PL246028B1

PL246028B1 - 6-Methylene-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol and method for producing 6-methylene-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol

Info

Publication number: PL246028B1
Application number: PL440865A
Authority: PL
Inventors: Martyna Perz; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2022-04-06
Filing date: 2022-04-06
Publication date: 2024-11-18
Also published as: PL440865A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 6-Metyleno-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-ol o wzorze 2. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania 6-metyleno-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu, który charakteryzuje się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-metylo-8-nitroflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 6-metyleno-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-ol o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.The subject of the application is 6-Methylene-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol of formula 2. The application also covers a method for producing 6-methylene-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol, which is characterized in that the strain Isaria fumosorosea KCH J2 is introduced into a medium suitable for filamentous fungi, then after at least 72 hours a substrate is introduced into the culture, which is 6-methyl-8-nitrophlavanone of formula 1, dissolved in an organic solvent miscible with water, the transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius, with continuous shaking, for at least 96 hours, after which the product is extracted with an organic solvent immiscible with water and purified chromatographically, wherein 6-Methylene-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol of formula 2 is located in the fraction of intermediate polarity, in the third band from the starting line.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest 6-metyleno-Ο-β-D -(4”-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-ol o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.The subject of the invention is 6-methylene-Ο-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol of formula 2 shown in the drawing.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 6-metyleno-Ο-β-D -(4”-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu.The subject of the invention is also a process for the preparation of 6-methylene-Ο-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol.

6-Metyleno-Ο-β-D -(4”-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-ol może znaleźć zastosowanie jako preparat chemoprewencyjny, hepatoprotekcyjny, bakteriostatyczny czy substancja zapobiegająca peroksydacji lipidów w preparatach farmaceutycznych.6-Methylene-Ο-β-D-(4”-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol can be used as a chemopreventive, hepatoprotective, bacteriostatic agent or as a substance preventing lipid peroxidation in pharmaceutical preparations.

Znany jest szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze P.416996.The Isaria fumosorosea KCH J2 strain disclosed in patent application number P.416996 is known.

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego, kosmetycznego i spożywczego.In recent years, in the treatment and prevention of various diseases, compounds of natural origin and their equivalents considered natural, which were obtained through microbiological transformations, have become increasingly important. Therefore, it is important to develop new methods of producing biologically active compounds through biotransformation, useful for the pharmaceutical, cosmetic and food industries.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 6-metyleno-O -β-D -(4”-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu.There is no information in the available literature on the preparation of 6-methylene-O-β-D-(4”-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol.

Istotą wynalazku jest 6-metyleno-O -β-D -(4”-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-ol.The essence of the invention is 6-methylene-O-β-D-(4”-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol.

Istota sposobu polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-metylo-8-nitroflawanon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 6-metyleno-O -β-D -(4”-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-ol znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.The essence of the method consists in introducing the strain Isaria fumosorosea KCH J2 into a medium suitable for filamentous fungi. After at least 72 hours, the substrate, which is 6-methyl-8-nitrophlavanone, dissolved in an organic solvent miscible with water, is introduced into the culture. The transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius, with continuous shaking, for at least 96 hours. Then the product is extracted with an organic solvent immiscible with water and purified chromatographically. 6-methylene-O -β-D -(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol is found in the fraction of intermediate polarity, in the third band from the starting line.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.It is advantageous when the ratio of the mass of the added substrate to the volume of the culture is 0.1 mg:1 cm ³ .

