PL188502B1

PL188502B1 - Enzym reduktaza czteroazotanu pentaerytrytu (PETN), cząsteczka DNA, zrekombinowany wektor DNA, komórka gospodarza, sposób wytwarzania enzymu reduktazy PETN, czujnik biologiczny, sposób biologicznego oczyszczania środowiska, sposób wykrywania PETN w próbce oraz szczep bakteryjny Enterobacter cloacae

Info

Publication number: PL188502B1
Application number: PL96324481A
Authority: PL
Inventors: Stephen Nicklin; Peter Roland Binks; Neil Charles Bruce; Christopher Edward French
Original assignee: Secr Defence
Priority date: 1995-07-11
Filing date: 1996-07-08
Publication date: 2005-02-28
Also published as: AU6365296A; DE69626646D1; EP0837941A1; NO980107L; IL122801A; WO1997003201A1; EP0837941B1; PL324481A1; HU224000B1; DE69626646T2; CZ6698A3; US5928859A; NO980107D0; ES2189878T3; NO324210B1; HUP9901395A3; CA2226729C; CZ295656B6; HUP9901395A2; IL122801A0

Abstract

1. Enzym reduktaza czteroazotanu pentaerytrytu (PETN), który katalizuje usu- niecie azotynu z PETN, znamienny tym, ze posiada sekwencje aminokwasowa przed- stawiona na fig. 4. Fig.4. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest enzym reduktaza czteroazotanu pentaerytrytu (PETN), cząsteczka DNA, zrekombinowany wektor DNA, komórka gospodarza, sposób wytwarzania enzymu reduktazy PETN, czujnik biologiczny, sposób biologicznego oczyszczania środowiska, sposób wykrywania PETN w próbce oraz szczep bakteryjny Enterobacter cloacae. Wynalazek znajduje zastosowanie przy wykrywaniu i degradacji biologicznej materiałów wybuchowych.

Estry azotanowe, chociaż pozornie skrajnie rzadkie w przyrodzie, w znaczących ilościach wytwarzane są przez przemysł chemiczny i obejmują, na przykład, ważną klasę materiałów energetycznych znajdujących zastosowania jako materiały wybuchowe i materiały napędowe. Sam PETN ma rozmaity zakres zastosowań, włącznie z zastosowaniem jako materiał wybuchowy w kapiszonach i spłonkach oraz w kompozycjach farmaceutycznych jako składnik aktywny długo działających środków rozszerzających naczynia wieńcowe o wolno narastającej aktywności do zapobiegania napadom dusznicy bolesnej. Zarówno produkcja, jak i przewóz oraz magazynowanie PETN mogą prowadzić do zanieczyszczenia środowiska PETN. Występuje zainteresowanie losami estrów azotanowych w środowisku z powodu ich stosunkowo wysokiej odporności i dlatego też występuje zapotrzebowanie na sposoby usuwania takich zanieczyszczeń ze środowiska bez wytwarzania innych niepożądanych zanieczyszczeń. Istnieje również pilne zapotrzebowanie na lepszy sposób wykrywania PETN, ponieważ obecnie proponowane układy analityczne polegają głównie na stosowaniu dużych i skomplikowanych urządzeń, takich jak chromatografy gazowe lub spektrometry masowe i/lub wymagają specjalnie wyszkolonych techników laboratoryjnych do ich stosowania.

Celem tego wynalazku jest zapewnienie enzymu, który jest zdolny do katalizowania degradacji biologicznej PETN i który może zostać wykorzystany w układzie ochrony biologicznej do usuwania zanieczyszczeń PETN ze środowiska. Dalszym celem jest zapewnienie enzymu, który jest użyteczny do układów wykrywania PETN.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest enzym reduktaza czteroazotanu pentaerytrytu (PETN), który katalizuje usunięcie azotynu z PETN, charakteryzujący się tym, że posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4.

Drugim przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA, charakteryzująca się tym, że koduje enzym reduktazę PETN według wynalazku.

Korzystnie, cząsteczka DNA według wynalazku posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3 lub sekwencję przynajmniej w 70% identyczną wobec sekwencji przedstawionej na fig. 3 kodującej reduktazę PETN zdolną do katalizowania usunięcia azotynu z PETN.

Trzecim przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany wektor dNa, charakteryzujący się tym, że zawiera cząsteczkę DNA według wynalazku.

Czwartym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że jest stransformowana cząsteczką DNA zdefiniowaną, powyżej.

Korzystnie, komórka gospodarza według wynalazku jest stransformowana zrekombinowanym wektorem DNA zawierającym cząsteczkę DNA według wynalazku.

Piątym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania enzymu reduktazy PETN zdefiniowanego powyżej, charakteryzujący się tym, że transformuje się komórkę gospodarza cząsteczką DNA według wynalazku, a następnie hoduje się stransformowaną. komórkę gospodarza, po czym ekstrahuje się enzym reduktazę PETN z podłoża wzrostowego lub z komórki gospodarza po jej rozbiciu.

Korzystnie, komórkę gospodarza transformuje się zrekombinowanym wektorem DNA według wynalazku.

Szóstym przedmiotem wynalazku jest czujnik biologiczny do wykrywania trójazotanu glicerolu (GTN) i/lub dwuazotanu glicerolu (EDGN) w próbce, charakteryzujący się tym, że zawiera środki do kontaktowania próbki z enzymem reduktazą PETN według wynalazku, w obecności NADPH oraz środki do wykrywania wystąpienia reakcji z GTN i/lub EDGN

188 502 katalizowanej przez enzym reduktazę PETN w przypadku obecności któregokolwiek z nich lub obydwu w próbce.

Siódmym przedmiotem wynalazku jest sposób biologicznego oczyszczania środowiska zanieczyszczonego GTN i/lub EGDN, charakteryzujący się tym, że wprowadza się do środowiska zanieczyszczonego GTN i/lub EGDN enzym reduktazę PETN według wynalazku, po czym utrzymuje się mieszaninę w warunkach odpowiednich do degradacji zanieczyszczenia przez enzym reduktazę PETN, umożliwiając usunięcie GTN i/lub EGDN.

Ósmym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania PETN w próbce, charakteryzujący się tym, że poddaje się próbkę reakcji obejmującej usunięcie azotynu z PETN w obecności NADPH i enzymu reduktazy PETN według wynalazku, dopóki wydzielają się NADP i azotyn, po czym wykrywa się wystąpienie tej reakcji.

Korzystnie, wykrywa się NADP uwalniany podczas reakcji.

Dziewiątym przedmiotem wynalazku jest czujnik biologiczny do wykrywania PETN w próbce, charakteryzujący się tym, że zawiera środki do kontaktowania próbki z enzymem reduktazą PETN według wynalazku, w obecności NADPH i środki do wykrywania wystąpienia reakcji PETN katalizowanej przez enzym reduktazę PETN, gdy PETN jest obecny w próbce.

Dziesiątym przedmiotem wynalazku jest sposób biologicznego oczyszczania środowiska zanieczyszczonego PETN, charakteryzujący się tym, że do środowiska wprowadza się enzym reduktazę PETN według wynalazku, po czym utrzymuje się mieszaninę w warunkach odpowiednich do degradacji zanieczyszczenia przez enzym reduktazę PETN, umożliwiając zużycie PETN obecnego w materiale.

Jedenastym przedmiotem wynalazku jest szczep bakteryjny Enterobacter cloacae oznaczony jako „PB2” i zdeponowany pod numerem NCIMB 40718.

Dwunastym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania enzymu reduktazy PETN według wynalazku, charakteryzujący się tym, że hoduje się szczep bakteryjny Enterobacter cloacae NCIMB 40718 według wynalazku w obecności PETN jako źródła azotu, w temperaturze od 20 do 40°C, po czym ekstrahuje się enzym reduktazę PETN z podłoża wzrostowego lub z komórki gospodarza po jej rozbiciu.

Trzynastym przedmiotem wynalazku jest sposób biologicznego oczyszczania środowiska zanieczyszczonego PETN, charakteryzujący się tym, że środowisko inokuluje się próbką izolatu szczepu bakteryjnego Enterobacter cloacae według wynalazku, po czym umożliwia się izolatowi usunięcie PETN obecnego w środowisku.

Jak już wspomniano, enzym według wynalazku posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4.

W oparciu o dane eksperymentalne tej sekwencji aminokwasowej możliwe jest ustalenie, że enzym ten jest przedstawicielem rodziny oksydoreduktaz flawoproteinowych o strukturze cylindra a/β.

Enzym reduktaza PETN charakteryzuje się tym, że w obecności fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (dalej w niniejszym opisie NADPH):

1) katalizuje usunięcie azotynu z PETN; i

2) wykazuje aktywność reduktazy specyficznie wobec estrowego wiązania azotanowego PETN.

