PL179432B1

PL179432B1 - Kompozycja kosmetyczna do zwalniania starzenia sie tkanki lacznej oraz sp o só b jej wytwarzania PL PL

Info

Publication number: PL179432B1
Application number: PL94313036A
Authority: PL
Inventors: Ladislas Robert; Alexandre Robert; Elemer Moczar
Original assignee: Roc Sa
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 2000-09-29
Also published as: DE69426932T2; HU9600347D0; GR3035907T3; JPH09501672A; FI960585L; CZ45196A3; EP0714284A1; FI960585A0; AU699585B2; US5910490A; ES2155478T3; CN1131389A; WO1995005155A1; FR2709061B1; DK0714284T3; CZ292029B6; PL313036A1; FR2709061A1; SK18296A3; AU7539394A

Abstract

1. K om pozycja kosm etyczna do zw alniania starzenia sie tkanki lacznej zaw ierajaca oligosacharyd i kosm etycznie akceptow alny nosnik, zn am ien n a tym , z e jak o substancje czynna zaw iera zw iazek wybrany z grupy obejm ujacej m elibioze i pochodne olisacharydów zaw ie rajacych 2-5 reszt glikozydow ych oraz galaktoze w nieredukujacej koncowej pozycji, przy czym pochodne te s a podstaw ione hydrofobowym rodnikiem i s a wybrane z grupy obejm ujacej. a) glikozyd o jednym z ponizszych wzorów , w których oligosacharyd stanowi oligoglikozyd, korzystnie laktoza, m elibioza lub stachioza: w zór (I) o lig o g lik o z y d -1-O -R, w którym R o zn acza lin iow a lub ro zgale zio n a grupe alkilow a o 1-18 atomach wegla, z tym, ze jesli we wzorze ogólnym galaktoza-n -(a lub ß )- ( X ) n ' (A) w którym n oznacza pozycje 1 ,2 ,3 ,4 lub 6, X oznacza pentoze lub heksoze polaczona w konfiguracji a lu b ß , an ' oznacza liczbe od 1 do 5, X oznacza gal, a n równe je s t 1, to R oznacza grupe inna niz etyl lub metyl oraz je sli oligosacharyd stanow i laktoza, to R oznacza grupe inna niz reszta alkilow a o 1-6 atom ach w egla, wzór (II) oligoglikozyd 1-O -R-O-1-oligoglikozyd, w którym R oznacza (C H 2)n, gdzie n w ynosi od 2 do 10, b) acetylow an a glikozyloam ine o jednym z nastepujacych wzorów , w których oligoglikozyd stanow i korzystnie laktoza, m elibioza lub stachioza: wzór (III) oligoglikozyd 1-NH-CO-R, w którym R oznacza liniowa lub rozgaleziona grupe alkilow ao 2-18 atomach w egla, zaw ierajaca 0, 1 lub dw a w iazania podw ójne, w zór (IV ) oligoglikozyd -1-N H -CO -R-CO -N H -1-oligoglikozyd, w którym R oznacza (C H 2)n, gdzie n ozn acza liczbe od 2 do 8, c) alkiloam ine acylow ana kw asem aldonowym stanow iacym produkt utleniania oligoglikozydu o jednym z nastepujacych wzorów wzór (V ) oligoglikozyd-CO-NH-R, w którym R m a to sam o znaczenie co we wzorze (III), wzór (VI) oligoglikozyd-CO-NH-R-CO-oligoglikozyd, w którym R m a to sam o znaczenie co we w zorze (III), d) albo produkt redukcji zasad Sch iffa powstalych w reakcji oligoglikozydów z alifatycznym i m ono- lub diam inam i, o jednym z naste- pujacych wzorów : w zór (V II) G al-(H ex)n-X-H N -R, w zór (V III) G al-(H ex)n-X-H N -R-N H -X-(H ex)n-Gal w którym H ex oznacza heksoze (lub pentoze), n oznacza 0, 1 lub 2, X oznacza reszte heksytolu (lub pentytolu), a R m a to sam o znaczenie co we w zorze (III). 3. Sposób w ytw arzania kom pozycji kosm etycznej do zw alniania starzenia sie tkanki lacznej zaw ierajacej oligosach aryd i kosm etycznie dopuszczalny nosnik, zn am ien n y tym , ze do kosm etycznie akceptow alnego nosnika w prow adza sie skladnik aktywny wybrany z grupy obe- jm ujacej melibioze i pochodne oligosacharydów zaw ierajacych 2-5 reszt glikozydow ych oraz.......... PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja kosmetyczna do zwalniania starzenia się tkanki łącznej oraz sposób jej wytwarzania. Kompozycja ta zawiera oligosacharydy lub pochodne oligosacharydów z D-galaktozą w nieredukującej końcowej pozycji, przy czym pochodne te działająjako modulatory syntezy i/lub wydzielania elastazy z fibroblastów.

