PL184903B1

PL184903B1 - Method of obtaining a standardised reagent containing human immunoglobulins of g class and anti-d specificity

Info

Publication number: PL184903B1
Application number: PL97320303A
Authority: PL
Inventors: Fedczyszyn┴Wiktor; Kołodziejczyk┴Teresa; Klak┴Krzysztof
Original assignee: Fedczyszyn Wiktor; Klak Krzysztof; Kolodziejczyk Teresa; Regionalne Ct Krwiodawstwa I K
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2003-01-31
Also published as: PL320303A1

Abstract

1· Sposób wytwarzania standaryzowanego odczynnika zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty-D, zwłaszcza do badań serologicznych grup krwi człowieka, znamienny tym, że uzyskuje się roztwór o zawartości przeciwciał anty-D klasy IgG od 0,05-0,06 pg/ml przez rozcieńczenie substancji wyjściowej zawierającej immunoglobuliny, dogodnie za pomocą zbuforowanej soli fizjologicznej o odczynie pH 6,9-7,2, korzystnie 7, który bezpośrednio po tym stabilizuje się ludzką surowicą grupy krwi AB bądź albuminą: ludzką, bydlęcą w ilości 1% objętościowego, konserwuje, dogodnie azydkiem sodu w ilości 0,1% wagowego, po czym chłodzi w temperaturze od + 2 do + 8°C przez około 24 godziny1 · Method for the manufacture of standardized immunoglobulin reagent human G class with anti-D specificity, especially for blood group serology A human being, characterized in that the solution is obtained with an anti-D class antibody content IgG from 0.05-0.06 pg / ml by dilution of the starting substance containing immunoglobulins, conveniently using buffered saline with a pH of 6.9-7.2, preferably 7, which is stabilized immediately after this with human serum of the blood group AB or albumin: human, bovine in the amount of 1% by volume, preserves, preferably with azide sodium in the amount of 0.1% by weight, then cooled at a temperature of + 2 to + 8 ° C for approximately 24 hours

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania standaryzowanego odczynnika, zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty-D przeznaczonego do kontroli testów diagnostycznych, zwłaszcza do badań grup krwi człowieka.The subject of the invention is a method of producing a standardized reagent containing class G human immunoglobulins with anti-D specificity, intended for the control of diagnostic tests, in particular for human blood group tests.

Znane są różne sposoby otrzymywania preparatów na bazie surowicy. Z polskiego opisu patentowego nr 114 529 znany jest sposób wytwarzania liofilizowanego preparatu surowicy antyglobulinowej zwierzęcej. Polega on na tym, że natywną surowicę antyglobulinową bezpośrednio przed liofilizacją rozcieńcza się roztworem buforu fosforanowego o pH 4-8, korzystnie 6,5 zawierającym w 1000³ cm wody destylowanej 13-15 g NajHPO4 · 12H₂O najkorzystniej 14,32 g, 7-10 g KH₂PO4 najkorzystniej 8,16 g.Various methods for the preparation of serum-based preparations are known. The Polish patent specification No. 114 529 describes a method of producing a lyophilized preparation of an antiglobulin animal serum. It consists in the fact that the native antiglobulin serum is diluted immediately before lyophilization with a phosphate buffer solution of pH 4-8, preferably 6.5 containing in 1000 ³ cm of distilled water 13-15 g of NajHPO4 12H ₂ O, most preferably 14.32 g, 7 -10 g KH ₂ PO 4 most preferably 8.16 g.

Z kolei sposób wytwarzania surowic wzorcowych układu ABO - według polskiego opisu patentowego nr 134 342 charakteryzuje się tym, że osocze krwi o mianie niższym od 1 : 32, po odwłóknieniu poddaje się parokrotnie, naprzemiennie zamrożeniu w temperaturze poniżej 5°C i powolnemu rozmrażaniu w temperaturze powyżej + 4°C aż do uzyskania wyraźnego rozdziału surowicy na dwie frakcje. Następnie rozwarstwioną surowicę rozdziela się, frakcję dolną surowicy wzbogaconą w przeciwciała o mianie co najmniej 1 : 32 sączy się przez filtr bakteriologiczny i dodaje środek konserwujący.On the other hand, the method of producing ABO standard sera - according to Polish patent specification No. 134 342, is characterized by the fact that blood plasma with a titer lower than 1:32, after defibrinization, is subjected to several times, alternately freezing at a temperature below 5 ° C and slowly thawing at above + 4 ° C until a clear separation of the serum into two fractions is obtained. The stratified serum is then separated, the bottom fraction of the serum enriched in antibodies with a titer of at least 1:32 is filtered through a bacteriological filter, and a preservative is added.

