Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrebniania antybiotyku AV 290 z brzeczek pofermentacyjnych.W szczególnosci sposób wedlug wynalazku polega na dodaniu alkilosiarczanu potasowca lub mieszaniny alkilosiarczanów albo do pelnej brzeczki pofermentacyjnej, albo do sklarowanej brzeczki pofermentacyjnej, a nastepnie na wydzieleniu w znany sposób wytraconego kompleksu antybiotyk-alkilosiarczan lub mieszaniny kompleksów.Antybiotyk AV 290 powstaje na drodze biosyntezy fermentacyjnej podczas hodowli Streptomyces candidus NRRL3218 i jego mutantów w warunkach kontrolowanych. Sposób wytwarzania oraz wlasciwosci antybiotyku AV 290 omówione sa w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 338 786. Problem stosowania oplacalnego sposobu wyodrebniania antybiotyku jest bardzo powazny. Sposób zamieszczony w opisie przewiduje adsorbeje antybiotyku na weglu aktywnym, a nastepnie elucje i chromatografie kolumnowa.Chociaz metoda ta nie jest za droga w przypadku wytwarzania czystego antybiotyku dla lecznictwa, to jednak w przypadku zastosowania antybiotyku jako skladnika dodatków paszowych czynnik kosztów staje sie sprawa bardzo wazna. Celem wynalazku byla koniecznosc opracowania taniego sposobu wyodrebniania antybiotyku, przeznaczonego do tego celu.Wynalazek obejmuje sposób wyodrebniania antybiotyku, polegajacy na wytracaniu antybiotyku albo z pelnej brzeczki pofermentacyjnej albo ze sklarowanej brzeczki pofermentacyjnej przez dodanie alkilosiarczanu potasowca. Stosowane w sposobie wedlug wynalazku alkilosiarczany potasowców maja ogólny wzór: CH3- w którym n oznacza liczbe calkowita 9-17 wlacznie, a M oznacza atom sodu lub potasu. Przykladami alkilosiarczanów potasowców stosowanych w sposobie wedlug wynalazku sa takie zwiazki, jak decylosiarczan sodowy, hendecylosiarczan potasowy, laurylosiarczan potasowy, trójdecylosiarczan potasowy, mirystylosiarczan sodowy, pentadecylosiarczan potasowy, cetylosiarczan sodowy, heptadecylosiarczan potasowy oraz oktadecylo- siarczan sodowy. Moga byc takze uzyte mieszaniny alkilosiarczanów potasowców takie jak mieszanina hendecylosiarczanu sodowego i oktadecylosiarczanu potasowego, lub mieszanina decylosiarczanu potasowego i heptadecylosiarczanu sodowego, lub mieszanina laurylosiarczanu potasowego i cetylosiarczanu potasowego lub2 90477 mieszanina trójdecylosiarczanu sodowego, mirystylosiarczanu potasowego i pentadecylosiarczanu sodowego, lub inne podobne mieszaniny. W przypadku uzycia mieszanin alkilosiarczanów potasowców uzyskuje sie odpowied¬ nia mieszanine kompleksów antybiotyk—alkilosiarczan.Sposób wedlug wynalazku umozliwia prawie calkowite wyodrebnianie czynnej substancji antybiotycznej z pekiej brzeczki pofermentacyjnej lub ze sklarowanej brzeczki pofermentacyjnej. Poza tym przynosi korzysc ekonomiczna, polegajaca na tym, ze wytworzony sposobem wedlug wynalazku kompleks antybiotykalkilosiar- czan moze byc uzyty jako skladnik dodatków paszowych bez rozdzielenia na swoje skladniki.Produkt zwiazania antybiotyku z alkilosiarczanem potasowca stanowi odwracalny kompleks antybiotyk- alkilosiarczan. Jego budowa chemiczna nie jest dokladnie okreslona, jednak nie wystepuje tu wiazanie kowalencyjne, a produkt nie jest tez mieszanina fizyczna. Kompleks ten tworzy sie w wyniku wzajemnego oddzialywania antybiotyku i alkilosiarczanu potasowca w stosunkach niestechiometrycznycru Wiazanie chemi¬ czne jest odwracalne, gdyz antybiotyk AV 290 mozna odzyskac z kompleksu róznymi metodami takimi, jak adsorpcja na kolumnie, wypelnionej poprzecznie usieciowanym zelem karboksymetylodekstranu, a nastepnie elucja wodnym roztworem kwasu.W sposobie wedlug wynalazku jako