PL237896B1

PL237896B1 - Medium, in particular for amphibian cell, tissue and organ culture and method of amphibian cell, tissue and organ culture

Info

Publication number: PL237896B1
Application number: PL428393A
Authority: PL
Inventors: Rafał Piprek
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2018-12-31
Filing date: 2018-12-31
Publication date: 2021-06-14
Also published as: PL428393A1

Description

Substancje osmolarnie czynne występują w płynach tkankowych płazów w mniejszym stężeniu, co oznacza, że płyny tkankowe płazów są bardziej rozcieńczone niż w przypadku ssaków. Hodowla komórek czy tkanek płazów w pożywce tradycyjnej, dostosowanej osmolarnością do ssaków powoduje utratę wody z komórek, ich obkurczenie i zwiększa śmiertelność skracając maksymalny okres utrzymania komórek w warunkach in vitro. W pracach dotyczących hodowli komórek i tkanek płazów wykorzystuje się zazwyczaj mieszaninę pożywek L15 (Leibovitz, A.; Am. J. Hygiene 78: 173; 1963) i RPMI1640 (Moore, G.E., Gerner, R.E. i Franklin, H.A.; J.A.M.A., 199: 519; 1967), rozcieńczanych wodą do stężenia 66 lub 67% i suplementowanych surowicą FBS w stężeniu 10% obj. Osmolarności nierozcieńczonych pożywek L15 i RPM11640, przygotowanych zgodnie z zaleceniami producenta, wynoszą odpowiednio 310 i 280 mOsm/kg.Osmolar active substances are present in the tissue fluids of amphibians at a lower concentration, which means that the tissue fluids of amphibians are more diluted than in mammals. Cultivation of amphibian cells or tissues in a traditional medium, adapted to mammalian osmolarity, causes water loss from cells, shrinkage and increases mortality by shortening the maximum period of cell maintenance in in vitro conditions. Works involving the cultivation of amphibian cells and tissues typically use a mixture of L15 (Leibovitz, A .; Am. J. Hygiene 78: 173; 1963) and RPMI1640 (Moore, GE, Gerner, RE and Franklin, HA; JAMA, 199: 519; 1967), diluted with water to a concentration of 66 or 67% and supplemented with FBS serum at a concentration of 10% vol. The osmolarity of the undiluted L15 and RPM11640 media, prepared according to the manufacturer's recommendations, is 310 and 280 mOsm / kg, respectively.

Znany jest ze staniu techniki sposób hodowli komórek Xenopus tropicalis w pożywce składającej się z 67% obj. rozcieńczenia pożywki L15 w wodzie z dodatkiem 10% obj. serum płodowego cieląt FBS (Sinzelle et al.; Genesis 50: 316-324; 2012). Hodowlę prowadzi się w temp. 28°C.It is well known in the art to cultivate Xenopus tropicalis cells in a medium consisting of 67 vol. dilution of the L15 medium in water with the addition of 10% vol. FBS fetal calf serum (Sinzelle et al .; Genesis 50: 316-324; 2012). The cultivation is carried out at 28 ° C.

Znana jest również hodowla komórek płaza X. tropicalis w pożywce składającej się z 33,3 mL pożywki L15, 33,3 mL pożywki RPMI1640 z HEPES, 10 ml FBS z dodatkiem 1,33 mg/mL wodorowęglanu sodu, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM 2-merkaptoetanolu i 1000 U/mL LIF. Hodowlę komórek prowadzi się w 29,5°C w 5,5% atmosferze CO2 (TIapakova et al., Biol. Open 5: 12751282; 2016).It is also known to cultivate amphibian X. tropicalis cells in a medium consisting of 33.3 mL of L15 medium, 33.3 mL of RPMI1640 medium with HEPES, 10 ml of FBS with the addition of 1.33 mg / mL of sodium bicarbonate, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 1000 U / mL LIF. The cells are grown at 29.5 ° C in a 5.5% CO2 atmosphere (TIapakova et al., Biol. Open 5: 12751282; 2016).

Piprek et al. 2013 (Mech Dev 130: 613-627) ujawnił sposób hodowli narządów płazich przez 10-20 dni w 20°C, w pożywce składającej się z 33,3 mL pożywki L15, 33,3 mL pożywki RPMI1640, 26 mL wody i 6,65 mL FBS, której osmolarność wynosiła 185 mOsm/kg.Piprek et al. 2013 (Mech Dev 130: 613-627) disclosed a method of cultivating amphibian organs for 10-20 days at 20 ° C, in a medium consisting of 33.3 mL of L15 medium, 33.3 mL of RPMI1640 medium, 26 mL of water and 6, 65 mL FBS with an osmolarity of 185 mOsm / kg.

Znany jest również sposób hodowli komórek płazów w 66% obj. pożywki L15 z dodatkiem 10% obj. FBS według protokołu z Stukenberg Lab. (http://wiki.xenbase.org/xenwiki/index.php/Tissue_cul- ture_of_Xenopus_cell_lines _S3,_XTC_(Stukenberg_lab)).There is also a method of culturing amphibian cells in 66% vol. medium L15 with the addition of 10% vol. FBS according to the protocol from Stukenberg Lab. (http://wiki.xenbase.org/xenwiki/index.php/Tissue_cul- ture_of_Xenopus_cell_lines _S3, _XTC_ (Stukenberg_lab)).

