PL210872B1 - Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych oraz wzbogacona populacja komórek macierzystych i populacja komórek potomnych - Google Patents
Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych oraz wzbogacona populacja komórek macierzystych i populacja komórek potomnychInfo
- Publication number
- PL210872B1 PL210872B1 PL374312A PL37431202A PL210872B1 PL 210872 B1 PL210872 B1 PL 210872B1 PL 374312 A PL374312 A PL 374312A PL 37431202 A PL37431202 A PL 37431202A PL 210872 B1 PL210872 B1 PL 210872B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- population
- stem cells
- enriched
- endothelial
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 265
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 title claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 374
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 38
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 38
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 38
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 38
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 31
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 claims description 31
- 101000606506 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta Proteins 0.000 claims description 30
- 102100039808 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta Human genes 0.000 claims description 30
- 102100029761 Cadherin-5 Human genes 0.000 claims description 20
- 101000794587 Homo sapiens Cadherin-5 Proteins 0.000 claims description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 20
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims description 16
- 102100022014 Angiopoietin-1 receptor Human genes 0.000 claims description 15
- 101000753291 Homo sapiens Angiopoietin-1 receptor Proteins 0.000 claims description 15
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims description 10
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims description 7
- 210000004269 weibel-palade body Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 5
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 59
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 18
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 18
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 18
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 18
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 17
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 13
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 13
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 12
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 9
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- -1 for example Proteins 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 6
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 description 5
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 description 5
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 5
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101710204281 Growth/differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 2
- 102100035368 Growth/differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000016946 TWEAK Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010014401 TWEAK Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100024584 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12 Human genes 0.000 description 2
- 101710097155 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12 Proteins 0.000 description 2
- 102100028786 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A Human genes 0.000 description 2
- 101710178416 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A Proteins 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 2
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 2
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 2
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 2
- MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 230000000982 vasogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJOHVEQSYPOERL-SHEAVXILSA-N (e)-n-[(4r,4as,7ar,12br)-3-(cyclopropylmethyl)-9-hydroxy-7-oxo-2,4,5,6,7a,13-hexahydro-1h-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-4a-yl]-3-(4-methylphenyl)prop-2-enamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1\C=C\C(=O)N[C@]1(CCC(=O)[C@@H]2O3)[C@H]4CC5=CC=C(O)C3=C5[C@]12CCN4CC1CC1 PJOHVEQSYPOERL-SHEAVXILSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005465 AC133 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000005908 AC133 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000009088 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034608 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241001213911 Avian retroviruses Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241001436672 Bhatia Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 101100008047 Caenorhabditis elegans cut-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 description 1
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000037408 Device failure Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000013875 Heart injury Diseases 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101001019598 Homo sapiens Interleukin-17 receptor A Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102100035018 Interleukin-17 receptor A Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 102000015215 Stem Cell Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 229920001938 Vegetable gum Polymers 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002729 catgut Substances 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000009028 cell transition Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013552 cultured cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000005786 degenerative changes Effects 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 102000003977 fibroblast growth factor 18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000370 fibroblast growth factor 18 Proteins 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035926 haptotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011345 viscous material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
- C12N5/0691—Vascular smooth muscle cells; 3D culture thereof, e.g. models of blood vessels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
- C12N5/0692—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Description
Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 374312 (22) Data zgłoszenia: 20.12.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
20.12.2002, PCT/US02/041161 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
24.07.2003, WO03/060077 (11) 210872 (13) B1 (51) Int.Cl.
C12N 5/02 (2006.01) A01N 1/02 (2006.01) C12N 15/86 (2006.01) A01N 63/00 (2006.01)
Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej (54) populacji komórek macierzystych oraz wzbogacona populacja komórek macierzystych i populacja komórek potomnych (73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:
21.12.2001, US, 60/343,498 (43) Zgłoszenie ogłoszono:
03.10.2005 BUP 20/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.03.2012 WUP 03/12
IMMUNEX CORPORATION, Thousand Oaks, US (72) Twórca(y) wynalazku:
WILLIAM C. FANSLOW III, Normandy Park, US ANNE-MARIE C. ROUSSEAU, Seattle, US THOMAS O. DANIEL, Bainbridge Island, US (74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Ewa Malewska
PL 210 872 B1
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Obecny wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, a także wzbogaconej populacji komórek macierzystych i populacji komórek potomnych oraz ich wykorzystania, przy czym komórki macierzyste cechują się zdolnością do odnowy oraz zdolnością do wytworzenia komórek śródbłonkowych i/lub śródbłonkowopodobnych.
Tło wynalazku
Organizm ssaka składa się z wielu typów komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania (lineage-committed cells), z których powstają różne tkanki organizmu ssaka. Pomimo różnorodności natury, morfologii, charakterystyki oraz funkcji takich komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania, obecnie uważa się, że większość - jeśli nie wszystkie, komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania wywodzi się z różnorodnych komórek macierzystych, z których mogą rozwijać się pojedyncze lub liczniejsze komórki o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania organizmu ssaka. Takie komórki macierzyste stanowią jedynie niewielki odsetek wszystkich komórek obecnych w organizmie oraz mogą się zmieniać stosownie do ich względnego ukierunkowania na tworzenie określonego typu komórek. Ponadto, nie jest wiadomo, jakie markery związane z komórkami o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania występują również na komórkach macierzystych. Jeden marker, o którym doniesiono, że występuje na komórkach macierzystych - CD34, można znaleźć na znaczącej ilości komórek potomnych, o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania. W szczególności, komórki-B (CD19+) oraz komórki mieloidalne (CD33+) stanowią 80-90% populacji CD34+. Ponadto, kombinacja CD3, 8, 10, 15, 19, 20 oraz 33 będzie obecna na ponad 90% wszystkich komórek CD34+. Zatem, z uwagi na niewielki udział komórek macierzystych w ogólnej ilości komórek w szpiku kostnym, niepewność co do markerów związanych z komórkami macierzystymi jako różnymi od bardziej zróżnicowanych komórek oraz generalnie brak możliwości wykrycia metodami prób biologicznych ludzkich komórek macierzystych identyfikacja oraz oczyszczenie komórek macierzystych była wątpliwa.
Komórki śródbłonkowe są komórkowymi jednostkami organizacyjnymi struktur naczyniowych. Ich powstanie, ekspansja oraz wbudowanie w naczynia krwionośne warunkują organogenezę podczas rozwoju embrionalnego. Podczas angiogenezy, komórki śródbłonkowe w istniejących naczyniach są aktywowane przez czynniki angiogenezy takie jak TGF, FGF oraz VEGF. Nowe naczynia powstają w wyniku proliferacji i migracji komórek, a takż e wydł u ż ania i rozgałęziania istnieją cych naczyń .
Niezbędna jest identyfikacja łatwo dostępnego źródła komórek macierzystych, które mogą powodować powstawanie komórek śródbłonkowych. Potrzeba ta jest szczególnie ostra w stosunku do komórek macierzystych pochodzących od dorosłych w świetle ostatnio wprowadzonych restrykcji w wykorzystywaniu funduszy federalnych do finansowania badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi. Posiadanie takich komórek macierzystych pozwoli na identyfikację czynników wzrostu związanych z regeneracją komórek śródbłonkowych. Ponadto, może okazać się, że istnieją jeszcze nieodkryte czynniki wzrostu lub inne czynniki biologiczne (przykładowo, czynniki transkrypcji) związane ze wczesnymi etapami dedykacji komórek macierzystych do wykształcania komórek śródbłonkowych, z zapobieganiem takiej dedykacji oraz negatywną kontrolą proliferacji komórek macierzystych. Dostępność komórek macierzystych byłaby wysoce pożądana i użyteczna przy transplantacji naczyń, inżynierii tkankowej oraz przy regulacji i zapobieganiu angiogenezie i naczyniogenezie. Komórki macierzyste oraz ich potomstwo mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu uszkodzeń i naprawie mięśnia sercowego. Takie komórki macierzyste mogłyby być również stosowane do wprowadzania genu do organizmu w ramach reżimu terapii genowej.
Obecny wynalazek odpowiada na to zapotrzebowanie.
Wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, na drodze pozytywnej selekcji z populacji oryginalnej, przy czym wspomniane komórki macierzyste cechują się zdolnością do wytworzenia komórek śródbłonkowych i/lub śródbłonkowo-podobnych.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+ w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek, korzystnie w stężeniu co najmniej około 1000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek, a korzystniej - w stężeniu od około 1000-krotnie do około 4000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.
PL 210 872 B1
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera jeden lub więcej niż jeden z markerów wybranych z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 w stężeniu wyższym niż we wspomnianej oryginalnej populacji komórek.
Korzystnie, wspomnianym przeciwciałem jest monoklonalne przeciwciało.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniane wzbogacanie obejmuje:
(a) kontaktowanie wspomnianej oryginalnej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek związanych ze wspomnianą cząsteczką;
(b) kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z markerem wybranym z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz usuwanie ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek niezwiązanych ze wspomnianą cząsteczką;
(c) kontaktowanie wspomnianej oryginalnej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek niezwiązanych ze wspomnianą cząsteczką;
(d) kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz usuwanie komórek, które są związane ze wspomnianą cząsteczką ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- lub VEGFR2, w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek, korzystnie w stężeniu co najmniej około 1000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek, a korzystniej - w stężeniu od około 1000-krotnie do około 4000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest ponadto:
(a) wzbogacona w komórki macierzyste CD34+ lub CD45+;
(b) wzbogacona w komórki macierzyste CD34- oraz CD45+;
(c) wzbogacona w komórki macierzyste CD34+ oraz CD45+.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniane przeciwciało połączone jest z wykrywalną jednostką lub jest przyłączone do stałego podłoża.
Korzystnie, wspomniana wykrywalna jednostka jest ugrupowaniem fluorescencyjnym, ugrupowaniem kolorymetrycznym lub ugrupowaniem magnetycznym.
Korzystnie, wspomniane stałe podłoże jest powierzchnią tworzywa sztucznego, powierzchnią szklaną, agarozą, akrylamidem, lektyną lub cząstką magnetyczną.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana oryginalna populacja komórek pochodzi od ssaka. Korzystnie, wspomnianym ssakiem jest ssak naczelny, a korzystniej wspomnianym naczelnym jest człowiek.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wspomniana oryginalna populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej, ze szpiku kostnego lub z płodowej tkanki wątroby.
Wynalazek obejmuje także wzbogaconą populację komórek macierzystych, zawierającą komórki macierzyste w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wyjściowa populacja komórek, wzbogaconą w komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- oraz VEGFR2- i będące CD34+ lub CD45+, przy czym wspomniane komórki macierzyste cechują się zdolnością do wytworzenia komórek śródbłonkowych i/lub śródbłonkowo-podobnych.
Wynalazek obejmuje także populację komórek potomnych pochodzących od wzbogaconej populacji komórek macierzystych według wynalazku, przy czym wspomniane komórki potomne są P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, posiadają wyższą zdolność proliferacji niż komórki HUVEC i MVEC oraz zawierają ciałka Weibel-Palade.
Wzbogacona populacja komórek macierzystych jak określono wyżej oraz populacja komórek potomnych jak określono wyżej znajdują zastosowanie w terapii, przy czym zgodnie z wynalazkiem, wzbogacona populacja komórek macierzystych i/lub populacja komórek potomnych znajdują korzyst4
PL 210 872 B1 nie zastosowanie w leczeniu zaburzenia lub choroby układu krążenia, albo zaburzenia lub choroby naczyniowej, bądź w działaniu nakierowanym na regenerację lub naprawę tkanek.
Dzięki obecnemu wynalazkowi zapewniono możliwość wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, obejmującą oddzielanie tej wzbogaconej populacji komórek macierzystych od wyjściowej - określanej tu także jako oryginalna lub pierwsza, populacji komórek, gdzie wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+ w stężeniu co najmniej około 100-krotnie większym niż wspomniana pierwsza populacja komórek, korzystniej co najmniej około 1,000-krotnie większym niż wspomniana pierwsza populacja komórek, a nawet w stężeniu od około 1,000-krotnie do około 4,000-krotnie większym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera ponadto jeden lub więcej niż jeden spośród markerów wybranych z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 oraz CD34 w stężeniu wyższym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje kontaktowanie wspomnianej pierwszej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z P1H12+ oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, które wiążą się z tą cząsteczką. Zgodnie z wynalazkiem, wspomnianą cząsteczką jest przeciwciało. W innym wykonaniu, wspomniane przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem. Zgodnie z obecnym ujawnieniem, wspomniana cząsteczka może być uzyskana z przeciwciała, przykładowo może być cząsteczką fuzyjną peptyd-Fc. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje dodatkowo kontaktowanie wspomnianej pierwszej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek wiążących się ze wspomnianą cząsteczką. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje dodatkowo kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z markerem wybranym z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz usuwanie ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek tych, które nie ulegają związaniu ze wspomnianą cząsteczką. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje ponadto kontaktowanie wspomnianej pierwszej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, zawierającej komórki, które nie wiążą się ze wspomnianą cząsteczką. W innym wykonaniu, wspomniany etap oddzielania obejmuje ponadto kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z czą steczką wybraną z grupy obejmują cej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz usuwanie ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek wiążących się ze wspomnianą cząsteczką. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- lub VEGFR2- w stężeniu co najmniej około 100krotnie wyższym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- lub VEGFR2- w stężeniu co najmniej około 1,000-krotnie wyższym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- lub VEGFR2- w stężeniu około 1,000-krotnie do około 4,000-krotnie wyższym niż wspomniana pierwsza populacja komórek. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest dodatkowo wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34+ lub CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest dodatkowo wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34- oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest dodatkowo wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34+ oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniany związek jest związany z wykrywalną jednostką. W innym wykonaniu, wspomniana wykrywalna jednostka jest jednostką fluorescencyjną, kolorymetryczną lub magnetyczną. W innym wykonaniu, wspomniana cząsteczka jest związana ze stałym podłożem. W innym wykonaniu, wspomniane stałe podłoże jest powierzchnią tworzywa sztucznego, powierzchnią szklaną, agarozą, akrylamidem, lektyną lub magnetyczną drobiną. W innym wykonaniu, wspomniany sposób obejmuje ponadto etap prowadzenia hodowli wspomnianej wzbogaconej populacji komórek macierzystych, z wytworzeniem komórek potomnych będących P1H12+, CD144+, AC133, CD202+, CD45-, VEGFR2+, posiadających większą zdolność proliferacyjną niż komórki HUVEC i MVEC oraz zawierających ciałka Weibel-Palade. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi od ssaków. W korzystnym wykonaniu, wspomnianym ssakiem
PL 210 872 B1 jest ssak z rodziny naczelnych. W innym korzystnym wykonaniu, wspomnianym naczelnym jest człowiek. Korzystnie, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi ze szpiku kostnego. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z płodowej tkanki wątroby.