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.It is also advantageous if the process is carried out at a temperature of 25 degrees Celsius.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 10 dni.Additionally, it is beneficial if the transformation is carried out for 10 days.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9:1.It is also advantageous when the purification is carried out using thin-layer preparative chromatography in an eluting system with chloroform and methanol in a volume ratio of 9:1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje redukcja grupy karbonylowej do grupy hydroksylowej przy C-4 oraz przyłączenie 4-metoksy-/>-D-glukozy do grupy CH3 przy C-6. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą.In accordance with the invention, as a result of the action of the enzymatic system contained in the cells of the Isaria fumosorosea KCH J2 strain, the carbonyl group is reduced to the hydroxyl group at C-4 and 4-methoxy-/>-D-glucose is attached to the CH3 group at C-6. The product obtained in this way is isolated from the aqueous culture of the microorganism in a known manner, by extraction with an organic solvent immiscible with water.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 6-metyleno-Ο-β- D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.The main advantage of the invention is the obtaining of 6-methylene-Ο-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol at room temperature and at the natural pH of the strain and using a microorganism that is not a human pathogen.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty.The use of biotransformation instead of chemical synthesis makes it possible, in an environmentally friendly manner, to obtain compounds with greater bioavailability and biological activity than the substrates used.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.The invention is explained in more detail with reference to an example embodiment.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 6-metylo-8-nitroflawanonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.Example. The strain Isaria fumosorosea KCH J2 is introduced into a 2000 cm ³ conical flask containing 500 cm ³ of sterile medium containing 10 g of aminobac and 30 g of glucose. After 72 hours of its growth, 50 mg of 6-methyl-8-nitrophlavanone of formula 1, dissolved in 1 cm ³ of dimethyl sulfoxide, is added. The transformation is carried out at 25 degrees Celsius with constant shaking for 10 days. Then the reaction mixture is extracted twice with ethyl acetate, dried with anhydrous magnesium sulfate and the solvent is evaporated. The extract obtained is purified by chromatography using a mixture of chloroform and methanol in a volume ratio of 9:1 as eluent. The product is found in the fraction of intermediate polarity, in the third band from the starting line.

PL 246028 Β1PL 246028 Β1

Na tej drodze otrzymuje się 12,5 mg 6-metyleno-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu o wzorze (wydajność 14,8%) oraz pozostałość, w skład, której wchodzi 6-metylo-8-nitro-4-O/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)flawanon.In this way, 12.5 mg of 6-methylene-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavan-4-ol of the formula (yield 14.8%) and a residue consisting of 6-methyl-8-nitro-4-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)flavanone are obtained.

Stopień konwersji substratu według HPLC >87%.Substrate conversion rate by HPLC >87%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.The obtained product is characterized by the following spectral data.

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-de)Description of signals from the ¹ H NMR spectrum (601 MHz, Acetone-de)

Sygnały pochodzące od szkieletu flawonoidowego Signals from the flavonoid skeleton Sygnały pochodzące od jednostki cukrowej Signals from the sugar unit δ [ppm] δ [ppm] J [Hz] J [Hz] H H δ [ppm] δ [ppm] J[Hz] J[Hz] H H 5,49 (dd) 5.49 (dd) 11,8; 2,1 11.8; 2.1 2 2 4,41 (d) 4.41 (d) 7,8 7,8 1 1 2,37 (m) 2.37 (m) 3ax 3ax 3,28 (m) 3.28 (m) 2”, 5” 2", 5" 2,20 (ddd) 2.20 (ddd) 11,7; 7,6; 2,0 11.7; 7.6; 2.0 3eq 3eq 3,51 (d) 3.51 (d) 9,0 9.0 3 3 4,90 (s) 4.90 (sec) 4-H 4-H 3,10(m) 3.10(m) 4” 4” 4,99 (s) 4.99 (sec) 4-OH 4-OH 3,83 (d) 3,66 (m) 3.83 (d) 3.66 (m) 11,6 11.6 6” 6" 7,87 (d) 7.87 (d) 2,1 2,1 5 5 4,29 (s) 4.29 (s) C2”-OH C2”-OH 7,71 (d) 7.71 (d) 2,0 2.0 7 7 3,73 (m) 3.73 (m) C6’’-OH C6''-OH 7,54 (d) 7.54 (d) 1,6 1.6 2' 2' 3,53 (s) 3.53 (s) C4”-O- CH3 C4”-O- CH3 7,43 (m) 7.43 (m) 3’, 5’ 3', 5' 4,90 (d) 4,68 (d) 4.90 (d) 4.68 (d) 12,1 12,1 12.1 12.1 C6-CH2- O C6-CH2- O 7,36 (m) 7.36 (m) 4’ 4’ 7,53 (d) 7.53 (d) 0,6 0.6 6’ 6’

