PL217522B1 - Sposób wydzielania cyklopeptydów z lnu zwyczajnego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania cyklopeptydów z lnu zwyczajnego, także z materiału odpadowego jak makuchy i plewy lniane.

Cyklopeptydy z lnu są grupą cyklicznych peptydów złożonych z 8 lub więcej cząsteczek aminokwasów o działaniu immunosupresyjnym.

Immunosupresory są to leki hamujące lub osłabiające odpowiedzi immunologiczne; wskazaniem do ich stosowania są przeszczepy narządów i tkanek oraz choroby immunologiczne; działanie immunosupresyjne posiadają m.in.: hormony kory nadnerczy, antymetabolity hamujące procesy biosyntezy, leki alkilujące hamujące wytwarzanie przeciwciał, globulina antylimfocytarna zawierająca przeciwciała antylimfocytarne, cyklosporyna. Immunosupresory hamują proces wytwarzania w ustroju przeciwciał i komórek odpornościowych, czyli immunogenezę. W transplantologii używa się ich w celu osłabienia reakcji organizmu biorcy na przeszczepioną tkankę będącą dla niego antygenem. Podawanie bezpośrednio po transplantacji immunosupresorów zmniejsza ryzyko odrzucenia przeszczepu.

Znanym i stosowanym immunosupresorem jest cyklosporyna. Mechanizm jej działania polega na wiązaniu się z cyklofiliną, cytozolowym białkiem, w immunokompetentnych limfocytach, głównie typu T. Kompleks tych dwóch białek inhibuje kalcyneurynę, która jest odpowiedzialna za aktywację transkrypcji interleukiny-2. Hamują one także produkcję Iimfokin i uwalnianie interleukin, co prowadzi do redukcji funkcji efektorów komórek typu T.

Jednakże u pacjentów przyjmujących cyklosporynę obserwuje się liczne działania niepożądane, które szczególnie występują u pacjentów leczonych ze wskazań transplantologicznych i są zazwyczaj bardziej nasilone i częstsze. Najczęstsze z nich to: zaburzenia czynności nerek, nadciśnienie tętnicze, drżenie, bóle głowy i hiperlipidemia. Dlatego ciągle poszukuje się nowych, lepszych immunosupresorów.

W nasionach lnu zwyczajnego stwierdzono obecność cyklicznych peptydów, posiadających budowę podobną do cyklosporyny, co mogło sugerować potencjalne immunosupresyjne działanie. Przy ich stosowaniu nie stwierdzono ubocznych działań na organizm człowieka. Dotychczas wydzielono i określono struktury następujących cyklicznych peptydów z nasion lnu:

- Nonapeptydy: CLA (PPFFLIILV), CLB (PPFFVIMLI), CLC (PPFFVIMoLI),

- Oktapeptydy: CLD (PFFWIMoLL), CLE (PLFIMoLVF), CLF (PFFWVMoLMo), CLG (PFFWIMoLMo), CLH (PFFWIMoLM), CLI (PFFWVMLMo), CLJ (PLFIMLVF), CLK (PFFWIMLL), CLL (PFFWVMLM), CLM (PFFWIMLM), CLN (PFFWIMLMo), CLX (PPFFILLX)

- bicykliczny dekapeptyd (BCD).

Najbardziej interesującym ze względu na działanie jest nonacyklopeptyd lnu A (cyclinopeptyd A) o wzorze (1) określonym poniżej, oznaczany też często w skrócie CLA. Głównym naturalnym źródłem cyklopeptydów jest len. Cyklopeptydy z lnu mają charakter niepolarny, są hydrofobowe i wykazują odporność na utlenienie. Cyklopeptydy A i X jako jedyne z grupy nie zawierają atomów siarki. Struktura cyklopeptydu A składa się z 57 atomów węgla.

Cząsteczka CLA cyklo(PPFFLIlLV)nonapeptyd, zawiera kolejno dwie reszty aminokwasowe proliny, dwie fenyloalaniny, leucynę, dwie izoleucyny, leucynę oraz jedną resztę waliny.