Po rozcieńczeniu pożywek przeznaczonych pierwotnie do hodowli tkanek i komórek ssaków, celem dostosowania do hodowli komórek płazów, obniża się w sposób niepożądany stężenie niektórych substancji, przez co substancje te nie działają. To wskazuje, że samo rozcieńczenie pożywki nie zapewni dobrych warunków dla hodowli komórek i narządów płazów. W rzeczywistości konieczne jest jedynie rozcieńczenie składników osmotycznie czynnych, takich jak sole mineralne.When the media originally intended for the cultivation of mammalian tissues and cells is diluted to suit amphibian cell culture, the concentration of certain substances is undesirably lowered, making these substances ineffective. This indicates that dilution of the medium alone will not provide good conditions for the cultivation of amphibian cells and organs. In fact, it is only necessary to dilute osmotically active ingredients such as mineral salts.

Celem wynalazku było zatem stworzenie pożywki rozcieńczonej względem pożywek tradycyjnych, ale o niektórych składnikach dostosowanych stężeniem do wymogów komórek płazich, aby ciągle wykazywały działanie. Wynalazek opiera się na wykorzystaniu substancji z pożywek L15 i RPMI1640 z modyfikowaniem składu celem dokładnego dostosowania aminokwasów, witamin i substancji dodatkowych do wymogów komórek płazich.The aim of the invention was therefore to create a medium diluted in relation to traditional mediums, but with some components adjusted in concentration to the requirements of amphibian cells, so that they would still be effective. The invention is based on the use of substances from L15 and RPMI1640 media with modification of the composition in order to fine-tune amino acids, vitamins and additives to the requirements of amphibian cells.

Pożywka zwłaszcza do hodowli komórek płazich według wynalazku osmolarności między 180 a 200 mOsm/kg zawiera sole nieorganiczne, źródło węgla, aminokwasy i witaminy. Pożywka zawiera L-alaninę w ilości 0,11 g/L i L-argininę w ilości 0,35 g/L i L-asparaginę w ilości 0,15 g/L i L-cysteinę w ilości 0,09 g/L i L-glutaminę w ilości 0,3 g/L i glicynę w ilości 0,1 g/L i L-histydynę w ilości 0,13 g/L i L-izoleucynę w ilości 0,09 g/L i L-leucynę w ilości 0,09 g/L i L-lizynę w ilości 0,07 g/L i L-metioninę w ilości 0,045 g/L i L-fenyloalaninę w ilości 0,07 g/L i L- serynę ilości 0,115 g/L i L-treoninę w ilości 0,16 g/L i L-tryptofan w ilości 0,013 g/L i L-tyrozynę w ilości 0,164 g/L i L-walinę w ilości 0,06 g/L i kwas L-asparaginowy w ilości 0,01 g/L i kwas L-glutaminowy w ilości 0,01 g/L i L-hydroksyprolinę w ilości co najmniej 0,01 g/L.The medium especially for the cultivation of amphibian cells according to the invention with an osmolarity between 180 and 200 mOsm / kg contains inorganic salts, a carbon source, amino acids and vitamins. The medium contains L-alanine in the amount of 0.11 g / L and L-arginine in the amount of 0.35 g / L and L-asparagine in the amount of 0.15 g / L and L-cysteine in the amount of 0.09 g / L and L-glutamine in the amount of 0.3 g / L and glycine in the amount of 0.1 g / L and L-histidine in the amount of 0.13 g / L and L-isoleucine in the amount of 0.09 g / L and L-leucine in the amount of 0.09 g / L and 0.07 g / L L-lysine and 0.045 g / L L-methionine and 0.07 g / L L-phenylalanine and 0.115 g / L L-serine and L-threonine at 0.16 g / L and L-tryptophan at 0.013 g / L and L-tyrosine at 0.164 g / L and L-valine at 0.06 g / L and L-aspartic acid in in an amount of 0.01 g / L and L-glutamic acid in an amount of 0.01 g / L and L-hydroxyproline in an amount of at least 0.01 g / L.

Korzystnie, pożywka zawiera L-alanyl-L-glutaminy w ilości co najmniej 0,34 g/L, korzystnie 0,43 g/L.Preferably, the medium comprises L-alanyl-L-glutamine in an amount of at least 0.34 g / L, preferably 0.43 g / L.

Korzystnie, jako źródło węgla pożywka zawiera glukozę w ilości co najmniej 1 g/L, korzystnie 1,5 g/L.Preferably, as the carbon source, the medium contains glucose in an amount of at least 1 g / L, preferably 1.5 g / L.

Korzystnie, jako źródło węgla pożywka zawiera glutation, korzystnie w ilości co najmniej 0,4 g/L.Preferably, the medium contains glutathione as the carbon source, preferably in an amount of at least 0.4 g / L.

