PL238016B1 - Krystaliczna, bezcynkowa postać insuliny glargine i sposób jej otrzymywania - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania krystalicznej postaci insuliny glargine bezcynkowej, która powinna znaleźć zastosowanie w wytwarzaniu preparatów farmaceutycznych przeznaczonych do leczenia cukrzycy.

Stan techniki

Insulina glargine (znana również jako Lantus®) to analog ludzkiej insuliny, w której występujący w pozycji 21 łańcucha A kwas asparaginowy został zastąpiony glicyną Gly (A21) natomiast sekwencję łańcucha B przedłużono o dodatkowe dwa aminokwasy, tj. dodając dwie argininy, Arg (B31) i Arg (B32). Wprowadzone modyfikacje zmieniają punkt izoelektryczny uzyskiwanego analogu z pH 5,4 na pH 6,7, dzięki czemu posiada on lepszą rozpuszczalność w roztworze o pH kwaśnym (zwłaszcza wynoszącym około 4) niż o pH fizjologicznym (wynoszącym około 7,4). W efekcie, po podskórnym wstrzyknięciu kwaśnego roztworu tego analogu, np. o pH około 4) wytrąca się on w miejscu wstrzyknięcia tworząc tzw. depot, z którego później następuje stopniowe uwalnianie białka do organizmu. Dlatego insulina glargine jest stosowana do wytwarzania preparatów insuliny o spowolnionym uwalnianiu przeznaczonych do leczenia cukrzycy.

Ze względów praktycznych, takich jak lepsza stabilność i trwałość białka, szczególnie pożądane jest otrzymywanie insuliny i jej analogów w postaci krystalicznej. Dotyczy to w szczególności insuliny glargine.

W zgłoszeniu WO2015084694 opisano sposób krystalizacji insuliny glargine z zasadowego roztworu (o pH wyższym o co najmniej 1 od wartości punktu izoelektrycznego analogu insuliny) zawierającego czynnik stabilizujący kryształy (związek fenolowy) oraz rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą (taki jak: etanol, metanol, aceton lub izopropanol) przy czym krystalizacja inicjowana jest poprzez dodanie soli cynku.

W zgłoszeniu WO2014122653 opisano sposób krystalizacji insuliny glargine z 30% roztworu izopropanolu z zastosowaniem pH7 i jonów cynku do jej inicjacji.

Znane metody uzyskiwania krystalicznej insuliny glargine wiążą się z problemem zawartości cynku w uzyskiwanej tymi sposobami substancji aktywnej na poziomie 0,2 do 0,6%, co wymusza uwzględnianie jego zawartości przy przygotowywaniu gotowej formy leku.

Cel wynalazku

Celem wynalazku jest dostarczenie krystalicznej postaci insuliny glargine niezawierającej cynku i wytworzonej bez stosowania fenolu na etapie krystalizacji, spełniającej wymagania farmakopealne dla tej substancji aktywnej, stabilnej przez co najmniej 12 miesięcy w zakresie wymagań farmakopealnych określonych dla tej substancji aktywnej oraz łatwo rozpuszczalnej.

Nieoczekiwanie, określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest postać stała insuliny glargine bez zawartości cynku, korzystnie, krystaliczna postać insuliny glargine niezawierająca cynku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania postaci krystalicznej insuliny glargine charakteryzujący się tym, że przygotowuje się mieszaninę krystalizacyjną stanowiącą wodny roztwór zawierający izopropanol, cytrynian sodu i insulinę glargine, a następnie przez stopniowe rozcieńczanie mieszaniny krystalizacyjnej inicjuje się i kontynuuje proces krystalizacji, po którego zakończeniu oddziela się otrzymaną postać krystaliczną insuliny glargine niezawierającą cynku.

Sposób według wynalazku polega na przygotowaniu mieszaniny, w której insulina glargine jest rozpuszczona, a następnie zainicjowaniu krystalizacji przez rozcieńczenie mieszaniny wodą.

Korzystnie, mieszanina w warunkach początkowych stanowi wodny roztwór następujących składników:

- insulina glargine w stężeniu 5 do 20 mg/ml,

- izopropanol w stężeniu od 20 do 40%,

- cytrynian sodu w stężeniu od 0,1 do 0,5 M.

