PL226806B1

PL226806B1 - Preparaty peptydowe oraz peptydy odziałaniu przeciwnowotworowym

Info

Publication number: PL226806B1
Application number: PL393153A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Lipkowski; Sergiusz Markowicz
Original assignee: Inst Medycyny Doświadczalnej I Klinicznej Im Mirosława Mossakowskiego Pan
Priority date: 2010-12-06
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2017-09-29
Also published as: WO2012078060A2; WO2012078060A3; US9365633B2; PL393153A1; US20140315824A1; EP2649089A2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są preparaty peptydowe otrzymywane w wyniku trawienia enzymatycznego włosów, wełny, szczeciny, futra zwierzęcego oraz indywidualne peptydowe o sekwencjach odpowiadających poszczególnym składnikom preparatów peptydowych o działaniu przeciwnowotworowym do zastosowania w leczeniu nowotworów lub profilaktyce onkologicznej jako składnik podstawowy lub składnik kompozycji substancji leczących nowotwory lub składnik substancji stosowanych w profilaktyce onkologicznej zapobiegającej nowotworzeniu.

Powszechnie przyjmuje się, że włosy, futro, szczecina stanowi naturalną ochronę fizyczną organizmu jako ochrona mechaniczna urazów oraz ochrona termiczna zapobiegająca nadmiernemu przegrzaniu i/lub ochłodzeniu organizmu. Jednakże pomimo dużej odporności na naturalne czynniki rozkładające włosy, futro lub szczecinę, istnieje możliwość rozkładu ich składowych białek przez enzymy kolonizujących skórę bakterii lub grzybów jak również enzymów endogennych wydzielanych z potem. Obserwuje się również, że zwierzęta zlizują i połykają swoje futro, które może ulegać częściowej degradacji w przewodzie pokarmowym wydzielając odpowiednie fragmenty peptydowe. Podjęto więc poszukiwania biologicznej roli peptydów wchodzących w skład włosów, futra lub szczeciny. W patencie WO 03/064449 opisano i zastrzeżono zastosowanie aktywnych peptydów pochodzących z białek włosów lub wełny w gojeniu ran. Nasze badania nad przetwarzaniem włosów lub futra lub szczeciny pozwoliły na opracowanie oryginalnej metody przetwarzania z zastosowaniem aktywacji chemicznej i następnie trawieniem enzymatycznym z zastosowaniem pepsyny. Metoda ta została opisana i zastrzeżona w roku 1995 przez B. Baranowską, A.W. Lipkowskiego, E. Marczak, I. Makulec, H. Rybak, J. Pastuszak, „Sposób aktywacji surowców keratynowych przed hydrolizą enzymatyczną, Polski Patent Nr 179342.

Badając działanie biologiczne preparatów uzyskane w wyniku trawienia enzymatycznego surowców z włosów lub wełny lub futra zwierzęcego wstępnie aktywowanych działaniem alkaliów, nieoczekiwanie okazało się, że preparaty te wykazują istotne działanie przeciwnowotworowe na nowotwory różnej etiologii. Dalsza analiza peptydów wchodzących w skład preparatów wykazała, że indywidualne peptydy składowe wykazują również działanie przeciwnowotworowe. Dlatego też preparaty peptydowe otrzymywane w wyniku odpowiedniego trawienia włosów lub wełny lub futra zwierzęcego mogą być stosowane jako związki aktywne w leczeniu nowotworów lub zapobieganiu nowotworzeniu lub stanowiące składniki substancji leczących lub profilaktycznych.

Dla lepszego zilustrowania przedmiotowego wynalazku ilustrującego działanie przeciwnowotworowe otrzymywanych preparatów lub indywidualnych składowych peptydów przedstawiono przykłady ich działania. Nie należy jednak ograniczać zakresu wynalazku jedynie do treści poniższych przykładów.

P r z y k ł a d 1.

Włosy otrzymane od mężczyzny w wieku 60 lat aktywowano i hydrolizowano pepsyną według sposobu opisanego przez A.W. Lipkowskiego, B. Gajkowską, A. Grabowską, K. Kurzepaę, w artykule p.t. „Keratin-associated protein micromaterials for medical and cosmetic applications.” w piśmie Polimery, wol. 54, str. 386-388, w roku 2009. Część rozpuszczoną w wyniku trawienia pepsyną zliofilizowano otrzymując preparat do dalszych badań. Analiza peptydów w preparacie wykazała obecność peptydów o sekwencjach podanych w tabeli oraz większe peptydy zawierające sekwencje podane w tabeli.

