PL212312B1 - Live attenuated vaccine against porcine pleuropneumonia - Google Patents
Live attenuated vaccine against porcine pleuropneumoniaInfo
- Publication number
- PL212312B1 PL212312B1 PL376527A PL37652703A PL212312B1 PL 212312 B1 PL212312 B1 PL 212312B1 PL 376527 A PL376527 A PL 376527A PL 37652703 A PL37652703 A PL 37652703A PL 212312 B1 PL212312 B1 PL 212312B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- strain
- gene
- app
- plasmid
- segment
- Prior art date
Links
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 title abstract 2
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 title abstract 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 title description 6
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 title description 6
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 46
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 101150051095 apxIA gene Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 101150099390 apxIIA gene Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000002126 nonhaemolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims abstract description 10
- 101000657454 Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-I toxin determinant A from serotypes 1/9 Proteins 0.000 claims description 39
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 34
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 34
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 claims description 7
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 claims description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 23
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 17
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 17
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 17
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 13
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 10
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 10
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 8
- 101100243724 Caenorhabditis elegans pgp-3 gene Proteins 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 7
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 7
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 101150115143 shroom2 gene Proteins 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 101100148256 Actinobacillus pleuropneumoniae apxIB gene Proteins 0.000 description 4
- 101100148258 Actinobacillus pleuropneumoniae apxID gene Proteins 0.000 description 4
- 101100351961 Caenorhabditis elegans pgp-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 101150099875 atpE gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 239000007382 columbia agar Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100148257 Actinobacillus pleuropneumoniae apxIC gene Proteins 0.000 description 2
- 101100484521 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) atpF gene Proteins 0.000 description 2
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 101100110710 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) atpH gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 101150015540 apxIIC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150090348 atpC gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000006781 columbia blood agar Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150105863 apxIB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150056862 apxIC gene Proteins 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 101150113191 cmr gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012259 partial gene deletion Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania immunogennego, niehemolitycznego szczepu Actinobacillus pleuropneumoniae, odpowiedniego do przygotowania żywej, atenuowanej szczepionki przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń.The invention relates to a method for the preparation of an immunogenic, non-haemolytic Actinobacillus pleuropneumoniae strain suitable for the preparation of a live attenuated vaccine against swine pleurisy.
Stan technikiState of the art
Actinobacillus pleuropneuraonia (dalej określany jako „App) jest gram-ujemną bakterią, która powoduje zapalenie płuc i opłucnej u świń, rozpowszechnioną na całym świecie chorobę zakaźną odpowiedzialną za znaczące straty ekonomiczne w przemyśle hodowlanym trzody chlewnej.Actinobacillus pleuropneuraonia (hereinafter referred to as "App) is a gram negative bacterium that causes pneumonia and pleuritis in pigs, a widespread infectious disease responsible for significant economic losses to the pig livestock industry.
Najważniejszymi czynnikami wirulencji App są zewnątrzkomórkowe białka mianowicie: egzotoksyny Apx. Te egzotoksyny należą do rodziny tworzących pory toksyn RTX, szeroko rozpowszechnionej wśród patogennych bakterii gram-ujemnych. Głównymi egzotoksynami u App są: ApxI, ApxII, ApxIII i ApxIV.The most important factors of App virulence are the extracellular proteins namely: Apx exotoxins. These exotoxins belong to the pore-forming RTX family of toxins, widely distributed among pathogenic gram-negative bacteria. The major exotoxins in the App are: ApxI, ApxII, ApxIII, and ApxIV.
Egzotoksyny ApxI i ApxII są hemolityczne i cytolityczne. ApxI wykazuje silną aktywność hemolityczną i cytolityczną, a ApxII wykazuje słabą aktywność hemolityczną i umiarkowaną aktywność cytolityczną.The exotoxins ApxI and ApxII are hemolytic and cytolytic. ApxI shows strong haemolytic and cytolytic activity and ApxII shows weak haemolytic activity and moderate cytolytic activity.
Chociaż wszystkie, do tej pory przebadane, serotypy są zdolne do wytwarzania ApxIV, występuje charakterystyczny rozkład ekspresji pozostałych egzotoksyn Apx w serotypach. Serotypy 1, 5, 9 i 11 wytwarzają egzotoksyny ApxI i ApxII; serotyp 10 wytwarza tylko ApxI; serotypy 7 i 12 wytwarzają tylko ApxII, a serotypy 2, 3, 4, 6, i 8 wytwarzają ApxII i ApxIII.Although all serotypes tested so far are capable of producing ApxIV, there is a characteristic distribution of expression of the remaining Apx exotoxins in the serotypes. Serotypes 1, 5, 9 and 11 produce ApxI and ApxII exotoxins; serotype 10 produces only ApxI; serotypes 7 and 12 only produce ApxII and serotypes 2, 3, 4, 6, and 8 produce ApxII and ApxIII.
Geny odpowiadające egzotoksynom ApxI i ApxII są zorganizowane w operony. Operon egzotoksyny ApxI zawiera 4 geny: apxIC, apxIA, apxIB i apxID. Gen apxIA koduje samą egzotoksynę ApxI. Gen apxIC koduje białko aktywatorowe (acylazę), które powoduje posttranslacyjne modyfikacje (acylację) Apx, co umożliwia ApxI osiągnięcie aktywnej konformacji, umożliwiając interakcję ze specyficznymi receptorami komórki gospodarza. Geny apxIB i apxID kodują dwa białka błonowe, które wydzielają dojrzałą egzotoksynę ApxI do środowiska zewnętrznego.The genes corresponding to the ApxI and ApxII exotoxins are organized into operons. The ApxI exotoxin operon contains 4 genes: apxIC, apxIA, apxIB and apxID. The apxIA gene codes for the ApxI exotoxin itself. The apxIC gene encodes an activator protein (acylase) that causes post-translational modifications (acylations) of Apx, allowing ApxI to reach an active conformation, allowing interaction with specific host cell receptors. The apxIB and apxID genes encode two membrane proteins that secrete the mature ApxI exotoxin into the external environment.
Operon ApxII zawiera tylko gen A (apxIIA) i gen C (apxIIC), który koduje, odpowiednio, ApxII i acylazę odpowiedzialną za uzyskanie przez ApxII aktywnej konformacji. Występuje także niewielki fragment, który wykazuje pewne podobieństwo do genu apxIB, lecz nie powstaje z niego funkcjonalne białko. Eksport dojrzałego ApxII do środowiska zewnętrznego jest zależny od działania białek kodowanych przez geny apxIB i apxID.The ApxII operon contains only the A gene (apxIIA) and the C gene (apxIIC), which codes for ApxII and the acylase, respectively, responsible for obtaining an active conformation by ApxII. There is also a small fragment that shows some similarity to the apxIB gene, but does not produce a functional protein. The export of mature ApxII to the external environment depends on the action of proteins encoded by the apxIB and apxID genes.
Obecne metody szczepienia nie zapewniają całkowitego zabezpieczenia przeciw wszystkim serotypom App.Current vaccination methods do not provide complete protection against all App serotypes.
W zgłoszeniu WO97/16532A1 ujawniono konstrukcję szczepu szczepionkowego, zdolnego do indukcji odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia. Konstrukt obejmuje zmodyfikowany mikroorganizm, który wytwarza, na skutek częściowej delecji, częściowo lub całkowicie inaktywowaną toksynę Apx. Ta delecja spowodowana jest indukowaną mutagenezą strukturalnego genu apxIA i/lub częściową delecją aktywatorowego genu apxIIC. Nie modyfikuje ona obszaru transbłonowego.WO97 / 16532A1 discloses the construction of a vaccine strain capable of inducing an immune response in an animal. The construct comprises a modified microorganism that produces, through partial deletion, a partially or completely inactivated Apx toxin. This deletion is due to induced mutagenesis of the apxIA structural gene and / or a partial deletion of the activator apxIIC gene. It does not modify the transmembrane area.
W europejskim opisie patentowym nr 810283A2 ujawniono konstrukcję szczepu szczepionkowego App przez modyfikację genu ApxIC w taki sposób, że nie wytwarza on białka aktywatorowego w funkcjonalnej postaci i nie moż e ono aktywować toksyny przez acylację . To takż e nie zmienia obszaru transbłonowego.EP 810283A2 discloses the construction of an App vaccine strain by modifying the ApxIC gene such that it does not produce the activator protein in a functional form and cannot activate the toxin by acylation. It also does not alter the transmembrane region.
Jansen i in. (Infection and Immunity 63:7-37 (1995)) opisali wytwarzanie homologicznych rekombinantów App metodą ukierunkowanej mutagenezy. Te mutanty posiadają gen apxIA, który jest inaktywowany przez insercję genu CMr i/lub gen apxIIA inaktywowany przez insercję genu TETr.Jansen et al. (Infection and Immunity 63: 7-37 (1995)) describe the production of homologous App recombinants by site-directed mutagenesis. These mutants have the apxIA gene that is inactivated by insertion of the CMr gene and / or the apxIIA gene that is inactivated by insertion of the TETr gene.
Tascón i in. (Molecular Microbiology 14: 207-216 (1994)) opisali dwa mutanty App. W jednym z nich rozbito gen apxIBD, a w drugim rozbito strukturalny gen apxIA.Tascón et al. (Molecular Microbiology 14: 207-216 (1994)) described two mutants of App. In one, the apxIBD gene was broken, and in the other, the structural apxIA gene was broken.
Reimer i in.; (Microbial Pathogenesis 18:197-209 (1995)) opisali niezjadliwego mutanta App, który, w wyniku chemicznej mutagenezy, posiada delecje, które wpływają na istotne części operonu apxIABCD. Ten mutant nie syntetyzuje toksyny ApxI, lecz jest zdolny do syntezy ApxII, chociaż nie jest ona wydzielana przez komórkę.Reimer et al; (Microbial Pathogenesis 18: 197-209 (1995)) reported an avirulent mutant of App which, by chemical mutagenesis, has deletions that affect essential parts of the apxIABCD operon. This mutant does not synthesize the ApxI toxin, but is able to synthesize ApxII, although it is not secreted by the cell.
Szczepów, które nie eksprymują egzotoksyn ApxI i ApxII, nie można stosować jako atenuowanych szczepionek, ponieważ nie indukują one ochronnej odpowiedzi immunologicznej, gdyż egzotoksyny ApxI i ApxII są jednymi z najważniejszych determinantów wirulencji App.Strains that do not express the ApxI and ApxII exotoxins cannot be used as attenuated vaccines because they do not induce a protective immune response as the ApxI and ApxII exotoxins are among the most important determinants of App virulence.
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
Prideaux (The 16th International Pig Veterinary Society Congress, Melbourne (Australia) 17-20 września 2000, str. 439-442) opisuje szczepionkę wytworzoną ze szczepu z inaktywowanym genem apxIIC, który wydziela i eksprymuje nieaktywowaną toksynę ApxII która jest zatem niezdolna do przyłączenia się do komórek docelowych.Prideaux (The 16 th International Pig Veterinary Society Congress, Melbourne (Australia) 17-20 September 2000, pp. 439-442) describes a vaccine produced from a strain of inactivated apxIIC gene that secretes and expresses an inactivated toxin apxII which is therefore unable to join to target cells.
Z tego powodu żywe, atenuowane szczepionki opisane uprzednio w rozdziale Stan techniki, na bazie szczepów App nie posiadających zdolności do hemolizy, mają słabsze działanie immunoprotekcyjne, ponieważ ich budowa uległa modyfikacjom, co uniemożliwia im przyłączenia się do receptora błonowego komórki docelowej. Ponadto nie mogą one powodować wytwarzania przeciwciał przeciw toksynom ApxI i/lub ApxII, ponieważ nie zostały wydzielone przez komórkę. Frey i in. (Gene 142:97-102 (1994)) opisują sekwencję aminokwasową egzotoksyny ApxIe ze szczepu o serotypie I, a Smiths i in. (Infection and Immunity 59:4497-4504 (1991)) opisują sekwencję aminokwasową egzotoksyny ApxII szczepu o serotypie 9.For this reason, the live attenuated vaccines described previously in the section BACKGROUND OF THE INVENTION, based on non-haemolytic App strains, have a weaker immunoprotective effect because their structure has been modified, preventing them from attaching to the target cell's membrane receptor. Moreover, they cannot give rise to the production of antibodies against ApxI and / or ApxII toxins because they have not been secreted by the cell. Frey et al. (Gene 142: 97-102 (1994)) describe the amino acid sequence of the ApxIe exotoxin from a serotype I strain, and Smiths et al. (Infection and Immunity 59: 4497-4504 (1991)) describe the amino acid sequence of the ApxII exotoxin of strain serotype 9.
Istota wynalazkuThe essence of the invention
Autorzy wynalazku opracowali sposób otrzymywania immunogennego i niehemolitycznego szczepu App z wirulentnego szczepu App, który zmodyfikowano w co najmniej jednym segmencie genu apxIA (SEQ ID nr 1) i ewentualnie w segmencie genu apxIIA (SEQ ID nr 2), który koduje domenę transbłonową cytolitycznej i hemolitycznej egzotoksyny Apx.The inventors have developed a method for obtaining an immunogenic and non-haemolytic App strain from a virulent App strain that has been modified in at least one apxIA gene segment (SEQ ID No. 1) and possibly in the apxIIA gene segment (SEQ ID No. 2) that encodes the cytolytic and hemolytic transmembrane domain Apx exotoxin.
Ten szczep nie posiada aktywności hemolitycznej, lecz zachowuje nie zmienioną zdolność immunoprotekcyjną i jest odpowiedni do przygotowania żywej, atenuowanej szczepionki przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń.This strain has no haemolytic activity, but retains unaltered immunoprotective capacity and is suitable for the preparation of a live attenuated vaccine against swine pleurisy.
Transbłonowe domeny egzotoksyn ApxI i ApxII odgrywają ważną rolę w powstawaniu poru w błonie komórki docelowej. Gdy ten por zostanie utworzony, pojawia się zaburzenie równowagi osmotycznej, które w końcu powoduje lizę komórki docelowej.The transmembrane domains of the ApxI and ApxII exotoxins play an important role in pore formation in the target cell membrane. Once this pore is created, an osmotic imbalance occurs which eventually lyses the target cell.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że żywa, atenuowana szczepionka wytworzona z zastosowaniem tego zmodyfikowanego szczepu App obejmująca toksyny ApxI i ApxII pozbawione hemolitycznej aktywności, podawana w małych dawkach, zawiera wszystkie antygeny immunologicznie konieczne do wywołania silnej immunogennej odpowiedzi.Surprisingly, it was found that a live attenuated vaccine prepared with this modified App strain comprising the ApxI and ApxII toxins devoid of haemolytic activity, administered at low doses, contains all the immunologically necessary antigens to elicit a strong immunogenic response.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunogennego i niehemolitycznego szczepu App z wirulentnego szczepu App zmodyfikowanego w co najmniej jednym segmencie genu apxIA i ewentualnie w segmencie genu apxIIA, który koduje transbłonową domenę hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx.The invention relates to a method of producing an immunogenic and non-haemolytic App strain from a virulent App strain modified in at least one apxIA gene segment, and optionally in the apxIIA gene segment, which encodes the transmembrane domain of the Apx hemolytic and cytolytic exotoxin.
Ponadto, innym aspektem wynalazku są szczepy otrzymywane z zastosowaniem sposobów według wynalazku i wytworzone z nich szczepionki.In addition, another aspect of the invention is the strains obtainable using the methods of the invention and the vaccines prepared therefrom.
W trzecim aspekcie wynalazek dotyczy szczepów App zdeponowanych w Colección Espań ola de Cultivos Tipo o numerach rejestracyjnych: CECT 5985 i CECT 5994.In a third aspect, the invention relates to App strains deposited at Colección España ola de Cultivos Tipo with registration numbers CECT 5985 and CECT 5994.
Opis rysunkówDescription of the drawings
Fig. 1Fig. 1
Fig. 1 przedstawia dopasowanie (alignment) przeprowadzone z zastosowaniem programu ClustalX (Thompson i in.; Nucleic Acid Research 24:4876-4882 (1997) pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi ApxI pochodzącymi ze szczepu o serotypie 1 (Frey i in.; Gene 142: 97-102 (1994) i z ApxII serotypu 9 (Smits i in.; Infection & Immun. 59:4497-4504 (1991). Na tej fig. zamieszczono tylko sekwencję zawartą pomiędzy aminokwasami 1 do 594 ApxI i 1 do 590 ApxII. Na dopasowaniu następujące obszary są przedstawione w ramkach: H1 (aminokwasy 233 do 253), H2 (aminokwasy 296 do 315) i H3 (aminokwasy 369 do 405). Te obszary odpowiadają odpowiednio trzem transbłonowym domenom występującym w obu Apx.Figure 1 shows an alignment performed with the ClustalX program (Thompson et al .; Nucleic Acid Research 24: 4876-4882 (1997) between ApxI amino acid sequences derived from the serotype 1 strain (Frey et al; Gene 142: 97) -102 (1994) and with ApxII serotype 9 (Smits et al .; Infection & Immun. 59: 4497-4504 (1991). In this figure only the sequence between amino acids 1 to 594 of ApxI and 1 to 590 of ApxII is shown. the following regions are shown in boxes: H1 (amino acids 233 to 253), H2 (amino acids 296 to 315), and H3 (amino acids 369 to 405) These regions correspond to the three transmembrane domains found in both Apx, respectively.