PL 217 522 B1

Podobieństwo sekwencji aminokwasowej pomiędzy cyklosporyną a CLA sugerowało działanie immunosupresyjne cyklopeptydu, które zostało potwierdzone licznymi badaniami medycznymi. Stwierdzono, że mechanizm działania CLA na układ odpornościowy organizmu jest analogiczny do mechanizmu działania cyklosporyny.

Na podstawie wstępnych badań medycznych stwierdzono również, że cyklopeptydy wykazują w porównaniu do cyklosporyny, zbliżone działanie immunosupresyjne w niższych dawkach, mają dużo niższą toksyczność i nie powodują działań ubocznych. Ponadto cyklopeptydy wykazują również działanie przeciwmalaryczne.

Znana jest metoda wydzielania cyklopeptydu A (CLA) z lnu, przedstawiona w zgłoszeniu patentowym WO 2009/079792 A1, polegająca na ekstrakcji rozpuszczalnikowej połączonej z adsorpcją na złożu żelu krzemionkowego. Olej lniany mieszano z adsorbentem przez 2 godziny w temperaturze 60°C. Adsorbent po odfiltrowaniu umieszczono w kolumnie chromatograficznej i odolejono, przemywając heksanem i 20% roztworem octanu etylu w heksanie. Zaadsorbowane peptydy wymywano ze złoża 10% roztworem alkoholu etylowego w octanie etylu. Metodą tą ze 100 g oleju lnianego uzyskano 146 mg frakcji zawierającej cyklopeptydy, co stanowi 0,146%. Po chromatograficznym rozdzieleniu i oczyszczeniu produktów końcowych otrzymano: 20,3 mg czystego CLA; 16,3 mg CLC; 3,3 mg CLD; 10,7 mg CLE, 1,0 mg CLF; 6,1 mg CLG. Wydzielony chromatograficznie CLA oczyszczono metodą rekrystalizacji.

Na podstawie informacji zawartych w cytowanym dokumencie nie można określić wydajności opisanego procesu.

Zawartość cyklopeptydów zależy od gatunku lnu i miejsca uprawy. Wykonano analizy dwóch rodzajów handlowych olejów lnianych, które wykazały zawartość cyklopeptydu A 0,001% i 0,05%.

W literaturze patentowej i w publikacjach w czasopismach specjalistycznych opisano wydzielanie oleju z nasion lnu przy zastosowaniu metody ekstrakcji nadkrytycznym ditlenkiem węgla. Opisano również zastosowanie ciekłego lub nadkrytycznego CO2 do wydzielenia z lnu na przykład: diglikozydów, kwasu a - linoleinowego i mieszaniny kwasów linolenowych ω - 3.

W dostępnej literaturze nie opisano sposobu wydzielania cyklopeptydów z lnu przy wykorzystaniu procesu ekstrakcji za pomocą ciekłego lub nadkrytycznego CO2 a także jego wykorzystania do zatężania lub izolacji cyklopeptydów pochodzących z lnu.

Celem niniejszego wynalazku była izolacja mieszaniny cyklopeptydów z lnu zwyczajnego za pomocą ekstrakcji ditlenkiem węgla w stanie ciekłym lub nadkrytycznym. Do tego celu można również zastosować ekstrakcję frakcjonującą ditlenkiem węgla w stanie ciekłym lub nadkrytycznym. Wydzielone tym sposobem cyklopeptydy można oczyszczać metodą chromatograficzną.

