PL211033B1

PL211033B1 - Zastosowanie związku będącego polipeptydem do wytwarzania leku, zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do wytwarzania leku oraz zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do hamowania wytwarzania przeciwciała związanego z toczniem rumieniowatym układowym

Info

Publication number: PL211033B1
Application number: PL385677A
Authority: PL
Inventors: Jane A. Gross; Wenfeng Xu; Karen L. Madden; David P. Yee
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2012-04-30
Also published as: CA2358520C; ES2204502T3; PL393286A1; PL209535B1; EE05539B1; BR0007423A; DE60043626D1; CY1109977T1; PT1642972E; ES2338661T3; JP2003525861A; CA2753331A1; HK1041497B; HUP0200429A2; IL144029A; ES2329254T3; PT1141274E; CA2358520A1; CN1342202A; AU780805B2

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211033 (21) Numer zgłoszenia: 385677 ^{(13) B1} (22) Data zgłoszenia: 07.01.2000 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:

364817 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

07.01.2000, PCT/US00/000396 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

13.07.2000, WO00/40716 (51) Int.Cl.

C07K 14/715 (2006.01) C07K 16/28 (2006.01) A61P 11/00 (2006.01) A61P 13/12 (2006.01) A61P 19/02 (2006.01)

A61P 37/06 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważ one błędy

Zastosowanie związku będącego polipeptydem do wytwarzania leku, zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do wytwarzania leku oraz zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do hamowania wytwarzania przeciwciała związanego z toczniem rumieniowatym układowym

	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	ZYMOGENETICS, INC., Seattle, US
07.01.1999, US, 09/226,533	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 13.12.2004 BUP 25/04	JANE A. GROSS, Seattle, US WENFENG XU, Mukilteo, US KAREN L. MADDEN, Bellevue, US DAVID P. YEE, Shaker Heights, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2012 WUP 04/12	(74) Pełnomocnik:
	rzecz. pat. Urszula Bartnik

PL 211 033 B1

Opis wynalazku

Podstawa wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku będącego polipeptydem do wytwarzania leku do leczenia astmy i innych chorób, zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia astmy i innych chorób oraz zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do hamowania wytwarzania przeciwciała związanego z toczniem rumieniowatym układowym.

Oddziaływania komórkowe, które występują podczas odpowiedzi immunologicznej są regulowane przez wiele rodzin powierzchniowych receptorów komórkowych, włączając receptory nekrotycznego czynnika nowotworowego (TNFR). Rodzina TNFR składa się z szeregu integralnych glikoproteinowych receptorów błonowych, z których wiele, w połączeniu z odpowiadającymi im ligandami, reguluje oddziaływaniami pomiędzy różnymi liniami komórek krwiotwórczych (Smith et al., The TNF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins: Activation, Costimulation and Death, 76:959-62, 1994; Cosman, Stem Celles 12:440-55, 1994).

Jednym z takich receptorów jest TACI, transbłonowy aktywator oraz interaktor CAML (von Βϋlow i Bram, Science 228:134-41, 1997 i publikacja WIPO, WO 98/39361). TACI jest receptorem związanym z błoną, posiadającym domenę zewnątrzkomórkową posiadającą dwa pseudo-powtórzenia bogate w cysteinę, domenę transbłonową oraz domenę cytoplazmatyczną, która oddziałuje z CAML (modulator wapniowy i ligand cyklofiliny), integralnym białkiem błonowym zlokalizowanym w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach, które jest ko-induktorem aktywacji NF-AT, kiedy jest nadprodukowane w komórkach Jurkat'a. TACI jest związane z limfocytami B i podtypem limfocytów T. Von B^ow i Bram (ibid.) twierdzą, że nie jest znany ligand dla TACI.

Wykryto, że polipeptyd opisany w niniejszym wynalazku, będący izoformą TACI posiadającą tylko jedno pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę (BR43x2), TACI oraz pokrewne białko z limfocytów B, BCMA (Gras et al., Int. Immunol. 17:1093-106, 1995) wiąże się z ligandem TNF, ztnf4, znanym jako neurokina α (publikacja WIPO, WO 98/18921), BLyS (Moore et al., Science, 285:260-3, 1999), BAFF (Schneider i wsp., J. Exp. Med. 189:1747-56, 199), TALL-1 (Shu i wsp., J. Leukoc. Biel. 65:680-3, 1999) czy THANK (Mukhopadhyay i wsp., J. Biol. Chem. 2 7 4:15978-81, 1999). W związku z tym, BR43x2, TACI oraz BCMA będą przydatne w regulowaniu aktywności ztnf4, a w szczególności aktywacji limfocytów B.

W niniejszym wynalazku opisane są też białkowe substancje terapeutyczne dla modulowania aktywności ztnf4 lub innych ligandów BR43x2, TACI czy BCAM, kompozycje oraz sposoby jak również inne zastosowania oczywiste dla specjalistów.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku wybranego z grupy obejmującej

a) polipeptyd zawierający pozakomórkową domenę BR43x2 (SEQ ID nr: 2);

b) polipeptyd o sekwencji SEQ ID nr: 4; i

c) polipeptyd zawierający sekwencję SEQ ID nr: 10, do wytwarzania leku do leczenia astmy, zapalenia oskrzeli, rozedmy płuc, schyłkowego zapalenia nerek, neuropatii lekkiego łańcucha, skrobiawicy, zapalenia, nefropatii błoniastej, nefropatii IgA, choroby Berger'a, nefropatii IgM, choroby Goodpastur'a, postzakaźnego zapalenia kłębuszków nerkowych, choroby mezangialno-rozplemowej, zmian minimalnych w zespole nerczycowym, lub wtórnego zapalenia kłębuszków nerkowych lub zapalenia naczyń krwionośnych związanego z toczniem układowym, lub hamowania wytwarzania przeciwciał związanych z chorobą autoimmunologiczną u ssaka przez hamowanie sprzęgania ztnf4-receptor BR43x2, TACI lub BCMA.

Korzystnie, wspomniany związek stanowi białko fuzyjne złożone z pierwszej części i części drugiej, które połączone są wiązaniem peptydowym, a wspomniana część pierwsza zawiera polipeptyd zawierający reszty aminokwasowe 25-58 SEQ ID nr: 2; oraz część drugą zawierającą inny polipeptyd.

W innym korzystnym rozwiązaniu, pierwsza część wspomnianego białka fuzyjnego zawiera polipeptyd składający się z reszt aminokwasowych 59-120 w SEQ ID nr: 2.

Także korzystnie, pierwsza część jest polipeptydem zawierającym domenę pozakomórkową BR43x2 (SEQ ID nr: 2), lub ewentualnie bardziej korzystnie pierwsza część jest polipeptydem o sekwencji SEQ ID nr: 4.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku, wspomniany związek jest polipeptydem zawierającym sekwencję SEQ ID nr: 10 przy czym wspomniana sekwencja obejmuje reszty aminokwasowe 34-66

PL 211 033 B1

SEQ ID nr: 6 i reszty aminokwasowe 71-104 SEQ ID nr: 6, natomiast wspomniana druga część jest stałym regionem łańcucha ciężkiego imimunoglobuliny.

W zastosowaniu według wynalazku, wspomniany stały region łańcucha ciężkiego jest stałym regionem łańcucha ciężkiego immunoglobuliny ludzkiej IgG1.

W zastosowaniu według wynalazku, wspomniany lek korzystnie zawiera multimer białek fuzyjnych, także korzystnie wspomniany lek zawiera stały region łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, który zawiera dwa regiony stałe i pozbawiony jest domeny zmiennej.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku wybranego z grupy obejmującej: a) przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem o sekwencji SEQ ID nr: 2; i

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem o sekwencji SEQ ID nr: 4; do wytwarzania leku do leczenia astmy, zapalenia oskrzeli, rozedmy płuc, schyłkowego zapalenia nerek, neuropatii lekkiego łańcucha, skrobiawicy, zapalenia, nefropatii błoniastej, nefropatii IgA, choroby Berger'a, nefropatii IgM, choroby Goodpastur'a, postzakaźnego zapalenia kłębuszków nerkowych, choroby mezangialno-rozplemowej, zmian minimalnych w zespole nerczycowym, lub wtórnego zapalenia kłębuszków nerkowych lub zapalenia naczyń krwionośnych związanego z toczniem układowym, lub hamowania wytwarzania przeciwciał związanych z chorobą autoimmunologiczną u ssaka przez hamowanie sprzęgania ztnf4-receptor BR43X2.

Korzystnie, wytwarzanie wspomnianego przeciwciała jest związane z chorobą autoimmunologiczną wybraną takich chorób jak: układowy toczeń rumieniowaty, ciężka miastenia, stwardnienie rozsiane lub reumatoidalne zapaleniem stawów.

Również korzystnie, wytwarzanie wspomnianego przeciwciała jest związane z chorobą autoimmunologiczną wybraną z cukrzycy insulinozależnej lub choroby Crohn'a.

Według zastosowania według niniejszego wynalazku wspominaną chorobą nerek jest zapalenie kłębuszków nerkowych, zapalenie naczyń, zapalenie nerek lub odmiedniczkowe zapalenie nerek.

Wspomniane zapalenie korzystnie może być również związane z bólem stawowym, obrzękiem lub szokiem septycznym.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem SEQ ID nr: 6 do wytwarzania leku do leczenia astmy, zapalenia oskrzeli lub rozedmy płuc u ssaka, przez hamowanie sprzęgania receptor TACI-ztnf4.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem SEQ ID nr: 18, do wytwarzania leku do hamowania wytwarzania przeciwciała związanego z toczeniem rumieniowatym układowym u ssaka przez hamowanie sprzęgania ztnf4-receptor-BR43X2, TACI lub BCMA.

Metoda hamowania aktywności ztnf4 u ssaka obejmuje podawanie temu ssakowi porcji związku wyselekcjonowanego z grupy składającej się z: a) polipeptydu obejmującego zewnątrzkomórkową domenę z BR43x2; b) polipeptydu obejmującego zewnątrzkomórkową domenę z TACI; c) polipeptydu obejmującego zewnątrzkomórkową domenę z BCMA.

Związek opisany w wynalazku jest białkiem fuzyjnym zawierającym pierwszą i drugą część połączone wiązaniem peptydowym, gdzie omawiana pierwsza część obejmuje polipeptyd wyselekcjonowany z grupy składającej się z: a) polipeptydu obejmującego sekwencję SEQ ID NO: 8; b) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 25-58 z SEQ ID NO:2; c) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 34-66 z SEQ ID NO:6; d) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 71-104 z SEQ ID NO:6; e) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 25-104 z SEQ ID NO:6; f) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 8-37 z SEQ ID NO:8; g) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 41-88 z SEQ ID NO:8; h) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 8-88 z SEQ ID NO:8 a omawiana część druga obejmuje inny polipeptyd. W innym wykonaniu część pierwsza obejmuje dodatkowo polipeptyd wyselekcjonowany z grupy składającej się z: a) reszt aminokwasowych 59-120 z SEQ ID NO:2; b) reszt aminokwasowych 105-166 z SEQ ID NO: 6 oraz c) reszt aminokwasowych 89-150 z SEQ ID NO:8. W innym wykonaniu część pierwsza jest wyselekcjonowana z grupy z składającej się z: a) polipeptydu obejmują cego domenę zewnątrzkomórkową z BR43x2; b) polipeptydu obejmującego domenę zewnątrzkomórkową z TACI oraz c) polipeptydu obejmującego domenę zewnątrzkomórkową z BCMA. W pokrewnym wykonaniu część pierwsza jest wyselekcjonowana z grupy z skł adają cej się z: a) polipeptydu z SEQ ID NO:4; b) reszt aminokwasowych 1-154 z SEQ ID NO:6 oraz c) reszt aminokwasowych 1-48 z SEQ ID NO:8. W innym pokrewnym wykonaniu część druga jest regionem stałym ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego.

PL 211 033 B1

Przeciwciało lub fragment przeciwciała może być wyselekcjonowany z grupy składającej się z: a) przeciwciała poliklonalnego; b) mysiego przeciwciała monoklonalnego; c) humanizowanego przeciwciała pochodzącego z b) oraz d) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Fragment przeciwciała może być także wyselekcjonowany z grupy składającej się z F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv oraz minimalnej jednostki rozpoznającej. Aktywność ztnf4 związana jest z limfocytami B lub aktywowanymi limfocytami B, lub z spoczynkowymi limfocytami B. W innym podejściu, aktywność ztnf4 związana jest z produkcją przeciwciał , czę sto zwią zana z chorobą autoimmunologiczną , przy czym w niniejszym wynalazku omawiana choroba autoimmunologiczna jest układowym toczeniem rumieniowatym.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku w następujących figurach:

Figura 1 przedstawia złożone przyrównanie sekwencji aminokwasowych pomiędzy BR43x2,

TACI (von B^ow i Bram, ibid.) (SEQ ID NO:6), BCMA (Gras i wsp., ibid.) (SEQ ID NO:6) oraz BR43x1 (SEQ ID NO:7). Zaznaczono pseudo-powtórzenia bogate w cysteinę oraz domenę transbłonową.

Figura 2 przedstawia wykres analizy Scatchard wiązania rozpuszczalnego I-¹²⁵-ztnf4 z TACI i BCMA wytworzonych w stabilnych transfektantach BHK.

Figura 3A przedstawia ztnf4 współaktywujący ludzkie limfocyty B do proliferacji i wydzielania immunoglobulin.

Figura 3B przedstawia poziomy IgM i IgG mierzone w supernatantach uzyskanych z limfocytów B stymulowanych rozpuszczalnym ztnf4 w obecności IL4 lub IL4+IL5 po 9 dniach hodowli.

Figura 4 przedstawia ludzkie limfocyty B z krwi obwodowej stymulowane rozpuszczalnym ztnf4 lub białkiem kontrolnym (ubikwityna) w obecności IL-4 po 5 dniach in vitro. Oczyszczone TACI-Ig, BCMA-Ig oraz kontrolny Fc pod kątem inhibicji specyficznej proliferacji dla ztnf4.

Figura 5A przedstawia wyniki dla zwierząt transgenicznych ztnf4, u których rozwinęły się charakterystyczne SLE.

Figura 5B przedstawia komórki węzła chłonnego, śledziony i grasicy ze zwierząt transgenicznych ztnf4 barwione przeciwciałami dla CD5, CD4 oraz CD8.

Figura 5C przedstawia całkowite poziomy IgM, IgG oraz IgE w surowicy ze zwierząt transgenicznych ztnf4 w granicach wieku od 6 do 23 tygodni.

Figura 5D przedstawia złogi amyloidowe oraz pogrubiałe mezangium kłębuszków nerkowych w skrawkach nerki ze zwierząt transgenicznych ztnf4.

Figura 5E przedstawia efektorowe limfocyty T w transgenicznej myszy ztnf4.

Figury 6A i 6B przedstawiają podwyższone poziomy ztnf4 w surowicy uzyskanej z myszy ZNBWF1 oraz myszy MRL/lpr/lpr, które korelują z rozwojem SLE.

Figura 7 przedstawia procent myszy ZNBWF1, u których rozwinął się białkomocz podczas prowadzenia badań.

Figura 8 przedstawia poziomy anty-dsDNA przy użyciu FLISA z myszy transgenicznych ztnf4 oraz miotu kontrolnego w porównaniu z surowicą myszy ZNBWF1 i MRL/lpr/lpr.

Szczegółowy opis wynalazku

Definicje

Znacznik powinowactwa: oznacza segment polipeptydowy, który można przyłączyć do drugiego polipeptydu w celu oczyszczania lub wykrywania drugiego peptydu lub w celu dostarczenia miejsc przyłączania drugiego peptydu do substratu. Zasadniczo, dowolny peptyd lub białko, dla którego istnieje przeciwciało lub inny swoisty czynnik wiążący można użyć jako znacznik powinowactwa. Znaczniki powinowactwa obejmują ciągi poli-histydynowe, białko A ((Nilsson i wsp., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson i wsp., Methods Enzymol. 198:3, 1991), transferaza S glutationu (Smith i Johnson, Gene 67:31, 1988), znacznik powinowactwa Glu-Glu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), substancja P, peptyd Flag^TM (Hopp i wsp., Biotechnology 6:1204-10, 1988), peptyd wiążący streptawidynę lub inny epitop antygenowy czy domenę wiążącą. Patrz, ogólnie, Ford i wsp., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991. Cząsteczki DNA kodujące znaczniki powinowactwa są handlowo dostępne (np. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Odmiana alleliczna: dowolna z dwóch lub większej liczby alternatywnych form genu zajmującego ten sam locus w chromosomie. Odmiana alleliczna powstaje naturalnie w wyniku mutacji i może dawać polimorfizm fenotypowy w populacjach. Mutacje w genach mogą być ciche (tzn. nie powodować zmian w kodowanym polipeptydzie) lub mogą dawać polipeptydy o zmienionej sekwencji aminokwasowej. Termin „odmiana alleliczna” jest tu także użyty dla oznaczenia białka kodowanego przez alleliczną odmianę genu. Także obejmuje to samo białko z tego samego gatunku, które różni się od

PL 211 033 B1 aminokwasowej sekwencji odniesienia zgodnej z odmiana alleliczną. Odmiana alleliczna odnosi się do naturalnie występujących różnic pomiędzy osobnikami w genach kodujących dane białko.

Koniec aminowy i koniec karboksylowy: są użyte dla oznaczenia pozycji w polipeptydach i białkach. Tam gdzie pozwala na to kontekst terminy te są użyte w odniesieniu do określonej sekwencji lub części polipeptydu lub białka dla określenia bliskości lub względnego położenia. Przykładowo, pewna sekwencja położona w stronę końca karboksylowego w stosunku do sekwencji odniesienia w białku jest usytuowana bliżej końca karboksylowego sekwencji odniesienia, ale niekoniecznie leży na końcu karboksylowym całego białka.

Para - komplementujący/anty-komplementujący: oznacza nie identyczne cząsteczki tworzące w odpowiednich warunkach nie kowalencyjne związaną stabilną parę. Przykładowo, biotyna i awidyna (lub streptawidyna) są prototypowymi członkami pary komplementujący/anty-komplementujący. Inne przykłady par komplementujący/anty-komplementujący obejmują pary receptor/ligand, pary przeciwciało/antygen (lub hapten czy epitop), pary sensowny/antysensowny polinukleotyd i im podobne. Kiedy pożądana jest następnie dysocjacja pary komplementujący/anty-komplementujący wówczas powinowactwo wiązania pary komplementujący/anty-komplementujący korzystnie wynosi <10^-9 M.

Kontig: Oznacza polinukleotyd posiadający ciąg identycznej lub komplementarnej do innego polinukleotydu sekwencji. O ciągłych sekwencjach mówi się, że „zachodzą” na dany ciąg sekwencji polinukleotydowej całkowicie lub na część ciągu polinukleotydu. Przykładowo, reprezentatywnymi kontigami do sekwencji polinukleotydowej 5'-ATGGCTTAGCTT-3' są 5'-TAGCTTgagtct-3' i 3'-gtcgacTACCGA-5'.

Komplementarność cząsteczek polinukleotydowych: oznacza cząsteczki polinukleotydowe posiadające komplementarną sekwencję zasad i odwróconą orientację w porównaniu z sekwencją odniesienia. Przykładowo, sekwencja 5'ATGCACGGG3' jest komplementarna do 5' CCCGTGCAT3'.

Zdegenerowana sekwencja nuleotydowa lub sekwencja zdegenerowana: oznacza sekwencję nukleotydów, która zawiera jeden lub większą liczbę kodonów zdegenerowanych (w porównaniu z cząsteczką polinukleotydową, która koduje polipeptyd). Zdegenerowane kodony zawierają róż ne trójki nukleotydowe, lecz kodują tę samą resztę aminokwasową (tzn. każda z trójek GAU i GAC koduje Asp).

Wektor ekspresyjny: cząsteczka DNA, liniowa lub kolista, obejmująca segment kodujący interesujący polipeptyd funkcjonalnie połączony z dodatkowymi segmentami umożliwiającymi jego transkrypcję. Takie dodatkowe segmenty mogą zawierać sekwencje promotora i terminatora oraz fakultatywnie jedno lub kilka miejsc startu replikacji, jeden lub kilka markerów selekcyjnych, enhancer, sygnał poliadenylacji i temu podobne. Wektory ekspresyjne są zazwyczaj pochodnymi DNA plazmidowego lub wirusowego lub mogą zawierać elementy ich obu.

Izoforma: odnosi się do różnych form białka, które mogą być wytwarzane w oparciu o różne geny lub ten sam gen poprzez alternatywne składanie. W niektórych przypadkach, izoformy różnią się aktywnością transportową, czasem ekspresji podczas rozwoju, rozmieszczeniem w tankach, lokalizacją w komórce lub kombinacja tych właściwości.

Wyizolowany polinukleotyd: oznacza, że polinukleotyd jest wyjęty ze swojego naturalnego otoczenia i jest zatem wolny od innych bocznych i niepożądanych sekwencji kodujących oraz występuje w formie stosownej do uż ycia w systemach do produkcji biał ka za pomocą metod inż ynierii genetycznej. Takie wyizolowane cząsteczki są wyizolowanymi ich naturalnego środowiska i obejmują klony cDNA i genomowe. Wyizolowane cząsteczki DNA opisane w niniejszego dokumencie są wolne od innych genów, z którymi są one oryginalnie związane, lecz mogą obejmować naturalnie występujące nieulegające translacji regiony 5' i 3', takie jak promotory i terminatory. Identyfikacja regionów przylegających jest jasna dla specjalistów (patrz przykładowo Dynan i Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Wyizolowany polipeptyd lub białko: jest polipeptydem lub białkiem znalezionym w warunkach innych niż jego natywne środowisko, takie jak krew czy tkanka zwierzęca. W korzystnej formie, wyizolowany polipeptyd jest zasadniczo wolny od innych polipeptydów, w szczególności innych peptydów pochodzenia zwierzęcego. Korzystne jest dostarczenie polipeptydów w formie o wysokiej czystości, tzn. powyżej 95% czystości, bardziej korzystnie powyżej 99% czystości. Używany w tym kontekście termin „wyizolowany” nie wyklucza obecności tego samego polipeptydu w alternatywnych formach fizycznych, takich jak dimery lub formy alternatywnie glikozylowane czy pochodne.

Funkcjonalnie połączony: stosowany do segmentów nukleotydowych, termin „funkcjonalnie połączony” oznacza, że segmenty są tak ułożone, że współpracują dla uzyskania zamierzonego celu, np. transkrypcja rozpoczyna się w promotorze i zachodzi poprzez segment kodujący do terminatora.

PL 211 033 B1

Ortolog: oznacza polipeptyd lub białko uzyskane z jednego gatunku, które jest funkcjonalnym odpowiednikiem polipeptydu lub białka z innego gatunku. Różnice sekwencji pośród ortologami są wynikiem specjacji.

Polinukleotyd: oznacza jedno- lub dwuniciowy polimer zasad dezoksyrybonukleotydowych lub rybonukleotydowych czytany od końca 5' do końca 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA, oraz mogą być wyizolowane z naturalnych źródeł, syntetyzowane in vitro czy wytwarzane z kombinacji cząsteczek naturalnych i syntetycznych. Wielkości polinukleotydów wyraża się w parach zasad (skrót „bp”), nukleotydach („nt”) lub tysiącach par zasad („kb”). O ile pozwala na to kontekst, ostatnie dwa terminy mogą opisywać polinukleotydy jednoniciowe lub dwuniciowe. Kiedy termin stosowany jest do cząsteczek dwuniciowych użyty jest dla oznaczenia pełnej długości i będzie uważany jako równoznaczny z „par zasad”. Zrozumiałe będzie dla specjalistów, że dwie nici z dwuniciowego polinukleotydu mogą różnić się nieznacznie długością oraz, że ich końce mogą być przesunięte w wyniku cięcia enzymatycznego; zatem nie wszystkie nukleotydy w dwuniciowej cząsteczce polinukleotydowej są sparowane. Takie niesparowane końce zasadniczo nie będą przekraczać długości 20 nt.

Polipeptyd: Polimer reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi, wytworzony naturalnie lub syntetycznie. Polipeptydy zbudowane z mniej niż 10 reszt aminokwasowych są powszechnie nazywane „peptydami”.

Promotor: Oznacza część genu zawierającą sekwencje DNA umożliwiające wiązanie polimerazy RNA i inicjację transkrypcji. Sekwencje promotorowe leżą powszechnie, lecz nie zawsze, w 5' niekodujących regionach genów.

Białko: jest makrocząsteczką obejmującą jeden lub kilka łańcuchów polipeptydowych. Białko może także obejmować komponenty niepeptydowe, jak grupy węglowodanowe. Węglowodany i inne niepeptydowe podstawniki mogą być dołączone do białka przez komórkę, w której wytwarzane jest białko i mogą różnić się w zależności od typu komórki. Białka są tu zdefiniowane poprzez określenie struktur ich szkieletu aminokwasowego; podstawniki takie jak grupy węglowodanowe nie są zazwyczaj zaznaczane, niemniej jednak mogą być obecne.

Receptor: Białko związane z komórką lub podjednostka polipeptydowa takiego białka, która wiąże się z aktywną biologicznie cząstką („ligandem”) i pośredniczy w działaniu liganda na komórkę. Związanie liganda z receptorem powoduje zmianę w receptorze (i, w niektórych przypadkach, multimeryzację receptora, tzn. łączenie się identycznych lub różnych podjednostek receptora) w wyniku czego następują interakcje pomiędzy domeną(ami) efektorową receptora i inną cząsteczką(ami) w komórce. Uruchomienie tych interakcji prowadzi do zmian w metabolizmie komórki. Zdarzenia metaboliczne związane z interakcjami receptor-ligand obejmują transkrypcję genu, fosforylację, defosforylację, proliferację komórki, wzrost produkcji cyklicznego AMP, mobilizację wapnia komórkowego, mobilizację lipidów błonowych, adhezję komórkową, hydrolizę lipidów inozytolowych oraz hydrolizę fosfolipidów. BR43x2, jak tu w szczegółach omówiono, ma cechy charakterystyczne dla receptorów TNF.

Sekwencja sygnału wydzielniczego: sekwencja DNA kodująca polipeptyd („peptyd wydzielniczy”), która jako składnik większego polipeptydu, kieruje większy polipeptyd na drogę wydzielniczą komórki, w której jest syntetyzowany. Większy polipeptyd jest na ogół cięty w celu odrzucenia peptydu wydzielniczego podczas przemieszczania się przez drogę wydzielniczą.

Rozpuszczalny receptor: Receptor polipeptydowy, który nie jest związany z błoną komórkową. Rozpuszczalne receptory są na ogół receptorami polipeptydowymi wiążącymi ligand, które nie posiadają domen transbłonowych i cytoplazmatycznych. Rozpuszczalne receptory mogą obejmować dodatkowe reszty aminokwasowe, jak znaczniki powinowactwa umożliwiające oczyszczanie polipeptydu lub dostarczające miejsc dla wiązania polipeptydu z substratem. Wiele receptorów powierzchniowych komórek ma swoje naturalnie występujące, rozpuszczalne odpowiedniki wytwarzane poprzez proteolizę lub dzięki translacji alternatywnie złożonych cząsteczek mRNA. Receptory polipeptydowe zasadniczo nie posiadają polipeptydowych segmentów transbłonowych i wewnątrzkomórkowych wówczas gdy utracą wystarczającą część fragmentów umożliwiających odpowiednio zakotwiczenie w błonie lub transdukcję sygnału.

Masy cząsteczkowe i długości polimerów określane na podstawie niedokładnych metod analitycznych (np. elektroforeza w żelu) przyjmowane są jako wartości przybliżone. Kiedy wartość wyraża się jako „około” X lub „w przybliżeniu” X, wartość oznaczona jako X będzie przyjmowana z dokładnością ±10%.

PL 211 033 B1

Niniejszy wynalazek w części opiera się na odkryciu sekwencji DNA o 1192 bp (SEQ ID NO:1) i odpowiadającej jej sekwencji polipeptydowej (SEQ ID NO:2), która jest izoformą receptora TACI. Ta izoforma została oznaczona jako BR43x2. Rozpuszczalna forma BR43x2 jest ujawniona jako SEQ ID NO: 3. Jak tu opisano w szczegółach, polinukleotydy kodujące receptor BR43x2 oraz opisane w wynalazku polipeptydy były pierwotnie zidentyfikowane przez klonowanie pułapki sygnałów przy użyciu biblioteki ludzkiego RPMI 1788 oraz wyznakowanych FLAG na końcach N lub C, wyznakowanego biotyną lub FITC liganda czynnika martwicy nowotworu ztnf4, obecnie znanego jako neurokina α (WIPO W098/18921), BLyS (Moore i wsp., ibid.), BAFF (Schneider i wsp., ibid.), TALL-1 (Shu i wsp., ibid.) lub THANK (Mukhopadhyay i wsp., ibid.). Pozytywne pule identyfikowano poprzez wiązanie liganda, rozbijano na pojedyncze klony, izolowano cDNA i sekwencjonowano. Porównanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej BR43x2 (jak przedstawiona na SEQ ID NO:2) ze znanymi receptorami nekrotycznego czynnika nowotworowego wykazało, że BR43x2 jest izoformą TACI posiadającą, słabo konserwowane pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę.

Strukturalnie, rodzina receptora TNF charakteryzuje się częścią zewnątrzkomórkową złożoną z kilku modułów, historycznie nazwanych, pseudo-powtórzeniami bogatymi w cysteinę. Prototypowy przedstawiciel rodziny TNFR ma cztery takie pseudo-powtórzenia, każde o długości około 29-43 reszt, jedno za drugim. Typowe pseudo-powtórzenie ma 6 reszt cysteinowych. Są one nazwane pseudo-powtórzeniami ponieważ, pomimo, że wydają się pochodzić od wspólnego modułu przodka, nie powtarzają się dokładnie: pseudo-powtórzenia #1, #2, #3 oraz #4 mają charakterystyczne cechy sekwencji pozwalające rozróżnić jedną od drugiej. Struktura krystaliczna receptora p55 TNF wykazała, że każde pseudo-powtórzenie odpowiada jednej sfałdowanej domenie, oraz, że wszystkie cztery pseudo-powtórzenia fałdują się w tę samą strukturę trzeciorzędową, utrzymywaną wewnętrznie przez mostki dwusiarczkowe.

TACI zawiera dwa pseudo-powtórzenia bogate w cysteinę (von B^ow i Bram, ibid.), struktura pierwszego jest konserwowana u innych członków rodziny receptora TNF, a drugiego jest mniej konserwowana. Izoforma BR43x2 opisana w niniejszym wynalazku utraciła pierwsze pseudo-powtórzenie TACI bogate w cysteinę, i posiada tylko drugie powtórzenie, słabiej konserwowane.

Analiza sekwencji w przewidywanej sekwencji aminokwasowej BR43x2 jak przedstawiono w SEQ ID NO: wykazuje obecność dojrzałego białka posiadającego zewnątrz komórkową domenę (reszty 1-120 z SEQ ID NO:2), która zawiera jedno pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę (reszty 25 -58 z SEQ ID NO:2), domenę transbłonową (reszty 121-133 z SEQ ID NO:2) oraz domenę cytoplazmatyczną (reszty 134-247 z SEQ ID NO:2). Pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę z BR43x2 posiada 6 konserwowanych reszt cysteinowych (reszty 25, 40, 43, 47, 54 oraz 58 z SEQ ID NO:2), konserwowaną resztę kwasu asparaginowego (reszta 34 z SEQ ID NO:2) oraz dwie konserwowane reszty leucynowe (reszty 36 i 37 z SEQ ID NO:2) i jest w 46% identyczne z pseudo-powtórzeniem bogatym w cysteinę z TACI (SEQ ID NO:6) oraz w 35% identyczne z pseudo-powtórzeniem bogatym w cysteinę z BCMA (SEQ ID NO:8) (Figura 1). Pseudo-powtórzenie bogate w cysteine może być reprezentowane przez następujący motyw:

CX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX {6-8}CX{2}[YF]C (SEQ ID NO:10), gdzie C oznacza resztę cysteinową, Q glutaminę, E kwas glutaminowy, K lizynę, N asparaginę, R argininę, R kwas asparaginowy, H histydynę, S serynę, Y tyrozynę, F fenyloalaninę, W tryptofan, L leucynę, I izoleucynę, V valinę a X oznacza dowolnie naturalnie występującą resztę aminokwasową z wyjątkiem cysteiny. Reszty aminokwasowe w nawiasach kwadratowych „[]” wskazują na dozwolone warianty reszt aminokwasowych w tej pozycji. Liczby podane w klamrach „{}” wskazują na liczbę dozwolonych reszt aminokwasowych w danej pozycji.

Niniejszy wynalazek dostarcza także rozpuszczalne polipeptydy o długości od 32 do 40 reszt aminokwasowych dostarczanych przez SEQ ID NO:10.

Rozpuszczalny receptor BR43x2, jak reprezentowany przez reszty 1-120 z SEQ ID NO:4, zawiera jedno pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę (reszty 25-58 z SEQ ID NO:4) oraz nie posiada domeny transbłonowej i cytoplazmatycznej z BR43x2 jak opisano w SEQ ID NO:2.

Specjaliści w dziedzinie zauważą, że granice tych domen są przybliżone i opierają się na przyrównaniach do znanych białek oraz przewidywanym fałdowaniu białka. Cechy te wskazują na to, że receptor kodowany przez sekwencje DNA z SEQ ID NO:1 i 3 jest członkiem rodziny receptora TNF.

PL 211 033 B1

Analiza typu Northern i dot blot badająca rozmieszczenie w tkankach mRNA odpowiadającego sondom nukleotydowym dla BR43x1, o których przypuszczano, ze wykryją ekspresję BR43x2 wykazała ekspresję w śledzionie, węzłach chłonnych, komórkach CD 19⁺, słabą w komórkach reagujących z limfocytami, komórkach Daudi i Raji. Przy uż yciu PCR z odwrotną transkryptazą BR43x1 wykryto tylko w limfocytach B i nie wykryto w aktywowanych limfocytach T, jak donoszono dla TACI (von Βϋlow i Bram, ibid.). Przy użyciu sondy BR43x2 pokrywającej w 100% sekwencję odpowiadającą TACI, TACI oraz BR43c2 wykryto w śledzionie, węzłach chłonnych, jelicie cienkim, żołądku, śliniankach, wyrostku robaczkowym, płucach, szpiku, śledzionie płodowej, komórkach CD 19⁺ oraz komórkach Raji.

Przy użyciu analizy typu Northern BCAM wykryto w jelicie cienkim, śledzionie, żołądku, okrężnicy, wyrostku robaczkowym, węzłach chłonnych, tchawicy oraz jądrach. BCMA wykryto także w torbielakogruczolaku brodawkowatym, chłoniaku nieziarniczym oraz nowotworze przyusznic i słabo wykryto w komórkach CD 8⁺ CD 19⁺ komórkach MRL, Daudi, Raji oraz Hut 78.

Analizę typu Northern przeprowadzono również przy użyciu mysiego ztnf4 (SEQ ID NO:19) oraz podobnych do ludzkich TACI, BCMA oraz BR43x2, ekspresję mysiego ztnf4 wykryto głównie w śledzionie i grasicy. Mysi ztnf4 ulegał także ekspresji w płucach i słabą ekspresję wykryto w skórze i sercu.

Niniejszy wynalazek opisuje także cząsteczki polinukleotydowe, włączając cząsteczki DNA i RNA, które kodują ujawniane tu polipeptydy BR43x2. Specjaliści z łatwością zauważą, że ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego możliwe jest znaczne zróżnicowanie sekwencji wśród tych cząsteczek polinukleotydowych. SEQ ID NO:11 jest zdegenerowaną sekwencją DNA, która obejmuje wszystkie cząsteczki DNA kodujące rozpuszczalny polipeptyd BR43x2 o SEQ ID NO:4. Podobnie, SEQ ID NO:12 jest zdegenerowaną sekwencją DNA, która obejmuje wszystkie cząsteczki DNA kodujące polipeptyd BR43x2 o SEQ ID NO:2. Specjaliści z łatwością zauważą, że zdegenerowana sekwencja SEQ ID NO:12 dostarcza także wszystkie sekwencje TNA kodowane przez SEQ ID NO: 4, poprzez podstawienie U zamiast T. Zatem, polinukleotydy kodujące polipeptyd BR43x2 obejmujące nukleotyd 1 do nukleotydu 360 z SEQ ID NO: 11, nukleotyd 1 do 741 z SEQ ID NO:12 oraz ich odpowiedniki RNA są rozpatrywane przez niniejszy wynalazek. W Tabeli 1 przedstawione są jednoliterowe kody używane w SEQ ID NO: 11 i 12 dla zaznaczenia pozycji zdegenerowanych nukleotydów. „Rozkłady” są nukleotydami oznaczonymi przez literę kodu. „Komplementarny” oznacza kod dla komplementarnego nukleotydu(ów). Przykładowo, kod Y oznacza C lub T, a jego komplementarne R oznacza A lub G, A komplementarne do T a G komplementarne do C.

T a b e l a 1

Nukleotyd	Rozkład	Komplementarny	Rozkład
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A/G	Y	C/T
Y	C/T	R	A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
S	C/G	S	C/G
W	A/T	W	A/T
H	A/C/T	D	A/G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	A/C/G	B	C/G/T
D	A/G/T	H	A/C/T
N	A/C/G/T	N	A/C/G/T

PL 211 033 B1

Zdegenerowane kodony użyte w SEQ ID NO:11 i 12, obejmują wszystkie możliwe kodony dla danego aminokwasu, jak przedstawiono w Tabeli 2.

T a b e l a 2

Aminokwas	Kod jednoliterowy	Kodony	Kodon zdegenerowany
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gln	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG GTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter		TAA TAG TGA	TRR
Asn/Asp	B		RAY
Glu/Gln	Z		SAR
dowolny	X		NNN

Przeciętny specjalista w tej dziedzinie będzie zdawał sobie sprawę z tego, że w określaniu kodonu zdegenerowanego wprowadzana jest pewna dwuznaczność, reprezentanta wszystkich możliwych kodonów kodujących każdy aminokwas. Przykładowo, zdegenerowany kodon dla seryny (WSN), w pewnych okolicznościach, może kodować argininę (AGR), a zdegenerowany kodon dla argininy (MGN) może, w pewnych okolicznościach, może kodować serynę (AGY). Podobne zależności istnieją pomiędzy kodonami kodującymi fenyloalaninę i leucynę. Zatem, niektóre oligonukleotydy obejmujące zdegenerowaną sekwencję mogą kodować odmienne sekwencje aminokwasowe, lecz specjalista z łatwością może zidentyfikować takie odmienne sekwencje poprzez porównanie z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO:2 i 4. Odmienne sekwencje można z łatwością badać pod kątem funkcjonalności jak tu opisano.