Korzystnie, stosuje się pH z zakresu od 6 do 9.

Korzystnie, krystalizację inicjuje się poprzez stopniowe dodawanie wody.

Korzystnie, że rozcieńczanie prowadzi się do osiągnięcia wartości stężenia rozpuszczalnika organicznego poniżej 70% wartości jego stężenia w momencie inicjacji krystalizacji, korzystnie nie więcej niż 50% stężenia początkowego.

PL 238 016 B1

Korzystnie, że krystalizację prowadzi się w zakresie temperatur od 10°C do 20°C.

Szczegółowy opis wynalazku

Dla celów niniejszego opisu przyjęto następujące rozumienie poniższych pojęć.

Insulina glargine bezcynkowa - postać krystaliczna insuliny glargine, dla której zawartość cynku oznaczona dostępną metodą analityczną jest poniżej czułości tej metody, w szczególności wynosi poniżej 0,01% masowego.

Inicjacja krystalizacji - moment rozpoczęcia procesu krystalizacji obserwowany jako zmętnianie mieszaniny krystalizacyjnej. Zmętnienie to następuje przy określonym składzie oraz określonych wartościach pH i temperatury osiągniętych w trakcie rozcieńczania mieszaniny krystalizacyjnej przez dodawanie wody.

Proces krystalizacji - proces stopniowego rozcieńczania mieszaniny krystalizacyjnej do osiągnięcia ustalonego składu, pH i temperatury mieszaniny, mający na celu uzyskanie insuliny glargine w postaci krystalicznej.

Oznaczanie zawartości cynku w uzyskanym preparacie krystalicznej insuliny glargine wykonano metodą absorpcyjnej spektroskopii atomowej zgodnie z Farmakopeą Europejską (2.2.23 Metoda I). Zawartość cynku została określona w % masowych, gdzie limit detekcji (LOD) dla tej metody wynosi 0,01%.

Mieszaninę krystalizacyjną uzyskuje się przez zmieszanie, w określonej temperaturze, wodnego roztworu białka z rozpuszczalnikiem organicznym i solą. Po korekcie pH do zadanej wartości mieszanina jest gotowa do zainicjowania krystalizacji. Kolejność dodawania składników nie ma większego znaczenia, ale najkorzystniej jest, gdy do roztworu białka dodaje się jako pierwszy rozpuszczalnik organiczny.

Inicjacja krystalizacji i sam proces krystalizacji następują przez rozcieńczenie mieszaniny wodą, co powoduje zmniejszenie stężenia rozpuszczalnika organicznego i soli.

Najważniejszy wpływ na przebieg sposobu według wynalazku mają następujące parametry: stężenie insuliny glargine, pH, stężenie rozpuszczalnika organicznego, stężenie soli, temperatura mieszaniny, ale na jakość uzyskanych wyników mogą wpływać również takie parametry jak intensywność mieszania podczas procesu krystalizacji oraz szybkość rozcieńczania wodą.

Stężenie insuliny glargine w mieszaninie krystalizacyjnej powinno wynosić od 5 do 20 mg/ml.

Jako rozpuszczalnik organiczny stosowano izopropanol w stężeniu od 20 do 40%.

Jako sól zastosowano cytrynian sodu w stężeniu od 0,1 do 0,5 M.

Temperatura krystalizacji ma wpływ na moment inicjacji krystalizacji i na jej wydajność i powinna wynosić od 10 do 20°C.

Wartość pH powinna wynosić od 6,0 do 9,0. Zbyt wysoka wartość pH, zwłaszcza powyżej 9, może znacząco przyspieszyć degradację insuliny glargine.

Korzystne jest, aby mieszanina krystalizacyjna przed rozpoczęciem rozcieńczania była klarowna - zapobiega to wypadaniu białka z mieszaniny krystalizacyjnej w postaci amorficznej, która może już nie przejść do formy krystalicznej, obniżając wydajność i/lub utrudniając odsączenie kryształów.