Ekstrakcja nadkrytyczna jest procesem wymiany masy, w którym zamiast klasycznych rozpuszczalników stosuje się sprężone gazy w warunkach nadkrytycznych. Ta forma ekstrakcji wykorzystuje pozytywną z punktu widzenia procesów wymiany masy cechę gazów i cieczy, jaką jest niska lepkość przy stosunkowo dużej gęstości. W wyniku tego ekstrahent posiada wysoką zdolność rozpuszczania oraz dobre własności penetracyjne. Zdolność rozpuszczania dla tego samego rozpuszczalnika zmienia się w szerokim zakresie i zależy od temperatury i ciśnienia prowadzenia procesu. Możliwe jest prowadzenie ekstrakcji ciekłym gazem, pod wysokim ciśnieniem i w temperaturze niższej niż jego temperatura krytyczna.

W niektórych przypadkach do strumienia ciekłego lub nadkrytycznego gazu dodawany jest w sposób ciągły strumień ciekłego rozpuszczalnika nazywanego „entrainerem”. Odpowiedni dobór entrainera może w znacznym stopniu zwiększyć szybkość i selektywność ekstrakcji.

Ditlenek węgla jest obojętny fizjologicznie i nie reaguje z większością substancji pochodzenia naturalnego oraz łatwo oddziela się od wyekstrahowanego produktu. Posiada własności bakteriostatyczne, jest niepalny, tani i łatwo dostępny. Procesy w skali przemysłowej prowadzone są z jego pełną recyrkulacją.

Źródłem cyklopeptydów uzyskiwanych sposobem według wynalazku może być cała roślina lnu, jego nasiona, olej lniany oraz materiały odpadowe po obróbce lnu takie jak: makuchy, plewy, korzenie.

Nasiona lnu zwyczajnego poddawane są ekstrakcji lub tłoczeniu w celu uzyskania oleju. Pozostałości (makuchy) zawierają jeszcze ok. 10% oleju oraz między innymi cyklopeptydy. Olej lniany zawiera cyklopeptydy w ilości od 0,01 do 0,05% (w zależności od odmiany lnu, z którego jest otrzymywany oraz od procesu obróbki). Zawartości cyklopeptydów zmieniają się w zależności od odmiany lnu i wynoszą: odmiana Modron - 0,05% a odmiana Szafir - 0,04%.

PL 217 522 B1

Równie dobrym źródłem tych cennych produktów są materiały odpadowe z procesów obróbki lnu. Zawierają one cyklopeptydy w ilości ok. 0,01 - 0,05%. Obok cyklopeptydu A występują również inne cyklopeptydy, głównie CLE i CLC.

Sposób wydzielania cyklopeptydów z lnu zwyczajnego przez ekstrakcję, według wynalazku polega na tym, że len, korzystnie wysuszony i rozdrobniony, lub olej lniany lub produkt odpadowy z przerobu lnu jak makuchy lub plewy lniane, korzystnie rozdrobnione, poddaje się ekstrakcji ciekłym lub nadkrytycznym ditlenkiem węgla i ewentualnie ekstrakt rozdziela się na frakcje wzbogacone w pożądane cyklopeptydy.

Korzystnie ekstrakcję ciekłym lub nadkrytycznym ditlenkiem węgla prowadzi się w temperaturze od 15°C do 80°C, pod ciśnieniem od 7,3 MPa do 50 MPa.

Korzystnie ekstrakcję prowadzi się z dodatkiem entrainera, którym jest substancja polarna lub niepolarna.

Jako entrainer polarny korzystnie stosuje się alkohol alifatyczny C1-C8, najkorzystniej metanol, etanol lub propan-2-ol.

Jako entrainer niepolarny korzystnie stosuje się octan etylu.

Korzystnie ekstrakt rozdziela się na frakcje metodą ekstrakcji nadkrytycznej frakcjonującej.

Korzystnie ekstrakt oczyszcza się metodą chromatograficzną.