Obecny wynalazek zapewnia populację komórek macierzystych otrzymanych, jak to podano wyżej. W innym wykonaniu, wspomniane komórki macierzyste są pozytywne ze względu na jeden lub więcej niż jeden z markerów wybranych z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 oraz CD34. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest wzbogacona w komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- oraz VEGFR2-. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest wzbogacona ponadto w komórki macierzyste będące CD34+ lub CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest ponadto wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34+ oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest ponadto wzbogacona w komórki macierzyste będące CD34- oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniane komórki macierzyste zawierają ciałka Weibel-Palade. W innym wykonaniu, wspomniane komórki macierzyste są potomnymi komórkami śródbłonkowymi. Zgodnie z obecnym wynalazkiem populacje te uzyskiwane są ze wspomnianej pierwszej populacji komórek, pochodzącej od ssaków, korzystnie od ssaka z rodziny naczelnych, zwłaszcza człowieka, przy czym ta pierwsza populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi ze szpiku kostnego. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z płodowej tkanki wątroby.
Obecny wynalazek zapewnia także populację potomnych komórek pochodzących ze wzbogaconej populacji komórek macierzystych, gdzie wspomniane komórki potomne są P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, posiadają większą zdolność do proliferacji niż komórki HUVEC oraz MVEC oraz zawierają ciałka Weibel-Palade.
Ujawniono także wyizolowaną komórkę macierzystą P1H12+ oraz AC133+, która może się samoodnawiać oraz różnicować do komórki śródbłonkowej. W innym wykonaniu, wyizolowana komórka macierzysta jest ponadto CD148+, CD144-, VEGFR2- oraz CD202b-. W innym wykonaniu, wspomniana wyizolowana komórka macierzysta jest dodatkowo CD34+ lub CD45+. W innym wykonaniu, wyizolowana komórka macierzysta jest dodatkowo CD34+ oraz CD45+. W innym wykonaniu, wyizolowana komórka macierzysta jest dodatkowo CD34- oraz CD45+. W innym wykonaniu, wspomniana komórka macierzysta pochodzi od ssaka, korzystnie od ssaka z rodziny naczelnych, zwłaszcza od człowieka. Korzystnie, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi ze szpiku kostnego. W innym wykonaniu, wspomniana pierwsza populacja komórek pochodzi z płodowej tkanki wątroby. W innym wykonaniu, wspomniana wyizolowana komórka macierzysta jest zdolna do podlegania hodowli przez co najmniej 14 dni w kompletnej pożywce zawierającej 15% surowicy. W innym wykonaniu, wspomniana wyizolowana komórka macierzysta zawiera ponadto heterologiczną sekwencję polinukleotydu.
Ujawniono także linię komórkową obejmującą wyizolowaną komórkę macierzystą, opisaną powyżej lub jej komórki potomne.
W innym wykonaniu, obecny wynalazek zapewnia hodowlę komórek macierzystych zawierają c ą zasadniczo homogeniczną populację komórek macierzystych opisanych powyżej.
Ujawniono także kompozycję zawierającą wyizolowaną komórkę macierzystą jak opisana wyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, wspomniany farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jest wybrany z grupy obejmującej solankę, żel, hydrożel, gąbkę oraz matrycę.
Ujawniono także wyizolowaną komórkę potomną otrzymaną w wyniku prowadzenia hodowli wyizolowanej komórki macierzystej opisanej wyżej, przez około 6 dni do około 3 tygodni w kompletnej pożywce z dodatkiem 15% surowicy, gdzie komórka potomna jest scharakteryzowana jako P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, jako posiadająca większą zdolność do proliferacji niż komórki HUVEC i MVEC oraz zawierająca ciałka Weibel-Palade, wskazując także na hodowlę komórek potomnych zawierającą zasadniczo homogeniczną populację wyizolowanej komórki potomnej, opisanej wyżej.
Wyizolowana komórka potomna, opisana wyżej może stanowić składnik aktywny kompozycji zawierającej także farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jest wybrany z grupy obejmującej solankę, żel, hydrożel, gąbkę oraz matrycę.
PL 210 872 B1
Ponadto, ujawniono konstrukt inżynierii tkankowej zawierający wyizolowaną komórkę macierzystą, opisaną wyżej oraz konstrukt inżynierii tkankowej zawierający potomstwo wyizolowanej komórki macierzystej, opisanej wyżej, a także konstrukt inżynierii tkankowej zawierający wspomnianą wyizolowaną komórkę macierzystą oraz jej komórki potomne.
Ujawniono także sposób identyfikacji środka indukującego różnicowanie wyizolowanej komórki macierzystej, opisanej wyżej, obejmujący kontaktowanie wspomnianej wyizolowanej komórki macierzystej z testowanym środkiem oraz wykrywanie zmiany we wspomnianej wyizolowanej komórce macierzystej, gdzie wspomniana zmiana wskazuje, że wspomniany środek indukuje różnicowanie wspomnianej wyizolowanej komórki macierzystej, jak również sposób generowania konstruktu inżynierii tkankowej zawierającego komórki śródbłonka, który to sposób obejmuje hodowlę wyizolowanej komórki macierzystej, opisanej wyżej w konstrukcie inżynierii tkankowej.
Wzbogacone populacje komórek według wynalazku mają zastosowanie w terapii, zwłaszcza w leczeniu zaburzenia lub choroby naczyniowej.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 przedstawia wpływ różnych inhibitorów na indukowaną przez PMA migrację komórek śródbłonkowych ludzkiej krwi pochodzących od komórek macierzystych w próbie na zamykanie ran.
Fig. 2 przedstawia wpływ różnych inhibitorów na indukowaną przez EGF migrację komórek śródbłonkowych ludzkiej krwi pochodzących od komórek macierzystych w próbie na zamykanie ran.
Fig. 3 przedstawia zdolność komórek macierzystych oraz komórek potomnych według wynalazku do proliferacji, wyrażoną poprzez produkcję biomasy.
Szczegółowy opis wynalazku
Obecny wynalazek - odnoszący się do zastosowania przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, zapewnia możliwość pozyskania komórek macierzystych, które mogą podlegać propagacji jako komórki macierzyste oraz mogą powodować wytworzenie komórek śródbłonkowych i/lub komórek śródbłonkowo-podobnych, sposoby wyodrębniania i wykorzystywania kompozycji obejmujących takie komórki macierzyste oraz komórki od nich pochodzące. Populacje komórek macierzystych według wynalazku znajdują zastosowanie w terapii genowej, inżynierii tkankowej, generowaniu tkanek, gojeniu ran, w diagnostyce, w charakterze środków angiogennych i naczyniogennych, jako środków do dostarczania genów i protein, a także w charakterze środków terapeutycznych.
W innym aspekcie, obecny wynalazek zapewnia populację komórek macierzystych posiadających charakterystyki obejmujące zdolność do samoodnawiania oraz różnicowania do komórek śródbłonkowych i/lub komórek podobnych do śródbłonkowych. W jednym wykonaniu, komórki macierzyste według wynalazku mają czas podwajania swej liczebności od 18 do 24 godzin hodowli monowarstwowej oraz mają okresy trwałości dłuższe niż pierwotne ludzkie komórki śródbłonkowe znane ze stanu techniki (to znaczy HUVECs). Czas podwojenia jest zależny od ilości dni, w których uprzednio inkubowano komórki macierzyste w hodowli. W hodowli, te komórki macierzyste przyłączają się do i/lub migrują w substratach opartych na kolagenie i są zdolne do różnicowania do komórek o morfologii i/lub funkcji typowej dla komórek śródbłonkowych.
Komórki macierzyste według obecnego wynalazku są zdolne do ekspresji jednego lub więcej niż jednego z markerów towarzyszących fenotypowi śródbłonkowej komórki macierzystej i/lub są pozbawione jednego lub więcej niż jednego z markerów towarzyszących komórce uzyskanej w wyniku różnicowania (przykładowo, komórce o obniżonej zdolności do samoodnawiania, regeneracji lub różnicowania) i/lub komórce o pochodzeniu hematopoetycznym. Cząsteczka stanowi marker pożądanego rodzaju komórek, jeżeli występuje w wystarczająco wysokim procencie komórek pożądanego rodzaju i w wystarczająco niskim procencie komórek niepożądanego rodzaju tak, że można osiągnąć żądany poziom oczyszczenia pożądanego rodzaju komórek w populacji komórek obejmującej zarówno pożądane, jak i niepożądane rodzaje komórek w wyniku selekcji pod kątem wyodrębnienia z tej populacji, tych komórek, które posiadają marker. Marker może występować, przykładowo, na 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% lub ponad 99% komórek pożądanego rodzaju i może być wykryty na w mniej niż 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% lub poniżej 1% komórek niepożądanego rodzaju. Przykłady markerów charakterystycznych dla komórki macierzystej według wynalazku obejmują antygen P1H12 (znany również jako MUC18 oraz CD146; Solovey i wsp., 2001, J. Lab. Clin. Med. 138:322-31; przeciwciała rozpoznające ten antygen, dostępne z - przykładowo, CRP Inc., Denver, PA, numer katalogowy MMS-470R) oraz AC133 (Bhatia, 2001, Leukemia 15:1685-88). Przykłady markerów, które typowo nie występują na
PL 210 872 B1 komórkach macierzystych według wynalazku, obejmują: CD3, CD14, CD144, CD202b (znany także jako Tek oraz Tie-2; patrz Leukocyte Typing VII, Mason i wsp., (wyd.), Oxford University Press, 2002, strony 344-46) lub dowolną ich kombinację.
W pewnym wykonaniu, komórki macierzyste według wynalazku, po wyizolowaniu, są P1H12+ oraz AC133+. Te komórki macierzyste również mogą być nisko CD34 lub CD34-, CD148+, i/lub CD45+ w czasie wyizolowywania. Komórka macierzysta według wynalazku może również nie mieć jednego lub więcej niż jednego z fenotypowych markerów CD14-, CD144, CD202b i/lub VEGRF2. W zwią zku z tym, w innym wykonaniu, komórki macierzyste są P1H12+, CD148+, AC133+, CD34+, CD45+, CD144-, CD202b- oraz VEGRF2-.
Określenia komórka prekursorowa, komórka potomna oraz komórka macierzysta stosowane są zamiennie w stanie techniki oraz w obecnej dokumentacji i odnoszą się do pluripotentnej komórki potomnej o nieukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania, która jest potencjalnie zdolna do nieograniczonej ilości podziałów mitotycznych już to w celu odnowy jej linii już to do wytwarzania komórek potomnych, które będą podlegać różnicowaniu do komórek śródbłonkowych lub komórek śródbłonkowo-podobnych; lub do komórki potomnej o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania oraz jej potomstwa, które jest zdolne do samoodnawiania oraz do podlegania różnicowaniu do komórki śródbłonkowej. Odmiennie niż pluripotentne, komórki potomne o nieukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania są generalnie uważane za niezdolne do przekształcenia w komórki wielu różnych typów różniących się fenotypowo między sobą. Mogą one natomiast ulegać przekształceniu w komórki o określonej ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania jednego lub ewentualnie dwóch typów.
W innym aspekcie, obecny wynalazek zapewnia wyizolowane komórki macierzyste, pojedyncze lub w populacjach. Określenia wyizolowany lub oczyszczony - jeżeli odnoszą się do komórek macierzystych według wynalazku oznaczają komórki, które są zasadniczo wolne od komórek z markerami towarzyszącymi przypisaniu do określonej ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania. W szczególnych wykonaniach, komórki macierzyste są w co najmniej 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 99 procentach wolne od takich rodzajów zanieczyszczeń komórkowych. W innym wykonaniu, wyodrębnione komórki macierzyste są również zasadniczo wolne od rozpuszczalnych związków występujących w naturze. Jak to niżej przedyskutowano bardziej szczegółowo, zasadniczo oczyszczona komórka macierzysta według wynalazku może być otrzymana, przykładowo, w wyniku ekstrakcji (przykładowo, stosując odwirowanie z gradientem gęstości i/lub przepływową cytometrię) z naturalnego źródła takiego jak tkanka lub próbka krwi. Czystość może być mierzona dowolną odpowiednią metodą. Komórka macierzysta według obecnego wynalazku może być oczyszczona w 99%-100%, przykładowo metodą przepływowej cytometrii (przykładowo, analiza FACS), jak to omówiono niżej.
Obecny wynalazek zapewnia wzbogaconą populację komórek macierzystych. Wzbogacona populacja komórek macierzystych jest populacją, w której komórki macierzyste według wynalazku zostały częściowo oddzielone od innych rodzajów komórek tak, że otrzymana populacja komórek macierzystych ma większe stężenie komórek macierzystych niż oryginalna wyjściowa populacja komórek. Wzbogacona populacja komórek macierzystych może mieć około 10-krotnie, 100-krotnie, 500-krotnie, 1.000-krotnie, 2.000-krotnie, 3.000-krotnie, 4.000-krotnie, 5.000-krotnie, 6.000-krotnie, 7.000-krotnie, 8.000-krotnie, 9.000-krotnie, 10.000-krotnie lub ponad 10.000-krotnie większe stężenie komórek macierzystych niż oryginalna populacja przed rozdziałem. Komórki macierzyste według wynalazku mogą, przykładowo, stanowić co najmniej 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% lub ponad 99% wzbogaconej populacji komórek macierzystych. Wzbogacona populacja komórek macierzystych może być otrzymana przez, przykładowo, selekcję ze względu na komórki znaczone markerami związanymi z komórkami po różnicowaniu lub inne niepożądane rodzaje komórek i/lub przez selekcję pod kątem markerów związanych z komórkami macierzystymi według wynalazku, i/lub przez regenerację wyodrębnionych komórek macierzystych w zdefiniowanych systemach hodowli, jak to omówiono poniż ej.