Enzym ponadto posiada optimum pH 6,5 i posiada M_r około 40 000 daltonów, jak określono przez sączenie molekularne. Mr podjednostki, jak oceniono przez SDS-PAGE (elektroforezę w żelu poliakryloamidowym), również wynosiła 40 000. Wyniki te sugerują, że reduktaza PETN jest monomerem o Mr około 40 000.

Enzym reduktaza PETN według wynalazku może być poza tym wyróżniony poprzez dodatkowe cechy charakterystyczne, takie jak jego optimum pH, aktywność katalityczna, stabilność termiczna i masa cząsteczkowa. Szczegóły takich dalszych cech charakterystycznych podano poniżej w Przykładzie 3, ale trzeba podkreślić, że te cechy charakterystyczne są zmienne w stopniu zależnym od warunków, w których jest hodowany mikroorganizm wytwarzający enzym i od stopnia oczyszczenia surowego produktu. Zmienność tego rodzaju będzie dobrze zrozumiała dla specjalistów w tej dziedzinie.

Oczyszczony enzym posiada wyraźną żółtą barwę i wykazuje widmo absorpcji charakterystyczne dla utlenionych flawoprotein. Flawina uwalniała się z reduktazy PETN pod wpływem

188 502 temperatury wrzenia, a następnie usunięcia zdenaturowanego białka przez wirowanie, wskazując, że flawina nie jest związana kowalencyjnie. W dwóch układach chromatografii cienkowarstwowej uwolniona flawina współmigrowała z rzeczywistym mononukleotydem flawinowym (FMN), a nie z dinukleotydem flawinoadeninowym (FAD). Standardy flawin poddane procedurze użytej do uwalniania flawiny z reduktazy PETN nie wykazywały żadnych zmian; w szczególności, FAD nie ulegał hydrolizie do FMN. Dlatego też, wyniki te wskazują że enzym jest monomeryczną flawoproteiną, która wiąże FMN niekowalencyjnie.

Cząsteczka DNA według wynalazku jest zwana dalej genem onr (oznaczenie onr od reduktazy organicznego estru azotanowego).

Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie z łatwością zrozumiałe, że po zidentyfikowaniu w niniejszym wynalazku sekwencji materiału genetycznego, który koduje enzym reduktazę PETN w mikroorganizmie E. cloacae PB2, możliwa będzie, zgodnie z dobrze znanymi technikami, transformacja odpowiednich komórek gospodarza genem onr (lub jego pochodną), tak że komórki gospodarza wytwarzać będą (eksprymować) produkt zrekombinowanego genu, tj.' reduktazę PETN. Można tego dokonać jakąkolwiek odpowiednią metodą, taką jak włączenie genu do wektora i transformację wymienionej komórki gospodarza wektorem.

Sposób, w który można wytwarzać takie wektory i żrekombinowany DNA, będzie łatwo zrozumiały dla specjalistów w tej dziedzinie, ponieważ możliwe do stosowania metody, włącznie z wyborem odpowiedniej komórki gospodarza i odpowiednich promotorów, są ogólnie dobrze znane w tej dziedzinie.

Wśród komórek gospodarza, które można użyć do tego celu, odpowiednie może być zastosowanie komórek E. cloacae PB2 stransformowanych dodatkowymi kopiami genu onr.

Stosując komórki gospodarza stransformowane genem onr lub jego pochodną, wstawionym za odpowiednim promotorem komórki gospodarza, możliwe będzie wytwarzanie enzymu reduktazy PETN w ilościach użytecznych przemysłowo, znów przez zastosowanie technik, które są dobrze znane w nauce.

Najdogodniej, proces wytwarzania prowadzi się w sposób ciągły lub półciągły w celu ciągłej ekstrakcji wytwarzanego enzymu z podłoża wzrostowego komórek gospodarza, wykorzystując techniki, które są dobrze znane w nauce. Jeśli komórka gospodarza wytwarza enzym wewnątrzkomórkowo, do ekstrakcji produktu enzymatycznego konieczne będzie rozbicie komórek w hodowli. Odpowiednie komórki gospodarza mogą zapewnić organizmy albo prokariotyczne, albo eukariotyczne. Enzym reduktaza wytwarzana według powyższego sposobu jest zapewniona jako dalszy aspekt obecnego wynalazku.

Działanie nowego enzymu reduktazy według niniejszego wynalazku polega na katalizowaniu redukcji PETN do trój- i dwuazotanów pentaerytrytu poprzez atak na estrowe wiązanie azotanowe PETN. Zdolność do specyficznego atakowania estrowego wiązania azotanowego PETN jest cechą wyróżniającą enzym PETN, której nie posiadają reduktazy dostępne komercjalnie. Opis sposobu identyfikacji produktów reakcji PETN przedstawiono w przykładzie 2 poniżej.

Zdolność nowego enzymu reduktazy PETN do katalizowania usuwania azotynu z PETN w obecności NADPH umożliwia stosowanie enzymu w wykrywaniu PETN.

Dlatego też, według jeszcze dalszego aspektu wynalazku, zapewnia się sposób wykrywania obecności PETN w próbce, który obejmuje poddawanie próbki działaniu enzymu reduktazy PETN według tego wynalazku w obecności NADPH i w warunkach umożliwiających reakcję wszelkiego PETN obecnego w próbce, oraz wykrywanie wystąpienia takiej reakcji. Dogodnie, wykrywanie reakcji można przeprowadzać wykorzystując test bioluminescencji z zastosowaniem lucyferazy, albo bakteryjnej, albo świetlika, bądź metodą kolorymetryczną lub amperometryczną, jak jest dobrze znane w nauce.

Dlatego też, w kolejnym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia również czujniki biologiczne do wykrywania PETN w próbce, które obejmują środki do kontaktowania tej próbki z enzymem reduktazą PETN w obecności NADPH oraz środki do wykrywania wystąpienia reakcji, katalizowanej przez enzym, PETN, gdy PETN jest obecny w próbce. Środki do wykrywania wystąpienia reakcji mogą dogodnie obejmować przetwornik biolumninescencyjny lub przetwornik amperometryczny. Bardzo dogodnych przenośnych detektorów do sprawdzania bagaży, odzieży pod kątem śladowych ilości PETN.

188 502

Sposoby przygotowywania czujników biologicznych, które opieraj ą się na zmianach amperometrycznych lub bioluminescencyjnych w reakcji testowej są dobrze znane w nauce. Na przykład, publikacja zgłoszenia patentowego Wielkiej Brytanii numer 2 231 332A (NRDC) opisuje takie sposoby i ich stosowanie w czujnikach biologicznych; treść tej publikacji w tym zakresie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Wszystkie takie sposoby mogą być użyteczne w wykrywaniu wystąpienia reakcji degradacji PETN i dzięki temu w wykrywaniu PETN.

Zazwyczaj w przypadku biologicznego czujnika bioluminescencyjnego stosuje się lucyferazę. Enzym ten odpowiedzialny jest za reakcję emisji światła świecących bakterii i katalizuje reakcję cząsteczkowego tlenu ze zredukowaną flawiną i alifatycznym aldehydem, z utworzeniem długotrwałych półproduktów, których powolny rozpad dostarcza energię dającą emisję światła z wystarczająco wysoką wydajnością kwantową. Po sprzęgnięciu reduktazy PETN z takim układem bioluminiscencji, NADP+ wytwarzany w wyniku aktywności reduktazy PETN wykrywa się przez utlenianie alkoholu, takiego jak dekanol, oktanol lub heksanol, do odpowiadającego mu aldehydu w obecności dehydrogenazy alkoholowej. Aldehyd wykrywa się następnie w reakcji ze zredukowaną flawiną (FMNH2) w obecności tlenu razem z lucyferazą katalizującą reakcję. Intensywność emitowanego światła stanowi miarę NADP+ przekształcanego w NADPH, co z kolei stanowi miarę stężenia obecnego PETN.

Przewiduje się, że przy zastosowaniu stosując takiego schematu, czułość wobec PETN pozostawać będzie w zakresie 0,1 pmola - 0,1 mmola.

Dogodna procedura wykrywania kolorymetrycznego wykorzystuje odczynnik Griessa, który wytwarza charakterystyczne purpurowe zabarwienie w obecności azotynu.

Przez przeprowadzenie testów z zastosowaniem szeregu próbek gleby zawierających znane stężenia PETN można utworzyć krzywą standardową przedstawiającą zależność absorbancji przy długości fali 540 nm od stężenia PETN w próbkach gleby. Tę krzywą standardowa można następnie stosować do określania stężenia PETN w nieznanych testowanych próbkach gleby. (Dalsze szczegóły sposobu wykrywania kolorymetrycznego podano w przykładzie 7).