surowiec wyjsciowy stosuje sie pelna brzeczke pofermentacyjna, uzyskana po zakonczeniu fermentacji z udzialem S.candidus NRRL 3218 lub jego mutantów. Korzystnie stosuje sie brzeczke pofermentacyjna sklarowana w wyniku usuniecia grzybni i innych czesci stalych przez odsaczenie..Dla ulatwienia saczenia mozna dodac ziemie okrzemkowa, wzglednie inny pomocniczy material filtracyjny.W kazdym przypadku pelna brzeczke pofermentacyjna lub sklarowana brzeczke pofermentacyjna doprowadza sie przy pomocy kwasu do wartosci pH = 1,9—2,1, korzystnie okolo 2,0. Odpowiednimi kwasami do tego celu sa takie kwasy, jak kwas solny, kwas siarkowy, kwas trójfluorooctowy i inne, ale uzyc mozna nawet lodowatego kwasu octowego. Ta wartosc pH jest graniczna, poniewaz ponizej wartosci pH = 1,9, zachodzi rozklad antybiotyku AV 290 podczas suszenia placka filtracyjnego nawet juz w temperaturze 40°C pod zmniejszonym cisnieniem. Nastepnie przy mieszaniu i w temperaturze otoczenia, dodaje sie powoli wodny roztwór alkilosiar¬ czanu potasowca lub mieszaniny alkilosiarczanów potasowców.Proces wedlug wynalazku korzystnie prowadzi sie w temperaturze okolo 15—30°C, korzystnie w tempera¬ turze pokojowej. Antybiotyk i alkilosiarczan tworza kompleks nierozpuszczalny w wodzie który wytraca sie.Wytracony kompleks, wzglednie, w przypadku pelnej brzeczki pofermentacyjnej, wytracony kompleks lacznie z czesciami stalymi brzeczki, wyodrebnia sie przez odsaczenie lub odwirowanie i suszy.Uzyskane w ten sposób produkty mozna suszyc albo przez zawieszenie wilgotnego osadu w polarnych, mieszajacych sie z woda i nierozpuszczajacych kompleksu rozpuszczalnikach takich, jak aceton, a nastepnie przez odsaczenie przemycie i wysuszenie na powietrzu, albo przez zawieszenie wilgotnego osadu w wodzie i liofilizacje albo suszenie rozpryskowe.Produkty, wytworzone sposobem wedlug wynalazku, ostroznie wysuszone z zachowaniem temperatury, w której nie zachodzi degradacja antybiotyku AV290, maja zwykle w przypadku kompleksów alkilosiarczano- wych postac proszków o barwie od bialej do zólto-brazowej, natomiast w przypadku kompleksów alkilosiarcza- nowych wydzielonych razem z wysuszonymi czesciami stalymi brzeczki, postac proszków lub grudek o barwie szarej do brazowej. W postaci suchej produkty, utworzone sposobem wedlug wynalazku, sa bardzo stabilne i moga byc przechowywane bez widocznej straty aktywnosci w ciagu dlugich okresów czasu. Ten dlugi okres trwalosci jest praktycznie wazna cecha produktów, wytworzonych w sposób wedlug wynalazku.Ilosc alkilosiarczanu potasowego, konieczna do wytracania kompleksu z antybiotykiem, nie musi byc wyliczona precyzyjnie i nie musza w tym wypadku byc zachowane scisle zaleznosci stechiometryczne-Zazwyczaj ilosc alkilosiarczanu potasowca konieczna do wytracania antybiotyku AV 290 z pelnej brzeczki pofermentacyj¬ nej wynosi 1,5—2,5 grama gram czynnej substancji AV 290, zawartej w brzeczce - Zazwyczaj korzystnie jest dodawanie alkilosiarczan potasowca w ilosci 2,0 grama/gram antybiotyku, zawartego w brzeczce. Zawartosc antybiotyku AV 290 w brzeczce mozna latwo oznaczyc metoda mikrobiologiczna po doprowadzeniu brzeczki do wartosci pH 8,0—9,0, w sposób omówiony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 338 786. Korzystna metoda oznaczania jest adaptacja turbidometrycznej metody oznaczania tetracykliny z uzyciem Staphylococcus aureus, opisanej w „Assay Methods of Antibiotics, a Laboratory Manual", Grove & - Randall, Medical Encyclopedie, Inc. (1955), strony 48—52. Nastepnie potrzebna ilosc alkilosiarczanu potasowca korzystnie rozpuszcza sie lub zawiesza w dogodnej ilosci wody, po czym wodny roztwór lub zawiesine