Wiadomo, że tkanka łączna w skórze powstaje w wyniku biosyntetycznej aktywności fibroblastów, które wytwarzają matrycę pozakomórkową (Labat-Robert J. i inni, Elsevier

Science Publisher B.V. 248: 386-393, 1990).

179 432

Matryca pozakomórkowa składa się z 4 grup makrocząsteczek. Należą do nich kolageny i elastyna, które tworzą materiał włóknisty skóry, glikoproteiny strukturalne, które zapewniają kohezję między komórkami i pozakomórkową matrycą i stanowią mikrowłóknisty materiał elastycznej tkanki, oraz proteoglikany zapewniające nawilżenie tkanek oraz regulujące przepływ i oddziaływania cząsteczek.

Elastyna zawiera złożony receptor w błonie komórek fibroblastów, zawierający podjednostkę o 67 kD, w skład której wchodzi miejsce wiązania węglowodanów.

A . Hinek i inni (Science 239: 1539-1541, 1988) wykazali, że jeśli podjednostkę o 67 kD receptora elastyny unieruchomi się w kolumnie do chromatografii powinowactwa, w której ligand zawiera elastynę lub peptyd elastyny, to laktoza (1 mM) może eluować to białko o 67 kD, a także że galaktoza jest równie skuteczna w zastępowaniu wiązania białka o 67 kD z elastyną.

Natomiast oligosacharydy nie zawierające galaktozy umożliwiająeluowanie białka o 65 kD związanego w kolumnie powinowactwa z elastyną.

W związku z tym uznano, że receptor elastyny jest białkiem wykazującym wiązania galaktozydów.

Wiadomo również, że elastyny w postaci rozpuszczalnej lub nierozpuszczalnej są podatne na hydrolizę przez endoproteazy, a zwłaszcza przez elastazę.

Zidentyfikowano różne grupy proteaz i endopeptydaz, przy czym przegląd różnych endopeptydaz i ich właściwości został opublikowany przez Barretfa i innych, 1977 (Barrett A.J., red., North Holland, Amsterdam).

Elastazy stanowią proteazy i endoproteazy, których właściwości zaczyna się dokładnie badać. W następujących artykułach, które wprowadza się jako źródło literaturowe, opisano te właściwości:

Bieth J. (1978): „Elastase: structure, function and pathological role”. Front, of Matrix Biol. Cis.: 1-82, oraz

- Homsey R i inni (1988): „Characterization of human skin fibroblastes elastase activity”. Joum. Invest. Dermatol. 91: 472-4777.

Określenie enzymu nazwą elastaza nie oznacza, że jest to proteaza specyficzna względem elastyny. W rzeczywistości elastaza hydrolizuje szereg różnych substratów białkowych; tak np. elastaza leukocytowa może rozszczepiać praktycznie wszystkie makrocząsteczki w tkance łącznej (Robert L., 1988, Path. Biol. 36: 1101-1107).

Takie proteazy typu elastaz mogą degradować elastyczne włókna w tkankach, a także inne składniki takie jak włókna kolagenowe lub glikoproteiny, np. fibronektynę. Tego typu zjawisko opisano wśród zjawisk związanych ze starzeniem komórek; liczne badania wykazały, że synteza i nagromadzanie się tego enzymu zwiększa się wraz ze starzeniem, przy czym wymienić tu można w szczególności następujące pozycje:

- Labat-Robert J. i inni, Ann. New York Acad. Sci. (1992), 673: 16-22;

- Robert J. Sang Thrombose Vaisseaux (1991), 3: 267-330;

- Robert L. Pathol. Biol. (1988), 36: 1101-1107.