W amperometrycznym czujniku biologicznym, NADP+ wytwarzany w reakcji reduktazy PETN w obecności NADPH można ponownie redukować enzymatycznie dehydrogenazą L-glutaminianow-ą (np. z wątroby bydlęcej), transaminazą glutaminowo-pirogronową (np. z serca świni) i oksydazą pirogronianową (np. z Pediococcus sp.). Produktem jest nadtlenek wodoru, a stężenie tej substancji można bezpośrednio mierzyć, na przykład, elektrodą platynową przy 0,7v lub elektrodą peroksydazową bez pośredników.

Stwierdzono, że reduktaza PETN będzie powodować uwalnianie azotynu, poza PETN, także z trójazotanu glicerolu (GTN) i z dwuazotanu glikolu etylenowego (EgDn). Pozorną Km dla GTN w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7,0, w obecności 0,2 mM NADPH, zmierzono stosując stężenia GTN pomiędzy 5 jtM a 200 pM i stwierdzono, że wynosi 22 + 2 (M (jeden błąd standardowy). Początkowego produktu denitracji GTN nie określono.

Pozorną K_m dla EGDN zmierzono przy stężeniach EGDN pomiędzy 0,5 a 2,5 mM i stwierdzono, że wynosi około 2 mM. Łącznie z obserwacją, że dwuazotan pentaerytrytu nie okazał się być substratem tego enzymu, sugeruje to, że dwie grupy azotanowe, poza tą ulegającą redukcji, mogą być wymagane do dobrego wiązania lub aktywności. Wartości Km dla PETN nie można było oznaczyć z powodu słabej rozpuszczalności tego substratu.

A zatem, poza jego stosowaniem w urządzeniach do wykrywania PETN, enzym reduktazę PETN można stosować w celu oczyszczania środowisk zanieczyszczonych PETN, GTN i/lub EGDN. Takimi środowiskami mogą być miejsca, w których albo w przeszłości wytwarzano te materiały, albo występują w nich produkty uboczne itp. towarzyszące obecnym obszarom produkcji i transportu tych materiałów.

Dlatego też w szczególności, według kolejnego aspektu tego wynalazku, zapewnia się sposób biologicznego oczyszczania środowiska zanieczyszczonego PETN, GTN lub EGDN, który to sposób obejmuje etapy dodawania do zanieczyszczonego środowiska pewnej ilości enzymu reduktazy PETN i utrzymywania mieszaniny w warunkach odpowiednich do degradacji PETN, GTN i/lub EGDN przez enzym, tak że PETN, GTN i/lub EGDN obecny w materiale jest zużywany.

188 502

Materiałem, którego to dotyczy, mogą być, na przykład, odpady materiału zawierającego PETN, pochodzące ze zniszczenia ładunku wybuchowego zawierającego PETN, lub próbka ziemi zawierającej PETN, bądź inny materiał. W pierwszym przypadku oczyszczanie biologiczne można dogodnie przeprowadzić w naczyniu reakcyjnym, podczas gdy w drugim przypadku enzym można wprowadzać bezpośrednio do materiału dodając do niego enzymu. Inne właściwe sposoby przeprowadzania oczyszczania będą z łatwością zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie.

Enzym reduktazę PETN według niniejszego wynalazku otrzymuje się z ze szczepu bakteryjnego wyizolowanego ze środowiska naturalnego. Szczepem bakteryjnym jest szczep Enterobacter cloacae w niniejszym opisie oznaczony jako PB2. Ten nowy izolat bakteryjny stanowi kolejny aspekt niniejszego wynalazku. Próbkę nowego izolatu zdeponowano na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego o Międzynarodowym Uznawaniu Depozytu Mikroorganizmów do celów procedur patentowych w brytyjskiej National Collection of Industrial and Marine Bacteria, 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Szkocja, 14 kwietnia 1995 pod numerem dostępu NCIMB 40718.

Dlatego też, według jeszcze dalszego aspektu niniejszego wynalazku, zdolność enzymu reduktazy PETN do degradacji PETN, jak opisano powyżej, zapewnia alternatywny sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego PETN, który to sposób obejmuje etap inokulacji środowiska próbką izolatu bakteryjnego i umożliwiania izolatowi zużywania PETN obecnego w środowisku. Środowiskiem, którego to dotyczy, mogą być, na przykład, odpady materiału zawierającego PETN pochodzące ze zniszczenia ładunku wybuchowego zawierającego PETN lub próbka ziemi zanieczyszczona PETN, bądź inny materiał. W pierwszym przypadku oczyszczanie biologiczne można dogodnie przeprowadzić w naczyniu reakcyjnym, podczas gdy w drugim przypadku enzym można wprowadzać bezpośrednio do materiału przez inokulację nim zanieczyszczonej gleby. Inne właściwe sposoby przeprowadzania oczyszczania będą z łatwością zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie.

Zidentyfikowana powyżej bakteria wytwarzać będzie aktywność enzymatyczną, której dotyczy niniejszy wynalazek, tylko wtedy, gdy hoduje się ją na PETN jako źródle azotu. Dalsze cechy charakterystyczne zdeponowanej baJk^<e:rii PB2 wymieniono poniżej.

Barwienie Grama Przetrwalniki Ruchliwość +

Wzrost 37°C +

41°C +

45°C +

Katalaza +

Oksydaza Fermentacja w glukozie OF +

Morfologia kolonii: okrągłe, regularne, niepodzielone, gładkie, lśniące kremowe, lekko wypukłe, półprzezroczyste, o średnicy 1 mm.

Szybki test (API): 24 godziny w temperaturze 30°C p-galaktozydaza +

Dihydrolaza argininowa +

Dekarboksylaza lizenowa Dekarboksylaza omitynowa +

Wykorzystywanie cytrynianu +

Wytwarzanie H2S Ureaza Deaminaza tryptofanowi Wytwarzanie indolu reakcja z odczynnikiem

Vogesa Proskauera +

Żelatynaza 188 502

Wytwarzanie kwasów z:

glukozy + mannitolu + inozytolu sorbitolu + ramnozy + sacharozy melibiozy + amigdaliny +

L(+)arabinozy +

Oksydaza cytochromowi Dodatkowe testy, temperatura 30°C, 7 dni Czerwień metylowa (37°C) Kwasy z rafinozy +

Kwasy z α-metyloglukozy +

Kwasy z adonitolu +

Żelatyna +

Reduktazę PETN można wytwarzać przez hodowanie E. cloacae stosując PETN jako źródło azotu. Jeśli hoduje się w obecności NH4NO3, aktywność można indukować przez dodanie PETN. Jednakże, nie jest to możliwe w przypadku, hodowli w obecności NH4CL Hodowlę korzystnie prowadzi się w warunkach niedoboru tlenu w każdej ze zwykle stosowanych temperatur, na przykład w zakresie od 20 do 40°C, korzystnie 25 do 30°C. Dla otrzymania reduktazy' można rozbić w każdy konwencjonalny . Korzystnie, przygotowuje się ekstrakt wolny od komórek. Następnie enzym odzyskuje się z ekstraktu.

Zamiast stosowania jako organizm wyjściowy ściśle określonego zdeponowanego mikroorganizmu, można zastosować jego mutant, np. otrzymany przez napromieniowanie promieniami gamma lub mutację chemiczną, indukcję przez hodowlę na innym podłożu itp., bądź jego transkoniugację z inną bakterią lub sztucznie wytworzony wariant. Zdolność każdego takiego organizmu wytwarzania aktywności enzymatycznej może łatwo określić specjalista.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest odtworzony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia uporządkowanie wstawek DNA w pNER-G1, pNER-G2 i pNER 1, fig. 2 w schematyczny sposób przedstawia strategię zastosowaną do sekwencjonowania onr i flankującego DNA, fig. 3 przedstawia sekwencję nukleotydową onr i przewidywaną sekwencję aminokwasową reduktazy PETNm, fig. 4 przedstawia sekwencję aminokwasową per se, fig. 5 - jest krzywą standardową oznaczenia reduktazy PETN dla gleb zanieczyszczonych PETN.

Przedmiot wynalazku został również zilustrowany poniższymi przykładami.

Przykład 1

Przygotowywanie aktywności enzymatycznej ze szczepu bakteryjnego Enterobacter cloacae PB2

1. Materiały i metody

Enterobacter cloacae PB2 wyizolowano, stosując techniki standardowe w nauce, z próbek zebranych ze źródła naturalnego przez wzbogacenie ich w PETN jako źródło azotu.