Modelowanie aktywności biologicznych przy użyciu programu PASS online, wykazało że związek 6-metyleno-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawanon-4-ol z najwyższym prawdopodobieństwem 86,9% może być inhibitorem glicerofosfotransferazy CDP-glycerol. Enzym ten odpowiada za tworzenie kwasów tejchojowych (TA) w ścianie komórkowej bakterii gram dodatnich. Kwasy tejchojowe wiążą kationy metali jedno- i dwuwartościowych. Sieci kationów skoordynowanych przez TA wpływają na ogólną strukturę polimerów, a to z kolei wpływa na porowatość i sztywność otoczki komórki. Sugeruje się, że kwasy tejchojowe są ważne dla homeostazy kationów w organizmach gram-dodatnich. Inhibicja glicerofosfotransferazy CDP-glicerol uniemożliwia prawidłowe tworzenie kwasów tejchojowych. Brak kwasów tejchojowych może zakłócić prawidłowe funkcjonowanie bakterii gram dodatnich (Swoboda, J. G., Campbell, J., Meredith, T. C., & Walker, S. (2010). Wall teichoic acid function, biosynthesis, and inhibition. Chembiochem, 35-45.). Dzięki temu 6-metyleno-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawon-4-ol może posiadać właściwości bakteriobójcze wobec patogenów.Modeling of biological activities using the PASS online program, showed that the compound 6-methylene-0-/?-D-(4”-0-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavanone-4-ol with the highest probability of 86.9% can be an inhibitor of CDP-glycerol glycerophosphotransferase. This enzyme is responsible for the formation of teichoic acids (TA) in the cell wall of gram-positive bacteria. Teichoic acids bind mono- and divalent metal cations. The cation networks coordinated by TA affect the overall structure of polymers, which in turn affects the porosity and stiffness of the cell envelope. It is suggested that teichoic acids are important for cation homeostasis in gram-positive organisms. Inhibition of CDP-glycerol glycerophosphotransferase prevents the proper formation of teichoic acids. The lack of teichoic acids may disrupt the proper functioning of gram-positive bacteria (Swoboda, J. G., Campbell, J., Meredith, T. C., & Walker, S. (2010). Wall teichoic acid function, biosynthesis, and inhibition. Chembiochem, 35-45.). Due to this, 6-methylene-0-/?-D-(4”-0-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavon-4-ol may have bactericidal properties against pathogens.

Według symulacji in silico wykazano, że z prawdopodobieństwem 65,7% 6-metyleno-O-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawon-4-ol może być stosowany jako związek chemoprewencyjny. Chemoprewencja polega na stosowaniu naturalnych lub syntetycznych związków chemicznych, które mogą chronić przed nowotworami. Dzięki temu związek może posiadać szereg aktywności anty kancerogennych składających się na profilaktykę (chemoprewencję), między innymi: właściwości przeciwzapalne, inhibicja angiogenezy, inhibicja wzrostu oraz indukcja apoptozy komórek rakowych, czy zmiatacz wolnych rodników (ROS) (Forni, C., Rossi, M., Borromeo, I., Feriotto, G., Platamone, G., Tabolacci, C., ... & Beninati, S. (2021). Flavonoids: A Myth or a Reality for Cancer Therapy?. Molecules, 26(12), 3583.).According to in silico simulations, it was shown that with a probability of 65.7% 6-methylene-O-/?-D-(4”-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavon-4-ol can be used as a chemopreventive compound. Chemoprevention is the use of natural or synthetic chemical compounds that can protect against cancer. Thanks to this, the compound may have a number of anti-carcinogenic activities contributing to prevention (chemoprevention), including: anti-inflammatory properties, inhibition of angiogenesis, inhibition of growth and induction of apoptosis of cancer cells, or a free radical scavenger (ROS) (Forni, C., Rossi, M., Borromeo, I., Feriotto, G., Platamone, G., Tabolacci, C., ... & Beninati, S. (2021). Flavonoids: A Myth or a Reality for Cancer Therapy?. Molecules, 26(12), 3583.).

Wykazano także, że z prawdopodobieństwem 68,7% związek może być stosowany jako substancja hepatoprotekcyjna. Yoshikawa i współpracownicy wyizolowali z metanolowego ekstraktu z Anastatlca hierochuntica L Anastatynę A i Anastatynę B. Wykazali, że te związki flawonoidowe mają działanie hepatoprotekcyjne na cytotoksyczność indukowaną przez D-galaktozaminę w pierwotnie hodowanych mysich hepatocytach, a ich aktywność była silniejsza w porównaniu z pokrewnymi flawonoidami i handlową sylibiną - znaną i stosowaną komercyjnie substancją hepatoprotekcyjną (Adewusi, E. A., & Afolayan, A. J. (2010). A review of natural products with hepatoprotective activity. Journal of Medicinal Plants Research, 4(13), 1318-1334.).It was also shown that the compound can be used as a hepatoprotective substance with a probability of 68.7%. Yoshikawa et al. isolated Anastatine A and Anastatine B from the methanolic extract of Anastatlca hierochuntica L. They showed that these flavonoid compounds had hepatoprotective effects on D-galactosamine-induced cytotoxicity in primary cultured mouse hepatocytes, and their activity was stronger compared to related flavonoids and commercial silybin - a known and commercially used hepatoprotective substance (Adewusi, E. A., & Afolayan, A. J. (2010). A review of natural products with hepatoprotective activity. Journal of Medicinal Plants Research, 4(13), 1318-1334.).