T a b e l a.

Lp.	Zidentyfikowane sekwencje krótkich peptydów w preparacie otrzymanym z włosów ludzkich (reszty aminokwasowe podane w standardowym kodzie jednoliterowym)
1	2
1	AEIRSDL
2	VVQIDNAKL
3	LVVQIDNAKL
4	NKQVVSSSEQL
5	LNKQVVSSSEQL

PL 226 806 B1 cd. tabeli

1	2
6	RQLVESDINGL
7	TESEARYSSQL
8	VVQIDNAKLAADDF
9	NRVLNETRSQYEAL
10	NKQVVSSSEQLQSYQAEIIELR
11	NKQVVSSSEQLQSYQAEIIEL
12	LNKQVVSSSEQLQSYQAEIIEL
13	VVNIDNAKL
14	NKQVVSSSEQL
15	LNKQVVSSSEQL
16	NVEVDTAPTVDL
17	VVNIDNAKLASDDF
18	VVEIDNAKL
19	IQEIDF
20	IDKVRF
21	LEQQNKL
22	ASELNHVQEVL
23	NQQVVSSSEQL
24	NQQVVSSSEQL
25	RQLVESDINGL
26	VVEIDNAKLAADDF
27	IVQIDNAKLAADDF
28	TVIFDTGSSNL
29	GILGPVIKAEVGDTL
30	IQEIDF
31	IDKVRF
32	VVQIDNAKL
33	AEIRSDL
34	AEIRSDLE
35	AEIRSDL
36	VVQIDNAKLA

PL 226 806 B1 cd. tabeli

1	2
37	VVQIDNAKL
38	NETRSQYEAL
39	NKQVVSSSEQLQ
40	NKQVVSSSEQL
41	LNKQVVSSSEQL
42	RQLVESDINGL
43	VVQIDNAKLAADDF
44	SQVQSLITNVESQL
45	SQVQSLITNVESQLA
46	NRVLNETRSQYEALV
47	NRVLNETRSQYEAL
48	LNRVLNETRSQYEAL
49	NKQVVSSSEQLQSYQAEIIEL
50	NKQVVSSSEQLQSYQAEIIELR
51	AEIRSDLE
52	AEIRSDL
53	LAEIRSDL
54	VVQIDNAKLA
55	VVQIDNAKL
56	NETRSQYEALV
57	NKQVVSSSEQLQ
58	NKQVVSSSEQL
59	LNKQVVSSSEQL
60	RQLVESDINGL
61	SQVQRLITNVESQLA
62	SQVQRLITNVESQL
63	NQVLNETRSQYEALV
64	LNQVLNETRSQYEAL
65	NQVLNETRSQYEAL
66	NKQVVSSSEQLQSYQAEIIELR
67	NKQVVSSSEQLQSYQAEIIEL
68	VVNIDNAKLA

PL 226 806 B1 cd. tabeli

1	2
69	VVNIDNAKL
70	NETRSQYEALV
71	NKQVVSSSEQLQ
72	NKQVVSSSEQL
73	LNKQVVSSSEQL
74	VVNIDNAKLASDDF
75	SQVQSLITNVESQLA
76	SQVQSLITNVESQL
77	NQVLNETRSQYEALV
78	LNQVLNETRSQYEAL
79	NQVLNETRSQYEAL
80	LGRVTIAQGGVL
81	PKKTESHHKAKGK
82	IDKVRF
83	LEQQNKL
84	RATAENEF
85	IREYQEVMNSKLGL
86	QNQLEKLG
87	LQNQLEKL
88	QNQLEKL
89	LGKVTIAQGGVLP
90	PKKTESHHKAKGK
91	YRPWGSGSGFG
92	YRPWGSGSGF
93	ERIAGEASRL
94	AKHAVSEGTKAVTKYTSSK
95	DRANNQVGLAPVA
96	FDRANNQVGLAPVA
97	IGGITGPIAKL
98	MEARGPGELC
99	MEARGPGELC
100	IERIPEL

PL 226 806 B1 cd. tabeli

1	2
101	TVIFDTGSSNL
102	LIPWVQKPIIF
103	GKEPLGPAL
104	IVNTNVPRASVPDGF
105	MALPVTAL
106	KVGINYQPPTVVPGGDL
107	IDTSRHYLPVKIIL
108	LGRIPSAVGYQPTL
109	VINGNPITIF
110	MKSCGVSL