E. cloacae namnażano w 1 litrze zdefiniowanego podłoża, składającego się z 10 mM buforu fosforanów potasowych, pH 7,3, zawierającego 0,25 mM MgSO4, 5 mM glukozę, 5 mM bursztynian, 10 mM glicerol, 2 mM NH4NO3, PETN (10 mM) i pierwiastki śladowe (jak opisali Pfennig i Lippert, Ach. Microbiology 1966, 55, 726-739) uzupełnionego CaCl2 · 2H2O (100 mg/litr).

Kolby inkubowano przy 180 obrotach na minutę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30°C. W celu namnożenia bakterii na dużą, skalę, 1 litr hodowli zarodowej aseptyczni_e d_odawan_o d_o naczynia hodowlanego o objętości 75 ldrów-·, zawierającego 50 litrów jało_wego podłoża H_odowle o dużej objętości iokubownno ni temperamrze 30°C, mii eszano przy 150 o brotach na minutę z jałowym żrpoarietrzażiezj dla utrz^amrżia 10% nasymenia rozpuszczonym tlanem. ,

Z komórek namnożonych w opisany powyżej sposób przygotowywano ekstrakty wolne od komórek Komórk zbieryne z prowadzonych na dużą skalę hodowli o objętości 75 litrów

188 502 stosując ciągłe wirowanie przepływowe (rotor Sorval TZ-28, wirówka Sorval RC-5C). Komórki otrzymane z hodowli w mniejszej objętości osadzano następnie przez wirowanie przy 10 000 g w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C w wirówce Sorval RC-SC z rotorem GS-3. Te osadzone komórki zawieszano ponownie w 2 ml buforu bis-Tris propanowym (pH 7) na gram mokrej masy komórek. Komórki rozbito przez sonikację w MSE Soniprep (Fisons, Instruments, FSA Ltd.) stosując 6 x 12 μηι impulsów o długości 15 sekund, na przemian z 30 sekundami schładzania w topniejącym lodzie. Pozostałości komórek i nierozbite komórki usuwano przez wirowanie przy 20 000 x g w ciągu 20 minut w temperaturze 4°C w wirówce Sorval RC-5C, stosując rotor SS-34, otrzymując klarowny ekstrakt wolny od komórek.

2. Odczynniki chemiczne

Stosowano PETN o najwyższej czystości, a inne odczynniki czyste do analizy i, o ile nie stwierdzono inaczej, otrzymano je z BDH Ltd. (Poole, Wielka Brytania), Sigma Chemical Company Ltd. (Poole, Wielka Brytania) lub Alrich (Gillingham, Wielka Brytania).

3. Oznaczenia

Reduktaza PETN

Aktywność reduktazy PETN oznaczano przez monitorowanie zanikania PETN przez w 50 mM buforze bis-Tris propanowym (pH 7), zawierającym PETN (stężenie końcowe 47 (iM), 40 (ii enzymu i NADPH (stężenie końcowe 0,2 mM) w objętości końcowej 1 ml.

Alternatywnie, degradację PETN śledzono również przez monitorowanie uwalniania azotynu z zastosowaniem odczynnika Greissa (Rossenblatt, Burrows i Parmer, 1991, „Organic Explosives and Related Compounds”, w: The Handbook of Environmental Chemistry 3 (G), red. O. Hutzinger, Springer-Verlag). Oznaczenie prowadzono jak opisano powyżej i zakończono przez dodanie żelazicyjanku (stężenie końcowe 0,5 mM) i metosulfonianu fenazyny (stężenie końcowe 0,2 mM). Dodawano kwas sulfanilowy (stężenie końcowe 0,6 mM) i odstawiono na 15 minut. Następnie dodawano N-l-nfftyloetylenodiaminę (stężenie końcowe 0,4 mM) i po 15 minutach powstające zabarwienie mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm. Jednostkę aktywności enzymatycznej definiuje się jako ilość enzymu konieczną do uwolnienia 1 ąmola azotynu na minutę w temperaturze 30°C.

Degradację PETN można także określać przez monitorowanie utleniania NADPH przy długości fali 340 nm.

Białko

Białko rutynowo oznaczano metodą Bradford wiązania barwnika Coomassiego Bradford (Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254) stosując komercjalnie dostępny odczynnik i albuminę surowicy bydlęcej jako standard (Pierce Ltd. - otrzymaną z Life Science Labs Ltd., Luton). Próbki (20 |il) zawierające 0,2-1 mg białka/ml dodawano do 1 ml odczynnika i umożliwiano zachodzenie reakcji w ciągu 5 minut w temperaturze pokojowej przed odczytem absorbancji przy długości fali 595 nm wobec próby odczynnikowej zawierającej bufor (20 |il) i odczynnik (1 ml). Porównanie z krzywą standardową standardowych wartości (0-1 mg/ml) umożliwiało obliczenie stężenia białka w próbce.

Standardy do sączenia molekularnego

Następujące enzymy stosowano jako wzorce masy cząsteczkowej w doświadczeniach sączenia molekularnego: albuminę surowicy bydlęcej, owoalbuminę, chymotrypsynę i rybonukleazę A (masy cząsteczkowe odpowiednio 67 000,43 000,25 000 i 13 700 daltonów).

Przykład 2

Oczyszczanie reduktazy PETN

Do surowego ekstraktu, otrzymanego z 30 g mokrej masy komórek, dodawano wystarczającą ilość siarczanu amonowego do uzyskania 50% nasycenia. Po mieszaniu w temperaturze 4°C w ciągu 5 minut, powstały osad usuwano przez wirowanie przy 20 000 g w ciągu 20 minut. Do uzyskanego supematantu dodawano siarczan amonowy do uzyskania 90% nasycenia. Powstający osad zbierano przez wirowanie w temperaturze 4°C i ponownie rozpuszczano w 4 ml 50 mM buforu bis-Tris propanowego (pH 7). Próbkę odsalano stosując kolumnę PD-10 upakowaną Sephadex G-25M (Pharmacia) i zatężano do objętości 8 ml przez ultrafiltrację stosując komorę z mieszaniem do ultrafiltracji wyposażoną w sączek błonowy Diaflo typu YM-3, który zatrzymywał białka o masach cząsteczkowych wyższych niż 3 000

188 502 daltonów. Do dalszego oczyszczenia próbki stosowano układ szybkiej chromatografii cieczowej (FPLC) wraz z kolumną Q-sepharose. Układ FPLC składał się z dwóch pomp LKB P500 (Pharmacia) połączonych z kontrolerem gradientu model LCC-500 PLUS (Pharmacia), zaworem iniekcyjnym Rheodyne, jednokanałowym monitor UV (Pharmacia) i kolektorem frakcji LKB 22l2 HELIRAC. FPLC prowadzono w temperaturze pokojowej, ale zbierane frakcje schładzano na lodzie. Zatężony roztwór nakładano na kolumną Q-sepharose (1x7 cm), którą uprzednio równoważono 50 mM buforem bis-Tris propanowym pH 8,5 w temperaturze pokojowej. Kolumnę przemywano intensywnie buforem dopóki w eluencie nie stwierdzano już absorbancji przy długości fali 280 nm, wówczas reduktazę eluowano 10 mM NaCl. Frakcje (4 ml) zbierano przy szybkości przepływu 1 ml/minutę, odsalano i zatężano przez ultrafiltrację jak opisano uprzednio. Następnie próbkę nakładano na kolumnę do chromatografii powinowactwa Mimetic Orange 2 (8 x 20 mm, Affinity Chromatography Ltd.), którą uprzednio zrównoważono 50 mM bis-Tris propanowym (pH 7) w temperaturze 4°C. Kolumnę przemywano w objętościami kolumny buforu. Trzecia objętość kolumny zawierała aktywność reduktazy, którą zbierano.

Wyniki

Po różnych, opisanych powyżej, etapach oczyszczania mierzono aktywność właściwą reduktazy PETN. Otrzymane dane przedstawiono w tabeli 1; na ich podstawie można zobaczyć, że w wolnym od komórek ekstrakcie E. cloacae PB2 hodowanej w obecności PETN jako źródła azotu, reduktaza PETN obecna była w ilości odpowiadającej aktywności właściwej 0,025 jednostki/mg białka, podczas gdy ostatecznie oczyszczono ją l82-krotnie.

Tabela 1

Etap oczyszczania	Objętość (ml)	Białko całkowite (mg)	Aktywność całkowita (jednostki)	Aktywność właściwa (jednostki/ mg)	Aktywność odzyskana (%)	Współczynnik oczyszczenia (krotność)
Surowy ekstrakt	40	361,6	9,04	0,025	100	-
Frakcjonowanie siarczanem amonu	8	31,4	3,47	0,110	39	4
Chromatografia jonowymienna na Q-Sepharose	10,5	15	0,83	0,720	9	29
Chromatografia powinowactwa na Mimetic Orange 2	16	0,16	0,728	4,550	8	182

Przykład 3

Cechy charakterystyczne reduktazy PETN

Optimum pH

Oczyszczoną reduktazę PETN (50 μ1, 0,5 jtg białka) inkubowano w ciągu 4 minut w temperaturze 30°C z 47 |iM PETN w szeregu buforów: 50 mM bis-Tris propanowym (pH 6,5, 7, 7,5 i 8), 50 mM kwasie 2-[N-morfolino]etanosulfenowym (MES) (pH 5,5, 6, 6,5) i 50 mM bis-Tris (pH 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7 i 6,8). Następnie stężenie azotynu mierzono stosując odczynnik Greissa.