W innym wykonaniu, obecna dokumentacja ujawnia linie komórkowe komórek macierzystych. W znaczeniu tutaj stosowanym, określenie linia komórkowa oznacza hodowlę komórek macierzystych według obecnego wynalazku lub ich komórek potomnych (przykładowo, komórek śródbłonkowych i/lub komórek podobnych do śródbłonkowych), które mogą być reprodukowane przez wydłużony okres czasu, korzystnie bezterminowo, który to termin obejmuje, przykładowo, komórki poddawane hodowli, krio-konserwowane i oraz ponownie hodowane po krio-konserwacji. W znaczeniu tutaj stosowanym określenie hodowla oznacza populację śródbłonkowych komórek macierzystych wzrasta8
PL 210 872 B1 nych w pożywce oraz ewentualnie poddanych odnośnym przejściom. Hodowla komórki macierzystej może być pierwotną hodowlą (to znaczy hodowlą, która nie była poddawana przejściom) lub może być hodowlą wtórną drugorzędową lub kolejną hodowlą (co znaczy, że jest populacją komórek, które były przeniesione do podhodowli lub poddane przejściu raz lub więcej niż jeden raz).
Jak to omówiono wyżej, komórki macierzyste według obecnego wynalazku cechują się obecnością i/lub nieobecnością pewnych markerów, które są specyficznie rozpoznawane przez cząsteczkę (związek). W związku z tym, zgodnie z jednym aspektem, obecny wynalazek zapewnia sposoby znakowania komórek macierzystych według wynalazku. W pewnym wykonaniu, komórki macierzyste są znakowane cząsteczką (przykładowo, przeciwciałem), która specyficznie rozpoznaje marker związany z komórką macierzystą wedł ug wynalazku (przykł adowo, antygen P1H12). W innym wykonaniu, populacja komórek poddawana jest kontaktowaniu z cząsteczką specyficznie wiążącą się z markerem w warunkach, które pozwalają tej cząsteczce związać się z markerem, przy czym populacja komórek obejmuje co najmniej jedną komórkę macierzystą posiadającą wspomniany marker. W innym wykonaniu, populację komórek poddaje się kontaktowi ze związkiem, który specyficznie wiąże się z markerem w warunkach, które pozwalają na związanie cząsteczek tego związku z markerem, przy czym ta populacja komórek obejmuje komórki macierzyste, które nie posiadają tego markera oraz komórki niemacierzyste posiadające ten marker. Stosowanym związkiem (cząsteczką) może być, przykładowo, przeciwciało, pochodna przeciwciała, ligand, cząsteczka fuzyjna Fc-peptyd (przykładowo, jak to opisano w publikacji zgłoszenia patentowego PCT, nr WO 01/83525 A2) lub inny związek. Cząsteczka takiego związku może ewentualnie obejmować dodatkowe ugrupowanie, przykładowo, ugrupowanie wykrywalne (przykładowo, znakowane fluorescencyjnie lub kolorymetrycznie) wspomagające wyodrębnianie znakowanych komórek (przykładowo ugrupowanie, które jest związane z drugą cząsteczkę lub cząstka magnetyczna).
W innym aspekcie, obecny wynalazek zapewnia możliwość wyodrębniania komórek macierzystych według wynalazku. Komórki macierzyste według wynalazku mogą być wyizolowane przez, przykładowo, wykorzystanie cząsteczek (przykładowo, przeciwciał, pochodnych przeciwciał, ligandów lub cząsteczek fuzyjnych Fc-peptyd) które wiążą się z markerem komórek macierzystych (przykładowo, antygen P1H12, CD34, CD45, AC133 oraz CD148) i pozytywną selekcję komórek, które wiążą się z tymi czą steczkami (tak zwana selekcja pozytywna). Inne przyk ł ady sposobów pozytywnej selekcji obejmują sposoby preferencyjnie promujące wzrost pożądanego typu komórek w populacji stanowiącej mieszaninę pożądanych i niepożądanych rodzajów komórek. Alternatywnie, stosując cząsteczki wiążące się z markerami, które nie występują w pożądanym rodzaju komórek, lecz występują w niepożądanym rodzaju komórek, niepożądane komórki zawierające takie markery mogą być usunięte z populacji pożądanych komórek (tak zwana selekcja negatywna). Inne sposoby selekcji negatywnej obejmują korzystnie zabijanie lub inhibitowanie wzrostu komórek niepożądanego rodzaju w mieszaninie populacji pożądanych i niepożądanych rodzajów komórek. W związku z tym, poprzez stosowanie negatywnej selekcji, pozytywnej selekcji lub ich kombinacji, można wytworzyć wzbogaconą populację komórek macierzystych.
Śródbłonkowe komórki macierzyste według wynalazku mogą być wyizolowane z próbki pobranej od ssaka. Dawcą może być dowolny ssak (przykładowo wół, owca, świnia, pies, kot, koń, naczelny), lecz korzystnie człowiek. Próbkę komórek można uzyskać z dowolnego spośród szeregu różnych źródeł w tym, przykładowo, ze szpiku kostnego, tkanek płodowych (przykładowo, z płodowej tkanki wątroby), z krwi obwodowej, krwi pępowinowej oraz tym podobnych. Korzystnym źródłem komórek jest krew obwodowa z uwagi na wykorzystanie mniej inwazyjnych technik pobierania próbek takich komórek oraz łatwo dostępną populację dawców.
W celu otrzymania komórek macierzystych według wynalazku, konieczne jest wyizolowanie, oddzielenie lub usunięcie komórek macierzystych według wynalazku spośród innych komórek, z którymi normalnie występują. Przykładowo, jeżeli źródło komórek pochodzi z krwi obwodowej, komórki macierzyste muszą być wzbogacone lub oddzielone od innych komórek (takich przykładowo, erytrocyty, płytki, monocyty, neutrofile, makrofagi oraz tym podobne).
W celu oddzielenia komórek macierzystych wedł ug wynalazku mogą być zastosowane róż ne techniki, od wstępnego usunięcia komórek macierzystych według wynalazku z innych rodzajów komórek przez charakterystyczną ekspresję markera i/lub przez usunięcie komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania z populacji komórek macierzystych według wynalazku w podobny sposób. Przeciwciała (przykładowo, monoklonalne przeciwciała) są szczególnie przydatne do identyfikacji markerów proteinowych na powierzchni komórkowej związanych z komórkami o ukierunkowanej linii
PL 210 872 B1 rozwoju i dojrzewania i/lub w określonej fazie różnicowania. Przeciwciała mogą być przyłączone do stałego podłoża (przykładowo, powleczone przeciwciałem złoża magnetyczne). Przykłady dostępnych w handlu przeciwciał , które rozpoznają markery zale ż ne od okreś lonej ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania obejmują anty-AC133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA); anty-CD34 (Becton Dickinson, San Jose, CA), anty-CD31, anty-CD62E, anty-CD104, anty-CD106, anty-CD1a, anty-CD14 (wszystkie dostępne z firmy Pharmingen, Hamburg, Germany); anty-CD144 oraz anty-CD-13 (Immunotech, Marseille, France). Klon P1H12 (Chemicon, Temecula, CA; numer katalogowy MAB16985) wytwarza przeciwciało, które specyficznie reaguje z antygenem P1H12 (znanym także jako CD146, MCAM oraz MUC18). Przeciwciało P1H12 specyficznie lokalizuje komórki śródbłonkowe wszystkich naczyń włączając mikronaczynia normalnej i rakowatej tkanki. Przeciwciało P1H12 nie wybarwia komórek hematopoetycznych.
Procedury rozdzielania mogą obejmować magnetyczne rozdzielanie, przy zastosowaniu złoży magnetycznych powleczonych przeciwciałem, chromatografii opartej na powinowactwie, środków cytotoksycznych przyłączonych do monoklonalnego przeciwciała lub takich środków stosowanych w połączeniu z monoklonalnym przeciwciałem, przykładowo, komplementu oraz cytotoksyn oraz wychwytywania z przeciwciałem przyłączonym do stałej matrycy (przykładowo, płytka), lub innej odpowiedniej techniki. Techniki zapewniające dokładne rozdzielanie obejmują sortery komórkowe aktywowane fluorescencyjnie, które mogą posiadać różne stopnie złożoności, przykładowo, mnogość kolorowych kanałów, kanały do wykrywania światła padającego pod niskim kątem oraz pod kątem rozwartym, a także kanały impedancyjne. Dogodnie, przeciwciała mogą być związane z markerami, takimi jak złoża magnetyczne, które pozwalają na bezpośrednie rozdzielanie, biotyna, która może być usunięta z awidyną lub streptawidiną związaną z podłożem, fluorochromy, które mogą być stosowane z sorterem komórkowym aktywowanym fluorescencjgnie lub tym podobne, co pozwala na ł atwiejsze wyodrębnienie komórki szczególnego rodzaju. Dowolne techniki mogą być stosowane, o ile nie są niepotrzebnie szkodliwe dla żywotności komórek macierzystych.
W pewnym wykonaniu, zł o ż a magnetyczne po łączone z przeciwciał ami selektywnymi wzglę dem markerów z powierzchni komórkowej występujących u dużej ilości komórek o różnych liniach rozwoju i dojrzewania należących do systemów hematopoetycznych [przykładowo, komórki-T, komórki-B, (zarówno komórki pre-B oraz komórki-B) oraz komórki szpiczakowi] i/lub mniejszych populacji komórkowych (przykładowo, megakariocyty, komórki tuczne, eozynofile oraz bazofile) są stosowane zarówno przed, równocześnie z -, lub kolejno po stosowaniu selekcji z użyciem antygenu P1H12 w celu usunięcia komórek o ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania lub innych komórek z komórek macierzystych według wynalazku. Co najmniej około 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% lub więcej wszystkich komórek hematopoetycznych będzie usuniętych; jednakże, nie jest istotne usunięcie wszystkich typów ostatecznie zróżnicowanych komórek. Płytki oraz erytrocyty mogą być usunięte (przykładowo, technikami z gradientem gęstości) przed sortowaniem lub rozdzieleniem komórek macierzystych od pozostałych nie-płytek, komórek nie-erytrocytowych. Gdy stosuje się protokół pozytywnej selekcji, komórki o ukierunkowanej linii rozwoju pozbawione markera, ze względu na który dokonywana jest selekcja pozytywna - będą pozostawione. Jednakże, w pewnym wykonaniu, stosowana jest zarówno pozytywna jak i negatywna selekcja tak, że w etapie końcowej pozytywnej selekcji, ilość obecnych dedykowanych komórek jest zminimalizowana. Biegły w sztuce rozpozna, że na skutek braku zdolności proliferacyjnej wielu rodzajów komórek w krwi obwodowej, większość - jeśli nie wszystkie, pozostałych komórek o określonej linii rozwoju i dojrzewania, po procesie pozytywnej i/lub negatywnej selekcji nie będzie ulegać proliferacji i/lub wiązaniu do substratu opartego na kolagenie oraz będzie usunięta podczas stosowania technik przepuszczania komórkowego. Kompozycje mające więcej niż około 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% lub więcej, mogą być wykonane w ten sposób, gdzie pożądane komórki macierzyste - zidentyfikowane jako P1H12+, CD148+, AC133+, CD34+, CD45+, CD144-, CD202b- oraz VEGRF2-, są zdolne do samoodnawiania oraz przekształcania we w pełni zróżnicowane śródbłonkowe komórki i/lub komórki podobne do śródbłonkowych komórek.
Kombinacje sposobów wzbogacania mogą być stosowane w celu poprawienia czasu lub wydajności oczyszczania lub wzbogacenia. Przykładowo, po etapie wzbogacenia - w celu usunięcia komórek zawierających markery, które nie wskazują na rodzaj badanych komórek, komórki mogą być dalej rozdzielane lub wzbogacane przez aktywowany fluorescencyjnie sorter komórkowy (FACS) lub zgodnie z inną metodologią posiadającą wysoką specyficzność. Można zastosować wielobarwne analizy przy użyciu FACS. Komórki mogą być rozdzielane na zasadzie poziomu wybarwienia szczególnego
PL 210 872 B1 antygenu lub jego braku. Fluorochromy mogą być stosowane do znakowania przeciwciał specyficznych względem szczególnego antygenu. Takie fluorochromy obejmują fikobiliproteiny, przykładowo, fikoerytrynę oraz alofikocyjaniny, fluoresceinę, czerwień teksańską oraz tym podobne. Podczas gdy każde z połączeń obecnych w populacji może być rozdzielone w etapie rozdzielania, typowo przez proces negatywnej selekcji, korzystne jest, że badany typ komórek będzie wyodrębniany w jednym etapie w procesie pozytywnej selekcji. Komórki są typowo zbierane w kompletnej pożywce (przykładowo, EGM2, z określonymi uzupełnieniami; Clonetics Corporation) + 15% surowicy. Surowica może być ksenogeniczna, autologiczna, lub allogeniczna. Mogą być zastosowane inne techniki dla pozytywnej selekcji, które pozwalają na dokładne rozdzielenie, przykładowo rozdział na kolumnach oparty na powinowactwie oraz temu podobne.
Chociaż szczególny porządek rozdzielania nie jest krytyczny dla obecnego wynalazku, korzystna kolejność obejmuje zgrubne rozdzielanie (przykładowo, odwirowanie z gradientem stężenia), a nastę pnie dokładne rozdzielanie (przykł adowo, pozytywna selekcja markera zwią zanego z komórkami macierzystymi (przykładowo, antygen P1H12)). Typowo, po rozdzielaniu z gradientem stężenia następuje pozytywna selekcja komórek P1H12+, które są następnie hodowane do dalszego namnażania komórek macierzystych według wynalazku.
Dowolne markery specyficzne względem określonego rodzaju komórek mogą być stosowane do selekcji ze względu na - lub przeciw określonemu rodzajowi komórek. Przykłady takich markerów obejmują CD10/19/20 (związane z komórkami-B), CD3/4/8 (związane z komórkami-T), CD14/15/33 (związane z komórkami szpikowymi) oraz Thy-1, który nie występuje na ludzkich komórkach-T. Podobnie, rodamina 123 może być stosowana do podzielenia komórek CD34+ na wysokie oraz niskie podjednostki. Patrz: Spangrude, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7433, opis stosowania rodaminy 123 z mysimi komórkami macierzystymi. W pewnym wykonaniu, komórki macierzyste wedł ug wynalazku są w większości P1H12+, CD148+, AC133+, .CD144-, CD202b-, VEGRF2 oraz są nisko rodaminowe.