dodaje sie do pelnej brzeczki w sposób, podany w opisie. Jakikolwiek nadmiar alkilosiarczanu potasowca pozostanie po przesaczeniu w roztworze.Na ogól ilosc alkilosiarczanu potasowca konieczna do wytracenia antybiotyku AV 290 ze sklarowanej brzeczki pofermentacyjnej wynosi okolo 1 grama/gram czynnej substancji AV 290, zawartej w brzeczce sklaro-90477 3 wanej. Wieksza ilosc alkilosiarczanu potasowca, potrzebna do wytracenia antybiotyku AV 290 z pelnej brzeczki pofermentacyjnej,, anizeli ilosc, potrzebna do wytracenia w przypadku sklarowanej brzeczki pofermentacyjnej wynika z koprecypitacji innych substancji bialkowych, zawartych w pelnej brzeczce.Minimalna ilosc alkilosiar¬ czanu potasowca, potrzebna do wytworzenia kompleksu z antybiotykiem, zawartym w sklarowanej brzeczce . pofermentacyjnej zdanej szarzy fermentacyjnej, dogodnie mozna okreslic w sposób opisany ponizej.Pobiera sie próbke pelnej brzeczki pofermentacyjnej, dogodnie 50—100 ml. klaruje sie ja przez odsaczenie grzybni i innych czesci nierozpuszczalnych, korzystnie z dodaniem pomocniczego materialu filtracyjnego, po czym przesacz zakwasza sie do wartosci pH * 1,9—2,1, rozcienczonym wodnym roztworem kwasu mineralnego, takim, jak rozcienczony kwas solny, rozcienczony kwas siarkowy, rozcienczony kwas fosforowy i tym podobne. Otrzymany roztwór miareczkuje sie wodnym roztworem takiego alkilosiarczanu potasowca, jak ma byc uzyty do wytracania, az do momentu ustania tworzenia sie osadu lub zmetnienia. Ilosc roztworu alkilosiarczanu potasowca, odnoszaca sie do przesaczonej brzeczki zdanej szarzy fermentacyjnej oblicza sie z miana pobranej próbki z zapewnieniem niewielkiego nadmiaru.Ponizsze przyklady objasniaja wynalazek i jego podstawowe zasady nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad I. Wytracanie kompleksu antybiotyk AV 290 — laurylosiarczan sodowy ze sklarowanej brzeczki pofermentacyjnej.Stosowano techniczny siarczan AV 290 o aktywnosci 63,8%. Odwazki siarczanu AV 290 rozpuszczono w wodzie i roztwory doprowadzono do wartosci pH = 2,0 przy pomocy wodnego 15% roztworu H2 SÓ 4. Jako pomocniczy material filtracyjny dodano Celit 545R (ziemie okrzemkowa), po czym, przy mieszaniu, wkroplono wodny 2% roztwór laurylosiarczanu sodowego. Zawiesine sezonowano wciagu 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym osad odsaczono i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Wyczer¬ pany przesacz oraz wysuszony osad zbadano metoda mikrobiologiczna. Uzyskane wyniki zamieszczono w tablicy I.Przyklad II. Wytracanie kompleksu antybiotyk AV 290 — laurylosiarczan sodowy z pelnej brzeczki pofermentacyjnej.Pobierano próbki pelnej brzeczki pofermentacyjnej z hodowli trzesawkowej S.candidus i wzbogacono je przez dodanie technicznego siarczanu AV 290. Stosowano 100 ml próbki pelnej brzeczki pofermentacyjnej.Próbki doprowadzono do wartosci pH = 2,0, przy pomocy wodnego 15% roztworu kwasu siarkowego. Do próbek dodawano nastepnie 3,0 g Dicalite 478® (ziemia okrzemkowa), po czym, przy mieszaniu wkraplano wodny 2% roztwór laurylosiarczanu sodowego. Zawiesine sezonowano w ciagu trzech godzin w temperaturze pokojowej, po czym osad odsaczono i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Wyczerpany przesacz i wysuszony osad zbadano metoda mikrobiologiczna. Uzyskane wyniki zamieszczono w tablicy II.Przyklad III. Wplyw wartosci pH na wytracanie sie kompleksu z pelnej brzeczki pofermentacyjnej.Próbki pelnej brzeczki pofermentacyjnej z hodowli S.candidus wzbogacono do 4930 7/ml przez dodanie technicznego siarczanu AV 290, po czym doprowadzono do wartosci pH, wykazanych w tablicy II, przy pomocy wodnego 15% roztworu kwasu