Reduktaza PETN wykazywała optimum pH 6,5.

K_m enzymu

Km reduktazy PETN była wyższa od maksymalnej rozpuszczalności PETN (47 jiM).

Oznaczanie masy cząsteczkowej

Masę cząsteczkową natywnego enzymu oznaczono metodą Andrewsa (Biochem. J. (1964) 91, 222-223). Pomiary prowadzono na kolumnie Superose 6 HR 10,/30 (1 x 30 cm). Oczyszczoną reduktazę PETN (10 fig) mieszano z białkami wzorcowymi i' nakładano na ko12

188 502 lumnę. Kolumnę hluowano buforem bi--Tri- propanow/m (pH 7) i zbierano fraUcje o objętości 4 ml. Objętość hlucji rhduUtazy PETN odpowiadała ma-ie czągthczUowhj 40 000 daltonów.

Oznaczanie ma-y czą-thceUowbj przeprowadzono również -to-ując SDS-PAGE. Oczy-zczona reduUtaza PETN migruje jaUo wyraźny główny prążeU odpowiadający ma-ie czą-teczUowej 42 000 daltonów. Ta wartość, podobna do wartości dla natywnedo enzymu, oznacza, że, jaUiUolwihU wpływ oddziaływań dhthrghnt/białUo w oznaczaniu ma-y coą-thcoUowhj enzymu był minimalny.

PrzdUlad 4

Klonowanie i -hUwhncjonowanih geno -truUtury onr Uodująchgo reduUtsoę PETN.

Gen struktury kodujący reduktazę PETN, oznaczony onr (od reduktazy organicznego estru azotanowego) sklonowano stosując /degenerowane sondy oligonukleotydowe oparte o N-Uońcową -hUwhncję aminoUws-ową zczd-zczonhdo białUa.

W celu uoy-Uania N-Uańcowej -eUwencji aminoUwsgowhj rhduUtaoy PETN, oczy-zczony hnodm (4,0 pg) przenie-iono z żelu poliaUsdloamidowhdo z SDS na membranę poli-(difluorUu windlidenu) (ProBlott; Applied Bio-d-thm-, Fo-tes City, CA, USA) -to-ując aparat do blottingu pół-uchego Pharmacia PhsgtTssn-fhr (Pharmacia Biotech, St. Alban-, WielUa Brytania). Bufor do tssn-feru -Uładał -ię z 25 mM tsi-(hydszUjdmhthylo)aminomhtano, 190 mM glicdry, 10% w/v metanolu. Tran-fer prowadzono -to-ując natężenie prądu 25 mA w ciądu 30 minut. N-Uońcową -eUwencję sminoUwa-ową oUreślono przez automatyczną degradację Edmans w Protein and Nucleic Acid Chemi-try Facility, Cambridde Centre for Molecolss Reco-gnition Department of Biochemi-try, UnAbr-ity of Csmbridde.

W oparciu o elementy sekwencji aminokwasowej, zaprojektowano następujące sondy oligonukleotydowe:

1) ACTTT(G/C)AG(G/C)GQ(G/C)GTGAA(G/C)AGTTTTTC(G/C)GC

2) GT(G/C)AG(G/C)GG(GC)GCCATGAA(G/C)AC(G/C)CGGTT

OlidonuUlhotydd ogdnthtyoowsno w Protein snd Nockic Acid Chemi-try Facility, Csmbridde Centre for Molecolar Rhcognieion, Department of Biochemi-try, UnAer-ity of Csmbsiddh.

Ghnomowd DNA E. clocae proddotowsnz jaU opi-ali Au-bel i in. (Au-bel, F. M., Brent, R., Kind-ton, R. E. i in. (1994) Cursent Protocol- in Mokculsr Biolody, John Wiki and Son-, Nowy JorU). Ghnomowd DNA -trawiono całUowick różnymi Uombinacjsmi hndonuUlhso Sh-tsdUcdjnych otrodmanych z Bohhsindhr-Mannhhim (Lewe-, E. Su—eK, WielUs Brytania), Gibco/BRL (Pai-ley, SoUocjs, WielUa Brytania) i Promeda (Southsmpton, Hant-., WielUs Brytania). Fradmenty DNA rozdzielono przez hlhUtsofoshzę w żelu adssooowdm -to-ując 0,8% (w/v) żele adarozowe i bufor TAE (SambsooU, J., Frit-ch, E. F. i Maniati-, T. (1989) Mokcular Cloning: A Laboratosy Msnual, wyd. 2, Cold Sprind Hssbor Labosatosy Pre--, Cold Sprind Hssbor, Nowy JorU) i prohnih-iono na membrany nylonowe (Hybond N+, Amer-ham, Little Chslfont, BucU-., WielUa Brytania) -to-ując procedurę alUaliconhdo blottindu Uapilamhdo wedłud producenta.

Końce opi-snych powyżej -ond olidonuUlhotddowdch wdonaUowsno -to-ując [y-³²P]ATP (Dupont/NEN i Uinazę polinuUlhotydową T4 (Psomeda). Bioty poddawano prehybrydyzacji w ciądu 2 dodzin w temperaturze 42°C w buforze do hybrydyzacji -Uładającdm -ię z 5 x SSC (gdzie 1 x SSC to 0,15 M NaCl/0,015 M cytrynian -odowy) z 5 x sozewoshm Denhardta (gdzie 1 x roztwór Denhardta to 0,02% Ficoll 400/0,02% poliwindlo-pisOlidOn/0,02% albumina -orowicy bydlęcej') osaz 0,02 md/ml -onikowanhdz zdhnatorowanhdo DNA. -permy ło-orim Na-^eępnih dodawano oodznakowsnh -ond^U oHgonukkotydowe w stężeniu 1 ptrwEmi i πιπ^ΙΑ wisno hdbrd'^odZaCję pS^nsU noc w tej -amej ^ehmphea^dLιrzo. Bioty pszhmyovano cothroUgotnih _w ciąg₀ 15 minut w0.5 _x SSCMP/o (_w/_v) SDS w temperaturze 45°C i hU-ponowsno na bło_nę rhntdhnows^gą Fuj i RX100.

Stwierdzono, że obie -ondy oligonuklhotydowh hdbrydydowćiEy z tym _-smd_m regi^^ g^o^wego DNA. Do Ulonowsnia wybrano fragment Bam UHin dlii _o dUgośc 4,5 Ub. Zasto-owsnym whUtorhm b_nł plEHue-cript SK+ (Sgrantghne, Cambridge, Wi_elU_a Br/tama). Ghnomoood DNA -ttawiuno Bam HI^- Hin diii i fragmenty o długości _od 4 d_o 5 Ub wydrn^ w_{Sno z} żeld EdEErozowego -to-ując uUład US Biockan (United State- Bccoemaiao Cc^oratmm ^n/rasny z Amhl-ham). DNA weUtora -trawiono Eymi -amymi hnodmsmi i w^tm i _w-t_awUę

188 502

DNA zligowano stosując ligazę DNA T4 (Promega lub Gibco/BRL). Mieszaniną ligacyjną stransformowano przez elektroporację elektrokompeteniną Escherichia coli JM 109 (otrzymaną z z Promega) stosując Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts., Wielka Brytania). DNA z transformantów opornych na ampicylinę przeniesiono na membranę Hybond-N+ (Amersham) przez blotting kolonijny zgodnie z procedurą podaną przez producenta. Bioty przeszukano stosując wyznakowane promieniotwórcze sondy Ołlgonukleotydowe jak opisano powyżej.