Specjalista także zdaje sobie sprawę, że różne gatunki mogą wykazywać „preferencyjne użycie kodonów”. Ogólnie patrz Grantham i wsp., Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas et al. Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson i wsp., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean i Fiers, Gene 18;199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Użyty tu termin „preferencyjne użycie kodonów” jest terminem specjalistycznym odnoszącym się do kodonów dla

PL 211 033 B1 translacji białka, które są najczęściej używane w komórkach danego gatunku, a zatem są faworyzowane z kilku możliwych kodonów kodujących każdy aminokwas (patrz Tabela 2). Przykładowo, aminokwas treonina (Thr) może być kodowany przez ACA, ACC, ACG lub ACT, lecz w komórkach ssaków najczęściej używanym jest kodon ACC; w innych gatunkach, przykładowo komórkach owadów, drożdżach, wirusach czy bakteriach preferowane mogą być inne kodony dla Thr. Kodony preferencyjne dla poszczególnych gatunków można wprowadzać do polinukleotydów opisanych w niniejszego wynalazku różnymi sposobami znanymi specjalistom. Wprowadzenie sekwencji kodonów preferencyjnych do zrekombinowanego DNA może, przykładowo, zwiększyć produkcję białka dzięki wydajniejszej translacji białka w określonym typie komórki lub gatunku. Zatem, sekwencje zdegenerowanych kodonów ujawnione na SEQ ID NO: 11 i 12 mogą stanowić matrycę dla zoptymalizowanej ekspresji polinukleotydów w różnych typach komórek i gatunkach powszechnie używanych i tu ujawnionych. Sekwencje zawierające kodony preferencyjne można badać i optymalizować pod kątem ekspresji w różnych gatunkach oraz testować pod kątem funkcjonalności jak tu opisano.

Silnie konserwowane aminokwasy pseudo-powtórzenia bogatego w cysteinę z BR43x2 można zastosować jako narzędzie do identyfikowania nowych członków rodziny receptorów. Przykładowo, reakcję łańcuchową polimerazy z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (RT-PCR) można użyć do zamplifikowania sekwencji kodujących zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand, opisaną powyżej, na RNA pochodzącym z tkanek z różnych źródeł lub z linii komórkowych. W szczególności przydatne do tego celu są silnie zdegenerowane startery zaprojektowane do sekwencji BR43x2.

Wyizolowane polinukleotydy będą hybrydyzowały do regionów o podobnej wielkości z SEQ ID NO:3 lub do sekwencji do niej komplementarnej, w ostrych warunkach. Zasadniczo, ostre warunki są o okoł o 5°C niż sze niż punkt temperatury topnienia (Tm) dla specyficznej sekwencji w okreś lonej sile jonowej i pH. Tm jest temperaturą (w określonej sile jonowej i pH) przy której 50% sekwencji docelowej hybrydyzuje z idealnie pasującą sondą. Typowe ostre warunki to takie, w których stężenie soli jest do około 0,03 M w pH 7 a temperatura wynosi co najmniej 60°C.

Jak wcześniej zaznaczono, wyizolowane polinukleotydy obejmują DNA i RNA. Metody izolacji DNA i RNA są dobrze znane specjalistom. Zasadniczo korzystne jest izolowanie RNA z komórek RPMI 1788, PBMNC, spoczynkowych lub aktywowanych stransfekowanych limfocytów B lub tkanki migdałka, chociaż DNA można także wytwarzać przy użyciu RNA z innych tkanek lub izolować jako genomowy DNA. Całkowity RNA można wytwarzać przy stosując ekstrakcję roztworem guanidyny HCl a następnie izolacje przez wirowanie w gradiencie CsCl (Chirgwin i wsp., Biochemistry 18:52-94, 1979). Poll(A)⁺ RNA jest wytwarzany z całkowitego RNA przy użyciu metody Aviv i Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972). Komplementarny DNA (cDNA) wytwarza się z Poli(A)⁺ RNA przy użyciu znanych metod. Polinukleotydy kodujące BR43x2 są następnie identyfikowane i izolowane, przykładowo, przez hybrydyzację lub PCR.

Specjaliści zauważą, że sekwencje ujawnione w SEQ ID NO: 1 i 3 reprezentują pojedynczy allel ludzkiego genu i że spodziewane jest pojawianie się odmiany allelicznej i alternatywnego składania. Odmiany alleliczne sekwencji DNA pokazane w SEQ ID NO: 1 i 3, włączając te, które zawierają ciche mutacje oraz te, w których mutacje powodują zmiany w sekwencji aminokwasowej objęte są niniejszym wynalazkiem, tak jak objęte są też białka będące odmianami allelicznymi SEQ ID NO: 2 i 4. Alleliczne odmiany oraz odmiany powstające w wyniku składania tych sekwencji można klonować poprzez przeszukiwanie sondą bibliotek cDNA i genomowych z różnych osobników lub tkanek zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi specjalistom.

Niniejszy wynalazek omawia także wyizolowane polipeptydy BR43x2, które są zasadniczo homologiczne do polipeptydów z SEQ ID NO: 2 i 4 oraz ich gatunkowych ortologów. Termin „zasadniczo homologiczny” jest tu używany dla oznaczenia polipeptydów posiadających 50%, korzystnie 60%, bardziej korzystnie co najmniej 80%, identyczności z sekwencjami pokazanymi na SEQ ID NO: 2 i 4 lub z ich ortologami. Peptydy takie bardziej korzystnie będą identyczne w co najmniej 90% i najkorzystniej identyczne w 95% i więcej z SEQ ID NO: 2 lub jej ortologami. Procent identyczności sekwencji jest określany przy użyciu konwencjonalnych metod. Patrz, przykładowo, Altschul i wsp., Bull. Math. Bio. 48:603-66, 1986 oraz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9, 1992. Krótko mówiąc, dwie sekwencje aminokwasowe są zestawiane dla zoptymalizowania przyrównania znaków przy użyciu kary za przerwę 10, kary za wydłużoną przerwę 1 oraz tablicy podobieństwa znaków

PL 211 033 B1 „blosum 62” według Henikoffer i Henikoffer (ibid.) jak pokazano w Tabeli 3 (aminokwasy podano za pomocą standardowych kodów jednoliterowych).

Procent identyczności oblicza się według wzoru:

Całkowita liczba identycznych dopasowań X 100

[długość najdłuższej sekwencji plus liczba przerw wprowadzona do najdłuższej sekwencji w celu przyrównania dwóch sekwencji]

Identyczność sekwencji cząsteczek polinukleotydowych określana jest przy użyciu podobnych metod z zastosowaniem przedstawionego powyżej stosunku.

	A	R	N	D	C	Q
A	4
R	-1	5
N	-2	0	6
D	-2	-2	1	6
C	0	-3	-3	-3	9
Q	-1	1	0	0	-3	5
E	-1	0	0	2	-4	2
G	0	-2	0	-1	-3	-2
H	-2	0	1	-1	-3	0
I	-1	-3	-3	-3	-1	-3
L	-1	-2	-3	-4	-1	-2
K	-1	2	0	-1	-3	1
M	-1	-1	-2	-3	-1	0
F	-2	-3	-3	-3	-2	-3
P	-1	-2	-2	-1	-3	-1
s	1	-1	1	0	-1	0
T	0	-1	0	-1	-1	-1
w	-3	-3	-4	-4	-2	-2
Y	-2	-2	-2	-3	-2	-1
V	0	-3	-3	-3	-i	-2

-2 6 0-2 8

Tablica 3

E G Η I L Κ Μ

F P S T W Y V

-3	-4	-3	4
-3	-4	-3	2	4
1	-2	-1	-3	-2	5
-2	-3	-2	1	2	-1
-3	-3	-1	0	0	-3
-1	-2	-2	-3	-3	-1
0	0	-1	-2	-2	0
-1	-2	-2	-1	-1	-1
-3	-2	-2	-3	-2	-3

-4 7

-2 -1 4

-2 -3 2 -1 -1 -2 -1

-2	-1	1	5
1	-4	-3	-2 11
3	-3	-2	-2 2	7
-1	-2	-2	0 -3	-1 4

Zasadniczo homologiczne białka i polipeptydy są scharakteryzowane jako posiadające jedno lub więcej podstawień, delecji lub insercji. Korzystnie jest jeśli zmiany te mają niewielkie znaczenie, jak konserwatywne podstawienia aminokwasowe (patrz Tabela 4) oraz inne podstawienia, które nie mają znaczącego wpływu na fałdowanie i aktywność białka czy polipeptydu; małe delecje, zazwyczaj od jednego do około 30 aminokwasów; oraz niewielkie wydłużenia na końcu aminowym i karbokslowym, jak aminokońcowa reszta metioninowa, krótkie linkery peptydowe do około 20-25 reszt czy znaczniki powinowactwa. Polipeptydy obejmujące znaczniki powinowactwa mogą dodatkowo obejmować miejsce cięcia proteolitycznego pomiędzy polipeptydem BR43x2 i znacznikiem powinowactwa. Korzystne miejsca obejmują miejsca cięcia dla trombiny oraz miejsca cięcia dla czynnika Xa.

PL 211 033 B1

T a b e l a 4

Konserwatywne podstawienia aminokwasowe

Zasadowe:	arginina lizyna histydyna
Kwaśne:	kwas glutaminowy kwas asparaginowy
Polarne:	glutamina asparagina
Hydrofobowe:	Leucyna izoleucyna walina
Aromatyczne	fenyloalanina tryptofan tyrozyna
Małe:	glicyna alanina seryna treonina metionina

Oprócz standardowych 20 aminokwasów, reszty aminokwasowe polipeptydów BR43x2 mogą być podstawione nie standardowymi aminokwasami (takimi jak 4-hydroksyprolina, 6-N-metylolizyna, kwas 2-aminoizomasłowy, izowalina oraz a-metyloseryna). Reszty aminokwasowe peptydu BR43x2 mogą być podstawione przez ograniczona liczbę niekonserwatywnych aminokwasów, aminokwasów, aminokwasy nie kodowane przez kod genetyczny oraz przez nienaturalne aminokwasy. Białka opisane w wynalazku mogą także obejmować niewystępujące w naturze reszty aminokwasowe.

Nie występujące w naturze aminokwasy obejmują, lecz nie jedynie, trans-3-metyloprolinę, 2,4-metanoprolinę, cis-4-hydroksyprolinę, trans-4-hydroksyprolinę, N-metyloglicynę, allo-treoninę, metylotreoninę, hydroksy-etylocysteinę, hydroksyetylo-homocysteinę, nitro-glutaminę, homoglutaminę, kwas pipekolinowy, tert-leucynę, norwalinę, 2-azafenyloalaninę, 3-aza-fenyloalaninę, 4-azafenyloalaninę oraz 4-fluoro-fenyloalaninę. Specjalistom znanych jest szereg metod wprowadzania niewystępujących naturalnie reszt aminokwasowych do białek. Przykładowo, można wykorzystać systemy in vitro, gdzie nonsensowne mutacje podlegają supresji przy użyciu chemicznie aminoacylowanych supresorowych cząsteczek tRNA. Metody syntezy aminokwasów i aminoacylowanych tRNA są znane specjalistom. Transkrypcję i translację plazmidów zawierających mutacje nonsensowne przeprowadza się w układzie bezkomórkowym obejmującym ekstrakt S30 z E.coli oraz handlowo dostępne enzymy i inne odczynniki. Białka oczyszczane są chromatograficznie. Patrz, przykładowo, Robertson i wsp., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman i wsp., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung i wsp., Science 259:806-9, 1993 oraz Chung i wsp., Proc. Natl. Cad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). W drugiej metodzie, translację przeprowadza się w oocytach Xenopus poprzez mikroinjekcję zmutowanego mRNA oraz chemicznie aminoacylowanych supresorowych cząsteczek tRNA (Turcatti i wsp., J. Biol. Chem. 271:1991-8, 1996). W trzeciej metodzie, komórki E.coli hodowane są przy braku naturalnego aminokwasu, który ma zostać zastąpiony (np. fenyloalaniny) a w obecności pożądanego, nie występującego naturalnie aminokwasu(ów) (np. 2-azafenyloalaniny, 3-azafenyloalaniny, 4-azafenyloalaniny, czy 4-fluoro-fenyloalaniny). Niewystępujący naturalnie aminokwas jest włączany do białka w miejsce jego naturalnego odpowiednika. Patrz, Koide i wsp., Biochem. 33:7470-6, 1994. Naturalnie występujące reszty aminokwasowe można przekształcać w niewystępujące naturalnie typy poprzez chemiczna modyfikację in vitro. Chemiczna modyfikacja może być połączona z miejscowo ukierunkowaną mutagenezą dla uzyskania dalszych substytucji (Wynn i Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).

Reszty aminokwasowe z BR43x2 mogą być podstawione ograniczona liczbą niekonserwatywnych aminokwasów, aminokwasów, aminokwasy, które nie są kodowane przez kod genetyczny, aminokwasów niewystępujących naturalnie oraz nienaturalne aminokwasy.

Zasadnicze aminokwasy w polipeptydach BR43x2 można zidentyfikować stosując procedury znane specjalistom takie jak miejscowo ukierunkowana mutagenezą lub mutagenezą poprzez skaning

PL 211 033 B1 alaninowy (Cunningham i Wells, Science 244:1081-5, 1989). Pojedyncze mutacje alaninowe wprowadzane są w każdej reszcie cząsteczki a uzyskiwane zmutowane cząsteczki są testowane na aktywność biologiczną (np. dostarczenie obniżenia odpowiedzi limfocytów B podczas odpowiedzi immunologicznej, zahamowanie lub obniżenie produkcji autoprzeciwciała) w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych, które są krytyczne dla aktywności cząsteczki. Patrz także Hilton i wsp., J. Biol. Chem. 271:4699-708, 1996. Można także określać miejsca biologicznego oddziaływania, fragmentów wiążących ligand, jak pseudo-powtórzenia bogate w cysteinę, poprzez fizyczną analizę struktury za pomocą takich technik jak magnetyczny rezonans jądrowy, krystalografia, dyfrakcja elektronowa czy znakowanie dla fotopowinowactwa w powiązaniu z mutacją w przypuszczalnych aminokwasach miejsca kontaktowego. Patrz, przykładowo, de Vos i wsp., Science 255:306-12, 1992; Smith i wsp., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver i wsp., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Identyczność koniecznych aminokwasów można uzyskać z analizy homologii dla pokrewnych członków rodziny TNFR jak TACI i BCMA.

Dodatkowe substytucje można wytworzyć w pseudo-powtórzeniu bogatym w cysteinę z BR43x2 tak długo jak pozostawione są konserwowane reszty cysteiny, kwasu asparaginowego oraz leucyny i wyższe uporządkowanie struktury nie jest zaburzone. Korzystne jest przeprowadzenie substytucji w pseudo-powtórzeniu bogatym w cysteinę z BR43x2 w odniesieniu do sekwencji dla innych pseudopowtórzeń bogatych w cysteinę. SEQ ID NO:10 jest uogólnionym pseudo-powtórzeniem bogatym w cysteinę , które pokazuje dopuszczalne substytucje aminokwasowe w oparciu o przyrównanie. Substytucje w tej domenie są poddane ograniczeniom przedstawionym tu.

Mnogie substytucje aminokwasowe można wytwarzać i testować przy użyciu znanych metod mutagenezy i przeszukiwania, jak te ujawnione przez Reidhaar-Olson i Sauer (Science 241:53-7, 1988) czy Bowie i Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Krótko mówiąc, autorzy ci ujawniają metody jednoczesnego losowego zmieniania dwóch lub większej liczby pozycji w polipeptydzie, selekcjonowania funkcjonalnego polipeptydu oraz sekwencjonowania zmutowanych polipeptydów w celu określenia zakresu dopuszczalnego dla substytucji w każdej pozycji. Inne metody, które można użyć obejmują metodę „phage display” (np. Lowman i wsp., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner i wsp., patent USA nr 5223409; Huse, publikacja WIPO WO 92/06204) oraz mutagenezę ukierunkowaną na cały obszar (Derbyshire i wsp., Gene 46:145, 1986; Ner i wsp., DNA 7: 127, 1988).

Odmiany ujawnianego DNA dla BR43x2 można wytwarzać metoda typu „shuffling” jak opisano w Stemmer, Nature 370:389-91, 1994 oraz publikacji WIPO 97/20078. Krótko mówią c, odmiany czą steczek DNA można wytwarzać poprzez homologiczna rekombinację in vitro, dzięki losowej fragmentacji rodzicielskiego DNA a następnie ponowne złożenie poprzez PCR, w wyniku czego uzyskuje się losowo wprowadzone mutacje punktowe. Technikę tę można zmodyfikować poprzez wprowadzenie rodziny rodzicielskich cząsteczek SDNA, takich jak alleliczne odmiany lub cząsteczki DNA pochodzące z różnych gatunków, co wprowadza dodatkowe zmienne do procesu. Selekcja lub poszukiwanie pożądanej aktywności, a następnie przeprowadzenie dodatkowych reakcji mutagenezy oraz testu dostarcza szybkiej „ewolucji” sekwencji dzięki selekcji pożądanych mutacji podczas jednoczesnej selekcji określonych zmian.

Metody mutagenezy jak te ujawnione powyżej można połączyć z wysokowydajnymi, zautomatyzowanymi metodami przesiewowymi dla wykrycia aktywności sklonowanych, zmutagenizowanych polipeptydów w komórkach gospodarza. Zmutagenizowane cząsteczki DNA, kodujące aktywne polipeptydy (np. umożliwiające obniżenie odpowiedzi limfocytów B podczas odpowiedzi immunologicznej, zahamowanie lub obniżenie produkcji autoprzeciwciała) można odzyskiwać z komórek gospodarza i szybko sekwencjonować przy użyciu nowoczesnego sprzętu. Metody te pozwalają na szybkie określenie istotności poszczególnych reszt aminokwasowych w interesującym peptydzie i mają zastosowanie dla polipeptydów o nieznanej strukturze.

Stosując metody omówione powyżej specjalista może identyfikować i/lub wytwarzać odmiany polipeptydów, które są zasadniczo homologiczne do reszt 1 do 120 z SEQ ID NO: 2 lub jej odmian allelicznych i zachowywać właściwości supresyjne limfocytów B białka dzikiego typu. Takie polipeptydy mogą zawierać dodatkowe aminokwasy lub domeny innych członków superrodziny receptora nekrotycznego czynnika nowotworowego, znaczniki powinowactwa i im podobne. Peptyd BR43x2 lub konstrukcje fuzyjne, zawierające funkcjonalne domeny innych członków superrodziny TNFR stanowią hybrydowe receptory nekrotycznego czynnika nowotworowego wykazujące zmodyfikowane zdolności supresji limfocytów B.

Niniejszy wynalazek opisuje dalej odpowiedniki receptorów i polinukleotydów z innych gatunków (ortologów). Gatunki te obejmują, lecz nie jedynie, gatunki ssaków, ptaków, płazów, gadów, ryb, owadów

PL 211 033 B1 i innych kręgowców i bezkręgowców. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są receptory BR43x2 z różnych gatunków ssaczych w tym receptory mysie, świńskie, owcze, bydlęce, psie, kocie, końskie oraz z innych naczelnych. Ortologi ludzkiego receptora BR43x2 można klonować stosując informacje i kompozycje dostarczane poprzez niniejszy wynalazek w połączeniu z konwencjonalnymi technikami klonowania. Przykładowo, cDNA można klonować przy użyciu mRNA uzyskanego z tkanki lub komórki, która wytwarza receptor. Dogodne źródła mRNA można zidentyfikować za pomocą techniki typu Northern stosując sondy zaprojektowane na podstawie ujawnianych tu sekwencji. Z mRNA pochodzącego z pozytywnych tkanek czy linii komórkowych przygotowywana jest następnie biblioteka. cDNA kodujący receptor można wyizolować różnymi sposobami, takimi jak hybrydyzacja z sondą pochodzącą z całkowitego lub fragmentu ludzkiego cDNA lub z jednego lub kilku zestawów zdegenerowanych sond wytworzonych w oparciu o ujawniona sekwencję. CDNA można także klonować stosując PCR, używając startery zaprojektowane na podstawie ujawnionych tu sekwencji W dodatkowej metodzie bibliotekę cDNA można użyć do transformacji czy transfekcji komórek gospodarza a ekspresja interesującego cDNA może być wykrywana przez przeciwciała dla receptora. Podobne techniki można zastosować do izolacji klonów genomowych.

Polipeptydy receptorowe, włączając w to receptory polipeptydowe o pełnej długości, rozpuszczalne receptory peptydowe, fragmenty polipeptydowe oraz fuzje peptydowe można wytwarzać w genetycznie skonstruowanych komórkach gospodarza zgodnie z konwencjonalnymi technikami. Dogodnymi komórkami gospodarza są takie typy komórek, które można transformować czy transferekować egzogennym DNA i hodować w hodowlach i obejmują one bakterie, komórki grzybów oraz kultury komórkowe wyższych eukariota. Korzystne są komórki eukariotyczne, w szczególności hodowlane komórki organizmów wielokomórkowych. Techniki manipulacji sklonowanymi cząsteczkami DNA oraz wprowadzania egzogennego DNA do różnych komórek gospodarza opisano w Sambrook et. Al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wyd. drugie, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et at., wyd. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

Zasadniczo, sekwencja DNA kodująca polipeptyd BR43x2 jest funkcjonalnie połączony z innymi elementami genetycznymi wymaganymi do jego ekspresji, zasadniczo obejmującymi promotor transkrypcji oraz terminator, w wektorze ekspresyjnym. Wektor także będzie zazwyczaj zawierał jeden lub większa liczbę markerów selekcyjnych oraz jedno lub więcej miejsc startu replikacji, chociaż specjalistom wiadomo jest, że w pewnych systemach markery selekcyjne można dostarczać na oddzielnych wektorach a replikację egzogennego DNA można osiągnąć poprzez jego integrację z genomem komórki gospodarza. Wybór promotorów, terminatorów, markerów selekcyjnych, wektorów oraz innych elementów zależy od specjalisty. Wiele takich elementów opisano w literaturze i są dostępne handlowo.

W celu skierowania peptydu BR43x2 na drogę wydzielniczą komórki gospodarza, w wektorze dostarczana jest wydzielnicza sekwencja sygnałowa (także znana jako sekwencja sygnałowa, sekwencja liderowa, prepro-sekwencja czy pre-sekwencja). Wydzielnicza sekwencja sygnałowa może pochodzić albo z peptydu BR43x2 lub z innego wydzielanego białka (np. t-PA) lub zsyntetyzowana de novo. Wydzielnicza sekwencja sygnałowa jest połączona z sekwencja DNA dla BR43x2 we właściwej ramce odczytu i tak położona aby kierować nowo syntetyzowane białko na drogę wydzielniczą komórki gospodarza. Wydzielnicze sekwencje sygnałowe są zazwyczaj położone na końcu 5' sekwencji DNA kodującej interesujący polipeptyd, chociaż pewne sekwencje sygnałowe mogą być położone gdzie indziej w interesującej sekwencji DNA (patrz, np. Welch i wsp., patent USA nr 5037743; Holland i wsp., patent USA nr 5143830).

Hodowle komórek ssaczych są dogodnymi gospodarzami do realizacji zastosowania według niniejszego wynalazku. Sposoby wprowadzania egzogennego DNA do ssaczych komórek gospodarza obejmują transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia (Wigler i wsp., Cell 14:725, 1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham i Van der Eb, Virology 52:456, 1973), elektroporację (Neumann i wsp., EMBO J. 1:841-45. 1982), transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstranu (Ausubel i wsp., ibid.) oraz transfekcję za pośrednictwem liposomów (Hawley-Nelson i wsp., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et. al., Focus 15:80, 1993). Wytwarzanie zrekombinowanych polipeptydów w hodowlach ssaczych komórek ujawniono, przykładowo, w Levinson i wsp., patent USA nr 4713339; Hagen i wsp., patent USA nr 4784950; Palmiter i wsp., patent USA nr 4579821 oraz Ringold, patent USA nr 4656134. Stosowne hodowle komórek ssaczych obejmują COS-1 (ATCC nr CRL 1650), COS-7 (ATCC nr CRL 1651), BHK (ATCC nr CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr CRL 10314), 293 (ATCC nr CRL 1573, Graham i wsp., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), Jurkat (ATCC nr CRL-8129), BaF3 (zależna od interleukiny 3 linia komórek pre-limfoidalnych pochodząca z mysiego

PL 211 033 B1 szpiku kostnego. Patrz, Palacios i Steinmetz, Cell 41: 727-34, 1985; Mathey-Prevot i wsp., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-5, 1986) oraz linie komórkowe jajnika chomika chińskiego (np. CHO-K1; ATCC nr CCL 61). Dodatkowe dogodne linie komórkowe są znane specjalistom i dostępne z publicznych depozytów takich jak American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Zasadniczo, korzystne są silne promotory traskrypcji, takie jak promotor z SV-40 czy cytomegalowirusa. Patrz, np., patent USA nr 4956288. Inne dogodne promotory obejmują pochodzące z genów metalotioneiny (patenty USA nr. 4579821 i 4601978 oraz główny późny promotor adenowirusa).

Selekcja oporności na leki jest zasadniczo stosowana w celu znalezienia hodowli ssaczych komórek z insercją obcego DNA. Komórki takie powszechnie nazywa się „transfektantami”. Komórki, które były hodowane w obecności czynnika selekcyjnego i są zdolne do przekazywania insercji potomnym pokoleniom nazywane są „stabilnymi transfektantami” Korzystnym markerem selekcyjnym jest gen kodujący oporność na amtybiotyk-neomycynę. Selekcja jest prowadzona w obecności leku typu neomycyny takiego jak G-418 czy podobnego. Systemy selekcyjne można także zastosować dla podwyższenia poziomu ekspresji interesującego genu, proces zwany „amplifikacją”. Amplifikację prowadzi się poprzez hodowanie transfektantów w obecności niskiego poziomu czynnika selekcyjnego a następnie podwyższanie ilości czynnika selekcyjnego w celu wyselekcjonowania komórek wytwarzających wysokie poziomy produktów wprowadzonych genów. Korzystnym markerem selekcyjnym dla amplifikacji jest reduktaza dihydrofolianowa, która nadaje oporność na metotreksat. Można zastosować także inne geny nadające oporność na leki (np. oporność na higromycynę, oporność na wiele leków, acetylotransferaza puromycyny). Dla sortowania komórek stransfekowanych od niestransfekowanych, metodami typu FACS sorting czy przy użyciu kulek magnetycznych można stosować alternatywne markery nadające zmieniony fenotyp, takie jak białko fluorescencyjne, GFP, lub białka powierzchniowe komórki jak CD4, CD8, MHC klasy I czy fosfataza alkaliczna z łożyska.

Jako gospodarzy można także zastosować komórki innych wyższych eukariontów w tym komórki roślinne, komórki owadzie i komórki ptasie. Opisano użycie Agrobacterium rhizogenes jako wektora dla ekspresji genów w komórkach roślinnych, Sinkar i wsp., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. Transformację komórek owadzich do produkcji obcych polipeptydów ujawniono w Guarino i wsp., patent USA nr 5162222 oraz publikacji WIPO WO 94/06463. Komórki owadzie można infekować zrekombinowanym bakulowirusem pochodzącym z Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Patrz King i Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Londyn, Chapman & Hall; O'Reilly i wsp., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford, University Press., 1994 oraz Richardson, wyd., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Druga metoda uzyskiwania bakulowirusów ze zrekombinowanym BR43x2 wykorzystuje system oparty na transpozonie, opisany przez Lucow (Lucow i wsp., J. Virol. 67:4566-79, 1993). System ten, wykorzystujący wektory przenoszące, jest sprzedawany w zestawie Bac-to-Bac^TM (Life Technologies, Rockville, MD). System wykorzystujący wektor przenoszący, pFastBac1^TM (Life Technologies) zawiera transpozon T7 do przenoszenia DNA kodującego polipeptyd BR43x2 do genomu bakulowirusa utrzymywany w E.coli jako duży plazmid zwany „bacmid”. Patrz, Hill-Perkins i Possee, J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning i wsp., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994 oraz Chazenbalk oraz Rapoport J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. Dodatkowo, wektory przenoszące mogą obejmować w fuzji z ramką kodującego DNA znacznik epitopowy na końcu club N- wytwarzanego polipeptydu BR43x2, przykładowo, znacznik epitopowy Glu-Glu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-4, 1985). Przy użyciu technik znanych specjalistom, wektor przenoszący zawierający BR43x2 jest transformowany do E.coli a następnie poszukiwane są bacmidy, które zawierają uszkodzony gen lacZ, co wskazuje na zrekombinowanego wirusa. DNA bacmidu zawierającego zrekombinowany genom bakulowirusa jest izolowany przy użyciu powszechnych technik i używany do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda np. komórek Sf9. Wytwarzany jest zrekombinowany wirus, pozwalający na produkcję BR43x2. Stoki zrekombinowanych wirusów są uzyskiwane powszechnie znanymi metodami.

Zrekomibinowany wirus jest używany do infekcji komórek gospodarza, zazwyczaj linii komórkowej pochodzącej z pleniówki, Spodoptera frugiperda. Patrz, ogólnie, Glick i Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Waszyngton, D.C., 1994. Inną stosowną linią komórkową jest linia komórek High FiveO™ (Invitrogen) pochodząca z Trichoplusia ni (patent USA #53004345). Do hodowli i utrzymywania komórek stosowane są handlowo dostępne wolne od surowicy podłoża. Stosownymi podłożami są Sf900 II™ (Life Technologies) lub ESF 921™ (Expression Systems) dla komórek Sf9 oraz Ex-cell405™ (JRH Biosciences, Lenexa,

PL 211 033 B1

KS) czy Express FiveO™ (Invitrogen) dla komórek T.ni. Komórki hoduje się od gęstości zaszczepienia około 2-5 x 10⁵ komórek do gęstości 1-2 x 10⁵ komórek, przy której dodawany jest stok zrekombinowanych wirusów przy MOI (multiplicity of infection) do 0,1 do 10, bardziej typowo blisko 3. Stosowane procedury są zasadniczo opisane w dostępnych skryptach laboratoryjnych (King i Possee, ibid.). Polipeptyd BR43x2 można następnie oczyszczać z supernatantu sposobami tu opisanymi.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem także można stosować komórki grzyba, włączając komórki drożdży. Szczególnie przydatnymi gatunkami drożdży są Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oraz Pichia methanolica. Sposoby transformowania komórek S. cerevisiae egzogennym DNA oraz wytwarzania w nich zrekombinowanych polipeptydów są ujawnione przez, przykładowo, Kawasaki, patent USA nr 4599311; Kawasaki i wsp., patent USA nr 4931373; Brake, patent USA nr 4873008; Welch i wsp., patent USA nr 5037743 oraz Murray i wsp., patent USA nr 4845075. Stransformowane komórki są selekcjonowane dzięki fenotypowi nadanemu przez marker selekcyjny, zazwyczaj oporność na leki lub zdolność do wzrostu przy braku określonego składnika w pożywce (np. leucyny). Korzystnym systemem wektorowym do użycia w Saccharomyces cerevisiae jest system wektora POT1 ujawniony przez Kawasaki et al. (patent USA nr 4931373), który pozwalana na selekcjonowanie stransformowanych komórek poprzez wzrost na podłożach zawierających glukozę. Dogodnymi promotorami i terminatorami stosowanymi w drożdżach są promotory genów enzymów glikolitycznych (patrz, np. Kawasaki, patent USA nr 4599311; Kingsman i wsp., patent USA nr 4615974 oraz Bitter, patent USA nr 4977092) oraz genów dehydrogenazy alkoholowej. Patrz, patenty USA nr 4990446; 5063154; 5139936 oraz 4661454. Systemy transformacji dla innych drożdży, włączając Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii oraz Candida maltosa są znane specjalistom. Patrz, przykładowo, Gleeson i wsp., J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986 oraz Cregg, patent USA nr 4882279. Komórki Aspergillus można wykorzystywać zgodnie z metodami McKnight i wsp., patent USA nr 4935349. Metody transformacji Acremonium chrysogenum są ujawnione przez Sumino i wsp., patent USA nr 5162228. Metody transformacji Neurospora są ujawnione przez Lambowitz, patent USA nr 4486533.

Dla przykładu, użycie Pichia methanolica jako gospodarza do produkcji zrekombinowanych białek jest ujawnione przez Raymond, patent USA nr 5716808, Raymond, patent USA nr 5736383, Raymond i wsp., Yeast 14:11-23, 1998 oraz międzynarodowe publikacje nr WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 oraz WO 98/02565. Cząsteczki DNA do użycia przy transformacji P. methanlica mogą być przygotowane w formie dwuniciowych, kolistych plazmidów, które korzystnie są linearyzowane przed transformacją. Do wytwarzania polipeptydu w P. methanolica korzystne jest aby promotor i terminator znajdujące się w plazmidzie pochodziły z genu P. methanolica, jak gen wykorzystania alkoholu (AUG1 lub AUG2). Inne przydatne promotory obejmują te z genów syntazy dihydroksyacetonowej (DHAS), dehydrogenazy mrówczanowej (FMD) oraz katalazy (CAT). Dla ułatwienia integracji DNA do chromosomu gospodarza korzystne jest posiadanie całego segmentu ekspresyjnego z plazmidu w formie oflankowanej z obu stron przez sekwencje DNA gospodarza. Korzystnym markerem selekcyjnym do użycia w Pichia methanolica jest gen ADE2 z P. methanolica, kodujący karboksylazę fosforybozylo-5-aminoimidazolową (AIRC; EC 4.1.1.21), która pozwala komórkom gospodarza o fenotypie ade2 rosnąc przy braku adeniny. Tam gdzie pożądana jest minimalizacja zużycia metanolu, w procesach przemysłowych na dużą skalę, korzystne jest użycie komórek gospodarza z wydeletowanymi obydwoma genami wykorzystania metanolu (AUG1 i AUG2). Dla produkcji wydzielanych białek, korzystne są komórki gospodarza z zaburzonymi genami proteaz wakuolarnych (PEP4 i PRB1). Dla ułatwienia wprowadzenia plazmidu zawierającego DNA kodujący interesujący polipeptyd do komórek P. methanolica stosowana jest elektroporacja. Korzystne jest transformowanie komórek P. methanolica poprzez elektroporację stosując wykładniczo zanikającego pulsowego pola elektrycznego o sile pola od 2,5 do 4,5 kV/cm, korzystnie około 3,75 kV/cm i stałym czasie (t) od 1 do 40 milisek., bardziej korzystnie około 20 milisek.

Komórki gospodarza prokariotycznego, włączając szczepy bakterii jak Escherichia coli, Bacillus i innych rodzajów są także przydatne jako komórki gospodarza. Techniki transformacji tych komórek oraz ekspresji obcych sekwencji DNA w nich sklonowanych są dobrze znane specjalistom (patrz. np. Sambrook i wsp., ibid.). Kiedy wytwarzany w bakteriach takich jak E. coli polipeptyd BR43x2 może pozostać w cytoplazmie, zazwyczaj jako nierozpuszczalne granule, lub może być skierowany do przestrzeni periplazmatycznej dzięki sekwencjom wydzielniczym bakterii. W pierwszym przypadku, komórki są lizowane a granule są odzyskiwane i denaturowane przy użyciu, przykładowo, rodanku guanidyny

PL 211 033 B1 lub mocznika. Zdenaturowany polipeptyd można ponownie fałdować oraz dimeryzować poprzez rozcieńczenie denaturanta, jak w czasie dializy wobec roztworu mocznika i mieszaniny zredukowanego i utlenionego glutationu, a następnie wobec buforowanej soli fizjologicznej. W drugim przypadku polipeptyd jest odzyskiwany z przestrzeni periplazmatycznej w formie rozpuszczalnej i funkcjonalnej dzięki rozerwaniu komórek (przez przykładowo, sonikację lub szok osmotyczny) w celu uwolnienia zawartości przestrzeni periplazmatycznej i odzyskania białka, co pozwala na ominięcie denaturacji i ponownego fałdowania.

Stransformowane lub stransfekowane komórki gospodarza są hodowane zgodnie z tradycyjnymi procedurami w podłożu hodowlanym zawierającym składniki pokarmowe i inne składniki wymagane do wzrostu wybranych komórek gospodarza. Specjalistom znane są różne odpowiednie podłoża, w tym podłoża o zdefiniowanym składzie oraz podłoża złożone, i zasadniczo zawierają one źródło węgla, źródło azotu, niezbędne aminokwasy, witaminy i sole mineralne. Podłoża mogą także zawierać takie składniki jak czynniki wzrostu czy surowicę, jeśli jest to wymagane. Podłoże wzrostowe będzie zasadniczo selekcjonować komórki zawierające egzogennie dodany DNA poprzez, przykładowo, selekcję na lek lub brak zasadniczego składnika pokarmowego, który jest komplementowany przez marker selekcyjny niesiony przez wektor ekspresyjny lub ko-transfekowany do komórki gospodarza. Komórki P. methanolica są hodowane na podłożu zawierającym odpowiednie źródła węgla, azotu oraz śladowe ilości składników pokarmowych w temp. około 25°C do 35°C. Hodowle płynne są przeprowadzane z wystarczającym napowietrzaniem tradycyjnymi sposobami, takimi jak wytrząsanie małych kolbek czy skraplanie w fermentorach. Korzystnym podłożem hodowlanym dla P. methanolica jest YEPD (2% D-glukoza, 2% Bacto™ Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto™ yeast extract (Difco Laboratories), 0,004% adenina oraz 0,006% L-leucyna).