Fig. 2Fig. 2
Fig. 2 przedstawia schemat etapów przeprowadzanych w celu otrzymania hybrydowych plazmidów ρΑρχΙΔΗ2 i ρΑρχΙΙΔΗ2. Najpierw otrzymano plazmid pGP1 przez strawienie plazmidu pGP704 (Miller i Mekalanos; J. Bacteriol. 170: 2575-2583 (1988) z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych EcoRI i BglII i późniejszą ligację oligonukleotydów pGP5' i pGP3'. Ten plazmid zawiera wegetatywne miejsce startu replikacji plazmidu R6K (OriR6K) i miejsce startu transferu przez koniugację plazmidu RP4 (OriTP4) i gen oporności na ampicylinę (Bla). Plazmid pGP1 strawiono stosując enzym restrykcyjny PstI i ligowano z fragmentem nośnikowym PstI genu oporności na kanamycynę (Kmr lub Kan), pochodzącym z plazmidu pUC4K w celu uzyskania plazmidu pGP2. Do tego plazmidu, uprzednio zdefosforylowanego i strawionego enzymem restrykcyjnym EcoRI, włączono trzy fragmenty DNA zamplifikowane z zastosowaniem PCR, mianowicie: promotor ptac, region kodujący białka fuzyjnegoFig. 2 is a diagram of the steps carried out to obtain the hybrid plasmids ρΑρχΙΔΗ2 and ρΑρχΙΙΔΗ2. First, plasmid pGP1 was obtained by digesting plasmid pGP704 (Miller and Mekalanos; J. Bacteriol. 170: 2575-2583 (1988) using the restriction enzymes EcoRI and BglII and subsequent ligation of the oligonucleotides pGP5 'and pGP3'. This plasmid contains a vegetative origin of replication plasmid. R6K (OriR6K) and transfer start site by conjugation of plasmid RP4 (OriTP4) and ampicillin resistance gene (Bla) Plasmid pGP1 was digested with the restriction enzyme PstI and ligated with the PstI carrier fragment of the kanamycin resistance gene (Km r or Kan), derived from plasmid pUC4K to obtain plasmid pGP2 To this plasmid, previously dephosphorylated and digested with the restriction enzyme EcoRI, three DNA fragments amplified by PCR, namely: the ptac promoter, the coding region of the fusion protein
PL 212 312 B1 atpE/GFPUV (regionem wiązania rybosomu były E. coli atpE z odmianą U. V. zielonego białka fluorescencyjnego) i terminator transkrypcji rrnB. Uzyskany plazmid nazwano pGP3. Do tego plazmidu wstawiono regiony oskrzydlające 5' i 3' (zamplifikowane z zastosowaniem PCR), które kodują drugą transbłonową helisę genów apxl i apxll z wytworzeniem plazmidów odpowiednio ρΑρχΙΔΗ2 i ρΑρχΙΙΔΗ2.AtpE / GFPUV (the ribosome binding region was E. coli atpE with the U.V variant of the green fluorescent protein) and the rrnB transcription terminator. The resulting plasmid was named pGP3. The 5 'and 3' flanking regions (amplified by PCR) that encode the second transmembrane helix of the apxl and apxll genes were inserted into this plasmid to produce the plasmids ρΑρχΙΔΗ2 and ρΑρχΙΙΔΗ2, respectively.
Fig. 3Fig. 3
Fig. 3 podzielono na trzy panele: panel A przedstawia mapy restrykcyjne w kilobazach (kb) i położenie genów w operonie apxl genomu App. W jasnoszarym kolorze przedstawiono gen apxIA, będący przedmiotem różnych rekombinacji, a w kolorze ciemnoszarym sąsiednie geny apxIC, apxIB i apxID. Różne geny lub obszary plazmidu ρΑρχΙΔΗ2 zaznaczono stosując ukośne kreski. Fragmenty kodujące transbłonowe helisy (H1, H2 i H3) apxIA zaznaczono na czarno. Nazwy i pewne szczegółowe struktury plazmidów na fig. 2 podano skrótowo. Tak więc gfpUV zawiera promotor ptac i gen fuzyjny atpE/GFPUV; OriV oznacza wegetatywne miejsce startu replikacji z R6K, miejsce startu transferu przez koniugację z RP4OriT. Zarówno na (1) jak i (3) przedstawiono mapę restrykcyjną otrzymaną z zastosowaniem enzymu XhoI i przedstawiono położenie genów operonu ApxI genomu App. Na (2) przedstawiono mapę restrykcyjną tego samego operonu po wprowadzeniu do genomu App plazmidu pApxI.\H2. Do tej insercji dochodzi na skutek unikalnej homologicznej rekombinacji pomiędzy regionami oskrzydlającymi 5' dla H2 znajdującymi się odpowiednio na plazmidzie pApxI.\H2 i w genomie App.Fig. 3 is divided into three panels: panel A shows the restriction maps in kilobases (kb) and the location of the genes in the apxl operon of the App genome. Light gray shows the apxIA gene, which has been subject to various recombinations, and dark gray shows the neighboring apxIC, apxIB and apxID genes. Different genes or regions of the ρΑρχΙΔΗ2 plasmid are marked with diagonal lines. The coding fragments for transmembrane helices (H1, H2 and H3) of apxIA are marked in black. The names and some detailed structures of the plasmids in Figure 2 are summarized. Thus, gfpUV contains the ptac promoter and the atpE / GFPUV fusion gene; OriV designates a vegetative origin of replication with R6K, origin of transfer by conjugation with RP4OriT. Both (1) and (3) show the restriction map obtained with the use of the XhoI enzyme and the location of the genes of the ApxI operon of the App genome. The restriction map of the same operon after the introduction of the plasmid pApxI. \ H2 into the App genome is shown in (2). This insertion is due to the unique homologous recombination between the 5 'flanking regions for H 2 located on the pApxI. \ H 2 plasmid and the App genome, respectively.
Panel B fig. 3 przedstawia wyniki hybrydyzacji sondy genowej Apxl z przeniesionym metodą Southern strawionym genomowym DNA, strawionym z zastosowaniem XhoI i otrzymanym z zebrania: 1) HP816 Nr; 2) rekombinanta otrzymanego przez wprowadzenie plazmidu pApxI.\H2 do genomu App wskutek unikalnej homologicznej rekombinacji pomiędzy regionami oskrzydlającymi 5' dla H2 (HP816R1); 3) rekombinanta otrzymanego z HP816R1, który powrócił do fenotypu takiego samego, jak u macierzystego szczepu HP816 Nr i 4) rekombinanta otrzymanego z HP816R1, który powrócił do fenotypu takiego samego, jak u macierzystego szczepu HP816 Nr z tym wyjątkiem, że wykazuje on taką samą hemolityczną aktywność jak HP816R1 (AppApxIH2-).Panel B Fig. 3 shows the results of hybridization of the ApxI gene probe with Southern-transferred digested genomic DNA digested with XhoI and obtained from a pool of: 1) HP816 No.; 2) recombinant obtained by introducing the plasmid pApxI. \ H2 into the App genome by unique homologous recombination between the 5 'flanking regions for H2 (HP816R1); 3) recombinant derived from HP816R1 that reverted to the phenotype of the parent strain HP816 No. and 4) recombinant derived from HP816R1 that reverted to the phenotype of the parent strain HP816 No. except that it exhibits the same hemolytic activity like HP816R1 (AppApxIH2 - ).
Panel C przedstawia położenie kolonii wysianych z tych samych kultur, co opisane na panelu B (1, 2, 3 i 4) razem z innymi koloniami pochodzącymi z kultury serotypu 7 App (5). Kolonie wysiano na płytkach Columbia na agarze z krwią uzupełnionym 0,004% NAD (CA) lub na płytkach TSYN z dodatkiem 25 μg/ml kanamycyny (TS) . Na płytkach CA zauważyć można obecność dużych hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 1 i 3 i małych hemolitycznych stref przejaśnienia otaczających kolonie z kultur 2, 4 i 5. Na TS zauważyć można także brak wzrostu kultur 1, 3, 4 i 5.Panel C shows the location of the colonies seeded from the same cultures as described in Panel B (1, 2, 3 and 4) together with other colonies derived from the App serotype 7 culture (5). Colonies were plated on Columbia plates on blood agar supplemented with 0.004% NAD (CA) or on TSYN plates supplemented with 25 µg / ml kanamycin (TS). The presence of large hemolytic brightening zones around the colonies of cultures 1 and 3 and small hemolytic brightening zones surrounding the colonies of cultures 2, 4 and 5 can be seen on the CA plates. The lack of growth of cultures 1, 3, 4 and 5 can also be seen on TS.
Fig. 4Fig. 4
Fig. 4 podzielono na 3 panele: panel A przedstawia mapy restrykcyjne (w kb) i położenie genów w operonie apxll znajdującym się w genomie App. W jasnoszarym kolorze przedstawiono gen apxIIA. Jest on przedmiotem różnych rekombinacji. Sąsiednie geny apxIIC, apxIIB przedstawiono w kolorze ciemnoszarym; różne geny lub obszary plazmidu pApxII.\H2 zaznaczono na rysunku stosując ukośne kreski. Fragmenty kodujące transbłonowe helisy (H1, H2 i H3) apxIIA przedstawiono na czarno. Mapę restrykcyjną otrzymano przy zastosowaniu enzymu EcoRI, a położenie genów w operonie ApxII genomu App przedstawiono na (1) i (3). Mapę restrykcyjną tego samego operonu po wprowadzeniu plazmidu pApxI.\H2 przedstawiono na (2). Insercję tę uzyskano poprzez unikalną homologiczną rekombinację pomiędzy regionami oskrzydlającymi 3' H2 znajdującymi się na plazmidzie pApxIAH2 i w genomie App. Na (4) przedstawiono mapę restrykcyjną operonu po rozdziale na składowe plazmidu wstawionego w (2) po drugiej rekombinacji poprzez regiony oskrzydlające 5' H2 znajdujące się w genomie App.Fig. 4 is divided into 3 panels: panel A shows the restriction maps (in kb) and the location of the genes in the apxII operon located in the App genome. The apxIIA gene is shown in light gray. It is subject to various recombinations. The adjacent apxIIC, apxIIB genes are shown in dark gray; the different genes or regions of the pApxII. \ H2 plasmid are marked in the figure with diagonal lines. The coding fragments for the transmembrane helices (H1, H2 and H3) of apxIIA are shown in black. The restriction map was obtained using the enzyme EcoRI, and the position of the genes in the ApxII operon of the App genome is shown in (1) and (3). The restriction map of the same operon after the introduction of the pApxI. 1 H 2 plasmid is shown in (2). This insertion was achieved by unique homologous recombination between the 3 'flanking regions of H2 located on the pApxIAH2 plasmid and the App genome. In (4) the restriction map of the operon after separation into components of the plasmid inserted in (2) after a second recombination through the 5 'flanking regions of H2 located in the App genome is shown.
Panel B przedstawia wyniki hybrydyzacji sondy genowej apxIIA z przeniesionymi metodą Southern genomowymi DNA strawionymi z zastosowaniem EcoRI i otrzymanymi z następujących kultur: 1) HP8816 Nlr 2) rekombinant otrzymany przez wprowadzenie plazmidu pApxIAH2 do genomu App poprzez unikalną homologiczną rekombinację pomiędzy regionami oskrzydlającymi 5' H2 (HP816R2); 3) rekombinant otrzymany z HP816R2, który powrócił do fenotypu takiego samego, jak u macierzystego szczepu macierzystego szczepu HP816 Nlr; 4) rekombinant otrzymany z HP816R2, który powrócił do fenotypu takiego samego, jak u macierzystego szczepu HP816 Nlr z tym wyjątkiem, że wykazuje on taką samą aktywność hemolityczną jak HP816R2 (AppApxI/IIH2-).Panel B shows the results of hybridization of the apxIIA gene probe with Southern transferred genomic DNA digested with EcoRI and obtained from the following cultures: 1) HP8816 Nl r 2) recombinant obtained by introducing the pApxIAH2 plasmid into the App genome by unique homologous recombination between the 5 'flanking regions of H2 (HP816R2); 3) recombinant derived from HP816R2 that reverted to the same phenotype as in the parental parent strain of HP816 Nl r ; 4) recombinant obtained from HP816R2 which recovers the same phenotype such as in the parent strain HP816 Nl r with the exception that it shows the same haemolytic activity as HP816R2 (AppApxI / IIH2 -).
Panel C przedstawia położenie kolonii wysianych z samych kultur opisanych na panelu B (1, 2, i 4). Kolonie wysiano na płytkach Columbia z agarem z krwią uzupełnionym NAD (CA), lub na płytkach TSYN z dodatkiem 25 μ/ml kanamycyny (TS). Można zaobserwować obecność małych hemoliPL 212 312 B1 tycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 1 i 3 i brak hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 2 i 4. Widać także brak wzrostu kultur 1, 3 i 4 na TS.Panel C shows the location of the colonies seeded from the cultures alone described in Panel B (1, 2, and 4). Colonies were plated on Columbia blood agar plates supplemented with NAD (CA), or on TSYN plates supplemented with 25 µ / ml kanamycin (TS). One can observe the presence of small hemolytic brightening zones around the colonies of cultures 1 and 3 and no hemolytic brightening zones around the colonies of cultures 2 and 4. Also, no growth of cultures 1, 3 and 4 on TS can be seen.
Fig. 5Fig. 5
Fig. 5 przedstawia trzy wykresy krzywych wzrostu różnych kultur, wyznaczone (ciemne symbole) z wartości absorbancji, przy 600 nm, w jednogodzinnych przedziałach czasu (lewa oś y). Jednocześnie, w tych samych odstępach czasu, pobrano kilka próbek z supernatantów tych kultur. Próbki te trzymano w temperaturze 0°C aż do ich rozcieńczenia 1/50 w buforze węglanowym (pH 9,6). Następnie umieszczono je w mikrostudzienkach do ilościowej oceny obecności ApxI i ApxII metodą ELISA z zastosowaniem specyficznego monoklonalnego przeciwciał a dla każ dego Apx. Na podstawie wartości absorbancji przy 405 nm, dla każdej badanej próbki (prawa oś y), narysowano krzywe przedstawiające akumulację każdej z Apx w czasie (jasne symbole). Na (A), hodowla HP816 Nlr trójkąty i hodowla AppApxIH2- - koła, jasne symbole przedstawiają akumulację ApxI. Na (B), hodowla HP816 Nlr - trójkąty i hodowla AppApxI/IIH2- - koła, jasne symbole przedstawiają akumulację ApxII. Na (C), hodowla HP816RI - trójkąty i hodowla HP816R2 - koła, przedstawiają akumulację ApxI, a jasne koła przedstawiają nagromadzenie ApxII.Fig. 5 shows three plots of the growth curves of different cultures, determined (dark symbols) from the absorbance values, at 600 nm, over 1 hour time intervals (left y-axis). Simultaneously, at the same time intervals, several samples were taken from the supernatants of these cultures. These samples were kept at 0 ° C until they were diluted 1/50 in carbonate buffer (pH 9.6). They were then placed in microwells to quantify the presence of ApxI and ApxII by ELISA using a specific monoclonal antibody for each Apx. Based on the absorbance values at 405 nm, for each sample tested (right y-axis), curves were drawn representing the accumulation of each Ap x over time (bright symbols). In (A), culture of HP816 Nl r triangles and culture of AppApxIH2 - - circles, bright symbols represent accumulation of ApxI. On (B), HP816 Nl r culture - triangles and AppApxI / IIH2 culture - - circles, bright symbols represent ApxII accumulation. In (C), HP816RI culture - triangles and HP816R2 culture - circles show ApxI accumulation and bright circles show ApxII accumulation.
Fig. 6Fig. 6
Panel (A) przedstawia barwienie błękitem Coomassie'go denaturującej elektroforezy na żelu poliakrylamidowym próbek supernatantów z kultur pobranych w 5 godzinie z 1) HP816 Nlr; 2) AppApxIH2-; 3) kontroli otrzymanej z App serotyp 4 (serotyp 4 App wytwarza i wydziela ApxII o wielkości 105 kD i ApxIII o wielkoś ci 115 kD, lecz nie ApxI); i M) marker masy czą steczkowej (wskazano stosowne prążki 110 i 120 kD). (B) przedstawia Western-blot żelu z próbkami identycznymi z tymi analizowanymi na żelu (A), wykrywanymi za pomocą monoklonalnego przeciwciała swoistego dla ApxI. (C) przedstawia Western-blot żelu z próbkami identycznymi z tymi z żelu (A) za wyjątkiem ścieżki 2, która zawiera próbkę supernatantu znad hodowli AppApxI/IIH2-. Nie załączono fotografii żelu, ponieważ rozkład prążków jest identyczny z tym, który występuje na żelu (A). Ten transfer uzyskano stosując specyficzne monoklonalne przeciwciało przeciw ApxII. Należy zwrócić uwagę, że prążek 105 kD na ścieżce 3 jest wykrywany tylko na (C).Panel (A) shows the Coomassie blue staining of a denaturing polyacrylamide gel electrophoresis of samples of the supernatants of cultures taken at 5 time of 1) HP816 Nl r; 2) AppApxIH2 - ; 3) control obtained from App serotype 4 (App serotype 4 produces and secretes 105 kD ApxII and 115 kD ApxIII, but not ApxI); and M) molecular weight marker (appropriate bands 110 and 120 kD are indicated). (B) shows a gel Western-blot with samples identical to those analyzed on the gel (A), detected with an ApxI specific monoclonal antibody. (C) shows a gel Western-blot with samples identical to those in gel (A) except lane 2 which contains the AppApxI / IIH2 - culture supernatant sample. No photo of the gel is included because the pattern of the fringes is identical to that of the gel (A). This transfer was achieved using a specific monoclonal anti-ApxII antibody. Note that the 105 kD band on track 3 is detected only on (C).
Szczegółowy opis wynalazkuDetailed Description of the Invention
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania immunogennego i niehemolitycznego szczepu Actinobacillus pleuropneumoniae z wirulentnego App, scharakteryzowanego w następujących etapach:The subject of the invention is a method of obtaining an immunogenic and non-haemolytic strain of Actinobacillus pleuropneumoniae from a virulent App, characterized in the following steps:
- określa się transbłonowe domeny hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn Apx.- the transmembrane domains of Apx hemolytic and cytolytic exotoxins are determined.
- modyfikuje się co najmniej jeden fragment genu apxIA i ewentualnie segment genu apxIIA, który koduje transbłonową domenę Apx hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn Apx.- modifying at least one apxIA gene fragment and optionally the apxIIA gene segment which encodes the transmembrane Apx domain of the hemolytic and cytolytic Apx exotoxins.
Termin immunogenny oznacza, że szczep App otrzymany z zastosowaniem sposobu według wynalazku zachowuje nie zmienioną zdolność immunoprotekcyjną, co oznacza, że zawiera on wszystkie antygeny immunologicznie konieczne do wywołania silnej immunogennej odpowiedzi w organizmie gospodarza.The term immunogenic means that the App strain obtained using the method of the invention retains unaltered immunoprotective capacity, meaning that it contains all the immunologically necessary antigens to elicit a strong immunogenic response in the host organism.
Termin niehemolityczny oznacza, że szczep App, otrzymany z zastosowaniem sposobu według wynalazku, nie posiada aktywności hemolitycznej, co sprawia, że jest on niezjadliwy.The term non-haemolytic means that the App strain obtained using the method of the invention does not have haemolytic activity, which renders it avirulent.
Wyboru wirulentnego szczepu App, otrzymanego od zainfekowanych zwierząt cierpiących na tę chorobę, dokonuje się zgodnie ze zwykłymi metodami znanymi fachowcom w dziedzinie.Selection of a virulent App strain obtained from infected animals suffering from the disease is made according to the usual methods known to those skilled in the art.
