku glinu otrzymuje sie winblastyne, leurozyne, winrozydyne, des-N-me- tylówinblastyne i inne dimeryczne alkaloidy.Przyklad II. Oczyszczanie winblastyny. Fra¬ kcje pochodzace z wysokocisnieniowego rozdziele¬ nia chromatograficznego na tlenku glinu postepujac w sposób analogiczny do opisanego w przykla¬ dzie I, które metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej okreslono jako zawierajace przewazajaca ilosc winblastyny laczy sie, a nastepnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem do sucha. Otrzymana pozostalosc dimerycznych alkaloidów zawierajaca zasadniczo winblastyne i troche pozostalej leuro- zyny rozpuszcza sie w mieszaninie rozpuszczalni¬ ków metanol-etanol. Leurozyna nie rozpuszcza sie w takiej mieszaninie i wytraca sie. Po oddzieleniu leurozyny przez odwirowanie, roztwór zawieraja¬ cy winblastyne dekantuje sie.Doprowadza sie pH roztworu do wartosci 4 do przez dodanie etanolowego roztworu kwasu siar¬ kowego, w wyniku czego tworza sie sole siarcza¬ nowe winblastyny i innych alkaloidów.Siarczany zbiera sie, przesacz odrzuca a nastep¬ nie przeprowadza powtórnie ogólnie znanymi me¬ todami siarczyny w ich odpowiednie wodorotlenki.Powtarza sie rozdzielenie chromatograficzne wol¬ nych wodorotlenków na tlenku glinu o stopniu aktywnosci III, przy stosunku wagowym tlenku glinu do materialu wprowadzonego 60:1 uzywajac jako faze ruchoma mieszanine benzenu z chloro¬ formem. Otrzymuje sie frakcje zawierajace win¬ blastyne (co stwierdzono za pomoca chromatografii cienkowarstwowej) i nie zawierajace innych alka¬ loidów. Frakcje zawierajace winblastyne laczy sie i odparowuje rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem. Po rekrystalizacji pozostalej winblasty¬ ny przy uzyciu metanolu otrzymuje sie oczyszczona winblastyne, która z kolei rozpuszcza sie w eta¬ nolu i przeprowadza w odpowiednie sole siarcza¬ nowe przez dzialanie etanolowego roztworu kwasu siarkowgeo. Otrzymany w ten sposób siarczan winblastyny wykazuje pojedyncza plamke przy analizie metoda chromatografii cienkowarstwowej.Przyklad III, Otrzymywanie winkrystyny z des-N-metylowinblastyny.Dwiescie siedemdziesiat kilogramów suchych lisci rosliny Catharanthus roseus poddaje sie dzia¬ laniu wedlug sposobu opisanego w przykladzie I.Frakcje identyfikowane metoda chromatografii cienkowarstwowej jako zawierajace des-N-metylo- winblastyne oddziela sie na etapie rozdzialu pro¬ wadzonym sposobem wysokocisnieniowej cieklej chromatografii i zateza do sucha pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Stosujac metode opisana przez Gormana w opisie patentowym Stanów Zjednoczo¬ nych nr 3354163, 7,^3 g otrzymanej surowej des- -N-metylowinblastyny przeprowadza sie w tem¬ peraturze otoczenia w winkrystyne przez dodanie roztworu zawierajacego 927 ml 98;%-owego kwasu mrówkowego i 154 ml bezwodnika octowego. Po zakonczeniu reakcji, co stwierdza sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej, mieszanine re¬ akcyjna zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do syropu.Koncentrat rozpuszcza sie w 100 czesciach obje¬ tosciowych wody i przeprowadza alkaloidy w ich wolne wodorotlenki przez ekstrakcje wodnego roz¬ tworu o wartosci pH = 5,8 trzykrotnie chlorkiem metylenu. Zatezajac polaczone ekstrakty chlorku metylenu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymuje sie 7,84 gramów wodnego wodorotlenku winkrys¬ tyny. Nastepnie wolny wodorotlenek oczyszcza sie poprzez wysokocisnieniowa (14,1—21,1 at) ciekla chromatografia w stalowej kolumnie o wymiarach 2,5X730 cm, przy uzyciu 3200 g absorbenta obojet¬ nego tlenku glinowego o stopniu aktywnosci III— IV i jako fazy ruchomej mieszaniny octan etylu — chlorek metylenu — woda w stosunku 25 : 75 :0,4.Po odparowaniu do sucha frakcji zawierajacej winkrystyne otrzymuje sie do 2,64 g winkrystyny.Material ten rekrystalizuje sie dwukrotnie przy uzyciu etanolu, poddaje powtórnie oczyszczeniu metoda chromatografii za pomoca mieszaniny: octan metylu — chlorek metylenu — woda w sto¬ sunku 48 : 51:1, krystalizuje przy uzyciu metanolu i przeprowadza w roztworze etanolu w siarczan.Otrzymuje sie 1,4 g siarczanu winkrystyny bedace równowaznikiem 5,3 mg na 1 kg ekstrahowanych lisci. PL PL PL