Wytworzone zrekombinowane polipeptydy BR43x2 (lub chimery czy fuzje peptydowe BR43x2) można oczyszczać tradycyjnymi metodami oczyszczania i złóż. Korzystne jest dostarczanie białek czy polipeptydów w formie o wysokiej czystości np. powyżej 95% czystości, bardziej korzystnie powyżej 99% czystości. Do frakcjonowania próbek można użyć wytrącanie siarczanem amonu oraz ekstrakcję kwaśną czy chalotropową. Przykładowe etapy oczyszczania mogą wymagać hydroksyapatytu, wykluczania zależnego od wielkości, FPLC oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej odwróconej fazy. Przydatne podłoża jonowymienne obejmują pochodne dekstranów, agarozy, celulozy, poliakryloamidu, specjalnych krzemionek i temu podobnych. Korzystne są pochodne PEI, DEAE, QAE i Q ze szczególnie korzystną DEAE Flow-Fast Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Przykłady złóż chromatograficznych obejmują pochodne złóż z grupami fenylową, butylową lub oktylową, jak Phenyl-Sepharose FE (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i podobne; lub żywice poliakrylowe, jak Amberchrom CG 71 (Toso HAAS) i podobne. Stosowne stałe nośniki obejmują kulki szklane, żywice oparte na krzemie, żywice celulozowe, żywice agarozowe, kulki z krzyżowo podłączoną agarozą kulki polistyrenowe, kulki z krzyżowo podłączonym poliakryloamidem i podobne, które są nierozpuszczalne w warunkach w jakich są stosowane. Nośniki te można modyfikować za pomocą grup reaktywnych, które umożliwiają przyłączanie białek poprzez grupy aminowe, grupy karboksylowe, grupy sulfhydrylowe, grupy hydroksylowe i/lub cząsteczki węglowodanów. Przykłady chemii sprzęgania obejmują aktywację bromocjankiem, aktywację hydroksybursztynyloimidem, aktywację epoksydową, aktywację sulfhydrylową, aktywację hydrazydową, oraz pochodne karboksylowe i aminowe karboimidowej chemii sprzęgania. Te jak i inne stałe złoża są dobrze znane i powszechnie używane przez specjalistów oraz są handlowo dostępne. Sposoby wiązania receptorów polipeptydowych ze stałymi złożami są dobrze znane specjalistom. Wybór konkretnej metody zależy od projektu i jest w części zdeterminowana przez właściwości wybranego nośnika. Patrz, przykładowo. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Szwecja, 1988.

Polipeptydy opisane w wynalazku można izolować wykorzystując ich właściwości fizyczne. Przykładowo, chromatografię z unieruchomianiem poprzez absorpcję na metalu (IMAC) można stosować przy oczyszczaniu białek bogatych w histydynę w tym tych, które posiadają znaczniki polihistydynowe. W skrócie, żel jest najpierw ładowany dwuwartościowymi jonami metali tak, że powstają chelaty (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Białka bogate w histydynę będą adsorbować na takiej matrycy z różnym powinowactwem, zależnie od użytego jonu metalu i będą wymywane za pomocą współzawodniczącego roztworu elucyjnego, obniżonego pH czy dzięki zastosowaniu czynników chelatujących. Inne metody oczyszczania obejmują oczyszczanie białek glikozylowanych za pomocą chromatografii z powinowactwem do lektyn i chromatografii jonowymiennej (Methods in Enzymol., Vol. 182,

PL 211 033 B1 „Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, (wyd.), Acad. Press, San Diego, 1990, str. 529-39). W dodatkowym wykonaniu można skonstruować fuzję interesującego polipeptydu ze znacznikiem powinowactwa (np. białkiem wiążącym maltozę, FLAG-tag (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID NO:13)), znacznikiem Glu-Glu (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEQ ID NO: 14)), domeną immunoglobulinową dla ułatwienia oczyszczania.

Można też zastosować procedury ponownego fałdowania białka (i fakultatywnie reoksydacji). Korzystne jest oczyszczenie białka do >80% czystości, bardziej korzystnie do >90% czystości, jeszcze bardziej korzystnie do >95% i szczególnie korzystny jest farmaceutycznie czysty stan, to znaczy powyżej 99,9% czystości w odniesieniu do zanieczyszczających makrocząsteczek, w szczególności innych białek oraz kwasów nukleinowych, wolny od czynników infekcyjnych i pyrogennych. Korzystnie, oczyszczone białko jest zasadniczo wolne od innych białek w szczególności innych białek pochodzenia zwierzęcego.

Polipeptydy BR43x2 lub ich fragmenty można także wytwarzać na drodze syntezy chemicznej. Polipeptydy BR43x2 mogą być monomerami lub multimerami; glikozylowane lub nieglikozylowane, pegilowane lub niepegilowane i mogą lecz nie muszą zawierać inicjacyjnej metioninowej reszty aminokwasowej. Przykłady polipeptydów BR43x2 obejmują polipeptydy o długości 32-40 reszt, posiadające sekwencję aminokwasową zgodną z motywem: XXCX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]CXX (SEQ ID NO:10) poddaną ograniczeniom jak opisano powyżej.

Polipeptydy BR43x2 można syntetyzować ekskluzyjna syntezą fazy stałej, metodami częściowej fazy stałej, poprzez kondensację fragmentów czy klasyczną syntezą w roztworze. Polipeptydy są korzystnie wytwarzane przy użyciu syntezy peptydów w fazie stałej, przykładowo jak opisano w Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963. Synteza prowadzona jest z aminokwasami, które są zabezpieczone na końcach alfa-aminowych. Trójfunkcjonalne aminokwasy z labilnymi łańcuchami bocznymi także są zabezpieczone odpowiednimi grupami dla uniemożliwienia niepożądanych reakcji chemicznych pojawiających się w czasie składania polipeptydów. Grupa zabezpieczająca koniec alfa-aminowy jest selektywnie usuwana co umożliwia zajście kolejnej reakcji na końcu aminowym. Warunki usuwania grupy zabezpieczającej koniec alfa-aminowy są tak dobrane, że nie powodują usunięcia grup zabezpieczających łańcuch boczny. Grupami zabezpieczającymi koniec alfa-aminowy są te, które są przydatne w stopniowej syntezie polipeptydu. Włączone są grupy zabezpieczające typu akrylowego (np. formylowe, trifluoroacetylowe, acetylowe), grupy zabezpieczające typu arylowego (np. biotynylowe), grupy zabezpieczające typu aromatycznych uretanów [np. benzylooksykarbonylowa (Cbz), podstawiona benzylokarbonylowa i 9-fluorenylometyloksykarbonylowa (Fmoc), grupy zabezpieczające typu alifatycznych uretanów [np. t-butylooksykarbonylowa (tBoc), izopropylo-oksy-karbonylowa, cykloheksyloksykarbonylowa] oraz grupy zabezpieczające typu alkilowego (np. benzylowa, trifenylometylowa). Korzystnymi grupami zabezpieczającymi są tBoc i Fmoc.

Wybrane grupy zabezpieczające łańcuch boczny muszą pozostać nienaruszone w czasie sprzęgania i nie mogą być usunięte podczas usuwania grup zabezpieczających koniec aminowy lub w warunkach sprzęgania. Grupy zabezpieczające łańcuch boczny muszą być usuwalne po zakończeniu syntezy w warunkach reakcji, które nie zmienią wytworzonego polipeptydu. W chemii tBoc, grupy zabezpieczające łańcuch boczny w trójfunkcjonalnych aminokwasach są przeważnie oparte na benzylu. W chemii Fmoc są one przeważnie oparte na tert-butylu tritylu.

W chemii tBoc korzystnymi grupami zabezpieczającymi są tosylowa dla argininy, cykloheksyl dla kwasu asparaginowego, 4-metylobenzylowa (i acetamidometylowa) dla cysteiny, benzylowa dla kwasu glutaminowego, seryny i treoniny, benzyloksymetylowa (i dinitrofenylowa) dla histydyny, 2-Cl-benzyloksykarbonylowa dla lizyny, formylowa dla tryptofanu oraz 2-bromobenzylowa dla tyrozyny. W chemii Fmoc korzystnymi grupami zabezpieczającymi są 2,2,4,6,7-pentametylochromano-6-sulfonylowa (Pmc) lub 2,2,4,5,7-pentametylodihydrobenzofurano-5 sulfonylowa (Pbf) dla argininy, tritylowa dla asparaginy, cysteiny, glutaminy i histydyny, tert-butylowa dla kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, seryny, treoniny i tyrozyny, tBoc dla lizyny i tryptofanu.

Dla syntezy fosfopeptydów stosowane jest wprowadzanie grupy fosforanowej zarówno bezpośrednio jak i po złożeniu peptydu. W strategii wprowadzania bezpośredniego, fosforanowa grupa w serynie, treoninie czy tyrozynie może być zabezpieczana przez grupę metylową, benzylową czy tertbutylową w chemii Fmoc lub grupę metylową, benzylową czy fenylową w chemii tBoc. W chemii Fmoc można także zastosować bezpośrednie wprowadzenie fosfotyrozyny bez zabezpieczania grupy fosforanowej. W strategii wprowadzania grupy fosforanowej po złożeniu peptydu nie zabezpieczone grupy

PL 211 033 B1 hydroksylowe seryny, treoniny czy tyrozyny są derywatyzowane na fazie stałej z di-tert-butylo, dibenzylo- lub dimetylo-N,N'-diizopropylofosforamiditem, a następnie oksydowane przez wodoronadtlenek tert-butylowy.

Synteza na fazie stałej jest zazwyczaj przeprowadzana od końca karboksylowego poprzez sprzęganie aminokwasu zabezpieczonego na alfa-aminowym końcu (z protekcją łańcucha bocznego) z odpowiednim stałym nośnikiem. W czasie przyłączania do żywicy chlorometylowej, chlorotritylowej czy hydroksymetylowej tworzone jest wiązanie estrowe i powstający polipeptyd będzie miał wolną grupę karboksylową na końcu C. Alternatywnie, kiedy stosowana jest żywica taka jak benzhydryloaminowa czy p-metylobenzhydryloaminowa (dla chemii tBoc) oraz Rink amid lub żywica PAL (dla chemii Fmoc) tworzone jest wiązanie amidowe i powstający polipeptyd będzie miał grupę karboksyamidową na końcu C. Żywice te, zarówno oparte na polistyrenie jak poliamidach czy szczepione z polietylenoglikolem, z lub bez uchwytu czy linkera, z lub bez przyłączonego pierwszego aminokwasu są handlowo dostępne a ich wytwarzanie opisano w Sterward i wsp., „Solid Phase Peptide Synthesis” (2 wyd.), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) oraz Bayer i Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986 oraz Atherton i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1939.

C-końcowy aminokwas, z zabezpieczaną grupą boczną jeśli jest to konieczne i zabezpieczaną grupą alfa-aminową przyłączany jest do żywicy hydroksymetylowej przy użyciu różnych czynników aktywujących włączając dicykloheksylokarbodiimid (DCC), N,N'-diizopropylokarboimid (DIPCDI) oraz karbonylodiimidazol (CDI). Będzie on przyłączany do żywicy chlorometylowej lub chlorotritylowej bezpośrednio w formie soli tetrametyloamonowej cezu lub w obecności trietyloaminy (TEA) czy diizopropyloetyloaminy (DIEA). Przyłączenie pierwszego aminokwasu do żywicy amidowej jest takie samo jak tworzenie wiązania amidowego podczas reakcji sprzęgania.

Po przyłączeniu do nośnika z żywicy, grupa zabezpieczająca alfa-aminowy koniec jest usuwana przy użyciu różnych odczynników w zależności od zastosowanej chemii protekcji (np. tBoc, Fmoc). Zakres usunięcia Fmoc można monitorować przy 300-320 nm lub w naczynku konduktometrycznym. Po usunięciu grupy zabezpieczającej alfa-aminowy koniec, pozostałe zabezpieczane aminokwasy są stopniowo sprzęgane w porządku wymaganym dla uzyskania pożądanej sekwencji.

Można stosować różne czynniki aktywujące do reakcji sprzęgania włączając DCC, DIPCDI, heksafluorofosforan 2-chloro-1,3-dimetyloimidiowy (CIP), heksafluorofosforan benzotriazolo-1-ylo-oksy-tris-(dimetylo-amino)-fosfoniowy (BOP) i jego analog pirrolidynowy (PyBOP), heksafluorofosforan bromo-tris-pirrolidyno-fosfoniowy (PyBrOP), heksafluorofosforan O-(benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylo-uroniowy (HBTU) oraz jego tetra-fluoroboranowy analog (TBTU) czy analog pirrolidonowy (HBPyU), heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylo-uroniowy (HATU) lub jego tetra-fluoroboranowy analog (TATU) czy analog pirrolidonowy (HAPyU). Najpowszechniej dodawanymi związkami katalitycznymi, używanymi w reakcjach sprzęgania są 4-dimetyloaminopirydyna (DMAP), 3-hydroksy-3,4-dihydro-4-okso-1,2,3-benzotriazyna (HODhbt), N-hydroksybenzaotriazol (HOBt)) oraz 1-hydroksy-7-azabenzotrazol (HOAt). Każdy z protegowanych aminokwasów jest stosowany w nadmiarze (>2,0 równoważniki) i sprzęganie jest zazwyczaj prowadzone w N-metylopirrolidonie (NMP) lub DMF, CH2Cl2 lub ich mieszaninie. Postępowanie reakcji sprzęgania można monitorować na każdym etapie np. przez reakcję z ninhydryną jak opisano przez Kaiser i wsp., Anal. Biochem. 34:595, 1970.

Po całkowitym złożeniu pożądanego peptydu, peptyd-żywica jest cięty przy użyciu odczynnika z odpowiednimi zmiataczami rodników. Peptydy Fmoc są zazwyczaj cięte i odbezpieczane przez TFA ze zmiataczami rodnikowymi (np. H2O, etanoditiol, fenol oraz tioanizol). Peptydy tBoc są zazwyczaj cięte i odbezpieczane przez płynny HF przez 1-2 godz. w -5 do 0°C, który odcina polipeptyd od żywicy i usuwa większość grup zabezpieczających łańcuchy boczne. Zmiatacze rodnikowe jak anizol, siarczek metylowy p-tiokrezol są zazwyczaj stosowane z ciekłym HF dla ochrony kationów powstających podczas odcinania z alkilowanych i acylowanych reszt aminokwasowych obecnych w polipeptydzie. Grupa formylowa z tryptofanu oraz grupa dinitrofenylowa z histydyny musi być usunięta odpowiednio przez piperydynę i tiofenyl w DMF przed cięciem w HF. Grupę acetamidometylową z cysteiny można usunąć octanem rtęci(II) i alternatywnie jodem, trifluorooctanem talu (III) lub tetrafluoroboranem srebra, który jednocześnie utlenia cysteinę do cystyny. Innymi silnymi kwasami stosowanymi do cięcia peptydu z tBoc oraz odbezpieczania są kwas trifluorometanosulfonowy (TFMSA) oraz trimietylosilylotrifluorooctan (TMSOTf).

Niniejszy wynalazek dodatkowo opisuje różne fuzje z innymi polipeptydami oraz pokrewne multimerowe białka obejmujące jedno lub kilka polipeptydów fuzyjnych. Rozpuszczalne polipeptydy

PL 211 033 B1

BR43x2, TACI czy BCMA można wytwarzać jako fuzje z regionem stałym ciężkiego łańcuch immunoglobuliny, zazwyczaj fragmentem Fc, który zawiera dwie domeny regionu stałego i utracił region zmienny. Sposoby wytwarzania takich fuzji są ujawnione w patencie USA nr 515507 i 5567584. Fuzje takie są zazwyczaj wydzielane jako cząsteczki multimeryczne gdzie części Fc są związana ze sobą poprzez mostki dwusiarczkowe a dwa polipeptydy nie-Ig są ułożone w duże bliskości. Fuzje immunoglobulina-polipeptyd BR43x2 (TACI lub BCMA) można wytwarzać w genetycznie skonstruowanych komórkach dla produkcji różnych multimerycznych analogów BR43x2. Domeny pomocnicze można łączyć w fuzje z polipeptydami BR43x2 (TACI lub BCMA) w celu umieszczania ich w docelowych specyficznych komórkach, tkankach czy makrocząsteczkach. Fuzje można także wytwarzać przy użyciu toksyn jak tu omówiono. W ten sposób polipeptydy lub białka mogą być kierowane do celów terapeutycznych i diagnostycznych. Peptyd BR43x2 może być w fuzji z jedną lub kilkoma cząstkami takimi jak znacznik powinowactwa oraz domena celująca. Fuzje polipeptydowe mogą także obejmować jedno lub więcej miejsc cięcia, w szczególności pomiędzy domenami. Patrz, Tuan i wsp., Connect. Tiss. Res. 34:1-9, 1996. Fuzje tego typu można także zastosować do, przykładowo, oczyszczenia przez powinowactwo pokrewnego liganda z roztworu, jako narzędzia w testach in vitro, do blokowania sygnałów in vitro przez swoiste wymiareczkowanie liganda, do wiązania liganda na powierzchni komórki lub jako antagonistów BR43x2 in vivo poprzez podawanie ich do blokowania stymulacji ligandem. Do użycia w testach, białka fuzyjne można wiązać z nośnikiem poprzez region Fc i używać w testach ELISA.

Rozpuszczalne receptory BR43x2 i fragmenty polipeptydowe mogą być używane do tworzenia białek fuzyjnych ze znacznikami powinowactwa i znacznikami. Rozpuszczalne białka fuzyjne BR43x2 ze znacznikiem powinowactwa stosowane są przykładowo do identyfikacji ligandów BR43x2, jak również agonistów i antagonistów naturalnych ligandów. Stosując wyznakowane, rozpuszczalne BR43x2, można identyfikować komórki wytwarzające ligandy, agonistów czy antagonistów dzięki immunocytometrii i immunohistochemii. Rozpuszczalne białka fuzyjne są przydatne w badaniach rozmieszczenia liganda w tkankach lub specyficznych liniach komórkowych oraz w dostarczaniu informacji na temat działania biologicznego receptora/liganda.

Oczyszczony ligand, agonista czy antagonista białka fuzyjnego BR43x2-Ig dodawany jest do próbki zawierającej ligand, agonistę lub antagonistę w warunkach ułatwiających wiązanie receptorligand (zazwyczaj prawie fizjologiczne temperatura, pH i siła jonowa). Kompleks receptor-ligand jest następnie rozdzielany dzięki mieszaninie z proteiną A, która jest unieruchomiona na stałym nośniku (np. kulki nierozpuszczalnej żywicy). Ligand, agonista lub antagonista jest następnie wypłukiwany przy użyciu tradycyjnych technik chemicznych jak gradient soli czy pH. Alternatywnie białko fuzyjne samo jest związane ze stałym nośnikiem a wiązanie i wypłukiwanie są przeprowadzane jak opisano powyżej. Sposoby unieruchamiania receptora polipeptydowego na stałym nośniku jak kulki agarozy, związana krzyżowo agaroza, szkło, żywice celulozowe, żywice oparte na krzemie, polistyren, związany krzyżowo poliakrylamid oraz materiały podobne, które są stabilne w stosowanych warunkach są znane specjalistom. Sposoby wiązania polipeptydów ze stałymi nośnikami są znane specjalistom i obejmują chemię aminową, aktywację bromocjankiem, aktywację N-hydroksybursztynyloimidem, aktywację epoksydową, aktywację sulfhydrylową oraz aktywację hydrazydową. Uzyskiwane złoża są zazwyczaj pakowane w kolumnach a płyny zawierające ligand są przepuszczane przez kolumnę jeden lub kilka razy, co pozwala na związanie się liganda z polipeptydowym receptorem. Ligand jest następnie wymywany przy użyciu zmiennych stężeń soli, czynników chlotropowych (MnCl2) lub pH, które rozrywają wiązanie ligand-receptor.

Dla uzyskania bezpośredniego eksportu rozpuszczalnego receptora z komórki gospodarza, DNA rozpuszczalnego receptora jest połączony z drugim segmentem DNA kodującym peptyd wydzielniczy, taki jak peptyd wydzielniczy t-PA. Dla ułatwienia oczyszczania domeny wydzielanego receptora na jej końcu N lub C można dodać znacznik powinowactwa lub inny polipeptyd czy białko dla którego jest dostępne przeciwciało czy inny specyficznie wiążący się czynnik.

Komórki wytwarzające rozpuszczalne oraz związane z błoną receptory przedstawione w tym opisie są stosowane w testach przesiewowych. Różne dogodne testy są znane specjalistom. Testy te są oparte na wykrywaniu odpowiedzi biologicznej w komórce docelowej. Zmiana w metabolizmie w porównaniu z wartością kontrolną wskazuje na to, ż e badany związek moduluje metabolizm za pośrednictwem BR43x2. Jednym z takich testów jest test na proliferację komórkową. Komórki hodowane są w obecności i przy braku badanego związku a proliferacja komórkowa jest wykrywana poprzez, przykładowo, pomiar inkorporacji irytowanej tymidyny lub testem kolorymetrycznym opartym

PL 211 033 B1 na metabolicznym rozkładaniu bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983). Alternatywna forma testu wykorzystuje komórki, które są dodatkowo zmienione tak, że wytwarzają gen reporterowy. Gen reporterowy jest połączony z elementem promotorowym, który jest wrażliwy na drogę związana z receptorem i test wykrywa aktywację transkrypcji genu reporterowego. Specjalistom znany jest szereg genów reporterowych, które można z łatwością testować w ekstraktach komórkowych, przykładowo, lacZ z E.coli, transferaza acetylo-chloramfenikolowa (CAT) oraz element odpowiedzi na surowicę (SRE) (patrz, Shaw i wsp., Cell 56:563-72, 1989). Korzystnym genem reporterowym jest gen lucyferazy (de Wet i wsp., Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987). Ekspresja genu lucyferazy wykrywana jest poprzez chemiluminescencję przy użyciu metod znanych specjalistom (np. Baumgartner i wsp., J. Biol. Chem. 269:29094-101, 1994; Schenborn i Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Zestawy do badania aktywności lucyferazy są handlowo dostępne, przykładowo, Promega Corp., Madison, WI. Docelowych linii komórkowych tego typu można użyć do przeszukiwania bibliotek związków, komórkowych podłoży hodowlanych, bulionów grzybowych, próbek ziemi, próbek wody, i podobnych. Przykładowo, komórkowe podłoża hodowlane można badać pod kątem komórek docelowych dla identyfikowania komórek produkujących ligand. Komórki pozytywne są następnie używane do wytworzenia biblioteki cDNA w ssaczym wektorze ekspresyjnym, która jest podzielona na pule, którymi transfekowane są komórki gospodarza, w których zachodzi ekspresja. Próbki podłoża ze stransfekowanych komórek są badane, a następnie dzielone na pule, i ponownie transfekowane, hodowane i ponownie testowane na pozytywne kolonie w celu sklonowania cDNA kodującego ligand.

System testu wykorzystujący wiązanie liganda z receptorem (czy przeciwciałem, jeden z członków pary komplement/antykomplement) lub jego fragment wiążący oraz handlowo dostępne narzędzia biosensorowe (BIAcore™, PharmaciaBiosensor, Piscatway, NJ) można także korzystnie stosować. Receptor, przeciwciało, członek pary komplement/antykomplement lub fragment jest unieruchamiany na powierzchni czipa receptorowego. Użycie takiego narzędzia ujawniono w Karlsson, J. Immunol. Meth. 145:229-40, 1991 oraz Cunningham i Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Przykładowo, polipeptyd BR43x2, fragment, przeciwciało, czy członek pary komplement/antykomplement jest kowalencyjnie przyłączony, za pomocą chemii aminowej lub sulfhydrylowej do włókien dekstranowych, które są przyłączone do złotego filmu w przepływającej komórce. Testowana próbka przechodzi przez komórkę. Jeżeli ligand, epitop, czy przeciwny członek pary komplement/antykomplement jest obecny w próbce, będzie się wiązał odpowiednio z unieruchomionym receptorem, przeciwciałem czy członkiem pary komplement/antykomplement wywołując zmianę w reagującym wskaźniku występującym w podłożu, który jest wykrywany jako zmiana na powierzchni rezonansu plazmonowego złotego filmu. System taki pozwala na określenie gromadzenia i braku, z czego można obliczyć współczynnik powinowactwa wiązania i ocenić stechiometrię wiązania. Wiązanie ligand-receptor polipeptydowy można także wykorzystać w innych systemach znanych specjalistom. Systemy takie obejmują analizę Scatchard dla określania powinowactwa wiązania (patrz, Scatchard Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) oraz testy kolorymetryczne (Cunningham i wsp., Science 253:545-48, 1991; Cunningham i wsp., Science 245:821-25, 1991).

Wykres analizy Scacharda wiązania rozpuszczalnego I¹²⁵-ztnf4 z TACI oraz BCMA przedstawiono na Fig. 2 i porównano ze stałymi wiązania dla innych członków rodziny TNFR w Tabeli 7.

T a b e l a 7

Ligand	Kd M	Źródło komórek	Referencje
1	2	3	4
TNFa wysoki	7,14E-11	HL-60	a
TNFa niski	3,26E-10	HEP-2	a
TNFa wysoki	2,00E-10	HL-60	b
CD27L	3,70E-10	MP-1	c
CD27L	8,30E-09	MP-1	c
CD40L	5,00E-10	EL40,5	d

PL 211 033 B1 cd. tabeli 7

1	2	3	4
CDL40-L	1,00E-09	EBNA	d
(125I-CD40)
4-1BBL	1,16E-09	Biocare	e
Anty 41Bbmab	4,14E-10	Biocare	e
Ztnf4 sol.	1,11E-09	TACI-BHK
Ztnf4 sol.	1,25E-09	BCMA-BHK

a Hohmann i wsp., J. Biol. Chem. 264:14927-34, 1989 a Manna i Aggarwal, J. Biol. Chem. 273: 33333-41, 1998 a Goodwin i wsp., Cell 73:447-56, 1993 d Armitage i wsp., Nature 357:80-82, 1992 e Shuford i wsp., J. Exp. Med. 186:47-55, 1997

Jako receptora, aktywację polipeptydu BR43x2 można mierzyć w oparciu o krzemowy mikrofizjometr biosensorowy, który mierzy poziom zewnątrz komórkowego zakwaszenia lub wydzielanie protonów związane z wiązaniem receptora i następującą zmianę odpowiedzi komórkowej. Przykładowym urządzeniem jest Cytosensor™ Microphysiometr wytwarzany przez Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Metodą tą można mierzyć różne odpowiedzi komórkowe, takie jak proliferacja komórkowa, transport jonów, produkcja energii, odpowiedź zapalna, aktywacja regulatorowa i receptorowa i podobne. Patrz, przykładowo, McConnell i wsp., Science 257:1906-12, 1992; Pitchford i wsp., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli i wsp., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde i wsp., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. Mikrofizjometr można zastosować do badania adherentnych i nieadherentnych komórek eukariotycznych i prokariotycznych. Mierząc zmiany zewnątrz komórkowego zakwaszenia w podłożu komórkowym przez określony czas, mikrofizjometr mierzy bezpośrednio odpowiedzi komórkowe na różne bodźce w tym na działanie agonistów, ligandów czy antagonistów polipeptydu BR43x2. Korzystnie mikrofizjometr jest stosowany do mierzenia odpowiedzi eukariotycznych komórek wytwarzających BR43x2, w porównaniu z kontrolnymi komórkami ekariotycznymi, które nie wytwarzają polipeptydu BR43x2. Komórki eukariotyczne wytwarzające BR43x2 obejmują komórki, do których BR43x2 został wprowadzony poprzez transfekcję, jak opisano powyżej, co stwarza komórki odpowiadające na bodźce modulujące BR43x2 lub komórki naturalnie wytwarzające BR43x2, takie jak komórki wytwarzające BR43x2 pochodzące z tkanki śledziony. Różnice mierzone na podstawie zmiany w zakwaszeniu zewnątrzkomórkowym, przykładowo, wzrost czy zmniejszenie odpowiedzi komórek wytwarzających BR43x2, w porównaniu z kontrolą, są bezpośrednimi miarami odpowiedzi komórkowych modulowanych przez BR43x2. Ponadto, takie odpowiedzi modulowane przez BR43x2 można testować wobec różnych bodźców. Także, dzięki użyciu mikrofizjometra, dostarczana jest metoda identyfikowania agonistów i antagonistów polipeptydu BR43x2, obejmująca dostarczenie komórek wytwarzających polipepty BR43x2, hodowanie pierwszej porcji komórek przy braku testowanego związku, hodowanie drugiej porcji komórek w obecności badanego związku oraz wykrywanie zmian, przykładowo, w zwiększeniu lub zmniejszeniu odpowiedzi komórkowej dla drugiej porcji komórek w porównaniu z pierwszą porcją komórek. Zmiany w odpowiedzi komórkowej pokazywane są jako mierzony poziom zmiany zewnątrz komórkowego zakwaszenia. Przy użyciu tej metody można szybko identyfikować agonistów i antagonistów polipeptydu BR43x2.

Rozpuszczalny BR43x2 jest przydatny w badaniu rozmieszczenia ligandów w tkankach lub specyficznych ligandów komórkowych, w celu zbadania biologicznego działania receptora/liganda. Można także zastosować do badania specyficzności receptorów TNF pod względem ligandów jako mechanizmu poprzez który niszczony jest cel komórkowy dla liganda. Przykładowo, związek toksyczny można sprzęgać z rozpuszczalnymi receptorem BR43x2 lub fuzją BR43x2, Przykłady związków toksycznych będą obejmowały radiofarmaceutyki, które inaktywują docelowe komórki; czynniki chemoterapeutyczne jak doksorubicyna, daunorubicyna, metotreksat oraz cytoksan; toksyny takie jak rycyna, dyfteria, egzotoksyna A z Pseudomonas oraz abrina a także przeciwciała przeciwko cząsteczkom cytotoksycznych limfocytów T.

PL 211 033 B1

Wykazano, za pomocą analizy FACS (Flow Cytometry and Sorting, Melamed i wsp., wyd. Wiley-Liss, 1990 oraz Immunofluorescence and Cell Sorting, Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Coligan i wsp., wyd John Wiley & Son, 1997), że ztnf4 (5ng/ml) wiąże się z BR43x2 (SEQ ID NO:2), TACI (SEQ ID NO: 6), BCMA (SEQ ID NO: 8) oraz BR43x1 (SEQ ID NO:9). Przy użyciu analizy FACS wykazano, że wyznakowany FITC, rozpuszczalny ztnf4 także wiąże swoiście, pośród innych rzeczy, limfocyty B w PBMNC, komórki migdałkowe, komórki linii chłoniaka z limfocytów B (Raji, Burkitt's human lymphoma ATCC CCL86), Ramos (Burkitt's lymphoma cell line ATCC CRL-1596), Daudi (Burkitt's human lymphoma ATCC CCL-156) oraz RPMI 1788 (B lymphocyte cell line ATCC CCL-156). Nie wykazano wiązania z HL-60 (ATCC protomyelocytic cell line, ATCC CCL-240). Swoistość wiązania do komórek B z PBMNC i komórek migdałkowych potwierdzono poprzez współbarwienie przeciwciałami dla cząsteczek swoistych dla limfocytów B w tym CD19, IgD, IgM oraz CD20. Podobieństwo ztnf4 do CD40L sugeruje szersze rozmieszczenie w tkankach niż to obserwowano. Badano powinowactwo ztnf4 do monocytów, komórek dendrytycznych oraz oczyszczonych limfocytów T przy użyciu testów z proliferacją cytokininową oraz proliferacja limfocytów T, przykładowo, i nie wykryto wiązania ztnf4 ani innego biologicznego wpływu na inne typy testowanych komórek. Zatem, swoistość limfocytów B dla liganda i receptora sugeruje, że są one przydatne do badania i leczenia chorób autoimmunologicznych, nowotworów limfocytów B, immunomodulacyjnych, IBD oraz innych zaburzeń związanych z przeciwciałami, np. ITCP, miastenia ciężka i podobnych, chorób nerek, niebezpośredniej odpowiedzi immunologicznej limfocytów T, odrzucaniu przeszczepu, reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi.

Wykazano, że ztnf4 aktywuje limfocyty B w wyniku czego następuje proliferacja limfocytów B, produkcja przeciwciał i podniesienie regulacji aktywującej markery in vitro (patrz przykłady poniżej). Zmiany te mogą wymagać ko-stymulacji poprzez IL-4 lub inne cytokininy czy stymulacji poprzez receptor antygenowy limfocytów B lub innych receptorów powierzchniowych komórki, które aktywują limfocyty B tzn. CD40. Inne ligandy nekrotycznego czynnika nowotworowego, takie jak gp39 i TNFe także mogą stymulować proliferację limfocytów B. Zatem polipeptydy te mogą być celami dla swoiście regulowanych odpowiedzi limfocytów B, hamując aktywowane limfocyty B, podczas odpowiedzi immunologicznej, bez zaburzania populacji innych komórek co jest korzystne w leczeniu. Dodatkowo, polipeptydy te można stosować do modulowania rozwoju limfocytów B, rozwoju innych komórek, produkcji przeciwciał oraz produkcji cytokinin. Polipeptydy BR43x2 można także z powodzeniem zastosować w indukowaniu apoptozy i/lub anergii komórek. Polipeptydy opisane w wynalazku mogą także modulować komunikację limfocytów B i T poprzez neutralizowanie skutków proliferacji wywołanych przez ztnf4. Testy biologiczne oraz ELISA są przydatne w mierzeniu odpowiedzi komórkowej na ztn4 w obecności rozpuszczalnego BR43x2, TACI i/lub BCMA. Inne testy obejmują te, które mierzą zmiany produkcji cytokin jako miarę odpowiedzi komórkowej (patrz przykładowo. Current Protocols in Immunology, wyd. John E. Coilgan i wsp., NIH, 1996). Testy mierzące inne odpowiedzi komórkowe obejmują izotypowanie przeciwciał, aktywację monocytów, tworzenie komórek NK, komórkową prezentacje antygenu, apotozę.

Polipeptydy BR43x2 będą przydatne w neutralizowaniu efektów ztn4 w leczeniu białaczek limfatycznych z komórkami pre-B lub B, takich jak białaczka plazmocytowa, białaczka limfatyczna przewlekła i ostra, szpiczaków jak szpiczak mnogi, szpiczak plazmocytowy, mięsak Ewinga, guz olbrzymiokomórkowy kości oraz chłoniaków takich jak chłoniak nieziarniczy, z którymi jest związany wzrost ilości polipeptydów ztnf4. Rozpuszczalny BR43x2 będzie przydatnym składnikiem w stosowaniu terapii hamującej rozwój nowotworu oraz i pozwalającej na przeżycie. Analiza typu Northern wykazała, że ztnf4 jest wytwarzany w komórkach CD8⁺, monocytach, dendrocytach, aktywowanych monocytach. Sugeruje to, że w niektórych chorobach autoimmunologicznych limfocyty cytotoksyczne T mogą stymulować produkcję limfocytów B poprzez nadmierną produkcję ztnf4. Białka immunosupresorowe, które selektywnie blokują działanie limfocytów B będą przydatne w leczeniu. Produkcja autoprzeciwciał jest powszechna w wielu chorobach autoimmunologicznych i przyczynia się do rozmieszczenia tkankowego oraz zaostrzenia choroby. Autoprzeciwciała mogą także prowadzić do wystąpienia komplikacji związanych z odkładaniem kompleksu immunologicznego i prowadzić do wielu objawów układowego toczenia rumieniowatego, włączając niewydolność nerek, objawy neuralgiczne i śmierć. Modulowanie produkcji przeciwciał niezależnie od odpowiedzi komórkowej będzie także korzystne w innych stanach chorobowych. Wykazano także, że limfocyty B odgrywają rolę w wydzielaniu immunoglobulin w zapaleniu stawów reumatoidalnym (Korganow i wsp., Immunity 10:451-61, 1999). Zatem zahamowanie produkcji przeciwciał wywołanej przez ztnf4 będzie korzystne w leczeniu chorób

PL 211 033 B1 autoimmunologicznych takich jak ciężka miastenia i reumatoidalne zapalenie stawów. W tym celu będą przydatne terapeutyki immunosupresyjne takie jak rozpuszczalny BR43x2, które selektywnie blokują lub neutralizują działanie limfocytów B. Dla zweryfikowania tych zdolności rozpuszczalnego receptora polipeptydowego BR43x2 według zastosowania według niniejszego wynalazku peptydy BR43x2 są badane przy użyciu opisanych w opisie testów znanych specjalistom.

Wynalazek dostarcza sposobów wykorzystania polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA, ich fuzji, przeciwciał agonistów oraz antagonistów w selektywnym blokowaniu lub neutralizowaniu działania limfocytów B związanych z końcowym stadium niewydolności nerek, które mogą lecz nie muszą być związane z chorobami autoimmunologicznymi. Sposoby takie będą także przydatne w leczeniu immunologicznych niewydolności nerek, oraz w leczeniu zapalenia kłębuszków nerkowych związanego z chorobami takimi jak nefropatia membranowa, nefropatia IgA czy choroba Berger'a, nefropatia IgM, choroba Goodpasture'a, poinfekcyjne zapalenie kłębuszków nerkowych, nefropatia z rozrostem mezangium, nefropatia z minimalnymi zmianami. Metody takie można także zastosować w leczeniu wtórnego zapalenia kłębuszków nerkowych czy zapaleniu naczyń związanych z toczniem, zapaleniu wielu tętnic, choroby Henoch-Schonlein'a, twardziny skóry, chorób pokrewnych HIV, skrobiawicy czy zespołu hemolityczno-mocznicowego. Sposoby te mogą być także przydatne jako część stosowanej terapii przy leczeniu śródmiąższowego zapalenia nerek czy zapalenia miedniczek nerkowych związanych z przewlekłą chorobą miedniczek nerkowych, nadu ż ywaniem leków przeciwbólowych, wapnicą nerek, zapalenia nerek wywołanego innymi czynnikami, kamicy nerkowej czy przewlekłego lub ostrego zapalenia śródmiąższowego miedniczek nerkowych.

Metody te obejmują także użycie polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA, fuzji, przeciwciał, agonistów czy antagonistów w leczeniu chorób naczyń nadwrażliwych i rozległych, włączając zwężenie tętnicy nerkowej czy złogowe czy cholesterolowe czopy zatorowe czy nerkowe czopy zatorowe.

Niniejszy wynalazek umożliwia także wdrożenie sposobów diagnozowania i leczenia nowotworów nerkowych i urologicznych, szpiczaków mnogich, chłoniaków, neuropatii lekkiego łańcucha łub skrobiawicy.