Po wyizolowaniu komórek macierzystych, mogą być one ewentualnie propagowane w kompletnej pożywce (przykładowo, EGM2 zawierającej dostępne w handlu uzupełnienia z firmy Clonetics Corp., przykładowo, IGF, EGF, FGF oraz VEGF) + 15% cielęcej surowicy płodowej (FCS), w kondycjonowanej pożywce od innych rodzajów komórek, przykładowo komórek zrębowych (przykładowo, zrębowe komórki otrzymane ze szpiku kostnego, płodowej grasicy oraz płodowej wątroby), w pożywce zawierającej czynniki wzrostu związane z utrzymaniem komórki macierzystej, współhodowane z komórkami zrębowymi lub w pożywce obejmującej czynniki podtrzymujące proliferację komórek macierzystych, gdzie komórki zrębowe mogą być, przykładowo, allogeniczne lub ksenogeniczne. Przed użyciem we współhodowli, zmieszane preparaty komórek zrębowych mogą być uwolnione od komórek hematopoetycznych stosując odpowiednie monoklonalne przeciwciała w celu usunięcia niepożądanych komórek, jak przykładowo, koniugaty toksyny-przeciwciała, przeciwciało oraz komplement i tym podobne. Alternatywnie, można stosować klonowane zrębowe linie komórkowe, przy czym zrębowe linie mogą być allogeniczne lub ksenogeniczne. Ponadto, komórki macierzyste według wynalazku mogą być hodowane w układzie bioreaktora.
W innym wykonaniu, obecny wynalazek zapewnia moż liwoś ci tworzenia i/lub utrzymywania populacji komórek macierzystych lub ich komórek potomnych, jak również mieszanych populacji obejmujących zarówno komórki macierzyste, jak i komórki potomne podobne do śródbłonkowych oraz tak wytwarzane populacje komórek. Tak jak to jest z komórkami macierzystymi według wynalazku, gdy hodowla komórek podobnych do śródbłonkowych lub mieszana hodowla komórek macierzystych oraz komórek podobnych do śródbłonkowych jest założona, populację komórek poddaje się mitotycznej ekspansji in vitro poprzez przepuszczenie do świeżej pożywki tak, jak to dyktuje gęstość komórek, w warunkach zachęcających do proliferacji komórek, z - lub bez formowania śródbłonka. Takie sposoby hodowli mogą obejmować, przykładowo, prowadzenie przejść komórek w pożywce, w których jest brak IGF, EGF, FGF, VEGF, i/lub innego czynnika wzrostu. Hodowle obejmujące komórki śródbłonkowe i/lub komórki podobne do śródbłonkowych oraz mieszane hodowle obejmujące komórki macierzyste oraz śródbłonkowe i/lub komórki podobne do śródbłonkowych mogą być przenoszone do świeżej pożywki, kiedy wystarczająco zwiększa się gęstość komórek. Chociaż wiele rodzajów komórek według obecnego wynalazku nie przejawia typowego kontaktowego inhibitowania-apoptozy, stają się one nieruchome, kiedy gęstość jest maksymalna. A więc, w pewnym wykonaniu, formowanie konfluentnej monowarstwy komórek jest powstrzymane lub zminimalizowane przez, przykładowo, przeniesienie części komórek do nowego naczynia do hodowli ze świeżą pożywką. Takie usunięcie lub przeniesienie może być wykonane w dowolnym naczyniu do hodowli, które posiada komórkową monoPL 210 872 B1 warstwę przekraczającą gęstość około 1 x 106 komórek na kolbę do hodowli tkankowej T75. Alternatywnie, system hodowli może być mieszany w celu zabezpieczenia komórek przed zlepianiem.
Kiedy sporządzono stabilne hodowle komórek macierzystych według wynalazku, jak opisano powyżej, to mogą być one utrzymywane lub przechowywane w komórkowych bankach obejmujących ciągłą hodowlę in vitro komórek wymagających regularnego przenoszenia lub korzystnie komórki mogą być krio-zakonserwowane.
Krio-konserwowanie komórek macierzystych lub innych komórek według wynalazku, może przebiegać według znanych metod, takich jak metody opisane w: Doyle i wsp., (wyd.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, komórki mogą być zawieszone w pożywce do zamrożenia takiej, jak przykładowo, pożywka do hodowli obejmująca dodatkowo 15-20% FBS oraz 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), z - lub bez 5-10% glicerolu, o gęstości, przykładowo, około 4-10 x 106 komórek/ml. Komórki rozkłada się do szklanych lub plastikowych naczynek, które następnie zapieczętowuje się i przenosi do komory zamrażającej programowalnej lub pasywnej zamrażarki. Optymalna szybkość zamrażania może być określona doświadczalnie. Przykładowo, może być stosowany program zamrażania, który daje zmianę temperatury o -1°C/min poprzez ciepło stapiania. Kiedy naczyńka zawierające komórki osiągną temperaturę -80°C, przenosi się je do pomieszczenia do przechowywania w ciekłym azocie. Krio-zakonserwowane komórki mogą być przechowywane przez lata, chociaż powinny być kontrolowane co najmniej co każde pięć lat pod kątem utrzymania zdolności do przeżycia.
Krio-zakonserwowane komórki według wynalazku tworzące bank komórek, których porcje mogą być pobrane przez rozmrożenie, a następnie stosowane do wytwarzania hodowli komórek macierzystych obejmującej komórki macierzyste, śródbłonkowe i/lub komórki podobne do śródbłonkowych, lub w razie potrzeby tkankę śródbłonkową. Rozmrażanie powinno generalnie przebiegać szybko, przykładowo, poprzez przeniesienie naczyńka z ciekłego azotu do kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Rozmrożone zawartości naczyńka powinny być niezwłocznie (bezpośrednio) przeniesione w sterylnych warunkach do naczynia do hodowli zawierającego odpowiednią pożywkę taką, jak kompletna pożywka (przykładowo, pożywka EGM2 zawierająca IGF, EGF, FGF oraz VEGF) + 15% FCS. Warto doradzić, żeby komórki w pożywce do hodowli były doprowadzone do początkowej gęstości około 1-3 x 105 komórek/ml tak, żeby komórki mogły kondycjonować pożywkę tak szybko jak to możliwe, a przez to zapobiegać przewlekłej fazie opóźnienia. Podczas hodowli komórki mogą być badane codziennie, przykładowo, za pomocą mikroskopu inwersyjnego w celu wykrycia proliferacji komórkowej oraz tworzenia ich pod-hodowli, gdy tylko osiągną odpowiednią gęstość.
Komórki macierzyste według wynalazku mogą być pobrane z banku komórek w razie potrzeby i stosowane do wytwarzania nowych komórek macierzystych, śródbłonkowych i/lub komórek podobnych do śródbłonkowych i/lub śródbłonkowej tkanki in vitro, przykładowo, jako trójwymiarowa śródbłonkowa hodowla, jak opisano poniżej, lub in vivo, przykładowo, przez bezpośrednie podawanie komórek do miejsca, gdzie nowe śródbłonkowe komórki lub tkanka, są potrzebne. Jak tutaj opisano, komórki macierzyste według wynalazku mogą być stosowane do wytwarzania nowej tkanki śródbłonkowej do wykorzystania u osobnika, gdy komórki były pierwotnie wyizolowane z własnej krwi tego osobnika lub z innej tkanki (to znaczy, z komórek autologicznych). Alternatywnie, komórki według wynalazku mogą być stosowane jako wszechobecne komórki donorowe w celu wytwarzania nowej tkanki śródbłonkowej do wykorzystania przez dowolnego osobnika (to znaczy, komórki heterologiczne).
Po wytworzeniu, hodowla komórek macierzystych może być stosowana do wytwarzania podobnych do śródbłonkowych komórek potomnych i/lub komórek śródbłonkowych zdolnych do wytwarzania nowej tkanki śródbłonkowej. Zróżnicowanie komórek macierzystych na komórki śródbłonkowe lub komórki podobne do śródbłonkowych, a następnie wytwarzanie z nich tkanki śródbłonkowej, może być zapoczątkowane przez specyficzne egzogenne czynniki wzrostu lub przez zmianę warunków hodowli (przykładowo, gęstości) hodowanych komórek macierzystych. Ponieważ komórki są naiwne, mogą być stosowane do rekonstytucji osobnika po naświetlaniu i/lub osobnika leczonego chemioterapią; lub jako źródło komórek na specyficzne połączenia, przez zapewnienie ich dojrzewania, proliferacji oraz różnicowania do jednego lub więcej niż jednego wybranego połączenia. Przykłady czynników, które mogą być stosowane do indukowania różnicowania obejmują erytropoetynę, czynniki stymulujące kolonie - przykładowo, GM-CSF, G-CSF, lub M-CSF, interleukiny, przykładowo, IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 oraz tym podobne, czynnik inhibitorowy leukemii (LIF), czynnik Steela (Stl) lub tym podobne, współhodowanie z miocytami sercowymi lub innymi rodzajami komórek o ukierunkowanej linii rozwoju
PL 210 872 B1 i dojrzewania, do indukowania komórek macierzystych, do ich ukierunkowywania na przekształcanie w komórki o określonej ukierunkowanej linii rozwoju i dojrzewania.
W innym aspekcie, wynalazek zapewnia możliwości prowadzenia hodowli komórek macierzystych, powodujące wzrastanie komórek potomnych oraz komórki tak wytworzone. W pewnym wykonaniu, komórka potomna jest P1H12+, CD144+, AC133-, CD202b+, CD45-, VEGFR2+, ma wysoką zdolność do proliferacji w porównaniu z komórkami HUVEC i MVEC oraz zawiera ciałka Weibel-Palade.
W innym wykonaniu, komórki macierzyste są poddane obróbce metodami inż ynierii genetycznej w celu ekspresji genów dla określonych rodzajów czynników wzrostu, takich jak - przykładowo, TGF-β, b-FGF, VEGF, FGF-18 oraz tym podobnych do skutecznego i/lub usprawnionego różnicowania do komórek śródbłonkowych i/lub całkowitej produkcji komórek śródbłonkowych albo przed - lub po implantacji. Inne czynniki lub geny, które mogą być indukowane w - oraz transferowane do komórek macierzystych lub do komórek potomnych komórki macierzystej według wynalazku, dla terapeutycznych korzyści obejmują, przykładowo, IL17R, TNFR, angiopoetynę-1 oraz -2, TWEAK, TWEAKR, jak również inne przeciw-zapalne lub angiogeniczne czynniki znane w sztuce.
Uważa się, że ilość natywnych komórek śródbłonkowych (EC) i/lub ich zdolność do przeżycia zmniejszają się w czasie. A więc, w niektórych populacjach pacjentów - przykładowo wśród osób starszych, rezydentna populacja komórek EC zdolnych do odpowiedzi na cytokiny angiogeniczne może być ograniczona. W związku z tym, komórki macierzyste według wynalazku mogą zapewnić pożądaną populację komórek, co skutkuje zwiększeniem aktywności angiogenicznej oraz reperacji tkanek.
Komórki według wynalazku mogą być stosowane do leczenia osób wymagających naprawy lub zamiany tkanki śródbłonkowej na skutek choroby lub urazu albo w celu realizacji funkcji kosmetycznych, takich jak wzmocnienie widocznych lub innych cech ciała. Leczenie może pociągać za sobą stosowanie komórek według wynalazku w celu wytwarzania nowej śródbłonkowej tkanki oraz stosowanie tak wytworzonej tkanki śródbłonkowej, według dowolnego ze sposobów obecnie znanych w sztuce lub które będą opracowane w przyszłości. Przykładowo, komórki według wynalazku mogą być implantowane, podawane w postaci iniekcji lub innymi drogami podawania bezpośrednio do miejsca uszkodzenia w tkance tak, że będą one wytwarzać nową śródbłonkową tkankę in vivo. W pewnym wykonaniu, podawanie obejmuje podawanie genetycznie zmodyfikowanych śródbłonkowych komórek macierzystych.
W pewnym wykonaniu, formulacja obejmująca komórki według wynalazku jest wytwarzana w postaci nadającej się do bezpośredniej iniekcji do miejsca, w którym pożądane jest wytwarzanie nowej tkanki śródbłonkowej. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, komórki według wynalazku mogą być zawieszone w roztworze hydrożelu do iniekcji. Alternatywnie, roztwór hydrożelu zawierający komórki można pozostawić do utwardzenia, przykładowo w formie (jak przykładowo konstrukt naczyniowy lub tkanka rurkowa), uzyskując matrycę posiadającą komórki zdyspergowane w niej przed implantacją. Kiedy matryca stwardnieje, formacje komórkowe mogą być hodowane tak, że komórki są mitotycznie namnażane przed implantacją. Hydrożel jest organicznym polimerem (naturalnym lub syntetycznym), który jest usieciowany poprzez wiązania kowalencyjne, jonowe lub wodorowe, kreując trójwymiarową strukturę otwartej kratownicy, która wyłapuje cząsteczki wody tworząc żel. Przykłady materiałów, które mogą być stosowane do wytwarzania hydrożelu obejmują polisacharydy, takie jak alginian oraz jego sole, polifosfazyny oraz poliakrylany, które są usieciowane jonowo, bądź polimery blokowe takie, jak PLURONICSTM lub TETRONICS™ (BASF Corp., Mount Olive, NY), kopolimery blokowe tlenek polietylenu - glikol polipropylenowy, które są sieciowane na skutek działania, odpowiednio, temperatury lub pH. Sposoby syntezy materiałów hydrożelowych, jak również sposoby wytwarzania takich hydrożeli, są znane w sztuce.
Takie formulacje komórkowe mogą dalej obejmować jeden lub więcej niż jeden inny komponent, w tym wybrane komponenty zewnątrzkomórkowej matrycy, takie jak jeden lub więcej niż jeden spośród rodzajów kolagenu znanych w sztuce, i/lub czynniki wzrostu oraz leki. Czynniki wzrostu, które mogą być użytecznie wprowadzone do formulacji komórkowej, obejmują jeden lub więcej niż jeden spośród tkankowych czynników wzrostu znanych w sztuce lub które będą zidentyfikowane w przyszłości, takie - lecz nie wyłącznie, jak dowolny członek rodziny TGF-β, IGF-I i IGF-II, hormon wzrostu, różne BMP takie jak BMP-13 oraz tym podobne. Alternatywnie, komórki według wynalazku mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by eksprymować i wytwarzać czynniki wzrostu takie, jak BMP-13 lub TGF-β. Szczegóły obróbki komórki według wynalazku metodami inżynierii genetycznej podano poniżej. Leki, które mogą być korzystnie wprowadzone do formulacji tych komórek obejmują, przykładowo związki przeciwzapalne, jak również środki znieczulające miejscowo. Inne
PL 210 872 B1 komponenty, które mogą być również objęte formulacjami obejmują, przykładowo bufory zapewniające odpowiednie pH oraz izotoniczność, środki smarujące, materiały o dużej lepkości w celu utrzymywania komórek w miejscu podawania lub w pobliżu miejsca podawania (przykładowo, alginiany, agary oraz gumy roślinne) oraz inne rodzaje komórek, które mogą powodować pożądany skutek w miejscu podawania (przykładowo wzmocnienie lub modyfikację formowania tkanki śródbłonkowej, lub też jej fizykochemicznych charakterystyk, wsparcie zdolności komórek do życia lub inhibitowanie stanu zapalnego lub odrzucenia). Komórki można pokryć odpowiednim opatrunkiem na ranę, aby zapobiec opuszczaniu przez komórki miejsca, w którym mają być zlokalizowane. Takie opatrunki na rany są znane biegłym w sztuce.