Pierwszy etap obejmuje identyfikację transbłonowych domen App hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn Apx z zastosowaniem programów TransMem (Aloy i in.; Comp. Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997)) lub Helixmem (Eisenbeg i in.; J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)), które analizują sekwencje aminokwasowe hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn Apx, jak opisał dla E. coli Ludwig i in; Mol. Gene. Genet. 226: 198-208 (1991).The first step involves the identification of the transmembrane app domains of the hemolytic and cytolytic Apx exotoxins using the TransMem programs (Aloy et al.; Comp. Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997)) or Helixmem (Eisenbeg et al; J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)) which analyze the amino acid sequences of Apx hemolytic and cytolytic exotoxins as described for E. coli Ludwig et al; Moth. Gene. Genet. 226: 198-208 (1991).
Drugi etap obejmuje modyfikację co najmniej jednego segmentu genu apxIA i ewentualnie segmentu genu apxIIA, kodującego transbłonową domenę hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx.The second step involves modifying at least one segment of the apxIA gene, and optionally a segment of the apxIIA gene, encoding the transmembrane domain of the Apx hemolytic and cytolytic exotoxin.
Termin „modyfikacja odnosi się do modyfikacji genu albo z zastosowaniem typowych technik rekombinacji DNA, które obejmują: substytucję jednego lub kilku nukleotydów, insercję jednego lub kilku nukleotydów, częściową lub całkowitą delecję genu, albo przez rozbicie przez chemiczną lub wywołaną napromienianiem mutagenezę.The term "modification" refers to the modification of a gene either by conventional recombinant DNA techniques, which include: one or more nucleotide substitution, one or more nucleotide insertion, a partial or complete deletion of a gene, or by disruption by chemical or radiation induced mutagenesis.
W korzystnym rozwiązaniu modyfikację przeprowadza się przez delecję, w co najmniej jednym segmencie, genu apxIA i ewentualnie w segmencie genu apxIIA, kodującego transbłonową domenę hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx.In a preferred embodiment, the modification is carried out by deleting, in at least one segment, the apxIA gene and optionally a segment of the apxIIA gene encoding the transmembrane domain of the Apx hemolytic and cytolytic exotoxin.
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
Domeny transbłonowe, występujące w genach apxIA i apxIIA hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny, wykrywano stosując wyżej wymienione programy Transmem i Helixmem. Przewidywanie przeprowadzone na podstawie sekwencji aminokwasowych hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn ApxI i ApxII wskazuje, że domeny transbłonowe, występują w następujących obszarach sekwencji egzotoksyny:The transmembrane domains found in the apxIA and apxIIA genes of the hemolytic and cytolytic exotoxin were detected using the Transmem and Helixm programs mentioned above. A prediction based on the amino acid sequences of the hemolytic and cytolytic exotoxins ApxI and ApxII indicates that transmembrane domains are present in the following regions of the exotoxin sequence:
- pierwsza domena transbłonowa H1: pomię dzy aminokwasami 233 i 253 odpowiadająca nukleotydom 697 do 759 apxl.- first transmembrane domain H1: between amino acids 233 and 253 corresponding to nucleotides 697 to 759 of apxl.
- druga domena transbłonowa H2: pomiędzy aminokwasami 296 i 315, odpowiadająca nukleotydom 886 do 945 apxl- second H2 transmembrane domain: between amino acids 296 and 315, corresponding to nucleotides 886 to 945 apxl
- trzecia domena transbł onowa H3: pomię dzy aminokwasami 369 do 405, odpowiadają ca nukleotydom 1105 do 1215 apxl- third transmembrane domain H3: between amino acids 369 to 405, corresponding to nucleotides 1105 to 1215 apxl
W korzystnym rozwiązaniu, modyfikację przeprowadza się za pomocą delecji w segmencie genu apxIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI szczepu App.In a preferred embodiment, the modification is performed by a deletion in the segment of the apxIA gene that encodes the second transmembrane domain of the ApxI exotoxin of strain App.
Korzystnie, modyfikację przeprowadza się na drodze delecji nukleotydów 886 do 945 genu apxIA, kodującego drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI App.Preferably, the modification is performed by deleting nucleotides 886 to 945 of the apxIA gene encoding the second transmembrane domain of the ApxI App exotoxin.
W innym korzystnym rozwiązaniu, sposób według wynalazku, obejmuje ponadto uzyskanie dodatkowej delecji w segmencie genu apxIIA, kodującego drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII App. Korzystnie, delecji nukleotydów 886 do 945 genu apxIIA, kodującego drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII App.In another preferred embodiment, the method of the invention further comprises obtaining an additional deletion in a segment of the apxIIA gene encoding the second transmembrane domain of the ApxII App exotoxin. Preferably, the deletion of nucleotides 886 to 945 of the apxIIA gene encoding the second transmembrane domain of the ApxII exotoxin App.
W korzystnym rozwią zaniu wedł ug wynalazku, które szczegó ł owo opisano w części „przykłady, uzyskano immunogenny niehemolityczny szczepu App stosując proces obejmujący następujące etapy:In a preferred embodiment of the invention, which is described in detail in the "Examples" section, an immunogenic non-haemolytic strain of App was obtained using a process comprising the following steps:
A. Wybór wirulentnego szczepu App.A. Selection of a Virulent Strain App.
B. Przewidywanie helis alfa domeny transbłonowej białek ApxI i ApxII w celu zaprojektowania kostruktu nukleotydowego, umożliwiającego delecję w drugiej domenie transbłonowej obu białek bez oddziaływania na proces fałdowania i zdolności uzyskanych hemolizyn do interakcji ze specyficznymi receptorami błonowymi.B. Anticipation of the alpha helix of the transmembrane domain of the ApxI and ApxII proteins in order to design a nucleotide structure that allows deletion in the second transmembrane domain of both proteins without affecting the folding process and the ability of the resulting hemolysins to interact with specific membrane receptors.
C. Konstrukcja wektora zdolnego do integracji z genomem App i zawierającego geny markerowe, które umożliwiają efektywny sposób monitorowania integracji takiego wektora.C. Construction of a vector capable of integrating into the App genome and containing marker genes that allow an efficient way of monitoring the integration of such a vector.
C.1. Konstrukcja hybrydowego plazmidu pGP3, mającego miejsce startu replikacji RK 6, miejsce startu transferu RP4 i gen oporności na kanamycynę. Ponadto, włączono gen fluorescencyjnego białka GPVUV (dalej nazywany GFP) pod kontrolą promotora ptac i terminatora rrnB. Miejsce wielokrotnego klonowania także zmodyfikowano, aby ułatwić późniejsze wprowadzenie sekwencji DNA.C.1. Construction of pGP3 hybrid plasmid having an RK 6 origin of replication, an RP4 transfer start site and a kanamycin resistance gene. In addition, the fluorescent GPVUV protein gene (hereinafter referred to as GFP) was incorporated under the control of the ptac promoter and the rrnB terminator. The multiple cloning site was also modified to facilitate the subsequent insertion of the DNA sequence.
C.2. Konstrukcja hybrydowego wektora, zawierającego sekwencje oskrzydlające 5' i 3' drugiej transbłonowej helisy, określonej przez gen apxIA. Zatem, w celu wybrania i sklonowania takich fragmentów sąsiadujących z końcami 5' i 3' segmentu, który koduje drugą transbłonową helisę w genie apxIA skonstruowano hybrydowy plazmid ρΑρχΙΙΔΗ2. Plazmid ten zastosowano jako końcowy wektor do transformacji App.C.2. Construction of a hybrid vector containing the 5 'and 3' flanking sequences of the second transmembrane helix defined by the apxIA gene. Thus, in order to select and clone such fragments adjacent to the 5 'and 3' ends of a segment that encodes the second transmembrane helix in the apxIA gene, a hybrid plasmid ρΑρχΙΙΔΗ2 was constructed. This plasmid was used as the final transformation vector for App.
C. 3. Konstrukcja hybrydowego wektora, zawierającego sekwencje oskrzydlające 5' i 3' drugiej transbłonowej helisy określonej przez gen apxIIA. Zatem, w celu wybrania i sklonowania takich fragmentów przylegających do końców 5' i 3' segmentu, który koduje drugą transbłonową helisę w genie apxIIA skonstruowano hybrydowy plazmid pAppx^H2. Plazmid ten zastosowano jako końcowy wektor do transformacji App.C. 3. Construction of a hybrid vector containing the 5 'and 3' flanking sequences of the second transmembrane helix defined by the apxIIA gene. Thus, in order to select and clone such fragments adjacent to the 5 'and 3' ends of a segment that encodes the second transmembrane helix in the apxIIA gene, the hybrid plasmid pAppx ^ H2 was constructed. This plasmid was used as the final transformation vector for App.
D. Konstrukcja zrekombinowanych bakterii, zawierających wprowadzony do genomu plazmid hybrydowy.D. Construction of recombinant bacteria containing the hybrid plasmid introduced into the genome.
D.1. Konstrukcja zrekombinowanego szczepu App nazwanego HP816R1, który włącza hybrydowy plazmid pApxI.\H2 do genomu App w wyniku unikalnej homologicznej rekombinacji pomiędzy takim plazmidem i genomem App HP816 Nlr, który to szczep jest szczepem opornym na kwas nalidyksowy, otrzymanym w wyniku spontanicznej mutacji szczepu App HP816.D.1. Construction of a recombinant App strain named HP816R1 which integrates the hybrid plasmid pApxI. \ H2 into the App genome as a result of unique homologous recombination between such plasmid and the App HP816 Nl r genome, which strain is a nalidixic acid resistant strain obtained by spontaneous mutation of the App strain HP816.
D.2. Konstrukcja szczepu AppApxIH2- z zastosowaniem procedury umożliwiającej, gdy zidentyfikuje się zrekombinowane bakterie otrzymane w etapie 1, oddzielenie zrekombinowanego wektora zintegrowanego z genomem poprzez drugą homologiczną rekombinację, jak również wykrywanie i izolację bakterii, które, z uwagi na tę drugą rekombinację, posiadają częściową delecję genu apxIA.D.2. Construction of the AppApxIH2 strain - using a procedure that allows, when the recombinant bacteria obtained in step 1 are identified, the separation of the recombinant vector integrated into the genome by a second homologous recombination, as well as the detection and isolation of bacteria which, due to the latter recombination, have a partial gene deletion apxIA.
D.3. Konstrukcja zrekombinowanego szczepu App HP816R2, który włącza hybrydowy plazmid pApxI.\H2 do genomu AppApxIH2- w wyniku unikalnej homologicznej rekombinacji pomiędzy takim plazmidem i genomem AppApxIH2-.D.3. Construction of the recombinant App HP816R2 strain, which integrates the hybrid plasmid pApxI. \ H2 into the AppApxIH2 genome - as a result of unique homologous recombination between such plasmid and the AppApxIH2 genome - .
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
D.4. Konstrukcja szczepu AppApxI/IIH2- z zastosowaniem procedury umożliwiającej, po zidentyfikowaniu zrekombinowanych bakterii otrzymanych w etapie D.3, oddzielenie zrekombinowanego wektora zintegrowanego z genomem za pomocą drugiej homologicznej rekombinacji, jak również wykrycie i wyizolowanie bakterii, które, na skutek drugiej rekombinacji, nabyły częściową delecję w genie apxIIA.D.4. Construction of the AppApxI / IIH2 strain - using a procedure that allows, after identifying the recombinant bacteria obtained in step D.3, the separation of the recombinant vector integrated into the genome by means of a second homologous recombination, as well as the detection and isolation of bacteria which, as a result of the second recombination, have acquired partial a deletion in the apxIIA gene.
Zgodnie z wynalazkiem otrzymany mutant AppApxIH2- jest identyczny z oryginalnym szczepem App typu dzikiego, za wyjątkiem delecji nukleotydów 886 do 945 (obu włącznie) sekwencji kodującej genu apxIA, co wiąże się z brakiem aminokwasów 296 do 315 (obu włącznie) w wytwarzanej ApxI.According to the invention, the resulting AppApxIH2 mutant - is identical to the original wild-type App strain, except for the deletion of nucleotides 886 to 945 (both inclusive) of the coding sequence of the apxIA gene, which results in a lack of amino acids 296 to 315 (both inclusive) in the produced ApxI.
Zgodnie z wynalazkiem, otrzymany mutant AppApxI/IIH2- jest identyczny ze szczepem ApppxIH2 za wyjątkiem delecji nukleotydów 886 do 945 (obu włącznie) sekwencji kodującej genu apxIIA, co wiąże się z brakiem aminokwasów 296 do 315 (obu włącznie) w wytwarzanej ApxII.According to the invention, the resulting AppApxI / IIH2 mutant- it is identical to the ApppxIH2 strain except for the deletion of nucleotides 886 to 945 (both inclusive) of the coding sequence of the apxIIA gene, which results in the absence of amino acids 296 to 315 (both inclusive) in the produced ApxII.
W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku jedyną modyfikacją wprowadzaną do genomu App jest delecja 60 par zasad w sekwencjach kodujących genów apxIA i apxIIA oraz substytucja ich przez miejsca restrykcyjne, w tym przypadku odpowiadające odpowiednio miejscom dla enzymów XholI i EcoRI. Do genomu App nie wprowadza się żadnych dodatkowych insercji sekwencji pochodzących od plazmidowego DNA (jak na przykład gen oporności na kanamycynę). Umożliwia to zmodyfikowanie otrzymanego szczepu w tym samym genie lub w innym docelowym genie w dokładnie ten sam sposób, który zastosowano do przeprowadzenia pierwszej modyfikacji. Z drugiej strony, unika się oporności uzyskanego szczep na wiele antybiotyków, co jest cechą pożądaną w szczepie stosowanym jako żywa szczepionka.In a preferred embodiment of the invention, the only modification introduced into the App genome is the deletion of 60 base pairs in the coding sequences of the apxIA and apxIIA genes and their substitution by restriction sites, in this case corresponding to the sites for the XholI and EcoRI enzymes, respectively. No additional insertions of plasmid DNA-derived sequences (such as the kanamycin resistance gene) are introduced into the App genome. This allows the resulting strain to be modified in the same gene or in a different target gene in exactly the same way that was used to carry out the first modification. On the other hand, the resistance of the resulting strain to multiple antibiotics is avoided, which is a desirable feature in a strain used as a live vaccine.
Stosowane miejsce restrykcyjne według wynalazku nie jest najważniejsze. Chociaż można zastosować konstrukcję, która nie wprowadza miejsc restrykcyjnych - jej zastosowanie jest korzystne z uwagi na występowanie dodatkowego mechanizmu do wykrywania pożądanych zrekombinowanych klonów i z uwagi na możliwość obserwacji trwałości otrzymanego szczepu lub szczepów. Zatem można posłużyć się dowolnym miejscem, pod warunkiem, że nie wprowadza się kodonu stop syntezy białka i że uzyska się fragmenty restrykcyjne możliwe do zanalizowania metodą elektroforezy (tj. powyżej 100 par zasad) z oskrzydlającymi fragmentami restrykcyjnymi, które mogły uprzednio występować w genomie App.The restriction site used according to the invention is not the most important. While a construction which does not introduce restriction sites can be used, its use is advantageous because of the additional mechanism for detecting the desired recombinant clones and because the stability of the resulting strain or strains can be observed. Thus, any site can be used, provided that no stop codon for protein synthesis is introduced and that restriction fragments are obtained which can be analyzed by electrophoresis (i.e. greater than 100 bp) with flanking restriction fragments that may have previously existed in the App genome.
Wynalazek obejmuje także szczep App otrzymany zgodnie z powyżej opisanym sposobem.The invention also includes an App strain obtained according to the above-described method.
Innym przedmiotem wynalazku jest szczep App charakteryzujący się delecją nukleotydów 886 do 945 w genie apxIA, które kodują drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI, zdeponowany w Colección Espań ola de Cultivos Tipo (Spanish Collection of Type Cultures) pod numerem rejestracyjnym CECT 5985, zgodnie z Traktatem Budapesztańskim z 28 kwietnia 1977, lub jego mutant.Another subject of the invention is an App strain characterized by a deletion of nucleotides 886 to 945 in the apxIA gene, which encode the second transmembrane domain of the ApxI exotoxin, deposited at Colección España ola de Cultivos Tipo (Spanish Collection of Type Cultures) under the registration number CECT 5985, in accordance with the Budapest Treaty. on April 28, 1977, or its mutant.
Innym przedmiotem wynalazku jest szczep App charakteryzujący się delecją nukleotydów 886 do 945 w genie apxIA, które kodują drugą transbłonową domenę egzotoksyny ApxI i dodatkowo delecją nukleotydów 886 do 945 w genie apxIIA, które kodują drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII, zdeponowany w Spanish Collection of Type Cultures pod numerem rejestracyjnym CECT 5994, zgodnie z Traktatem Budapesztańskim, lub jego mutant.Another subject of the invention is an App strain characterized by a deletion of nucleotides 886 to 945 in the apxIA gene, which encode the second transmembrane domain of the ApxI exotoxin, and additionally a deletion of nucleotides 886 to 945 in the apxIIA gene, which encodes the second transmembrane domain of the ApxII exotoxin, deposited in the Spanish Collection of Type Cultures under the registration number CECT 5994 according to the Budapest Treaty, or a mutant thereof.
Wynalazek dotyczy także szczepionek do ochrony zwierząt przed zapaleniem płuc i opłucnej u ś wiń. Te szczepionki można wytworzyć zgodnie z stosowanymi zwyczajowo sposobami znanymi fachowcom w dziedzinie.The invention also relates to vaccines for the protection of animals against swine pneumonia and pleurisy. These vaccines can be prepared according to the usual methods known to those skilled in the art.
Te szczepionki zawierają bakterie żywego atenuowanego szczepu App w ilości wywołującej odpowiedź immunologiczną, otrzymane zgodnie ze sposobem według wynalazku. Termin „wywołujący odpowiedź immunologiczną oznacza, że bakterie w szczepionce podawane są w ilości wystarczającej do indukcji w organizmie gospodarza skutecznej odpowiedzi immunologicznej na infekcję spowodowaną przez wirulentne formy App.These vaccines contain live attenuated App strain bacteria in an amount inducing an immune response, obtained according to the method of the invention. The term "eliciting an immune response" means that the bacteria in the vaccine are administered in an amount sufficient to induce in the host an effective immune response to infection by virulent forms of App.
Stosowane dawkowanie będzie zależeć od wieku i masy szczepionego zwierzęcia oraz postaci podawania.The dosage employed will depend on the age and weight of the animal to be vaccinated and the form of administration.
Szczepionka może zawierać bakterie w dowolnej dawce wystarczającej do indukcji odpowiedzi immunologicznej. Odpowiednie dawkowanie obejmuje zakres pomiędzy 103 i 1010.The vaccine may contain the bacteria in any dose sufficient to induce an immune response. Suitable dosage includes a range of between 10 3 and 10 10.