Niniejszy wynalazek dostarcza także metod blokowania i hamowania aktywowanych limfocytów B przy użyciu polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA, fuzji, przeciwciał, agonistów i antagonistów w leczeniu astmy i innych przewlekłych chorób dróg oddechowych jak zapalenie oskrzeli i rozedma płuc.

Dostarczane są także sposoby hamowania lub neutralizowania odpowiedzi efektorowych limfocytów T przy użyciu polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA, fuzji, przeciwciał, agonistów i antagonistów w zastosowaniu immunosupresji, w szczególności w leczeniu reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi i przy odrzucaniu przeszczepu. Dodatkowe zastosowanie można znaleźć przy regulacji odpowiedzi immunologicznej w szczególności w aktywacji i regulacji limfocytów. Polipeptydy BR43x2, TACI czy BCMA, fuzje, przeciwciała, agoniści i antagoniści będą przydatni w leczeniu niedoborów immunologicznych. Polipeptydy BR43x2, TACI czy BCMA, fuzje, przeciwciała, agoniści i antagoniści będą przydatni w leczeniu takich chorób autoimmunologicznych jak cukrzyca insulinozależna (IDDM) lub choroba Crohn'a. Sposoby te będą miały dodatkową wartość terapeutyczną w leczeniu przewlekłych chorób zapalnych, w szczególności związanych z bólem stawowym, obrzękiem, anemią jak również wstrząsem septycznym.

Wpływ rozpuszczalnych polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA oraz białek fuzyjnych na odpowiedź immunologiczną można mierzyć przez podanie polipeptydów opisanych w niniejszym wynalazku zwierzętom immunizowanym antygenem po podaniu ztnf4 oraz mierzenie produkcji izotypowej przeciwciał oraz odpowiedzi limfocytów B i T włączając reakcję opóźnionej nadwrażliwości i proliferację in vitro oraz produkcję cytokinin.

Niniejszy wynalazek pozwala na hamowanie aktywności ztnf4 w ssakach, które to hamowanie jest wynikiem podawania ssakom porcji związku wyselekcjonowanego z grupy składającej się z a) polipeptydu z SEQ ID NO: 4; b) polipeptydu z SEQ ID NO: 8; c) biał ka fuzyjnego; d) polipeptydu z SEQ ID NO: 6 od reszty aminokwasowej 1 do reszty 166; e) polipeptydu z SEQ ID NO:8 od reszty aminokwasowej 1 do reszty 150; f) przeciwciała lub fragmentu przeciwciała swoiście wiążącego się z polipeptydem o SEQ ID NO:4 oraz g) przeciwciał a lub fragmentu przeciwciała swoiście wiążącego się z polipeptydem o SEQ ID NO:10. Przykłady białek fuzyjnych obejmują fuzje rozpuszczalnego BR43x2 (SEQ ID NO:4), TACI (od reszty aminokwasowej 1 do reszty 166 z SEQ ID NO: 6) lub BCMA (od reszty aminokwasowej 1 do reszty 150 z SEQ ID NO: 8) z innym polipeptydem, korzystnie fragmentem Fc

PL 211 033 B1 regionu stałego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. Wynalazek dostarcza podobnie sposobu hamowania kompleksów receptor BR43x21 TACI czy BCMA -ligand.

Metody takie będą szczególnie korzystne tam1 gdzie aktywność ztnf4 jest związana z aktywowanymi limfocytami B oraz w leczeniu nowotworów limfocytów pre-B i B. Metody takie będą też przydatne tam1 gdzie aktywność ztnf4 jest związana z produkcją przeciwciał. W szczególności przy produkcji przeciwciał związanej z chorobami autoimmunologicznymi jak układowy toczeń rumieniowaty1 ciężka miastenia czy reumatoidalne zapalenie stawów.

Niniejszy wynalazek dostarcza także agonistów i antagonistów BR43x2. Związki zidentyfikowane jako antagoniści BR43x2 są przydatne w modyfikowaniu proliferacji i rozwoju komórek docelowych in vitro i in vivo. Przykładowo1 związki agonistyczne są przydatne same lub w kombinacji z innymi cytokininami i hormonami jako składniki zdefiniowanych podłoży hodowlanych dla komórek. Agoniści są zatem przydatni w specyficznym pośredniczeniu we wzroście i/lub rozwoju w hodowli limfocytów B niosących BR43x2. Agoniści i antagoniści mogą także okazać się przydatni w badaniach wpływu na funkcjonowanie limfocytów B1 w szczególności aktywacji i różnicowania limfocytów B. Antagoniści są również przydatni jako czynniki w charakteryzowaniu interakcji ligand-receptor.

Składniki zidentyfikowane jako antagoniści BR43x2 są także przydatne w zwiększaniu humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedzi limfocytów B są ważne w walce z chorobami zakaźnymi włączając zakażenia bakteryjne1 wirusowe1 wywołane protozoa czy pasożytami. Przeciwciała przeciwko mikroorganizmom zakaźnym mogą unieruchamiać patogen poprzez wiązanie z antygenem a następnie jest on rozkładany w procesie lizy za pośrednictwem dopełniacza lub ataku komórek pośredniczących. Antagonista BR43x2 może dawać zwiększona odpowiedź humoralną i może być przydatnym lekarstwem u osobników z podwyższonym ryzykiem zachorowania na chorobę zakaźną lub może służyć jako uzupełnienie szczepionki.

Niniejszy wynalazek dostarcza także antagonistów1 którzy albo wiążą się z polipeptydami

BR43x2 albo1 alternatywnie1 z ligandami z którymi wiążą się polipeptydy BR43x21 powodując tym samym hamowanie lub eliminowanie funkcji BR43x2. Do wymienionych antagonistów BR43x2 należą: przeciwciała; oligonukleotydy1 które wiążą się zarówno do polipeptydu BR43x2 jak i jego ligandów1 naturalne lub sztuczne analogi ligandów BR43x21 które mają zdolność wiązania się z receptorem1 ale nie zachowują zdolności do przekazywania sygnału za pomocą ligandu i receptora. Takimi analogami mogą być polipeptydy lub związki peptydo-podobne. Naturalne lub sztuczne związki mające zdolność wiązania polipeptydów BR43x2 i uniemożliwiania przekazywania sygnału nazywa się antagonistami.

Takie związki antagonistyczne mogą być użyteczne jako leki przy leczeniu chorób1 w których zarówno blokowanie receptora jak i ligandu będzie miało znaczenie. Antagoniści mogą być użyteczni jako związki używane przy charakteryzowaniu oddziaływań ligand-receptor. BR43x2 jest wyrażany przez transformowane linie komórek B1 włączając te indukowane EBV jak1 spontaniczne chłoniaki Burkitta oraz kilka nowotworów komórek B. Blokowanie funkcji BR43x2 może być użyteczne w leczeniu chłoniaków i nowotworów komórek B. Antagoniści BR43x21 tacy jak rozpuszczalne receptory BR43x2 lub przeciwciała mogą być używane w leczeniu progresji nowotworowej.

Aktywność antagonistów i agonistów może być wyznaczana w testach badających aktywność1 które wykrywają możliwości wiązania receptor/ligand. Wytworzono stabilnie transfekowane linie komórek B wyrażające BR43x21 takie jak Baf3 (mysia linia komórek pre-B Palacios i Steinmetz1 i MatheyPrevot i wsp.)1 które jednocześnie wyrażają na wysokim poziomie konstrukt z genem reporterowym (NfKB1 NFAT-1 i AP-1. W podobny sposób w komórkach Jurkat i innych liniach chłoniaków komórek B wytworzono linie wyrażającej TACI i BCMA. Wykazano1 że Ztnf4 brał udział w przekazywaniu sygnału w przypadku wymienionych konstruktów z genem reporterowym. Rozpuszczalny BR43x2 i przeciwciała mogą być używane przy badaniu wiązania.

W badaniach białek in vivo wykorzystuje wirusowe systemy dostarczania genów. Przykładowe wirusy wykorzystywane do tego celu to: adenowirusy1 wirusy typu herpes1 wirusy ospy i wirusy związane z adenowirusami (AAV). Adenowirusy1 zawierające dwuniciowe DNA1 są obecnie najintensywniej badanymi wektorami do przenoszenia heterologicznych kwasów nukleinowych (patrz Becker i wsp.1

Meth. Cell Biol. 43:161-891 1994 i Douglas i Curiel1 Science & Medicine 4; 44-531 1997). Systemy adenowirusowe mają wiele zalet1 adenowirusy są zdolne do: (i) włączania stosunkowo dużych fragmentów DNA1 (ii) wzrostu do wysokich mian1 (iii) infekowania różnych typów komórek ssaczych1 (iv) mogą być wykorzystywane z dużą liczbą dostępnych wektorów1 zawierających różne promotory. Jednocześnie1 zaletą jest ich stabilność w układzie krążenia - mogą być podawane poprzez wstrzyknięcie dożylne.

PL 211 033 B1

Poprzez usunięcie fragmentu genomu adenowirusowego, mogą być wstawiane duże fragmenty (do 7 kb) heterologicznego DNA. Te fragmenty mogą być włączane do DNA wirusowego, poprzez ligację lub rekombinację homologiczną z ko-transfekowanym plazmidem. W przykładowym systemie, z wektora wirusowego usunięto gen E1, zatem wirus nie jest zdolny do replikacji, gdy gen E1 nie jest dostarczony przez komórkę gospodarza (przykładowo, ludzka linia komórkowa 293). Przy dostarczaniu adenowirusów do żywych zwierząt, pierwotnie kierują się one do wątroby. W adenowirusowym systemie dostarczania genów, w którym brak jest genu E1, wirus nie może się namnażać w komórkach gospodarza. Jednakże, tkanka gospodarza (np. wątroba) będzie wyrażać i obrabiać (przy obecności odpowiedniej sekwencji sygnałowej - wydzielać) białko heterologiczne. Wydzielane białka mogą dostawać się do krwioobiegu w unaczynionej wątrobie, zatem jego wpływ na infekowane zwierze może być badany.

Systemy adenowirusowe mogą być również wykorzystywane do produkcji białek in vitro. Poprzez hodowle komórek zinfekowanych adenowirusem (nie 293) w warunkach uniemożliwiających szybkie podziały, komórki produkują białko przez wydłużony okres czasu. Przykładowo, komórki BHK mogą być hodowane do osiągnięcia stanu zlewania się, a później eksponowane na wektor adenowirusowy kodujący odpowiednie białko. Następnie komórki są hodowane przy braku surowicy, co pozwala zainfekowanym komórkom przeżycie kilku tygodni bez znaczących podziałów komórkowych. Jednocześnie, infekowane wektorem adenowirusowym komórki 293S mogą rosnąć w hodowli zawiesionowej, przy wysokiej gęstości, tak aby produkować znaczące ilości białka (patrz Garnier i wsp., Cytotechnol. 15:145-55, 1994). Wyrażane, wydzielane białko heterologiczne może być w sposób powtarzalny izolowane z supernatantu takiej hodowli. W ramach tego samego protokołu (z komórkami 293S) białka, które nie są wydzielane również mogą być wydajnie otrzymywane.

Dobrze znane modele zwierzęce mogą być wykorzystywane w celu badania in vivo skuteczności rozpuszczalnych polipeptydów BR43x2, TACI i BCMA opisywanego wynalazku w określonych stanach chorobowych. W szczególności, rozpuszczalne polipeptydy i fragmenty polipeptydów BR43x2, TACI i BCMA mogą być badane in vivo w wielu modelach zwierzęcych chorób autoimmunologicznych takich, jak MRL-1pr/1pr lub NZB x NZW F1 szczepach myszy, które służą jako model SLE. Takie modele zwierzęce są znane w tej dziedzinie, dla przykładu Autoimmune Disease Models A Gudebook, Cohen i Miller wyd. Academic Press. W potomstwie krzyżówki pomiędzy myszami New Zealand Black (NZB) i New Zealand White (NZW) można zaobserwować rozwój spontanicznej formy SLE, która przypomina SLE u ludzi. W potomstwie tych myszy, nazywanym NZBW, wytwarzane są autoprzeciwciała IgM przeciw komórkom T w wieku 1 miesiąca, anty-DNA przeciwciała Ig w wieku 5-7 miesięcy są dominującymi immunoglobulinami. Nadaktywność poliklonalnych komórek T powoduje nadprodukcję autoprzeciwciał. Odkładanie się tych przeciwciał, w szczególności tych skierowanych przeciw jednoniciowemu DNA, jest związane z rozwojem glumerulonephritis, które klinicznie objawia się jako białkomocz, azotemia i śmierć w wyniku niewydolności nerek. Niewydolność nerek jest bezpośrednią przyczyną śmierci myszy ze spontanicznym SLE i, w przypadku szczepów NZBW, proces ten jest chroniczny i cechuje się niedrożnością. Ta choroba jest szybciej postępująca i cięższa u samic, w porównaniu z samcami. W przypadku samic, średnia długość życia to tylko 245 dni, podczas gdy u samców wynosi ona 406 dni. Wiele samic myszy wykazuje symptomy choroby (białkomocz) w wieku 7-9 miesięcy, jednocześnie niektóre z nich mogą być o wiele młodsze lub starsze w momencie pojawienia się symptomów. Płodowe immunologiczne zapalenie nerek u myszy NZBW jest bardzo podobne do glomerulonephritis obserwowanego w przypadku ludzkiego SLE, przez to spontaniczny mysi model może być niezwykle użyteczny w badaniu potencjalnych leków na SLE (Putterman i Naparstek, Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus, Autoimmune Disease Models: A Guidebook, rozdz. 14, str. 217-34, 1994, Mohan i wsp., J. Immunol. 159:3104-08, 1997). Podanie tym myszom rozpuszczalnego TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig lub innych rozpuszczalnych lub fuzyjnych białek w celu zbadania zdolności TACI, BR43x2 i BCMA do poprawy symptomów lub zmiany przebiegu choroby, jest opisane w przykładach.

Mysie modele eksperymentalnego EAE użyto jako narzędzia przy badaniu zarówno mechanizmów chorób imnunologicznych, jak i metod leczenia. Model przypomina ludzkie stwardnienie rozsiane, powoduje demielinizację, jako wynik aktywacji komórek T przeciw neuroproteinom takim, jak MBP lub PLP. Inokulacja z antygenem prowadzi do indukcji CD4+, komórek T MHC klasy II. Zmiany w protokole mogą powodować ostre, chroniczne-powracające, lub bierne warianty modelu (Weinberg i wsp., J, Immunol. 162:1818-26, 1999; Mijaba i wsp., Cell. Immunol. 186:94-102, 1999; i Glabinski, Meth. Enzym, 288:182-90, 1997). Podanie rozpuszczalnego TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig lub innych

PL 211 033 B1 rozpuszczalnych lub fuzyjnych białek w celu zbadania zdolności TACI, BR43x2 i BCMA do poprawy symptomów lub zmiany przebiegu choroby, jest opisane w przykładach.

W modelu CIA, u myszy występuje chroniczne zapalenie stawów, które przypomina ludzkie reumatyczne zapalenie stawów (RA). Z uwagi na fakt, że CIA ma podobne do RA cechy immunologiczne i patologiczne, taki model jest dobry przy wyszukiwaniu ludzkich związków przeciwzapaleniowych. Inną zalecą użycia modelu CIA jest fakt, że mechanizm patogenezy jest znany. Zidentyfikowano epitopy komórek T i B na kolagenie typu II oraz różne immunologiczne (opóźniona nadwrażliwość i przeciwciała anty-kolagen) i zapaleniowe (cytokiny, chemokiny i enzymy) parametry związane z zapaleniem stawów, które mogą być używane w badaniu skuteczności związku w danym modelu (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams i wsp., Immunol. 89: 9784-788, 1992; Myers i wsp, life Sci. 61:1861-78, 1997; i Wang i wsp., Immunol. 92:895-959, 1995). Podanie tym myszom rozpuszczalnego TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig lub innych rozpuszczalnych lub fuzyjnych białek w celu zbadania zdolności TACI, BR43x2 i BCMA do poprawy symptomów lub zmiany przebiegu choroby, jest opisane w przykładach.

Modele infekcji oskrzelowych, takich jak astma, mogą być wytwarzane poprzez iniekcję myszy owalbuminą oraz stymulację nosową antygenem powodującym odpowiedź asomatyczną w oskrzelach, podobną do astmy. Podanie tym myszom rozpuszczalnego TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig lub innych rozpuszczalnych lub fuzyjnych białek w celu zbadania zdolności TACI, BR43x2 i BCMA do poprawy symptomów lub zmiany przebiegu choroby, jest opisane w przykładach.

Innym zastosowaniem, modeli in vivo jest prowokacja antygenem zwierząt, po które] następuje podanie rozpuszczalnego BR43x2 (TACI) lub jego ligandu ztnt4 oraz mierzenie odpowiedzi komórek T i B.

Odpowiedź zależna i niezależna od komórek T może byó mierzona tak jak opisano w Perez-Melgosa i wsp., J. Immunol. 163:1123-7, 1999.

Odpowiedź immunologiczna u zwierząt poddanych prowokacji antygenem, (przykładowo owalbumina lub kolagen), po której podawano polipeptydy BR43x2, TACI i BCMA, lub rozpuszczalne fuzje z Ig może być wykorzystywana w celu zmierzenia wpływu na odpowiedź komórek B.

Badania farmakokinetyczne mogą być używane razem z wyznakowanymi radioaktywnie rozpuszczalnymi polipeptydami BR43x2, TACI i BCMA lub fuzjami, w celu ustalenia rozmieszczenia i pół rozpadu tych polipeptydów in vivo.

Dostarczono również sposób wykorzystania polipeptydów BR43x2, TACI i BCMA jako markerów zastępczych w chorobach autoimmunologicznych, chorobach nerek i chorobach związanych z komórkami B i T. Tacy pacjenci mogą być skrwawiani, po czym rozpuszczalne receptory BR43x2, TACI i BCMA oraz ich ligandy mogą być wykrywane w krwi.

Wynalazek dostarcza również przeciwciała. Przeciwciała przeciw BR43x2 lub peptydom o sekwencji aminokwasów Seq Id No: 8, mogą być otrzymane przykładowo, przy zastosowaniu produktu ekspresji wektora zawierającego sekwencję kodującą odpowiedni polipetyd, lub polipetyd wyizolowany z naturalnego źródła, jako antygenu. Szczególnie użyteczne przeciwciała wiążą specyficznie BR43x2 lub peptydy mające sekwencje aminokwasów SEQ ID No: 10. Przeciwciała uważano za wiążące specyficznie, jeżeli wiążą polipeptyd BR43x2 lub polipeptyd o SEQ ID No: 8, peptyd lub epitop z powinowactwem (Ka) 10⁶M^-1 lub wyższym, korzystnie 10⁷M^-1 lub wyższym, bardziej korzystnie 10⁸M¹ lub wyższym, a najbardziej korzystnie 10⁹M^-1 lub wyższym. Powinowactwo przeciwciała może być określone przez biegłego w danej dziedzinie, na przykład w analizie Scatchard, (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949). Do odpowiednich przeciwciał należą te, które wiążą BR43x2, w szczególności domenę pozakomórkową (pozycje aminokwasów 1-120 na SEQ ID No: 2) i te, które wiążą polipetydy mające sekwencje aminokwasów SEQ ID NO: 10.

Przeciwciała anty-BR43x2 mogą być wytwarzane przy wykorzystaniu zawierających epitopy antygenowych peptydów i polipeptydów BR43x2. Zawierające epitopy antygenowe peptydy i polipeptydy niniejszego wynalazku, zawierają przynajmniej 9, a korzystnie pomiędzy 15 a 30 aminokwasów z SEQ ID MO: 2. Jednakże, peptydy i polipeptydy zawierające dłuższy fragment sekwencji aminokwasowej wynalazku (od 30 do 50 aminokwasów) lub dowolnej długości fragmentu włączając pełną sekwencję aminokwasową polipeptydu niniejszego wynalazku, mogą być wykorzystywane w indukcji przeciwciał wiążących BR43x2. Pożądane jest, żeby sekwencja aminokwasowa peptydu zawierającego epitop była wybrana w taki sposób, aby umożliwiać odpowiednią rozpuszczalność w rozpuszczalnikach wodnych (tj. sekwencja powinna zawierać względnie hydrofilowe aminokwasy, podczas gdy hydrofobowe powinny być unikane). Hydrofilowe peptydy mogą być zaprojektowane przez specjalistę

PL 211 033 B1 w danej dziedzinie z wykresu hydrofobowości, dla przykładu patrz Hopp i Woods (Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-8, 1981; oraz Kyte i Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105-142, 1982). Ponadto, sekwencje aminokwasowe bogate w prolinę mogą być pożądane do wytwarzania przeciwciał.

Przeciwciała poliklonalne do zrekombinowanego białka BR43x2 lub BR43x2 wyizolowanego ze źródeł naturalnych mogą być przygotowane przy zastosowaniu metod dobrze znanych specjalistom w danej dziedzinie, dla przykładu patrz Green i wsp. „Production of Policlonal Antisera” w Immunochemical Protocols (wyd. Manson), strony 1-5 (Humama Press 1992; oraz Williams i wsp. „Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid and vectors and purification of specific polyclonal antibodies” w DNA Cloning 2: Expression Systems. Wyd 2, Glover i wsp. (wyd.), str. 15 (Oxford University Press 1995). Imumunogeniczność polipeptydu BR43x2 może być zwiększona poprzez zastosowanie adjuwanta, takiego jak ałun oraz kompletnego lub niekompletnego adjuwanta Freunda. Polipeptydy użyteczne przy immunizacji zawierają polipeptydy fuzyjne takie jak fuzje BR43x2 lub jego fragmentu z polipeptydami immunoglobin lub białkiem wiążącym maltozę. Immunogen polipeptydowy może być cząsteczką pełnej długości lub jej fragmentem. Jeżeli fragment polipeptydu jest heptenopodobny, taki fragment może być połączony z nośnikiem makromolekularnym (takim jak KLH, BSA lub TT) do immunizacji.

Pomimo, że przeciwciała poliklonalne normalnie są wytwarzane w zwierzętach takich jak konie, krowy, psy, kurczaki, szczury, myszy, króliki, chomiki, świnki morskie, kozy lub owce, przeciwciało anty-BR43x2 niniejszego wynalazku może również być pochodną pierwotnego przeciwciała ludzkiego. Znane są techniki wytwarzania przeciwciał użytecznych diagnostycznie i terapeutycznie w pawianach, np., Goldenberg i wsp., international patent publication No. WO 91/11465, i Losman i wsp., Int. J. Gancer 46:310, 1990. Przeciwciała mogą być również wytwarzane w transgenicznych owcach, krowach, kozach i świniach, i mogą być wyrażane w zmodyfikowanych formach w drożdżach i grzybach, jak również w ssaczych i owadzich komórkach.

Jednocześnie, mogą być wytworzone monoklonalne przeciwciała anty-BR43x2. Monoklonalne przeciwciała do specyficznych antygenów mogą być otrzymane przez specjalistów w danej dziedzinie (patrz, np., Kohler i wsp., Nature 256:495, 1975, Coligan i wsp., (wyd.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, strony 2.5 1-2.6.7 (John Wiley i Sons 1991), Picksley i wsp., „Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli” in DNA Cloing 2; Expression Systems, 2nd Edition, Cover i wsp., (wyd.) strona 93 (Oxford University Press 1995).

W skrócie, przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymywane poprzez iniekcje myszy kompozycją zawierającą produkt genu BR43x2, sprawdzenie obecności przeciwciała w surowicy, wyizolowanie śledziony w celu otrzymania limfocytów B, fuzję limfocytów B komórkami nowotworowymi w celu otrzymania hybrydom, klonowanie hybrydom, selekcję pozytywnych klonów, które produkują przeciwciała przeciw antygenowi i izolację przeciwciał z kultur hybrydom.

Dodatkowo, przeciwciała anty-BR43x2 niniejszego wynalazku mogą być otrzymane z ludzkich przeciwciał monoklonalnych. Ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymywane z myszy transgenicznej, zinżynierowanej, tak by wytwarzać ludzkie specyficzne przeciwciała w odpowiedzi na prowokację antygenową. W tej technice fragmenty ludzkiego locus ciężkiego i lekkiego łańcucha są wprowadzane do szczepów myszy, pochodzących z linii komórek macierzystych, w których poddano delecji endogenne loci ciężkiego i lekkiego łańcucha. Takie transgeniczne myszy mogą produkować ludzkie przeciwciała specyficzne względem, ludzkich antygenów i myszy te mogą być wykorzystywane do wytwarzania hybrydom produkujących ludzkie przeciwciała. Metody otrzymywania ludzkich przeciwciał z myszy transgenicznych są opisane np. w Green i wsp., Nat. Genet. 7:13, 1994, Longerg i wsp., Nature 368:856, 1994, i Taylor i wsp., Int. Immun. 6:579, 1994.

Przeciwciała monoklonalne mogą być wyizolowane i oczyszczone z hodowli hybrydom przy wykorzystaniu wielu dobrze znanych technik. Do technik tych należą chromatografia powinowactwa z białkiem A, chromatografię wielkościową, chromatografię jonowymienną (patrz np., Coligan strony 2.7.1-2.7.12 i strony 2.9.1-2.9.3; Baines i wsp., „Purification of Immunoglobulin G (IgG)” in Methods in Molecular Biology, Vo. 10, strony 79-104 (The Humana Press, Inc 1992).

W szczególnych przypadkach, może być pożądane przygotowanie fragmentów przeciwciał anty-BR43x2. Takie fragmenty przeciwciał mogą być otrzymane poprzez proteolityczną hydrolizę przeciwciała. Fragmenty przeciwciał mogą być otrzymane przez trawienie pepsyną lub papaina całego przeciwciała konwencjonalnymi metodami. Przykładowo, fragment przeciwciała może być otrzymywany poprzez enzymatyczne cięcie przeciwciał pepsyną w celu otrzymania fragmentów 5S oznaczonych jako F(ab')2. Taki fragment może być dalej cięty czynnikiem redukującym grupy tiolowe, w celu

PL 211 033 B1 otrzymania monowalencyjnych fragmentów 315S Fab'. W razie potrzeby1 cięcie może być przeprowadzane przy wykorzystaniu grup blokujących grupy siarkowe1 w wyniku czego dochodzi do przerwania mostków dwusiarczkowych. Dodatkowo1 cięcie enzymatyczne pepsyną generuje dwa monowalencyjne fragmenty Fab oraz fragment Fc. Te metody są opisywane np. przez Goldenber1 U.S. patent No. 413311 6471 Nisonoff i wsp.1 Arch Biochem. Biophys. 89:2301 19601 Porter1 Biochem. J. 73:1191 19591 Edelman i wsp.1 w Methods in Enzymology Vo. 11 strona 422 Academin Press 1967) i Coligan.

Inne metody cięcia przeciwciał1 takie jak oddzielenie ciężkich łańcuchów w celu utworzenia monowalencyjnych fragmentów lekko ciężkich łańcuchów oraz dalsze cięcie uzyskanych fragmentów lub enzymatyczne1 chemiczne lub genetyczne techniki mogą być również wykorzystywane1 jeżeli fragmenty wiążą antygen1 który jest rozpoznawany przez niecięte przeciwciało.

Na przykład1 fragmenty Fv zawierające związane łańcuchy VH i VL. To powiązanie może być niekowalencyjne1 tak jak opisano w Ibar i wsp.1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:25691 1972. Jednocześnie1 różne łańcuchy mogą być połączone wewnątrz cząsteczkowym wiązaniem dwusiarczkowym lub połączone związkami chemicznymi1 takimi jak gluteraldehyd (patrz np.1 Sandhu1 Crit. Rev. Biotech. 12:4371 1992).

Fragmenty Fv mogą zawierać łańcuchy VH i VL1 które są połączone łącznikiem białkowym. Takie jedno łańcuchowe białka wiążące antygen (scFv) mogą być przygotowywane poprzez konstrukcję genu struktury1 zawierającego sekwencję DNA1 kodującą domeny VH i VL1 połączone oligonukleotydem. Taki gen struktury może być wstawiony w wektor ekspresyjny1 który jest wprowadzany do komórki gospodarza1 takiej jak E. coli. Zrekombinowana komórka gospodarza wytwarza pojedynczy łańcuch polipeptydowy z peptydem łącznikowym1 łączącym dwie domeny V. Metody wytwarzania scFvs są opisane przykładowo w Whitlow i wsp. Methods: A Companion to Methods i Enzymiology 2:97 19911 jak również Bird i wsp. Science 242:4231 19981 Lander i wsp. U.S. Patent Nr 49467781 Pack i wsp.1 Bio/Technology 11:12711 1993 oraz Sandhu.

Jako przykład1 scFvs może być otrzymywane poprzez ekspozycje limfocytów na polipeptyd BR43x2 in vitro i selekcję bibliotek eksponujących przeciwciało w fagu lub podobnym wektorze (przykładowo przez użycie umieruchomionego lub wyznakowanego białka lub peptydu BR43x2). Geny kodujące polipeptydy mające domeny zdolne do wiązania polipeptydu BR43x2 mogą być otrzymane poprzez przeszukiwanie losowych bibliotek polipeptydów eksponowanych na fagu lub bakterii1 takich jak E. coli. Sekwencje nukloetydowe kodujące te polipeptydy mogą być otrzymane na szereg sposobów1 takich jak losowa mutageneza1 czy losowa synteza. Takie losowe biblioteki mogą być wykorzystywane w celu do wyszukiwania peptydów1 które oddziaływają ze znaną sekwencją docelową1 która może budować białko lub polipeptyd1 takie jak ligand lub receptor1 cząsteczka biologiczna lub sztuczna lub substancja organiczna lub nieorganiczna. Techniki tworzenia i przeszukiwania takich losowych bibliotek peptydowych są znane w dziedzinie (Lander i wsp. U.S. Patent Nr 52234091 Lander i wsp. U.S. Patent Nr 49467781 Lander i wsp. U.S. Patent Nr 54034841 Lander i wsp. U.S. Patent Nr 5571698 i Kay i wsp. Phage Display ot peptides and proteins (Academic Press Inc1 1996) oraz losowe biblioteki peptydowe oraz zestawy do przeszukiwania takich bibliotek są dostępne komercyjnie1 przykładowo z Clontech (Palo Alto1 CA)1 Invitrogen Inc (San Diego1 Ca)1 New England Biolabs1 Inc. (Bevery1 MA) oraz Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway1 NJ). Losowe biblioteki peptydowe mogą być przeszukiwane przy zastosowaniu sekwencji BR43x2 załączonych tutaj1 w celu identyfikacji białek1 wiążących BR43x2.

Inną formą fragmentu przeciwciała jest peptyd kodujący pojedynczy obszar warunkujący komplementarność (CDR). Peptydy CDR mogą być otrzymane przez konstrukcje genów1 kodujących CDR odpowiedniego przeciwciała. Takie geny mogą być przygotowywane przy zastosowaniu reakcji PCR1 w celu syntezy różnych regionów na podstawie RNA z komórek produkujących przeciwciała (patrz przykładowo Larrick i wsp. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 1991)1 Courtenay-Luck1 “Genetics manipulation of Monoclonal Antibodies” w Monoclonal Antibodies: Production1 Engineering and Clinical Application1 Ritter i wsp. strona 166 (Cambridge University Press 1995) oraz Ward i wsp. „Genetics manipulation and Expression of Antibodies” w Monoclonal Antibodies: Principles and Application1 Birch i wsp. strona 137 (Wiley-Liss1 Inc 1995).

Jednocześnie1 przeciwciało anty-BR43x2 może pochodzić od „humanizowanego” przeciwciała monoklonalnego. Humanizowane przeciwciało monoklonalne może być wytworzone poprzez transfer mysiego CDR z ciężkich i lekkich łańcuchów zmiennych mysiej immunoglobuliny do ludzkiej domeny zmiennej. Typowe pozycje ludzkich przeciwciał są podstawiane do mysich odpowiedników. Zastosowanie przeciwciał pochodzących z humanizowanych przeciwciał monoklonalnych może powodować

PL 211 033 B1 potencjalne problemy związane z immunogenicznością mysich regionów stałych. Techniki klonowania zmiennych domen mysich immunoglobulin są opisane przykładowo w Orlandi i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833, 1989. Techniki opisujące wytwarzanie humanizowanych przeciwciał są opisane przykładowo w Johns i wsp. Nature 321:522 1986, Carter i wsp. Proc. Nat. Acad. Sci USA 89:4285, 1992, Sandu crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992. Siger i wsp. J immune. 150:2844, 1993, Sudhir Antibody Engineering Protocols (Humana Press Inc, 1995), Kelly, „Engineering Therapeutic Antibodies” w Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp. strony 399-434 (John Wiley and Sons, Inc 1996) oraz przez Queen i wsp. U.S. patent Nr 5693762;1997).

Poliklonalne przeciwciała anty-idiotypowe mogą być przygotowywane poprzez immuniację zwierząt przeciwciałami anty-BR43x2 lub fragmentami przeciwciał przy zastosowaniu standardowych technik. Dla przykładu patrz Green i wsp. „Production of Policlonal Antisera” w Immunochemical Protocols (wyd. Manson), strony 1-5 (Humama Press 1992) oraz Coligan na stronach 2.4.1-2.4.7. Monoklonalne przeciwciała anty-idiotypowe mogą być alternatywnie przygotowywane przy użyciu przeciwciał antyBR43x2 lub fragmentów przeciwciał jako immunogenów, przy zastosowaniu technik opisanych powyżej. Inną możliwością jest wytwarzanie humanizowanych przeciwciał anty-idiotypowych lub przeciwciał anty-idiotypowych naczelnych subhuman przy zastosowaniu technik opisanych powyżej. Metody do wytwarzania przeciwciał anty-idiotypowych są opisane przykładowo w Irie U.S. Patent Nr 5208146, Greene i wsp. U.S. Patent Nr 5637677 oraz Varthakavi I Minocha, J. Gen. Virol 77:1875, 1996.

Przeciwciała lub polipeptydy w niniejszym wynalazku mogą być bezpośrednio lub pośrednio łączone z lekami, toksynami, izotopami i podobnymi, uzyskane połączenia mogą natomiast być używane do diagnostyki i leczenia in vivo. Przykładowo, polipeptydy lub przeciwciała mogą być wykorzystane w identyfikacji tkanek lub organów wyrażających odpowiednie antykomplementarne cząsteczki (np. odpowiednio receptor lub antygen). Dokładnie, polipeptydy lub przeciwciała anty-BR43x2 lub ich aktywne części i fragmenty, mogą być połączone z łatwo wykrywanymi lub cytotoksycznymi cząsteczkami i dostarczane komórek ssaczych, tkanek lub organów, które wyrażają antykomplementarne cząsteczki.

Odpowiednie łatwo wykrywalne cząsteczki mogą być pośrednio lub bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał i zawierać izotopy, substraty, enzymy, kofaktory, inhibitory, markery fluorescencyjne, markery chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne itp. Odpowiednie cząsteczki cytotoksyczne mogą być pośrednio i bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał i zawierać toksyny bakteryjne lub roślinne (np. toksynę dipterii, eksotoksynę Pseudomonas, rycynę, abrynę, itp.), jak również lecznicze izotopy, takie jak jodynę-131, renium-188, itryd-90 (zarówno bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał, jak pośrednio poprzez np. resztę chelatującą). Polipeptydy i przeciwciała mogą być również połączone do leków cytotoksycznych, takich jak: andrymycyna. W przypadku połączenia pośrednio łatwo wykrywalnej lub cytotoksycznej cząsteczki, łatwo wykrywalna lub cytotoksyczna cząsteczka może być połączona z jednym, z elementów pary komplementarnej, podczas gdy pozostały element z częścią przeciwciała lub polipeptydu. Przykładem pary komplementarnej może być oddziaływanie biotyna/streptawidyna.

Rozpuszczalne polipeptydy BR43x2 lub przeciwciała przeciw BR43x2 mogą być pośrednio lub bezpośrednio łączone z lekami, toksynami, izotopami i podobnymi, uzyskane połączenia mogą natomiast być używane do diagnostyki i leczenia in vivo. Przykładowo, polipeptydy lub przeciwciała wynalazku mogą być wykorzystane w identyfikacji tkanek lub organów wyrażających odpowiednie antykomplementarne cząsteczki (np. odpowiednio receptor lub antygen). Dokładnie, polipeptydy lub przeciwciała anty-BR43x2 lub ich aktywne części i fragmenty, mogą być połączone z łatwo wykrywanymi lub cytotoksycznymi cząsteczkami i dostarczane do komórek ssaczych, tkanek lub organów, które wyrażają antykomplementarne cząsteczki.

Odpowiednie łatwo wykrywalne cząsteczki mogą być pośrednio lub bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał i zawierać izotopy, substraty, enzymy, kofaktory, inhibitory, markery fluorescencyjne, markery chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne itp. Odpowiednie cząsteczki cytotoksyczne mogą być pośrednio i bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał i zawierać toksyny bakteryjne lub roślinne; np. toksynę dipterii, eksotoksynę Pseudomonas, rycynę, abrynę, itp.), jak również lecznicze izotopy, takie jak jodynę-131, renium-188, itryd-90 (zarówno bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał, jak pośrednio poprzez np. resztę chelatującą). Polipeptydy i przeciwciała mogą być również połączone do leków cytotoksycznych, takich jak: andrymycyna. W przypadku połączenia pośrednio łatwo wykrywalnej lub cytotoksycznej cząsteczki, łatwo wykrywalna lub cytotoksyczna cząsteczka może być połączona z jednym z elementów pary komplePL 211 033 B1 mentarnej, podczas gdy pozostały element z częścią przeciwciała lub polipeptydu. Przykładem pary komplementarnej może być oddziaływanie biotyna/streptawidyna.

Białka fuzyjne polipeptyd-toksyna lub ciałka fuzyjne przeciwciało/fragment toksyny mogą być używane do kierowanej inhibicji lub odcięcia tkankowego lub komórkowego (przykładowo przy leczeniu komórek lub tkanek nowotworowych. Jednocześnie, gdy polipeptyd ma wiele domen funkcjonalnych (tj. domenę aktywującą lub domenę wiążącą ligand oraz domenę sygnałową), białko fuzyjne, zawierające tylko domenę sygnałową (kierującą; może być odpowiednie do kierowania łatwo wykrywalnej cząsteczki, cząsteczki cytotoksycznej lub komplementarnej do odpowiedniej komórki lub tkanki. W przykładach, w których domenowe białko fuzyjne zawiera komplementarną cząsteczkę, cząsteczka antykomplementarna może być dołączona do łatwo wykrywalnej lub cytotoksycznej cząsteczki. Takie domena-cząsteczka komplementarna białka fuzyjne stanowi mechanizm kierowanego dostarczania komórkowo-i tkankowospecyficznego połączonych z łatwo wykrywalnymi/cytotoksycznymi cząsteczkami komplementarnych cząsteczek. Opisane aktywne biologicznie połączone polipeptydy i przeciwciała mogą być podawane dożylnie, dotętniczo i doprzewodowo lub miejscowo w pożądane miejsce działania.