Alternatywnie, komórki macierzyste według wynalazku mogą być rozsiane w trójwymiarowym szkielecie lub rusztowaniu i hodowane, powodując wzrost komórek wypełniających matrycę lub bezpośrednio implantowanych in vivo, gdzie rozsiane komórki będą proliferować na powierzchni szkieletowej i formować zastępczą tkankę śródbłonkową in vivo we współdziałaniu z komórkami pacjenta. Taki szkielet może być implantowany w połączeniu z dowolnym jednym lub więcej niż jednym spośród czynników wzrostu, z lekarstwami, dodatkowymi rodzajami komórek lub z innymi komponentami powyżej opisanymi, które stymulują wytwarzanie śródbłonka lub w inny sposób wzmacniają lub poprawiają funkcjonowanie rozwiązania według wynalazku.
Komórki według wynalazku mogą być stosowane do wytwarzania nowej, śródbłonkowej tkanki in vitro, która może być następnie implantowana, transplantowana lub w inny sposób wstawiana do miejsca wymagającego naprawy tkanki śródbłonkowej, zamiany lub zwiększenia jej ilości u pacjenta. W nieograniczających przykładach wykonania, komórki macierzyste według wynalazku są stosowane do wytwarzania trójwymiarowego konstruktu tkanki in vitro, który jest następnie implantowany in vivo. Jeśli chodzi o przykład wytwarzania trójwymiarowych konstruktów tkankowych, to patrz: patent nr US 4,963,489, wydany 16 października 1990 roku, na rzecz Naughton'a i wsp., który jest przywołany tutaj jako odnośnik literaturowy. Przykładowo, śródbłonkowe komórki macierzyste oraz śródbłonkowe i/lub podobne do śródbłonkowych komórki według wynalazku mogą być wszczepione lub rozsiane w trójwymiarowym szkielecie lub rusztowaniu oraz proliferowane lub poddane wzrostowi in vitro tworząc żywą tkankę śródbłonkową, która może być implantowana in vivo.
Trójwymiarowy szkielet może być wykonany z dowolnego materiału i/lub w dowolnym kształcie, który pozwala na przymocowanie do niego komórek (lub może być zmodyfikowany tak, by pozwalać na przymocowanie do niego komórek) oraz pozwala na wzrost komórek w więcej niż jednej warstwie. Wiele różnych materiałów może być stosowanych do formowania matrycy, w tym - lecz nie wyłącznie, materiały takie jak: nylon (poliamidy), dakron (poliestry), polistyren, polipropylen, poliakrylany, związki poliwinylowe (przykładowo polichlorek winylu), poliwęglan (PVC), politetrafluoroetylen (PTFE, teflon), THERMANOX (TPX), nitroceluloza, bawełna, kwas poliglikolowy (PGA), kolagen (w postaci gąbek, splotów lub gładkich nitek oraz tym podobnych), szwy katgutowe, celuloza, żelatyna lub inne naturalnie występujące biodegradowalne materiały lub syntetyczne materiały, w tym przykładowo rozmaite polihydroksyalkany. Dowolne z tych materiałów mogą być utkane w siatkę, przykładowo, w celu formowania trójwymiarowego szkieletu lub rusztowania. Pory lub przestrzenie w matrycy mogą być dobrane przez biegłego w sztuce, aby pozwalać na migrację lub zapobiegać migracji komórek do materiału matrycy lub przez materiał matrycy.
Trójwymiarowa matryca, hydrożel oraz tym podobne, mogą być kształtowane do postaci odpowiedniej dla tkanki, która będzie zastępowana lub naprawiana. Przykładowo, gdy pożądany jest przeszczep naczyniowy, trójwymiarowy szkielet może być ukształtowany jako rurkowa struktura oraz zaszczepiony śródbłonkowymi komórkami macierzystymi według wynalazku, samymi lub w kombinacji z komórkami zrębowymi (jak przykładowo fibroblasty), które następnie są hodowane w odpowiednich warunkach. Przykładowo, poza komórkami według wynalazku, do trójwymiarowego szkieletu mogą być dodane inne komórki w tym celu, aby polepszyć ich wzrost lub zmieniać jedną lub więcej niż jedną z charakterystyk nowej ś ródbł onkowej tkanki formowanej na nim. Komórki takie mog ą obejmować , lecz nie wyłącznie: między innymi fibroblasty, perycyty, makrofagi, monocyty, komórki plazmy, komórki tuczne oraz adipocyty.
W jeszcze innym wykonaniu, komórki macierzyste wedł ug wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z trójwymiarowym systemem hodowli w bioreaktorze, by wytwarzać śródbłonkowe konstrukty tkankowe, które posiadają krytyczne biochemiczne, fizyczne i strukturalne właściwości natywnej, ludzkiej tkanki śródbłonkowej, na drodze hodowli komórek i uzyskanej tkanki w takich warunkach środowiska, jakie są typowo doświadczane przez natywną, śródbłonkową tkankę. A więc,
PL 210 872 B1 trójwymiarowy system hodowli może być utrzymywany w warunkach nadciśnienia stosowanych z przerwami oraz okresowo, a komórkom według wynalazku zapewnia się właściwe zaopatrzenie w czynniki odżywcze przez konwekcję. Utrzymywanie odpowiednich dostaw substancji odżywczych do komórek według wynalazku w całym konstrukcie wymienianej tkanki śródbłonkowej o grubości około 2-5 mm jest doniosłe w miarę jak pozorna gęstość konstruktu wzrasta. Ciśnienie ułatwia przepływ płynu przez trójwymiarowy śródbłonkowy konstrukt, co polepsza dostarczanie odżywek oraz usuwanie odpadów z komórek osadzonych w konstrukcie. Bioreaktor może obejmować wiele wzorów. Typowo, warunki hodowli będą obejmowały wywieranie na konstrukt zawierający komórki stresu fizjologicznego podobnego do warunków, jakie wystąpią in vivo. Przykładowo, konstrukt naczyniowy może być hodowany w warunkach, które symulują ciśnienie oraz siły ścinające obserwowane w naczyniach krwionośnych (patrz, przykładowo, patent nr US 6,121,042, który jest tu włączony jako odnośnik literaturowy).
Komórki macierzyste, ich komórki potomne oraz tkanka śródbłonkowa według obecnego wynalazku mogą być stosowane w różnorodnych zastosowaniach. Obejmują one, lecz nie wyłącznie, transplantację lub implantację komórek w postaci nieprzyłączonej lub przyłączonej, przykładowo, do trójwymiarowego szkieletu, jaki tu opisano. Ponadto, iniekcja zewnątrzkomórkowej matrycy wytworzona z nowej, śródbłonkowej tkanki wytworzonej przez komórki według wynalazku może być podawana osobnikowi lub może być wykorzystana do dalszej hodowli komórek. Takie komórki, tkanki oraz zewnątrzkomórkowa matryca mogą służyć do naprawiania, zamiany lub zwiększenia tkanki śródbłonkowej, uszkodzonej w następstwie choroby lub urazu, lub której normalny rozwój nie nastąpił, lub też w celach kosmetycznych.
Tkanka śródbłonkowa wytworzona według wynalazku, może być stosowana do naprawiania lub zamiany uszkodzonej lub zniszczonej tkanki śródbłonkowej, do zwiększenia istniejącej tkanki śródbłonkowej, do wprowadzenia nowej lub zamienionej tkanki, do modyfikacji sztucznych protez albo do połączenia biologicznych tkanek lub struktur. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, szczególne przykłady wykonania wynalazku mogłyby obejmować zastępczą zastawkę sercową wytworzoną ze śródbłonkowych komórek macierzystych według wynalazku lub ich komórek potomnych oraz tkankę naczyniową lub przeszczep. W innym wykonaniu, komórki według wynalazku są podawane w kombinacji z czynnikami angiogenicznymi, by indukować lub promować formowanie nowych naczyń (krwionośnych) lub naczyń włoskowatych u osobnika. Komórki według wynalazku mogą być podawane przed, jednocześnie lub po iniekcji czynnika angiogenicznego. Ponadto, komórki według wynalazku mogą być podawane w bezpośrednim sąsiedztwie, w to samo miejsce lub z dala od miejsca podawania czynnika angiogenicznego. Przez czynnik angiogeniczny należy rozumieć czynnik wzrostu, proteinę lub środek, który promuje lub indukuje angiogenezę u osobnika.
Ponadto, komórki lub tkanka śródbłonkowa według wynalazku mogą być stosowane, przykładowo, do skriningu in vitro pod kątem skuteczności i/lub cytotoksyczności związków, alergenów, czynników wzrostowych/regulatorowych, związków farmaceutycznych oraz tym podobnych, w stosunku do śródbłonkowych komórek macierzystych, w celu wyjaśnienia mechanizmu pewnych chorób poprzez określenie zmian w aktywności biologicznej śródbłonkowych komórek macierzystych (przykładowo, zdolności do proliferacji, adhezji), w celu badania mechanizmu, dzięki któremu leki i/lub czynniki wzrostu oddziałują na modulowanie aktywności biologicznej śródbłonkowych komórek macierzystych, w celu diagnozowania oraz monitorowania raka u pacjenta, dla terapii genowej, dostarczania genu lub dostarczania proteiny, a także w celu wytwarzania produktów aktywnych biologicznie.
Obecne śródbłonkowe komórki macierzyste mogą być również stosowane przy izolowaniu i ocenie czynników zwią zanych z róż nicowaniem oraz dojrzewaniem ś ródbł onkowych komórek macierzystych. Tak więc, komórki macierzyste mogą być stosowane w próbach określających aktywność pożywki, przykładowo pożywki kondycjonowanej, przy ocenie płynów do prowadzenia wzrostu komórek, zaangażowania w tryb ukierunkowania określonej linii rozwoju i dojrzewania lub w tym podobnych. Różne systemy dają się zastosować i mogą być projektowane pod kątem indukowania różnicowania komórek macierzystych w oparciu o różne stresy fizjologiczne. Przykładowo, systemy bioreaktorów, które mogą być zastosowane do komórek według obecnego wynalazku, obejmują bioreaktory symulujące tkankę naczyniową.
Obecne śródbłonkowe komórki macierzyste, ich komórki potomne (przykładowo, zróżnicowane komórki śródbłonkowe i/lub podobne do śródbłonkowych) oraz pochodzące od nich śródbłonkowe tkanki według wynalazku mogą być stosowane in vitro do skriningu szerokiego wachlarza środków pod kątem skuteczności oraz cytotoksyczności środków farmaceutycznych, czynników wzrostowych/regulatorowych, środków przeciwzapalnych oraz tym podobnych. W tym celu, hodowle komórPL 210 872 B1 kowe lub tkankowe według wynalazku mogą być podtrzymywane in vitro oraz eksponowane na działanie badanego środka. Aktywność środka cytotoksycznego może być mierzona jego zdolnością do uszkadzania lub zabijania śródbłonkowych komórek macierzystych lub ich komórek potomnych w hodowli. Może być to łatwe do oszacowania technikami z wybarwianiem. Wpływ czynników wzrostowych/regulatorowych może być oszacowany przez analizę ilości żyjących komórek in vitro, przykładowo, przez zliczenie całkowitej ilości komórek oraz różnicowe zliczenie komórek. Może to być wykonane przy zastosowaniu standardowych technik cytologicznych i/lub histologicznych, włączając stosowanie technik immunocytochemicznych wykorzystujących przeciwciała, które definiują komórkowe antygeny specyficzne ze względu na rodzaj. Wpływ różnych leków na komórki według wynalazku może być oszacowany w hodowli w zawiesinie lub w systemie trójwymiarowym.
Śródbłonkowe komórki macierzyste, ich komórki potomne oraz śródbłonkowe tkanki z nich pochodzące według obecnego wynalazku, mogą stanowić nośnik dla wprowadzania genów oraz produktów genowych in vivo by wspierać lub poprawiać rezultaty implantacji i/lub do stosowania w terapiach genowych.
Śródbłonkowe komórki macierzyste, które eksprymują produkty genowe będące obiektem zainteresowania lub śródbłonkowa tkanka wytwarzana z nich in vitro, mogą być implantowane pacjentowi, który w przeciwnym wypadku miałby niedobór tego produktu genowego. Przykładowo geny, które eksprymują produkty zdolne do zapobiegania lub łagodzenia symptomów różnych rodzajów chorób lub zaburzeń naczyniowych, bądź które zapobiegają lub promują stany zapalne, są przedmiotem szczególnego zainteresowania. W jednym przykładzie wykonania, komórki według wynalazku poddaje się obróbce metodami inżynierii genetycznej, by eksprymowały przeciwzapalny produkt genowy, który mógłby służyć do redukcji ryzyka niepowodzenia implantacji lub dalszej degeneracyjnej zmianie w tkance ś ródbł onkowej na skutek reakcji zapalnej. Przykł adowo, ś ródbł onkowa komórka macierzysta według wynalazku może być poddana obróbce metodami inżynierii genetycznej by eksprymować jeden lub więcej niż jeden spośród przeciwzapalnych produktów genowych, obejmujących - przykładowo, peptydy lub polipeptydy odpowiadające idiotypom przeciwciał, które neutralizują czynnik stymulacji kolonii granulocyt-makrofag (GM-CSF), TNF, IL-1, IL-2 lub inne zapalne cytokiny. Wykazano, że IL-1 obniża syntezę proteoglikanów oraz kolagenów typu II, IX oraz XI (Tyler i wsp., 1985, Biochem. J. 227:69878; Tyler i wsp., 1988, Coll. Relat. Res. 82:393-405; Goldring i wsp., 1988, J. Clin. Invest. 82:20262037 oraz Lefebvre i wsp., 1990, Biophys. Acta. 1052:366-72). TNF również inhibituje syntezę proteoglikanów oraz kolagenu typu II, chociaż jest znacznie słabszy niż IL-1 (Yaron, I., i wsp., 1989, Arthritis Rheum. 32:173-80; Ikebe, T., i wsp., 1988, J. Immunol. 140:827-31 oraz Saklatvala, J., 1986, Nature 322:547-49). Również, przykładowo, komórki według wynalazku mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by eksprymować gen kodujący ludzką komplementarną proteinę regulatorową, która zapobiega odrzuceniu przeszczepu przez gospodarza. Patrz, przykładowo, McCurry i wsp., 1995, Nature Medicine 1:423-27. W innym wykonaniu, obecne ś ródbł onkowe komórki macierzyste mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej tak by zawierały gen lub sekwencję polinukleotydową, która eksprymuje lub powoduje, że następuje ekspresja czynnika angiogenicznego.