W dotychczasowej praktyce używano surowicy ludzkiej zawierającej przeciwciała anty-D klasy IgG - którą uzyskuje się dzięki immunizacji ochotników spośród dawców krwi - do wykonywania badań kontrolnych jedynie niektórych testów serologicznych. Natomiast do przeprowadzania testu enzymatycznego zwanego LEN i pośredniego testu antyglobulinowego zwanego PTA używano surowicy o wysokim mianie i krwinek wzorcowych. Polegało to na skontaktowaniu badanej surowicy z krwinkami wzorcowymi według określonej procedury, końcowym odwirowaniu próbek w ściśle określonych warunkach, a następnie na odczycie wyniku w kierunku obecności reakcji aglutynacji.To date, human serum containing anti-D IgG antibodies - obtained by immunizing volunteers from blood donors - has been used to perform control tests of only some serological tests. In contrast, high-titer serum and standard cells were used to perform an enzyme test called LEN and an indirect antiglobulin test called PTA. It consisted in contacting the test serum with reference blood cells according to a specific procedure, final centrifugation of the samples under strictly defined conditions, and then reading the result for the presence of agglutination reaction.

Stosowanie surowicy od dawców immunizowanych, zwykle o wysokim mianie to znaczy 1 : 32 do wykonywania kontroli testów LEN i PTA dawało błędne wyniki z uwagi na zbyt wysoki poziom przeciwciał anty-D w surowicy kontrolnej, co dawało pozytywne wyniki, nawetThe use of sera from immunized donors, usually high titer, i.e. 1:32, for the control of the LEN and PTA assays gave erroneous results due to too high levels of anti-D antibodies in the control serum, which gave positive results, even

184 903 w przypadku nieprawidłowej techniki wykonywania badań; różną zawartość przeciwciał anty-D w surowicy kontrolnej, która w praktyce była różna w różnych jej seriach.184 903 in the case of incorrect testing technique; different levels of anti-D antibodies in the control serum, which in practice were different in different series.

Jak z powyższego wynika, wykorzystanie wymienionej surowicy nie pozwalało na standaryzację badań w zakresie testów enzymatycznych i pośrednich testów antyglobulinowych.As can be seen from the above, the use of the aforementioned serum did not allow for standardization of tests in the field of enzymatic tests and indirect antiglobulin tests.

Celem wynalazku jest wyeliminowanie wymienionych niedogodności, a zadaniem technicznym opracowanie sposobu wytwarzania wzorcowego odczynnika zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty-D gwarantującego prawidłowość wyników badań łatwość ich prowadzenia i standaryzację testów.The aim of the invention is to eliminate the above-mentioned disadvantages, and the technical task is to develop a method for the production of a standard reagent containing class G human immunoglobulins with anti-D specificity, which guarantees the correctness of the test results, the ease of carrying out and standardization of tests.

Przy uwzględnieniu faktu, że surowica ludzka od dawców immunizowanych, o niskim poziomie przeciwciał anty-D klasy IgG wynoszącym około 0,05 pg/ml będzie odpowiednia dla wykonywania testów enzymatycznych i pośredniego testu antyglobulinowego stwierdzono, że otrzymany z niej w określonych warunkach i środowisku odczynnik charakteryzuje się nieoczekiwanie dużą stabilnością - ustalony poziom przeciwciał utrzymuje się w ciągu 12 miesięcy.Taking into account the fact that human serum from immunized donors with a low level of anti-D IgG antibodies of about 0.05 pg / ml would be suitable for the enzymatic and indirect antiglobulin tests, it was found that the reagent obtained from it under certain conditions and environment it is unexpectedly very stable - the set level of antibodies is maintained for 12 months.