Preparat dodano w stężeniu 0,1% do hodowlanej pożywki komórek nowotworowych. Równolegle prowadzono hodowlę kontrolną w identycznych warunkach, ale bez dodatku preparatu. Hodowle prowadzono przez określoną liczbę dni, w warunkach typowych. Płyn hodowlany wymieniano codziennie zarówno w hodowli kontrolnej jak i w hodowli badanej z preparatem. W hodowli badanej, każdorazowo wymieniany płyn hodowlany zawierał 0,1% preparatu. Po siedmiu dniach zliczono ilość komórek w hodowli kontrolnej i badanej. Okazało się, że w przypadku komórek czerniaka ludzkiego w hodowli kontrolnej w ciągu 7 dni liczba komórek wzrosła 20 krotnie. Natomiast w hodowli badanej z dodatkiem 0,1% preparatu liczba komórek pozostała na poziomie równym liczbie komórek w dniu rozpoczęcia hodowli. W przypadku czterodniowej hodowli komórek nowotworowych pęcherza moczowego dodatek 0,1% preparatu do hodowli spowodowało spowolnienie przyrostu komórek do 70% komórek w hodowli kontrolnej. W przypadku chłoniaka ludzkiego w czterodniowej hodowli dodatek 0,1% preparatu spowodował spowolnienie proliferacji komórek do 35% liczby komórek zliczanych w hodowli kontrolnej.

P r z y k ł a d 2.

Włosy otrzymane od kobiety w wieku 28 lat aktywowano i hydrolizowano pepsyną według sposobu opisanego w Przykładzie I. Część rozpuszczoną w wyniku trawienia pepsyną zliofilizowano otrzymując preparat do dalszych badań. Preparat dodano w stężeniu 0,1% do hodowlanej pożywki komórek nowotworowych. Równolegle prowadzono hodowlę kontrolną w identycznych warunkach, ale bez dodatku preparatu. Hodowle prowadzono przez określoną liczbę dni, w warunkach typowych. Płyn hodowlany wymieniano codziennie zarówno w hodowli kontrolnej jak i w hodowli badanej z preparatem. W hodowli badanej, każdorazowo wymieniany płyn hodowlany zawierał 0,1% preparatu. Po siedmiu dniach zliczono ilość komórek w hodowli kontrolnej i badanej. Okazało się, że w przypadku komórek czerniaka ludzkiego w hodowli kontrolnej w ciągu 7 dni liczba komórek wzrosła 20 krotnie. Natomiast w hodowli badanej z dodatkiem 0,1% preparatu liczba komórek pozostała na poziomie równym liczbie komórek w dniu rozpoczęcia hodowli. W przypadku czterodniowej hodowli komórek nowotworowych pęcherza moczowego dodatek 0,1% preparatu do hodowli spowodowało spowolnienie przyrostu komórek do 50% komórek w hodowli kontrolnej. W przypadku chłoniaka ludzkiego w czterodniowej hodowli dodatek 0,1% preparatu spowodował całkowite zablokowanie proliferacji komórek.

P r z y k ł a d 3.

Szczecina otrzymana od myszy aktywowano i hydrolizowano pepsyną według sposobu opisanego w Przykładzie I. Część rozpuszczoną w wyniku trawienia pepsyną zliofilizowano otrzymując preparat do dalszych badań. Preparat dodano w stężeniu 0,1% do hodowlanej pożywki mysich komórek nowotworowych. Równolegle prowadzono hodowlę kontrolną w identycznych warunkach, ale bez dodatku preparatu. Hodowle prowadzono przez określoną liczbę dni, w warunkach typowych. Płyn hodowlany wymieniano codziennie zarówno w hodowli kontrolnej jak i w hodowli badanej

PL 226 806 B1 z preparatem. W hodowli badanej, każdorazowo wymieniany płyn hodowlany zawierał 0,1% preparatu. Po czterech dniach zliczono ilość komórek w hodowli kontrolnej i badanej. Okazało się, że w przypadku komórek czerniaka mysiego dodatek preparatu całkowicie zablokował proliferację komórek.

Claims

1. Preparat peptydowy o działaniu przeciwnowotworowym, znamienny tym, że zawiera hydrolizat enzymatyczny białek włosów ludzkich lub szczeciny lub futra zwierząt, przy czym rzeczony hydrolizat uzyskano w wyniku trawienia pepsyną.