Sposobem według wynalazku, dzięki zastosowaniu ekstrakcji ditlenkiem węgla w stanie ciekłym lub nadkrytycznym, z dodatkiem entrainera lub bez, można w krótkim czasie (10 godzin) wyizolować cyklopeptydy z lnu z wysoką wydajnością, wolne od pozostałości rozpuszczalnikowych, wolne od pozostałości rozpuszczalnikowych, wykorzystując jako materiał wyjściowy olej lniany, plewy i surowe makuchy lniane. Proces ten umożliwia również wielokrotne zatężenie cyklopeptydów w próbkach, które mogą być bezpośrednio zastosowane jako produkty spożywcze lub lecznicze. Użycie do ekstrakcji frakcjonującej entrainera podwyższa wydajność i znacznie skraca czas procesu ze względu na obecność cyklopeptydów w pierwszych frakcjach. Cyklopeptydy wykazują działanie biologiczne już w stężeniu 1 μΜ, co stwierdzono w opisie patentowym WO 2009/079792 a efekt działania na komórki rakowe uzyskano stosując stężenie 0,1-100 μΜ. W ekstraktach uzyskanych sposobem według wynalazku stężenie cyklopeptydu A wynosi od 1-125 μΜ a więc, w zależności od potrzeby, ekstrakty mogą być zastosowane bezpośrednio w preparatach farmaceutycznych. Metodą ekstrakcji nadkrytycznej frakcjonującej można uzyskać produkt zawierający ponad 3% cyklopeptydów, który można zastosować bezpośrednio jako substancję czynną. W wielu zastosowaniach jest to wystarczająca dawka terapeutyczna. Oczyszczone cyklopeptydy są białymi lub prawie białymi osadami, natomiast uzyskane ekstrakty z zastosowaniem ditlenku węgla w stanie ciekłym lub nadkrytycznym są w postaci oleju ₃ o gęstości od 810 do 950 kg/dm³. Identyfikację cyklopeptydów wydzielonych sposobem według wynalazku przeprowadzono za pomocą HPLC-MS/ESI. Na chromatogramie wykonanym w trybie SIM widoczne są sygnały od cyklopepłydów: CLA (1040,65); CLE (977,52), CLC (1074,57); CLL Na+ (1075,40); CLI (1068,50), sulfon CLC (1090,52) (rys. 1). Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d I.

W ekstraktorze rurowym o pojemności 150 ml umieszczono 100 g rozdrobnionych i zhomogenizowanych makuchów lnianych, które poddano ekstrakcji strumieniem ciekłego ditlenku węgla pod ciśnieniem 7,3 - 8 MPa i w temperaturze 25°C. Ditlenek węgla przepływał przez ekstraktor z szybkoscią 50 l/h, w przeliczeniu na warunki normalne. Po rozprężeniu strumienia ditlenku węgla do ciśnienia atmosferycznego był on kierowany do odbieralnika, utrzymywanego w temperaturze -30°C, w którym zbierano ciekły ekstrakt. Po 6,5 godzinach ekstrakcji odebrano 2,28 g ekstraktu zawierającego 0,154% CLA, 0,116% CLE oraz 0,079% CLC w postaci oleistej cieczy. Po kolejnych 15 godzinach ekstrakcji odebrano 4,38 g oleju o zawartości CLA 0,088%, 0,096% CLE oraz 0,049% CLC o barwie jasnożółtej, a po kolejnych 14 godzinach 1,87 g ekstraktu o zawartości 0,148% CLA, 0,158% CLE oraz 0,076% CLC w postaci żółtego oleju.

Ekstrakty oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, wstępnie eluowanym toluenem (200 ml) a następnie mieszaniną toluen:metanol w stosunku 8:1. Sumarycznie, uzyskano frakcję o masie 5,5 mg o zawartości 74% CLA (HPLC) w postaci białego osadu, oraz frakcję o masie 10,6 mg zawierającą 48,5% CLA (HPLC) w postaci białawego osadu a także frakcję o masie 11 mg zawierającą 80% cyklopeptydu CLE w postaci białego osadu o t.t. oraz frakcję o masie 7,8 mg zawierającą 75% CLC w postaci białego osadu.

PL 217 522 B1

Próbki czystych cyklopeptydów stosowane były jako wzorce do oznaczania ilościowego cyklopeptydów z lnu za pomocą HPLC.