Korzystnie, pożywka zawiera źródło żelaza, korzystnie azotan żelaza (III), korzystnie w ilości co najmniej 0,0001 g/L.Preferably, the medium contains an iron source, preferably iron (III) nitrate, preferably in an amount of at least 0.0001 g / L.

Korzystnie, pożywka zawiera pirogronian sodu, korzystnie w ilości co najmniej 0,25 g/L.Preferably, the medium contains sodium pyruvate, preferably in an amount of at least 0.25 g / L.

PL 237 896 B1PL 237 896 B1

Korzystnie, pożywka zawiera witaminy w stężeniach odpowiadających ich stężeniom w osoczu komórek płazich.Preferably, the medium contains vitamins at concentrations corresponding to those in the plasma of amphibian cells.

Korzystnie, pożywka zawiera chlorek choliny w ilości od 0,0016 do 0,0024 g/L, mononukleotyd flawinowy w ilości od 0,00008 do 0,00012 g/L, kwas foliowy w ilości od 0,0008 do 0,0012 g/L, myoinozytol w ilości od 0,0148 do 0,0222 g/L, nikotynamid w ilości od 0,0008 do 0,0012 g/L, kwas pantotenowy w ilości od 0,00056 do 0,00084 g/L, pirydoksynę w ilości od 0,0008 do 0,0012 g/L, D-biotynę w ilości od 0,00016 do 0,00024 g/L, kobalaminę w ilości od 0,000004 g/L do 0,000006 g/L, kwas p-aminobenzoesowy w ilości od 0,0008 do 0,0012 g/L oraz ryboflawinę w ilości od 0,00016 do 0,00024 g/L.Preferably, the medium contains choline chloride from 0.0016 to 0.0024 g / L, flavin mononucleotide from 0.00008 to 0.00012 g / L, folic acid from 0.0008 to 0.0012 g / L. L, myoinositol in an amount from 0.0148 to 0.0222 g / L, nicotinamide in an amount from 0.0008 to 0.0012 g / L, pantothenic acid in an amount from 0.00056 to 0.00084 g / L, pyridoxine in the amount of 0.0008 to 0.0012 g / L, D-biotin 0.00016 to 0.00024 g / L, cobalamin 0.000004 g / L to 0.000006 g / L, acid p -aminobenzoic acid in an amount from 0.0008 to 0.0012 g / L and riboflavin in an amount from 0.00016 to 0.00024 g / L.

Korzystnie, pożywka zawiera chlorek choliny w ilości 0,002 g/L, mononukleotyd flawinowy w ilości 0,0001 g/L, kwas foliowy w ilości 0,001 g/L, myo-inozytol w ilości 0,0185 g/L, nikotynamid w ilości 0,001 g/L, kwas pantotenowy w ilości 0,0007 g/L, pirydoksynę w ilości 0,001 g/L, D-biotynę w ilości 0,0002 g/L, kobalaminę w ilości 0,000005, kwas p-aminobenzoesowy w ilości 0,001 g/L oraz ryboflawinę w ilości 0,0002 g/L.Preferably, the medium contains 0.002 g / L choline chloride, 0.0001 g / L flavin mononucleotide, 0.001 g / L folic acid, 0.0185 g / L myo-inositol, 0.001 g nicotinamide. / L, pantothenic acid 0.0007 g / L, pyridoxine 0.001 g / L, D-biotin 0.0002 g / L, cobalamin 0.000005, p-aminobenzoic acid 0.001 g / L and riboflavin in the amount of 0.0002 g / L.

Korzystnie, pożywka zawiera tiaminę, korzystnie w ilości co najmniej 0,0005 g/L.Preferably, the medium contains thiamine, preferably in an amount of at least 0.0005 g / L.

Korzystnie, pożywka zawiera HEPES, korzystnie w ilości 2,38 g/L.Preferably the medium comprises HEPES, preferably 2.38 g / L.

Korzystnie, pożywka zawiera FBS, korzystnie w ilości 6,7% obj.Preferably, the medium comprises FBS, preferably in an amount of 6.7 vol.%.

Korzystnie, pożywka zawiera agar, korzystnie w ilości 20 g/L.Preferably, the medium comprises agar, preferably in an amount of 20 g / L.

Sposób hodowli komórek lub tkanek lub narządów płazich według wynalazku polega na tym, że komórki lub tkanki lub narządy płazie hoduje się w pożywce według wynalazku, w atmosferze od 3 do 5% CO2.The method of culturing amphibian cells or tissues or organs according to the invention consists in culturing the amphibian cells or tissues or organs in the medium according to the invention in an atmosphere of 3 to 5% CO2.

Korzystnie komórki nieadherentne hoduje się w pożywce zawierającej FBS, korzystnie w ilości 6,7% obj.Preferably, non-adherent cells are grown in a medium containing FBS, preferably in an amount of 6.7 vol.%.

Korzystnie, komórki adherentne hoduje się w pożywce zawierającej agar, korzystnie w ilości 20 g/L.Preferably, adherent cells are grown in an agar-containing medium, preferably at a rate of 20 g / L.