2. Preparat peptydowy o działaniu przeciwnowotworowym, znamienny tym, że jako składnik aktywny zawiera mieszaninę peptydów o następujących sekwencjach aminokwasowych:

1 AEIRSDL 2 VVQIDNAKL 3 LVVQIDNAKL 4 NKQVVSSSEQL 5 LNKQVVSSSEQL 6 RQLVESDINGL 7 TESEARYSSQL 8 VVQIDNAKLAADDF 9 NRVLNETRSQYEAL 10 NKQVVSSSEQLQSYQAEIIELR 11 NKQVVSSSEQLQSYQAEIIEL 12 LNKQVVSSSEQLQSYQAEIIEL 13 VVNIDNAKL 14 NKQVVSSSEQL 15 LNKQVVSSSEQL 16 NVEVDTAPTVDL 17 VVNIDNAKLASDDF 18 VVEIDNAKL 19 IQEIDF 20 IDKVRF 21 LEQQNKL 22 ASELNHVQEVL 23 NQQVVSSSEQL 24 NQQVVSSSEQL

PL 226 806 B1 25 RQLVESDINGL 26 VVEIDNAKLAADDF 27 IVQIDNAKLAADDF 28 TVIFDTGSSNL 29 GILGPVIKAEVGDTL 30 IQEIDF 31 IDKVRF 32 VVQIDNAKL 33 AEIRSDL 34 AEIRSDLE 35 AEIRSDL 36 VVQIDNAKLA 37 VVQIDNAKL 38 NETRSQYEAL 39 NKQVVSSSEQLQ 40 NKQVVSSSEQL 41 LNKQVVSSSEQL 42 RQLVESDINGL 43 VVQIDNAKLAADDF 44 SQVQSLITNVESQL 45 SQVQSLITNVESQLA 46 NRVLNETRSQYEALV 47 NRVLNETRSQYEAL 48 LNRVLNETRSQYEAL 49 NKQVVSSSEQLQSYQAEIIEL 50 NKQVVSSSEQLQSYQAEIIELR 51 AEIRSDLE 52 AEIRSDL 53 LAEIRSDL 54 VVQIDNAKLA

PL 226 806 B1 55 VVQIDNAKL 56 NETRSQYEALV 57 NKQVVSSSEQLQ 58 NKQVVSSSEQL 59 LNKQVVSSSEQL 60 RQLVESDINGL 61 SQVQRLITNVESQLA 62 SQVQRLITNVESQL 63 NQVLNETRSQYEALV 64 LNQVLNETRSQYEAL 65 NQVLNETRSQYEAL 66 NKQVVSSSEQLQSYQAEIIELR 67 NKQVVSSSEQLQSYQAEIIEL 68 VVNIDNAKLA 69 VVNIDNAKL 70 NETRSQYEALV 71 NKQVVSSSEQLQ 72 NKQVVSSSEQL 73 LNKQVVSSSEQL 74 VVNIDNAKLASDDF 75 SQVQSLITNVESQLA 76 SQVQSLITNVESQL 77 NQVLNETRSQYEALV 78 LNQVLNETRSQYEAL 79 NQVLNETRSQYEAL 80 LGRVTIAQGGVL 81 PKKTESHHKAKGK 82 IDKVRF 83 LEQQNKL 84 RATAENEF 85 IREYQEVMNSKLGL

PL 226 806 B1 86 QNQLEKLG 87 LQNQLEKL 88 QNQLEKL 89 LGKVTIAQGGVLP 90 PKKTESHHKAKGK 91 YRPWGSGSGFG 92 YRPWGSGSGF 93 ERIAGEASRL 94 AKHAVSEGTKAVTKYTSSK 95 DRANNQVGLAPVA 96 FDRANNQVGLAPVA 97 IGGITGPIAKL 98 MEARGPGELC 99 MEARGPGELC 100 IERIPEL 101 TVIFDTGSSNL 102 LIPWVQKPIIF 103 GKEPLGPAL 104 IVNTNVPRASVPDGF 105 MALPVTAL 106 KVGINYQPPTVVPGGDL 107 IDTSRHYLPVKIIL 108 LGRIPSAVGYQPTL 109 VINGNPITIF 110 MKSCGVSL

3. Preparat peptydowy według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że jest przeznaczony do wytwarzania preparatów do leczenia lub profilaktyki nowotworów.

4. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że jest przeznaczony do wytwarzania preparatów w postaci kremów, maści, płynów kosmetycznych lub preparatów doustnych.

5. Preparaty peptydowe o działaniu przeciwnowotworowym, znamienne tym, że jest przeznaczony do stosowania w terapii zapobiegającej nawrotom choroby nowotworowej.