Szczepionka może ponadto zawierać farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą. Ta substancja pomocnicza może być po prostu wodą, lecz może także obejmować płynne podłoże hodowlane, na którym rosły bakterie lub roztwór o fizjologicznym stężeniu soli.The vaccine may further contain a pharmaceutically acceptable excipient. This excipient may simply be water, but may also include a liquid culture medium on which bacteria have grown, or a saline solution.
Inny przykład farmaceutycznie dopuszczalnej substancji pomocniczej, przydatnej według wynalazku obejmuje stabilizatory, węglowodany (tj.: glukozę, sacharozę, mannitol, sorbitol) i bufory (tj.: bufory fosforanowe).Another example of a pharmaceutically acceptable excipient useful in the invention includes stabilizers, carbohydrates (i.e., glucose, sucrose, mannitol, sorbitol) and buffers (i.e., phosphate buffers).
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
Ewentualnie, do szczepionki można dodawać inne składniki pomocnicze. Te substancje pomocnicze są niespecyficznymi stymulantami układu immunologicznego, które zwiększają odpowiedź immunologiczną gospodarza na atakujące patogeny. Przykłady środków wspomagających obejmują: witaminę E i olej roślinny.Optionally, other adjuvants can be added to the vaccine. These excipients are non-specific immune system stimulants that increase the host's immune response to invading pathogens. Examples of adjuvants include: vitamin E and vegetable oil.
Szczepionkę można podawać zwierzętom donosowo, doskórnie, podskórnie, jako aerozol lub domięśniowo.The vaccine may be administered to animals intranasally, intradermally, subcutaneously, as an aerosol, or intramuscularly.
Przemysłowe zastosowanie wynalazku łatwo wywnioskować z opisu. Warto wspomnieć, że zapalenie płuc i opłucnej u świń jest występującą na całym świecie zakaźną chorobą układu oddechowego powodującą poważne straty ekonomiczne w przemyśle hodowlanym świń oraz że sposób według wynalazku otrzymywania immunogennych, niehemolitycznych szczepów App umożliwia wytwarzanie skutecznej szczepionki do zwalczania zapalenia płuc i opłucnej u świń.The industrial application of the invention is readily apparent from the description. It is worth mentioning that porcine pneumonia and pleurisy is an infectious respiratory disease worldwide causing severe economic losses to the pig breeding industry, and that the method of the invention for obtaining immunogenic, non-haemolytic App strains enables the production of an effective vaccine to combat swine pneumonia and pleura .
Poniższe przykłady zamieszczono w celu dostarczenia fachowcom w dziedzinie dostatecznie obszernego i wyczerpującego objaśnienia wynalazku, lecz nie należy ich traktować jako ograniczania jego zasadniczych aspektów opisanych w poprzedniej części tego opisu.The following examples are provided to provide those skilled in the art with a sufficiently comprehensive and comprehensive explanation of the invention, but are not to be construed as limiting the essential aspects thereof as described in the preceding section of this specification.
P r z y k ł a dP r z k ł a d
Techniki i metody rekombinacji DNA stosowane poniżej opisali szczegółowo Sambrook i Russell (w Molecular Cloning wyd. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001) i Ausubel i in.; Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998)). Wszystkie produkty PCR wklonowano uprzednio do plazmidu pBE przed strawieniem enzymami restrykcyjnymi. Ten plazmid jest pochodną wektora pBluescript SK2 (Stratagene) i posiada miejsce wielokrotnego klonowania zastąpione krótką nukleotydową sekwencją, która wyznacza jedynie miejsce restrykcyjne dla enzymu restrykcyjnego EcoRV.The recombinant DNA techniques and methods used below are described in detail by Sambrook and Russell (in Molecular Cloning 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001) and Ausubel et al .; Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons , Inc. (1998)). All PCR products were previously cloned into the pBE plasmid prior to restriction digestion. This plasmid is derived from the pBluescript SK2 vector (Stratagene) and has a multiple cloning site replaced by a short nucleotide sequence that only designates a restriction site for the EcoRV restriction enzyme.
Szczep E. coli XL1-blue (Stratagene) zastosowano jako gospodarza dla wektorów hybrydowych na bazie plazmidów pUC118 lub pBluescript SK. Jako gospodarza dla wektorów hybrydowych na bazie plazmidu pGP704 użyto szczepu E. coli S17-1 λ pir (Simon i in.; Biotechnology 1:784-791 (1983).The E. coli XL1-blue strain (Stratagene) was used as the host for hybrid vectors based on the pUC118 or pBluescript SK plasmids. E. coli S17-1 λ pir strain (Simon et al .; Biotechnology 1: 784-791 (1983) was used as the host for the hybrid vectors based on the pGP704 plasmid.
Wszystkie poniżej opisane sekwencje oligonukleotydowe, o ile nie zaznaczono inaczej, pisane są w kierunku 5' do 3'. We wszystkich reakcjach PCR zastosowano termostabilną polimerazę Deep Vent (New England Biolabs), wykazującą aktywność poprawiającą test.All oligonucleotide sequences described below are written in the 5 'to 3' direction unless otherwise noted. Thermostable Deep Vent polymerase (New England Biolabs) was used in all PCR reactions, exhibiting assay-enhancing activity.
A. Wybór wirulentnego szczepu AppA. Selection of a Virulent Strain App
Jako szczep App typu dzikiego wybrano szczep HP816, odpowiadający występującemu w naturze serotypowi typu 1 App, należący do Laboratorios Hipra S.A. (Amer - Girona - Spain).The strain HP816, corresponding to the naturally occurring serotype 1 App, belonging to Laboratorios Hipra S.A. was selected as the wild-type App strain. (Amer - Girona - Spain).
Szczep HP816Nlr jest szczepem odpornym na kwas nalidyksowy otrzymanym ze spontanicznego mutanta HP816 typu dzikiego.Strain HP816Nl r is a nalidixic acid resistant strain derived from the spontaneous wild-type mutant HP816.
B. Identyfikacja domen transbłonowych egzotoksyn ApxI i ApxIIB. Identification of the transmembrane domains of the ApxI and ApxII exotoxins
Trzy domeny transbłonowe, które przyjmują strukturę α-helisy zidentyfikowano za pomocą programów TransMem (Aloy i in.; Comp. Appl. Biosc. 13:213-234 (1997) i Helixmem (Eisenbeg i in.; J. Mol. Biol,179: 125-142 (1984) jak opisano dla E. coli (Ludwig i in.; Mol. Gene. Genet. 226:198-208 (1991) stosowanych do sekwencji aminokwasowej ApxI pochodzącej ze szczepu o serotypie 1 (Frey i in.; Gene 142: 97-102 (1994) i ApxII z serotypu typu 9 (Smits i in.; Infection and Immunity 59:44974504 (1991). Te programy wykryły trzy regiony, mogące działać jako transbłonowe helisy w obydwu białkach (fig 1): pierwsza domena transbłonowa znajduje się pomiędzy aminokwasami 233 i 253 (H1); druga domena transbłonowa znajduje się pomiędzy aminokwasami 296 i 315 (H2), a trzecia domena transbłonowa pomiędzy aminokwasami 369 i 405 (H3) białka ApxI.Three transmembrane domains that adopt an α-helix structure were identified using the TransMem programs (Aloy et al .; Comp. Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997) and Helixmem (Eisenbeg et al .; J. Mol. Biol, 179) : 125-142 (1984) as described for E. coli (Ludwig et al .; Mol. Gene. Genet. 226: 198-208 (1991) applied to the ApxI amino acid sequence derived from the serotype 1 strain (Frey et al .; Gene 142: 97-102 (1994) and ApxII from serotype 9 (Smits et al .; Infection and Immunity 59: 44974504 (1991). These programs detected three regions that could act as transmembrane helices in both proteins (Fig 1): the first transmembrane domain is between amino acids 233 and 253 (H1); the second transmembrane domain is between amino acids 296 and 315 (H2) and the third transmembrane domain is between amino acids 369 and 405 (H3) of ApxI.
C. Konstrukcja hybrydowych wektorów, zdolnych do włączenia się do genomu AppC. Construction of hybrid vectors capable of being integrated into the App genome
Na fig. 2 można zobaczyć mapy plazmidów, które opisano w tej części.In Fig. 2, you can see the plasmid maps that are described in this section.
C.1. Konstrukcja zrekombinowanego plazmidu pGP3 Plazmid pGP704 (Miller i Mekalanos; J. Bact. 170:2575- 2583 (1988) przecięto jednocześnie enzymami restrykcyjnymi BglII i EcoRI. Stosując elektroforezę w żelu agarozowym wyizolowano 3,7 kb fragment DNA. Ten fragment inkubowano Iigując razem z oligonukleotydami pGP5' (GAT CGA ATT CAG GAT ATC ACA GAT CT) (SEQ ID nr 3) i pGP3' (ATT TAG ATC TGT GAT ATC GTG AAT TC) (SEQ ID nr 4). Otrzymany zrekombinowany plazmid nazwano pGP1.C.1. Construction of the recombinant pGP3 plasmid The plasmid pGP704 (Miller and Mekalanos; J. Bact. 170: 2575-2583 (1988) was cut simultaneously with the restriction enzymes BglII and EcoRI. A 3.7 kb DNA fragment was isolated by agarose gel electrophoresis. This fragment was incubated by ligating together with oligonucleotides pGP5 '(GAT CGA ATT CAG GAT ATC ACA GAT CT) (SEQ ID No. 3) and pGP3' (ATT TAG ATC TGT GAT ATC GTG AAT TC) (SEQ ID No. 4) The resulting recombinant plasmid was named pGP1.
Plazmid pGP1 strawiono enzymem restrykcyjnym PstI. Stosując elektroforezę w żelu agarozowym wyizolowano 3,12 kb fragment DNA. Ten fragment zligowano z innym fragmentem o wielkościThe pGP1 plasmid was digested with the restriction enzyme PstI. A 3.12 kb DNA fragment was isolated by agarose gel electrophoresis. This fragment was ligated with a different size fragment
1,2 kb otrzymanym przez strawienie plazmidu pUC4K (Pharmacia) enzymem restrykcyjnym PstI.1.2 kb obtained by digesting plasmid pUC4K (Pharmacia) with the restriction enzyme PstI.
Tak otrzymany zrekombinowany plazmid nazwano pGP2.The thus obtained recombinant plasmid was named pGP2.
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
Stosując plazmid pMAL-p2 (New England Biolabs) sekwencje odpowiadające promotorowi ptac zamplifikowano metodą PCR stosując primery oligonukleotydowe ptac5' (GAA TTC AAT GCT TCT GGC GTC AG) (SEQ ID nr 5) i ptac3' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID nr 6), które zawierają odpowiednie miejsca restrykcyjne dla EcoRI i KpnI na swych końcach 5'. Także z plazmidu pMAL-p2, metodą PCR zamplifikowano sekwencje odpowiadające rho-niezależnemu terminatorowi operonu rrnB stosując primerowe oligonukleotydy rrnB5' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID nr 7) i rrnB3' (GAA TTC AAG AGT TTG TAG AAA CGC) (SEQ ID nr 8), które zawierają miejsca restrykcyjne odpowiednio dla KpnI i EcoRI na swych końcach 5'. Wielkość zamplifikowanego fragmentu DNA wynosiła 278 par zasad (pz).Using the pMAL-p2 plasmid (New England Biolabs), the sequences corresponding to the ptac promoter were amplified by PCR using the oligonucleotide primers ptac5 '(GAA TTC AAT GCT TCT GGC GTC AG) (SEQ ID No. 5) and ptac3' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC ) (SEQ ID NO: 6) which contain the appropriate restriction sites for EcoRI and KpnI at their 5 'ends. Also from the pMAL-p2 plasmid, the sequences corresponding to the rho-independent terminator of the rrnB operon were amplified by PCR using primer oligonucleotides rrnB5 '(GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID No. 7) and rrnB3' (GAA TTC AAG AA AGT TTG CGC) (SEQ ID NO: 8), which contain restriction sites for KpnI and EcoRI, respectively, at their 5 'ends. The size of the amplified DNA fragment was 278 base pairs (bp).
Z plazmidem pAG408 (Suarez i in.; Gene 196: 69-74 (1997) amplifikowano gen fuzyjny dla białka GFPUV z regionem wiążącym się z rybosomem genu atpE, stosując oligonukleotydy primerowe GFP5' (GGT ACC TAA TTT ACC AAC ACT AC) (SEQ ID nr 9) i GFP3' (GGT ACC TTA TTT GTA GAG CTC ATC) (SEQ ID nr 10), które zawierają miejsce restrykcyjne KpnI na swych końcach 5'. Amplifikowany fragment ma wielkość 830 pz.With the pAG408 plasmid (Suarez et al .; Gene 196: 69-74 (1997), a fusion gene for the GFPUV protein with the ribosome binding region of the atpE gene was amplified using GFP5 'primer oligonucleotides (GGT ACC TAA TTT ACC AAC ACT AC) (SEQ ID NO: 9) and GFP3 '(GGT ACC TTA TTT GTA GAG CTC ATC) (SEQ ID NO: 10) which contain a KpnI restriction site at their 5' ends. The amplified fragment is 830 bp in size.
Dwa pierwsze fragmenty (promotor ptac i terminator rrnB) strawiono enzymami restrykcyjnymi KpnI i EcoRI, podczas gdy ten trzeci (gen fuzyjny atpE-GFPUV) strawiono enzymem restrykcyjnym KpnI. Otrzymane w ten sposób trzy fragmenty następnie zligowano z plazmidem pGP2, który uprzednio zdefosforylowano i przecięto enzymem restrykcyjnym EcoRI. Spośród różnych otrzymanych zrekombinowanych plazmidów wybrano jeden, będący nośnikiem trzech fragmentów umieszczonych zgodnie z fig. 2. Kolonie, które zawierały ten plazmid, wykazywały intensywną fluorescencję w odpowiedzi na ekspozycję na światło ultrafioletowe. Tak otrzymany hybrydowy plazmid nazwano pGP3.The first two fragments (ptac promoter and rrnB terminator) were digested with the restriction enzymes KpnI and EcoRI, while the third one (atpE-GFPUV fusion gene) was digested with the restriction enzyme KpnI. The three fragments thus obtained were then ligated into the pGP2 plasmid, which had been previously dephosphorylated and cut with the restriction enzyme EcoRI. Of the various recombinant plasmids obtained, one was selected to carry the three fragments placed according to Figure 2. Colonies that contained this plasmid showed intense fluorescence in response to exposure to ultraviolet light. The hybrid plasmid thus obtained was named pGP3.
C.2. Konstrukcja hybrydowego plazmidu pApx^H2C.2. Construction of the pApx ^ H2 hybrid plasmid
Na tym etapie, pierwszym zadaniem było otrzymanie fragmentu DNA przylegającego do końca 5' fragmentu kodującego drugą transbłonową helisę genu apxIA. W tym celu fragment o długości 897 pz zamplifikowano metodą PCR z oczyszczonego genomowego DNA szczepu App HP816 stosując jako primery oligonukleotydy Apxla5' (GAT ATC ATG GCT AAC TCT CTC AGC TCG ATA G) (SEQ ID nr 11) i Apxla3' (CTC GAG GCC TGC CGC CAC ACG TTG) (SEQ ID nr 12), zawierające miejsca restrykcyjne dla EcoRV i XhoI na swych odpowiednich końcach 5'. Siódma zasada oligonukleotydu Apxla5' (SEQ ID nr 9) odpowiada pierwszej zasadzie kodonu start translacji genu apxIA. Siódma zasada oligonukleotydu Apxla3' (SEQ ID nr 10) jest komplementarna do 885 zasady sekwencji kodującej genu apxIA, przy czym ta ostatnia jest ostatnią zasadą przed początkiem sekwencji dla drugiej transbłonowej helisy.At this stage, the first task was to obtain a DNA fragment adjacent to the 5 'end of the fragment encoding the second transmembrane helix of the apxIA gene. For this purpose, the 897 bp fragment was amplified by PCR from purified genomic DNA of the App HP816 strain using as primers the oligonucleotides Apxla5 '(GAT ATC ATG GCT AAC TCT CTC AGC TCG ATA G) (SEQ ID No. 11) and Apxla3' (CTC GAG GCC TGC CGC CAC ACG TTG) (SEQ ID NO: 12), containing EcoRV and XhoI restriction sites at their respective 5 'ends. The seventh base of the Apxla5 'oligonucleotide (SEQ ID NO: 9) corresponds to the first base of the translation start codon of the apxIA gene. The seventh base of the Apxla3 'oligonucleotide (SEQ ID NO: 10) is complementary to base 885 of the coding sequence of the apxIA gene, the latter being the last base before the beginning of the sequence for the second transmembrane helix.
Drugim zadaniem w tej fazie było otrzymanie fragmentu DNA przylegającego do końca 3' kodującego segmentu drugiej transbłonowej helisy genu apxIA. W tym celu, posługując się metodą PCR zamplifikowano fragment o długości 1042 pz z oczyszczonego genomowego DNA szczepu App HP816, stosując jako primery oligonukleotydy Apxlb5' (CTC GAG CCG CTT TCG TTC TTA AAT GTT GCG) (SEQ ID nr 13) i Apxlb3' (AGA TCT TCA CCG GCT TTC TGT GCA CTT TG) (SEQ ID nr 14), które zawierają miejsca restrykcyjne XhoI i BglII na odpowiednich końcach 5'. Siódma zasada oligonukleotydu Apxlb5' (SEQ ID nr 13) odpowiada zasadzie 946 sekwencji kodującej genu apxIA, stanowiąc tym samym pierwszą zasadę po końcu sekwencji drugiej transbłonowej helisy. Siódma zasada oligonukleotydu Apxlb3' (SEQ ID nr 14) jest komplementarna do zasady 1975 sekwencji kodującej genu apxIA.The second task in this phase was to obtain a DNA fragment adjacent to the 3 'end of the coding segment of the second transmembrane helix of the apxIA gene. For this purpose, the 1042 bp fragment from the purified genomic DNA of the App HP816 strain was amplified by PCR, using the oligonucleotides Apxlb5 '(CTC GAG CCG CTT TCG TTC TTA AAT GTT GCG) (SEQ ID No. 13) and Apxlb3' as primers ( AGA TCT TCA CCG GCT TTC TGT GCA CTT TG) (SEQ ID NO: 14) which contain XhoI and BglII restriction sites at the respective 5 'ends. The seventh base of the Apxlb5 'oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) corresponds to base 946 of the coding sequence of the apxIA gene, thus constituting the first base after the end of the second transmembrane helix sequence. The seventh base of the Apxlb3 'oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) is complementary to base 1975 of the apxIA gene coding sequence.