Genetycznie zmienione komórki macierzyste są użyteczne w wytwarzaniu zarówno nie-terapeutycznych, jak i terapeutycznych protein rekombinacyjnych in vivo oraz in vitro. Obecne śródbłonkowe komórki macierzyste są izolowane od dawcy (ludzkiego lub nie-ludzkiego) jak opisano powyżej, transfekowane lub transformowane rekombinacyjnym polinukleotydem in vitro lub ex vivo i transplantowane do odbiorcy lub hodowane in vitro. Obecne genetycznie zmienione śródbłonkowe komórki macierzyste lub ich potomstwo wytwarzają pożądaną rekombinacyjną proteinę in vivo lub in vitro. Wytworzona proteina lub związek (cząsteczka) może wywoływać bezpośredni lub pośredni efekt terapeutyczny lub wytwarzać diagnostyczną proteinę lub cząsteczkę.
Alternatywnie, śródbłonkowe komórki macierzyste lub ich potomstwo według wynalazku mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by eksprymować oraz wytwarzać czynniki wzrostu, takie jak VEGF, FGF, EGF, IGF, jak również - środki terapeutyczne, takie jak TWEAK, TWEAKR, TNFR, inne środki przeciwzapalne lub środki angiogeniczne. Przykładowo, gen lub sekwencja kodująca takie czynniki wzrostu lub środki terapeutyczne mogłyby pozostawać w operacyjnym związku z regulowanym promotorem tak, by wytwarzanie czynnika wzrostu lub środka w hodowli mogło być kontrolowane. Komórki według wynalazku mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by wytwarzać inne rekombinacyjne produkty o dobroczynnym wpływie na transplantację takie, jak czynniki przeciwzapalne, przykładowo, anty-GM-CSF, anty-TNF, anty-IL-1, anty-IL-2 oraz tym podob16
PL 210 872 B1 ne. Alternatywnie, komórki mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej by powodować knock out ekspresji natywnych produktów genowych, które promują stan zapalny, przykładowo, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, lub powodować knock out ekspresji MHC w celu obniżenia ryzyka odrzucenia. Ponadto, komórki mogą być poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej z przeznaczeniem do stosowania w terapii genowej, by dostosować poziom aktywności genowej u pacjenta aby wspomagać lub poprawić wyniki transplantacji śródbłonka. Komórki poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej mogą być przesiewane w celu selekcji tych linii komórkowych, które powodują łagodzenie symptomów choroby reumatycznej lub reakcji zapalnych in vivo i/lub pozwalają uniknąć immunologicznego nadzoru i odrzucenia.
Konwencjonalne rekombinacyjne techniki DNA są stosowane do wstawiania pożądanego polinukleotydu do obecnych komórek macierzystych lub ich potomstwa. Precyzyjny sposób stosowany do wprowadzenia polinukleotydu (przykładowo, genu zamieniającego) nie ma krytycznego znaczenia dla obecnego wynalazku. Przykładowo, fizyczne sposoby wstawiania polinukleotydów do komórek obejmują mikroiniekcję oraz elektroporezę. Chemiczne sposoby, takie jak współstrącanie z fosforanem wapnia oraz wstawianie polinukleotydów do lipozomów są również standardowymi metodami wstawiania polinukleotydów do ssaczych komórek. Przykładowo, DNA lub RNA mogą być wstawione przy użyciu standardowych wektorów, takich jak te pochodzące z mysich i ptasich retrowirusów (patrz, przykładowo, Gluzman i wsp., 1988, Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Standardowe metody rekombinacyjnej biologii molekularnej są dobrze znane (patrz, przykładowo, Ausubel i wsp., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), a wirusowe wektory dla terapii genowej opracowano i z powodzeniem stosowano klinicznie (Rosenberg, i wsp., 1990, N. Engl. J. Med, 323:370). Inne sposoby, takie jak wchłanianie nieosłoniętego polinukleotydu z matrycy powleczonej DNA są również objęte obecnym wynalazkiem (patrz, przykładowo, patent nr US 5,962,427, który jest tu włączony jako odnośnik literaturowy). Przykłady protein, polinukleotydów lub związków, które mogą być wytwarzane przez rekombinacyjne komórki macierzyste według wynalazku obejmują GMCSF, IGF, EGF, VEGF, FGF oraz tym podobne.
W dalszym przykładzie wykonania, śródbłonkowe komórki macierzyste według wynalazku mogą być hodowane in vitro w celu wytwarzania produktów biologicznych z dużą wydajnością. Przykładowo, takie komórki, które w naturalny sposób wytwarzają szczególny biologiczny produkt będący przedmiotem zainteresowania (przykładowo, czynnik wzrostu, czynnik regulatorowy lub hormon peptydowy i tym podobne) lub by ł y poddane obróbce metodami inż ynierii genetycznej w celu wytwarzania produktu biologicznego, mogą być namnażane przez klonowanie. Jeżeli komórki wydzielają produkt biologiczny do odżywczej pożywki, produkt może być łatwo wyizolowany z wyczerpanej lub kondycjonowanej pożywki przy użyciu standardowych technik wydzielania, przykładowo, takich jak różnicowe strącanie protein, chromatografia jonowymienna, chromatografia filtracyjna na żelu, elektroforeza oraz HPLC, żeby wymienić jedynie kilka. Alternatywnie, produkt biologiczny będący przedmiotem zainteresowania może pozostawać w obrębie komórki, a zatem jego zebranie może wymagać poddania komórek lizie. Wówczas ów produkt biologiczny może następnie być oczyszczony przy użyciu dowolnej, jednej lub więcej niż jednej z wyżej wymienionych technik.
Terapeutyczne zastosowania komórek macierzystych według wynalazku obejmują transplantowanie komórek macierzystych, populacji komórek macierzystych lub ich komórek potomnych do osobników, w celu leczenia różnych patologicznych stanów, w tym chorób i zaburzeń będących następstwem uszkodzenia mięśnia sercowego, zaburzeń czy chorób krążeniowych lub naczyniowych, jak również regenerację i naprawę tkanek. Komórki macierzyste lub populacje komórek macierzystych (włączając w to genetycznie zmienione komórki macierzyste) wprowadzane są do organizmu osobnika potrzebującego takich komórek macierzystych lub potrzebującego proteiny lub związku kodowanego lub wytwarzanego przez genetycznie zamienioną komórkę. Przykładowo, w pewnym wykonaniu, komórki macierzyste mogą być podawane pacjentowi choremu na raka, który przebył chemoterapię, która zabiła, zredukowała lub uszkodziła śródbłonkowe komórki macierzyste, komórki śródbłonkowe lub śródbłonek osobnika.
Jeżeli komórki macierzyste pochodzą ze źródła heterologicznego względem podmiotu będącego ich odbiorcą, typowo jest stosowana towarzysząca terapia immunosupresyjna, w której przykładowo podaje się cyklosporynę lub FK506 jako środek immunosupresyjny. Jednakże w związku z niedojrzałym stanem komórek macierzystych według wynalazku, taka terapia immunosupresyjna może nie być wymagana. W związku z tym, w pewnym wykonaniu, komórki macierzyste według wynalazku mogą być podawane odbiorcy pod nieobecność terapii immunomodulatorowej (przykładowo, imPL 210 872 B1 munsupresyjnej). Alternatywnie, komórki mogą być zakapsułkowane w błonie, która pozwala na wymianę płynów, lecz zapobiega kontaktowi komórka/komórka. Transplantacja komórek w formie mikrokapsułek jest znana w stanie techniki, przykładowo, Balladur i wsp., 1995, Surgery 117:189-94, 1995 oraz Dixit i wsp., 1992, Cell Transplantation 1:275-79.
Komórki mogą być bezpośrednio wprowadzone do krwi obwodowej lub zdeponowane w obrębie innych lokalizacji w organizmie, przykładowo, w śledzionie, w trzustce lub na perełkach mikronośnika w otrzewnej. Przykładowo, od 102 do 109 komórek może być transplantowanych jednorazowo, a jeżeli jest to wymagane mogą być przeprowadzone dodatkowe transplantacje.
Różnicowanie komórek macierzystych może być indukowane ex vivo lub alternatywnie, może być indukowane in vivo poprzez kontakt z tkanką (przykładowo, przez kontakt ze śródbłonkowymi komórkami lub komponentami matrycy komórkowej), opcjonalnie, środek różnicujący może być współ-podawany lub podawany następczo osobnikowi, by promować różnicowanie komórek macierzystych.
Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe tutaj stosowane posiadają takie samo znaczenie, jak powszechne przyjęte przez osoby posiadające zwykłe umiejętności z dziedziny, do której należy obecny wynalazek. Wszystkie tytuły oraz podtytuły tutaj występujące są stosowane wyłącznie dla ułatwienia czytania i nie powinny być interpretowane jako ograniczenie zakresu wynalazku. Rozumie się, że wszelkie przypadki użycia liczby pojedynczej [partykuł a, an oraz the w oryginale angielskim] obejmują również liczbę mnogą, jeżeli tylko ich kontekst nie wskazuje wyraźnie na liczbę pojedynczą. Chociaż sposoby i materiały podobne lub równoważne tu opisanym mogą być stosowane w praktyce wynalazku lub przy testowaniu wynalazku, odpowiednie sposoby oraz materiały opisano poniżej. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty oraz inne odnośniki literaturowe tu wymienione są włączone w całości jako odnośniki literaturowe. W razie konfliktu, niniejszy opis wraz z definicjami ma charakter nadrzędny. Ponadto, materiały, sposoby oraz przykłady są jedynie ilustracją, nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku. Następujące przykłady zamieszczono dla ilustracji szczególnych przykładów realizacji, nie zaś w celu ograniczenia zakresu wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Wyodrębnianie śródbłonkowej komórki macierzystej
Objętość 200 cm3 sodowo heparynizowanej ludzkiej krwi rozfrakcjonowano przez odwirowanie na FICOLL™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) o ciężarze właściwym 1,077 w celu wyizolowania PBMC. Wyizolowane komórki PBMC, obecne w kożuszku przeprowadzono ponownie w zawiesinę o stężeniu około i w nie większym niż 100x106 komórek/ml w kompletnej pożywce (EGM2 zawierającej IGF, FGF, EGF oraz VEGF + 15% FCS; Cambrex Bioscience, Inc., Baltimore, MD). Dziesięć μg/ml mysich przeciwciał anty-P1H12 (Chemicon MAB16985) dodano do tych komórek i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
Komórki przemyto dwukrotnie kompletną pożywką lub solanką buforowaną fosforanami (PBS) i przeprowadzono ponownie w zawiesinę o stężeniu około - lecz nie większym niż 100x106 komórek w 1 ml PBS. Dwadzieścia μl wypełnienia magnetycznego anty-muIgG-MACS (numer katalogowy 130047-101, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) dodano do 20 μl zawierających około 10 x 106 komórek aby oznakować komórki przeciwciałem i inkubowano komórki w temperaturze 4°C przez 15 minut. Komórki znakowane przeciwciałem przemyto jeden raz w PBS + 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i przeprowadzono w zawiesinę o końcowej objętości 5 ml PBS + 3% BSA.
Komórki znakowane przeciwciałem przepuszczono następnie przez wstępnie przygotowaną kolumnę MACS LS umieszczoną w magnetycznym separatorze VARIOMACTM (Miltenyi Biotec). Zebrano frakcję wypływającą z kolumny i odrzucono, a kolumnę przemyto trzykrotnie PBS + 3% BSA. Znakowane komórki usunięto z kolumny przemywając kolumnę pod nieobecność pola magnetycznego. Wymytą frakcję przemyto i zliczono.
Pozytywną frakcję komórek hodowano w kompletnej pożywce w stężeniu około - lecz typowo nie wyższym niż, 1-5x106 komórek na wgłębienie stosując płytkę o 6 wgłębieniach pokrytą kolagenem IV (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Po 48 godzinach, nieprzyczepione komórki usunięto. Pożywka ulegała połowicznemu wyczerpaniu dwa razy na tydzień.
P r z y k ł a d 2. Badanie właściwości śródbłonkowych komórek macierzystych
Komórki scharakteryzowano metodą FACS w momencie wyodrębnienia oraz w różnych punktach czasowych wskazanych w poniższych Tablicach.
W momencie wyodrębnienia, komórki eksprymowały antygen P1H12, CD148 oraz AC133 na stosunkowo wysokich poziomach. Komórki były negatywne względem CD202b oraz CD144. W niektó18
PL 210 872 B1 rych izolatach subpopulacja komórek CD45+ eksprymowała również CD34+. Ilość tych podwójnie pozytywnych komórek CD45+/CD34+ wyrażona jako procent ogólnej ilości komórek była zmienna i w niektórych przypadkach wynosił a 100%. W Tablicy 1 przedstawiono zmierzone markery obecne na komórkach w momencie wyodrębnienia. Jako kontrolę do cytometrii przepływowej zastosowano mysią IgG1; dane dla kontroli przedstawiono w Tablicy 1.