Te same proteazy i endopeptydazy mogą również degradować składniki matrycy innych organów, np. elastyny płucnej, co prowadzi do samoistnej rozedmy płuc, albo degradować elastyczną warstwę tętnic, a także elastynę i kolagen w żyłach, co przyczynia się do pojawienia się chorób naczyniowych, miażdżycy i stwardnienia tętnic oraz żylaków. Częstotliwość występowania i ostrość wszystkich takich stanów patologicznych zwiększa się wraz z wiekiem.

Inne endopeptydazy tego samego typu (metaloendopeptydazy cynkowe) mogą uaktywniać nieczynną angiotensynę I do angiotensyny II, co może wywołać poważne nadciśnienie tętnicze.

Ponadto endokefaliny, inne endopeptydazy cynkowe tego typu zakłócają działanie enkefalin, co w zależności od stopnia ich nadmiaru może doprowadzić do zakłóceń w pracy mózgu.

179 432

Wspólnym mianownikiem wszystkich tych endopeptydaz działających na różne substraty i prowadzonych do różnych zmian patologicznych jest to, że posiadają one centrum aktywności zawierające Zn oraz to, że wszystkie związane są z błoną komórkową.

W poniższym opisie rozpatrzony zostanie przypadek elastazy fibroblastów skóry, z tym że fizjopatologiczny mechanizm i zaprezentowany sposób przeciwdziałania będą również obowiązywać w przypadku innych endopeptydaz i innych stanów patologicznych, których niepełne zestawienie podano powyżej.

W stanie techniki znana jest kompozycja kosmetyczna zawierająca ołigosacharydy, fruktooligosacharydy, galaktooligosacharydy lub ich mieszaniny ujawniona w publikacji WO 93/00067. Ujawniona kompozycja zawiera galaktooligosacharydy o reszcie sacharozy o ogólnym wzorze [a-Gal(l->a)]_n a-Glu(l—>2^-fluktoza i/lub zawiera galaktooligosacharydy o reszcie laktozowej o ogólnym wzorze [3-Gal(l^a)]_n p-Gal(l->4)glukoza, podczas gdy kosmetyczna kompozycja według niniejszego wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera melibiozę jako oligosacharyd lub konkretne pochodne oligosacharydów o wzorze I do VII (to jest ołigosacharydy podstawione przez rodniki hydrofobowe).

Europejski opis patentowy EP 0133170 natomiast ujawnia kompozycje zawierające jako substancję aktywną laktozę i podstawione pochodne laktozy, które nie są objęte w ogóle niniejszym wynalazkiem.

Według wynalazku kompozycja kosmetyczna do zwalniania starzenia się tkanki łącznej zawierająca oligosacharyd i kosmetycznie akceptowalny nośnik, charakteryzuje się tym, że jako substancję czynną zawiera związek wybrany z grupy obejmującej melibiozę i pochodne oligosacharydów zawierających 2-5 reszt glikozydowych oraz galaktozę w nieredukującej końcowej pozycji, przy czym pochodne te są podstawione hydrofobowym rodnikiem i są wybrane z grupy obejmującej

a) glikozyd o jednym z poniższych wzorów, w których oligosacharyd stanowi oligoglikozyd, korzystnie laktoza, melibioza lub stachioza:

wzór (I) oligoglikozyd 1-O-R, w którym R oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1-8 atomach węgla, z tym, że jeśli we wzorze ogólnym (A) galaktoza-_n-(a lub β)-(Χ)_η, (A) w którym n oznacza pozycję 1, 2, 3, 4 lub 6, X oznacza pentozę lub heksozę połączoną w konfiguracji a lub β, a ń oznacza liczbę od 1 do 5,

X oznacza gal, a n równe jest 1, to R oznacza grupę inną niż etyl lub metyl oraz jeśli oligosacharyd stanowi laktoza, to R oznacza grupę inną niż reszta alkilowa o 1-6 atomach węgla, wzór (II) oligoglikozyd-1-O-R-O-l-oligoglikozyd, w którym R oznacza (CH_2)n, gdzie n wynosi od 2 do 10,

b) acetylowaną glikozyloaminę o jednym z następujących wzorów, w których oligoglikozyd stanowi korzystnie laktoza, melibioza lub stachioza:

wzór (III) oligoglikozyd-1-NH-CO-R, w którym R oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 2-18 atomach węgla, zawierającą 0, 1 lub dwa wiązania podwójne, wzór (IV) oligoglikozyd-1-NH-CO-R-ĆO-NH-l-oligoglikozyd, w którym R oznacza (CH₂)_n, gdzie n oznacza liczbę od 2 do 8,

c) alkiloaminę acylowaną kwasem aldonowym stanowiącym produkt utleniania oligoglikozydu, wzór (V) oligoglikozyd-CO-NH-R, w którym R ma to samo znaczenie co we wzorze (ΠΙ), wzór (VI) oligoglikozyd-CO-NH-R-CO-oligoglikozyd, w którym R ma to samo znaczenie co we wzorze (III),

d) albo produkt redukcji zasad Schiffa powstałych w reakcji oligoglikozydów z alifatycznymi mono- lub diaminami, o jednym z następujących wzorów:

179 432 wzór (VII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R, wzór (VIII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R-NH-X-(Hex)_n-GAl w którym

Hex oznacza heksozę (lub pentozę), n oznacza 0, 1 lub 2,

X oznacza resztę heksytołu (lub pentytolu), a

R ma to samo znaczenie co we wzorze (III).

Kompozycja korzystnie zawiera melibiozę.

Według wynalazku sposób wytwarzania kompozycji kosmetycznej do zwalniania starzenia się tkanki łącznej zawierającej oligosacharyd i kosmetycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzuje się tym, że do kosmetycznie akceptowalnego nośnika wprowadza się składnik czynny wybrany z grupy obejmującej melibiozę i pochodne oligosacharydów zawierających 2-5 reszt glikozydowych oraz galaktozę w nieredukującej końcowej pozycji, przy czym pochodne te są podstawione hydrofobowym rodnikiem i są wybrane z grupy obejmującej.

wzór (I) oligoglikozyd-l-O-R, w którym R oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1-18 atomach węgla, z tym, że jeśli we wzorze ogólnym (A) galaktoza-_n-(a lub β)-(Χ)_η. (A) w którym n oznacza pozycję 1, 2, 3,4 lub 6, X oznacza pentozę lub heksozę połączoną w konfiguracji a lub β, a n' oznacza liczbę od 1 do 5,

X oznacza gal, a n równe jest 1, to R oznacza grupę inną niż etyl lub metyl oraz jeśli oligosacharyd stanowi laktoza, to R oznacza grupę inną niż reszta alkilowa o 1-6 atomach węgla, wzór (II) oligoglikozyd-l-O-R-O-l-oligoglikozyd, w którym R oznacza (CH₂)_n, gdzie n wynosi od 2 do 10,

wzór (III) oligoglikozyd-l-NH-CO-R, w którym R oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 2-18 atomach węgla, zawierającą 0,1 lub dwa wiązania podwójne, wzór (IV) oligoglikozyd-l-NH-CO-R-CO-NH-l-oligoglikozyd, w którym R oznacza (CH₂)_n, gdzie n oznacza liczbę od 2 do 8,

c) alkiloaminę acylowaną kwasem aldonowym stanowiącym produkt utleniania oligoglikozydu, wzór (V) oligoglikozyd-CO-NH-R, w którym R ma to samo znaczenie co we wzorze (III), wzór (VI) oligoglikozyd-CO-NH-R-CO-oligoglikozyd, w którym R ma to samo znaczenie co we wzorze (III),

wzór (VII) GAl-(Hex)_n-X-HN-R, wzór (VIII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R-NH-X-(Hex)_n-Gal w którym

Hex oznacza heksozę (lub pentozę), n oznacza 0, 1 łub 2,

X oznacza resztę heksytołu (lub pentytolu), a

R ma to samo znaczenie co we wzorze (III), przy czym pochodne oligosacharydów wytwarza się w sposób obejmujący

a) ekstrahowanie cukrów ze środowiska biologicznego, zwłaszcza z mleka, krwi lub łożyska,

179 432

b) degradowanie enzymatyczne wyekstrahowanych cukrów lub ich chemiczną hydrolizę oraz

c) wydzielanie pożądanego oligosacharydu.

Do kosmetycznie akceptowalnego nośnika wprowadza się oligosacharyd z 2-5 resztami glikozydowymi zawierający galaktozę w nieredukującej końcowej pozycji, albo pochodną takiego oligosacharydu, w ilości stanowiącej 0,5-6% korzystnie 1-4% wagowo/objętościowych kompozycji.