Korzystnie, tkankę lub narząd hoduje się w naczyniu zawierającym na dnie warstwę pożywki zawierającej agar, korzystnie w ilości 20 g/L, i umieszczoną na niej warstwę pożywki zawierającej FBS, korzystnie w ilości 6,7% obj., w której to warstwie pożywki zawierającej FBS, umieszcza się tkankę lub narząd.Preferably, the tissue or organ is grown in a vessel having a bottom layer of agar-containing medium, preferably 20 g / L, and a layer of FBS-containing medium, preferably 6.7 vol.% At the bottom, in which layer of medium containing agar FBS, tissue or organ is placed.

Dzięki wykorzystaniu żelaza, korzystnie w postaci azotanu żelaza III, oraz tiaminy oraz wyeliminowaniu galaktozy z pożywki według wynalazku hodowla może trwać dłużej i uzyskuje się większą proliferację i mniejszą śmiertelność komórek. Brak jonów żelaza lub jego zbyt niskie stężenie w pożywkach dotychczas stosowanych prowadzi do wytwarzania nadtlenku wodoru, co bezpośrednio powoduje zwiększoną śmiertelność hodowanych komórek. Pożywki L15 i RPMI1640 nie zawierają związków żelaza, a surowica FBS ma ich zbyt mało. Użycie tiaminy pozytywnie wpływa na proliferację (podziały) komórek, co jest istotne dla uzyskania wzrostu liczby komórek w hodowli in vitro. Użycie L-alanylu-L-glutaminy obok glutaminy zmniejsza śmiertelność komórek, ponieważ w pierwszej kolejności komórki czerpią glutaminę, której jest coraz mniej z powodu jej szybkiego rozkładu, a po jej zaniku z pożywki komórki wykorzystują L-alanylu-L-glutaminy, który jest substancja długotrwałą. Użycie L-alanylu-L-glutaminy powoduje także mniejsze zanieczyszczenie amoniakiem wydalanym przez komórki.By using iron, preferably in the form of iron III nitrate, and thiamine, and by eliminating galactose from the medium according to the invention, cultivation can take longer and results in greater proliferation and lower cell death. The lack of iron ions or its too low concentration in the media used so far leads to the production of hydrogen peroxide, which directly causes increased mortality of the cultured cells. L15 and RPMI1640 media do not contain iron compounds and FBS serum has too little of them. The use of thiamine has a positive effect on cell proliferation (division), which is important for obtaining an increase in the number of cells in in vitro culture. The use of L-alanyl-L-glutamine in addition to glutamine reduces cell death, because first the cells consume glutamine, of which there is less and less due to its rapid degradation, and after its disappearance from the medium, the cells use L-alanyl-L-glutamine, which is long-term substance. The use of L-alanyl-L-glutamine also results in less ammonia contamination from cell excretion.

Zastosowanie pirogronianiu sodu jako źródła węgla obok glukozy zmniejsza stężenie nadtlenku wodoru, który niszczy komórki. Wykorzystanie glutationu wpływa pozytywnie na rozwój tkanek i narządów w warunkach in vitro.The use of sodium pyruvate as a carbon source in addition to glucose reduces the concentration of hydrogen peroxide which destroys cells. The use of glutathione has a positive effect on the development of tissues and organs in vitro.

Dodatkowo, można również zwiększyć stężenie czerwieni fenolowej w pożywce do poziomu stosowanego w pożywkach ssaczych (0,01 g/L). W pożywkach rozcieńczanych ze stanu techniki stężenie tego związku jest obniżone, co może wpłynąć na zmiany w zabarwieniu pożywki przy ustalaniu pH.Additionally, the concentration of phenol red in the medium can also be increased to the level used in mammalian media (0.01 g / L). In prior art dilution media, the concentration of this compound is lowered, which may result in changes in the color of the medium upon pH adjustment.

Pożywka według wynalazku umożliwia długoterminową hodowlę narządów - nawet do 30 dni, oraz uzyskanie wysokiej proliferacji komórek i obniżenie ich nekrozy w porównaniu z innymi pożywkami.The medium according to the invention enables the long-term cultivation of organs - even up to 30 days, and the achievement of high proliferation of cells and reduction of their necrosis compared to other media.

Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia liczbę komórek proliferujących i obumierających po 4 dniach hodowli w testowanej pożywce i w pożywkach kontrolnych wcześniej wykorzystywanych, Fig. 2 przedstawia liczbę komórek proliferujących i obumierających w gonadach hodowanych przez 10 dni w testowanej pożywce i w pożywkach kontrolnych wcześniej wykorzystywanych, Fig. 3 przedstawia schemat hodowli tkanki, wycinka lub narządu na agarze, Fig. 4 przedstawia maksymalnego okresu hodowli in vitro narządu w testowanej pożywce i w pożywkach kontrolnych wcześniej wykorzystywanych.The invention is illustrated in the embodiments in the drawing, in which Fig. 1 shows the number of cells proliferating and dying after 4 days of culture in the test medium and previously used control media, Fig. 2 shows the number of cells proliferating and dying in gonads grown for 10 days in the test medium and in previously used control media, Fig. 3 shows a scheme of tissue, slice or organ culture on agar, Fig. 4 shows the maximum period of in vitro cultivation of an organ in the test media and previously used control media.