T a b l i c a 1. Analiza przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej oraz fenotyp komórek po wzbogaceniu względem komórek P1H12+
| Powierzchniowe markery | dawca 46 | dawca 526 | dawca 55 | dawca 374 | dawka 119b | dawca 301 | dawca 512 | dawca 143 | dawca 546 |
| Dzień próby | d0 | d0 | d0 | d0 | d0 | d0 | d0 | d0 | d0 |
| kontrola | 3,6 | 6,93 | 8,54 | 7,96 | 3,97 | 2,32 | 3,27 | 2,3 | 3,05 |
| P1H12 | 23,43 | 50,2 | 53,99 | 31,71 | 44,81 | 88,18 | 20,58 | 28,77 | 17,97 |
| CD148 | NW | 76,17 | 93,08 | 37,23 | 88,76 | 51,99 | NW | NW | NW |
| CD144 | NW | 20,34 | 36,35 | 3,5 | 18,06 | 2,4 | 4,43 | 3,9 | 1,78 |
| AC 133 | NW | 89,79 | 96,01 | 73,01 | 92,23 | 95,44 | 33,71 | 66 | 33 |
| CD45 | 98,56 | 98,61 | 93,02 | 95,16 | 99,24 | 94 | 97,08 | 96,3 | 96,3 |
| CD34 | NW | 0,86 | 1,51 | 4,72 | NW | 50,02 | 1,4 | 96,3 | 1,96 |
| CD202b | NW | 7,65 | 12,23 | 0,16 | 7,26 | 0,87 | 3,31 | 0,56 | 0,59 |
| CD45/CD34 podwójnie pozytywne | NW | 0,86 | 1,51 | 4,72? | 99,24 | 50,02 | 1,4 | 96,3 | 1,96 |
| aVEGFR2 | NW | NW | NW | NW | NW | NW | 9,63 | 1,6 | 0,79 |
| P1H12/AC133 podwójnie pozytywne | NW | NW | NW | NW | NW | NW | 16,42 | 54,25 | 28,49 |
| CD34/AC133 podwójnie pozytywne | NW | NW | NW | NW | NW | NW | 8,92 | 30,06 | 47,96 |
NW - niewykrywalny
Podczas hodowli wygląd śródbłonkowych komórek macierzystych uległ zmianie i zmieniły się a markery obecne na komórkach, jak to przedstawiono w Tablicy 2.
T a b l i c a 2. Podsumowanie zmian w czasie markerów powierzchniowych dla pojedynczego dawcy w czasie
| tuż przed przeniesieniem | tuż przed przeniesieniem | Przejście 5 | Przejście 7 | Przejście 12 | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| DAWCA #46 | wyjściowe wyodrębnienie | Dzień 14 | Dzień 22 | Dzień 35 | Dzień 45 | Dzień 59 |
| kontrola | 3,6 | 6,9 | 9,31 | 6,26 | 9,93 | 5,27 |
| P1H12 | 23,43 | 33,28 | 97,85 | 75,06 | 99,27 | 91,44 |
| CD148 | NW | 97,53 | 51,31 | 87,74 | 92,66 | 91,93 |
| CD144 | NW | 8,48 | 98,96 | 83,88 | 66,85 | 89,05 |
| AC 133 | NW | NW | 20,15 | 8,56 | 31,56 | NW |
| CD45 | 98,56 | 16,45 | 2,8 | 0,56 | 0,45 | 0,25 |
PL 210 872 B1 cd. tablicy 2
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| CD34 | NW | 0 | 70,44 | 3,56 | 2,14 | 16,06 |
| CD202b | NW | 2,07 | 97,25 | 95,07 | 88,44 | 94,09 |
| CD45/CD34 podwójnie pozytywny | NW | 83,5 | 7,77 | 1,44 | 0,54 | 2,28 |
NW - niewykrywalny
P r z y k ł a d 3. Powierzchniowa migracja komórek śródbłonkowych pochodzą cych od komórek macierzystych z ludzkiej krwi obwodowej w odpowiedzi na bodziec oraz wpływ inhibitorów migracji
Zastosowano próbę na powierzchniową migrację komórek śródbłonkowych (na zamykanie rany) do ilościowego oznaczenia migracji komórek śródbłonkowych pochodzących od komórek macierzystych z ludzkiej krwi obwodowej w odpowiedzi na PMA, EGF oraz inne bodźce migracyjne. W tej próbie, migrację komórek śródbłonkowych mierzono jako szybkość zamykania okrągłej rany w hodowanej monowarstwie komórek. Szybkość zamknięcia rany jest liniowa w przypadku nerkowych oraz skórnych mikronaczyniowych komórek śródbłonkowych i jest dynamicznie regulowana przez środki, które stymulują oraz inhibitują angiogenezę in vivo. Zarówno nerkowe mikronaczyniowe komórki śródbłonkowe, jak i skórne mikronaczyniowe komórki migrują w odpowiedzi na PMA oraz EGF, a migracja ta może być regulowana poprzez dodanie antyangiogenicznych środków do hodowli testującej migrację (Wiley i wsp., 2001, Immunity 15: 837-46). Wyodrębniono komórki macierzyste z ludzkiej krwi obwodowej tak jak to tu opisano, po czym wyodrębniono i prowadzono hodowlę ich komórek potomnych - pierwotnych komórek śródbłonkowych pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej, hPBEC, oraz stosowano między przejściami 6-11, jak tutaj opisano. Powtarzalne okrągłe uszkodzenia, rany (o średnicy 600-800 mikronów), wytworzono w konfluentnych monowarstwach hPBEC hodowanych przez noc przy niedoborze surowicy (DMEM + 0,5% FES), w stężeniu około 80.000 komórek/wgłębienie stosując punktak o końcu pokrytym silikonem. W momencie kaleczenia pożywkę (DMEM + 0,1% FES) wzbogacono 5 ng/ml PMA (12-myrystynian-13-octan forbolu), 40 ng/ml EGF lub kombinacją 5 ng/ml PMA lub EGF i inhibitorów migracji. Resztkowy obszar rany mierzono w funkcji czasu (0-14 godzin) przy użyciu mikroskopu oraz programu analizującego obraz (Bioquant; Nashville, TN). Względną szybkość migracji obliczono dla każdego środka i kombinacji środków jako liniową regresję resztkowego obszaru rany w czasie. Wyniki przedstawiono na rysunkach Fig. 1-2. Komórki hPBEC dobrze migrowały w odpowiedzi na PMA (>=50%) (Fig. 1) oraz wolniej w odpowiedzi na EGF (>=35%) (Fig. 2).
Dodanie anty-angiogenicznych środków huTekΔFc (WO 00/75323), TweakR.Fc (WO 01/45730), nektyny-3a-Fc (E7L4.Fc) (WO 02/28902) oraz CD148 mAb w podanych stężeniach hamowało migrację hPBEC indukowaną przez PMA, odpowiednio w 40%, 40%, 70% oraz 100% w porównaniu z proteiną kontrolną huIgG (Fig. 1). Dodanie antyangiogenicznych środków: huTekΔFc, TweakR.Fc, nektyny-3a-Fc (B7L4.Fc) oraz anty-CD148 mAb we wskazanych stężeniach inhibitowało migrację hPBEC indukowaną przez EGF, odpowiednio w 50%, 100%, 95% oraz 100% w porównaniu z proteiną kontrolną huIgG (Fig. 2).
P r z y k ł a d 4. Próba na migrację przez barierę
Śródbłonkowe komórki macierzyste hodowano przez noc (18 godzin) w pożywce (przykładowo, pożywka EGM-2, Clonetics, Walkersville, MD) oraz w obecności lub pod nieobecność PMA (50 ng/ml), po czym komórki przemyto i znakowano w PBS zawierającej 4 μM barwnika kalceinowego w ciągu dwóch godzin. Po znakowaniu kalceiną komórki wzbudzono do fluorescencji poprzez wzbudzanie przy 488 nm. Komórki przemyto w PBS, ponownie rozproszono w podstawowej pożywce (EBM +/-0,1% FBS) oraz umieszczono w hodowli we wkładkach fluoroblokowych z porami o wymiarach 3 mikrony do płytek o 24 wgłębieniach. Pięćdziesiąt tysięcy komórek macierzystych zawierających zróżnicowane śródbłonkowe komórki potomne hodowano w 300 mikrolitrach podstawowej pożywki we wkładce fluoroblokowej, a wkładki zawierające te komórki umieszczono na sterylnych płytkach do hodowli o 24 wgłębieniach, zawierających 1 ml pożywki z cytokinami i/lub surowicą posiadającej zdolność spowodowania migracji lub ruchu (haptotaksa) komórek według wynalazku przez ścięty 3 mikronowy filtr w formie wkładki do płytki o 24 wgłębieniach. Migrację komórek przez filtr wykrywano przez pomiary poziomu fluorescencyjnej emisji obserwowanej przez 530 nm w dolnym wgłębieniu przy użyciu licznika wieloznacznikowego. Wyniki migracji były podobne do wyników badań w próbie na migrację po powierzchni z przykładu 3, powyżej.
PL 210 872 B1
P r z y k ł a d 5. Próba z kapilarą na tworzenie strun
Matrycę typu MATRIGELTM (Becton Dickinson, Bedford, MA), solubilizowany podstawowy preparat membranowy wyekstrahowany z mysiego mięsaka Engel-bretha-Holma-Swarma (EHS), rozmrożono przez noc na lodzie w temperaturze 4°C. Płytkę o 24 wgłębieniach (BD Labware, Franklin
Lakes, NJ) oraz czubki 1000 μΐ pipet chłodzono również przez noc w temperaturze 4°C. W dniu przeprowadzania próby, wgłębienia płytki równomiernie powleczono 300 μl MATRIGEL™ na wgłębienie, dbając aby nie wprowadzić pęcherzyków. Powleczone płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut, pozwalając matrycy na polimeryzację.
Śródbłonkowe komórki macierzyste i/lub śródbłonkowe komórki potomne komórek macierzystych poddano trypsynizacji, przemyto w świeżej, kompletnej pożywce (jak to opisano w przykładzie 1) oraz zliczono. Trzydzieści tysięcy komórek na wgłębienie naniesiono na płytkę w 100 μl pożywki wzrostowej i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Dodano pięćset mikrolitrów świeżej pożywki wzrostowej.
Przeprowadzono obserwację komórek po 4 oraz 5 godzinach po naniesieniu na płytkę. Kontrolne komórki identycznie traktowane, lecz bez naniesienia na MATRIGEL™ użyto do porównań. Po czterech godzinach komórki kontrolne wykazywały ogólną charakterystykę rozproszonego przylegania wyhodowanych komórek tkankowej hodowli na plastiku. Komórki wzrastane na MATRIGELTM przez 4 godziny utworzyły liczne ogniska z komórkami łączącymi te ogniska wyglądających jak świetliste struny. Pojawienie się obfitych świetlistych struktur było wyraźne przy obserwacji po 24 godzinach w hodowli.
P r z y k ł a d 6. Umiejscowienie in vivo podawanych komórek macierzystych oraz ich komórek potomnych
Niniejszy przykład wykazuje, że komórki wyizolowane w sposób tu opisany migrują in vivo do obszarów wykazujących aktywność angiogeniczną i/lub naczyniogeniczną.
Komórki śródbłonkowe pochodzące z ludzkiej krwi obwodowej od Dawcy 1017 (hPBEC; rozmnożone ze śródbłonkowych komórek potomnych pochodzących z krwi tak jak to opisano w przykładzie 3) znakowano in vitro jednomikronowymi perełkami o zielono-żółtej fluorescencji (emisja przy 515 nM; Molecular Probes, Eugene, OR). Znakowanie komórek przeprowadzono poprzez inkubowanie 1017 hPBEC od Dawcy 1017 (5x106 perełek na 1x106 komórek) przez 18 godzin. Przylegające komórki, które wchłonęły perełki, usunięto poprzez krótkotrwałą trypsynizację i przemyto raz w PBS w celu usunięcia nieprzyswojonych perełek i ponownie naniesiono na płytkę w pożywce wzrostu EC (jak to opisano w przykładzie 1) i pozwolono im na ponowne przylgnięcie. Znakowanie komórek potwierdzono mikroskopowo w odwróconym świetle oraz przez immunofluorescencję. W dniu iniekcji (patrz niżej), znakowane hPBEC od Dawcy 1017 usunięto na drodze krótkotrwałej trypsynizacji i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w PBS w celu dokonania doskórnej (i.d.) lub dożylnej (i.v.) iniekcji. Znakowane ludzkie mikronaczyniowe śródbłonkowe komórki skórne (hMVEC-d) służyły jako kontrola, a 5 x 106 samych fluorescencyjnych perełek, jako takich - podanych doskórnie stanowiło kontrolę negatywną.
Serca nowonarodzonych - młodszych niż 24 godziny, myszy BALB/c prze-transplantowano pod narkozą do małżowiny usznej (obustronnie) myszy BALB/c SCID (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) płci żeńskiej w wieku 12 tygodni. Bezpośrednio po transplantacji, myszom podano w iniekcji do ucha, w odległości 4-5 mm od przeszczepionego serca albo znakowane komórki hPBEC od Dawcy 1017 (1x106 komórek i.d. - doskórnie lub 2x106 komórek i.v. - dożylnie), same perełki fluorescencyjne (5x106 perełek i.d. - doskórnie) lub znakowane komórki hMVEC-d (1x106 komórek).
Bezpośrednio po doskórnym wstrzyknięciu, sporządzano obraz ucha uśpionej myszy przy zastosowaniu systemu mikroskopowego zawierającego odwrócony mikroskop z napędem wyposażony w obiektywy 4x oraz 10x oraz w kamerę CCD w celu wykrycie niskiego poziomu światła fluorescencyjnego, sterowanego przez program OPENLABTM (Improvision, Inc., Lexington, MA), w celu potwierdzenia depozytu zielonych immunofluorescencyjnych komórek w miejscu iniekcji. Sporządzano obrazy izograftów wszczepionych w uszy każdej myszy w 24 godziny oraz 144 godziny po transplantacji/wstrzyknięciu komórek.
Obserwowano, że depozyty zarówno żywych znakowanych hPBEC (Dawca 1017) lub samych fluorescencyjnych perełek były bezpośrednio (1-2 godziny) po iniekcji ograniczone do miejsca iniekcji. W 24 godziny po iniekcji, zaobserwowano, że znakowane hPBEC migrowały od miejsca wstrzyknięcia w kierunku ischemicznego serca. Po 144 godzinach po iniekcji, izografty serc pulsowały, a większa ilość znakowanych, podanych w doskórnej iniekcji hPBEC, uległa migracji z miejsca iniekcji w kierunPL 210 872 B1 ku izograftu serca. Niektóre hPBEC uległy migracji do bijącej części izograftu serca, gdzie występuje neounaczynienie lub do obszaru bezpośrednio z nim sąsiadującego. Ani doskórnie podanych (drogą iniekcji i.d.) perełek, ani podanych dożylnie znakowanych komórek nie można było wykryć w 24 godziny ani w 144 godziny po iniekcji. Komórki podane na drodze iniekcji doskórnej zlokalizowano w przestrzeni śródskórnej, blisko wyeksponowanej powierzchni skóry, co pozwalało łatwiej śledzić je za pomocą urządzenia do sporządzania obrazu, w porównaniu do komórek wstrzykniętych dożylnie, które trzeba było tropić histologicznie.