Przeciwciała mogą być wywarzane przeciw rozpuszczalnym polipeptydom BR43x2, do których przyłączone są etykietki His lub FLAG™. Przeciwciała mogą być również wywarzane przeciw białkom fuzyjnym MBP, produkowanym w E. coli. Dodatkowo, takie polipeptydy mogą zawierać białka fuzyjne z ludzkimi Ig. Dokładnie, surowica zawierająca przeciwciała przeciw rozpuszczalnemu BR43x2, do których przyłączone są etykietki His lub FLAG™, może być używana do analizy rozmieszczenia BR43x2 w tkankach z wykorzystaniem immunocytochemii na tkankach ludzkich lub naczelnych. Takie rozpuszczalne BR43x2 może być również wykorzystywane do immunizowania myszy w celu otrzymywania przeciwciał moloklonalnych przeciw rozpuszczalnemu ludzkiemu BR43x2. Przeciwciała moloklonalne przeciw rozpuszczalnemu ludzkiemu BR43x2 mogą być używane w naśladowaniu wiązania ligand/receptor, w wyniku czego może dojść do aktywacji lub inaktywacji pary ligand/receptor. Przykładowo, zademonstrowano, że połączenie kowalencyjne przeciwciał monoklonalnych przeciw rozpuszczalnemu CD40, powoduje sygnał stymulujący dla komórek B, które prawie optymalnie aktywowano anty-IgM lub LPS, w wyniku czego dochodzi do proliferacji i produkcji immunoglobulin. Te same przeciwciała monoklonalne działają jako antagoniści, gdy są używane w roztworze, blokując aktywacje receptora. Przeciwciała monoklonalne przeciw BR43x2 mogą być używane do wykrywania dystrybucji, regulacji i oddziaływań biologicznych pary BR43x2/BR43x2-ligand w specyficznych liniach komórkowych, zidentyfikowanych w badaniach dystrybucji tkankowej.

Wynalazek dostarcza również wyizolowane i oczyszczone polinukleotydowe sondy i startery BR43x2, TACI i BCMA. Takie polinukleotydowe sondy mogą być w postaci DNA lub RNA. DNA może być DNA genomowym lub cDNA. Polinukleotydowe sondy to jedno- lub dwuniciowe DNA lub RNA, zwykle sztuczne oligonukleotydy, ale mogą być również wytwarzane ze sklonowanego cDNA lub sekwencji genomowej, i zawierają przynajmniej 16 nukleotydów, częściej od 17 do 25 nukleotydów, czasami od 40 do 60 nukleotydów, a w niektórych przykładach pokaźną część domeny lub nawet cały gen BR43x2 lub jego cDNA. Sondy i startery stanowią zwykle sztuczne oligonukleotydy, ale mogą być równiej wytwarzane ze sklonowanego cDNA, ich sekwencji genomowej lub ich odpowiedników. Sondy analityczne mają zazwyczaj 20 nukleotydów długości, chociaż czasami krótsze sondy (14 - 17 nukleotydów) mogą być używane. Startery do PCR muszą mieć przynajmniej 5 nukleotydów długości korzystnie 15 lub więcej nukleotydów, zaś najbardziej korzystnie 20 do 30 nukleotydów. Krótkie polinukleotydy mogą być używane, gdy analizowane są małe regiony genu. W przypadku dużych analiz genów sondy polinukleotydowe mogą zawierać cały ekson lub więcej. Sondy mogą być znakowane w celu wykrywania np. enzymatycznie, przez biotynę, izotopami, fluoroforami, chemiluminescencyjnie, cząstkami magnetycznymi itp., które są dostępne komercyjnie z wielu źródeł, takich jak Molecular Probes, Inc., Eugene, OR i Amersham. Corp., Arlington Heights, IL, przy użyciu technik dobrze znanych w dziedzinie. Korzystnymi obszarami do konstrukcji sond są region wiążący ligand, pseudo powtórzenia bogate w cysteinę, sekwencje sygnałowe i podobne. Techniki wytwarzania sond polinukleotydowych oraz techniki hybrydyzacyjne są dobrze znane specjalistom., dla przykładu patrz Ausubel i wsp., wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley i Sons, Inc., NY, 1991.

Peptydy i przeciwciała BR43x2, TACI i BCMA mogą być używane w systemach diagnostycznych w celu wykrywania obecności BR43x2, TACI i BCMA oraz polipeptydów ligandowych BR43x2, TACI i BCMA, takich jak ztnf4. Informacje uzyskane przy zastosowaniu odpowiednich metod detekcji mogą dostarczyć wskazówek dotyczących znaczenia polipeptydów BR43x2 w różnych chorobach

PL 211 033 B1 oraz mogą być wykorzystane jako narzędzia diagnostyczne w chorobach1 w których zmienione poziomy BR43x2 mają znaczenie. Zmienione poziomy polipeptydów receptorowych BR43x21 TACI i BCMA mogą wskazywać stany patologiczne w chorobach nowotworowych1 autoimmunologicznych i infekcyjnych.

W podstawowym teście jednoniciowa sonda jest inkubowana z RNA wyizolowanego z próbki biologicznej w temperaturze i sile jonowej1 umożliwiającej parowanie pomiędzy sondą a cząsteczkami RNA BR43x21 TACI i BCMA. Po oddzieleniu niezwiązanej sondy można wykryć ilość powstałych hybryd.

Dobrze znane metody hybrydyzacji RNA1 włączając analizę northern i hybrydyzację typu dot/slot blot (dla przykładu patrz Ausubel ibid. i Wu i wsp. (wyd.)1 „Analysis of Gene Expression at the RNA Level”1 w Methods in Gene Biotechnology1 strony 225-239 (CRC Press1 Inc. 1997)). Sondy kwasów nukleinowych mogą być znakowane radioizotopami1 takimi jak ³²P i ³⁵S. Dodatkowo1 RNA BR43x2 może być wykrywane w metodach hybrydyzacji nieradioaktywnej (dla przykładu patrz Issac (wyd.)1 Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes1 Humana Press1 Inc.1 1993). Zwykle1 nieradioaktywna detekcja opiera się na chromogenicznych i chemiluminescencyjnych przemianach enzymatycznych1 wykorzystujących biotynę1 flouroesceinę i digoksygeninę.

Sondy oligonukleotydowe BR43x21 TACI i BCMA mogą być również użyteczne w diagnostyce in vivo. Przykładowe1 oligonukleotydy wyznakowane ¹⁸F mogą być podane osobnikom badanym i wizualizowane poprzez pozytronową tomografię emisyjną (Tavitian i wsp.1 Nature Medicine 4:4671 1998).

Wiele metod diagnostycznych1 dla zwiększenia czułości detekcji1 wykorzystuje reakcję PCR. Standardowe techniki przeprowadzania PCR są dobrze znane (patrz1 Mathew (wyd.)1 Protocols in Human Molecular Genetics Humana Press1 Inc. 1991)1 White (wyd.) PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press1 Inc. 1993)1 Cotter (wyd.)1 Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press1 Inc. 1996)1 Hanausek i Walaszek (wyd.)1 Tumor Marker Protocols (Humana Press1 Inc. 1998)1 Lo (wyd.). Clinical Applications of PCR (Humana Press1 Inc. 1998)1 i Meltzer (wyd.) PCR in Bioanalysis ((Humana Press1 Inc. 1998)). Startery do PCR mogą być projektowane tak1 by amplifikować sekwencję kodującą odpowiednią domenę lub motyw BR43x21 taki jak BR43x21 TACI i BCMA pseudo powtórzenie bogate w cysternę.

Jedną z odmian PCR wykorzystywaną w testach diagnostycznych jest RT-PCR. W technice RT-PCR RNA może być izolowane z próbki biologicznej1 następnie poddawane reakcji odwrotnej transkrypcji1 tak by powstał cDNA1 następnie cDNA jest inkubowany ze starterami BR43x2 (dla przykładu patrz Wu i wsp. (wyd.)1 „Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR”1 w Methods in Gene Biotechnology1 CRC Press1 Inc. strony 15-281 1997). Po czym można przeprowadzić reakcję PCR i analizować produkty używając standardowych technik.

Przykładowo1 RNA może być izolowane z próbki biologicznej przy zastosowaniu lizy komórek tiocyjankiem guanidyny (opisane powyżej). Jednocześnie1 techniki stałej fazy mogą być wykorzystywane do izolacji mRNA z ekstraktu komórek. Reakcji odwrotnej transkrypcji może być rozpoczynana na matrycy wyizolowanego RNA przy wykorzystaniu losowych oligonukleotydów1 krótkich homopolimerów dT lub antysensownych oligomerów BR43x21 TACI i BCMA. Startery Oligo-dT są korzystne ze względu na to1 że różne sekwencje mRNA mogą być amplifikowane1 stanowiąc późniejszą kontrolę. Sekwencje BR43x21 TACI i BCMA mogą być amplifikowane w reakcji PCR przy użyciu otaczających starterów oligonukleotydowych o typowej długości1 przynajmniej 5 nukleotydów.

Produkty amplifikacji w reakcji PCR mogą być wykrywane różnymi sposobami. Przykładowo1 produkty PRC mogą być frakcjonowane poprzez elektroforezę w żelu i wizualizowane poprzez barwienie bromkiem etydyny. Dodatkowo1 rozdzielone produkty PCR mogą być przenoszone na filtr1 hybrydyzowane z wyznakowaną sondą BR43x2 oraz sprawdzane poprzez autoradiografię. Dodatkowe podejścia mogą zawierać użycie trójfosforanów kwasów deoksyrybonukleinowych wyznakowanych digoksygeniną1 w celu detekcji chemiluminescencyjnej i testu kolorymetrycznego C-TRAK.

Innymi podejściem jest ilościowa reakcja PCR czasu rzeczywistego (Real Timie PCR) (Perkin-Elmer Cetus1 Norwalk1 Ct.). Sonda fluorogeniczna1 zawierająca oligonukleotyd z barwnikiem reporterowym i wytłumiającym1 może się łączyć specyficznie pomiędzy prawym i lewym starterem. Przy wykorzystaniu 5' endonukleolitycznej aktywności polimerazy DNA Tag1 barwnik reporterowy jest oddzielany od barwnika wytłumiającego i1 w ten sposób1 generowany jest specyficzny sygnał1 który wzrasta wraz z postępem amplifikacji. Intensywność fluorescencji może być w sposób ciągły obserwowana i mierzona podczas trwania reakcji PCR.

PL 211 033 B1

Innym podejściem, umożliwiającym wykrywanie ekspresji BR43x2, TACI i BCMA, jest technika CPT, w której jednoniciowe DNA wiąże się z nadmiarem chimerycznej sondy DNA-RNA-DNA, tworząc kompleks, następnie RNA jest przecinane RNazą H, po czym badana jest obecność przeciętej chimerycznej sondy (dla przykładu patrz Beggs i wsp., Clin. Microbiol. 34:2985, 1995 i Bekkaoui i wsp., Biotechniques 20:240, 1996). Innymi metodami detekcji sekwencji BR43x2, TACI i BCMA są: NASBA, CATCH oraz LCR (dla przykładu patrz Marshall i wsp., U.S. Patent No. 5,686,272 (1997), Dyer i wsp., J. Virol. Methods 60:161, 1996; Enricht i wsp., Eur. J. Biochem. 243:358, 1997 i Chadwick i wsp., J. Virol. Methods 70:59, 1998). Inne standardowe metody są dobrze znane specjalistom w danej dziedzinie.

Sondy i startery BR43x2, TACI i BCMA mogą być również używane w celu wykrywania i lokalizacji ekspresji genów BR43x2, TACI i BCMA w próbkach tkanek. Metody takiej hybrydyzacji in situ są dobrze znane specjalistom w danej dziedzinie (dla przykładu patrz Choo (wyd.), In Situ Hybridization Protocols, Humana press, Inc., 1994, Wu i wsp., (wyd.) „Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISE)”, w Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., strony 259-278, 1997 i Wu i wsp. (wyd.), „Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)”, w Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., strony 279-289, 1997).

Wiele innych podejść diagnostycznych jest dobrze znanych specjalistom w danej dziedzinie (dla przykładu patrz Methew (wyd.). Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996 i Elles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press, Inc., 1996).

Dodatkowo, opisane sondy polinuklotydowe mogą być wykorzystywane w hybrydyzacji do odpowiednich sekwencji na odpowiednich chromosomach. Identyfikacja na chromosomie i/lub mapowanie genu BR43x2 może dostarczyć użytecznej informacji na temat funkcji i powiązania z chorobami. Wiele technik mapowania jest dostępna specjalistom w dziedzinie, na przykład mapowanie hybryd komórek somatycznych i technika FISH. Korzystną metodą jest radiacyjne mapowanie hybryd. Radiacyjne mapowanie hybryd jest techniką genetyczną na komórkach somatycznych, opracowaną w celu konstruowania ciągłych map o wysokiej rozdzielczości ssaczych chromosomów (Cox i wsp., Science 250:245-50, 1990). Częściowa lub pełna znajomość sekwencji genów pozwala na zaprojektowanie starterów do PCR odpowiednich do wykorzystania w radiacyjnym mapowaniu chromosomów hybryd. Dostępne są komercyjne panele do radiacyjnego mapowania hybryd, pokrywające cały ludzki genom, takie jak Stanford G3 RH Panel i DeneGridge 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huncsville, AL.). Panele takie pozwalają na szybką, opartą na PCR lokalizazję i uporządkowanie genów, sekwencji STS i innych niepolimorficznych i polimorficznych markerów w obrębie odpowiedniego obszaru. Podejście to pozwala na ustalenie proporcjonalnych fizycznych odległości pomiędzy nowo okrytymi genami i uprzednio zmapowanymi markerami. Precyzyjna znajomość pozycji genu może być użyteczna na wiele sposobów: 1) pozwala na ustalenie, czy sekwencja jest częścią istniejącego contigu i na uzyskanie otaczających sekwencji genetycznych w różnej postaci (YAG, BAC lub klony cDNA), 2) pozwala na ustalenie genu związanego z chorobą dziedziczną, który mieści się w tym samym, obszarze chromosomu i 3) pozwala na odwoływanie się do sekwencji modelowych organizmów, takich jak mysz, co może być pomocne w określaniu funkcji danego genu.

Lokalizacja chromosomowa może być przeprowadzona z wykorzystaniem, sekwencji STS. STS stanowi sekwencje DNA, która jest unikalna w genomie ludzkim i może być używana jako odniesienie dla danego chromosomu lub obszaru na chromosomie. STS może być zdefiniowany przez parę oligonukletydowych starterów, które mogą być użyte w reakcji PCR do wykrycia obecności danej sekwencji w sekwencjach genomowych. Ponieważ STS są oparte na sekwencjach DNA, mogą być dokładnie opisane w ramach bazy danych, np. dbSTS, GenBank (National Center for Bilogical Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD http://www.ncbi.nlm.nih.gov) i mogą być przeszukiwane z sekwencją odpowiedniego genu pod kątem, danych zawartych w pojedynczym STS.

Opisywany wynalazek dostarcza również odczynniki do dodatkowych zastosowań w diagnostyce. Na przykład, gen BR43x2, sonda zawierająca DNA lub RNA BR43x2 lub ich podsekwencje, które mogą być użyte w celu stwierdzenia, czy gen BR43x2 jest obecny na odpowiednim chromosomie lub czy zawiera mutacje. Wykrywalne aberacje chromosomowe w locus genu BR43x2 zawierają, nie będąc ograniczone do, aneuploidia, zmiany w liczbie kopii genu, insercje, delecje, zmiany w mapie restrykcyjnej oraz rearanżacje. Wymienione aberacje mogą powstawać w obrębie sekwencji kodującej,

PL 211 033 B1 w obrę bie intronów lub w obrę bie sekwencji otaczają cych, zawierają cych promotor i obszary regulatorowe, i mogą dotyczyć zmian fizycznych sekwencji kodującej lub zmian w poziomie ekspresji genu.

Wymienione metody diagnostyczne skradają się z następujących etapów: a) otrzymanie próbki genetycznej od pacjenta, b) inkubacja otrzymanej próbki z sondą polinukleotydową lub starterem opisanymi powyżej, w warunkach, w których polinukleotyd będzie hybrydyzował do komplementarnej sekwencji, wytwarzają pierwszy produkt reakcji i c) porównanie pierwszego produktu reakcji z produktem reakcji kontrolnej. Różnica pomiędzy pierwszym produktem reakcji i produktem reakcji kontrolnej jest równoznaczna z występowaniem nieprawidłowości genetycznych u pacjenta. Próbki genetyczne używane w ramach opisywanego wynalazku to: DNA genomowy, cDNA i RNA. Sondy polinukleotydowe oraz startery mogą być RNA lub DNA, i zawierać fragment SEQ ID NR: 3, składnik SEQ ID NR:1 lub ich odpowiednik w postaci RNA. Odpowiednie metody testowe w tym względzie zawierają techniki genetyki molekularnej znane specjalistom w dziedzinie, takie jak analiza RFLP, analiza STR wykorzystująca techniki PCR, technika LCR (Barany, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991), testy typu ochrona przed rybonukleazą i inne techniki genetyczne znane w dziedzinie (Sambrook i wsp., ibid., Ausbei i wsp., idid., Marian, Chest 108:255-65, 1995). Testy typu ochrona przed rybonukleazą; patrz np. Ausuoel i wsp., ibid, ch. 4) zawierają hybrydyzację sondy RNA do próbki RNA pacjenta, po czym. produkt reakcji (hybryda RNA-RNA) jest wystawiany na działanie RNAzy. Shybrydyzowane obszary RNA są zabezpieczone przed trawieniem. W ramach testów wykorzystujących PCR, genetyczna próbka pacjenta jest inkubowana z starterami polinukleotydowymi, następnie obszar pomiędzy starterami jest amplifikowany. Zmiany w rozmiarze i ilości otrzymywanego produktu są jednoznaczne z wystę powaniem mutacji u pacjenta. Inn ą techniką opierają c ą się na PCR, która moż e być wykorzystana, jest analiza SSCP (Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34-8, 1991).

Metodologia wykorzystująca antysensowne RNA może być użyta w celu zablokowania transkrypcji genów BR43x2, TACI i BCMA, aby zatrzymać rozwój komórek B oraz oddziaływanie z innymi komórkami. Możliwe jest zaprojektowanie polinukleotydów komplementarnych do segmentów polinukleotydów kodujących BR43x2, TACI i BCMA (np. polinukleotyd przedstawiony w ramach SEQ ID NR: 3) w celu związania mRNA kodującego BR43x2, TACI i BCMA i uniemożliwienia translacji takiego mRNA. Takie antysensowne polinukleotydy mogą być użyte do zatrzymania ekspresji genów kodujących polipeptydy BR43x2, TACI i BCMA w hodowlach komórkowych i u osobników badanych.

Myszy genetycznie zmienione tak, by wyrażać BR43x2, TACI lub BCMA są nazywane „myszami transgenicznymi”, natomiast myszy wykazujące całkowity brak funkcji BR43x2, TACI lub BCMA są nazywane myszami „knockout” i mogą być również wytworzone. (Snouwaert i wsp., Science 257:1083, 1992; Lowell i wsp., Nature 366:740-42, 1993; Cepecchi, Science 244:1288-92, 1989; Palmiter i wsp. Ann Rev Genet. 20:465-99, 1986). Na przykład, myszy transgenicznej, które nadeksprymują BR43x2, TACI lub BCMA zarówno we wszystkich tkankach, jak i w sposób specyficzny lub ograniczony tkankowo, mogą być wykorzystane dla zbadania, czy nadekspresja powoduje fenotyp. Przykładowo, nadekspresja dzikiej formy polipeptydu BR43x2, TACI lub BCMA, fragmentu polipeptydu lub mutanta może zmieniać procesy komórkowe, co będzie się objawiać fenotypem identyfikującym tkankę, w której ekspresja BR43x2, TACI lub BCMA wpływa na funkcje i może wyznaczać cel terapeutyczny dla BR43x2, TACI lub BCMA lub ich agonistów i antagonistów. Przykładowo, korzystne byłoby wytworzenie myszy transgenicznej nadeksprymującej rozpuszczalne BR43x2, TACI lub BCMA. Dodatkowo, taka nadekspresja może powodować fenotyp, wykazujący podobieństwa z ludzkimi chorobami. Podobnie knockout BR43x2, TACI lub BCMA może być wykorzystany w celu określenia, gdzie BR43x2 jest niezbędny in vivo. Fenotyp myszy znokautowanej może być podobny do efektu, który jest obserwowany w przypadku antagonistów BR43x2, TACI lub BCMA in vivo. Ludzkie cDNA DNA BR43x2, TACI lub BCMA może być wykorzystane w celu izolacji mysiego mRNA cDNA lub genomowego DNA BR43x2, TACI lub BCMA, które mogą być wykorzystane przy wytwarzaniu znokautowanych myszy. Te myszy mogą być wykorzystane w badaniach genu BR43x2, TACI lub BCMA i kodowanych biał ek w systemie in vivo i mogą być uż yte jako modele in vivo dla odpowiednich chorób ludzkich. Dodatkowo, transgeniczna ekspresja antysensownych polinukleotydów lub rybozymów skierowanych przeciwko BR43x2, TACI lub BCMA opisanych tutaj, może być użyta analogicznie do opisanych powyżej myszy transgenicznych.

Farmaceutycznie skuteczne ilości polipeptydów BR43x2, TACI lub BCMA niniejszego wynalazku mogą być przygotowane z akceptowanymi farmaceutycznie nośnikami dla podawania pozajelitowego, doustnego, donosowego, odbytniczego, miejscowego i przezskórnego itp., zgodnie z konwencjonalnymi metodami. Przygotowania mogą ponadto zawierać jeden lub więcej rozcieńczalników,

PL 211 033 B1 wypełniaczy, konserwantów, buforów, emulsyfikatorów, zaróbek i im podobnych, i mogą być dostarczane jako płyny, proszki, emulsje, czopki, lipozomy, plastry, tabletki itp. Powolne lub wzmożone systemy dostarczania zawierające dowolne z wielu systemów biopolimerowych, zawierających lipozomy, oraz systemy polimerowe, mogą być również wykorzystywane w celu ciągłego i długoterminowego dostarczania polipeptydu BR43x2 lub antagonisty. Takie powolne systemy mogą być wykorzystywane w przypadku uż ycia doustnego, miejscowego i pozajelitowego. Termin „akceptowany farmaceutycznie nośnik” dotyczy nośnika, który nie wpływa na efektywność aktywności biologicznej aktywnych składników i który nie jest toksyczny dla gospodarza lub pacjenta. Specjalista w dziedzinie może przygotowywać związki niniejszego wynalazku w odpowiedni sposób i w zgodzie z uznanymi metodami, takimi jak opisane w Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, wyd., Mack Publishing Co., Easton PA, 19th wyd., 1995.

Jak użyto w niniejszym opracowaniu, farmaceutycznie skuteczna ilość polipeptydu BR43x2, TACI lub BCMA, antagonisty lub agonisty, jest ilością wystarczającą do wywołania pożądanego efekty biologicznego. Efektem może być złagodzenie oznak, symptomów lub przyczyn choroby lub inne pożądane zmiany systemu biologicznego. Przykładowo, skuteczna ilość polipeptydu BR43x2, TACI lub BCMA to taka, która powoduje zarówno ustąpienie objawów jak i poprawę zauważalną przez lekarza lub innego wykwalifikowanego obserwatora. Przykładowo, skuteczna ilość polipeptydu lub rozpuszczalnej fuzji BR43x2, TACI lub BCMA może powodować obniżenie odpowiedzi komórek B podczas odpowiedzi immunologicznej lub zmniejszoną produkcję autoprzeciwciał, zatrzymanie symptomów związanych z SLE, MG lub RA. Skuteczne ilości BR43x2, TACI lub BCMA obniżają procent komórek B i krwi obiegowej. Efektywne ilości polipeptydów BR43x2, TACI lub BCMA mogą się wahać w zależ ności od choroby lub symptomów. Ilość polipeptydu, która ma być podana, oraz jego stężenie podczas przygotowywania zależy od wybranego podłoża, sposobu podania, potencji odpowiedniego polipeptydu, stanu klinicznego pacjenta, efektów ubocznych oraz stabilności związków. Zatem, lekarz powinien przygotować preparat o odpowiednim, stężeniu i w odpowiedniej ilości, w zależności od historii klinicznej pacjenta z uwzględnieniem podobnych przypadków. Te ilości zależeć będą, w części, od szczególnego stanu, wieku, wagi, ogólnego stanu zdrowia pacjenta i innych czynników ewidentnych dla biegłych w danej dziedzinie. Zazwyczaj, dawka będzie się wahać z zakresie 0,1 - 100 mg/kg masy ciała osobnika. Dawki odpowiednich związków mogą być określone w badaniach in vitro lub ex vivo w połączeniu z badaniami na zwierzętach doświadczalnych. Stężenia związków, które były efektywne w podaniach in vitro lub ex vivo mogą dostarczyć wskazówek w badaniach nad zwierzętami, w których dawki są wyliczane tak, aby zachować te same stężenia w miejscu działania.

Wynalazek będzie dalej przedstawiony w następujących, nieograniczających przykładach.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Identyfikacja BR43x2

Izoformę TACI sklonowane przy użyciu biblioteki RPMI w postaci uporządkowanego zestawu i podejścia wykorzystującego sekrecję. Bibliotekę RPMI 1788 (aktywowane komórki B) uporządkowano wykorzystując 20 96-studzienkowych płytek mikrotitracyjnych. Każda studzienka zawierała ok. 100 kolonii E. coli; każda kolonia natomiast zawierała jeden klon cDNA. Minipreparaty przygotowywano bezpośrednio na 96-studzienkowej płytce, stosując TomTecn Quadra 9600. Wyizolowane DNA połączono w 120 puli, w której każda zawierała 1600 klonów. Pulami transfekowano komórki Cos-7 i wysiewano na 12-studzienkowe płytki. Mieszano 3 mikrolitry DNA pochodzącego z odpowiedniej puli, 5 μΐ LipofectAMINE oraz 92 μΐ pożywki DMEM bez surowicy 50 mg pirogronianu sodu, 146 mg L-glutaminy, 5 mg transferyny, 2,5 mg insuliny, 1 μl selenu i 5 mg fetuiny w 500 ml DMEM), inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 min., po czym dodawano 400 μΐ pożywki DMEM bez surowicy. Mieszaninę DNA-LipofectAMINE dodawano do 220000 komórek Cos-7 na studzienkę, wysiewano na 12-studzienkową płytkę do hodowli tkankowych, a następnie inkubowano 5 godzin w temp. 37°C. Po 5 godzinach dodawano 500 μl pożywki DMEM z 20% FBS (100 ml FBS, 55 mg pirogronianiu sodu 146 mg L-glutaminy w 500 ml DMEM) i inkubowano komórki przez noc.

Przeszukiwanie z wykorzystaniem sekrecji przeprowadzano przy użyciu biotynowanego, ztnf4 z etykietką FLAG. Komórki przemywano PBS i utrwalano przez 15 minut 1,8% formaldehydem w PBS. Następnie przemywano komórki buforem TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl i 0,05% Tween20 w H2O). Następnie komórki permeabilizowano 0,1% Triton-X w PBS, przez 15 minut i przemywano TNT. Następnie komórki blokowano przez 1 godzinę w buforze TNB (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl i 0,5% odczynnik blokujący) przy użyciu zestawu NEN Renaissance® TSA-Direct Kit (NEN, Boston, MA),

PL 211 033 B1 zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki przemywano TNT i blokowano przez 15 minut awidyna a później biotyną (Vector Labs Cat# SP-2001), przemywając TNT pomiędzy poszczególnym blokowaniem. Komórki inkubowano przez 1 godzinę z 1 μΙ/ml ztnf4/Flag/Biotyna w TNB, a następnie przepłukiwano TNT. W kolejnym kroku komórki inkubowano z połączeniem streptawidyina-HRP (NEN) rozcieńczonym 1:300 w TNB i przepłukiwane TNT. Hybrydyzację wygrywano tyramidem fluoresceiny rozcieńczonym 1:50 w buforze do rozcieńczania (NEN), inkubując przez 4,4 minuty i przepłukując TNT. Komórki zabezpieczano w Vectashield Mounting Media (Vector Labs, Burlingame, CA) rozcieńczonymi 1:5 w TNT.

Komórki wizualizowano w mikroskopie fluorescencyjnym z filtrem FITC. Dwanaście puli było pozytywnych pod względem wiązania ztnf4. Pulę D8 (zawierającą 1600 klonów) rozbito na pojedyncze klony (D8-1) i wyizolowano pozytywne pod względem ztnf4. Przy użyciu sekwencjonowania ustalano, że klon D8-1, zawierał sekwencje polipeptydu, będącego izoformą TACI, w którym: Phe21-Arg67 pierwsze pseudo powtórzenie bogate w cysternę było zastąpione pojedynczym aminokwasem (tryptofanem). Uzyskaną izoformę nazwano BR43x2, zaś jej sekwencję polinukleotydową przedstawiono na Seq. Id nr: 1.

P r z y k ł a d 2

Lokalizacja BR43x1 w limfocytach i monocytach.

W celu zlokalizowania ekspresji BR43x1 w komórkach B i T oraz monocytach wykorzystano technikę RT-PCR. Użyto startery ZC19980 (SEQ ID Nr:15) i ZC19981 (SEQ ID Nr:16) w celu przeszukania cDNA CD19+, CD3+ i monocytów pod kątem BR43. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzano w 94°C przez 3 minuty, po czym przez 30 cykli w 94°C przez 30 sekund, 68°C przez 2 minuty i 72°C przez 1 minutę, a następnie 7 minutowe wydłużanie w 72°C. Prążek o długości 720 bp wykryto tylko w przypadku komórek B, przy braku w aktywowanych komórkach T, tak jak donoszono w przypadku przeciwciał dla TACI (von B^ow i Bram).

P r z y k ł a d 3

Test proliferacji komórek B, wykorzystujący ligand BR43 - ztnf4.

Probówkę zawierającą 1 x 10⁸ zamrożonych komórek PBMCS szybko rozmrożono w łaźni wodnej w in 37°C i zawieszono w 25 ml pożywki dla komórek B (Iscovels Modified Dulbecco's Medium, 10% FSB inaktywowana termicznie, 5% L-glutamina, 5% Pen/Strep) w 50 ml probówce. Przeżywalność komórek testowano za pomocą barwnika Trypan Blue (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). 10 μl mieszaniny Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) dodano pod zawiesinę komórek i wirowano prze 30 minut w 1800 rpm zatrzymując bez hamowania. Następnie usunięto interfazę i przeniesiono do nowych probówek na 50 ml, doprowadzono do objętości 40 ml buforem PBS i wirowano prze 10 minut w 1200 rpm zatrzymując z hamowaniem. Przeżywalność komórek B testowano barwnikiem Trypan Blue. Komórki B zawieszono w gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml w pożywce do komórek B w wysiawano 180 μl/studzienka w 96-studzienkowej płytce z dnami w kształcie litery „U” (Falcon, VWR, Seattle, WA).

Do komórek dodawano jeden z poniżej wymienionych stymulatorów tak by całkowita objętość wynosiła 200 gl.

Rozpuszczalne, ztnf-4sCF z etykietka FLAG lub ztnf-4sCF w rozcieńczeniach 10 krotnych od 1 mg-1 ng/ml, zarówno same jak i z 10 gg/ml anty-IgM (kozie przeciwciało anty ludzkie IgM) rozpuszczone w NaH₂CO₃, ph 9,5, (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) lub z 10 gg/ml anty-IgM i 10 ng/ml zrekombinowanego IL4 (rozpuszczonego w PBS i 0,1% BSA). Dodatkowo testowano również inne cytokiny takie jak IL-3 i IL-6 jak również rozpuszczalne przeciwciało CD40 (sCD40) (Pharmingen, San Diego, CA). W ramach kontroli komórki inkubowano z 0,1% BSA i PBS, 10 gg/ml anty-IgM lub 10 gg/ml anty-IgM i 10 ng/ml IL4 (lub innymi cytokinami). Następnie komórki inkubowano w at 37°C w wilgotnym, inkubatorze przez 72 godziny. 16 godzin przed zebraniem 1gCi ³H tymidyny dodawano do każdej studzienki. Komórki zbierano do 96-studzienkowej filtrowanej płytki (Uni -Filter GF/C, Packard, Meriden, CT), po czym zbierano przy użyciu odpowiedniego urządzenia zbierającego (Packard), zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie płytki suszono w 55°C przez 20-30 minut, po czym zatykano denka płytki. Do każdej studzienki dodawano 0.25 ml płynu scyntylacyjnego (Microscint0, Packard) i odczytywano płytki przy użyciu TopCount Microplate Scintillation Counter (Packard).

W celu zmierzenia indukcji produkcji IgG w odpowiedzi na różne mitogeny komórek B po stymulacji oczyszczonych komórek B, komórki przygotowywano zgodnie z opisem, i inkubowano przez 9 dni. Zbierano odsącz komórek w celu zbadania produkcji IgG.

PL 211 033 B1

W celu zmierzenia aktywacji markerów powierzchniowych w odpowiedzi na różne mitogeny komórek B po stymulacji oczyszczonych komórek B1 komórki przygotowywano zgodnie z opisem i inkubowano tylko przez 48 godzin. Komórkowe markery powierzchniowe mierzono wykorzystując analizę FACS.

Proliferacja ludzkich oczyszczonych komórek; B stymulowanych różnymi mitogenami komórek B jest podsumowana w tabeli 5.

T a b e l a 5

Stymulant	Indeks proliferacji
ztnf4	1.5
ztnf4 + IL4	9.9
ztnf4 + anty-IgM + IL4	15.8

Synergiczny wpływ ztnf4 z IL4, IL3 (10 μg/ml) i IL6 (10 μg/ml) zaobserwowano w przypadku proliferacji komórek B. Obserwowano też dwukrotne zwiększenie przekazywania sygnału komórek B przy użyciu sCD40.

Indukcja produkcji IgG (ng/ml) w odpowiedzi na różne miitogeny komórek B po stymulacji oczyszczonych komórek B jest podsumowana w Tabeli 6.

T a b e l a 6

Stymulant	kontrola	Ztnf4
anti-IgM	3	7,5
anti-IgM + IL-4	13	32
anti-IgM + IL-4 + IL-5	10	45

Zaobserwowano wzrost aktywacji markerów powierzchniowych po stymulacji oczyszczonych komórek B tylko zntf41 z anty-IgM lub z anty-IgM i IL4. Nie zaobserwowano natomiast wpływu na proliferację PBMNC w obecności optymalnej lub suboptymalnej dawki mitogenów komórek T. Jednocześnie nie zaobserwowano wpływu na produkcję TNFa w oczyszczonych monocytach w odpowiedzi na stymulację LPS.

Figura 3 przedstawia koaktywacje ludzkich limfocytów B do proliferacji i wydzielania immunoglobulin przez ztnf4. Fig. 3A1 przedstawia proliferację oczyszczonych ludzkich komórek PBMNC w odpowiedzi na stymulację rozpuszczalnymi ztnf4 (25 ng/ml) w obecności tylko IL-41 IL-4 z anty-IgM1 anty-CD40 lub anty-CD19 po 5 dniach hodowli. Fig. 3B przedstawia poziomy IgM i IgG mierzone w supernatantach1 otrzymanych z ludzkich komórek B stymulowanych rozpuszczalnym ztnf4 w obecności IL-41 IL-4 i IL-5 po 9 dniach hodowli.

Wyniki te sugerują1 że rozpuszczalne ztnf4 jest cząstką aktywującą komórki B1 która działa razem z innymi stymulantami komórek B i słabo jako jedyna. Rozpuszczalne ztnf4 powoduje proliferacje komórek B i produkcję IgG. Podnoszenie poziomów cząsteczek adhezyjnych1 kostymulujących i receptorów aktywujących sugeruje udział w funkcjach APC komórek B.

Figura 4 przedstawia stymulowanie ludzkich komórek PBMNC rozpuszczalnymi ztnf4 (25 ng/ml) lub białek kontrolnych (ubikwityna) w obecności 10 ng/ml IL-4 przez 5 dni in vitro. Oczyszczone TACI-IG1 BCMA -IG oraz kontrolne Fc testowano pod względem hamowania specyficznej proliferacji pod wpływem1 rozpuszczalnego ztnf4.

P r z y k ł a d 4

Selekcja komórek BHK stransformowanych TACI i BCMA przy wykorzystaniu wiązania ztnf4.

Komórki BHK wyrażające TACI na wysokimi poziomie selekcjonowano poprzez klonowanie rozcieńczone pul transfektantów. Stransfekowane komórki (2 x 10⁵) inkubowano w lodzie przez 30 minut z biotynolowanymi ztnf4 o stężeniu 1 μg/ml w buforze do wiązania (PBS, 2% BSA, 0.02% NaN₃), następnie komórki przemywano kolejno w buforze do przemywania1 inkubowano z SA-PE (Caltag) (rozcieńczenie 1:1000 w buforze do wiązania) w lodzie przez 30 minut. Następnie komórki przemywano 2 razy w buforze do wiązania, zawieszano również w buforze do wiązania i analizowano przy użyciu

PL 211 033 B1

FACS (FACS Vantage, Becton Dickinson). Wyselekcjonowano klony wykazujące najwyższe wiązanie TNF4.

Komórki BHK wyrażające białko BCMA na wysokim poziomie wyselekcjonowano na drodze znakowania powierzchniowego puli transfektantów wyrażających BCMA przy użyciu biotynylowanego ztnf4. Następnie dokonywano sterylnego sortowania poprzez Streptavidin-Phyco-Erythrin (SA-PE Caltag Burlingame, CA) w FL2, przy użyciu FACS Vantage (Becton Dickinson). Pojedyncze kolonie przeszukiwano pod kątem wiązania ztnf4.