PL 237 896 Β1PL 237 896 Β1

Przykład 1Example 1

Przygotowano pożywki o osmolarnościach 180, 185, 190, 195 i 200 mOsm/kg o składzie przedstawionym w Tabeli 1.Media with 180, 185, 190, 195 and 200 mOsm / kg osmolarity were prepared with the composition shown in Table 1.

Tabela 1. Skład pożywek o osmolarności 180, 185, 190, 195 i 200 mOsm/kgTable 1. Composition of media with 180, 185, 190, 195 and 200 mOsm / kg osmolarity

180 mOsm 180 mOsm 185 mOsm 185 mOsm 190 mOsm 190 mOsm 195 mOsm 195 mOsm 200 mOsm 200 mOsm Nazwa składnika Ingredient name Ilość składnika [g/L] Ingredient amount [g / L] Chlorek wapnia Calcium chloride 0,044 0.044 0,045 0.045 0,0465 0.0465 0,0477 0.0477 0,0489 0.0489 Chlorek magnezu Magnesium chloride 0,029 0.029 0,03 0.03 0,0312 0.0312 0,032 0.032 0,0328 0.0328 Bezw. siarczan magnezu Anless. sulfate magnesium 0,046 0.046 0,0475 0.0475 0,0488 0.0488 0,05 0.05 0,0514 0.0514 Chlorek potasu Potassium chloride 0,252 0.252 0,259 0.259 0,2666 0.2666 0,273 0.273 0,28 0.28 Bezw. diwodorofosforan potasu Anless. potassium dihydrogen phosphate 0,0189 0.0189 0,0195 0.0195 0,02 0.02 0,02 0.02 0,021 0.021 Chlorek sodu Sodium chloride 4,421 4.421 4,543 4.543 4,6666 4.6666 4,789 4.789 4,9122 4.9122

PL 237 896 Β1PL 237 896 Β1

Bezw. wodorofosforan sodu Anless. sodium hydrogen phosphate 0,03 0.03 0,321 0.321 0,33 0.33 0,339 0.339 0,347 0.347 Azotan wapnia x 4H₂OCalcium nitrate x 4H ₂ O 0,03 0.03 0,032 0.032 0,0332 0.0332 0,034 0.034 0,0346 0.0346 Azotan żelaza (III) x 9H2O Iron (III) nitrate x 9H2O 0,0001 0.0001 0,0001 0.0001 0,0001 0.0001 0,0001 0.0001 0,0001 0.0001 L-alanylu-Lglutaminy L-Alanyl-Lglutamine 0,43 0.43 0,43 0.43 0,43 0.43 0,43 0.43 0,43 0.43 L-Alanina L-Alanine 0,11 0.11 0,11 0.11 0,11 0.11 0,11 0.11 0,11 0.11 L-Arginina L-Arginine 0,35 0.35 0,35 0.35 0,35 0.35 0,35 0.35 0,35 0.35 L-Asparagninian L-Asparagnate 0,15 0.15 0,15 0.15 0,15 0.15 0,15 0.15 0,15 0.15 Kwas L- Asparaginowy L- acid Aspartic 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 L-Cysteina L-Cysteine 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 L-Glutamina L-Glutamine 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 Glicyna Glycine 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 L-Histydyna L-Histidine 0,13 0.13 0,13 0.13 0,13 0.13 0,13 0.13 0,13 0.13 Hyd roksy- L- Prol i na Hydroxy- L- Prol and na 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 L-Izoleucyna L-Isoleucine 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 L-Leucyna L-Leucine 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 0,09 0.09 L-Lizyna L-Lysine 0,07 0.07 0,07 0.07 0,07 0.07 0,07 0.07 0,07 0.07 L-Metionina L-Methionine 0,045 0.045 0,045 0.045 0,045 0.045 0,045 0.045 0,045 0.045 L-Fenyloalanina L-Phenylalanine 0,07 0.07 0,07 0.07 0,07 0.07 0,07 0.07 0,07 0.07 L-Prolina L-proline 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 L-Seryna L-Serine 0,115 0.115 0,115 0.115 0,115 0.115 0,115 0.115 0,115 0.115 L-Treonina L-Threonine 0,16 0.16 0,16 0.16 0,16 0.16 0,16 0.16 0,16 0.16 L-T ryptofan L-T rptophan 0,013 0.013 0,013 0.013 0,013 0.013 0,013 0.013 0,013 0.013 L-Tyrozyna L-Tyrosine 0,164 0.164 0,164 0.164 0,164 0.164 0,164 0.164 0,164 0.164 L-Walina L-Valine 0,06 0.06 0,06 0.06 0,06 0.06 0,06 0.06 0,06 0.06 Chlorek choliny Choline chloride 0,002 0.002 0,002 0.002 0,002 0.002 0,002 0.002 0,002 0.002 Mononukleotyd flawinowy Flavin mononucleotide 0,0001 0.0001 0,0001 0.0001 0,0001 0.0001 0,0001 0.0001 0,0001 0.0001 Kwas foliowy Folic acid 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001