Kompozycję według wynalazku zawierającą oligosacharydy lub ich pochodne z galaktozą w nieredukującej końcowej pozycji można stosować do przeciwdziałania lub zapobiegania objawom przyspieszonego starzenia się włóknistego zrębu tkanki łącznej towarzyszącego pewnym stanom patologicznym, zwłaszcza patologii sercowo-naczyniowej i rozedmie płuc.

Do oligosacharydów wchodzących w skład kompozycji do przeciwdziałania lub zapobiegania objawom starzenia się skóry lub przyspieszczonego starzenia się włóknistego zrębu tkanki łącznej należy korzystnie laktoza, melibioza, stachioza albo pochodne jednego z tych cukrów lub ich mieszaniny.

Wszystkie takie oligosacharydy lub ich pochodne wymienione powyżej, wykazują tą wspólną cechę, że zmniejszają o co najmniej 20% syntezę i/lub wydzielanie elastazy w hodowli fibroblastów.

Działanie to objawia się spadkiem mierzalnej aktywności enzymatycznej ośrodka hodowli takich komórek, a także samych komórek.

Wykorzystywany sposób obejmuje hodowlę fibroblastów ludzkiej skóry w standardowych warunkach oraz oznaczanie aktywności elastazowej hodowli metodą kolorymetryczną z wykorzystaniem syntetycznego substratu (N-sukcynylotrialanylo)-p-nitroanilidu).

Przy wykorzystaniu takiego syntetycznego substratu można również wykazać, że biosynteza endopeptydaz typu elastazy zwiększa się w czasie kolejnych pasażowań fibroblastów, tak że stanowi on układ starzenia in vitro, zgodnie z modelem Hayflicka (1980, Celi Adding In. Annual Review of Gerontology and Geriatrics; Springer, New York 1: 26-67); Labat-Robert J. i inni (1988, Expert Gerontol. 23: 5-18).

Aktywność enzymatyczna jest zasadniczo związana z błoną komórkową i może być odzyskana po trypsynizacji fibroblastów we frakcji rozpuszczalnej.

2-10% całkowitej aktywności można odzyskać w ośrodku hodowli, a reszta związana jest z resztkami komórek i może zostać rozpuszczona przy zastosowaniu detergentu.

Wynalazek dotyczy zastosowania oligosacharydów lub ich pochodnych opisanych powyżej do kontrolowania biosyntezy i wydzielania proteaz typu elastazy z fibroblastów poprzez receptor elastyny obecny na ludzkich fibroblastach, zwłaszcza na fibroblastach skóry, przy czym wynikiem tego kontrolowania jest zapobieganie lub przeciwdziałanie objawom starzenia skóry lub tych procesów przyspieszonego starzenia związanych ze stanami patologicznymi, w szczególności z obecnością nadmiaru endopeptydaz.

Jak to zaznaczono powyżej, podjednostka receptora elastyny o 67 kD zawiera strukturę, która reaguje specyficznie z laktozą lub ze strukturami oligo- lub polisacharydowymi zawierającymi galaktozę w pozycji końcowej (Labat-Robert J. i inni, patrz wyżej. Mecham R.P i inni, Biochem. 28: 3716- 3722).

Pochodne oligosacharydów wchodzące w skład kompozycji według wynalazku można syntetyzować chemicznie, jak to zostanie wyjaśnione poniżej w przykładach, albo wyodrębnić z ośrodków biologicznych, zwłaszcza z mleka, krwi lub łożyska, bądź też z produktów naturalnych takich jak miód, zawierających galaktozydy nadające się do wytwarzania kompozycji według wynalazku (R. Siddiąui, w Advance in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, red.: D. Horton, VoL 49, 285-309).

Polisacharydy lub ich pochodne można wyodrębniać znanymi sposobami (Frontiers of Matrix Biology (1985), Vol. 10, S. Karger red.), po czym poddawać degradacji enzymatycznej lub hydrolizie chemicznej, po czym odpowiedni związek oddziela się przez wytrącanie

179 432 roztworem soli, metodą chromatografii jonowymiennej lub chromatografii na żelu Sepharose albo innym odpowiednim sposobem.