P r z y k ł a d 5

Dystrybucja tkankowa

Ludzkie Multiple Tissue Northern Blots (MTN I, MTN II and MTN III; Clontech) próbowano w celu wyznaczenia dystrybucji tkankowej ekspresji ludzkiego BR43x2 i TACI. Sonda PCR o długości około 500 bp (SEQ ID NR:21) amplifikowano przy użyciu BR43x2 (SEQ ID NR:1) jako matrycy i oligonukleotydów ZC20061 (SEQ ID NR:22) i ZC20062 (SEQ ID NR:23) jako starterów. Ta sekwencja jest identyczna z homologicznymi obszarami TACI. Reakcję PCR przeprowadzano w następujący sposób: 1 cykl 94°C przez 1 minutę, po czym przez 30 cykli w 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund, a następnie 10 minutowe wydłużanie w 72°C. Produkty PCR wizualizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym, a następnie produkt PCR o długości 500 bp oczyszczano stosując Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA), zgodnie z zaleceniami producenta. Sondę znakowano radioaktywnie przy użyciu MUITIPRIME DNA labeling kit (Amersham, Arlington Heights, IL) zgodnie z zaleceniami producenta i oczyszczono stosując NUCTRAP push column (Stratagene). EXPRESSHYB (Clontech) stosowano w czasie prehybrydyzacji i jako roztwór do hybrydyzacji. Hybrydyzację przeprowadzano przez noc w 65°C stosując 10⁶ cpm/ml wyznakowanej sondy. Filtry przepłukiwano w 2X SSC i 0,1% SDS w temperaturze pokojowej, po czym. dwukrotnie w 0,1X SSC i 0,1% SDS w 50°C. Transkrypt o długości około 1,5 kb wykryto w śledzionie, węzłach chłonnych i jelicie cienkim.

Ludzkie Multiple Tissue Northern Blots (MTN I, MTN II and MTN III; Clontech) próbowano w celu wyznaczenia dystrybucji tkankowej ekspresji ludzkiego BCMA. Sonda PCR o długości około 257 bp (SEQ ID NR:24) amplifikowano przy użyciu cDNA komórek Daudi jako matrycy i oligonukleotydów ZC21065 (SEQ ID NR:25) i ZC21067 (SEQ ID NR:26) jako starterów. Reakcję PCR przeprowadzano w następujący sposób: 1 cykl 94°C przez 1 minutę, po czym przez 35 cykli w 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund, a następnie 10 minutowe wydłużanie w 72°C. Produkty PCR wizualizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym, a następnie produkt PCR o długości 257 bp oczyszczano stosując Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA), zgodnie z zaleceniami producenta. Sondę znakowano radioaktywnie przy użyciu MULTIPRIME DNA labeling kit (Amersham, Arlingotn Heights, IL) zgodnie z zaleceniami producenta i oczyszczono stosując NUCTRAP push column (Stratagene). EXPRESSHYB (Clontech) stosowano w czasie prehybrydyzacji i jako roztwór do hybrydyzacji. Hybrydyzację przeprowadzano przez noc w 65°C stosując 10⁶ cpm/ml wyznakowanej sondy. Filtry przepłukiwano w 2X SSC i 0,1% SDS w temperaturze pokojowej, po czym dwukrotnie w 0,1X SSC i 0,1% SDS w 50°C. Transkrypt o długości około 1,2 kb wykryto w żołądku, węzłach chłonnych i jelicie cienkim, śledzionie, tchawicy i jądrach.

RNA Master Dot Blots (Clontech) zawierające RNA z różnych tkanek standaryzowane względem 8 genów typu housekeeping próbowano zarówno sondą TACI (SEQ ID NR:21), jak i sondą BCMA (SEQ ID NR:24) i hybrydyzowano zgodnie z powyższym opisem. Zaobserwowano ekspresję BR43x2/TACI w żołądku, węzłach chłonnych i jelicie cienkim, śledzionie, płucach, szpiku kostnym, śledzionie płodowej, gruczołach ślinowych i wyrostku robaczkowym. Wykryto ekspresje BCMA w jelicie cienkim, śledzionie, żołądku, jelicie grubym, węzłach chłonnych i wyrostku robaczkowym.

A human Tumor Panel Blot V (Invitrogen Inc., San Diego, CA) i ludzkie filtry z próbkami chłoniaków (Invitrogen) próbowano zarówno z sondą BR43x2/TACI, (SEQ ID NR:21), jak i sondą BCMA (SEQ ID NR:24). Transkrypt o długości 1,5 kb odpowiadający TACI znaleziono w chłoniaku typu non-Hodgkin i nowotworze ślinianki przyustnej. Transkrypt o długości 1,2 kb odpowiadający BCMA znaleziono w chłoniaku gruczołowym, chłoniaku typu non-Hodgkin i nowotworze ślinianki przyustnej.

Całkowite RNA z CD4+, CD8+, CD19+ z komórek limfocytów (Cell Pro, Bothell, WA) przygotowano przy użyciu tiocyjanku guanidyny (Chirgwin i wsp., Biochemistry 18:52-94, 1979), po czym przeprowadzono wirowanie w gradiencie CsCL. Poly(A) + RNA wyizolowano przy użyciu chromatografii z oligo d(T) celulozą; Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69:1438-12, 1972). Analizę typu Northern blot przeprowadzono jak następuje.

PL 211 033 B1

Około 2 mg każdego poly A+ RNA denaturowano w 2,2 M formaldehyd/bufor forsforanowy (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 50 mM NaOAc, 1 mM EDTA and 2,2 M formaldehyd) i rozdzielono w 1,5% mini żelu agarozowym (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Electroforezę przeprowadzano w formaldehyd/bufor forsforanowy. RNA transferowano na filer nitranowy przez noc (Schleicher & Schuell, Keene, NH), a następnie filer poddawano działaniu UV (1,200 mdżuli) w STRATALINKERA UV Crosslinker (Stratagene Cloning Systems), po czym zapiekano w 80°C przez jedną godzinę.

Filtry próbowano zarówno z sondą TACI, (SEQ ID NR:21), jak i sondą BCMA (SEQ ID NR:24). Fragment o długości 1,5 kb odpowiadający TACI znaleziono wyłącznie w komórkach CD19+. Transkrypt o długości 1,2 kb odpowiadający BCMA znaleziono na niskim, poziomie w komórkach CD8+, CD19+ i MLR.

Dodatkową analizę typu Northern Blot przeprowadzano na filtrach z poly(A) RNA z komórek K-562 (komórki erytroidalne, ATCC CCL 243), komórki HUT78 (komórki T, ATCC TIB161), komórki Jurkat (komórki T), DAUDI (ludzki chłoniak Burkitta, Clontech, Palo Alto, CA), RAJI Ludzki chłoniak Burkitta, Clontech) i HL60 (Monocyty) zgodnie z powyższym opisem. Fragment o długości 1,5 kb odpowiadający TACI znaleziono w komórkach Raji. Transkrypt o długości 1,2 kb odpowiadający BCMA znaleziono w komórkach Daudi, Raji i Hut 78.

Przeszukiwanie oparte o PCR zastosowano w celu identyfikacji tkanek wyrażające ludzkie lub mysie TACI lub ludzkie BCMA. Ludzkie i mysie Rapid-Scan Gene Expression Panels (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) przeszukiwano zgodnie z zaleceniami producenta. Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC24200 (SEQ ID NR:27) i ZC24201 (SEQ ID NR:28), tak aby pokrywały połączenie eksonu i umożliwiały amplifikację fragmentu odpowiadającemu mysiemu TACI o długości 257 bp. Wykryto ekspresję w śledzionie, grasicy, płucach, klatce piersiowej, sercu, mięśniach, skórze, gruczole nadnercza, żołądku, jelicie cienkim, mózgu, jajowodzie, gruczole prostaty i embrionach. Dodatkowe prążki o długości około 500 i 800 bp wykryto w wielu tkankach.

Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC24193 (SEQ ID NR:29) i ZC24199 (SEQ ID NR:30), tak aby pokrywały połączenie eksonu i umożliwiały amplifikację fragmentu odpowiadającemu ludzkiemu TACI o długości 204 bp. Wykryto ekspresję w śledzionie, mózgu, sercu, wątrobie, jelicie grubym, płucach, jądrach, łożysku, gruczole śliniankowym, trzustce, mięśniach, gruczole nadnercza, żołądku, jelicie cienkim, gruczole prostaty, limfocytach i szpiku kostnym.

Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC24271 (SEQ ID NR:31) i ZC24272 (SEQ ID NR:32), tak aby pokrywały połączenie eksonu i umożliwiały amplifikację fragmentu odpowiadającemu ludzkiemu BCMA o długości 329 bp. Wykryto ekspresję w śledzionie, mózgu, wątrobie płodowej, jelicie grubym, płucach, jądrach, gruczole śliniankowym, gruczole nadnercza, żołądku, jelicie cienkim, gruczole prostaty, jajowodzie, limfocytach i szpiku kostnym.

Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC24495 (SEQ ID NR:33) i ZC24496 (SEQ ID NR:34), tak aby pokrywały połączenie eksonu i umożliwiały amplifikację fragmentu odpowiadającemu mysiemu BCMA o długości 436 bp. Wykryto ekspresję w wątrobie.

P r z y k ł a d 6

Przygotowanie wektorów fuzyjnych TACI-Ig i BCMA -Ig

Konstrukcja fragmentu Ig Gamma1 Pc4

W celu przygotowania białka fuzyjnego TACI-Ig region Fc ludzkiego IgG1 (region „zawiasowy” oraz domeny CH2 i CH3) zmodyfikowano rak, by usunąć receptor Fc (FcgRI) i fragmenty odpowiedzialne za wiązanie dopełniacza C1q. Zmodyfikowaną wersję ludzkiego IgG1 Fc nazwano Fc4.

Region Fc wyizolowano z ludzkiej płodowej biblioteki pochodzącej z wątroby, (Clontech) przy użyciu PCR i starterów ZC10134 (SEQ ID NR:43) i ZC10135 (SEQ ID NR:44). Reakcje PCR wykorzystano do wprowadzenia mutacji w obrębie regionu Fc, w celu ograniczenia wiązania FcgRI. Miejsce wiązania FcgRI (Leu-Leu-Gly-Gly) zmutowano do Ala-Glu-gly-Ala (pozycje aminokwasów 38-41 w SEQ ID NR:45) zgodnie z Baum i wsp. EMBO J. 13:3992-4001, 1994), aby obniżyć wiązanie FcRl (Duncan i wsp., Nature 332:563-4, 1988). Zastosowano startery oligonukleotydowe ZC15345 (SEQ ID NR:46) i ZC15347 (SEQ ID NR:47) w celu wprowadzenia mutacji. Do 50 μl końcowej objętości dodano 570 ng IgFc matrycy, 5 μl 10X Pfu buforu do reakcji (Stratagene), 8 μl 1,25 mM dNTP, 31 μl dH₂O, 0,2 μί 20 mM ZC15345 (SEQ ID NR:46) i ZC15347 (SEQ ID NR:47). Następnie dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez minutę. Po czym dodano polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene), a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę kończąc wydłużaniem, przez 7 minut w 72°C. Produkt reakcji podda40

PL 211 033 B1 no elektroforezie, wykrywając produkt o długości 676 bp. Prążek wycięto z żelu i odzyskano stosując QIAGEN QIAquickTM Gel Extraction Kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta.

Reakcję PCR zastosowano również do wprowadzenia mutacji: Ala do Ser (pozycja aminokwasowa 134, SEQ ID NR:45) i Pro do Ser (pozycja aminokwasowa 135, SEQ ID NR:45) w celu obniżenia wiązania komplementu Clg (Dunca i Winter, Nature 332:788, 1988) i wprowadzenia kodonu stop (TAA).

Dwie pierwsze reakcje przeprowadzono używając sekwencji IgFc ze zmutowanym miejscem wiązania

FcyRI jako matrycy. Do 50 μΐ końcowej objętości dodano 1 μΐ sekwencji IgFc ze zmutowanym miejscem wiązania FcyRI, 5 μl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene), 8 μl 1,25 mM dNTP, 31 μl dH₂O, 2 μl 20 mM ZC15517 (SEQ ID NR: 48), starter 5' rozpoczynający się od 26 nukleotydu SEQ ID NR:45 i 2 μΐ 20 mM ZC15530 (SEQ ID NR:49) starter 3' rozpoczynający się w obszarze dopełniacza począwszy od nukleotydu 405 SEQ ID NR: 45. Druga reakcja zawierała 2 μl 20 mM startera ZC15518 (SEQ ID NR:50), starter 5' rozpoczynający się od 338 nukleotydu SEQ ID NR:45 i ZC15347 (SEQ ID NR:47), starter 3' wprowadzający mutacje Ala do Ser oraz miejsce rozpoznawane przez Xbal kodon stop. Następnie dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez minutę. Po czym dodano polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene), a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty kończąc wydłużaniem przez minut w 72°C. Produkty reakcji poddano elektroforezie, wykrywając produkty odpowiednio o długościach 370 i 395 bp. Prążki wycięto z żelu i odzyskano stosując QIAGEN QIAquickTM Gel Extraction Kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Drugą reakcję przeprowadzano, aby połączyć powyższe fragmenty i wprowadzić miejsce dla restrykatazy BamHI na końcu 5'. Do 50 μl końcowej objętości dodano 30 μl dH₂O, 8 μl 1,25 mM dNTP, 5 μl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene) i po 1 μl każdego z produktów uzyskanych powyżej. Następnie dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez minutę. Po czym dodano polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene), a następnie przeprowadzono 5 cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty. Następnie temperaturę podwyższono ponownie do 94°C i dodano 2 μl 20 mM startera ZC15516 (SEQ ID NR:51), starter 5' rozpoczynający się od 1 nukleotydu SEQ ID NR:45 oraz ZC15347 (SEQ ID NR:47), a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 72°C przez minuty kończąc wydłużaniem przez 7 minut w 72°C. Produkt reakcji poddano elektroforezie, wykrywając produkt długości 789 bp.

Konstrukcja wektorów ekspresyjnych TACl-Fc4 i BCMA-Fc4.

Plazmidy ekspresyjne, zawierające fuzje białkowe TACI-Fc4 i BCMA-Fc4 wytworzono korzystając z homologicznej rekombinacji w drożdżach. Fragment cDNA TACI wyizolowano w reakcji PCR, tak aby zawierał sekwencje polinukleotydową od 15 do 475 nukleotydu z SEQ ID NR:5. Starterami użytymi do amplifikacji fragmentu TACI były: (1) starter, zawierający 40 bp sekwencji otaczającej od strony 5' wektora i 17 bp odpowiadające końcowi N fragmentu TACI (SEQ ID NO:52); (2) 40 bp sekwencji otaczającej od strony 3' Fc4 i 17 bp odpowiadające końcowi C fragmentu TACI (SEQ ID Nr: 53). Do 100 μl końcowej objętości dodano 10 ng matrycy TAIC, 10 μl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene), μl 2,5 mM dNTP, 78 μl dH₂O, po 2 μl 20 mM każdego ze starterów SEQ ID NR:52 i SEQ ID NR:53 oraz polimerazy Taq (2,5 jednostki, Life Technology). Później dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez 2 minuty, a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę kończąc wydłużaniem przez 5 minut w 72°C.

Fragment cDNA BCMA wyizolowano w reakcji PCR, tak aby zawierał sekwencje polinukleotydową od 219 do 362 nukleotydu z SEQ ID NR:7. Starterami użytymi do amplifikacji fragmentu TACI były starter, zawierający 40 bp sekwencji otaczającej od strony 5' z wektora i 17 bp odpowiadające końcowi N fragmentu BCMA (SEQ ID NC:54); oraz starter 40 bp sekwencji otaczającej od strony 3' z Fc4 i 17 bp odpowiadające końcowi C fragmentu BCMA (SEQ ID Nr:55). Do 100 μl końcowej objętości dodano 10 ng matrycy BCMA, 10 μl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene), 8 μl 2,5 mM dNTP, 78 μl dH₂O, po 2 μl 20 mM każdego ze starterów SEQ ID NR:54 i SEQ ID NR:55 oraz polimerazy Taq (2,5 jednostki, Life Technology). Później dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez 2 minuty, a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 33 sekund, 65°C przez 33 sekund, 65°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę kończąc wydłużaniem, przez 5 minut w 72°C.

Fragment zawierające cDNA, kodujące Fc4 konstruowano w podobny sposób, zarówno dla konstruktów fuzyjnych TACI i BCMA. W przypadku TACI dwoma starterami użytymi do amplifikacji fragmentu Fc4 były: starter, zawierający 40 bp sekwencji otaczającej od strony 5' z TACI i 17 bp odpowiadające końcowi N fragmentu Fc4; (SEQ ID NR: 56); oraz starter 40 bp sekwencji otaczającej od

PL 211 033 B1 strony 3' z sekwencji wektora i 17 bp odpowiadające końcowi C fragmentu Fc4 (SEQ ID Nr: 57). W przypadku BCMA dwoma starterami użytymi do amplifikacji fragmentu Fc4 były: starter, zawierający 40 bp sekwencji otaczającej od strony 5' z BCMA i 17 bp odpowiadające końcowi N fragmentu Fc4 (SEQ ID NR:58); Prawy do konstrukcji fragmenty Fc4 dla konstruktu z BCMA, był taki sam jak w przypadku TACI-Fc4 (SEQ ID NR:57)

Do 100 gl końcowej objętości dodano 10 ng matrycy Fc4, 10 μl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene), 8 μl 2,5 mM dNTP, 78 μl dH₂O, po 2 μl 20 mM każdego ze starterów SEQ ID NR:56 i SEQ ID NR:57 w przypadku TACI lub SEQ ID NR:58 i SEQ ID NR:57 w przypadku BCMA oraz polimerazy Taq (2,5 jednostki, Life Technology). Później dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez 2 minuty, a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę kończąc wydłużaniem przez 5 minut w 72°C.

gl każdej ze 100 μl opisanej powyżej reakcji PCR rozdzielono na 0,8% agarozie LMP (Seaplaque GTG) z 1X buforem TBE. Pozostałe 90 μl poddano precypitacji poprzez dodanie 5 μl 1 M NaCl i 250 gl absolutnego etanolu. Plazmid pZMP6 przecięto enzymem Smal w celu linearyzacji w miejscu wielokrotnego klonowania. Plazmid pZMP6 otrzymano z plazmidu pCZR199 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC# 98668) I jest ssaczym plazmidem do ekspresji, zawierającym kasetę ekspresyjną, wczesny promotor CMV, sekwencję najwyższej zgodności intronu ze zmiennego obszaru ciężkiego łańcucha mysiej immunoglobuliny, miejsce wielokrotnego klonowania do wstawiania sekwencji kodujących, kodon stop i ludzki terminator pochodzący z ganu na hormon wzrostu. Plazmid ma również ori replikacji z S. coli, ssaczy miarker selekcyjny z promotorem 3V40, sekwencje wzmacniacza, ori replikacji, gen DHFR oraz terminator SV40. Wektor pZMP6 skonstruowano na bazie pCZR199, zastępując promotor metalotioninowy wczesnym promotorem CMV i sekwencje Kozak na 5' końcu otwartej ramki odczytu.

100 gl kompetentny komórek drożdży (S. cerevisiae) zmieszano z 10 gl, zawierającego ok. 1 gg, każdej z pozakomórkowej domeny TACI i BCMA oraz odpowiednie do rekombinacji fragmenty PCR Fc4 oraz 100 ng wektora pZMP6, przeciętego enzymiem Smal, przeniesiono do kuwety do elektroporacji o grubości 0,2 cm. Mieszaninę drożdże/DNA elektroporowano (0,75 kV - 5kV/cm, brak oporności, 25 gF). Do każdej kuwety dodawano 600 gl 1,2 M sorbitolu, a następnie drożdże wysiewano na w objętości 300 gl na szalki URA-D i inkubowano w 30°C.

Po 43 godzinach pojedyncze transformanty ura+ zawieszano w 1 ml bufory do lizy (2% Triton X-100, 1%SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 gl tego buforu dodawano do 300 gl kulek szklanych przemytych kwasem i 200 gl mieszaniny fenol/chloroform, wytrząsano dwa lub trzy razy z minutowymi przerwami i wirowano w wirówce do probówek typy Eppendorf przy maksymalnej prędkości. 300 gl fazy wodnej przenoszono do nowych probówek typy Eppendorf, a następnie wytrącano DNA przy użyciu 600 gl etanolu, po czym wirowano przez 10 minut w 4°C, osad zawieszono w 100 gl H2O.

Transformację elektrokompetentnych komórek E. coli (DH10H, GibcoBRL) przeprowadzano z 0.5-2 ml drożdżowego DNA i 40 gl komórek DH10B. Komórki elektroporowano przy 2,0 kV, 400 omach i 25 gF. Po elektroporacji zawieszano w 1 ml SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0.5% yeast extract (Difco), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCI2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukoza) i wysiewano w porcjach 250 gl na 4 szalki LB Amp (LB broth (Lennox), 1.8% Bacto' Agar (Difco), 100 mg/L ampicylina).

Pojedyncze klony zawierające prawidłowe konstrukty TACI-Fc4 lub BCMA-Fc4 z odpowiednią wstawką i prawidłowo połączonymi DNA identyfikowano poprzez analizę restrykcyjną. Pozytywne klony sekwencjonowano. Plazmidy na wysoką skalę przygotowywano przy pomocy Qiagen Maxi kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta.

P r z y k ł a d 7

Ekspresja TACI-Fc4 i BCMA-Fc4 w komórkach ssaczych.

Komórki BHK 570 (ATCC NO: CRL-10314) wysiewano na 10 cm szalki do hodowli tkankowych i hodowano do osiągnięcia 50-70% zlewania przez noc w 5% atmosferze CO2 pożywce DMEM/FCS (DMEM, Gibco/BRL o wysokiej zawartości glukozy, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% FBS (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamina (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pirogronian sodu (Gibco BRL)). Następnie komórki transferowano plazmidami TACI-Fc4/pZMP6 i BCMA-Fc4/pZMP6 przy użyciu Lipofectamine (Gibco DRL) oraz pożywki DMEM bez surowicy (DMEM, 1% pirogronianu sodu, 1% L-glutaminy, 10 mg/ml transferyny, 5 mg/ml mg insuliny i 2 mg/ml fetuiny). Plazmidy TACI-Fc4/pZMP6 i BCMA-Fc4/pZMP6 rozcieńczano w 15 ml probówkach do całkowitej objętości 640 gl

PL 211 033 B1 w pożywce bez surowicy. Mieszano 35 gl LipofectAMINE oraz 605 gl pożywki DMEM bez surowicy. Mieszaninę LipofectAMINE dodawano do DNA i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 min. 5 ml pożywki bez surowicy dodawano do mieszaniny DNA-LipofectAMINE. Komórki przemywano jednokrotnie 5 ml pożywki bez surowicy i dodawano 5 ml mieszaniny DNA-LipofectAMINE. Komórki inkubowano w 37°C przez 5 godzin, następnie 6,4 ml pożywki DMEM/10% FCS, 1% PSN dodawano do każdej szalki. Szalki inkubowano przez noc w 37°C, a następnie następnego dnia pożywkę zawierająca DNA-LipofectAMINE zmieniano na świeżą pożywkę DMEM/FSB 5%. Piątego dnia po transfekcji komórki przenoszono do pożywki selekcyjnej w butelkach T-162 (OMEM/ 5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr). Około 10 dni po oransfekcji dwie 150 mm szalki do hodowli tkankowych z komórkami opornymi na metotreksan z każdej transfekcji trypsynizowano, połączono w pule, przesiano do butelek T-162 i przeniesiono do hodowli na dużą skalę.

P r z y k ł a d 9

Transgeniczna ekspresja ztnf4.

Zwierzęta transgeniczne wyrażające ztnf4 otrzymano wykorzystując dorosłe płodne samce (B6C3fl), przedpokwitaniowe płodne samice (B6C3fl), pozbawione nasieniowodów samce (B6D2fl) i dojrzałe samice (B6D2fl) (wszystkie Taconic Farms, Germiantown, NY). Przedpokwitaniowe płodne samice poddawano zabiegowi superowulacji używając gonadotropiny Pregnant Mare's Serum (Sigma, St. Loui.5, MO; i ludzkiej Chorionic Gonadotropin (hCG (Sigma)). Samice poddawano zabiegowi superowulacji krzyżowano z płodnymi samcami, a zajście kopulacji potwierdzano obecnością czopów spermy w pochwie.

Zapłodnione jaja zbierano pod mikroskopem, chirurgicznym (Leica MZ12 Stereo Microscope, Leica, Wetzlar, Germany). Jaja przemywano w hialuronidazie i pożywce Whittena W640 (Tabela; wszystkie odczynniki dostępne w Sigma Chemical Co.), która była inkubowana z 5% CO2, 5% O2, i 90% N2 w 37°C. Jaja przechowywano w inkubatorze 37°C/ 5% CO2 aż do momentu microinjekcji.

T a b e l a 8

	mg/200 ml	mg/500 ml
NaCl	1280	3200
KCl	72	180
KH2PO4	32	80
MgSO4-7H2O	60	150
Glukoza	200	500
Ca²+ mleczan	106	265
Benzylpenicylina	15	37,5
Streptomycyna SO4	10	25
NaHCO3	380	950
Na pirogronian	5	12,5
H2O	200 ml	500 ml
500 mM EDTA	100 gl	250 gl
5% Phenol Red	200 gl	500 gl
BSA	600	1500

Amplifikowano przy wykorzystaniu PCR otwartą ramkę odczytu od długości 858 bp, kodującą pełnej długości ludzkie TACI (SEQ ID Nr:35) tak by wprowadzić optymalne kodony i odpowiednie miejsca restykcyjne, Pmel na końcu 5' i AscI na końcu 3', używając starterów SEQ ID Nr:36 i SEQ ID Nr:37.

Otrzymany fragment Pmel - AscI subklonowano do plazmidu pKFO24, zawierającego sekwencje wzmacniacza Ig Em, specyficznego dla komórek B i/lub T (Bodrug i wsp., EMBO J. 13:2124-30, 1994), promotor Ig Vh, (536 bp HincII/XhoI fragment z pJHlX(-); Hu i wsp., J. Exp. Med. 177:1681-90,

PL 211 033 B1

1993), intron SV40 16S (171 bp Xhol/Hindlll fragment z pEmSR), miejsce klonowania Pmel/AscI i sygnał poliadenylacji pochodzący z ludzkiego genu kodującego hormon wzrostu (627 bp Smal/EcoRI fragment; Seeborg, DNA 1:239-49, 1982). Wstawkę wycięto z plazmidu enzymem Notl i oczyszczono po elektroforezie w żelu agarozowym, a następnie dokonano mikroinjekcji do zapłodnionych jaj z krzyżówki myszy B6C3FITac opisanej powyżej i implantowano do pseudociężarnych samic tak jak opisano poprzednio (Malik i wsp., Molec. Cell. Biol. 15:2349-58, 1995).

Samice trzymano w klatkach w parach i przez 19-21 dniowy okres ciąży. Po porodzie, myszy trzymano 19-21 dni przed określeniem płci i odstawianiem od karmienia, a następnie dokonano biopsji (do genotypowania) poprzez odcięcie fragmentu ogona czystymi nożyczkami.

Przygotowano genomowe DNA z fragmentów ogonów przy zastosowaniu komercyjnie dostępnego zestawu (DNeasy 95 Tissue Kit; Qiagen, Valencia, GA), zgodnie z zaleceniamii producenta. DNA genomowe sprawdzano stosując startery zaprojektowane tak by amplifikować 3' UTR ludzkiego genu kodującego hormon wzrostu (hGH) na wektorze transgenicznym. Startery ZC17251 (SEQ ID Nr:38) i ZC17252 (SEQ ID Nr:39) amplifikowały fragment hGH o długości 368 bp. Zastosowanie obszaru unikalnego w ludzkiej sekwencji (zidentyfikowanego przez przyrównanie sekwencji ludzkiego i mysiego 3' UTR hGH) daje pewność, że nie amplifikowano sekwencji mysiej. Dodatkowo, startery ZC17156 (SEQ ID Nr:40) i ZG17157 (SEQ ID Nr:41), hybrydyzujące z sekwencją wektora i amplifikujące cDNA wstawki mogą być używane razem ze starterami do hGH. W tych eksperymentach, DNA ze zwierząt pozytywnych pod względem obecności transgenu, po amplifikacji pozwala na zaobserwowanie dwóch prążków: jednego o długości 368 bp, odpowiadającego 3' UTR hGH oraz drugiego o zmiennej długości, odpowiadającego wstawce cDNA.

Po potwierdzeniu transgeniczności zwierząt, krzyżowano je wstecznie ze szczepami wsobnymi poprzez umieszczenie transgenicznej samicy z dzikim samcem lub transgenicznego samca z dziką samicą (samicami), Wszystkie osobniki potomne odstawiano od karmienia, rozdzielano ich płcie i odcinano kawałki ogonów do genotypowania.

W celu zbadania ekspresji transgenu w żywym zwierzęciu, dokonywano biopsji przyżyciowej. Analizowano poziomy ekspresji mRNA każdego transgenu wykorzystując test hybrydyzacji RNA lub real-time PCR w aparacie ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), zgodnie z zaleceniami producenta.

Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej.

Analizowano pierwotne myszy w różnym wieku. Dla dalszej analizy w cytometrze przepływowym wyizolowano tkankę limfoidalną oraz szpik kostny z kości udowych i piszczelowych, poprzez ostrożne rozłamanie w PBS przy użyciu moździerza. Komórki zawieszono i pozbawiono resztek kości poprzez bierną sedymentację i osadzono przez wirowanie w 1000 x g. Limfocyty śledzionowe, grasicowe i komórki węzłów chłonnych otrzymano poprzez zgniecenie tkanek pomiędzy szkiełkami, zawieszanie i osadzenie tak jak w przypadku szpiku kostnego. Przed barwieniem komórki zawieszono w buforze do płukania FACS (FACS WB) (HBSS, 1% BSA, 10 mM Hepes, pH 7.4) w gęstości 20 x 10⁶komórek/ml. Podczas barwieni, 1 x 10⁶ komórek przenoszono do s ml probówki i przemywano 1 ml FACS WB, po czym osadzano w 1000 x g. Następnie komórki inkubowano w lodzie przez 20 minut w obecności odpowiednich przeciwciał z dołączonymi FITC, PE, i/lub TriColor(TC) w całkowitej 100 ml FACS WB. Komórki przemywano 1,5 ml WB, osadzano i zawieszano w 400 ml WB i analizowano na cytometrze przepływowym FACSCalibur używając oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Detektory FSC i SSC ustawiono w skali liniowej, podczas gdy logarytmiczne detektory ustawiono dla wszystkich kanałów fluorescencyjnych (FL-1, FL-2 1 FL-3).

Kompensacje nałożenia spektralnego pomiędzy kanałami FL przeprowadzano dla każdego eksperymentu używając populacji komórek wybarwionych jednym, kolorem. Dane dla wszystkich komórek zgromadzono na dysku i analizowano przy użyciu oprogramowania CellQuest. Komórki RBC oraz komórki nie żywe wykluczano elektronicznie na podstawie danych z profili FSC vs. SSC.

Monoklonalne przeciwciała anty-CD8 połączone z FITC (klon 53-6,7) i anty-CD4 połączone z PE (klon RM4-5), anty-CD5 (klon 53-7,3), anty-CD19 (klon 1D3) oraz antysydekan (klon 281-2) przeciwciała monoklonalne kupiono w PharMingen (San Diego, CA). Przeciwciała anty-CD45R/B220 połączone z TriColor(TC) (klon RA3-6B2) zakupiono w Caltag.

Transgeniczne myszy nadeksprymujące ztnf4 w przedziałach limfoidalnych wykazywały podwyższoną liczbę obiegowych komórek B, zwiększoną liczbę komórek plazmy oraz podwyższone poziomy immunoglobulin osocza. Zwierzęca te miały podwyższoną liczbę komórek B200+ w trzustce, węzłach chłonnych i grasicy. Podwyższona liczba trzustkowych komórek B obejmuje zarówno komórki

PL 211 033 B1

B-2 i normalnie rzadko występującą populację komórek B-1. Zwykle komórki B-1 występują głównie w jamie otrzewnowej i innych jamach ciała, produkując samo reagujące przeciwciała o niskim, powinowactwie i są często związane z rozwojem chorób autoimmunologicznych takich, jak SLE.

Starsze transgeniczne zwierzęta wytwarzają autoprzeciwciała powodujące schorzenia typu białko w moczu, stwardnienie kłębków charakterystycznych dla SLE.

Figura 5a przedstawia zawiesiny pojedynczych komórek trzustki (górna ramka), węzłów chłonnych (środkowa ramka) i szpiku kostnego (dolna ramka), przygotowanych tak, jak opisano poniżej, barwionych anty-B220-TC i analizowanych przez cytometrię przypływową. Liczę komórek B220+ w każdej tkance obliczano mnożąc procent komórek B220+ przez całkowitą liczbę żywych komórek liczoną na hemocytometrze. Każdy słupek przedstawia dane z pojedynczej ztnf4 myszy transgenicznej (Tg, cieniowane słupki) lub nietransgenicznej myszy kontrolnej (niecieniowane słupki).

Figura 5B przedstawia komórki wyizolowane z transgenicznej myszy ztnf4 (prawa ramka) i nietransgenicznej myszy z tego samego miotu (lewa ramka) węzłów chłonnych (górny rząd), trzustki (środkowy rząd) oraz grasicy (dolny rząd) które barwiono monoklonalnymi przeciwciałami przeciw zaznaczonym, cząsteczkom (C5, CD4 i CD8) i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawione dane nie zawierają komórek martwych oraz komórek RBC.

Figura 5C przedstawia całkowite poziomy IgG, IgM i IgE w osoczu myszy transgenicznej ztnf4 względem wieku w zakresie od 6 do 23 tygodni.

Figura 5D przedstawia rozmieszczenia amyloidu i grubość tkanki łącznej kłębuszka nerki mierzoną poprzez barwienie sekcji nerki H&E u myszy transgenicznej ztnf4 w porównaniu z myszami kontrolnymi z tego samiego miotu.

Figura 5E przedstawia wzrost efektorowych komórek T w myszy transgenicznej podobnie jak pokazano w Mackay i wsp. (J. Exp. Med. 190:1697-1710, 1999).

Rozpuszczalne fuzje TACI (BR43x2) lub BCMA-Ig wstrzykiwano (dootrzewnowo, domięśniowo lub dożylnie) transgenicznym zwierzętom nadeksprymującym ztnf4. Analiza przy pomocy cytometrii przepływowej tkanki limfoidalnej może być użyta w celu identyfikacji zmian w liczbie komórek B220+ w trzustce, węzłach chłonnych i grasicy.

P r z y k ł a d 10

Test ELISA typu bezpośredniego wiązania

Test ELISA typu bezpośredniego wiązania opracowano w celu scharakteryzowania zdolności do wiązania i hamowania aktywności ztnfr4 in vitro zarówno przez rozpuszczalne TACI-Ig, jak i rozpuszczalne BCMA-Ig.

studzienkową płytkę pokryto 1 μg/ml kozim przeciwciałem, anty-ludzkie Ig (Jackson Labs, Bar Harbor, MA) w buforze ELISA (0,1 M Na2HCO, pH 9,6, 0,02% NaN3) i inkubowano przez noc w 4°C. TACI, BCMA i niezwiązany receptor TNF taki, jak ztnfr10 (SEQ ID MR:42) jako kontrolę miareczkowano począwszy od 10 μg/ml poprzez 5-krocne rozcieńczenia do 320 ng/ml (oraz 0), a następnie koinkubowano z 2,5, 0,5 i 0,1 μg/ml biotynylowanego ztnf4 lub owalbuminy jako kontroli negatywnej przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Koinkubowaną mieszaninę receptor-biotynylowany ligand dodawano do 96 studzienkowych płytek pokrytych kozim przeciwciałem anty-ludzkie Ig. Następnie płytki płukano (ELISA C, 500 μl Tweed 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), 200 mg NaN3 i PBS do końcowej objętości 1 litra) i blokowano odczynnikiem Superblock (Pierce, Rockford, IL) inkubując w 37°C przez 2 godziny.

Płytki przemywano ponownie ELISA C i dodawano po 100 μl na studzienkę neutra-avidin-HRP w rozcieńczeniu 1:10000 w ELISA B (5 lub 10 μg BSA (Sigma) tak, by otrzymać odpowiednio 1% lub 2% BSA, 250 μl Tween 20 (Sigma), 100 mg NaN₃ PBS pH 7,2 (PBS, Sigma) do końcowej objętości 500 ml. Względnie, bufor może być przygotowany jako 1% lub 2% BSA w ELISA C. Następnie płytki inkubowano 10 mm w temperaturze pokojowej i sczytywano przy długości fali 492.

P r z y k ł a d 11

Test aktywności biologicznej

Opracowano test aktywności biologicznej w celu zmierzenia hamowania ludzkich komórek B stymulowanych rozpuszczalnym ztnf4 przez rozpuszczalne TACI-FC. Komórki B izolowano z komórek PBMNC przy użyciu kulek magnetycznych z CD19 oraz systemu separacji magnetycznej VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) zgodnie z zaleceniami producenta. Zmieszano oczyszczone komórki B z rozpuszczalnym ztnf4 (25 mg/ml) oraz zrekombinowanym ludzkim IL-4 (10 ng/ml Pharmingen) i wysiewano w 3 powtórzeniach na 95 studzienkowej płytce o zaokrąglonych denkach w zagęszczeniu 1 x 10⁵ komórek na studzienkę.

PL 211 033 B1

Rozpuszczalne TACI-FC rozcieńczono od 5 μg/ml do 6 ng/ml i inkubowano z komórkami B przez 5 dni, dodając przez noc 4 dnia 1 gCi ³H Tymidyny (Amersham) na studzienkę. Jako kontrolę rozpuszczalne TACI-FC inkubowano z komórkami B i IL-4 bez obecności ztnf4.

Komórki z płytek zbierano stosując urządzenie Packard plate harvester i liczono na czytniku Packard. Rozpuszczalny receptor TACI-Ig hamował zdolność rozpuszczalnego ztnf4 do stymulacji proliferacji komórek B in vitro zależnie od dawki. 10-krotny molarny nadmiar TACI-Ig zupełnie hamował proliferację ludzkich komórek B, w odpowiedzi na rozpuszczalne ztnf4 w obecności IL-4.