PL 237 896 Β1PL 237 896 Β1

myo-inozytol myo-inositol 0,0185 0.0185 0,0185 0.0185 0,0185 0.0185 0,0185 0.0185 0,0185 0.0185 Nikotynamid Nicotinamide 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 Kwas pantotenowy Pantothenic acid 0,0007 0.0007 0,0007 0.0007 0,0007 0.0007 0,0007 0.0007 0,0007 0.0007 Pirydoksyna Pyridoxine 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 Fosforan tiaminy Thiamine Phosphate 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 D-Biotyna D-Biotin 0,0002 0.0002 0,0002 0.0002 0,0002 0.0002 0,0002 0.0002 0,0002 0.0002 Kobalamina Cobalamin 0,000005 0.000005 0,000005 0.000005 0,000005 0.000005 0,000005 0.000005 0,000005 0.000005 Kwas p- aminobenzoesowy Acid p- aminobenzoic 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 0,001 0.001 Ryboflawina Riboflavin 0,0002 0.0002 0,0002 0.0002 0,0002 0.0002 0,0002 0.0002 0,0002 0.0002 Tiamina Thiamine 0,0005 0.0005 0,0005 0.0005 0,0005 0.0005 0,0005 0.0005 0,0005 0.0005 D-glukoza D-glucose 1,5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1,5 1.5 1,5 1.5 Pirogronian sodu Sodium pyruvate 0,25 0.25 0,25 0.25 0,25 0.25 0,25 0.25 0,25 0.25 Glutation Glutathione 0,0004 0.0004 0,0004 0.0004 0,0004 0.0004 0,0004 0.0004 0,0004 0.0004 Czerwień fenolowa Phenol red 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 0,01 0.01 Wodorowęglan Sodu Sodium bicarbonate 1.5 1.5 1,5 1.5 1,5 1.5 1,5 1.5 1,5 1.5 HEPES HEPES 2,38 2.38 2,38 2.38 2,38 2.38 2,38 2.38 2,38 2.38

Po 7 dniach hodowli in vitro w pożywkach, komórki obserwowano pod mikroskopem. Morfologia komórek była prawidłowa, nie odnaleziono komórek obkurczonych lub o zwiększonej średnicy. Wśród komórek hodowanych w pożywce o osmolarności 190 mOsm/kg stwierdzono najmniejszą ilość komórek obumierających po 10 dniach hodowli in vitro.After 7 days of in vitro culture in media, cells were observed under a microscope. Cell morphology was normal, no contracted or enlarged cells were found. Among the cells grown in a medium with an osmolarity of 190 mOsm / kg, the lowest number of cells dying after 10 days of in vitro culture was found.

Przykład 2Example 2

Pożywkę o osmolarności 190 mOsm/kg z przykładu 1 (pożywka testowana) zastosowano do hodowli in vitro komórek izolowanych enzymatycznie z wątroby płaza Xenopus laevis. Komórki hodowane były w testowanej pożywce i w pożywkach kontrolnych wcześniej wykorzystywanych:The 190 mOsm / kg osmolarity medium of Example 1 (test medium) was used to culture cells enzymatically isolated from the liver of Xenopus laevis amphibians in vitro. The cells were cultured in the tested medium and in control media previously used:

T - pożywka testowanaT - tested medium

A - (67% L15 + 10% FBS) (z publikacji Sinzelle et al. 2012);A - (67% L15 + 10% FBS) (from Sinzelle et al. 2012);

B - (33,3 mL L15, 33,3 mL RPMI1640+HEPES + 10%FBS + 1,33 mg/MI wodorowęglanu sodu + 1 mM pirogronian sodu) (z publikacji Tlapakova et al. 2016);B - (33.3 mL L15, 33.3 mL RPMI1640 + HEPES + 10% FBS + 1.33 mg / MI sodium bicarbonate + 1 mM sodium pyruvate) (from Tlapakova et al. 2016);

C - (66% L15 + 10%FBS) (wg Stukenberg Lab);C - (66% L15 + 10% FBS) (by Stukenberg Lab);

D - (33,3 mL L15, 33,3 mL RPMI1640+HEPES + 6,65%FBS + 26 mL wody) (wg Piprek et al. 2013).D - (33.3 mL L15, 33.3 mL RPMI1640 + HEPES + 6.65% FBS + 26 mL water) (according to Piprek et al. 2013).

Po 4 dniach hodowli w temp 28°C w 5% CO2 oznaczono liczbę komórek proliferujących (obecność białka PCNA) i nekrotycznych (fluorescencja jodku propidyny) metodą cystometrii przepływowej.After 4 days of cultivation at 28 ° C in 5% CO2, the number of proliferating (PCNA protein) and necrotic (propidium iodide fluorescence) cells was determined by flow cystometry.

Wyniki pokazały, że hodowla komórek w pożywce testowanej (T) daje lepsze efekty hodowli (większa liczba komórek dzielących się - proliferujących i niższa liczba komórek obumierających - nekrotycznych).The results showed that culturing the cells in the test medium (T) gave better culture results (higher number of dividing - proliferating cells and lower number of dying - necrotic cells).