Sposób według wynalazku polega na tym, że uzyskuje się roztwór o zawartości przeciwciał anty-D klasy IgG od 0,05-0,06 pg/ml przez rozcieńczenie substancji wyjściowej zawierającej immunoglobuliny dogodnie za pomocą zbuforowanej soli fizjologicznej o odczynie pH 6,9-7,2, korzystnie 7. Bezpośrednio po tym roztwór stabilizuje się ludzką surowicą o grupie krwi AB bądź albuminą: ludzką, bydlęcą w ilości 1% objętościowego, konserwuje dogodnie azydkiem sodu w ilości 0,1°% wagowego, po czym chłodzi w temperaturze od + 2 do + 8°C przez około 24 godziny. Jako substancję wyjściową stosuje się osocze, surowicę ludzką od dawców immunizowanych, monoklonalne przeciwciała anty-D klasy IgG lub inną oczyszczoną immunoglobulinę tej klasy i swoistości. Proces prowadzi się w temperaturze najwyżej 35°C, a dogodnie w temperaturze pokojowej 18-23°C. Po procesie chłodzenia bada się aktywność serologiczną odczynnika, a następnie oznacza zawartość przeciwciał anty-D klasy IgG, które staiowiąjego ściśle określoną wielkość.The method of the invention consists in obtaining a solution with an anti-D IgG content of 0.05-0.06 pg / ml by diluting the immunoglobulin-containing starting material conveniently with buffered saline having a pH of 6.9-7. , 2, preferably 7. Immediately thereafter, the solution is stabilized with human blood group AB serum or 1% by volume human bovine albumin, suitably preserved with sodium azide in an amount of 0.1% by weight, and then cooled at a temperature of + 2 to + 8 ° C for approximately 24 hours. The starting materials are plasma, human serum from immunized donors, anti-D monoclonal antibodies of the IgG class, or other purified immunoglobulin of this class and specificity. The process is carried out at a temperature of at most 35 ° C and conveniently at a room temperature of 18-23 ° C. After the cooling process, the serological activity of the reagent is checked, and then the content of anti-D IgG antibodies, which gives a strictly defined amount, is determined.

Sposób według wynalazku odznacza się prostotą, łatwością wykonania. Umożliwia standaryzację metody badań do kontroli testów diagnostycznych takich jak: testy enzymatyczne, pośredni test antyglobulinowy oraz powtarzalność wyników. Otrzymany odczynnik jest stabilny i zachowuje ważność w okresie 12 miesięcy.The method according to the invention is simple and easy to carry out. It enables standardization of the test method to control diagnostic tests such as: enzymatic tests, indirect antiglobulin test and repeatability of results. The resulting reagent is stable and has a shelf life of 12 months.

Przykład I.Example I.

W osoczu uzyskanym od immunizowanego dawcy oznaczono w autoanalizatorze, zawartość ilościową immunoglobulin klasy G anty-D, która wyniosła 40 pg/ml. Pobrano 10 ml tego osocza i dodano do niego 7920 ml roztworu soli fizjologicznej zwanej PBS o odczynie pH 6,9. W trakcie mieszania dodano do niego 80 ml surowicy ludzkiej o grupie krwi AB oraz 8 g azydku sodu. Otrzymano 800 ml odczynnika, który chłodzono przez okres 24 godzin w temperaturze 5°C, po czym zbadano, że odczynnik jest aktywny serologicznie. Po 3 dniach skontrolowano odczynnik pod względem zawartości przeciwciał anty-D klasy IgG na autoanalizatorze, który wykazał, że zawartość immunoglobulin klasy G anty-D nie zmieniła się i wyniosła 0,05 pg/ml.In the plasma obtained from the immunized donor, the quantitative content of anti-D G-class immunoglobulins was determined in the autoanalyzer, which was 40 pg / ml. 10 ml of this plasma was withdrawn and 7920 ml of a physiological saline solution called PBS at pH 6.9 was added to it. While stirring, 80 ml of human serum with blood group AB and 8 g of sodium azide were added to it. 800 ml of a reagent was obtained, which was cooled for 24 hours at 5 ° C, and then the reagent was tested for serologically active. After 3 days, the reagent was checked for the content of anti-D IgG antibodies on an autoanalyzer, which showed that the content of anti-D G anti-D immunoglobulins was not changed and was 0.05 pg / ml.