siarkowego. Nastepnie dodano 3,0 g Dicalite 478®. po czym przy mieszaniu wkroplono 40 ml wodnego 2% roztworu laurylosiarczanu sodowego, az do osiagniecia stosunku ilosciowego C12H25OS03Na: AV290 = 1,62. Zawiesine sezonowano wciagu trzech godzin w temperaturze pokojowej, po czym osad odsaczono i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Wyczerpany przesacz 1 wysuszony osad zbadano metoda mikrobiologiczna. Uzyskane wyniki zamieszczono w tablicy III.Przyklad IV. Wytracanie antybiotyku AV 290 z pelnej brzeczki pofermentacyjnej z uzyciem laurylo¬ siarczanu sodowego.Do przerobu pobrano próbke pofermentacyjna z fermentora pilotowego, w ilosci 30 I i o aktywnosci, oznaczonej metoda mikrobiologiczna, 3740 7/ml. Brzeczke doprowadzono do wartosci pH - 2,0 przy pomocy 219 ml stezonego kwasu siarkowego, po czym dodano jako pomocniczy material filtracyjny 1 kilogram Dicalite 478®. Do calosci przy mieszaniu dodano powoli roztwór 240 g laurylosiarczanu sodowego w 31 wody, a nastepnie sezonowano, mieszajac w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej i odsaczono osad w prasie filtracyjnej. Osad zebrany z filtra wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 50°C i uzyskano 1978 g suchego produktu o aktywnosci, oznaczonej metoda mikrobiologiczna 4,72%. Oznacza to wydajnosc odzysku antybiotyku AV 290 w wysuszonym osadzie 83,2% w stosunku do zawartosci w pelnej brzeczce, pofermentacyjnej.Przyklad V. Wytracanie antybiotyku AV 290 z pelnej brzeczki pofermentacyjnej z uzyciem decylo- siarczanu sodowego.Próbke pelnej brzeczki pofermentacyjnej z hodowli trzesawkowej, w ilosci 400 ml i o aktywnosci, ozna¬ czonej metoda mikrobiologiczna, 4590 7/ml, doprowadzono do wartosci pH ¦ 2,0 przy pomocy 3,9 ml4 90477 stezonego kwasu siarkowego, po czym dodano jako pomocniczy material filtracyjny 5g Dicalite 478®. Przy mieszaniu dodano powoli 9,68 Empicol 0137® (roztwór decylosiarczanu sodowego o aktywnosci 30,5%, produk¬ cji Albright & Wilson Chemicale, Ltd.), rozcienczonego woda do objetosci 50 ml. Calosc sezonowano, mieszajac wciagu jednej godziny w temperaturze pokojowej, a nastepnie odsaczono osad na filtrze prózniowym. Osad, zebrany z filtra, wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 50°C i otrzymano 20,2 g suchego produktu o aktywnosci, oznaczonej metoda mikrobiologiczna 9,14%. Oznacza to wydajnosc odzysku antybio¬ tyku AV 290 w wysuszonym osadzie 100,5% w stosunku do zawartosci w pelnej brzeczce pofermentacyjnej- Przyklad VI. Wytracanie antybiotyku AV 290 w pelnej brzeczce pofermentacyjnej z uzyciem miesza¬ niny cetylosiarczanu sodowego i oleinosiarczanu sodowego.Próbke pelnej brzeczki pofermentacyjnej z hodowli trzesawkowej w ilosci 400 ml i o aktywnosci, oznaczo¬ nej metoda mikrobiologiczna, 4590 7/ml, doprowadzono do wartosci pH = 2,0 przy pomocy 3,9 ml stezonego kwasu siarkowego, po czym dodano jako pomocniczy material filtracyjny 5g Dicalite 478®. Nastepnie przy mieszaniu dodano powoli 13,51 g Empicol CHC 30® (mieszanine cetylosiarczanu sodowego i oleinosiarczanu sodowego w postaci pasty o aktywnosci 30%, produkcji Albreight & Wilson Chemicals, Ltd.), zawieszonej w wodzie w koncowej objetosci 50 ml. Calosc sezonowano, mieszajac w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej, a nastepnie odsaczono osad na filtrze prózniowym. Osad zebrany z filtra wysuszono pod zmniejszo¬ nym cisnieniem w temperaturze 50°C i otrzymano 24,0 suchego produktu o aktywnosci, oznaczonej metoda mikrobiologiczna, 8,08%. Oznacza to wydajnosc odzysku antybiotyku AV 290 w wysuszonym osadzie 105,6% w stosunku do zawartosci w pelnej brzeczce pofermentacyjnej. PL PL PL PL PL PL PL PL PL