Po otrzymaniu dwóch uprzednio opisanych fragmentów, pierwszy z nich strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRV i XhoI, natomiast drugi strawiono enzymami XhoI i BglII. Oba fragmenty następnie zligowano z wektorem pGP3, który uprzednio przecięto enzymami restrykcyjnymi EcoRV i BglII. Uzyskany hybrydowy plazmid nazwano pApx^H2.After obtaining the two previously described fragments, the first was digested with the restriction enzymes EcoRV and XhoI, while the second was digested with the enzymes XhoI and BglII. Both fragments were then ligated into the pGP3 vector, which had been previously cleaved with the restriction enzymes EcoRV and BglII. The resulting hybrid plasmid was named pApx ^ H2.
C.3. Konstrukcja hybrydowego plazmidu pApxI^H2C.3. Construction of the pApxI ^ H2 hybrid plasmid
Pierwszym zadaniem, na tym etapie, było otrzymanie fragmentu DNA przyległego do końca 5' segmentu kodującego drugiej transbłonowej helisy genu apxIIA. W tym celu, posługując się metodą PCR zamplifikowano 871 pz fragment z oczyszczonego genomowego DNA szczepu App HP816, stosując jako primery oligonukleotydy ApxIIa5' (GAT ATC AAA TCG TCC TTA CAA CAA GGA TTG) (SEQ ID nr 15) i ApxIIa3' (GAA TTC ACC TGA AGC GAC TCG TTG GGC) (SEQ ID nr 16), które zawierają miejsca restrykcyjne EcoRV i EcoRI na odpowiednich końcach 5'. Zasada numer 7 oligonukleotydu ApxIIa5' (SEQ ID nr 15) odpowiada zasadzie 27 sekwencji kodującej genu apxIIA. Siódma zasada oligonukleotydu ApxIIa3' (SEQ ID nr 16) jest komplementarna do zasady 885 sekwencji kodującej genu apxIIA, będąc tym samym ostatnią zasadą przed startem sekwencji dla drugiej transbłonowej helisy.The first task at this stage was to obtain a DNA fragment adjacent to the 5 'end of the coding segment of the second transmembrane helix of the apxIIA gene. To this end, an 871 bp fragment from the purified genomic DNA of the App HP816 strain was amplified by PCR using the oligonucleotides ApxIIa5 '(GAT ATC AAA TCG TCC TTA CAA CAA GGA TTG) (SEQ ID No. 15) and ApxIIa3' (GAA TTC as primers). ACC TGA AGC GAC TCG TTG GGC) (SEQ ID NO: 16) which contain EcoRV and EcoRI restriction sites at the respective 5 'ends. Base number 7 of the ApxIIa5 'oligonucleotide (SEQ ID NO: 15) corresponds to base 27 of the coding sequence of the apxIIA gene. The seventh base of the ApxIIa3 'oligonucleotide (SEQ ID NO: 16) is complementary to base 885 of the coding sequence of the apxIIA gene, thus being the last base before starting the sequence for the second transmembrane helix.
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
Drugim zadaniem tego etapu było otrzymanie fragmentu DNA przyległego do końca 3' segmentu kodującego drugiej transbłonowej helisy genu apxIIA. W tym celu metodą PCR zamplifikowano fragment o długości 952 pz z oczyszczonego genomowego DNA szczepu App HP816, jako primery stosując oligonukleotydy ApxIIb5' (GAA TTC CCT CTT TCA TTC TTA AAT GTA GC) (SEQ ID nr 17) i ApxIIb3' (AGA TCT GCC ATC AAT AAC GGT AGT ACT TG) (SEQ ID nr 18), które zawierają miejsca restrykcyjne dla EcoI i BglII na odpowiednich końcach 5'. Siódma zasada oligonukleotydu ApxIIb5' (SEQ ID nr 17) odpowiada zasadzie 946 sekwencji kodującej genu apxIIA, przy czym ta ostatnia jest pierwszą zasadą za końcem sekwencji drugiej transbłonowej helisy. Siódma zasada oligonukleotydu ApxIIb3' (SEQ ID nr 18) jest komplementarna do zasady 1845 sekwencji kodującej genu apxIIA.The second task of this step was to obtain a DNA fragment adjacent to the 3 'end of the coding segment of the second transmembrane helix of the apxIIA gene. For this purpose, a 952 bp fragment from the purified genomic DNA of the App HP816 strain was amplified by PCR, using oligonucleotides ApxIIb5 '(GAA TTC CCT CTT TCA TTC TTA AAT GTA GC) (SEQ ID No. 17) and ApxIIb3' (AGA TCT GCC as primers). ATC AAT AAC GGT AGT ACT TG) (SEQ ID NO: 18) which contain restriction sites for EcoI and BglII at the respective 5 'ends. The seventh base of the ApxIIb5 'oligonucleotide (SEQ ID NO: 17) corresponds to base 946 of the coding sequence of the apxIIA gene, the latter being the first base after the end of the second transmembrane helix sequence. The seventh base of the ApxIIb3 'oligonucleotide (SEQ ID NO: 18) is complementary to base 1845 of the coding sequence of the apxIIA gene.
Po otrzymaniu dwóch uprzednio opisanych fragmentów, pierwszy strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRV i EcoRI, podczas gdy drugi strawiono enzymami EcoRI i BglII. Oba fragmenty następnie zligowano z wektorem pGP3, uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRV i BglII. Powstały hybrydowy plazmid nazwano pApxI^H2.After obtaining the two previously described fragments, the first was digested with the restriction enzymes EcoRV and EcoRI, while the second was digested with the enzymes EcoRI and BglII. Both fragments were then ligated into the pGP3 vector, previously digested with the restriction enzymes EcoRV and BglII. The resulting hybrid plasmid was named pApxI ^ H2.
D. Konstrukcja zrekombinowanych bakterii, które usunęły hybrydowy plazmid wprowadzony do genomuD. Construction of recombinant bacteria that removed the hybrid plasmid introduced into the genome
D.1. Konstrukcja zrekombinowanego szczepu App HP816R1D.1. Construction of the recombinant App HP816R1 strain
Transformację App z zastosowaniem hybrydowego plazmidu pApx^H2 przeprowadzono przez koniugację z komórkami E. coli S17-1 λ pir, które są nośnikami tego plazmidu. Szczep HP816Nlr zastosowano do transformacji z użyciem hybrydowego plazmidu pApx^H2.Transformation of the App using the pApx ^ H2 hybrid plasmid was performed by conjugation with E. coli S17-1 λ pir cells, which are the carriers of this plasmid. The HP816N1 r strain was used for transformation with the pApx4H2 hybrid plasmid.
Przed przeprowadzeniem koniugacji, otrzymano hodowlę tych bakterii w fazie stacjonarnej. Do hodowli App816Nlr użyto podłoża hodowlanego TSYN (bulion Soya Tryptic 30 g/l, ekstrakt drożdżowy 6 g/l, jednokrotnie autoklawowany, uzupełniony 0,004% NAD) i kwasu nalidyksowego (50 μg/ml).Before carrying out conjugation, a culture of these bacteria was obtained in a stationary phase. For the cultivation of App816Nl r , TSYN culture medium (Soya Tryptic broth 30 g / L, yeast extract 6 g / L, autoclaved once, supplemented with 0.004% NAD) and nalidixic acid (50 µg / ml) were used.
Do hodowli E. coli S17-1 λ pir użyto podłoża hodowlanego LB (Trypton 10 g/l, ekstrakt drożdżowy 5g/l, NaCl 10g/l) jednokrotnie autoklawowanego, uzupełnionego 25 μg/ml kanamycyny. Po osiągnięciu stacjonarnej fazy wzrostu, do 1 ml 10 mM roztworu MgSO4 dodano 0,2-0,3 A600 jednostki hodowli App i 0,6-0,8 A600 jednostki hodowli E. coli. Następnie wirowano przez 2 minuty przy 15000 g i tak otrzymany osad ponownie zawieszono w 200 μl 10 mM roztworze MgSO4. Po otrzymaniu mieszaniny obu kultur, umieszczono ją na 2,5 cm i 0,45 nm filtrze nitrocelulozowym, uprzednio umieszczonym na płytce Petriego zawierającej podłoże TSYN uzupełnione 15 g/l agaru Noble. Po inkubacji przez 6 godzin w temperaturze 37°C filtr z koniugatem umieszczono w probówce zawierającej 2 ml PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM, KCl 2mM pH 7,4). Po energicznym wytrząsaniu, filtr usunięto i zawiesinę komórek wirowano przez 2 minuty przy 15000 g i osad ponownie zawieszono w 500 μl PBS. Tak otrzymaną zawiesinę rozdzielono na płytki Petriego z podłożem TSYN uzupełnionym 15 g/l agaru Noble, 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml kwasu nalidyksowego, w ilości 100 μl zawiesiny komórek na każdą płytkę Petriego. Uzyskane kultury inkubowano w temperaturze 37°C przez 24-36 godzin. Zgodnie z tą procedurą otrzymano 65 kolonii odpornych na kanamycynę i kwas nalidyksowy, do koniugacji z plazmidem pApxI.\H2, co równa się częstotliwości transformacji 1,3 x 10-7 dla każdej komórki receptorowej.LB culture medium (Trypton 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 10 g / L) once autoclaved, supplemented with 25 µg / ml kanamycin was used for the E. coli S17-1 λ pir cultivation. After reaching the stationary phase of growth, 0.2-0.3 A600 units of the App culture and 0.6-0.8 A600 units of the E. coli culture were added to 1 ml of a 10 mM MgSO4 solution. Then it was centrifuged for 2 minutes at 15,000 g and the pellet thus obtained was resuspended in 200 μl of 10 mM MgSO 4 solution. After obtaining the mixture of both cultures, it was placed on a 2.5 cm and 0.45 nm nitrocellulose filter previously placed in a petri dish containing TSYN medium supplemented with 15 g / L Noble agar. After incubation for 6 hours at 37 ° C, the conjugate filter was placed in a tube containing 2 ml of PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM, KCl 2mM pH 7.4). After vigorous shaking, the filter was removed and the cell suspension was centrifuged for 2 minutes at 15,000 g and the pellet resuspended in 500 µl PBS. The thus obtained suspension was dispensed into Petri dishes with TSYN medium supplemented with 15 g / L of Noble agar, 50 µg / ml of kanamycin and 50 µg / ml of nalidixic acid, in the amount of 100 µl of the cell suspension for each Petri dish. The resulting cultures were incubated at 37 ° C for 24-36 hours. According to this procedure, 65 kanamycin and nalidixic acid resistant colonies were obtained for conjugation with the pApxI. \ H2 plasmid, which equates to a transformation frequency of 1.3 x 10 -7 for each receptor cell.
Kilka kolonii powtórnie wysiano za pomocą ezy na płytkach Petriego zawierających podłoże LB uzupełnione 15 g/l Noble Agar, 0,004% NAD, 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml kwasu nalidyksowego. Wszystkie uzyskane kolonie wykazały wyraźną fluorescencję w odpowiedzi na ekspozycję na światło ultrafioletowe, co wskazuje na włączenie plazmidu do genomu App w wyniku unikalnej rekombinacji. Jak pokazano na fig. 3, gdyby zaszła podwójna rekombinacja, ekskoniuganty byłyby niezdolne do wzrostu w podłożu zawierającym kanamycynę. Obecność tego antybiotyku na płytkach umożliwia wzrost tylko tych rekombinantów, które wbudowały cały plazmid do swego genomu. Wskaźnikowy gen GFP umożliwia rozróżnienie, czy którakolwiek z kolonii odpornych na kanamycynę jest produktem mutacji spontanicznej.Several colonies were reseeded by loop in Petri dishes containing LB medium supplemented with 15 g / L Noble Agar, 0.004% NAD, 50 µg / ml kanamycin and 50 µg / ml nalidixic acid. All obtained colonies showed marked fluorescence in response to exposure to ultraviolet light, indicating the inclusion of the plasmid in the App genome as a result of unique recombination. As shown in Figure 3, if double recombination had occurred, the exconjugants would be unable to grow in a kanamycin containing medium. The presence of this antibiotic on the plates enables the growth of only those recombinants that have integrated the entire plasmid into their genome. The GFP pointer gene enables the discrimination whether any of the kanamycin resistant colonies are the product of a spontaneous mutation.
Na koniec, uzyskano rekombinanty z homologicznej rekombinacji pomiędzy plazmidem i genem apxIA. Zweryfikowano to przez obserwację hemolitycznej aktywności rekombinantów na płytkach Columbia z agarem z krwią, uzupełnionym 0,004% NAD (fig. 3, panel C). Rekombinanty zawierające plazmid pApx^H2 wykazują drastyczne zmniejszenie średnicy hemolitycznego halo w porównaniu z macierzystym szczepem HP816Nlr.Finally, recombinants were obtained from homologous recombination between the plasmid and the apxIA gene. This was verified by observing the haemolytic activity of the recombinants on Columbia blood agar plates supplemented with 0.004% NAD (Fig. 3, panel C). Recombinants containing the pApx4H2 plasmid show a drastic reduction in the diameter of the haemolytic halo compared to the parent strain HP816Nl r .
Jeden z rekombinantów zawierających plazmid pApxI.\H2 wybrano do późniejszego pasażowania i nazwano HP816R1.One of the recombinants containing the pApxI. 1 H 2 plasmid was selected for subsequent passaging and was named HP816R1.
D.2. Konstrukcja szczepu AppApxIH2- D.2. Construction of the AppApxIH2 strain -
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
Po otrzymaniu rekombinantów zawierających plazmid ρΑρχΙΔΗ2 wbudowany do genomu, ważne jest utrwalenie delecji w genomie App za pomocą drugiej rekombinacji. W tym celu jeden z rekombinantów uzyskanych w poprzednim etapie poddano serii pasażów w podłożu hodowlanym uzupełnionym tylko kwasem nalidyksowym. Podłoże nie zawierające kanamycyny pozwala na przeżycie bakterii, u których wystąpiła druga rekombinacja pomiędzy genomem App i zintegrowanym plazmidem. Ta druga rekombinacja powoduje powstanie dwóch różnych genotypów. W przypadku, gdy występuje ona w tym samym segmencie, w którym zaszła pierwsza rekombinacja, uzyskany genotyp będzie identyczny z macierzystym szczepem użytym w rozdziale D.1. Jeśli ta druga rekombinacja występuje w segmencie, w którym nie wystąpiła pierwsza rekombinacja, uzyskany genotyp będzie wykazywać delecję we fragmencie kodującym drugą transbłonową helisę hemolizyny (fig. 3, panel A). Pojawienie się rekombinantów można monitorować na kilka różnych sposobów: a) obserwując zanik fluorescencji po ekspozycji na światło ultrafioletowe; b) na podstawie wrażliwości na kanamycynę i c) ponowne pojawienie się hemolitycznego halo występującego w przypadku macierzystego szczepu użytego w rozdziale D.1. Dzięki metodom a) i b) wykryć można oba typy rekombinantów. Metoda c) umożliwia odróżnienie tych rekombinantów, które powróciły do macierzystego geneotypu. Jest to spowodowane tym, że w przypadku rekombinantów, które zawierają delecję w segmencie kodującym drugiej transbłonowej helisy genu apxIA, hemolityczną aktywność odpowiedniego macierzystego fenotypu nie jest przywracana.After obtaining recombinants containing the ρΑρχΙΔχΙ2 plasmid inserted into the genome, it is important to fix the deletion in the App genome by a second recombination. For this purpose, one of the recombinants obtained in the previous step was subjected to a series of passages in a culture medium supplemented only with nalidixic acid. The kanamycin-free medium allows the survival of bacteria that have had a second recombination between the App genome and the integrated plasmid. The latter recombination gives rise to two different genotypes. In case it occurs in the same segment where the first recombination took place, the resulting genotype will be identical to the parental strain used in chapter D.1. If this second recombination occurs in a segment where the first recombination has not occurred, the resulting genotype will show a deletion in the fragment encoding the second transmembrane hemolysin helix (Fig. 3, panel A). The appearance of recombinants can be monitored in several different ways: a) by observing the disappearance of fluorescence upon exposure to ultraviolet light; b) based on kanamycin sensitivity; and c) reappearance of the haemolytic halo associated with the parental strain used in chapter D.1. Both types of recombinants can be detected by methods a) and b). Method c) enables the discrimination of those recombinants that revert to the parent genotype. This is because in the case of recombinants that contain a deletion in the coding segment of the second transmembrane helix of the apxIA gene, the hemolytic activity of the corresponding parent phenotype is not restored.
Z poprzednich pasażów wykonano serię kolejnych pasaży stosując rozcieńczenie poprzedniego pasażu 1/10000, z wyjątkiem pierwszego pasażu, który po prostu składał się z hodowli otrzymanej z kolonii wyizolowanej z HP816R1. Podłożem hodowlanym było LB uzupełnione 0,004% NAD i 50 μg/ml kwasu nalidyksowego. Do każdego pasażu zastosowano podłoże w objętości 10 ml. Procentowy udział wykrywanych rekombinantów przedstawiono w tablicy 1A series of consecutive passages were made from the previous passages using a 1/10000 dilution of the previous passage, except for the first passage which simply consisted of a culture obtained from a colony isolated from HP816R1. The culture medium was LB supplemented with 0.004% NAD and 50 µg / ml nalidixic acid. The medium was used in a volume of 10 ml for each passage. The percentage of detected recombinants is shown in Table 1
T a b l i c a 1T a b l i c a 1
a) procent określony przez zliczenie kolonii, które odzyskały zdolność tworzenia hemolitycznego halo występującego w przypadku szczepu macierzystego.(a) the percentage determined by the count of the colonies that have regained their ability to form the haemolytic halo of the parental strain.
b) procent określony przez zliczenie kolonii, które nie wykazały fluorescencji po ekspozycji na światło ultrafioletowe.b) Percentage determined by the count of colonies that did not fluoresce upon exposure to ultraviolet light.
Jak widać na powyższej tablicy, z każdym pasażem zwiększa się ilość bakterii, które wykazują rozdzielenie plazmidu na skutek drugiej rekombinacji. Procent kolonii nie wykazujących fluorescencji jest tylko nieznacznie większy niż kolonii, które odzyskały hemolityczną aktywność. Ten fakt sugeruje, że druga rekombinacja występuje korzystnie w tym samym segmencie DNA, w którym wystąpiła pierwsza rekombinacja. Jeśli częstotliwość dla każdego typu rekombinatów wynosiła 50%, podwojono liczbę niefluorescencyjnych kolonii z uwzględnieniem tych, które odzyskały hemolityczną aktywność.As can be seen from the table above, with each passage, the number of bacteria that show separation of the plasmid due to the second recombination increases. The percentage of non-fluorescent colonies is only slightly higher than that of the colonies that regained hemolytic activity. This fact suggests that the second recombination preferably occurs in the same DNA segment where the first recombination occurred. If the frequency for each type of recombinant was 50%, the number of non-fluorescent colonies was doubled to include those that regained hemolytic activity.