Stwierdzono, że jeden klon, oznaczony pNER-Gl, zawiera wstawkę o długości 4,5 kb, która hybrydyzowała z obiema sondami. Sekwencjonowanie DNA wykazało obecność DNA kodującego N-końcową sekwencję reduktazy PETN, ale wykazało też, że miejsce Hin dlii znajdowało się w otwartej ramce odczytu, tak że koniec 3' genu został utracony (fig. 1). W oparciu o sekwencję DNA w pobliżu miejsca Hin dlH zaprojektowano dalszą sondę oligonukleotydową, GACGCCGTGGCCTTTGGCCGTGAC, i zastosowano do przeszukania produktów różnych trawień restrykcyjnych genomowego DNA, jak opisano powyżej, w celu zlokalizowania utraconego regionu. Hybrydyzację z tą sondą prowadzono w temperaturze 50°C i bioty przemywano w temperaturze 55°C, dwukrotnie w ciągu 15 minut 1 x SSC/O, 1%o (w/v) SDS i dwukrotnie w ciągu 15 minut 0,2 x SSC./O, 1⁰% (w/v) SDS. Do klonowania wybrano fragment Sal VCla I o długości 0,5 kb i sklonowano go jak opisano powyżej. Klon ten oznaczono pNERG2. Regiony pNER-Gl i pNER-G2 obejmujące gen onr zligowano ze sobą w pBluescript SK+ dla utworzenia wstawki o długości 1,5 kb, obejmującej cały gen onr. Konstrukcję tę oznaczono pNERl (fig. 1). Przygotowano ekstrakty komórkowe z prowadzonych przez noc hodowli E. coli JM'109/pNERl hodowano w bogatym podłożu i oznaczano je pod kątem aktywności reduktazy PETN. Okazało się, że reduktaza PETN stanowi około 15%o rozpuszczalnego białka.

Fragmenty DNA z regionu kodującego reduktazę PETN z pNER-Gl, pNER-G2 i p-NERl zsubklonowano w wektorze pBluescript SK+ i zsekwencjonowano stosując startery oparte na sekwencji wektora. Zastosowaną strategię sekwencjonowania przedstawiono na fig. 2. DNA do sekwencjonowania przygotowano stosując Qiagen Plasmid Mini Kit (Qiagen Ltd., Dorking, Surrey, Wielka Brytania). Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono w DNA Sequencing Facility, Cabridge Centre for Molecular Recognition, Department of Biochemistry, Universitry of Cambridge, stosując sekwenator DNA Pharmacia ALF (Pharmacia Biotech., St. Albans, Wielka Brytania). Sekwencję nukleotydową genu onr i przewidywaną sekwencję reduktazy PETN przedstawiono na fig. 3.

Rozważając dalej fig. 1, należy zauważyć, że wszystkie wstawki znajdują się w miejscu wielokrotnego klonowania wektora pBluescript SK+ (Stratagene). Ciemna strzałka wskazuje pozycję genu onr kodującego reduktazę PETN. Wstawkę pNERl przygotowano przez ligację regionu Nco I/Stu I pNER-Gl z regionem Stu l/Cla I pNER-G2. Fragment Nco l/Cla I wstawiono w pNERl pomiędzy miejscami Bam HI i Cla I miejsca wielokrotnego klonowania pBluescript SK+.

W szczególnym odniesieniu do fig. 2, subklony przygotowano w pBluescript SK+ i z sekwencjonowano stosując startery oparte na sekwencji wektora. Strzałki wskazują reakcje sekwencjonowania. Ciemna strzałka wskazuje region kodujący. Pozycje miejsc restrykcyjnych wykorzystanych w sekwencjonowaniu oznaczono liczbami, z 1 będącą A kodonu ATG rozpoczynającego region kodujący'.

Na fig. 3 nukleotydy ponumerowano z 1 będącym A kodonu ATG rozpoczynającego region kodujący. Wskazano przypuszczalne miejsce wiązania rybosomu. Należy zauważyć, że N-końcową sekwencja aminokwasowa reduktazy PETN wykazuje, że w E. cloacae PB2 początkowa reszta metioniny ulega usunięciu. Sekwencję aminokwasową przedstawiono niezależnie na fig. 4.

Dla specjalistów znających sekwencję genu będą oczywiste również alternatywne sposoby otrzymania i sklonowania genu. Można na przykład wykorzystać odpowiednie enzymy restrykcyjne do „cięcia” DNA w miejscach restrykcyjnych flankujących gen. Amplifikację genu można również przeprowadzić stosując techniki PCR wykorzystujące odpowiednio wybrane startery flankujące gen.

188 502

Przykład 5

Identyfikacja produktów degradacji przez całe komórki

Ekstrakty octanem etylu supermatantów z hodowli prowadzonych w obecności PETN zawierały PeTn i trzy metabolity (jak stwierdzono przez HPLC). Metabolity oddzielono od PETN przez TLC i stwierdzono, że posiadają niższe wartości Rf (0,64, 0,53 i 0,23) niż PETN (R, 0,81), co wskazuje, że nieznane metabolity były bardziej polarne niż PETN.

Tożsamość nieznanych metabolitów badano stosując spektrometrię masową z jonizacją poprzez zderzenia elektronów (EI). Widmo masowe El metabolitu 1 ujawniło jon cząsteczkowy o m/z 227, który jest zgodny z wzorem empirycznym C5H10N2O8. Widmo masowe wykazało zjonizowany fragment przy m/z 209. Uważa się, że metabolitem tym jest dwuazotan pentaerytrytu (2,2-bżs[(nitrooksy)metylo]-1,3-propanodiol), produkt denitracji PETN.

Widmo masowe EI metabolitu 2 ujawniło jon cząsteczkowy o m/z 224, który odpowiada wzorowi empirycznemu C5H8N2O8. Widmo masowe wykazało zjonizowane fragmenty przy m/z 207, 170, 141, 99, 76, 74, 158, 46 i 44. Uważa się, że metabolit ten stanowi 3-hydroksy-2,2-bis[(nitrooksy)metylo]propanal.

Widmo masowe metabolitu 3 ujawniło jon cząsteczkowy o m/z 222, który odpowiada wzorowi empirycznemu C5H6N2O8. Widmo masowe wykazało zjonizowane fragmenty przy m/z 208, 177 i 91. Uważa się, że metabolit ten stanowi 2,2-bis[(nitrooksy)metylo]propanodial. Proponowane struktury tych metabolitów są następujące:

HOH2C CH2ONO2

O2NOH2C CH2OH

Metabolit 1

OHC

O2NOH2C

HOH2C CH2ONO2

O2NOH2C CHO

Metabolit 2

CH2ONO2

CHO

Metabolit 3

Tożsamość Metabolitu 1 badano ponadto stosując 'H NMR przy 400 mhz. Widmo ’H NMR czystego PETN zawierało pojedynczy pik przy 4,77 ppm, który odpowiada czterem równoważnym grupom metylenowym PETN, podczas gdy widmo *H NMR nieznanego metabolitu zawierało dwa oddzielne piki przy 4,77 i 2,08 ppm. Uważa się, że pik przy 2,08 ppm odpowiada grupom metylenowym połączonym z grupami hydroksylowymi w zaproponowanym wzorze strukturalnym.

Spektroskopia masowa (EI) i analiza 'fi NMR nieznanych metabolitów tworzonych podczas degradacji PETN przez bakterię sugerują, że co najmniej dwa atomy azotu były wykorzystywane na cząsteczkę PETN; metabolity te nie dostarczyły dowodu na usuwanie trzeciej grupy azotanowej.

Przykład 6

Identyfikacja produktów reakcji reduktazy PETN

Po traktowaniu PETN oczyszczoną reduktazą PETN i NADPH, ekstrakt mieszaniny reakcyjnej octanem etylu zawierał PETN i dwa metabolity (jak stwierdzono przez HPLC). Metabolity oddzielono od PETN przez TLC i stwierdzono, że posiadają niższe wartości Rf (0,78 i 0,64) niż PETN (Rf 0,81).

Tożsamość nieznanych metabolitów badano stosując spektrometrię masową (EI). Widmo masowe (El) metabolitu A ujawniło jon cząsteczkowy o m/z 271, który odpowiada wzorowi empirycznemu CsHipN-jO;;·. Widmo masowe wykazało z jonizowane fragmenty przy m/z 239 i 207. Uważa się, że metabolit ten stanowi trój azotan pentaerytrytu. Widmo masowe EI i wartość Rf metabolitu B były identyczne jak Metabolitu 1 wyizolowanego z supernatantu hodowli (patrz przykład 2). Metabolit ten zidentyfikowano jaiko dwuazotan pentaerytrytu (PEDN). Dlatego też, okazało się, że reduktazą PETN redukcyjnie uwalnia azotyn z PETN z utworzeniem trój azotanu pentaerytrytu, a następnie PEDN, który nie jest substratem dla tego enzymu. Obecność aldehydów tworzonych z tych alkoholi w supernatantach hodowlanych (Przykład 2) sugeruje dalszą aktywność dehydrogenazo wą innego enzymu.

188 502

Aktywność właściwa reduktazy PETN w surowym ekstrakcie wynosiła około 0,32 U/mg, co jest równoważne 9,7 mmola PeTn (g białka rozpuszczalnego) zakładając pełne przekształcenie PETN w PEDN. Jest to prawdopodobnie wystarczające do wyjaśnienia obserwowanej szybkości degradacji PETN przez rosnące komórki, wynoszącej 1,03 mmola PETN (g białka) 'h'¹.