Przykład 3Example 3

Pożywkę o osmolarności 190 mOsm/kg z przykładu 1 (pożywka testowana) zastosowano do hodowli in vitro in vitro narządów - gonad izolowanych z kijanek X. Iaevis w pożywce testowej (T) i w pożywkach wcześniej stosowanych:The 190 mOsm / kg osmolarity medium from Example 1 (test medium) was used for in vitro cultivation of organs - gonads isolated from X. Iaevis tadpoles in test medium (T) and previously used media:

T - pożywka testowanaT - tested medium

PL 237 896 B1PL 237 896 B1

C - (66% L15 + 10% FBS) (wg Stukenberg Lab);C - (66% L15 + 10% FBS) (by Stukenberg Lab);

Przeprowadzono izolację gonad, płukanie w 6,66% PBS i hodowlę w szalce Petriego wysłanej 2% agarem (agar 2% w pożywce bez FBS). Szalkę przygotowano poprzez rozpuszczenie agaru (2 g/100 mL) w pożywce bez FBS, przez krótkie zagotowanie w kuchence mikrofalowej. Następnie wlano ciepły płynny agar na dno szalki Petriego, tak by utworzył cienką warstwę i równomiernie pokrył dno szalki. Po wystygnięciu agaru nalano na warstwę agaru pożywkę z FBS i wstawiono tak przygotowaną szalkę na 1 godzinę do inkubatora CO2 dla zrównoważenia warunków środowiska. Po minimum 1 godzinie umieszczono gonady na agarze i wyrównano ilość płynnej pożywki, tak by górna powierzchnia preparatu była na poziomie granicy faz medium-powietrze. Gonady hodowano w temp. 28°C w 95%/5% O2/CO2, pożywkę zmieniając co 2 dni.Gonadal isolation, washing in 6.66% PBS and growth in a petri dish shipped with 2% agar (2% agar in medium without FBS) were performed. A dish was prepared by dissolving agar (2 g / 100 mL) in FBS-free medium by boiling briefly in a microwave oven. Warm liquid agar was then poured onto the bottom of the Petri dish so that it would form a thin layer and evenly cover the bottom of the dish. After the agar had cooled down, the FBS medium was poured over the agar layer and the prepared dish was placed in the CO2 incubator for 1 hour to balance the environmental conditions. After a minimum of 1 hour, the gonads were placed on the agar and the amount of liquid medium was equalized so that the upper surface of the preparation was at the medium-air interface. Gonads were grown at 28 ° C in 95% / 5% O2 / CO2, the medium was changed every 2 days.

Po 10 dniach hodowli gonady były zamrażane w ciekłym azocie i krojone na skrawki mrożeniowe. Metodą immunofluorescencyjną została zbadana liczba komórek proliferujących (obecność białka PCNA) i komórek nekrotycznych (inkorporacja jodku propidyny). Wyniki pokazały najsilniejszą proliferację komórek i najniższy poziom nekrozy w gonadach hodowanych w pożywce testowej w porównaniu z pożywkami kontrolnymi.After 10 days of cultivation, the gonads were frozen in liquid nitrogen and cut into chill sections. The number of proliferating cells (presence of PCNA protein) and necrotic cells (propidium iodide incorporation) was examined by immunofluorescence method. The results showed the strongest cell proliferation and the lowest level of necrosis in gonads grown in the test medium compared to the control media.

P r z y k ł a d 4P r x l a d 4

Pożywkę o osmolarności 190 mOsm/kg z przykładu 1 (pożywka testowana) zastosowano do hodowli in vitro narządu w celu wyznaczenia maksymalnego okresu hodowli in vitro narządu (gonady kijanki X. laevis) do momentu, w którym liczba komórek nekrotycznych (znakowanych jodkiem propidyny) przekroczyła liczbę komórek proliferujących (PCNA-pozytywne). Pomiaru dokonano zliczając komórki na preparatach immunofluorescencyjnych, jak w Przykładzie 3.The 190 mOsm / kg osmolarity medium from Example 1 (test medium) was used for in vitro cultivation of the organ to determine the maximum period of in vitro cultivation of the organ (X. laevis tadpole gonads) until the number of necrotic cells (labeled with propidium iodide) exceeded the number of proliferating cells (PCNA positive). Measurement was made by counting cells on immunofluorescent slides as in Example 3.

Użyto pożywki:Nutrient medium used:

T - pożywka testowanaT - tested medium

B - (33,3 mL L15, 33,3 mL RPMI1640+HEPES + 10% FBS + 1,33 mg/MI wodorowęglanu sodu + 1 mM pirogronian sodu) (z publikacji Tlapakova et al. 2016);B - (33.3 mL L15, 33.3 mL RPMI1640 + HEPES + 10% FBS + 1.33 mg / MI sodium bicarbonate + 1 mM sodium pyruvate) (from Tlapakova et al. 2016);

Eksperyment wykazał, że pożywka testowana umożliwia przeprowadzenie hodowli in vitro przez najdłuższy okres czasu (do 30 dni).The experiment showed that the tested medium enables in vitro cultivation for the longest period of time (up to 30 days).