Z chwilą, gdy kulturę dostatecznie wzbogaci się w drugie rekombinanty, można rozpocząć etap oczyszczania. W tym celu kilka kolonii nie wykazujących fluorescencji propagowano na agarze Columbia uzupełnionym NAD i agarze LB uzupełnionym NAD, 50 μg/ml, kwasu nalidyksowego i 20 μg/ml kanamycyny (LBNKm). Do późniejszych badań, wybrano kilka kolonii, które nie wykazały wzrostu na LBNKm i które wykazały taką samą hemolityczną aktywność, jak rekombinant HP816R1 otrzymany w wyniku insercji.Once the culture is sufficiently enriched with the second recombinants, the purification step can begin. For this, several non-fluorescent colonies were propagated on Columbia agar supplemented with NAD and LB agar supplemented with NAD, 50 µg / ml, nalidixic acid and 20 µg / ml kanamycin (LBNKm). For later studies, a few colonies were selected which showed no growth on LBNKm and which showed the same haemolytic activity as the recombinant HP816R1 obtained by insertion.
D.3. Konstrukcja zrekombinowanego szczepu App HP816R2D.3. Construction of the recombinant App HP816R2 strain
Transformację App z zastosowaniem pApxII.\H2 przeprowadzono przez koniugację S17-1 λ pirApp transformation using pApxII. \ H2 was performed by S17-1 λ pir conjugation
E. coli, które są nośnikami tych plazmidów. Do transformacji użyto szczepu AppApxIH2- z hybrydowym plazmidem pApx^H2. Metody i podłoża hodowlane są identyczne jak opisano w rozdziale D.1. Częstotliwość transformacji plazmidem pApxII.\H2 była podobna do uzyskanej w rozdziale D.1. dla plazmidu pApx^H2.E. coli that carry these plasmids. For transformation, the strain AppApxIH2 was used - with the pApx1H2 hybrid plasmid. The methods and culture media are identical to those described in chapter D.1. The frequency of transformation with the pApxII. \ H2 plasmid was similar to that obtained in chapter D.1. for the plasmid pApx ^ H2.
Kilka kolonii powtórnie wysiano za pomocą ezy na płytkach Petriego z LB uzupełnionym 15 g/l agaru Noble 0,004% NAD, 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml kwasu nalidyksowego. Wszystkie uzyska12Several colonies were reseeded in petri dishes with LB supplemented with 15 g / L Noble agar 0.004% NAD, 50 µg / ml kanamycin and 50 µg / ml nalidixic acid. All will get 12
PL 212 312 B1 ne kolonie wykazały wyraźną fluorescencję w odpowiedzi na ekspozycję na światło ultrafioletowe, co wskazuje na wbudowanie plazmidu do genomu App w wyniku jednokrotnej rekombinacji. Jak widać na fig. 4, jeśli wystąpi podwójna rekombinacja, ekskoniuganty będą niezdolne do wzrostu na podłożu zawierającym kanamycynę. Obecność tego antybiotyku na płytkach umożliwia wzrost tylko tych rekombinantów, które mają wbudowany do swego genomu cały plazmid. Wskaźnikowy gen GFP umożliwia rozróżnienie, czy którakolwiek z kolonii, które są odporne na kanamycynę, jest produktem spontanicznej mutacji.New colonies showed marked fluorescence in response to exposure to ultraviolet light, indicating the incorporation of the plasmid into the App genome by a single recombination. As can be seen in Figure 4, if a double recombination occurs, the exconjugants will be unable to grow on a kanamycin containing medium. The presence of this antibiotic on the plates enables the growth of only those recombinants which have the entire plasmid integrated into their genome. The GFP pointer gene enables to distinguish whether any of the colonies that are resistant to kanamycin are the product of a spontaneous mutation.
Na koniec, otrzymano rekombinanty z homologicznej rekombinacji pomiędzy plazmidem i odpowiednim genem apxIIA. Dowiedziono tego przez obserwację hemolitycznej aktywności rekombinantów na płytkach Columbia z agarem uzupełnionym 0,004% NAD (fig. 4, panel C). Uzyskane rekombinanty z plazmidem pApxIIH2 wykazują całkowity zanik zdolności do tworzenia hemolitycznego halo.Finally, recombinants were obtained from homologous recombination between the plasmid and the corresponding apxIIA gene. This was proved by observing the haemolytic activity of the recombinants on Columbia agar plates supplemented with 0.004% NAD (Fig. 4, panel C). The recombinants obtained with the pApxIIH2 plasmid show complete loss of the ability to form haemolytic halo.
Jeden spośród rekombinantów otrzymanych z plazmidem pApxII.\H2 wybrano do późniejszego pasażowania i nazwano HP816R2.One of the recombinants obtained with the pApxII. 1 H 2 plasmid was selected for subsequent passaging and was named HP816R2.
D. 4. Konstrukcja szczepu AppApxI/IIH2- D. 4. Construction of the AppApxI / IIH2 strain -
Po otrzymaniu rekombinantów z plazmidem pApxI^H2 wbudowanym do genomu ważne jest utrwalenie delecji w genomie App za pomocą drugiej rekombinacji. W tym celu, rekombinanty otrzymane w poprzednim etapie poddano serii pasaży w podłożu hodowlanym uzupełnionym tylko kwasem nalidyksowym jak opisano w D.2. Wartości procentowe wykrywanych rekombinantów z drugiego pasażu są podobne do uzyskanych w D.2.After obtaining the recombinants with the pApxI ^ H2 plasmid integrated into the genome, it is important to fix the deletion in the App genome by a second recombination. For this, the recombinants obtained in the previous step were subjected to a series of passages in a culture medium supplemented only with nalidixic acid as described in D.2. The percentages of detected recombinants from the second passage are similar to those obtained in D.2.
Po dostatecznym wzbogaceniu hodowli w drugorzędowe rekombinanty, przeprowadza się etap oczyszczania. Mając to na uwadze, kilka kolonii nie wykazujących fluorescencji namnożono na agarze Columbia uzupełnionym NAD i agarze LB uzupełnionym NAD, 50 μg/ml kwasu nalidyksowego i kanamycyną 20 μg/ml (LBNKm). Do późniejszych badań wybrano kilka kolonii, które nie wykazywały wzrostu na LBNKm i wykazywały taką samą hemolityczną aktywność jak rekombinant HP816R2 uzyskany w wyniku insercji.After the culture is sufficiently enriched with secondary recombinants, a purification step is performed. With this in mind, several non-fluorescent colonies were grown on Columbia agar supplemented with NAD and LB agar supplemented with NAD, 50 µg / ml nalidixic acid and 20 µg / ml kanamycin (LBNKm). A few colonies which did not grow on LBNKm and showed the same haemolytic activity as the recombinant HP816R2 obtained by insertion were selected for later studies.
E. Analiza DNA oczyszczonego z kolonii wyizolowanych w poprzednim pasażu, w celu sprawdzenia jednorodności kultur i obecności delecji w genach apxIA i apxIIAE. Analysis of DNA purified from colonies isolated in the previous passage to check the homogeneity of the cultures and the presence of deletions in the apxIA and apxIIA genes
Rekombinanty z poprzednich pasaży D.2 i D.4 hodowano w 10 ml podłoża TSYN uzupełnionego 50 μg/ml kwasu nalidyksowego aż do osiągnięcia stacjonarnej fazy wzrostu. Następnie przeprowadzono ekstrakcję DNA każdego z nich.Recombinants from previous passages D.2 and D.4 were grown in 10 ml TSYN medium supplemented with 50 µg / ml nalidixic acid until the stationary growth phase was reached. Then, DNA extraction of each of them was performed.
E.1. Analiza rekombinantów apxIH2- E.1. Analysis of apxIH2 recombinants -
Próbki genomowego DNA odpowiadające każdej z kultur drugich rekombinantów otrzymanych z plazmidem pApx^H2 strawiono enzymem restrykcyjnym XhoI. Próbki z tego trawienia, razem z innymi otrzymanymi z ekstrakcji DNA odpowiednio z kultur szczepu HP816Nlr i HPB816R1, zanalizowano metodą Southern-blot stosując fragment DNA o długości 1927 pz pochodzący z trawienia plazmidu pAApx1H2- enzymami restrykcyjnymi EcoRV i BglII jako sondą. Wyniki tych hybrydyzacji przedstawiono na fig. 3B. Wyniki hybrydyzacji szczepu kontrolnego HP816Nlr wskazują na obecność miejsca restrykcyjnego dla XhoI umieszczonego w odległości około 20 kb od miejsca stwierdzonego wewnątrz operonu apxl. Analiza rekombinanta z wprowadzonym plazmidem pApxI.\H2, wskazuje na pojawienie się dwóch nowych prążków o wielkości 1,1 i 4,3 kb i nieznaczne zwiększenie wcześniej istniejącego prążka o wielkości 20 kb o około 1 kb. Wielkość nowych prążków i powiększenie wcześniej istniejącego, są takie jak się spodziewano na podstawie wprowadzenia hybrydowego plazmidu pΑpxΔΗ2 do regionu oskrzydlającego 5' kodującego fragmentu drugiej transbłonowej helisy genu apxIA genomu App (fig. 3A, szkic 2). Analiza rekombinanta z usuniętym plazmidem z drugiej rekombinacji w tym samym regionie 5', gdzie zaszła pierwsza, wskazuje na zanik dwóch prążków o mniejszej masie cząsteczkowej i nieznaczne zmniejszenie mobilności poprzedniego prążka 21 kb, który obecnie pojawia się na takim samym poziomie jak w szczepie macierzystym. To, wraz z faktem, że hemolityczną aktywność jest identyczna do wykazywanej przez macierzysty szczep HP816Nlr, sugeruje, że podczas wszystkich tych procesów nie wprowadzono do genomu App żadnych dodatkowych modyfikacji (fig. 3, A i C).Genomic DNA samples corresponding to each of the second recombinant cultures obtained with the pApx4H2 plasmid were digested with the restriction enzyme XhoI. Samples of the digestion, together with other obtained from the extraction of DNA from the cultures of the strain HP816Nl r and HPB816R1 were analyzed by Southern-blot using the fragment of DNA of 1927 bp coming from the digestion of plasmid pAApx1H2 - the restriction enzymes EcoRV and BglII as a probe. The results of these hybridizations are shown in Figure 3B. The results of hybridization of the control strain HP816Nl r showed the presence of a restriction site for XhoI located approximately 20 kb from the site found inside the apxl operon. Recombinant analysis with the plasmid pApxI. 1 H 2 introduced indicates the appearance of two new bands of 1.1 and 4.3 kb and a slight increase of the pre-existing 20 kb band by about 1 kb. The size of the new bands and the enlargement of the preexisting one are as expected from the introduction of the hybrid plasmid pΑpxΔΗ2 into the 5 'flanking region encoding the second transmembrane helix fragment of the apxIA gene of the App genome (Fig. 3A, sketch 2). Analysis of the recombinant with the removed plasmid from the second recombination in the same 5 'region where the first occurred indicates the disappearance of the two lower molecular weight bands and a slight reduction in mobility of the former 21 kb band, which now appears at the same level as in the parent strain. This, together with the fact that the haemolytic activity is identical to that displayed by the parent strain HP816Nl r , suggests that in all these processes no additional modifications were introduced into the App genome (Fig. 3, A and C).
Wreszcie analiza rekombinanta zawierającego usunięty plazmid z drugiej rekombinacji w regionie oskrzydlającym 3' segmentu, który koduje drugą transbłonową helisę, wskazuje zniknięcie prążka 4,3 kb, utrzymanie prążka 1,1 kb, który już zaobserwowano u rekombinanta uzyskanego w wyniku insercji i nieznaczne zmniejszenie prążka 20 kb. Ten rozkład prążków jest taki jak się spodziewano po zniknięciu kodującego segmentu drugiej transbłonowej helisy i jego zamianie na miejsce restrykcyjne dla XhoI. To nowe miejsce restrykcyjne, wprowadzone do genomu App, powoduje powstanieFinally, analysis of the recombinant containing the deleted plasmid from the second recombination in the 3 'flanking region of the segment that encodes the second transmembrane helix indicates the disappearance of the 4.3 kb band, maintenance of the 1.1 kb band already observed in the insertion recombinant and a slight reduction of the band 20 kb. This band distribution is as expected after the coding segment of the second transmembrane helix has disappeared and replaced with an XhoI restriction site. This new restriction site, introduced into the App genome, gives rise to
PL 212 312 B1 fragmentu 1,1 kb i co za tym idzie zmniejszenie o 1,1 kb prążka o długości 20 kb, który obserwuje się w szczepie 816 Nlr (fig. 3A i B). Należy zauważyć obecność na podłożu CA dużych hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 1 i 3 i małych hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 2, 4 i 5. Należy także dostrzec brak wzrostu na podłożu TS kultur 1, 3, 4 i 5. Ten rekombinant wykazuje bardzo obniżoną hemolityczną aktywność w porównaniu z macierzystym szczepem HP816 Nlr i taką samą hemolityczną aktywność jak App serotypu 7, który posiada tylko hemolizynę ApxII (fig. 3C). Ten wynik wskazuje, że delecją w drugiej transbłonowej helisie eliminuje lub znacznie obniża hemolityczną aktywność App ApxIA. App zmodyfikowany przez wprowadzenie opisanej delecji nazwany będzie od tego momentu ApxIAH2-.The yield of the 1.1 kb fragment and hence a 1.1 kb reduction in the 20 kb band that is observed in the 816 Nl r strain (Figs. 3A and B). Note the presence on CA medium of large hemolytic brightening zones around the colonies of cultures 1 and 3 and small hemolytic brightening zones around the colonies of cultures 2, 4 and 5. Also note the lack of growth on TS media of cultures 1, 3, 4 and 5. This recombinant shows very reduced haemolytic activity compared to the parent strain HP816 Nl r and the same haemolytic activity as App serotype 7, which has only ApxII haemolysin (Fig. 3C). This result indicates that the deletion in the second transmembrane helix eliminates or significantly reduces the hemolytic activity of App ApxIA. The app modified by introducing the described deletion will henceforth be named ApxIAH2 - .
Tak otrzymanego rekombinanta, charakteryzującego się delecjami nukleotydów 886 do 945 w genie apxIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI, nazwano AppApxIH2-. W dniu 10 stycznia 2002 zdeponowano go w Colección Espańola de Cultivos Tipo pod numerem rejestracyjnym CECT 5985, zgodnie z warunkami ustalonymi w Traktacie Budapesztańskim.The recombinant thus obtained, characterized by deletions of nucleotides 886 to 945 in the apxIA gene, which encodes the second transmembrane domain of the ApxI exotoxin, was named AppApxIH2 - . On January 10, 2002, it was deposited at the Colección Española de Cultivos Tipo under registration number CECT 5985, under the conditions laid down in the Budapest Treaty.
E. 2. Analiza rekombinantów apx/IIH2- E. 2. Analysis of recombinant apx / IIH2 -
Próbki genomowego DNA odpowiadające rekombinantowi HP816R2 otrzymanemu w wyniku insercji i drugiemu rekombinantowi otrzymanemu z plazmidem pApxIAH2 strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI. Próbki z tego trawienia razem z innymi uzyskanymi w wyniku ekstrakcji DNA z hodowli szczepu HP816Nlr, zanalizowano z zastosowaniem metody Southern-blot. Jako sondy użyto dwóch fragmentów DNA zamplifikowanych za pomocą PCR. Odpowiadały one regionom oskrzydlającym 5' i 3' segmentu DNA, który koduje drugą transbłonową helisę ApxII (rozdział B). Wyniki tych hybrydyzacji przedstawiono na fig. 4B. Wyniki hybrydyzacji kontrolnego szczepu HP816 Nlr wskazują na obecność dwóch miejsc restrykcyjnych dla EcoRI odległych od siebie o 15,7 kb, które ograniczają fragment, w którym zawarty jest operon apxll. Analiza rekombinanta uzyskanego w wyniku wprowadzenia plazmidu pApxIAH2 wykazała zanik prążka 15,7 kb i pojawienie się 3 nowych prążków o wielkości 8,2, 7,5, i 0,9 kb. Wielkość nowych prążków jest wielkością spodziewaną w wyniku wprowadzenia hybrydowego plazmidu pApxIAH2 do regionu oskrzydlającego 3' segmentu kodującego drugiej transbłonowej helisy genu apxIIA genomu App (fig. 4A). Analiza rekombinanta z plazmidem usuniętym wyniku drugiej rekombinacji w tym samym regionie 3', w którym miała miejsce pierwsza, wykazuje ponowne pojawienie się pojedynczego prążka 15,7 kb, który jest zgodny z tym występującym w przypadku szczepu kontrolnego (fig. 4B). Hemolityczną aktywność jest identyczna z wykazywaną przez macierzysty szczep AppApxIH2- (fig. 4C). Wreszcie analiza rekombinanta z plazmidem usuniętym w wyniku drugiej rekombinacji przez region oskrzydlający 3' segmentu, który koduje drugą transbłonową helisę, wskazuje na zniknięcie prążków 13,5 i 0,9 kb i pojawienie się nowego fragmentu 7,5 kb (fig. 4B). Ten rozkład prążków jest spodziewanym, w wyniku zniknięcia segmentu kodującego drugiej transbłonowej helisy i jego zastąpienia przez miejsce restrykcyjne EcoRI (fig. 4A). To nowe miejsce restrykcyjne wstawione do genomu App powoduje rozszczepienie 15,7 kb fragmentu EcoRI, który zawierał operon apxll w macierzystym szczepie, na dwa fragmenty 8,2 i 7,5 kb (fig 4A i B). Ten rekombinant jest właściwie niehemolityczny (fig. 4C). Ten wynik wskazuje, że delecją w drugiej domenie transbłonowej usuwa lub praktycznie zmniejsza całkowicie hemolityczną aktywność ApxIIA App. ApxIIA zmodyfikowany przez przeprowadzenie opisanej delecji będzie od tej chwili nazywany ApxIIAH2-. Należy zauważyć obecność na podłożu CA obecność małych hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 1 i 3 i brak hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 2 i 4. Należy także zauważyć brak wzrostu kultur 1, 3 i 4 na podłożu TS.Genomic DNA samples corresponding to the HP816R2 insertion-derived recombinant and the second recombinant obtained with the pApxIAH2 plasmid were digested with the restriction enzyme EcoRI. Samples of the digestion together with other obtained by extraction of DNA from a culture of the strain on HP816Nl were analyzed using the method of Southern-blot analysis. Two PCR amplified DNA fragments were used as probes. They corresponded to the 5 'and 3' flanking regions of the DNA segment that codes for the second transmembrane helix of ApxII (chapter B). The results of these hybridizations are shown in Figure 4B. The results of hybridization of the control strain HP816 Nl r indicated the presence of two restriction sites for EcoRI 15.7 kb apart from each other, limiting the fragment in which the apxII operon is contained. Analysis of the recombinant resulting from the introduction of pApxIAH2 showed the disappearance of the 15.7 kb band and the appearance of 3 new bands of 8.2, 7.5, and 0.9 kb in size. The size of the new bands is the size expected from the introduction of the hybrid plasmid pApxIAH2 into the 3 'flanking region of the coding segment of the second transmembrane helix of the apxIIA gene of the App genome (Fig. 4A). Analysis of the recombinant with the plasmid knocked out of the second recombination in the same 3 'region as the first one shows the reappearance of a single 15.7 kb band, which is consistent with that of the control strain (Fig. 4B). The hemolytic activity is identical to that displayed by the parent strain AppApxIH2 - (Fig. 4C). Finally, analysis of the recombinant with the plasmid deleted by the second recombination through the 3 'flanking region of the segment which encodes the second transmembrane helix shows the disappearance of the 13.5 and 0.9 kb bands and the appearance of a new 7.5 kb fragment (Figure 4B). This band distribution is expected as a result of the disappearance of the coding segment of the second transmembrane helix and its replacement by an EcoRI restriction site (Fig. 4A). This new restriction site inserted into the App genome cleaves the 15.7 kb EcoRI fragment that contained the apxII operon in the parent strain into two 8.2 and 7.5 kb fragments (Fig. 4A and B). This recombinant is virtually non-haemolytic (Fig. 4C). This result indicates that a deletion in the second transmembrane domain removes or virtually completely reduces the hemolytic activity of ApxIIA App. The ApxIIA modified by carrying out the described deletion will henceforth be referred to as ApxIIAH2 - . Note the presence of small hemolytic brightening zones around the colonies of cultures 1 and 3 on CA and the absence of hemolytic brightening zones around the colonies of cultures 2 and 4. Also note the lack of growth of cultures 1, 3 and 4 on TS medium.