Na przebieg procesu krystalizacji może mieć również wpływ sposób mieszania. Forma krystaliczna tworzy się zarówno przy stosowaniu mieszania jak i bez mieszania. Korzystnie krystalizację przeprowadza się jednak z mieszaniem. Mieszanie przyspiesza ujednolicenie składu mieszaniny w całej objętości podczas dodawania wody, co powoduje że uzyskany materiał krystaliczny jest bardziej jednorodny, a jego krystalizacja przebiega szybciej.

Czas krystalizacji zależy od szybkości rozcieńczania oraz od czasu potrzebnego na osiągnięcie stanu równowagi pomiędzy formą krystaliczną a rozpuszczonym białkiem. Im wolniejsze tempo rozcieńczania rozpuszczalnika organicznego i soli, tym większe uzyskuje się kryształy. Dlatego korzystne jest powolne dodawanie wody do mieszaniny.

P r z y k ł a d y

Dla lepszego zrozumienia jego istoty wynalazek został dodatkowo wyjaśniony na poniższych przykładach.

P r z y k ł a d 1

Do wodnego roztworu zawierającego białko o stężeniu ok. 8 mg/ml, izopropanol w stężeniu 20% i 0,5 M cytrynian sodu, o pH 8,5 i temperaturze ok. 20°C w ciągu 4 godzin dodawano porcjami wodę do końcowego stężenia białka wynoszącego ok. 4 mg/ml.

PL 238 016 B1

Uzyskano w ten sposób insulinę glargine w postaci krystalicznej. Otrzymane kryształy zostały przedstawione na Fig. 1, która prezentuje ich obraz mikroskopowy uzyskany za pomocą mikroskopu Nikon Eclipse 80i z obiektywem Nikon Plan Apo 100x/1.4.

P r z y k ł a d 2

Do wodnego roztworu zawierającego białko o stężeniu ok. 16 mg/ml, izopropanol w stężeniu 40% i 0,1 M cytrynian sodu, o pH 6,5 i temperaturze ok. 10°C w ciągu 2 godzin dodawano porcjami wodę do końcowego stężenia białka wynoszącego ok. 8 mg/ml.

Uzyskano w ten sposób insulinę glargine w postaci krystalicznej. Otrzymane kryształy zostały przedstawione na Fig. 2, która prezentuje ich obraz mikroskopowy uzyskany za pomocą mikroskopu Nikon Eclipse 80i z obiektywem Nikon Plan Apo 100x/1.4.

P r z y k ł a d 3

Kryształy z przykładu 2 odsączono, przemyto wodą i wysuszono próżniowo. Uzyskany osad odważono w ilości 77 mg i dodano 3 ml wody o pH ok. 3. Osad rozpuścił się dając klarowny roztwór o stężeniu ok. 25 mg/ml.

Claims (8)

1. Postać stała insuliny glargine bez zawartości cynku.

2. Postać insuliny glargine według zastrz. 1, znamienna tym, że ma postać krystaliczną.

3. Sposób otrzymywania postaci krystalicznej insuliny glargine, znamienny tym, że przygotowuje się mieszaninę krystalizacyjną stanowiącą wodny roztwór zawierający izopropanol, cytrynian sodu i insulinę glargine, a następnie przez stopniowe rozcieńczanie mieszaniny krystalizacyjnej inicjuje się i kontynuuje proces krystalizacji, po którego zakończeniu oddziela się otrzymaną postać krystaliczną insuliny glargine niezawierającą cynku.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że mieszanina w warunkach początkowych stanowi wodny roztwór następujących składników:

- insulina glargine w stężeniu 5 do 20 mg/ml,

- izopropanol w stężeniu od 20 do 40%,

- cytrynian sodu w stężeniu od 0,1 do 0,5 M.

5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się pH z zakresu od 6 do 9.

6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że krystalizację inicjuje się poprzez stopniowe dodawanie wody.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że rozcieńczanie prowadzi się do osiągnięcia wartości stężenia rozpuszczalnika organicznego poniżej 70% wartości jego stężenia w momencie inicjacji krystalizacji, korzystnie nie więcej niż 50% stężenia początkowego.

8. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że krystalizację prowadzi się w zakresie temperatur od 10°C do 20°C.