Chociaż powyższy wynalazek został opisany bardziej szczegółowo w przykładach celem ilustracji i dla jaśniejszego objaśnienia, będzie zrozumiałym dla osób o zwykłym doświadczeniu w tej dziedzinie, że w świetle ujawnienia zgodnego z obecnym wynalazkiem, pewne zmiany i modyfikacje mogą być w nim dokonane bez oddalania się od ducha wynalazku i nie wychodząc poza zakres wynalazku zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach.
Claims (22)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych, na drodze pozytywnej selekcji z populacji oryginalnej, przy czym wspomniane komórki macierzyste cechują się zdolnością do wytworzenia komórek śródbłonkowych i/lub śródbłonkowo-podobnych.
- 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+ w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.
- 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+ w stężeniu co najmniej około 1000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.
- 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+ w stężeniu od około 1000-krotnie do około 4000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera jeden lub więcej niż jeden z markerów wybranych z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 w stężeniu wyższym niż we wspomnianej oryginalnej populacji komórek.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomnianym przeciwciałem jest monoklonalne przeciwciało.
- 7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniane wzbogacanie obejmuje:(a) kontaktowanie wspomnianej oryginalnej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek związanych ze wspomnianą cząsteczką;(b) kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z markerem wybranym z grupy obejmującej CD148, AC133, CD45 i CD34 oraz usuwanie ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek niezwiązanych ze wspomnianą cząsteczką;(c) kontaktowanie wspomnianej oryginalnej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz selekcję pod kątem uzyskania wspomnianej wzbogaconej populacji komórek, komórek niezwiązanych ze wspomnianą cząsteczką;(d) kontaktowanie wspomnianej wzbogaconej populacji komórek z cząsteczką, która specyficznie wiąże się z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej CD144, CD202b, VEGFR2 oraz usuwanie komórek, które są związane ze wspomnianą cząsteczką ze wspomnianej wzbogaconej populacji komórek.
- 8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202blub VEGFR2, w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.PL 210 872 B1
- 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, ż e wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202blub VEGFR2, w stężeniu co najmniej około 1000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.
- 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych zawiera komórki macierzyste P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202blub VEGFR2, w stężeniu od około 1000-krotnie do około 4000-krotnie wyższym niż wspomniana oryginalna populacja komórek.
- 11. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że wspomniana wzbogacona populacja komórek macierzystych jest ponadto:(a) wzbogacona w komórki macierzyste CD34+ lub CD45+;(b) wzbogacona w komórki macierzyste CD34- oraz CD45+;(c) wzbogacona w komórki macierzyste CD34+ oraz CD45+.
- 12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniane przeciwciało połączone jest z wykrywalną jednostką lub jest przyłączone do stałego podłoża.
- 13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że wspomniana wykrywalna jednostka jest ugrupowaniem fluorescencyjnym, ugrupowaniem kolorymetrycznym lub ugrupowaniem magnetycznym.
- 14. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że wspomniane stałe podłoże jest powierzchnią tworzywa sztucznego, powierzchnią szklaną, agarozą, akrylamidem, lektyną lub cząstką magnetyczną.
- 15. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana oryginalna populacja komórek pochodzi od ssaka.
- 16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że wspomnianym ssakiem jest ssak naczelny.
- 17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że wspomnianym naczelnym jest człowiek.
- 18. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana oryginalna populacja komórek pochodzi z krwi obwodowej, ze szpiku kostnego lub z płodowej tkanki wątroby.
- 19. Wzbogacona populacja komórek macierzystych, zawierająca komórki macierzyste w stężeniu co najmniej około 100-krotnie wyższym niż wyjściowa populacja komórek, wzbogacona w komórki macierzyste będące P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- oraz VEGFR2- i będące CD34+ lub CD45+, przy czym wspomniane komórki macierzyste cechują się zdolnością do wytworzenia komórek śródbłonkowych i/lub śródbłonkowo-podobnych.
- 20. Populacja komórek potomnych pochodzących od wzbogaconej populacji komórek macierzystych jak określono w zastrz. 19, przy czym wspomniane komórki potomne są P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, posiadają wyższą zdolność proliferacji niż komórki HUVEC i MVEC oraz zawieraj ą ciał ka Weibel-Palade.
- 21. Wzbogacona populacja komórek macierzystych jak określono w zastrz. 19 lub populacja komórek potomnych jak określono w zastrz. 20, do stosowania w terapii.
- 22. Wzbogacona populacja komórek macierzystych lub populacja komórek potomnych według zastrz. 21, do stosowania określonego we wskazanym zastrzeżeniu, gdzie terapia jest leczeniem zaburzenia lub choroby układu krążenia, albo zaburzenia lub choroby naczyniowej bądź działaniem nakierowanym na regenerację lub naprawę tkanki.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34349801P | 2001-12-21 | 2001-12-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL374312A1 PL374312A1 (pl) | 2005-10-03 |
| PL210872B1 true PL210872B1 (pl) | 2012-03-30 |
Family
ID=23346359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL374312A PL210872B1 (pl) | 2001-12-21 | 2002-12-20 | Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych oraz wzbogacona populacja komórek macierzystych i populacja komórek potomnych |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7833697B2 (pl) |
| EP (1) | EP1465983B1 (pl) |
| JP (2) | JP2005514062A (pl) |
| AT (1) | ATE462782T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002360741B2 (pl) |
| CA (1) | CA2469472C (pl) |
| DE (1) | DE60235836D1 (pl) |
| ES (1) | ES2341948T3 (pl) |
| MX (1) | MXPA04006154A (pl) |
| PL (1) | PL210872B1 (pl) |
| WO (1) | WO2003060077A2 (pl) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL210872B1 (pl) | 2001-12-21 | 2012-03-30 | Immunex Corp | Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych oraz wzbogacona populacja komórek macierzystych i populacja komórek potomnych |
| US7470538B2 (en) * | 2002-12-05 | 2008-12-30 | Case Western Reserve University | Cell-based therapies for ischemia |
| EP1583422B1 (en) * | 2002-12-05 | 2016-03-30 | Case Western Reserve University | Cell-based therapies for ischemia |
| US20070269412A1 (en) | 2003-12-02 | 2007-11-22 | Celavie Biosciences, Llc | Pluripotent cells |
| US20050232905A1 (en) * | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Yeh Edward T | Use of peripheral blood cells for cardiac regeneration |
| US7790458B2 (en) * | 2004-05-14 | 2010-09-07 | Becton, Dickinson And Company | Material and methods for the growth of hematopoietic stem cells |
| CA2567578C (en) | 2004-06-01 | 2018-04-24 | In Motion Investment, Ltd. | In vitro techniques for obtaining stem cells from blood |
| JP2008528041A (ja) * | 2005-01-31 | 2008-07-31 | コグネート セラピューティクス，インコーポレーテッド | 内皮細胞の性質を示す脂肪由来成体間質細胞 |
| CA2623405C (en) * | 2005-09-20 | 2014-11-25 | Immunivest Corporation | Methods and composition to generate unique sequence dna probes labeling of dna probes and the use of these probes |
| US9134237B2 (en) | 2005-09-20 | 2015-09-15 | Janssen Diagnotics, LLC | High sensitivity multiparameter method for rare event analysis in a biological sample |
| ES2485387T3 (es) * | 2005-11-07 | 2014-08-13 | Amorcyte, Inc. | Composiciones y métodos de reparación de lesiones vasculares |
| US20110076255A1 (en) | 2005-11-07 | 2011-03-31 | Pecora Andrew L | Compositions and methods for treating progressive myocardial injury due to a vascular insufficiency |
| US9034316B2 (en) * | 2006-10-24 | 2015-05-19 | Amorcyte, Llc | Infarct area perfusion-improving compositions and methods of vascular injury repair |
| US8637005B2 (en) | 2005-11-07 | 2014-01-28 | Amorcyte, Inc. | Compositions and methods of vascular injury repair |
| TW200734462A (en) | 2006-03-08 | 2007-09-16 | In Motion Invest Ltd | Regulating stem cells |
| WO2008085229A2 (en) * | 2006-11-15 | 2008-07-17 | Arteriocyte Inc. | Cell-based therapies for treating liver disease |
| WO2008107652A1 (en) * | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Smith & Nephew Plc | Apparatus and method for filter cleaning by ultrasound, backwashing and filter movement during the filtration of biological samples |
| JP5607535B2 (ja) * | 2008-10-24 | 2014-10-15 | 株式会社クラレ | 細胞培養キット、スクリーニング方法、及び細胞培養キットの製造方法 |
| US20100209399A1 (en) * | 2009-02-13 | 2010-08-19 | Celavie Biosciences, Llc | Brain-derived stem cells for repair of musculoskeletal system in vertebrate subjects |
| CN103234993A (zh) * | 2013-04-11 | 2013-08-07 | 哈尔滨体育学院 | 一种优秀冰雪运动员内皮祖细胞鉴定方法 |
| CN103484423B (zh) * | 2013-07-18 | 2015-06-24 | 浙江大学 | 一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法 |
| CN113444637B (zh) * | 2021-01-28 | 2022-08-05 | 潍坊医学院 | 一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统及方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5637481A (en) * | 1993-02-01 | 1997-06-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell |
| US5980887A (en) | 1996-11-08 | 1999-11-09 | St. Elizabeth's Medical Center Of Boston | Methods for enhancing angiogenesis with endothelial progenitor cells |
| EP1060242A4 (en) * | 1998-01-23 | 2003-09-17 | Imclone Systems Inc | Purified populations of stem cells |
| JP2002537761A (ja) * | 1998-11-24 | 2002-11-12 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | トランスジェニック循環内皮細胞 |
| US20040131585A1 (en) | 2000-06-05 | 2004-07-08 | Silviu Itescu | Identification and use og human bone marrow-derived endothelial progenitor cells to improve myocardial function after ischemic injury |
| PL210872B1 (pl) | 2001-12-21 | 2012-03-30 | Immunex Corp | Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla P1H12 do wytwarzania wzbogaconej populacji komórek macierzystych oraz wzbogacona populacja komórek macierzystych i populacja komórek potomnych |
-
2002
- 2002-12-20 PL PL374312A patent/PL210872B1/pl unknown
- 2002-12-20 EP EP02796023A patent/EP1465983B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-20 JP JP2003560164A patent/JP2005514062A/ja not_active Withdrawn
- 2002-12-20 DE DE60235836T patent/DE60235836D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-20 AT AT02796023T patent/ATE462782T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-12-20 US US10/327,322 patent/US7833697B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-20 ES ES02796023T patent/ES2341948T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-20 MX MXPA04006154A patent/MXPA04006154A/es active IP Right Grant
- 2002-12-20 AU AU2002360741A patent/AU2002360741B2/en not_active Ceased
- 2002-12-20 WO PCT/US2002/041161 patent/WO2003060077A2/en active Application Filing
- 2002-12-20 CA CA2469472A patent/CA2469472C/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-12-19 JP JP2007327141A patent/JP4447033B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL374312A1 (pl) | 2005-10-03 |
| US20030148512A1 (en) | 2003-08-07 |
| EP1465983B1 (en) | 2010-03-31 |
| AU2002360741B2 (en) | 2008-07-17 |
| WO2003060077A2 (en) | 2003-07-24 |
| ATE462782T1 (de) | 2010-04-15 |
| JP2005514062A (ja) | 2005-05-19 |
| EP1465983A4 (en) | 2006-01-11 |
| AU2002360741A1 (en) | 2003-07-30 |
| DE60235836D1 (de) | 2010-05-12 |
| CA2469472C (en) | 2013-11-26 |
| JP2008148702A (ja) | 2008-07-03 |
| CA2469472A1 (en) | 2003-07-24 |
| EP1465983A2 (en) | 2004-10-13 |
| WO2003060077A3 (en) | 2003-12-31 |
| ES2341948T3 (es) | 2010-06-30 |
| JP4447033B2 (ja) | 2010-04-07 |
| US7833697B2 (en) | 2010-11-16 |
| MXPA04006154A (es) | 2004-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4447033B2 (ja) | 内皮幹細胞、該細胞集団、該細胞の単離法および使用法 | |
| Critser et al. | Isolating and defining cells to engineer human blood vessels | |
| Kumar et al. | Heterogeneity in endothelial cells from large vessels and microvessels | |
| Zammaretti et al. | Adult ‘endothelial progenitor cells’: renewing vasculature | |
| AU2004316477B2 (en) | Stem cell populations and methods of use | |
| ES2409128T3 (es) | Procedimientos de mejora de anidamiento e injerto de células madre | |
| CA2341754A1 (en) | Stem cells bearing an fgf receptor on the cell surface | |
| JP2024128116A (ja) | 細胞群及びその取得方法 | |
| US20100158874A1 (en) | Compositions and Methods for Treating Peripheral Vascular Diseases | |
| EP1776453B1 (en) | Isolation of endothelial progenitor cell subsets and methods for their use | |
| KR101132858B1 (ko) | 내피전구세포의 체외 증폭방법 | |
| CN103585179A (zh) | 一种药物组合物及其在制备治疗骨髓造血功能障碍疾病的药物中的应用 | |
| JPWO2005054459A1 (ja) | 造血幹細胞あるいは血管内皮前駆細胞の製造方法 | |
| Askenasy et al. | Characterization of adhesion and viability of early seeding hematopoietic cells in the host bone marrow in vivo and in situ | |
| Braham | In Vitro Bone Marrow Niches for Hematopoietic Cells: to have and to hold, in sickness and in health | |
| JP2022017977A (ja) | 細胞、組成物及び治療用組成物 | |
| Rashidi | Regional localization and regulation of hematopoietic stem cells in the bone marrow stem cell niche | |
| Kanthi | Simulation of the bone marrow microenvironment | |
| Mendes | Development of human osteogenic cell sheets co-cultured with endothelial and pericyte-like cells |