Przykład II.Example II.

W osoczu jak w przykładzie I zbadano zawartość ilościową immunoglobulin klasy G antyD, która wyniosła 20 pg/ml. Do 25 ml tego osocza dodano 9900 ml roztworu soli fizjologicznej zwanej PBS o odczynie pH 7,1. W trakcie mieszania dodano do niego 100 ml surowicy ludzkiej o grupie krwi AB oraz 10 g azydku sodu. Otrzymano 10000 ml odczynnika, który chłodzono przez okres 24 godziny w temperaturze 4°C. Po przebadaniu stwierdzono, że odczynnik jest aktywny serologicznie. Dalsze czynności wykonano jak w przykładzie I.As in example 1, the quantitative content of anti-D immunoglobulin G was 20 pg / ml in plasma. To 25 ml of this plasma was added 9900 ml of a physiological saline solution called PBS, pH 7.1. While stirring, 100 ml of human serum with blood group AB and 10 g of sodium azide were added to it. 10,000 ml of reagent was obtained, which was cooled for 24 hours at 4 ° C. Upon testing, the reagent was found to be serologically active. The next steps are as in example I.

Wykonanie oznaczenia za pomocą standaryzowanego odczynnika pokazano na przykładzie testu enzymatycznego zwanego LEN. Do probówki wlano 2 krople 3% zawiesiny krwinek wzorcowych w soli o niskiej sile jonowej zwanej LISS o grupie „0 Rh +” i fenotypie Cc DEe oraz 1 kroplę odczynnika LEN. Otrzymaną, mieszaninę poddano inkubacji w temperaturze + 37°C przez 10 minut. Następnie dodano 2 krople standaryzowanego odczynnika otrzymanego sposobem według wynalazku i ponownie poddano inkubacji w temperaturze 37°C przez 3 minuty. Z kolei odwirowywano przez 60 sekund przy 150 g. Na końcu odczytano wynik badania delikatnie wstrząsając probówką i obserwując jej zawartość w kierunku obecności aglutynacji.The determination with a standardized reagent is shown on the example of an enzyme test called LEN. 2 drops of a 3% suspension of standard blood cells in low ionic strength salt called LISS with the group "0 Rh +" and phenotype Cc DEe and 1 drop of LEN reagent were poured into the test tube. The resulting mixture was incubated at + 37 ° C for 10 minutes. Then, 2 drops of a standardized reagent according to the invention were added and incubated again at 37 ° C for 3 minutes. Subsequently, it was centrifuged for 60 seconds at 150 g. Finally, the test result was read by gently shaking the tube and observing its contents for the presence of agglutination.

Standaryzowany odczynnik - według wynalazku - reaguje z krwinkami Rh + dając aglutynację o nasileniu na ++ i nie reaguje z krwinkami RhThe standardized reagent - according to the invention - reacts with Rh + cells to give agglutination intensified to ++ and does not react with Rh + cells

184 903184 903

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 50 copies

Cena 2,00 zł.Price PLN 2.00.

Claims

Patent claims

1. Method for the production of a standardized reagent containing human class G immunoglobulins with anti-D specificity, especially for serological tests of human blood groups, characterized by obtaining a solution containing anti-D IgG antibodies from 0.05-0.06 pg / ml by dilution of the immunoglobulin starting material, suitably with buffered saline having a pH of 6.9-7.2, preferably 7, which is immediately stabilized with human blood group AB serum or 1% by volume of human or bovine albumin , preserved, conveniently with sodium azide in an amount of 0.1% by weight, and then cooled at + 2 to + 8 ° C for about 24 hours.

2. The method according to p. The method of claim 1, wherein the starting material is plasma, human serum from immunized donors, anti-D monoclonal IgS antibodies or other purified immunoglobulin of this class and specificity.

3. The method according to p. The process of claim 1, characterized in that it is carried out at a temperature of at most 35 ° C, and preferably at a room temperature of 18-23 ° C.

4. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that, after the cooling process, the serological activity of the reagent is tested, and then the content of anti-D IgG antibodies, which constitute its strictly defined quantity, is determined.