Tak otrzymanemu zrekombinowanemu szczepowi nadano nową nazwę AppApxI/IIH2-. Charakteryzuje się on delecjami nukleotydów 886 do 945 w genie apxIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI i ponadto delecją nukleotydów 886 do 945 genu apxIIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII. Ten szczep zdeponowano w Coleccion Espańola de Cultivos Tipo w dniu 12 czerwca 2002 pod numerem rejestracyjnym CECT 5994 jak wskazano w warunkach Traktatu Budapesztańskiego dla opisów patentowych.The thus obtained recombinant strain was given the new name AppApxI / IIH2 - . It is characterized by a deletion of nucleotides 886 to 945 in the apxIA gene which encodes the second transmembrane domain of the ApxI exotoxin and a further deletion of nucleotides 886 to 945 of the apxIIA gene which encodes the second transmembrane domain of the ApxII exotoxin. This strain was deposited with Coleccion Española de Cultivos Tipo on June 12, 2002 under registration number CECT 5994 as indicated in the terms of the Budapest Treaty for the patents.
F. Analiza wytwarzania ApxIAH2- i ApxIIAH2- przez otrzymane szczepy rekombinantówF. Analysis of the production of ApxIAH2 - and ApxIIAH2 - by the obtained recombinant strains
W celu określenia czy uzyskane zrekombinowane szczepy wciąż produkowały ApxH2- określono jej stężenie w podłożu LB. Produkcję Apx wykrywano posługując się monoklonalnymi przeciwciałami specyficznymi względem Apx I i Apx II stosując testy immunologiczne i Western-blot. Jak przedstawiono na fig. 5 (A i B) produkcja i wydzielanie do podłoża ApxIAH2- i ApxIIAH2- przez zrekombinowane szczepy następuje zgodnie z tym samym wzorem czasowym jak w przypadku niezmodyfikowanej Apx przez macierzysty szczep typu dzikiego HP816Nlr. Wszystkie hemolizyny (zmodyfikowane lubIn order to determine whether the obtained recombinant strains still produced ApxH2 - its concentration in the LB medium was determined. Apx production was detected with monoclonal antibodies specific for Apx I and Apx II using immunoassays and Western blots. As shown in FIG. 5 (A and B) the production and secretion into the medium ApxIAH2 - ApxIIAH2 and - by the recombinant strains follows the same temporary pattern as in the case of non-modified Apx from native wild type strain HP816Nl r. All haemolysins (modified or
PL 212 312 B1 nie) pojawiają się w podłożu hodowlanym około drugiej połowy fazy wzrostu wykładniczego i osiągają maksymalne stężenie na początku fazy stacjonarnej. Od tego momentu, stężenie wszystkich hemolizyn pozostaje stałe lub nieznacznie maleje. Jak widać na tej samej fig., ApxIAH2- i ApxIIAH2-akumulują się aż do osiągnięcie poziomów podobnych do poziomu odpowiedniej niezmodyfikowanej Apx wytwarzanej przez macierzysty szczep typu dzikiego HP816Nlr. Z drugiej strony wprowadzona delecją jest bardzo mała (18 aminokwasów) i spodziewane jest zmniejszenie masy cząsteczkowej dwóch ApxH2 tylko o 2 kD. Biorąc pod uwagę, że 2 hemolizyny typu dzikiego mają obserwowaną masę cząsteczkową w przybliżeniu 105 kDa, zmniejszenie ich mas cząsteczkowych o 2 kDa jest niezauważalne na żelach poliakrylamidowych i odpowiadających im Western-blotach (fig. 6). Na koniec należy zaznaczyć, że na tej samej fig. nie pojawią się skrócone lub niewłaściwie procesowane produkty polipeptydowe. Należy zauważyć, że 105 kDa na ścieżce 3 wydaje się być wykrywany tylko w (C). Wszystkie te dane wskazują, że mała delecją wprowadzona w obu Apx nie przeszkadza w ich pełnej syntezie i wydzieleniu do podłoża hodowlanego. Po uwolnieniu do podłoża hodowlanego, ApxH2- wykazuje trwałość podobną do wykazywanej przez odpowiednią nie zmodyfikowaną Apx.No) appear in the culture medium around the second half of the exponential growth phase and reach their maximum concentration at the beginning of the stationary phase. From then on, the concentration of all haemolysins remains constant or slightly decreases. As seen in the same figure, ApxIAH2- and ApxIIAH2-accumulate until reaching levels similar to that of the corresponding unmodified Apx produced by the wild-type parental strain HP816Nlr. On the other hand, the deletion introduced is very small (18 amino acids) and a reduction in the molecular weight of the two ApxH2 is expected. only by 2 kD. Given that the 2 wild-type haemolysins have an apparent molecular weight of approximately 105 kDa, the 2 kDa reduction in their molecular weights is imperceptible on polyacrylamide gels and the corresponding Western blots (Figure 6). Finally, it should be noted that truncated or improperly processed polypeptide products will not appear in the same figure. Note that the 105 kDa in lane 3 seems to be detected only in (C). All these data indicate that the small deletion introduced in both Apx does not prevent their full synthesis and secretion into the culture medium. After being released into the culture medium, ApxH2- shows durability similar to that of the corresponding unmodified Apx.
G. Skuteczność atenuacji uzyskanych szczepówG. Efficiency of attenuation of the obtained strains
W celu sprawdzenia stopnia atenuacji dwóch skonstruowanych zrekombinowanyxh szczepów, użyto trzymiesięcznych samców i samic świni hybrydowej LWxLD. W różnych doświadczeniach użyto czterech grup świń. Każdy szczep podawano w dawce 108 cfu w 5 ml PBS, każdemu zwierzęciu z 3 pierwszych grup, przez iniekcję dotchawiczą. Wcześniej tę dawkę szczepu typu dzikiego HP816Nlr dla świni w tym wieku uznano za LD50. Zwierzętom w czwartej grupie podano tylko PBS w pojedynczej dawce 5 ml. Kliniczne objawy notowano codziennie przez okres 7 dni trwania doświadczenia. Wyniki przedstawiono w tablicy 2:To test the degree of attenuation of the two constructed recombinant strains, 3-month-old male and female LWxLD hybrid pigs were used. Four groups of pigs were used in different experiments. Each strain was administered at a dose of 10 8 cfu in 5 ml PBS to each animal of the first 3 groups by intratracheal injection. Earlier this dose of wild-type strain HP816Nl year for pigs in this age was considered LD50. The animals in the fourth group received only PBS in a single 5 ml dose. Clinical signs were recorded daily for the duration of the 7 days of the experiment. The results are presented in Table 2:
T a b l i c a 2T a b l i c a 2
(a) Zwierzęta z zaburzeniami uwagi i zdolności do reakcji w obecności opiekuna (dotknięte tą przypadłością/wszystkie) (b) Zwierzęta z zakłóceniami rytmu oddechowego i/lub dusznością (dotknięte tą przypadłością/wszystkie).(a) Animals with attention deficit and reactivity disorders in the presence of a caregiver (affected / all) (b) Animals with respiratory disturbance and / or dyspnoea (affected / all).
Siedem dni po szczepieniu zwierzęta uśmiercono i rejestrowano zaobserwowane makroskopowo uszkodzenia narządów oddechowych. Podczas sekcji przeprowadzono także badania bakteriologiczne.Seven days after vaccination, the animals were sacrificed and macroscopically observed lesions of the respiratory organs were recorded. During the autopsy, bacteriological tests were also carried out.
Wyniki uzyskane w tym doświadczeniu podano w tablicy 3The results obtained in this experiment are given in Table 3
T a b l i c a 3T a b l i c a 3
W trakcie trwania doświadczenia dwa z 5 zwierząt w tej grupie zdechło. Sekcja u czterech na pięć zwierząt wykazała poważne uszkodzenia płuc. U zwierząt, które zaszczepiono szczepem AppADuring the course of the experiment, two of the 5 animals in this group died. Autopsy in four out of five animals showed severe lung damage. In animals vaccinated with an AppA strain
-pxIH2- także obserwowano zmianę zachowania, chociaż te objawy zmniejszyły się począwszy od czwartego dnia szczepienia. Objawy kliniczne były łagodniejsze i zaobserwowano je tylko u 50% świń.-pxIH2 - Behavioral change was also seen, although these symptoms decreased from day 4 of vaccination. The clinical signs were milder and were observed in only 50% of the pigs.
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
Chociaż żadne ze zwierząt w tej grupie nie zdechło podczas próby, u 70% z nich w czasie sekcji wykazano uszkodzenia, chociaż wszystkie te uszkodzenia okazały się mniejsze niż w poprzedniej grupie. Trzecią grupę szczepiono szczepem AppApx/IIH2-. Chociaż u czterech zwierząt obserwowano łagodne zmiany zachowania, zmniejszyły się one począwszy od 48 godziny po szczepieniu. Dwa zwierzęta, które wykazały umiarkowane objawy kliniczne także wyzdrowiały w przeciągu 48 godzin po szczepieniu. W sekcji u żadnego ze zwierząt nie zaobserwowano uszkodzeń płuc. Ocenę uszkodzeń płuc przeprowadzono w oparciu o publikację Hannan'a i in.; (Research in Veterinary Science 33:76-88 (1982). Przedstawione wartości są średnimi arytmetycznymi dla każdej grupy podanymi wraz z odchyleniem standardowym. Zgodnie z tymi wynikami, szczep AppApxI/IIH2- jest niezjadliwy i można go stosować bezpiecznie jako żywą szczepionkę. Ważne jest zaznaczenie, że szczep App wykryto u 80% świń w grupie, którą nim szczepiono, siedem dni po jego podaniu. Ten wynik wskazuje, że żywotność szczepu AppApxI/IIH2- w doświadczalnej infekcji nie jest zmodyfikowana mimo, że jest on pozbawiony aktywności hemolitycznej. Jest to ważny fakt jeśli, weźmiemy pod uwagę, że istotne jest, by mikroorganizm pozostawał zdolny do życia tak, aby egzotoksyny Apx mogły być wytwarzane i uwalniane. Bez produkcji egzotoksyn Apx, atenuowanego szczepu nie można stosować jako żywej szczepionki, ponieważ byłby on niezdolny do indukowania odpowiedzi immunologicznej, która chroniłaby zwierzę przed przyszłymi infekcjami (Reimer i in.; Microbial Pathogenesis 18:197-209 (1995)). We wszystkich doświadczeniach uzyskano silne działanie immunogenne.Although none of the animals in this group died during the trial, 70% of them were found to be injured at necropsy, although all of these injuries were less than in the previous group. The third group was vaccinated with the AppApx / IIH2 - strain. Although mild behavioral changes were seen in four animals, these decreased starting 48 hours post vaccination. The two animals that showed moderate clinical signs also recovered within 48 hours of vaccination. No lung damage was observed in any of the animals at necropsy. Assessment of lung damage was based on the publication by Hannan et al .; (Research in Veterinary Science 33: 76-88 (1982). The values shown are the arithmetic means for each group given together with the standard deviation. According to these results, the AppApxI / IIH2 strain - is avirulent and can be used safely as a live vaccine. Important. it is to note that the app strain has been detected in 80% of the pigs in the group that the inoculated, seven days after its administration. This result indicates that the viability of the strain AppApxI / IIH2 - in experimental infection is not modified even though it is devoid of haemolytic activity. This is an important fact if we take into account that it is essential that the microorganism remains viable so that the Apx exotoxins can be produced and released Without the production of Apx exotoxins, the attenuated strain cannot be used as a live vaccine because it would be incapable of inducing an immune response that would protect the animal from future infections (Reimer et al; Microbial Pathogenesis 18: 197-209 (1995)). In all experiments, a strong immunogenic effect was obtained.