P r z y k ł a d 12

Test typu ORIGIN

Zbadano poziomy ztnf4 u osobników cierpiących na choroby takie, jak SLE lub RA, względem zdrowych osobników, wykorzystując test elektrochemiluminescencyjny. Krzywą wzorcową przygotowaną na podstawie rozpuszczalnego ludzkiego ztnf4 w stężeniach 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml 0,01 ng/ml i 0 ng/ml w buforze ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD). Próbki surowicy rozcieńczano w buforze ORIGIN. Standard i próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z biotynylowanym króliczym przeciwciałem anty-ludzki ztnf4-NFBV rozcieńczonym do stężenia 1 L g/ml w buforze do testu Origin (IGEN) oraz rutenylowanym króliczym przeciwciałem poliklonalnym antyludzki ztnf4-NF BV rozcieńczonym do stężenia 1 L g/ml w buforze do testu Origin (IGEN). Po inkubacji próbki wytrząsano i dodawano 0,4 mg/ml streptavidin Dynabeads (Dynal, Oslo, Norwary) do każdego standardu i próbki w ilości 50 L l na probówkę i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie próbki inkubowano i sczytywano na Origin Analyzer (Igen) zgodnie z zaleceniami producenta. Test Origin jest oparty na elektrochemiluminescencji i umożliwia odczyt w ECL.

Wykryto podwyższony poziom ztnf4 w próbkach surowicy zarówno z myszy NZBWF1/J, jak i myszy MRL/Mpj-Fas^1pr, które wykazywały daleko posunięte stadium stwardnienia kłębków nerkowych i choroby autoimmunologicznej.

P r z y k ł a d 13

Rozpuszczalne TACI-Ig w spontanicznym modelu SLE

Myszy NZBW wykazują spontaniczne symptomy SLE w wieku około 7-9 miesięcy. Myszom NZBW podawano TACI-FC w celu monitorowania jego hamującego efektu na komórki B po 5 tygodniach, po których średni poziom autoprzeciwciał komórek B jest uważany za wysoki.

100, ośmiotygodniowych samic myszy (NZBxNZW)F1 (Jackson Labs) podzielono na 6 grup po 15 myszy w grupie. Przed leczeniem, myszy monitorowano raz w miesiącu pod względem, występowania białek w moczu, jak również pobierano im krew w celu zachowania CBC i surowicy. Surowicę przeszukiwano pod kątem, obecności autoprzeciwciał. Ponieważ białkomocz jest głównym objawem, w stwardnieniu kłębków nerkowych, poziom białek w moczu mierzono w regularnych odstępach w trakcie trwania badań. Przed leczeniem zwierzęta zważono. Dozowanie rozpoczęto, gdy myszy osiągnęły 5 miesięcy. Myszy otrzymywały dootrzewnowe zastrzyki podłoża (PBS), ludzkiego IgG-FC (białko kontrolnej lub TACI-FC4 (białko testowe) trzy razy w tygodniu przez 5 tygodni.

Grupa (po 5 myszy)	Leczenie	Dawka
1	Nietraktowana kontrola
2	Tylko podłoże
3	Ludzkie IgG-FC	20 gg
4	Ludzkie IgG-FC	100 gg
5	Ludzkie TAGI-FC4	20 gg
6	Ludzkie TADI-FC4	100 gg

Myszom, pobierano krew dwukrotnie podczas podawania leku i przynajmniej 2 razy po leczeniu. Wartości białkomoczu oraz masy ciała odczytywano co 2 tygodnie po rozpoczęciu leczenia. Wartości białkomoczu oraz masy ciała odczytano po uśmierceniu zwierząt. Zmierzono masę trzustki, grasicy, wątroby z woreczkiem, wątroby, lewej nerki i mózgu. Trzustkę i grasicę podzielone w celu analizy FACS i analizy histologicznej. Do analizy histologicznej pobrano również ślinianki podrzuchwowe, krezkowy węzeł limfatyczny, płat wątrobowy z woreczkiem żółciowym, jelito grube, żołądek, jelito cienkie, trzustkę, prawą nerkę, gruczoł nadnercza, język z tchawicą i przełykiem, serce i płuca.

PL 211 033 B1

Figura 6 przedstawia podwyższony poziom ztnf4 w surowicy myszy NZBWF1 i MRL/1pr/1pr, który koreluje z rozwojem SLE. Górna ramka na Fig. 6A przedstawia korelację poziomów ztnf4 w surowicy i wieku, dla 68 NZBWF1 myszy w wieku od 10 do 40 tygodni i dla kontrolnych myszy NZB/B w wieku od 10 do 30 tygodni, środkowa ramka przestawia korelację z białkomoczem w trzech zakresach: śladowe do 20 mg/dl (T-30), 100-300 ng/dl i 2000 m.g/dl u myszy NZBWF1 w porównaniu z myszami NZB/B. Dolna ramka przedstawia poziomy ztnf4 z różnymi mianami przeciwciał anty-dwuniciowe DNA u myszy NZBWF1 w porównaniu z myszami NZB/B.

Figura 6B przestawia te same zależności dla 23 myszy MRL/1pr/1pr w wieku od 18 do 24 tygodni i dla 10 myszy kontrolnych MRL/MpJ w wieku 11 tygodni.

Figura 7 przedstawia wyniki analizy moczu. Myszy uważano za cierpiące na białkomocz, jeżeli pomiary były równe lub większe 100 mg/dl. (A) PBS, (B) ludzkie IgG FC, 100 mg, (C) ludzkie IgG FC, 20 mg, (D) ludzkie TAGI-IgG, 100 mg i (E) ludzkie TACI-IgG, 20 mg. Myszy traktowane rozpuszczalnym TACI IgG wykazywały obniżone poziomy białkomoczu.

Analiza krwi obiegowej traktowanych zwierząt wykazała, że liczba białych krwinek i limfocytów była zredukowana u myszy traktowanych TACI-FC (20 i 100 mg) w porównaniu z myszami traktowanymi FC (20 i 100 mg) i PBS, w 2 tygodnie od rozpoczęcia leczenia. Analiza FAC krwi obiegowej, pobranej 6 tygodni po leczeniu (2 tygodnie po ostatni podaniu) wykazała znaczne obniżenie procentowości komórek B w próbkach. Poziomy komórek B były obniżone nawet w 5 tygodni po ostatnim podaniu, ale nie aż tak znacząco. Tabela 9 przedstawia średnią (i odchylenie standardowe) dla myszy z każdej grupy. Obniżenie procentu komórek B w krwi obiegowej obserwowano również podczas leczenia.

T a b e l a 9

Leczenie	2 Tygodnie	5 Tygodnie
	% komórek B	% komórek T	% komórek B
PBS	26,05 (6,52)	67,05 (6,80)	20,83 (3,14)
100 mg FC	23,34 (5,77)	68,23 (7,30)	25,04 (8,07)
20 mg FC	24,09 (6,26)	65,27 (7,18)	18,96 (6,42)
100 mg TACI-FC	11,07 (5,03)	79,06 (6,71)	14,79 (4,76)
20 mg TACI-FC	16,37 (7,27)	69,72 (8,90)	19,14 (5,27)

P r z y k ł a d 14

Rozpuszczalne TACI-Ig u zdrowych myszy

TACI-FC podawano myszom Blab/C w celu monitorowania efektu u zdrowych myszy. 60 8-tygodniowych samic myszy Blab/C (HSD) podzielono na 12 grup po pięć myszy. Przed leczeniem myszom pobrano krew w celu zachowania surowicy i CBC oraz zważono. Grupy 1-9 otrzymały 12 dootrzewnowych zastrzyków podłoża (PBS) lub ludzkiego IgG-FC (białko kontrolne) lub TACI-FC4 (białko testowe) dziennie, myszy uśmiercono 14 dnia. Grupy 10 i 11 otrzymały dootrzewnowe zastrzyki trzy razy w tygodniu przez 2 tygodnie, myszy uśmiercono 14 dnia.

Grupa (po 5 myszy)	Leczenie	Dawka
1	2	3
1	Ludzkie TACI-FC4	200 mg
2	Ludzkie TACI-FC4	100 mg
3	Ludzkie TACI-FC4	20 gg
4	Ludzkie TACI-FC4	5 gg
5	Ludzkie FC4	200 gg
6	Ludzkie FC4	100 mg

PL 211 033 B1 ciąg dalszy

1	2	3
7	Ludzkie FC4	20 mg
8	Ludzkie FC4	5 mg
9	Tylko podłoże	Jak użyto
10	Ludzkie TACI-FC4	100 mg
11	Ludzkie FC4	100 mg
12	Nietraktowana kontrola

Krew pobrano 7 i 12 dnia. Pobrano krew i zważono osobniki po eutanazji. Zważono śledzionę, grasicę i mózg. Śledzionę i grasicę podzielono w celu analizy FACS i analizy histologicznej. Do analizy histologicznej pobrano również skórę, ślinianki podrzuchwowe, krezkowy węzeł limfatyczny, płat wątrobowy z woreczkiem żółciowym, jelito grube, żołądek, jelito cienkie, trzustkę, jajowód, macicę, szyjkę macicy, pęcherz, grasicę, mięśnie, prawą i lewą kość udową, mózg, prawą nerkę, gruczoł nadnercza, język z tchawicą i przełykiem, serce i płuca. Jak opisano w przykładzie 13, zaobserwowano obniżenie procentu komórek B 7 dnia (CBC) i 12 dnia (FACS) w obiegowej krwi pobranej z wszystkich TACI-FC4 traktowanych próbek w porównaniu z traktowanymi FC4 lub PBS. Dodatkowo, zaobserwowano około 50% obniżenie poziomu komórek B w śledzionach pobranych ze zwierząt traktowanych TACI-FC4 w porównaniu z myszami traktowanymi FC4 po 14 dniach.

P r z y k ł a d 15

Test ELISA anty-dwuniciowe DNA

Autoimmunogenność cechuje się wysokimi poziomami przeciwciał anty-dwuniciowe DNA. W celu zmierzenia poziomów przeciwciał anty-dwuniciowe DNA zarówno u myszy nadeksprymujące ztnf4, jak i myszach NZBW, opracowano test ELISA. 96 studzienkowe płytki mikrotitracyjne (Nunc) pokryto poli-L-lizyną (Sigma) (20 gl/ml w 0,1 M Tris pH 7.3), 75 μl/studzienkę i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano w dH₂O i pokrywano poli dAdT (Sigma) (20 gl/ml w 0,1 M Tris pH 7.3), 75 gl/studzienkę i inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano w dH2O i blokowano w 2% BSA (Sigma) w buforze Tris przez 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym przepłukiwano w dH2O.

Próbki surowicy pobrano z transgenicznych myszy ztnf4 opisanych w przykładzie 10 i myszy NZBW opisanych w przykładzie 11. Próbki surowicy rozcieńczano 1:50 w 1% BSA/2% BGG (Calbiochem) w buforze Tris. Rozcieńczone próbki miareczkowano do pokrytych płytek w rozcieńczeniach 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 i 1:6400 (50 gl/studzienka) a następnie inkubowano przez 90 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie płytki przepłukiwano w dH2O i dodawano kozie przeciwciała anty-mysie IgG-Fc-HRP (Cappel) rozcieńczone 1:1000 w 1% BSA/2%BGG - 50 gl/studzienka. Płytkę inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej, przepłukiwano 5 razy w dH2O i wywoływano w celu odczytania gęstości optycznej - 1 tabletka/10 ml Novo D - 100 gl/studzienka. Wywoływanie zatrzymano 1N H2SO4, 100 gl/studzienka i odczytywano OD przy 492 nm.

Figura 8 przedstawia poziomy przeciwciał anty-dwuniciowe DNA u dwóch transgenicznych myszy ztnf4 (23 tygodnie) dwóch nietransgenicznych myszy z tego samego miotu, w porównaniu z poziomami wykrytymi w surowicach myszy NZBWF1 (32 tygodnie) i MRL/1pr/1pr (19 tygodni).

P r z y k ł a d 16

Rozpuszczalne TACI-Ig w spontanicznym modelu ELE samic myszy PLxSJL F1 (12 tygodni, Jackson Labs) poddano podskórnemu szczepieniu 125 gg/mysz antygenu (białko proteolipidu mielinowego, PLP, pozycje 139-151), przygotowanych w kompletnym adjuwancie Freunda. Myszy podzielono na 5 grup po 5 myszy. Myszom podano dootrzewnowo 400 ng toksyny krztuśca w dniu 0 i dniu 2. Grupom podawano 1x, 10x lub 100x dawkę TACI, BCMA lub BR43x2, jednej grupie podawano wyłącznie podłoże, natomiast ostatnia grupa pozostała nietraktowana. Terapię prewencyjną rozpoczęto w dniu 0, zaś terapię interwencyjną rozpoczęto w dniu 7 lub po zauważeniu objawów klinicznych. Objawy chorobowe (utraca wagi, paraliż) objawiały się 10-14 dnia lub po 1 tygodniu. Zwierzęta badano codziennie ważąc i określając objawy kliniczne odpowiadające rozmiarowi symptomów. Kliniczne objawy EAE pojawiły się 10-14 dnia po podaniu

PL 211 033 B1 i trwały przez około tydzień. Po zakończeniu badań, wszystkie zwierzęta uśmiercono i poddano sekcji. Pobrano mózg i rdzeń kręgowy do analizy histologicznej lub zamrożono do analizy mRNA. Dane dotyczące wagi ciała i miarę objawów klinicznych przedstawiono indywidualnie i dla grupy.

Miara objawów klinicznych

Norma

0,5 Słaby, obniżona ruchliwość ogona

Bezwładny ogon (mysz nie może podnieść ogona podczas podnoszenia)

Bezwładny ogon, słabe łapy (mysz nie może podnieść ogona, może stać na tylnich łapach, ale łapy trzęsą się)

Paraliż (mysz nie może siedzieć z podkurczonymi łapami, ciągnie nogi za sobą)

Paraliż (mysz nie może ruszyć tylnymi łapami)

Porażenie cztero kończynowe (paraliż przednich łap lub chodzenie w kółko, może mieć przechył głowy)

Stan agonalny (mysz całkowicie sparaliżowana, nie może dosięgnąć jedzenia i picia, uśmiercić mysz)

P r z y k ł a d 17

Model TACI-FC i CIA Reumatoidalnego Zapalenia Stawów (RA)

Ośmiotygodniowe samce myszy DBA/1J (Jackson Labs) podzielono w grupy po 5 myszy. Myszom, podano dwa podskórne zastrzyki 50-100 gl 1 mg/ml kolagenu (pochodzenia kurzego lub bydlęcego) w odstępach trzytygodniowych. Jedna kontrola nie otrzymała zastrzyku. Pierwszy zastrzyk przygotowano w kompletnym adjuwancie Freunda, drugi w niekompletnym adjuwancie Freunda. TACI-FC podawano profilaktycznie w momencie lub przed drugim zastrzykiem, lub po tym, jak u zwierzęcia zaobserwowano miarę objawów klinicznych o wartości 2 i wyższej, utrzymującej się przynajmniej przez 24 godziny. Zwierzęta wykazywały symptomy zapalenia stawów po drugim zastrzyku kolagenowym, zwykle w 2-3 tygodniu. Postęp choroby mierzono w każdej łapie, stosując miarkę do mierzenie grubości łapy i przypisując odpowiednią miarę kliniczną do każdej łapy (0-3). Miara kliniczna, 0 - Norma, 1 - Stan zapalny w palcach, 2 - Łagodne zapalenie łap, 3 - Średnie zapalenie łap, 4 - Ciężkie zapalenie łap. Zwierzęta uśmiercano po wykryciu choroby przez okres 7 dni. Łapy zbierano w celu analiz histologicznych i analizy mRNA, natomiast surowicę pobierano do testów immunoglobulin i cytokin.

P r z y k ł a d 18

Neutralizujące przeciwciała TACI

Poliklonalne przeciwciała przeciwko peptydowi przygotowano poprzez immunizację dwóch samic królików New Zealand White peptydem huztnf4-1 SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID NR:59) lub peptydem huztnf4-2 SFKRGSALEEKENKELVKET (SEQ ID NR: 60). Peptydy syntetyzowano przy użyciu Applied Biosystems Model 431A (Applied Biosystems, Inc,. Foster City, CA) zgodnie z zaleceniami producenta. Peptydy łączono z białkami nośnikowymi KLH z aktywacją maleimidową. Każdemu królikowi zrobiono wstępne dootrzewnowe zastrzyki 200 gg peptydu w kompletnym adjuwancie Freunda, po których wykonano zastrzyki wzmagające 100 gg peptydu w niekompletnym adjuwancie Freunda co 3 tygodnie. 7-10 dni po podaniu drugiego zastrzyku wzmagającego (w sumie 3 zastrzyki), zwierzęta skrwawiono w celu pobrania surowicy, a następnie zwierzętom podawano zastrzyki wzmagające i skrwawiano je co 3 tygodnie.

Surowice królicze specyficzne wobec zcnf4 scharakteryzowano w teście ELISA przy użyciu 1 gg/ml peptydu użytego do wytworzenia przeciwciał (SEQ ID NR:59 i 60). Surowice dwóch królików przeciw huztnf4-1 (SEQ ID NR:59) miały miana wobec specyficznego peptydu w rozcieńczeniach 1:100000. Surowice dwóch królików przeciw huztnf4-2 (SEQ ID NR: 60) miały miana wobec specyficznego peptydu w rozcieńczeniach 1:5000000 oraz wobec zrekombinowanego białka pełnej długości (ztnf4 wytworzone w bakulowirusie z etykietką FLAG na końcu N (huztnf4s-NF-Bv) i ztnf4 wytworzonego w komórkach BHK z etykietką FLAG na końcu C) w rozcieńczeniach 1:5000000.

Poliklonalne przeciwciała specyficzne przeciw ztnf4 oczyszczono z króliczej surowicy przy użyciu chromatografii powinowactwa na kolumnie białkowej CNBR-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) przygotowanej z 10 mg peptydu (SEQ ID NR: 59 lub 60) na gram CNBr-SEPHAROSE, po czym dializowano w PBS przez noc. Przeciwciała wobec zcnf4 scharakteryzowano w teście ELISA używając 1 gg/ml odpowiedniego peptydu antygenowego lub zrekombinowanego białka pełnej długości (huztnf4s-NF-BV). Najniższy poziom wykrywalności (LLD) króliczego anty-huztnf4-1 oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciała specyficznego antygenu (peptyd huztnf4-1, SEQ ID NR:59) wynosił

PL 211 033 B1 ng/ml. Najniższy poziom wykrywalności (LLD) króliczego anty-huztnf4-2 oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciała specyficznego antygenu (peptyd huztnf4-2, SEQ ID NR: 60) wynosił 0,5 ng/ml. Najniższy poziom wykrywalności (LLD) króliczego anty-huztnf4-2 oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciała białka huztnf4s-NF-Bv wynosił 5 ng/ml.

Wytworzono również mysie monoklonalne przeciwciała i wyselekcjonowano pod względem, hamowania rozpuszczalnego ztnf4 wyznakowanego biotyną. Żadne z przeciwciał monoklonalnych przeciw TACI (248,14, 248,23, 248,24, 246,3) nie blokowało wiązania ztnf4 do BCMA. Przeciwciało monoklonalne to 248,23 obniżało wiązanie 10 ng/ml ztnf4-biotyna do około 50% w momencie, gdy pożywka była rozcieńczana do 1:243 i obniżała wiązanie do około 2x w nie rozcieńczonej pożywce. Przeciwciało monoklonalne to 246,3 obniżało wiązanie 10 ng/ml ztnf4-biotyna do około 50% w momencie, gdy pożywka była rozcieńczana od 1:243 do 1:181 i obniżała wiązanie do około 5x w nierozcieńczonej pożywce.

PL 211 033 B1

Lista sekwencji <110> ZymcGenetics. Inc.

<120> Zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała <130> 98-75 <15C> 097220,533 <151> 1999-01-0/ <160> 60 <Γ0> FastSEO for Windows Tersion 3.0 <21ϋ> 1 <211> 1192 <212> ONA <213^ Homo sapiens <220>

<221> COS <222> (6). .(746) <400> 1 gagta atg agt ggc ct.g ggc cgg ago agg ega ggt ggc cgg ago cgf gtg Met Se^r Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Tal

1

5

10

gac

cag

gag

ege

tgg

tea

ctc

age

tgc

ege

aag

gag

caa

ggc

P .A «Ί

Au p

o 1 n

G1U

Glu

Arg

irp

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

G ty

Lys

20

25

JO

ttc

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

atc

age

tgt

gee

tcc

atc

tgt

Phe

Tyr

Aso

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Al a

Ser

He

tys

35

40

45

993

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

agg

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

50

55

60

age

cca

gtg

aac

ctt

cca

gag

ctc

agg

aga

cag

cgg

agt

gga

gaa

Ser

Pro

Tal

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

η H

70

75

PL 211 033 B1

gtt gaa aac

aat tca gac aac

tcg gga agg tac caa gga ttg gag cac

290

Va 1 80

Glu

Asn

Asn Ser Asp 85

Asn

Ser Gly

Arg

Tyr 90

Gln Giy

Leu

Glu

His 95

aga

ggc

tca

gaa

gca

agt

cca

gct

ctc

ccg

ggg

ctg

aag

ctg

agt

gca

338

Arg Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

100

105

110

gat

cag

gtg

gcc

ctg

gtc

tac

agc

acg

ctg

ggg

ctc

tgc

ctg tgt

gcc

386

Asp

Gln

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

Ala

115

120

125

gtc

ctc

tgc

ttc

ctg

gtg

gcg

gtg

gcc

tgc

ttc

ctc

aag

agg

434

Val

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

130

135

140

ggg

gat

ccc

tgc

tcc

tgc

cag

ccc

cgc

tca

agg

ccc

cgt

caa

agt

ccg

482

Gly

Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gln

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gln

Ser

Pro

145

150

155

gcc

aag

tct

tcc

cag

gat

cac

gcg

atg

gaa

gcc

ggc

agc

cct

gtg

agc

530

Ala

Lys

Ser

Gln

Asp

His

Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Va 1

Ser

160

165

170

175

aca

tcc

ccc

gag

cca

gtg

gag

acc

tgc

agc

ttc

tgc

ttc

cct

gag

tgc

578

Thr

Ser

Pro

Glu

Pro

Va 1

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Cys

180

185

190

agg

gcg

ccc

a cg

cag

gag

agc

gca

gtc

acg

cct

ggg

acc

ccc

gac

ccc

626

Arg

Al a

Pro

Thr

Gln

Glu

Ser

Ala

Va 1

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

Pro

195

200

205

act

tgt

gct

gga

agg

tgg

ggg

tgc

cac

acc

agg

acc

aca

gtc

ctg

cag

674

Thr

Cys

Ala

Gly Arg Trp Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

Gln

210

215

220

cct

tgc

cca

cac

atc

cca

gac

agt

ggc

ctt

ggc

att

gtg

tgt

gtg

cct

722

Pro

Cys

Pro

His

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Ile

Val

Cys

Val

Pro

225

230

235

gcc cag gag ggg ggc cca ggt gca taaatggggg tcagggaggg aaaggaggag 776 Ala Gln Glu Gly Gly Pro Gly Ala 240 245

PL 211 033 B1 ggagagagat ggagaggagg ggagagagaa agagaggtgg ggagagggga gagagatatg 836 aggagagaga gacagaggag gcagagaggg agagaaacag aggagacaga gagggagaga 896 gagacagagg gagagagaga cagaggggaa gagaggcaga gagggaaaga ggcagagaag 956 gaaagaggca gagagggaga gaggcagaga gggagagagg cagagagaca gagagggaga 1016 gagggacaga gagagataga gcaggaggtc ggggcactct gagtcccagt tcccagtgca 1076 gctgtaggtc gtcatcacct aaccacacgt gcaataaagt cctcgtgcct gctgctcaca 1136 gcccccgaga gcccctcctc ctggagaata aaacctttgg cagctgccct tcctca 1192 <210> 2 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met

Ser

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

Arg

Va 1

Asp

1

5

10

15

Gin

Glu

Arg

Trp

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

20

25

30

Tyr

Asp

Hi s

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

35

40

45

Gin

Hi s

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

50

55

60

Pro

Va 1

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Va 1

65

70

75

80

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

Hi s

Arg

85

90

95

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Al a

Asp

100

105

110

Gin

Val

Al a

Leu

Va 1

Tyr

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

Al a

Va 1

115

120

125

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Al a

Va 1

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Gly

130

135

140

Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

Pro

Ala

145

150

155

160

Lys

Ser

Gin

Asp

Hi s

Ala

Met

G1 u

Al a

Gly

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

165

170

175

Ser

Pro

Glu

Pro

Va 1

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Cys

Arg

180

185

190

Ala

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

Ala

Val

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

195

200

205

Cys

Ala

Gly

Arg

Trp

Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

Gin

Pro

210

215

220

Cys

Pro

His

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Ile

Va 1

Cys

Va 1

Pro

Ala

225

230

235

240

Gin

Glu

Gly

Pro

Gly

Al a

PL 211 033 B1

245 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)...(360) <400> 3

atg Met 1

agt ggc

ctg ggc Leu Gly 5

cgg Arg

agc agg cga ggt ggc cgg agc cgt gtg gac

48

Ser

Gly

Ser

Arg

Gly Gly 10

Arg

Ser

Arg

Val 15

Asp

cag

gag

cgc

tgg

tca

ctc

agc

tgc

cgc

aag

gag

caa

ggc

aag

ttc

96

Gin

Glu

Arg

Trp

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

20

25

30

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

atc

agc

tgt

gcc

tcc

atc

tgt

gga

144

Tyr Asp

Hi s

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Al a

Ser

Ile

Cys

Gly

35

40

45

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

agg

agc

192

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

50

55

60

cca

gtg

aac

ctt

cca

gag

ctc

agg

aga

cag

cgg

agt

gga

gaa

gtt

240

Pro

Va 1

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Val

65

70

75

80

gaa

aac

aat

tca

gac

aac

tcg

gga

agg

tac

caa

gga

ttg

gag

cac

aga

288

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

Arg

85

90

95

ggc

tca

gaa

gca

agt

cca

gct

ctc

ccg

ggg

ctg

aag

ctg

agt

gca

gat

336

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

Asp

100

105

110

cag

gtg

gcc

ctg

gtc

tac

agc

acg

360

Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

115

120

PL 211 033 B1 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Ser Giy Leu Giy Arg

Ser

Arg Arg Giy

Gly

Arg

Ser Arg Vai Asp

1

5

10

15

Gin

Glu

Arg

Trp

Ser

Leu

Ser

Cys Arg

Lys

Glu

Gin

Giy

Lys

Phe

20

25

30

Tyr

Asp

Hi s

Leu

Arg Asp Cys

Ile Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys Gly

35

40

45

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

50

55

60

Pro

Va 1

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg Arg

Gin

Arg

Ser

Giy

Giu

Val

65

70

75

80

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Giy Arg Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

Hi s

Arg

85

90

95

Giy

Ser

Giu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Al a

Asp

100

105

110

Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

115

120

<210> 5 <211> 1377 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS

<222> (14)..	.(895)
<400> 5

agcatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg ega ggt ggc cgg 49

Met Ser Gly Leu Giy Arg Ser Arg Arg Giy Giy Arg

5 10

agc Ser

cgt Arg

gtg gac cag gag gag

ege ttt cca cag ggc ctg tgg acg ggg

Val Asp 15

Gin Glu

Glu

Arg 20

Phe

Pro

Gin

Gly Leu 25

Trp Thr

Gly

gtg

gct

atg

aga

tcc

tgc

ccc

gaa

gag

cag

tac

tgg

gat

cct

ctg

Val

Ala

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

Glu

Gin

Tyr

Trp Asp

Pro

Leu

30

35

40

PL 211 033 B1

ggt Gly 45

acc tgc atg

tcc tgc

aaa Lys

acc att tgc aac cat cag agc cag cgc

193

Thr

Cys

Met

Ser

Cys 50

Thr

Ile Cys Asn 55

His

Gin

Ser

Gin

Arg 60

acc

tgt

gca

gcc

ttc

tgc

agg

tca

ctc

agc

tgc

cgc

aag

gag

caa

ggc

241

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

G1 u

Gin

Gly

65

70

75

aag

ttc

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

atc

agc

tgt

gcc

tcc

atc

289

Lys

Phe

Tyr

Asp

HI s

Leu

Arg Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

80

85

90

tgt

gga

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

337

Cys

Gly

Gin

Hi s

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

95

100

105

agg

agc

cca

gtg

aac

ctt

cca

gag

ctc

agg

aga

cag

cgg

agt

gga

385

Arg

Ser

Pro

Va 1

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

110

115

120

gaa

gtt

gaa

aac

aat

tca

gac

aac

teg

gga

agg

tac

caa

gga

ttg

gag

433

G1 u

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

125

130

135

140

cac

aga

ggc

tca

gaa

gca

agt

cca

gct

ctc

ccg

ggg

ctg

aag

ctg

agt

481

Hi s

Arg

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

145

150

155

gca

gat

cag

gtg

gcc

ctg

gte

tac

agc

acg

ctg

ggg

ctc

tgc

ctg

tgt

529

Al a

Asp

Gin

Val

Ala

Leu

Va 1

Tyr

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

160

165

170

gcc

gte

ctc

tgc

ttc

ctg

gtg

gcg

gtg

gcc

tgc

ttc

ctc

aag

577

Al a

Va 1

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Val

Al a

Cys

Phe

Leu

Lys

175

180

185

agg

ggg

gat

ccc

tgc

tcc

tgc

cag

ccc

cgc

tca

agg

ccc

cgt

caa

agt

625

Arg

Gly Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

G1 n

Ser

190

195

200

ccg

gcc

aag

tct

tcc

cag

gat

cac

gcg

atg

gaa

gcc

ggc

agc

cct

gtg

673

Pro

Ala Lys

Ser

Gin

Asp

His

Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Va 1

205

210

215

220

PL 211 033 B1

agc Sen

aca tcc ccc gag cca

gtg gag acc tgc agc ttc tgc ttc cct gag

721

Thr

Ser

Pro

Glu 225

Pro

Va 1

Glu

Thr

Cys 230

Ser

Phe

Cys

Phe Pro Glu 235

tgc

agg

gcg

ccc

acg

cag

gag

agc

gca

gtc

acg

cct

ggg

acc

ccc

gac

769

Cys

Arg

Al a

Pro

Thr

Gl n

Glu

Ser

Ala

Va 1

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

240

245

250

ccc

act

tgt

gct

gga

agg

tgg

ggg

tgc

cac

acc

agg

acc

aca

gtc

ctg

817

Pro

Thr

Cys

Ala

Gly

Arg

Trp Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

255

260

265

cag

cct

tgc

cca

cac

atc

cca

gac

agt

ggc

ctt

ggc

att

gtg

tgt

gtg

865

Gln

Pro

Cys

Pro

Hi s

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Ile

Val

Cys

Va 1

270

275

280

cct

gcc

cag

gag

ggg

ggc

cca

ggt

gca

taa

atgggggtca gggagggaaa

915

Pro

Ala

Gln

Glu

Gly Gly

Pro

Gly

Ala

*

285

290

ggaggaggga gagagatgga gaggagggga gagagaaaga gaggtgggga gaggggagag 975 agatatgagg agagagagac agaggaggca gaaagggaga gaaacagagg agacagagag 1035 ggagagagag acagagggag agagagacag aggggaagag aggcagagag ggaaagaggc 1095 agagaaggaa agagacaggc agagaaggag agaggcagag agggagagag gcagagaggg 1155 agagaggcag agagacagag agggagagag ggacagagag agatagagca ggaggtcggg 1215 gcactctgag tcccagttcc cagtgcagct gtaggtcgtc atcacctaac cacacgtgca 1275 ataaagtccr cgtgcctgct gctcacagcc cccgagagcc cctcctcctg gagaataaaa 1335 cctttggcag ctgcccttcc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1377 <210> 6 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met

Ser

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

Arg

Va 1

Asp

1

5

10

15

Gln

Glu

Arg

Phe

Pro

Gin

Gly

Leu

Trp

Thr

Gly

Va 1

Al a

Met

Arg

20

25

30

Ser

Cys

Pro

Glu

Gln

Tyr

Trp

Asp

Pro

Leu

Gly

Thr

Cys

Met

35

40

45

Ser

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys

Asn

His

Gln

Ser

Gln

Arg

Thr

Cys

Ala

Al a

50

55

60

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gln

Gly

Lys

Phe

Tyr

Asp

65

70

75

80

PL 211 033 B1

His

Leu Leu

Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin His

85

90

95

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

Pro

Val

100

105

110

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Va 1

Glu

Asn

115

120

125

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly Arg Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

Arg Gly

Ser

130

135

140

Glu

Ala

Sen

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

Asp Gin

Val

145

150

155

160

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

Ala

Va 1

Leu

Cys

165

170

175

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg Gly Asp

Pro

180

185

190

Cys

Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

Pro

Ala

Lys

Ser

195

200

205

Sen

Gin

Asp

His

Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Va 1

Ser

Thr

Ser

Pro

210

215

220

Glu

Pro

Va 1

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Cys Arg

Ala

Pro

225

230

235

240

Thr

Gin

Glu

Ser

Ala

Va 1

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

Cys

Ala

245

250

255

Gly Arg

Trp Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Va 1

Leu

Gin

Pro

Cys

Pro

260

265

270

His

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Ile

Val

Cys

Va 1

Pro

Ala

Gin

Glu

275 280 285

Gly Gly Pro Gly Ala 290 <210> 7 <211> 995 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (219)...(773) <400> 7 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60 acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc 180 tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg gct ggg 236

Met Leu Gin Met Ala Gly 1 5

PL 211 033 B1

cag Gin

tgc Cys

tcc caa aat gaa tat ttt gac agt ttg ttg cat get tgc

ata Ile

284

Ser

Gin Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

Leu

Leu His

Al a 20

Cys

10

15

cct

tgt

caa

ctt

ega

tgt

tet

aat

act

cct

eta

aca

tgt

cag

332

Pro

Cys

Gin

Leu

Arg

Cys

Ser

Asn

Thr

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

25

30

35

cgt

tat

tgt

aat

gca

agt

gtg

acc

aat

tea

gtg

aaa

gga

acg

aat

gcg

380

Arg

Tyr

Cys

Asn

Ala

Ser

Va 1

Thr

Asn

Ser

Va 1

Lys

Gly

Thr

Asn

Ala

40

45

50

att

ctc

tgg

acc

tgt

ttg

gga

ctg

age

tta

ata

att

tet

ttg

gca

gtt

428

Ile

Leu

Trp

Thr

Cys

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ile

Ser

Leu

Ala

Va 1

55

60

65

70

ttc

gtg

eta

atg

ttt

ttg

eta

agg

aag

ata

age

tet

gaa

cca

tta

aag

476

Phe

Va 1

Leu

Met

Phe

Leu

Arg

Lys

Ile

Ser

Glu

Pro

Leu

Lys

75

80

85

gac

gag

ttt

aaa

aac

aca

gga

tea

ggt

ctc

ctg

ggc

atg

get

aac

att

524

Asp

Glu

Phe

Lys

Asn

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Gly

Met

Al a

Asn

Ile

90

95

100

gac

ctg

gaa

aag

age

agg

act

ggt

gat

gaa

att

ctt

ccg

aga

ggc

572

Asp

Leu

Glu

Lys

Ser

Arg

Thr

Gly Asp

Glu

Ile

Leu

Pro

Arg

Gly

105

110

115

ctc

gag

tac

acg

gtg

gaa

tgc

acc

tgt

gaa

gac

tgc

atc

aag

age

620

Leu

Glu

Tyr

Thr

Va 1

G1 u

Glu

Cys

Thr

Cys

Glu

Asp

Cys

Ile

Lys

Ser

120

125

130

aaa

ccg

aag

gtc

gac

tet

gac

cat

tgc

ttt

cca

ctc

cca

get

atg

gag

668

Lys

Pro

Lys

Val

Asp

Ser

Asp

Hi s

Cys

Phe

Pro

Leu

Pro

Ala

Met

Glu

135

140

145

150

gaa

ggc

gca

acc

att

ctt

gtc

acc

acg

aaa

acg

aat

gac

tat

tgc

aag

716

Glu

Gly

Ala

Thr

Ile

Leu

Val

Thr

Lys

Thr

Asn

Asp

Tyr

Cys

Lys

155

160

165

age

ctg

cca

get

ttg

agt

get

acg

gag

ata

gag

aaa

tea

att

tet

764

Ser

Leu

Pro

Ala

Leu

Ser

Ala

Thr

Glu

Ile

Glu

Lys

Ser

Ile

Ser

170 175 180

PL 211 033 B1 gct agg taa ttaaccattt cgactcgagc agtgccactt taaaaatctt 813

Ala Arg * ttgtcagaat agatgatgtg tcagatctct ttaggatgac tgtatttttc agttgccgat 873 acagcttttt gtcctctaac tgtggaaact ctttatgtta gatatatttc tctaggttac 933 tgttgggagc ttaatggtag aaacttcctt ggtttcatga ttaaagtctt tttttttcct 993 <210> 8 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <4OO> 8

Met

Leu

Gin

Met

Ala

Gly

Gin

Cys

Ser

Gin

Asn

Glu

Tyr

Phe

Asp

Ser

1

5

10

15

Leu

His

Ala

Cys

Ile

Pro

Cys

Gin

Leu

Arg

Cys

Ser

Asn

Thr

20

25

30

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

Arg

Tyr

Cys

Asn

Ala

Ser

Val

Thr

Asn

Ser

35

40

45

Va 1

Lys

Gly

Thr

Asn

Ala

Ile

Leu

Trp

Thr

Cys

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

50

55

60

Ile

Ser

Leu

Ala

Val

Phe

Val

Leu

Met

Phe

Leu

Arg

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Glu

Pro

Leu

Lys

Asp

Glu

Phe

Lys

Asn

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

85

90

95

Leu

Gly

Met

Ala

Asn

Ile

Asp

Leu

G1 u

Lys

Ser

Arg

Thr

G iy

Asp

Glu

100

105

110

Ile

Leu

Pro

Arg

Gly

Leu

Glu

Tyr

Thr

Val

Glu

Cys

Thr

Cys

115

120

125

Glu

Asp

Cys

Ile

Lys

Ser

Lys

Pro

Lys

Val

Asp

Ser

Asp

His

Cys

Phe

130

135

140

Pro

Leu

Pro

Ala

Met

Glu

Gly

Ala

Thr

Ile

Leu

Val

Thr

Lys

145

150

155

160

Thr

Asn

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ser

Leu

Pro

Ala

Leu

Ser

Ala

Thr

G1 u

165

170

175

Ile

Glu

Lys

Ser

Ile

Ser

Ala

Arg

180

<;

210>

9

<,

211>

245

212>

PRT

<

213>

Homo saj

ai en:

PL 211 033 B1 <400> 9

Gly

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

Arg

Val

Asp

Gin

Glu

Arg

1

5

10

15

Phe

Pro

Gin

Gly

Leu

Trp

Thr

Gly

Va1

Ala

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Gin

Tyr

Trp

Asp

Pro

Leu

Gly

Thr

Cys

Met

Ser

Cys

Lys

Thr

35

40

45

Ile

Cys

Asn

His

Gin

Ser

Gin

Arg

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

65

70

75

80

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

Gin

Hi s

Pro

Lys

Gin

Cys

85

90

95

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

Pro

Val

Asn

Leu

Pro

100

105

110

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

115

120

125

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

Arg

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

130

135

140

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

Asp

Gin

Va1

Ala

Leu

Va 1

Tyr

145

150

155

160

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

Ala

Val

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

165

170

175

Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Gly

Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin

180

185

190

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

Pro

Ala

Lys

Ser

Gin

Asp

His

195

200

205

Al a

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Ser

Pro

Glu

Pro

Val

Glu

210

215

220

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Cys

Arg

Ala

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

225

230

235

240

Ala Val Thr Pro Gly 245 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Motyw opisany jako domena z pseudo-powtórzeniem bogatym w cysteinę <221> Wariant.