Przykład 7

Stosowanie enzymu reduktazy PETN jako kolorymetrycznego detektora PETN 1. Metodologia

Sposób ten polega na działaniu reduktazy PETN na PETN z wytwarzaniem azotynu, które monitoruje się stosując odczynnik Griessa. Do szeregu niezanieczyszczonych próbek gleby (w każdym przypadku John Innes nr. 2, 1 g), umieszczonych w czystych szklanych probówkach do gotowania, dodano znane stężenia PETN (od 1 do 500 pg) w acetonie czystości do HPLC. Każdą z próbek dokładnie mieszano, umieszczano w piecu próżniowym i suszono w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej.

Te celowo zanieczyszczone próbki gleby, razem z innymi próbkami gleby (1 g), zebranymi z gruntu, który został zanieczyszczony albo PETN lub mieszaninami RDX/TNT, traktowano następnie 1,5 ml acetonu na próbkę gleby i wytrząsano w ciągu 10 minut. Następnie umożliwiano grawitacyjne osadzanie się gleby, po czym pobierano próbki płynu o objętości 25 pl i dodawano do probówek Pyrex o pojemności 5 ml, zawierających mieszaninę 12,8 pl reduktazy PETN o stężeniu 7 mg/ml, 2 p120 mM NADPH (kofaktor enzymu) i 220,2 pl 50 mM soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami. Każdą próbkę mieszano, a następnie inkubowano w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej próbki dodawano 200 pl 1% sulfanilamidu w 2,5% kwasie solnym (tworzy on z azotynem jon diazoniowy) i inkubowano w ciągu dalszych 2 minut przed dodaniem 40 pl 0,5% N-(1-naftylo)-etylenodiaminy w wodzie, w wyniku czego tworzy się purpurowo zabarwionego produkt, jeśli obecny jest PETN.

Pobierano 200 pl każdej próbki i umieszczano w płytce do mikromiareczkowania, a następnie absorbancję próbki mierzono stosując czytnik Ceres 900 UV HDi. Na podstawie próbek pochodzących z gleb zawierających znane stężenia PETN można wykreślić krzywą standardową absorbancji w zależności od stężenia PETN w glebie (fig. 5). Stosując tą krzywą, gęstości optyczne uzyskane z próbek zanieczyszczonych gleb o nieznanej zawartości PETN można wykorzystać do określenia poziomu zanieczyszczenia PETN obecnym w każdej próbce.

Tabela 2 przedstawia dane otrzymane dla wskazanych szeregów próbek. Wykazują one, że opisane oznaczenie wykazuje specyficzną odpowiedź na poziomy PETN w próbkach gleby, że nie wykazuje fałszywych wyników dodatnich w nieobecności PETN lub obecności innych materiałów wybuchowych (RDK/TNT), oraz że jest zależne od obecności enzymu reduktazy PETN.

Tabela 2

Właściwości próbki	Numer próbki	Absorbancja przy 540 nm	Ilość PETN/pg/g gleby
brak enzymu,	1	0,125	0
100 pg pobranej gleby	2	0,156	0
niezanieczyszczona	3	0,137	0
gleba	4	0,162	0
	5	0,151	0
gleba zanieczyszczona	6	0, 148	0
TNT/RDX	7	0,131	0
	8	0,195	0
gleby zanieczyszczone	9	1,229	505
PETN	10	0,482	95
	11	0,764	200
	12	2,124	1200
	13	0,963	420
	14	0,805	280

188 502

Ncol(~279) ccacggataa	aggagccagc	ggcgtgattg	ccctgttggc	· tcaggcgctg	-230
gagagcgggc	gcaatgaaaa	aacgctctcc	ttctccggcg	atccgctcac	-180
gcaggcacag	gtgctctatt	ccctctggtt	aggcgccaac	ctgcaagcaa	-130
aaacgtctcg	cagcgccgtg	cegctcgaaa	gcgcgctggc	gcatgtgaaa	-80
aactgtatta	ccgcgcctgg	cgtgtagccg	gcgtttttat	ttaccctttt	-30
Sali(-25) actagtcgac tggtctactc	rbs aggagccgtt	atgtccgctg M S A	aaaagctgtt E K L F	+20
taccccactg T P L	aaagtgggtg K V G	ccgttactgc A V T A	cccaaaccgc P N R	gtgtttatgg V F M	+70

Ece>RV(106)

ccccacttac ccgtctgcgc	agcatcgagc cgggcgatat cccaacgcea +120
A P L T	R L R	SIE	P G D I	P T P
ttgatgggtg	agtattacca	ccagcgcgcc	agcgcgggcc	tgattatctc +170
L M G	E Y Y R	Q R A	SAG	L I I S
cgaagccacg	cagatttctg	etcaggcaaa	aggctacgcc	ggtgcaccgg +220
E A T	Q I S	A Q A K	G Y A	GAP
gtctgcacag	cccggaacag	atcgccgcgt	ggaaaaaaat	caccgcaggc +270
G L H S	P E Q	1 A A	W K K I	TAG
gtgcatgctg	aagatggccg	tattgcggtt	cagctgtggc	acaccggtcg +320
V H A	EDG R I A V	Q L W	Η T G R
tatctcacac	agcagcatcc	agcctggcgg	tcaggcgccg	gtttctgcct +370
I S H	S S I	Q P G G	Q A P	V S A
ctgccctgaa	cgccaatacc	cgcacttcec	tgcgcgatga	aaacggtaat +420
S A L N	ANT	R T S	L R D E	N G N

Sali(430)

gcgatccgcg AIR	tcgacaccac V D T T	cacgccacgc T P R	gcgctggagc ALE	tggacgagat L D E I	+470
Smal (471)				Smal(512)
cccgggtatc	gtgaatgatt	tccgtcaggc	cgtcgccaac	gcccgggaag	+ 520
P G I	V N D	F R Q A	V A N	A R E

188 502

Fig.3.(Cd.) cgggcttcga cctggttgag cttcactctg	BstEII(556) cgcacggtta cctgctgcat	+ 570
A G F D	L V E	L H S	A H G Y	L L H
cagttcctgt	ccccgtcttc	caaccagcgt	accgaccagt	acggcggcag	+620
Q F L	SPSS	N Q R	T D Q	Y G G S
cgttgaaaac	cgcgcgcgtc	tggtgcttga	agtggtggat	gctgtctgta	+670
V e n	R A R	L V L E	V V D	A V C
atgagtggag	cgcagaccgc	attggtattc	gtgtctcccc	gatcggtact	+720
NEWS	ADR	IGI	P. V S P	I G T

Sali (730)

ttccagaacg tcgacaacgg tccgaacgaa gaagcagacg cgctgtatct +770
F Q N	V D N G	P N E	E A D	A L Y L
gattgaagag	ctggcgaaac	gcggtatcgc	ctatctgcac	atgtccgaga +820
I E E	LAK	R G I A	Y L H	M S E
cggacttggc	aggcggcaag	ccttacagtg	aagccttccg	tcagaaagtg +870
T D L A	G G K	P Y S	E A F R	Q K V
cgcgagcgct	tccacggcgt	gattatcggg	gcgggtgcgt	atacggcaga +920
R E R	F H G V	I I G	AGA	Y T A E

Stul(945)

aaaagccgag	gatttgatcg	gtaaaggcct	gatcgacgcc	gtggcctttg +970
K A E	DLI	G K G L	IDA	V A F

gccgtgacta cattgctaac ccggatctgg ttgcccgttt gcagaaaaaa +1020
G R D Y	I A N	P D L	V A R L	Q K K

Hindlll (1047)

gccgaactga A E L	acccgcagcg N P Q R	tcctgaaagc P E S	ttctatggcg F Y G	gcggcgcgga G G A E	+1070
aggctatacc G Y T	gactaccctt D Y P	cactgtaatc S L *	ccgctttgta	cattgatagc	+ 1120
ggcgaccttt	cgccgctata	ctaaaacatc	gtttctgttc	aaaaagataa	+1170
tccattcgac	tggttaatga	ggaaattatg	cgcctacttc	acaccatgct	+ 1220

Ciał (1246) gcgcgctggc gacctgcaac gttccatcga t

188 502

Fig.4.

SAEKLFTPLKVGAVTAPNRVFMAPLTRLRSIEPGDIPTPLM

GE Y Y RQ R A S AGL11 S E AT QI S AQ AKG Y AG AP GLHS P E Q I A AWKKITAGVHAEDGRIAVQLWHTGRISHSSIQPGGQAPVS

AS ALNANTRTSLRDENGNAIR VDTTTPRALELDEIPGIVN

DFRQ A V AN ARE AGFD LVELH S AHG YLLHQFLS P S S N Q RTD QYGGSVENRARLVLEVVDAVCNEWSADRI GIR V S PIGTFQ

NVDNGPNEEADALYLIEELAKRGIAYLHMSETDLAGGKP

YSE AFRQKVRERFHG VI IG AG A YTAEKAEDLIGKGLID AV AFGRDYI ANPDLVARLQKKAELNPQRPESFYGGGAEGYT

D YPSL

188 502

Fsg.5.