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
Lista sekwencji <110> Laboratorios Hipra SA <120> Żywa, atenuowana szczepionka przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń <130> 4467WO334HIP <140> PCT/EP03/12839 <141> 2003-11-17 <150> ES P 200202663 <151> 2002-11-20 <160> 18 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 3072 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <300>Sequence list <110> Laboratorios Hipra SA <120> Live attenuated vaccine against porcine pleurisy <130> 4467WO334HIP <140> PCT / EP03 / 12839 <141> 2003-11-17 <150> ES P 200202663 <151 > 2002-11-20 <160> 18 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 3072 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <300>
<308> ΝΟΒΙ/Χ68595<308> ΝΟΒΙ / Χ68595
aacggtaccg cactagcgaa agaattattc ggtacaacgg aaaaactatt aggtttctcg 300 gaacgaggca tcgcattatt tgcacctcag tttgataagt tactgaataa gaaccaaaaa 360 ttaagtaaat cgctcggcgg ttcatcggaa gcattaggac aacgtttaaa taaaacgcaa 420 acggcacttt cagccttaca aagtttctta ggtacggcta ttgcgggtat ggatcttgat 480 agcctgcttc gtcgccgtag aaacggtgag gacgtcagtg gttcggaatt agctaaagca 540 ggtgtggatc tagccgctca gttagtggat aacattgcaa gtgcaacggg tacggtggat 600 gcgtttgccg aacaattagg taaattggca atgccttatc taacactcgc cttaagcggt 660 ttagcaagta agttaaataa ccttccagat ttaagccttg caggacctgg gtttgatgcc 720 gtatcaggta tcttatctgt tgtttcggct tcattcattt taagtaataa agatgccgat 780 gcaggtacaa aagcggcggc aggtattgaa atctcaacta aaatcttagg caatatcggt 840 aaagcggttt ctcaatatat tattgcgcaa cgtgtggcgg caggcttatc cacaactgcg 900 gcaaccggtg gtttaatcgg ttcggtcgta gcattagcga ttagcccgct ttcgttctta 960 aatgttgcgg ataagtttga acgtgcgaaa cagcttgaac aatattcgga gcgctttaaa 1020 aagttcggtt atgaaggtga tagtttatta gcttcattct accgtgaaac cggtgcgatt 1080 gaagcggcat taaccacgat taacagtgtg ttaagtgcgc gttccgcagg tgttggggct 1140 gctgcaaccg gctcattagt cggtgcgccg gtagcagctt tagttagtgc aatcaccggt 1200 attatttcag gtattttaga tgcttctaaa caggcaatct tcgaacgagt tgcaacgaaa 1260 ttagcgaata agattgacga atgggagaaa aaacacggta aaaactattt tgaaaacggt 1320 tatgacgccc gccattccgc attcttagaa gatacctttg aattgttatc acaatacaat 1380 aaagagtatt cggtagagcg tgtcgttgct attacgcaac agcgttggga tgtcaatatc 1440 ggtgaacttg ccggcattac tcgcaaaggt tctgatacga aaagcggtaa agcttacgtt 1500aacggtaccg cactagcgaa agaattattc ggtacaacgg aaaaactatt aggtttctcg 300 gaacgaggca tcgcattatt tgcacctcag tttgataagt tactgaataa gaaccaaaaa 360 ttaagtaaat cgctcggcgg ttcatcggaa gcattaggac aacgtttaaa taaaacgcaa 420 acggcacttt cagccttaca aagtttctta ggtacggcta ttgcgggtat ggatcttgat 480 agcctgcttc gtcgccgtag aaacggtgag gacgtcagtg gttcggaatt agctaaagca 540 ggtgtggatc tagccgctca gttagtggat aacattgcaa gtgcaacggg tacggtggat 600 gcgtttgccg aacaattagg taaattggca atgccttatc taacactcgc cttaagcggt 660 ttagcaagta agttaaataa ccttccagat ttaagccttg caggacctgg gtttgatgcc 720 gtatcaggta tcttatctgt tgtttcggct tcattcattt taagtaataa agatgccgat 780 gcaggtacaa aagcggcggc aggtattgaa atctcaacta aaatcttagg caatatcggt 840 aaagcggttt ctcaatatat tattgcgcaa cgtgtggcgg caggcttatc cacaactgcg 900 gcaaccggtg gtttaatcgg ttcggtcgta gcattagcga ttagcccgct ttcgttctta 960 aatgttgcgg ataagtttga acgtgcgaaa cagcttgaac aatattcgga gcgctttaaa 1020 aagttcggtt atgaaggtga tagtttatta gcttcattct accgtgaaac cggtgcgatt 1080 gaagcggcat taaccac gat taacagtgtg ttaagtgcgc gttccgcagg tgttggggct 1140 gctgcaaccg gctcattagt cggtgcgccg gtagcagctt tagttagtgc aatcaccggt 1200 attatttcag gtattttaga tgcttctaaa caggcaatct tcgaacgagt tgcaacgaaa 1260 ttagcgaata agattgacga atgggagaaa aaacacggta aaaactattt tgaaaacggt 1320 tatgacgccc gccattccgc attcttagaa gatacctttg aattgttatc acaatacaat 1380 aaagagtatt cggtagagcg tgtcgttgct attacgcaac agcgttggga tgtcaatatc 1440 ggtgaacttg ccggcattac tcgcaaaggt tctgatacga aaagcggtaa agcttacgtt 1500
PL 212 312 B1 gatttctttg aagaaggaaa acttttagag aaagaaccgg atcgttttga taaaaaagtg 1560 tttgatccgc ttgaaggtaa aatcgacctt tcttcaatta acaaaaccac tttattgaaa 1620 tttgttacgc cggtctttac cgcaggtgaa gagattcgtg agcgtaagca aaccggtaaa 1680 taccaatata tgaccgaatt attcgttaaa ggtaaagaaa aatgggtggt aaccggtgtg 1740 cagtcacata atgcgattta tgactatacg aatcttatcc aattagcgat agataaaaaa 1800 ggtgaaaaac gtcaagtgac cattgaatct catttgggtg agaaaaatga tcgtatatat 1860 ctttcatccg gttcatctat cgtatatgcg ggtaacggac atgatgtagc atattacgat 1920 aaaaccgata caggttactt aacatttgac ggacaaagtg cacagaaagc cggtgaatat 1980 attgtcacta aagaacttaa agctgatgta aaagttttaa aagaagtggt taaaactcag 2040 gatatttcag ttggaaaaac gtgcagtgaa aaattagaat atcgtgatta tgagttaagc 2100 ccattcgaac ttgggaacgg tatcagagct aaagatgaat tacattctgt tgaagaaatt 2160 atcggtagta atcgtaaaga caaattcttt ggtagtcgct ttaccgatat tttccatggt 2220 gcgaaaggcg atgatgaaat ctacggtaat gacggccacg atatcttata cggagacgac 2280 ggtaatgatg taatccatgg cggtgacggt aacgaccatc ttgttggtgg taacggaaac 2340 gaccgattaa tcggcggaaa aggtaataat ttccttaatg gcggtgatgg tgacgatgag 2400 ttgcaggtct ttgagggtca atacaacgta ttattaggtg gtgcgggtaa tgacattctg 2460 tatggcagcg atggtactaa cttatttgac ggtggtgtag gcaatgacaa aatctacggt 2520 ggtttaggta aggatattta tcgctacagt aaggagtacg gtcgtcatat cattattgag 2580 aaaggcggtg atgatgatac gttattgtta tcggatctta gttttaaaga tgtaggattt 2640 atcagaatcg gtgatgatct tcttgtgaat aaaagaatcg gaggaacact gtattaccat 2700 gaagattaca atgggaatgc gctcacgatt aaagattggt tcaaggaagg taaagaagga 2760 caaaataata aaattgaaaa aatcgttgat aaagatggag cttatgtttt aagccaatat 2820 ctgactgaac tgacagctcc tggaagaggt atcaattact ttaatgggtt agaagaaaaa 2880 ttgtattatg gagaaggata taatgcactt cctcaactca gaaaagatat tgaacaaatc 2940 atttcatcta cgggtgcatt taccggtgat cacggaaaag tatctgtagg ctcaggcgga 3000 ccgttagtct ataataactc agctaacaat gtagcaaatt ctttgagtta ttctttagca 3060 caagcagctt aa 3072 <210> 2 <211> 2871 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <300>GB 212 312 B1 gatttctttg aagaaggaaa acttttagag aaagaaccgg atcgttttga taaaaaagtg 1560 tttgatccgc ttgaaggtaa aatcgacctt tcttcaatta acaaaaccac tttattgaaa 1620 tttgttacgc cggtctttac cgcaggtgaa gagattcgtg agcgtaagca aaccggtaaa 1680 taccaatata tgaccgaatt attcgttaaa ggtaaagaaa aatgggtggt aaccggtgtg 1740 cagtcacata atgcgattta tgactatacg aatcttatcc aattagcgat agataaaaaa 1800 ggtgaaaaac gtcaagtgac cattgaatct catttgggtg agaaaaatga tcgtatatat 1860 ctttcatccg gttcatctat cgtatatgcg ggtaacggac atgatgtagc atattacgat 1920 aaaaccgata caggttactt aacatttgac ggacaaagtg cacagaaagc cggtgaatat 1980 attgtcacta aagaacttaa agctgatgta aaagttttaa aagaagtggt taaaactcag 2040 gatatttcag ttggaaaaac gtgcagtgaa aaattagaat atcgtgatta tgagttaagc 2100 ccattcgaac ttgggaacgg tatcagagct aaagatgaat tacattctgt tgaagaaatt 2160 atcggtagta atcgtaaaga caaattcttt ggtagtcgct ttaccgatat tttccatggt 2220 gcgaaaggcg atgatgaaat ctacggtaat gacggccacg atatcttata cggagacgac 2280 ggtaatgatg taatccatgg cggtgacggt aacgaccatc ttgttggtgg taacggaa ac 2340 gaccgattaa tcggcggaaa aggtaataat ttccttaatg gcggtgatgg tgacgatgag 2400 ttgcaggtct ttgagggtca atacaacgta ttattaggtg gtgcgggtaa tgacattctg 2460 tatggcagcg atggtactaa cttatttgac ggtggtgtag gcaatgacaa aatctacggt 2520 ggtttaggta aggatattta tcgctacagt aaggagtacg gtcgtcatat cattattgag 2580 aaaggcggtg atgatgatac gttattgtta tcggatctta gttttaaaga tgtaggattt 2640 atcagaatcg gtgatgatct tcttgtgaat aaaagaatcg gaggaacact gtattaccat 2700 gaagattaca atgggaatgc gctcacgatt aaagattggt tcaaggaagg taaagaagga 2760 caaaataata aaattgaaaa aatcgttgat aaagatggag cttatgtttt aagccaatat 2820 ctgactgaac tgacagctcc tggaagaggt atcaattact ttaatgggtt agaagaaaaa 2880 ttgtattatg gagaaggata taatgcactt cctcaactca gaaaagatat tgaacaaatc 2940 atttcatcta cgggtgcatt taccggtgat cacggaaaag tatctgtagg ctcaggcgga 3000 ccgttagtct ataataactc agctaacaat gtagcaaatt ctttgagtta ttctttagca 3060 caagcagctt aa 3072 <210> 2 <211> 2871 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <300>
<308> NCBI/X61111 <309> 1993-01-21 <313> (1) (2871) <400> 2 atgtcaaaaa tcactttgtc atcattaaaa tcgtccttac aacaaggatt gaaaaatggg 60 aaaaacaagt taaatcaagc aggtacaaca ctgaagaatg gtttaactca aactggtcat 120 tctctacaga atggggctaa aaaattaatc ttatatattc ctcaaggcta tgattcgggt 180 caaggaaatg gagttcaaga tttagttaaa gctgctaatg atttaggtat tgaagtatgg 240 cgagaagaac gcagcaattt ggacattgca aaaactagct ttgatacaac tcagaaaatt 300 ctaggtttta ctgatagagg aattgtatta tttgcacctc agctagataa tttattaaag 360 aagaatccta aaattggcaa tacattagga agtgcttcta gcatctcaca aaatataggt 420 aaagccaata ctgtattagg tggtattcaa tctattttag gatctgtttt atctggagta 480 aatctgaatg aattacttca aaataaagat cctaatcaat tagaacttgc aaaagcaggg 540<308> NCBI / X61111 <309> 1993-01-21 <313> (1) (2871) <400> 2 atgtcaaaaa tcactttgtc atcattaaaa tcgtccttac aacaaggatt gaaaaatggg 60 aaaaacaagt taaatcaagc aggtacaaca ctgaagaatg gtttaactca aactggtcat 120 tctctacaga atggggctaa aaaattaatc ttatatattc ctcaaggcta tgattcgggt 180 caaggaaatg gagttcaaga tttagttaaa gctgctaatg atttaggtat tgaagtatgg 240 cgagaagaac gcagcaattt ggacattgca aaaactagct ttgatacaac tcagaaaatt 300 ctaggtttta ctgatagagg aattgtatta tttgcacctc agctagataa tttattaaag 360 aagaatccta aaattggcaa tacattagga agtgcttcta gcatctcaca aaatataggt 420 aaagccaata ctgtattagg tggtattcaa tctattttag gatctgtttt atctggagta 480 aatctgaatg aattacttca aaataaagat cctaatcaat tagaacttgc aaaagcaggg 540
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
<210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 3 gatcgaattc aggatatcac agatct 26<210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Synthetic <400> 3 gatcgaattc aggatatcac agatct 26
PL 212 312 B1PL 212 312 B1
aattagatct gtgatatcgt gaattc 26 <210> 5aattagatct gtgatatcgt gaattc 26 <210> 5
gaattcaatg cttctggcgt cag 23 <210> 6gaattcaatg cttctggcgt cag 23 <210> 6
ggtaccggat gagataagat tttc 24 <210> 7ggtaccggat gagataagat tttc 24 <210> 7
ggtaccggat gagataagat tttc 24 <210> 8ggtaccggat gagataagat tttc 24 <210> 8
gaattcaaga gtttgtagaa acgc 24 <210> 9gaattcaaga gtttgtagaa acgc 24 <210> 9
ggtacctaat ttaccaacac tac 23 <210> 10ggtacctaat ttaccaacac tac 23 <210> 10
ggtaccttat ttgtagagct catc 24 <210> 11 <211> 31 <212> DNAggtaccttat ttgtagagct catc 24 <210> 11 <211> 31 <212> DNA
PL 212 312 B1 <213> Syntetyczny <400> 11 gatatcatgg ctaactctct cagctcgata g <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 12 ctcgaggcct gccgccacac gttg <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 13 ctcgagccgc tttcgttctt aaatgttgcg <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 14 agatcttcac cggctttctg tgcactttg <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 15 gatatcaaat cgtccttaca acaaggattg <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 16 gaattcacct gaagcgactc gttgggc <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 17 gaattccctc tttcattctt aaatgtagc <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 18 agatctgcca tcaataacgg tagtacttgPL 212 312 B1 <213> Synthetic <400> 11 gatatcatgg ctaactctct cagctcgata g <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic <400> 12 ctcgaggcct gccgccacac gttg <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic <400> 13 ctcgagccgc tttcgttctt aaatgttgcg <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Synthetic <400> 14 agatcttcac cggctttctg tgcactttg <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic <400> 15 gatatcaaat cgtccttaca acaaggattg <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic <400> 16 gaattcacct gaagcgactc gttgggc <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Synthetic <400> 17 gaattccctc tttcattctt aaatgtagc <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Synthetic <400> 18 agatctgcca tcaataacgg tagtacttg
Claims (12)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200202663A ES2233145B1 (en) | 2002-11-20 | 2002-11-20 | LIVED VACCINE ATTENATED AGAINST SWINE PLEURONEUMONIA. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL376527A1 PL376527A1 (en) | 2006-01-09 |
| PL212312B1 true PL212312B1 (en) | 2012-09-28 |
Family
ID=32319811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL376527A PL212312B1 (en) | 2002-11-20 | 2003-11-17 | Live attenuated vaccine against porcine pleuropneumonia |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7722882B2 (en) |
| EP (1) | EP1575610B1 (en) |
| JP (1) | JP2006510612A (en) |
| KR (1) | KR101164045B1 (en) |
| CN (1) | CN100435845C (en) |
| AT (1) | ATE543511T1 (en) |
| AU (1) | AU2003288088A1 (en) |
| BR (1) | BRPI0316395B1 (en) |
| CA (1) | CA2505869C (en) |
| DK (1) | DK1575610T3 (en) |
| ES (2) | ES2233145B1 (en) |
| MX (1) | MXPA05005387A (en) |
| PL (1) | PL212312B1 (en) |
| PT (1) | PT1575610E (en) |
| RU (1) | RU2351360C2 (en) |
| TW (1) | TW200504209A (en) |
| WO (1) | WO2004045639A1 (en) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100460503C (en) * | 2007-01-26 | 2009-02-11 | 华中农业大学 | A kind of vaccine and application of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 double gene deletion mutant without resistance marker |
| CN101265457B (en) * | 2007-07-20 | 2011-01-26 | 华中农业大学 | Vaccine and application of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 7 double-gene deletion mutant strain for distinguishing vaccine-immunized and wild virus-infected animals |
| TWI392737B (en) * | 2008-11-27 | 2013-04-11 | Intervet Int Bv | Method to produce rtx-toxins apxi or apxiii |
| TWI461529B (en) * | 2008-11-27 | 2014-11-21 | Intervet Int Bv | Method to produce rtx-toxin apxi |
| CN102058880B (en) * | 2010-10-13 | 2012-11-21 | 青岛易邦生物工程有限公司 | Method for producing trivalent inactivated vaccines for porcine infectious pleuropneumonia |
| ES2416154B1 (en) * | 2011-11-09 | 2015-04-01 | Laboratorios Hipra, S.A. | Live attenuated strain of Actinobacillus pleuropneumoniae |
| CN102517232B (en) * | 2011-12-15 | 2013-07-31 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | Resistance marker-free porcine actinobacillus pleuropneumoniae double-gene defective strain, construction method and application thereof |
| CN102796679B (en) * | 2012-01-16 | 2014-09-24 | 四川农业大学 | Candidate strain of serotype 5 Actinobacillus pleuropneumoniae Apx I C/Apx II C double gene deletion vaccine |
| KR101491795B1 (en) * | 2013-06-13 | 2015-02-16 | 대한민국 | Novel Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 strain, diagnostic composition and vaccin composition comprising the same |
| KR101491793B1 (en) | 2013-09-10 | 2015-02-16 | 대한민국 | Novel Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 12 strain, diagnostic composition and vaccine composition comprising the same |
| KR101705098B1 (en) * | 2014-05-29 | 2017-02-10 | 전북대학교산학협력단 | Vaccine composition for preventing or treating porcine pleuropneumonia comprising attenuated Salmonella mutant |
| CN105664148B (en) * | 2016-01-25 | 2019-05-07 | 华南农业大学 | A kind of genetic engineering subunit mixed vaccine and its preparation method and application |
| KR102018707B1 (en) * | 2017-07-31 | 2019-09-06 | 주식회사 고려비엔피 | Vaccine composition for preventing or treating porcine pleuropneumonia |
| EP3689373A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-08-05 | IDT Biologika GmbH | Inactivated apxia, apxiia and apxiiia toxins |
| GB202011902D0 (en) | 2020-07-30 | 2020-09-16 | Imperial College Innovations Ltd | Antinobacillus pleuropneumoniae vaccines |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2170839A1 (en) * | 1995-03-01 | 1996-09-02 | Janet Macinnes | Bacterial preparations, method for producing same, and their use as vaccines |
| AUPN631495A0 (en) * | 1995-11-02 | 1995-11-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vaccine and biological vector(I) |
| ES2109189B1 (en) * | 1996-03-14 | 1998-05-16 | Iberica Cyanamid | VECTORS BASED ON RECOMBINANT DEFECTIVE VIRAL GENOMES AND THEIR USE IN THE FORMULATION OF VACCINES. |
-
2002
- 2002-11-20 ES ES200202663A patent/ES2233145B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-11-17 JP JP2004552625A patent/JP2006510612A/en active Pending
- 2003-11-17 MX MXPA05005387A patent/MXPA05005387A/en active IP Right Grant
- 2003-11-17 AU AU2003288088A patent/AU2003288088A1/en not_active Abandoned
- 2003-11-17 WO PCT/EP2003/012839 patent/WO2004045639A1/en active Application Filing
- 2003-11-17 EP EP03779956A patent/EP1575610B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-17 CA CA2505869A patent/CA2505869C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-17 ES ES03779956T patent/ES2381973T3/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-17 CN CNB2003801036509A patent/CN100435845C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-17 US US10/535,416 patent/US7722882B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-17 PT PT03779956T patent/PT1575610E/en unknown
- 2003-11-17 KR KR1020057009123A patent/KR101164045B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-17 PL PL376527A patent/PL212312B1/en unknown
- 2003-11-17 BR BRPI0316395A patent/BRPI0316395B1/en not_active IP Right Cessation
- 2003-11-17 DK DK03779956.6T patent/DK1575610T3/en active
- 2003-11-17 AT AT03779956T patent/ATE543511T1/en active
- 2003-11-17 RU RU2005118761/13A patent/RU2351360C2/en not_active IP Right Cessation
- 2003-11-19 TW TW092132469A patent/TW200504209A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7722882B2 (en) | 2010-05-25 |
| EP1575610B1 (en) | 2012-02-01 |
| EP1575610A1 (en) | 2005-09-21 |
| PT1575610E (en) | 2012-03-16 |
| CA2505869C (en) | 2012-03-20 |
| KR101164045B1 (en) | 2012-07-18 |
| CA2505869A1 (en) | 2004-06-03 |
| ES2381973T3 (en) | 2012-06-04 |
| JP2006510612A (en) | 2006-03-30 |
| US20060051371A1 (en) | 2006-03-09 |
| WO2004045639A8 (en) | 2005-06-09 |
| ES2233145B1 (en) | 2006-07-16 |
| WO2004045639A1 (en) | 2004-06-03 |
| DK1575610T3 (en) | 2012-05-14 |
| ES2233145A1 (en) | 2005-06-01 |
| BRPI0316395B1 (en) | 2016-07-05 |
| BR0316395A (en) | 2005-09-27 |
| TW200504209A (en) | 2005-02-01 |
| KR20050062662A (en) | 2005-06-23 |
| CN1713921A (en) | 2005-12-28 |
| RU2005118761A (en) | 2006-02-27 |
| PL376527A1 (en) | 2006-01-09 |
| CN100435845C (en) | 2008-11-26 |
| RU2351360C2 (en) | 2009-04-10 |
| ATE543511T1 (en) | 2012-02-15 |
| AU2003288088A1 (en) | 2004-06-15 |
| MXPA05005387A (en) | 2005-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1066375B1 (en) | $i(LACTOBACILLI) HARBORING AGGREGATION AND MUCIN BINDING GENES AS VACCINE DELIVERY VEHICLES | |
| JP3054440B2 (en) | Live vaccine | |
| EP1267899B1 (en) | Ssa inactivated salmonella vaccines | |
| US7722882B2 (en) | Live attenuated vaccine against porcine pleuropneumonia | |
| AU2001256957A1 (en) | Salmonella vaccine materials and methods | |
| Venkatesan et al. | Virulence phenotype and genetic characteristics of the T32-ISTRATI Shigella flexneri 2a vaccine strain | |
| JP2001510342A (en) | New microorganism | |
| US20050019335A1 (en) | Salmonella vaccine | |
| WO1991013978A1 (en) | Vaccines for preventing furunculosis in fish | |
| EP0358692B1 (en) | Cholera vaccines | |
| CN113637621B (en) | Attenuated bacillus anthracis with recombinant low extracellular protease activity and application thereof | |
| EP1640013A2 (en) | Inactivated Salmonella vaccines | |
| HK1020004A1 (en) | Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms | |
| HK1020004B (en) | Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms | |
| AU2002223922A1 (en) | Salmonella vaccine |