Analizy wykonywano na gradientowym aparacie HPLC firmy Merck-Hitachi wyposażonym w detektor spektrofotometryczny UV-VIS typ L-7400, pompę wraz z czterorozpuszczalnikowym niskociśnieniowym systemem gradientowym typ L-7100. System sterowany był programem HPLC System Menager Model D-7000 przez interface typ D-7000. Rozdział produktów wykonywano na kolumnie Zorbax 300SB o długości 150 mm i średnicy 4,6 mm wypełnioną fazą typ C-18 firmy Agilent. Przepływ fazy ruchomej wynosił 1 ml/min, długość fali λ = 210 nm. Faza ruchoma A: 0,1% TFA / H₂O, faza ruchoma B: ACN, czas analizy: 75 min. Analizę wykonano w programie czasowym: gradient od 10%B do 85%B przez 65 min.

Czas retencji CLA wynosi 54,5 min.

Czas retencji CLC wynosi 44,0 min.

Czas retencji CLE wynosi 47,22 min.

P r z y k ł a d II.

Ekstrakcję z makuchów lnianych przeprowadzono w ekstraktorze jak w przykładzie I, ditlenkiem węgla w warunkach nadkrytycznych, w temperaturze 40°C, pod ciśnieniem 20 MPa.

Po 7,5 godzinach ekstrakcji odebrano 3,11 g olejowego ekstraktu zawierającego 0,210% CLA, 0,158% CLE oraz 0,098% CLC po kolejnych 15 godzinach ekstrakcji odebrano 3,18 g olejowego ekstraktu o zawartości 0,116% CLA, 0,091% CLE oraz 0,055% CLC i po dalszych 13 godzinach 0,49 g olejowego ekstraktu o zawartości 0,098% CLA, 0,098% CLE oraz 0,097% CLC.

Ekstrakty oczyszczano metodą chromatografii kolumnowej. Sumarycznie, uzyskano frakcję stałą o masie 5,9 mg o zawartości CLA 71% (HPLC) oraz frakcję stałą o masie 6,6 mg zawierającą 46,6% CLA (HPLC) a także frakcję stałą o masie 12,5 mg zawierającą 62% cyklopeptydu CLE oraz frakcję stałą o masie 10,5 mg zawierającą 43% CLC.

Analizy HPLC wykonano w warunkach podanych w przykładzie I.

P r z y k ł a d III.

Ekstrakcję z makuchów lnianych przeprowadzono w ekstraktorze jak w przykładzie I, ditlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym w temperaturze 35°C, pod ciśnieniem 21 MPa, a wraz ze strumieniem ditlenku węgla przez złoże wsadu przepuszczano metanol (polarny entrainer) w ilości 2 ml/h.

Po 5,5 godzinach ekstrakcji odebrano 3,24 g ekstraktu olejowego zawierającego 0,011% CLA, 0,001% CLE oraz 0,005% CLC, po kolejnych 5 godzinach ekstrakcji odebrano 3,04 g ekstraktu olejowego o zawartości 0,340% CLA, 0,24% CLE oraz 0,16% CLC i po dalszych 18 godzinach 3,48 g ekstraktu olejowego o zawartości 0,012% CLA, 0,011% CLE oraz 0,006% CLC.

Ekstrakty oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej.

Sumarycznie, uzyskano frakcję stałą o masie 6,9 mg o zawartości CLA 80% (HPLC) oraz frakcję stałą o masie 14,4 mg zawierającą 38% CLA (HPLC) a także frakcję stałą o masie 11,2 mg zawierającą 72% cyklopeptydu CLE oraz frakcję stałą o masie 9,5 mg zawierającą 55% CLC.

P r z y k ł a d IV.