Badania in silico wykazały również, że związek może być inhibitorem peroksydacji lipidów (prawdopodobieństwo 62,9%). Peroksydacja lipidów błonowych znacząco zmienia fizyczne właściwości dwuwarstw lipidowych. Udział peroksydacji lipidów oraz ogólnego stresu oksydacyjnego ma ogromny wpływ na rozwój choroby Alzheimera. Alzheimer jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną charakteryzującą się pozakomórkową akumulacją amyloidu-β (Ap) oraz wewnątrzkomórkową akumulacją splątków neurofibrylarnych składających się z białka tau. Wiadomo, że wstawienie Ap do błon komórkowych generuje nadtlenek wodoru oraz nadtlenki lipidów i produkty degradacji, takie jak MDA. Inhibicja peroksydacji lipidów, może stanowić jedną z metod leczenia choroby Alzheimera (Gaschler, M. M., & Stockwell, B. R. (2017). Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and biophysical research communications, 482(3), 419-425.).In silico studies have also shown that the compound can be an inhibitor of lipid peroxidation (62.9% probability). Peroxidation of membrane lipids significantly changes the physical properties of lipid bilayers. The participation of lipid peroxidation and general oxidative stress has a great impact on the development of Alzheimer's disease. Alzheimer's disease is a progressive neurodegenerative disease characterized by extracellular accumulation of amyloid-β (Ap) and intracellular accumulation of neurofibrillary tangles consisting of tau protein. It is known that insertion of Ap into cell membranes generates hydrogen peroxide and lipid peroxides and degradation products such as MDA. Inhibition of lipid peroxidation may be one of the methods of treating Alzheimer's disease (Gaschler, M. M., & Stockwell, B. R. (2017). Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and biophysical research communications, 482(3), 419-425.).

Odnośnie grupy nitrowej przedmiotowego 6-metyleno-O-^D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawanon-4-olu, badania Mughal i współpracowników potwierdziły, że grupa nitrowa albo siarkowa zwiększa właściwości przeciwbakteryjne, co za tym idzie, działa negatywnie na wzrost E. coli, S. flexneri, P. aeruginosa and S. typhi. (Mughal, E. U., Ayaz, M., Hussain, Z., Hasan, A., Sadiq, A., Riaz, M., ... & Choudhary, M. I. (2006). Synthesis and antibacterial activity of substituted flavones, 4-thioflavones and 4-iminoflavones. Bioorganic & medicinal chemistry, 14(14), 4704-4711.)Regarding the nitro group of the subject 6-methylene-O-^D-(4”-O-methylglucopyranosyl)-8-nitroflavanon-4-ol, the research of Mughal and colleagues confirmed that the nitro or sulfur group increases the antibacterial properties, therefore, has a negative effect on the growth of E. coli, S. flexneri, P. aeruginosa and S. typhi. (Mughal, E. U., Ayaz, M., Hussain, Z., Hasan, A., Sadiq, A., Riaz, M., ... & Choudhary, M. I. (2006). Synthesis and antibacterial activity of substituted flavones, 4 -thioflavones and 4-iminoflavones. Bioorganic & medicinal chemistry, 14(14), 4704-4711.)

Claims

1. 6-methylene-O-^-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavanon-4-ol of formula 2.

2. A method for producing 6-methylene-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavanone-4-ol, characterized in that the strain Isaria fumosorosea KCH J2 is introduced into a medium suitable for filamentous fungi, then after at least 72 hours a substrate is introduced into the culture, which is 6-methyl-8-nitrophlavanone of formula 1, dissolved in an organic solvent miscible with water, the transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius, with continuous shaking, for at least 96 hours, then the product is extracted with an organic solvent immiscible with water and purified by chromatography, wherein 6-methylene-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-8-nitrophlavanone of formula 2 is found in the fraction of intermediate polarity, in the third fraction band from the starting line.

3. The method according to claim 2, characterized in that the ratio of the mass of the added substrate to the volume of the culture is 0.1 mg:1 cm ³ .

4. The method according to claim 2, characterized in that the process is carried out at a temperature of 25 degrees Celsius.

5. The method according to claim 2, characterized in that the transformation is carried out for 10 days.

6. The method according to claim 2, characterized in that the purification is carried out using preparative thin-layer chromatography in an eluting system of chloroform:methanol in a volume ratio of 9:1.