<222> (1)...(2)

PL 211 033 B1 <223> Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny, lub brak <221> Wariant <222> (4)...(4) <223> Xaajest dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny <221> Wariant <222> (5)...(5) <223> Xaa jest glutaminą, kwasem glutaminowym lub lizyną Wariant (6) <221>

<222> (6).. <223>

Xaa jest glutaminą, kwasem glutaminowym, lizyną asparaginą, argininą, kwasem asparaginowym, histydyną Lub seryną <221> Wariant <222> (7)...(7) <223> Xaa jest glutaminą lub kwasem glutaminowym Wariant <221> <222> (8) <223>

(9)

Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny, lub brak Wariant <221>

<222> (10) <223>

.(11)

Xaajest tyrozyną, fenyloalaninąlub tryptofanem <221> ^Waiiant <222> (13)...(13)

223 Xaa jest dowolną resztą aminokwasową ^z wyjątkiem cysteiny Wariant <221>

<222> (16)...(17)

223 Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny Wariant <221>

<222> (19). <223>

Xaajest izoleucyną metioniną, leucynąlub waliną Wariant (19) <221>

PL 211 033 B1 <222> (20)...(20) ^<223> Xaa jest dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny Wariant <221>

<222> (22)...(24) <223= Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny <2?i> Wariant <222> (26)...(31) <2z3> Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny

Wariant <221>

<222> (32)...(33) <223> Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny, lub brak <221> Wariant <222> (35).. . Uo?

^ć Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny <221> Wariant <222> (37)...(37) <223> Xaa jest tyrozyną lub fenyloalaniną <221> Wariant <222> (39)...(40)

Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny, lub brak <400> 10

Xaa

Cys

Xaa

Asp

Xaa

Leu

Xaa

1

5

10

15

Xaa

Cys

Xaa

Cys

Xaa

Cys

Xaa

20

25

30

Xaa

Cys

Xaa

Cys

Xaa

35

40

<210>

<211>

<212>

<213>

360

DNA

Sekwencja sztuczna

PL 211 033 B1

<220>
<223>	Zdegenerowana sekwencja oligonukleotydowa kodująca
	colipeptyd o SEQ ID Nr 4
<221>	wariant
<222>	(1)...(360)
<223>	Każde N jest niezależnie A, T, G lub C
<400>	11

atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca rgargarmgn 60 tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt nmgngaytgy 120 athwsntgyc cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt ytgygaraay 180 aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws nggngargtn 240 garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg nwsngargcn 300 wsnccngcny tnccnggnyt naarytnwsn gcngaycarg tngcnytngt ntaywsnacn 360 <210> 12 <211> 741 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22C>

<223> .

Zdegenerowana sekwencja oligonukleotydowa kodująca polipeptyd o SEQ ID Nr 2 <221>

<222> (1)...(741) <223> .

wariant <4G0> 12 atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca rgargarmgn 60 tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt nmgngaytgy 120 athwsntgyg cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt ytgygaraay 180 aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws nggngargtn 240 garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg nwsngargcn 300 wsnccngcny tnccnggnyt naarytnwsn gcngaycarg tngcnytngt ntaywsnacn 360 ytnggnytnt gyytntgygc ngtnytntgy tgyttyytng tngcngtngc ntgyttyytn 420 aaraarmgng gngayccntg ywsntgycar ccnmgnwsnm gnccnmgnca rwsnccngcn 480 aarwsnwsnc argaycaygc natggargcn ggnwsnccng tnwsnacnws nccngarccn 540 gtngaracnt gywsnttytg yttyccngar tgymgngcnc cnacncarga rwsngcngtn 600 acnccnggna cnccngaycc nacntgygcn ggnmgntggg gntgycayac nmgnacnacn 660 gtnytncarc cntgyccnca yathccngay wsnggnytng gnathgtntg ygtnccngcn 720 cargarggng gnccr.ggngc n 741 <210> 13

PL 211 033 B1 <211> 8 <212> PRT ^<213> Sekwenc ja sztuczna <220>

<223> FLAG tag <400> 13

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

<210> 14 <211> 7 <212> PRT ^<213> Sekwencja	sztuczna
<220> <223>	Glu-Glu tag
<400> Glu Tyr	14 Met Pro Met 5	Glu
<210> <211> <212> <213>	15 24 DNA Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Olinukleo	tydZC19980

<400> 15 cgaagagcag tactgggatc ctct 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwenc:ja sztuczna <220>

<223> Olinukleotyd ZC19981 <40G> 16 gccaaggcca ctgtctggga tgt 23

PL 211 033 B1

<210>	17
<211>	1149
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<220>
<221>	CDS
<222>	(236)	.. .(1027)

<400> 17 gaattcggca cgaggcagaa aggagaaaat tcaggataac tctcctgagg ggtgagccaa gccctgccat gtagtgcacg caggacatca acaaacacag ataacaggaa atgatccatt ccctgtggtc acttattcta aaggccccaa ccttcaaagt tcaagtagtg atatggatga ctccacagaa agggagcagt cacgccttac ttcttgcctt aagaaaagag aagaa atg

Met

aaa ctg

aag gag

tgt gtt

tcc atc Ser Ile

ctc cca cgg aag gaa agc ccc tct

286

Lys

Leu

Lys

Glu 5

Cys

Val

Leu 10

Pro Arg

Lys

Glu

Ser 15

Pro

Ser

gte

ega

tcc

aaa

gac

gga

aag

ctg

gct

gca

acc

ttg

ctg

334

Val

Arg

Ser

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Ala

Thr

Leu

20

25

30

gca

ctg

tct

tgc

ctc

acg

gtg

tct

ttc

tac

cag

gtg

gcc

382

Ala

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Va 1

Val

Sen

Phe

Tyr

Gin

Val

Al a

35

40

45

gcc

ctg

caa

ggg

gac

ctg

gcc

agc

ctc

cgg

gca

gag

ctg

cag

ggc

cac

430

Ala

Leu

Gin

Gly Asp

Leu

Ala

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Leu

Gin

Gly

His

50

55

60

65

cac

gcg

gag

aag

ctg

cca

gca

gga

gca

gga

gcc

ccc

aag

gcc

ggc

ctg

478

Hi s

Ala

Glu

Lys

Leu

Pro

Ala

Gly

Ala

Gly

Ala

Pro

Lys

Ala

Gly

Leu

70

75

80

gag

gaa

gct

cca

gct

gte

acc

gcg

gga

ctg

aaa

atc

ttt

gaa

cca

526

Glu

Ala

Pro

Ala

Val

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Ile

Phe

Glu

Pro

85

90

95

gct

cca

gga

gaa

ggc

aac

tcc

agt

cag

aac

agc

aga

aat

aag

cgt

gcc

574

Ala

Pro

Gly

Glu

Gly

Asn

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

Asn

Lys

Arg

Ala

100 105 110

PL 211 033 B1

gtt cag ggt cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc ttg caa

ctg Leu

att Ile

622

Val Gin

Gly

Pro Glu Glu Thr 120

Va 1

Thr

Gin

Asp

Cys Leu 125

Gin

115

gca

gac

ago

gaa

aca

cca

act

ata

caa

aaa

gga

tet

tac

aca

ttt

gtt

670

Ala

Asp

Ser

Glu

Thr

Pro

Thr

Ile

Gin

Lys

Gly

Ser

Tyr

Thr

Phe

Va1

130

135

140

145

cca

tgg

ctt

ctc

age

ttt

aaa

agg

gga

agt

gee

eta

gaa

aaa

gag

718

Pro

Trp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg Gly

Ser

Ala

Leu

Glu

Lys

Glu

150

155

160

aat

aaa

ata

ttg

gtc

aaa

gaa

act

ggt

tac

ttt

ata

tat

ggt

cag

766

Asn

Lys

Ile

Leu

Va 1

Lys

Glu

Thr

Giy

tyr

Phe

Ile

Tyr Gly

Gin

165

170

175

gtt

tta

tat

act

gat

aag

acc

tac

gee

atg

gga

cat

eta

att

cag

agg

814

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp Lys

Thr

Tyr

Ala

Met

Gly

His

Leu

Ile

Gin

Arg

180

185

190

aag

gtc

cat

gtc

ttt

ggg

gat

gaa

ttg

agt

ctg

gtg

act

ttg

ttt

862

Lys

Va 1

His

Va 1

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

Va 1

Thr

Leu

Phe

195

200

205

ega

tgt

att

caa

aat

atg

cct

gaa

aca

eta

ccc

aat

tcc

tgc

tat

910

Arg

Cys

Ile

Gin

Asn

Met

Pro

Glu

Thr

Leu

Pro

Asn

Ser

Cys

Tyr

210

215

220

225

tea

get

ggc

att

gca

aaa

ctg

gaa

gga

gat

gaa

ctc

caa

ctt

gca

958

Ser

Ala

Gly

Ile

Ala

Lys

Leu

Glu

Gly

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

Ala

230

235

240

ata

cca

aga

gaa

aat

gca

caa

ata

tea

ctg gat

gga

gat

gtc

aca

ttt

1006

Ile

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

He

Ser

Leu Asp Gly Asp

Val

Thr

Phe

245

250

255

ttt ggt gca ttg aaa ctg ctg tgacctactt acaccatgtc tgtagctatt 1057

Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu

260 ttcctccctt tctctgtacc tctaagaaga aagaatctaa ctgaaaatac caaaaaaaaa 1117 aaaaaaaaaa aaaaaaccct cgagcggccg cc 1149 <210> 18 <211> 264

PL 211 033 B1

<212> PRT <213> Home

a sapiens

<.

400>

18

Met

Lys

Leu

Lys

Glu

Cys

Va 1

Ser

Ile

Leu

Pro

Arg

Lys

Glu

Ser

Pro

1

5

10

15

Ser

Va 1

Arg

Ser

Lys

Asp Gly

Lys

Leu

Ala

Al a

Thr

Leu

20

25

30

Leu

Al a

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Val

Va 1

Ser

Phe

Tyr

Gln

Va 1

35

40

45

Ala

Leu

Gln

Gly Asp

Leu

Ala

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Leu

Gln

Gly

50

55

60

His

Hi s

Al a

Gl u

Lys

Leu

Pro

Al a

Gly

Ala

Gly

Ala

Pro

Lys

Al a

Gly

65

70

75

80

Leu

Glu

Al a

Pro

Ala

Val

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Ile

Phe

Glu

Pro

85

90

95

Pro

Ala

Pro

Gly

Glu

Gly

Asn

Ser

Gln

Asn

Ser

Arg

Asn

Lys

Arg

100

105

110

Ala

Va 1

Gl n

Gly

Pro

Glu

Thr

Va 1

Thr

Gln

Asp Cys

Leu

Gln

Leu

115

120

125

He

Al a

Asp

Ser

Glu

Thr

Pro

Thr

Ile

Gln

Lys

Gly

Ser

Tyr

Thr

Phe

130

135

140

Val

Pro

Trp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg Gly

Ser

Al a

Leu

Glu

Lys

145

150

155

160

Glu

Asn

Lys

Ile

Leu

Va 1

Lys

Glu

Thr

Gly Tyr

Phe

Ile

lyr Gly

165

170

175

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr

Tyr

Al a

Met

Gly

Hi s

Leu

Ile

Gln

180

185

190

Arg

Lys

Va 1

His

Val

Phe

Gly Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

Va 1

Thr

Leu

195

200

205

Phe

Arg Cys

Ile

Gln

Asn

Met

Pro

Glu

Thr

Leu

Pro

Asn

Ser

Cys

210

215

220

Tyr

Ser

Ala

Gly

Ile

Ala

Lys

Leu

Glu

Gly Asp

Glu

Leu

Gln

Leu

225

230

235

240

Ala

Ile

Pro

Arg

Glu

Asn

Al a

Gln

Ile

Ser

Leu Asp Gly

Asp

Va 1

Thr

245

250

255

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

260 <210> 19 <211> 1430 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

PL 211 033 B1 <221> CDS <222> (102)...(848) <400> 19 ttggcgcagg agcgtgcgta ggattgctcg ctcacaacag gcacctgact ggtattgaaa 60 gccgagtctt cccttcctct ttaaaggatt ggtgaccagg c atg gct atg gca ttc 116

Met Ala Met Ala Phe

tgc ccc aaa gat cag

tac Tyr

tgg gac Trp Asp

1 tcc tca agg aaa tcc tgt gtc

5 tcc Ser

164

Cys

Pro Lys

Asp Gin 10

Ser Ser 15

Arg

Lys

Ser

Cys

Va 1 20

tgt

gca

ctg

acc

tgc

agc

cag

agg

agc

cag

cgc

acc

tgt

aca

gac

ttc

212

Cys

Al a

Leu

Thr

Cys

Ser

Gin

Arg

Ser

Gin

Arg

Thr

Cys

Thr

Asp

Phe

25

30

35

tgc

aaa

ttc

atc

aat

tgc

cga

aaa

gag

caa

ggc

agg

tac

gac

cat

260

Cys

Lys

Phe

Ile

Asn

Cys

Arg Lys

Glu

Gin

Gly Arg

Tyr

Asp

His

40

45

50

ctc

ctg

ggg

gcc

tgc

gtc

agc

tgt

gac

tcc

acc

tgc

aca

cag

cac

cct

308

Leu

Gly

Ala

Cys

Val

Ser

Cys

Asp

Ser

Thr

Cys

Thr

Gin

His

Pro

55

60

65

cag

tgt

gcc

cac

ttc

tgt

gag

aaa

agg

ccc

aga

agc

cag

gcg

aac

356

Gin

Cys

Ala

Hi s

Phe

Cys

Glu

Lys

Arg

Pro

Arg

Ser

Gin

Ala

Asn

70

75

80

85

ctc

cag

ccc

gag

ctc

ggg

aga

cca

cag

gcc

ggg

gag

gtg

gaa

gtc

agg

404

Leu

Gin

Pro Glu

Leu

Gly Arg

Pro

Gin

Ala

Gly

Glu

Val

Glu

Val

Arg

90

95

100

tca

gac

a3c

tca

gga

agg

cac

cag

gga

tet

gag

cat

ggt

cca

gga

ttg

452

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

His

Gin

Gly

Ser

Glu

His

Gly

Pro

Gly

Leu

105

110

115

agg

eta

agt

agc

gac

cag

ctg

act

ctc

tac

tgc

aca

ctg

ggg

gtc

tgc

500

Arg

Leu

Ser

Asp

Gin

Leu

Thr

Leu

Tyr Cys

Thr

Leu

Gly

Va 1

Cys

120

125

130

ctc

tgc

gcc

atc

ttc

tgc tgt

ttc

ttg

gtg gcc ttg

gcc

tcc

ttc

ctc

548

Leu

Cys

Ala

Ile

Phe

Cys Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Ala

Ser

Phe

Leu

135

140

145

PL 211 033 B1

agg cgt aga Arg Arg Arg 150

gga Gly

gag Glu

cca eta ccc agc cag cct gee ggg cca cgt ggg

596

Pro 155

Leu

Pro

Ser

Gin Pro 160

Ala

Gly

Pro

Arg

Gly 165

tca

caa

gca

aac

tct

ccc

cac

gee

cac

cgc

ccc

gtg

aca

gag

gct

tgc

644

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Pro

His

Ala

Hi s

Arg

Pro

Va1

Thr

Glu

Ala

Cys

170

175

180

gac

gag

gtg

acc

gcg

tca

ccc

cag

cct

gtg

gaa

acg

tgt

agc

ttc

tgc

692

Asp

Glu

Val

Thr

Ala

Ser

Pro

Gin

Pro

Va 1

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

185

190

195

ttc

ccg

gag

cgc

agt

tct

ccc

act

cag

gag

agc

gcg

ccg

cgt

teg

etc

740

Phe

Pro

Glu

Arg

Ser

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

Al a

Pro

Arg

Ser

Leu

200

205

210

ggg

a ta

cac

ggc

ttc

gcg

ggc

act

gee

ccg

cag

ccc

tgt

atg

cgt

783

Gly

Ile

His

Gly

Phe

Ala

Gly

Thr

Ala

Al a

Pro

Gin

Pro

Cys

Met

Arg

215

220

225

gca

aca

gta

ggc

ctg

ggt

gtc

ctg

cgc

gca

tcc

act

ggg

gac

gct

836

Ala

Thr

Mai

Gly

Leu

Gly

Va 1

Leu

Arg

Ala

Ser

Thr

Gly Asp

Ala

230

235

240

245

cgt ccg gca act tgacagcccg aaaaataaaa aagacaattt agaggatgga 888

Arg Pro Ala Thr gtgacagagg gggaaaggga tggagaagag acagatgaag acacgataaa ggaagcccgg 948 ctgcacccac gcagagcaac aaagcaacca cctgcagcgc ccacgttccc agcaccgcct 1008 gtgcctgccg ctgtgtccta tactttccag agcagtcaac ctgtgccttt tttctttagt 1068 cgagaaagat ggagaatgac cggcacctag cattaccctt acaattctta caaacaagtg 1128 gtctttccta tggccttagg cagatagctg agtgcagtgt ggatgtattt gtgatttaag 1188 taacttgtai gtgtatgtgc agattcgggg ttatgtcata tgtgcatgta tacgtgagtt 1248 gtgtgtctgt atgagttgtg tgtatatgtg cgcctataaa tatgtgtgtg aattctgtgc 1308 atgcagatgt gtgtgtacat atgtgtctgg ctgatgtggt atagccagaa agatgagggc 1368 ccttctaggt gaaggccaaa catctaaaaa ccatctaggt gatgggtgct cgtgccgaat 1428 tc 1430 <210> 20 <211> 249 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20

PL 211 033 B1

Met

Ala

Met

Ala

Phe

Cys

Pro

Lys

Asp

Gin

Tyr

Trp

Asp

Ser

Arg

1

5

10

15

Lys

Ser

Cys

Val

Ser

Cys

Ala

Leu

Thr

Cys

Ser

Gin

Arg

Ser

Gin

Arg

20

25

30

Thr

Cys

Thr

Asp

Phe

Cys

Lys

Phe

Ile

Asn

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

35

40

45

Arg

Tyr

Asp

His

Leu

Gly

Ala

Cys

Val

Ser

Cys

Asp

Ser

Thr

50

55

60

Cys

Thr

Gin

Hi S

Pro

Gin

Cys

Ala

His

Phe

Cys

Glu

Lys

Arg

Pro

65

70

75

80

Arg

Ser

Gin

Ala

Asn

Leu

Gin

Pro

Glu

Leu

dy

Arg

Pro

Gin

Ala

Gly

85

90

95

Glu

Val

Glu

Val

Arg

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

His

Gin

Gly

Ser

Glu

100

105

110

HI s

Gly

Pro

Gly

Leu

Arq

Leu

Ser

Asp

Gin

Leu

Thr

Leu

Tyr

Cys

115

120

125

Thr

Leu

Gly

Val

Cys

Leu

Cys

Al a

Ile

Phe

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

130

135

140

Leu

Ala

Ser

Phe

Leu

Arg

Gly

Glu

Pro

Leu

Pro

Ser

Gin

Pro

145

150

155

160

Ala

Gly

Pro

Arg

Gly

Ser

Gin

Al a

Asn

Ser

Pro

His

Ala

Hi s

Arg

Pro

165

170

175

Val

Thr

Glu

Ala

Cys

Asp

Glu

Val

Thr

Ala

Ser

Pro

Gin

Pro

Va 1

Glu

180

185

190

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Arg

Ser

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

195

200

205

Ala

Pro

Arg

Ser

Leu

Gly

Ile

His

Gly

Phe

Ala

Gly

Thr

Ala

Pro

210

215

220

Gin

Pro

Cys

Met

Arg

Ala

Thr

Va1

Gly

Leu

Gly

Va1

Leu

Arg

Ala

225

230

235

240

Ser

Thr

Gly

Asp

Al a

Arg

Pro

Ala

Thr

245 <210> 21 <211> 473 <212> DNA

Sekwencja sztuczna <220>

<223> Sonda do analizy typu Northern <400> 21 · ctgtggacgg gggtggctat gagatcctgc cccgaagagc agtactggga tcctctgctg 60 ggtacctgca tgtcctgcaa aaccatttgc aaccatcaga gccagcgcac ctgtgcagcc 120 ttctgcaggt cactcagctg ccgcaaggag caaggcaagt tctatgacca tctcctgagg 180

PL 211 033 B1 aactgcatca gagaacaagc gaagttgaaa gaagcaagtc agcacgctgg gctgtgcctc catctgtgga cagcacccta agcaatgtgc atacttctgt tcaggagccc agtgaacctt ccaccagagc tcaggagaca gcggagtgga acaattcaga caactcggga aggtaccaag gattggagca cagaggctca cagctctccc ggggctgaag ctgagtgcag atcaggtggc cctggtctac ggctctgcct gtgtgccgtc ctctgctgct tcctggtggc ggt

240

300

360

420

473

<210>	22
<211>	25
<212>	DNA
<213>	Sekwencja
<220>
<223>	ZC20061
<400>	22

sztuczna ctgtggacag gggtggctat gagat <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

^<223>oiigonukleotyd ZC20062 <400> 23 accgccacca ggaagcacag aggac <210> 24 <211> 256 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna . <220>

<223> Sonda do analizy typu Northern <400> 24 tgcgattctc tggacctgtt tgggactgag cttaataatt tctttggcag ttttcgtgct 60 aatgtttttg ctaaggaaga taagctctga accattaaag gacgagttta aaaacacagg 120 atcaggtctc ctgggcatgg ctaacattga cctggaaaag agcaggactg gtgatgaaat 180 tattcttccg agaggcctcg agtacacggt ggaagaatgc acctgtgaag actgcatcaa 240 gagcaaaccg aaggtc 256 <210> 25 <2U> 22

PL 211 033 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

^<223^> oligonukleotyd ' ZC21065 <4Q0> 25 tgcgattctc tggacctgtt tg

<210>	26
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Oligonukleotyd ZC21067
<400>	26

gaccttcggt ttgctcttga tg

<210>	27
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Oligónukleotya ZC24200
<400>	27

acactggggg tctgcctctg <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

^<223> oligonukleotyd ZC24201 <400> 28 gcgaagccgt gtatccc <210> 29 <211> 17 <212> DNA

PL 211 033 B1 ^<213> Sekwencja sztuczna <220>

^<223> l _01igonukleoty_{d zc2}4198 <400> 29 tctacagcac gctgggg <21Q> 30 <211> 16 <212> DNA ^<2^'^> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd ZC24199 <400> 30 gcacaagtgg ggtcgg <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> oligonukleotyd ZC24271 <400> 31 ttattgtaat gcaagtgtg ig <210> 32 <211> 17 <212> DNA sekwencja sztuczna <220>

<223>

Oligonukleotyd ZC4272 <400> 32 tagctgggag tggaaag <210> 33 <211> 20 <2I2> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 211 033 B1 <220>

<223> Oligonukleotyd ZC4495 <400> 33 tccaagcgtg accagttcag 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd ZC24496 <400> 34 agttggcttc tccatccc 18 <210> 35 <211> 1090 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 taactctcct gaggggtgag ccaagccctg ccatgtagtg cacgcaggac atcaacaaac 60 acagataaca ggaaatgatc cattccctgt ggtcacttat tctaaaggcc ccaaccttca 120 aagttcaagt agtgatatgg atgactccac agaaagggag cagccacgcc ttacttcttg 180 ccttaagaaa agagaagaaa tgaaactgaa ggagtgtgtt tccatcctcc cacggaagga 240 aagcccctct gtccgatcct ccaaagacgg aaagctgctg gctgcaacct tgctgctggc 300 actgctgtct tgctgcctca cggtggtgtc tttctaccag gtggccgccc tgcaagggga 360 cctggccagc ctccgggcag agctgcaggg ccaccacgcg gagaagctgc cagcaggagc 420 aggagccccc aaggccggcc tggaggaagc tccagctgtc accgcgggac tgaaaatctt 480 tgaaccacca gctccaggag aaggcaactc cagtcagaac agcagaaata agcgtgccgt 540 tcagggtcca gaagaaacag tcactcaaga ctgcttgcaa ctgattgcag acagtgaaac 600 accaactata caaaaaggat cttacacatt tgttccatgg cttctcagct ttaaaagggg 660 aagtgcccta gaagaaaaag agaataaaat atcggtcaaa gaaactggtt acttttttat 720 atatggtcag gttttatata ctgataagac ctacgccatg ggacatctaa ttcagaggaa 780 gaaggtccat gtctttgggg atgaattgag tctggtgact ttgtttcgat gtattcaaaa 840 tatgcctgaa acactaccca ataattcctg ctattcagct ggcattgcaa aactggaaga 900 aggagatgaa ctccaacttg caataccaag agaaaatgca caaatatcac tggatggaga 960 tgtcacattt tttggtgcat tgaaactgct gtgacctact tacaccatgt ctgtagctat 1020 ttucctccct ttctctgtac cuctaagaag aaagaatcta actgaaaata ccaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa 1090 <210> 36

PL 211 033 B1 <210 35 <212> ONA <213> _c , .

Sekwencja sztuczna <220=* <223> Oligonukleotyd <400 36 cgcgcggttt aaacgccacc atggatgact ccaca

<210>	37
<211>	32
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220
<223>	Oligonukleotyd
<400=*	37

gtatacggcg cgcctcacag cagtttcaat gc

<210>	38
<211>	25
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Oligonukleotyd ZC17251
<400>	38

tctggacgtc ctcctgctgg tatag <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213>

Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd ZC17252 <400=* 39 ggtatggagc aaggggcaag ttggg <210 40 <211=* 27

PL 211 033 B1 <212> DNA <213> i sekwencja sztuczna <220>

<223> oligonukleotyd ZC17156 <400> 40 gagtggcaac ttccagggcc aggagag 2

<210	41
<211>	27
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Oligonukleotyd ZC17157
<400>	41

cttttgctag cctcaaccct gactatc 27 <210> 42 <211> 813 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ggcacagcac ggggcgatgg gcgcgtttcg ggccctgtgc ggcctggcgc tgctytgcgc 60 gctcagcctg ggtcagcgcc ccaccggggg tcccgggtgc ggccctgggc gcctcctgct 120 tgggacggga acggacgcgc gctgctgccg ggttcacacg acgcgctgct gccgcgatta 180 cccgggcgag gagtgctgtt ccgagtggga ctgcatgtgt gtccagcctg aattccactg 240 cggagaccct tgctgcacga cctgccggca ccacccttgt cccccaggcc agggggtaca 300 gtcccagggg aaattcagtt ttggcttcca gtgtatcgac tgtgcctcgg ggaccttctc 360 cgggggccac gaaggccact gcaaaccttg gacagactgc acccagttcg ggtttctcac 420 tgtgttccct gggaacaaga cccacaacgc tgtgtgcgtc ccagggtccc cgccggcaga 480 gccgcttggg tggctgaccg tcgtcctcct ggccgtggcc gcctgcgtcc tcctcctgac 540 ctcggcccag cttggactgc acatctggca gctgaggagt cagtgcatgt ggccccgaga 600 gacccagctg ctgctggagg tgccgccgtc gaccgaagac gccagaagct gccagttccc 660 cgaggaagag cggggcgagc gatcggcaga ggagaagggg cggctgggag acctgtgggt 720 gtgagcctgg ctgtcctccg gggccaccga ccgcagccag cccctcccca ggagctcccc 780 aggccgcagg gctctgcgtt ctgctctggg ccg 813 <21Q> 43 <211> 44 <212> DMA <213> Sekwencja sztuczna

PL 211 033 B1 <220>

^<223> Oligonukleotyd ZC10.134 <400> 43 atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac 44

<210>	44
<211>	35
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Oligonukleotyd ZC10135
<4Q0>	44

ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag 35 <210> 45 <2U> 768 <212> DNA <213> Homo sapiens <220 <221> CDS <222> (7)...(759) <223> .

Sekwencja IgFc <400> 45 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

1

5

10

aga

tgg

gtc

ctg

tcc

gag

ccc

aga

tct

tca

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

96

Arg

Trp

Val

Leu

Ser

Glu

Pro

Arg

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

15

20

25

30

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

35

40

45

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

192

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

50

55

60

PL 211 033 B1

gte aca tgc gtg gtg

atg gac

gtg agc Val Ser 70

cac His

gaa gac cct gag gte aag

240

Val Thr

Cys Val Val 65

Val

As ρ

Glu

Asp

Pro Glu 75

Val

Lys

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

288

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp Gly

Val

Glu

tal

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

80

85

90

ccg

cgg

gag

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gte

agc

gte

ctc

336

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr Arg

Va 1

Va I

Ser

Val

Leu

95

100

105

110

acc

gte

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

384

Thr

Va 1

Leu

His

Gin

Asp Trp

Leu

Asn

Gly Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

115

120

125

gte

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

tcc

atc

aag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

432

va 1

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

130

135

140

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

480

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

145

150

155

cgg

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gte

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gte

aaa

528

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

160

165

170

ggc

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

576

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

175

180

185

190

ccg'

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg ctg

gac

tcc

gac

ggc

624

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp Gly

195

200

205

tcc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

672

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Va1

Asp Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

cag

ggg

aac

gte

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat gag

gct

ctg

cac

aac

720

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

225

230

235

PL 211 033 B1 cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taatctaga His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

768

240

245

250 <210> 46 <211> 52 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd ZC15345 <400> 46 ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc cc 52 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213>

Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd ZC15347 <400> 47 ggatrctaga ttttataccc ggagacaggg a <210> 48 <211> 55 <212> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna <220=* <223> Oligonukleotyd ZC15517 <400> 48 ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213^> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Oligonukleotyd ZC15530

PL 211 033 B1 <400> 49 tgggagggct ttgttgga

<210>	50
<211>	42
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Oligonukleotyd ZC15518
<400>	50

tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc

<210>	51
<211>	57
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Oligonukleotyd ZC15516
<400>	51

ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg <210> 52 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy <400> 52 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg <210> 53 <211> 48 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy

PL 211 033 B1 <400 53 gcatgtgtga gttttgtctg aagatctggg ctccttcagc cccgggag 43

<210>	54
<211>	59
<212>	DNA
<213>	Sekwencj	a sztuczna
<22(0
<223>	Starter	oligonukleotydowy
<400>	54

ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59

<210>	55
<211>	59
<212>	DNA
<213>	Sekwencj	a sztuczna
<220
<223>	Starter	oligonukleotydowy
<400>	55

gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tccttcagcc ccgggagag 59

<210>	56
<211>	60
<212>	DNA
<213>	Sekwencj	a sztuczna
<220>
<223>	Starter	oligonukleotydowy
<400>	56

gcacagaggc tcagaagcaa gtccagctct cccggggctg aaggagccca gatcttcaga 60

<210>	57
<211>	56
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy
<400>	57

PL 211 033 B1 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag acaggg 56

<210>	58
<211>	59
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220
<223>	Starter oligonukleotydowy
<400>	58

ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt gtgaccaatt cagagcccag atcttcaga 59

	<210>	59
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Sekwencja sztuczna
	<220>
	<223>	Peptyd przeciwciała
	<400>	59
Ser	Ala Gly	Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly	Pro	Glu	Leu	Gin	Leu Ala
1		5 10					15
Ile	Pro Arg	Glu
		20
	<210>	60
	<211>	20
	<212>	PRT
	<213>	Sekwencja sztuczna
	<220>
	<223>	Peptyd przeciwciała
	<400>	60
Ser	Phe Lys	Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu	Lys	Glu	Asn	Lys	Glu Leu
1		5 10					15
Val	Lys Glu	Thr

PL 211 033 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie związku wybranego z grupy obejmują cej

a) polipeptyd zawieraj ą cy pozakomórkową domenę BR43x2 (SEQ ID nr: 2);

b) polipeptyd o sekwencji SEQ ID nr: 4; i

c) polipeptyd zawierają cy sekwencję SEQ ID nr: 10, do wytwarzania leku do leczenia astmy, zapalenia oskrzeli, rozedmy płuc, schyłkowego zapalenia nerek, neuropatii lekkiego łańcucha, skrobiawicy, zapalenia, nefropatii błoniastej, nefropatii IgA, choroby Berger'a, nefropatii IgM, choroby Goodpastur'a, postzakaźnego zapalenia kłębuszków nerkowych, choroby mezangialno-rozplemowej, zmian minimalnych w zespole nerczycowym, lub wtórnego zapalenia kłębuszków nerkowych lub zapalenia naczyń krwionośnych związanego z toczniem układowym, lub hamowania wytwarzania przeciwciał związanych z chorobą autoimmunologiczną u ssaka przez hamowanie sprzęgania ztnf4-receptor BR43X2, TACI lub BCMA.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniany związek stanowi białko fuzyjne złożone z pierwszej części i części drugiej, połączonych wiązaniem peptydowym, a wspomniana część pierwsza zawiera polipeptyd zawierający reszty aminokwasowe 25-58 SEQ ID nr: 2; oraz część drugą zawierającą inny polipeptyd.
3. Zastosowanie wedł ug zastrz. 2, znamienne tym, ż e pierwsza część zawiera polipeptyd składający się z reszt aminokwasowych 59-120 w SEQ ID nr: 2.
4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że pierwsza część jest polipeptydem zawierającym domenę pozakomórkową BR43x2 (SEQ ID nr: 2).
5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że pierwsza część jest polipeptydem o sekwencji SEQ ID nr: 4.
6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniany związek jest polipeptydem zawierającym sekwencję SEQ ID nr: 10 przy czym wspomniana sekwencja obejmuje reszty aminokwasowe 34-66 SEQ ID nr: 6 i reszty aminokwasowe 71-104 SEQ ID nr: 6.
7. Zastosowanie według zastrz. 2-5, znamienne tym, ż e wspomniana druga część jest stałym regionem łańcucha ciężkiego immunoglobuliny.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że wspomniany stały region łańcucha ciężkiego jest stałym; regionem łańcucha ciężkiego immunoglobuliny ludzkiej.
9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że wspomniany stały region łańcucha ciężkiego immunoglobuliny ludzkiej jest stałym regionem łańcucha ciężkiego immunoglobuliny ludzkie IgGl.
10. Zastosowanie według zastrz. 7-9, znamienne tym, że wspomniany lek zawiera multimer białek fuzyjnych.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że wspomniany lek zawiera stały region łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, który zawiera dwa regiony stałe i pozbawiony jest domeny zmiennej.
12. Zastosowanie związku wybranego z grupy obejmującej:

a) przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem o sekwencji SEQ ID nr: 2; i

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem o sekwencji SEQ ID nr: 4; do wytwarzania leku do leczenia astmy, zapalenia oskrzeli, rozedmy płuc, schyłkowego zapalenia nerek, neuropatii lekkiego łańcucha, skrobiawicy, zapalenia, nefropatii błoniastej, nefropatii IgA, choroby Berger'a, nefropatii IgM, choroby Goodpastur'a, postzakaźnego zapalenia kłębuszków nerkowych, choroby mezangialno-rozplemowej, zmian minimalnych w zespole nerczycowym, lub wtórnego zapalenia kłębuszków nerkowych lub zapalenia naczyń krwionośnych związanego z toczniem układowym, lub hamowania wytwarzania przeciwciał związanych z chorobą autoimmunologiczną u ssaka przez hamowanie sprzęgania ztnf4-receptor BR43x2.
13. Zastosowanie według zastrz. 1-12, znamienne tym, że wytwarzanie wspomnianego przeciwciała jest związane z chorobą autoimmunologiczną wybraną z układowego toczenia rumieniowatego, ciężką miastenią, stwardnieniem rozsianym lub reumatoidalnym zapaleniem stawów.
14. Zastosowanie według zastrz. 1-12, znamienne tym, że wytwarzanie wspomnianego przeciwciała jest związane z choroba autoimmunologiczną wybraną z cukrzycy insulinozależnej lub choroby Crohn'a.

PL 211 033 B1
15. Zastosowanie według zastrz. 1-12, znamienne tym, że wspomnianą chorobą nerek jest zapalenie kłębuszków nerkowych, zapalenie naczyń, zapalenie nerek lub odmiedniczkowe zapalenie nerek.
16. Zastosowanie według zastrz. 1-12, znamienne tym, że wspomniane zapalenie jest związane z bólem stawowym, obrzękiem lub szokiem septycznym.
17. Zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem SEQ ID nr: 6 do wytwarzania leku do leczenia astmy, zapalenia oskrzeli lub rozedmy płuc u ssaka, przez hamowanie sprzęgania receptor TACI-ztnf4.
18. Zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem SEQ ID nr: 18, do wytwarzania leku do hamowania wytwarzania przeciwciała zwią zanego z toczeniem rumieniowatym układowym u ssaka przez hamowanie sprzęgania ztnf4-receptor-