Claims

1. A medium especially for the cultivation of amphibian cells with an osmolarity between 180 and 200 mOsm / kg, containing inorganic salts, a carbon source, amino acids and vitamins, characterized in that it contains L-alanine in an amount of 0.11 g / L and L-arginine in 0.35 g / L and 0.15 g / L L-asparagine and 0.09 g / L L-cysteine and 0.3 g / L L-glutamine and 0.1 g / L glycine g / L and L-histidine 0.13 g / L and L-isoleucine 0.09 g / L and L-leucine 0.09 g / L and L-lysine 0.07 g / L L and L-methionine in the amount of 0.045 g / L and L-phenylalanine in the amount of 0.07 g / L and L-serine in the amount of 0.115 g / L and L-threonine in the amount of 0.16 g / L and L-tryptophan in the amount of 0.013 g / L and L-tyrosine in the amount of 0.164 g / L and L-valine in the amount of 0.06 g / L and L-aspartic acid in the amount of 0.01 g / L and L-glutamic acid in the amount of 0.01 g / L and L-hydroxyproline in an amount of at least 0.01 g / L.

2. The medium according to claim 1 The composition of claim 1, wherein the L-alanyl-L-glutamine is present in an amount of at least 0.34 g / L, preferably 0.43 g / L.

3. The medium according to claim 1 2. The process according to claim 1 or 2, characterized in that the carbon source is glucose in an amount of at least 1 g / L, preferably 1.5 g / L.

4. The medium according to claim 1 The carbon source of claim 1, 2 or 3, wherein the carbon source is glutathione, preferably in an amount of at least 0.4 g / L.

5. The medium according to any one of claims 1 to 5; A composition according to any of the claims 1-4, characterized in that it contains an iron source, preferably iron (III) nitrate, preferably in an amount of at least 0.0001 g / L.

6. A medium according to any one of claims 1-7; 1-5, characterized in that it contains sodium pyruvate, preferably in an amount of at least 0.25 g / L.

PL 237 896 B1

The medium of any one of claims 1-7; A composition according to any of the claims 1-6, characterized in that it contains vitamins in concentrations corresponding to those in plasma of amphibian cells.

8. A medium according to any one of claims 1-8 1-7, characterized in that it contains choline chloride in an amount from 0.0016 to 0.0024 g / L, flavin mononucleotide in an amount from 0.00008 to 0.00012 g / L, folic acid in an amount from 0.0008 to 0.0012 g / L, myo-inositol in an amount from 0.0148 to 0.0222 g / L, nicotinamide in an amount from 0.0008 to 0.0012 g / L, pantothenic acid in an amount from 0.00056 to 0, 00084 g / L, pyridoxine in an amount from 0.0008 to 0.0012 g / L, D-biotin in an amount from 0.00016 to 0.00024 g / L, cobalamin in an amount from 0.000004 g / L to 0, 000006 g / L, p-aminobenzoic acid from 0.0008 to 0.0012 g / L and riboflavin from 0.00016 to 0.00024 g / L.

9. The medium according to claim 1 8, characterized in that it contains choline chloride in the amount of 0.002 g / L, flavin mononucleotide in the amount of 0.0001 g / L, folic acid in the amount of 0.001 g / L, myo-inositol in the amount of 0.0185 g / L, nicotinamide in the amount of 0.001 g / L, pantothenic acid 0.0007 g / L, pyridoxine 0.001 g / L, D-biotin 0.0002 g / L, cobalamin 0.000005, p-aminobenzoic acid 0.001 g / L and riboflavin in the amount of 0.0002 g / L.

10. The medium according to claim 1 The pharmaceutical composition according to claim 8 or 9, characterized in that it contains thiamine, preferably in an amount of at least 0.0005 g / L.

11. The medium according to any one of claims 1 to 11; 1-10, characterized in that it contains HEPES, preferably in an amount of 2.38 g / L.

12. The medium according to any one of claims 1 to 12, % V / V, characterized in that it contains FBS, preferably in an amount of 6.7 vol.%.

13. The medium of any one of claims 1 to 13, A food according to any one of the preceding claims, containing agar, preferably in an amount of 20 g / L.

14. A method of culturing amphibian cells or tissues or organs, characterized in that the amphibian cells or tissues or organs are cultivated in a medium as defined in any one of claims 1-7. 1-13, in an atmosphere of 3 to 5% CO2.

15. The method according to p. 14, characterized in that non-adherent cells are cultivated in a medium according to claim 14, 12.

16. The method according to p. The method of claim 14, wherein the adherent cells are grown in a medium according to claim 14, 13.

17. The method according to p. The method of claim 14, wherein the tissue or organ is grown in a vessel containing a medium layer on the bottom according to claim 14, wherein the tissue or organ is grown. 13, and a medium layer according to claim 13 thereon. The nutrient layer of claim 12, wherein the nutrient layer of claim 12 is 12 the tissue or organ is placed, preferably such that the upper surface of the tissue or organ is at the medium-air interface.

18. The method according to p. The method of claim 17, wherein the tissue or organ is grown at 28 ° C, changing the medium every 2 days.