ABSORBANCJA PRZY FALI O DŁUGOŚCI 540 nm

188 502

BamHI

Fig.1

η (Λ _to

Ο fr — ^Ξ —*£ — « _ .—tj α δ «Ε ο 3·£ wlu ωωω ωχ

pNER-G2 pNER1 pNER-GI kb J

Fig.2.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Enzym reduktaza czteroazotanu pentaerytrytu (PETN), który katalizuje usunięcie azotynu z PETN, znamienny tym, że posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4.
2. Cząsteczka DNA, znamienna tym, że koduje enzym reduktazę PETN zdefiniowany w zastrz. 1.
3. Cząsteczka DNA według zastrz. 2, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3 lub sekwencję przynajmniej w 70% identyczną wobec sekwencji przedstawionej na fig. 3 kodującej reduktazę PETN zdolną do katalizowania usunięcia azotynu z PETN.
4. Cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3.
5. Zrekombinowany wektor DNA, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę DNA zdefiniowaną w zastrz. 2.
6. Zrekombinowany wektor DNA, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę DNA zdefiniowaną w zastrz. 3.
7. Zrekombinowany wektor DNA, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę DNA zdefiniowaną w zastrz. 4.
8. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest stransformowana cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. 2.
9. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest stransformowana cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. 3.
10. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest stransformowana cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. 4.
11. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest stransformowana zrekombinowanym wektorem DNA zdefiniowanym w zastrz. 5.
12. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest stransformowana zrekombinowanym wektorem DNA zdefiniowanym w zastrz. 6.
13. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest stransformowana zrekombinowanym wektorem DNA zdefiniowanym w zastrz. 7.
14. Sposób wytwarzania enzymu reduktazy PETN zdefiniowanego w zastrz. 1, znamienny tym, że:

- transformuje się komórkę gospodarza cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. 2, a następnie hoduje się stransformowaną komórkę gospodarza, po czym

- ekstrahuje się enzym reduktazę PETN z podłoża wzrostowego lub z komórki gospodarza po jej rozbiciu.
15. Sposób wytwarzania enzymu reduktazy PETN zdefiniowanego w zastrz. 1, znamienny tym, że:

- transformuje się komórkę gospodarza cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. 3, a następnie hoduje się stransformowaną komórkę gospodarza, po czym

- ekstrahuje się enzym reduktazę PETN z podłoża wzrostowego lub z komórki gospodarza po jej rozbiciu.
16. Sposób wytwarzania enzymu reduktazy PETN zdefiniowanego w zastrz. 1, znamienny tym, że:

- transformuje się komórkę gospodarza cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. 4, a następnie hoduje się stransformowaną komórkę gospodarza, po czym;

188 502

- ekstrahuje: się enzym reduktazę PETN z podłoża wzrostowego lubi z komórki gospodarza po jej rzzbicio.
17. Sposób według za-tro. 14, znamienny tym, że UzmOrUę do-podarza tran-formoje -ię eshUzmbinowandm wektorem DNA zdefiniowanym w za-trz. 5.
18. Spo-Ob według za-trz. 14, znamienny tym, że UomórUę do-podarza tran-formuje -ię zshUombinowandm wektorem DNA zdefiniowanym w τsgtrz. 6.
19. Spo-Ob według oa-tro. 14, znamienny tym, że UomórUę do-podarza tran-formuje -ię oshUzmbinowanym whUeorhm DNA zdefiniowanym w za-eso. 7.
20. Spo-Ob według ea-tso. 15, znamienny tym, że UomórUę do-podarza tran-formuje -ię orhUzmbinowsnym whUtorhm DNA zdefiniowanym w τs-trz. 5.
21. Spo-ób wedłud za-tsz. 15, znamienny tym, że UomórUę do-podarza tran-formuje -ię orhUombinowsndm whUeoshm DNA zdefiniowanym w za-trz. 6.
22. Spo-ób wedłud za-trz. 15, znamienny tym, że UomórUę do-podarza tran-formuje -ię orhUombinowsndm whUtorhm DNA zdefiniowanym w za-tso. 7.
23. Spo-ób wedłud τsgtsz. 16, znamienny tym, że UomósUę do-podasτs tran-formuje -ię zshUombinowandm whUtoshm DNA zdefiniowanym w za-tso. 5.
24. Spo-ób wedłud za-trz. 16, znamienny tym, że UomórUę do-podarza tran-formuje -ię oshUombinowandm whUtoshm DNA zdefiniowanym w za-trz. 6.
25. Spo-ób wedłud za-eso. 16, znamienny tym, że UomórUę do-podarza tran-formuje -ię orhUombinowandm whUtoshm DNA zdefiniowanym w zsgtsz. 7.
26. CzujniU bizlodicznd do wyU^wania tsójazotanu dlichrolo (GTN) i/lub dwosootsnu dlichrzlo (EDGN) w próbce, znamienny tym, że zawiera środUi do UontsUtowama próbUi z enzymem rhduUtazą PETN zdefiniowanym w zagtre. 1, w obecności NADPH oraz środUi do wdUsdoania wy-tąpienia rhsUcji z GTN i/lub EDGN Uatslioowanhj przez enzym shdoUtaoę PETN w pszdpadUo obecności UtórhdoUolwihU z nich lub obydwu w próbce.
27. Spo-ób biolzdiconhdo oczd-eczania środowi-Ua zanihcod-zczonhdo GTN i/lub EGDN, znamienny tym, że wprowadza -ię do środowi-Ua zanihczd-zczonhdo GTN i/lub EGDN enzym rhdoUtaoę PETN zdefiniowany w za-trz. 1, po czym utrzymuje -ię mih-zsninę w wanmUach odpowiednich do degradacji zanieczy-zczenia przez enzym shdoUtsoę PETN, umożliwiając u-unięcie GTN i/lub EGDN.
28. Spo-ób wyUrywania PETN w próbce, znamienny tym, że poddaje -ię próbUę shsUcji obejmującej u-unięcie azotynu z PETN w obecności NADPH i enzymu rhdUUtaod PETN odhfiniowsnhdo w zsgtso. 1, dopóUi wydzielają -ię NADP i azotyn, po czym WdUsdwa -ię wy-tąpienie tej shsUcji.
29. Spo-ób wedłud osgtrz. 28, znamienny tym, że wdUsywa -ię NADP uwalniany podcza- shsUcji.
30. CzujniU biolodiczny do wyUsdwania PETN w próbce, znamienny tym, że zawiera środUi do UontsUtowania próbUj z enzymem shduUtazą PETN zdefiniowanym w τsgtso. 1, w obecności NADPH i środUi do wyUiywania wy-tąpienia shaUcji PETN Uatsliozwanhj przez enzym rhduUtaoę PETN, ddy PETN je-t obecny w próbce.
31. Spo-ób biolodicznhdo ocod-ocosnia środowi-Ua osnihcod-zcoonhgo PETN, znamienny tym, że do środowi-Ua wprowadza -ię enzym rhdoUtaoę PETN zdefiniowany w τsgtso. 1, po czym utrzymuje -ię mie-zaninę w warunUach odpowiednich do dedradacji zanieczy-zczenia przez enzym rhduUtsoę PETN, umożliwiając zużycie PETN obhcnhgo w materiale.
32. Szczep bateryjny Enterobacter cloacae oznaczony jaUo „PB2” i zdeponowany pod numerem NCIMB 40718.
33. Spo-ób wytwarzania enzymu rhduUtaod PETN odhfiniowsnhdo w zsgtsz. 1, znamienny tym, że:

- hoduje -ię ^czep baUteryjny Enterobacter cloacae NCIMB 40718 zdefiniowany w za-trz. 32 w obecności PETN jaUo źródła azotu, w temperaturze od 20 do 40°C, po czym

- hU-tsahujh -ię enzym shduUtaoę PETN z podłoża woso-towhdo lub z UomórUi do-podarza po jej rozbiciu.
34. Spo-ób bizlodicznhgo oczy-zczania środowi-Ua osnihcoy-zcoonhdo PETN, znamienny tym, że środowi-Uo inoUulujh -ię próbUą izolatu -zczepu bsUthryjnhdo Enterobacter

188 502 cloacae zdefiniowanego w zastrz. 32, po czym umożliwia się izolatowi usunięcie PETN obecnego w środowisku.