Ekstrakcję przeprowadzono jak w przykładzie III, przy użyciu entrainera niepolarnego - octanu etylu, który dozowano w ilości 2 ml/h. Po 5,5 godzinach ekstrakcji odebrano 2,99 g ekstraktu olejowego zawierającego 0,052% CLA, 0,038% CLE oraz 0,025% CLC po kolejnych 13 godzinach ekstrakcji odebrano 2,96 g ekstraktu olejowego o zawartości 0,274% CLA, 0,190% CLE oraz 0,130% CLC i po dalszych 6 godzinach 0,12 g ekstraktu olejowego o zawartości 1,258% CLA, 1,160% CLE oraz 0,600% CLC.

Ekstrakty oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej.

Sumarycznie, uzyskano frakcję stałą o masie 8,5 mg o zawartości CLA 73% (HPLC) oraz frakcję stałą o masie 11 mg zawierającą 36% CLA (HPLC) a także frakcję stałą o masie 11,7 mg zawierającą 68% cyklopeptydu CLE oraz frakcję stałą o masie 8,2 mg zawierającą 62% CLC.

P r z y k ł a d V.

Ekstrakcję przeprowadzono w ekstraktorze jak w przykładzie I, lecz zamiast makuchów lnianych użyto olej w ilości 100 g, uzyskany przez ekstrakcję toluenem makuchów lnianych, zawierający 0,1278% CLA. Temperatura ekstrakcji wynosiła 22°C, a ciśnienie 20 MPa. Po 18 godzinach ekstrakcji odebrano 17,0 g ekstraktu olejowego zawierającego 0,110% CLA, 0,037% CLE oraz 0,098% CLC po kolejnych 15 godzinach ekstrakcji odebrano 14,39 g ekstraktu olejowego o zawartości 0,58% CLA, 0,30% CLE oraz 0,47% CLC i po dalszych 10 godzinach 9,28 g ekstraktu olejowego o zawartości 0,13% CLA, 0,012% CLE oraz 0,15% CLC.

PL 217 522 B1

Ekstrakty oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej.

Sumarycznie, uzyskano frakcję stałą o masie 95,5 mg o zawartości CLA 84% (HPLC) oraz frakcję stałą o masie 56 mg zawierającą 61% CLA (HPLC), frakcję stałą o masie 63 mg zawierającą 72% cyklopeptydu CLE oraz frakcję stałą o masie 118 mg zawierającą 76% CLC.

P r z y k ł a d VI.

Ekstrakcję przeprowadzono jak w przykładzie I, ditlenkiem węgla w warunkach nadkrytycznych, w temperaturze 40°C, pod ciśnieniem 20 MPa, przy czym zamiast makuchów lnianych użyto plewy lniane. Po 25,5 godzinach ekstrakcji odebrano 2,27 g ekstraktu olejowego zawierającego 0,063% CLA oraz 0,062% CLC.

Ekstrakty oczyszczano stosując chromatografię kolumnową. Sumarycznie, uzyskano frakcję stałą o masie 3,1 mg o zawartości CLA 48% (HPLC) oraz frakcję stałą o masie 3,2 mg zawierającą 45% CLC.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wydzielania cyklopeptydów z lnu zwyczajnego, znamienny tym, że len, korzystnie wysuszony i rozdrobniony lub olej lniany, lub produkt odpadowy z przerobu lnu jak makuchy lub plewy lniane, korzystnie rozdrobnione, poddaje się ekstrakcji ciekłym lub nadkrytycznym ditlenkiem węgla i ewentualnie ekstrakt rozdziela się na frakcje wzbogacone w pożądane cyklopeptydy.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się w temperaturze od 15°C do 80°C, pod ciśnieniem od 7,3 MPa do 50 MPa.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się z dodatkiem entrainera, którym jest substancja polarna lub niepolarna.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako entrainer polarny stosuje się alkohol alifatyczny C1-C8, zwłaszcza metanol, etanol lub propan-2-ol.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako entrainer niepolarny stosuje się octan etylu.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakt rozdziela się na frakcje metodą ekstrakcji nadkrytycznej frakcjonującej.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakty oczyszcza się metodą chromatograficzną.