Kompozycja według wynalazku może być również przeznaczona do zapobiegania lub przeciwdziałania objawom przyspieszonego starzenia włóknistych zrębów tkanki łącznej towarzyszących pewnym stanom patologicznym związanym z nienormalną syntezą elastazy, w szczególności samoistnej rozedmy płuc, miażdżycy i stwardnienia tętnic oraz żylaków, a także do przeciwdziałania lub zapobiegania nadciśnieniu tętniczemu w przypadku, gdy endopeptydazy typu elastazy są odpowiedzialne za uaktywnienie angiotensyny I do angiotensyny II.

Gdy pochodna oligosacharydu zawiera hydrofobową resztę, korzystny nośnik mogą stanowić liposomy, dzięki czemu część glikozydowa pochodnej będzie znajdować się na ich powierzchni.

W podanych poniżej szczegółowych przykładach przedstawiono wpływ laktozy, melibiozy, stachiozy i ich pochodnych na syntezę i wydzielanie elastazy przez ludzkie fibroblasty po 15-25 pasażowaniach: komórki poddane takiej obróbce stanowią komórki, które weszły w fazę starzenia się, zgodnie z modelem Hayflicka (patrz wyżej) i w związku z tym stanowią model starzenia in vitro.

Zaobserwowane osłabienie syntezy i wydzielania elastazy w takim układzie w wyniku wprowadzania pochodnych oligosacharydów według wynalazku jest oznaką działania takich związków przeciwstarzeniowych gdyż, jak to zaznaczono powyżej, intensyfikacja syntezy i wydzielania elastazy jest zjawiskiem związanym ze starzeniem takich fibroblastów.

Przykłady te nie ograniczają się do wpływu na fibroblasty skóry, ale mogą być uogólnione na dowolny rodzaj komórek fibroblastów i innych komórek naskórka, komórek mięśni gładkich oraz leukocytów zawierających w błonie receptor elastyny, który to receptor zawiera podjednostkę o 67 kD i wykazuje powinowactwo względem galaktozydów.

Materiały i metody

Fibroblasty ludzkiej skóry uzyskano z biopsji skóry pobranych w czasie piersiowej chirurgii plastycznej kobiet w wieku 16-24 lat.

Komórki hodowano w ośrodku Eagle'a zmodyfikowanym według Dulbecco (DMEM) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 200 pg/ml penicyliny i 200 jednostek/ml streptomycyny w atmosferze 90/10% tlen/azot, w plastykowych butelkach Nunclon-Delta o wymiarach 35 x 10 mm.

Doświadczenia przeprowadzano między 18 i 21 pasażowaniem, przede wszystkim z tego powodu, że na takim poziomie zwiększa się aktywność elastazy, co świadczy o stanie starzenie się komórek.

godzin przed doświadczeniem ośrodek ściągano i dodawano świeży ośrodek DMEM z dodatkiem laktozy, tak aby jej ostateczne stężenie było 10 mM.

Po określonych odstępach czasu ośrodek usuwano i warstwę komórek przemywano 1 ml PBS (roztworu soli buforowanego fosforanem), który dodawano do ośrodka.

Warstwę komórek zadawano świeżym roztworem trypsyny (Worthington) o stężeniu 20 g/ml PBS na 5 minut w 37°C, po czym mieszaninę odwirowywano przy 100 x g przez 5 minut w 4°C.

Po zdekantowaniu i przemyciu 1 ml PBS pozostałości komórek zawieszano w 1 ml 0,1 M buforu Tris-HCl o pH 7,4, zawierającego 0,1% środka Triton Χ-100 i całość homogenizowano w homogenizatorze Potter.

Supematant z tej zawiesiny zastosowano do oznaczania aktywności enzymatycznej związanej z komórkami.

Oznaczanie elastazowej aktywności enzymatycznej przeprowadzano dodając substrat, (N-sukcynylo-trialanylo-p-acetanilid czyli N-Sus-ala₃p-Na) o stężeniu 125 mM w dimetyloformamidzie do próbki ekstraktu komórkowego, w sposób opisany przez J. Bieth'a (patrz wyżej).

μΐ ośrodka hodowli dodawano do 890 μΐ 0,1 M buforu Tris-HCl o pH 7,8 i 10 μΐ roztworu substratu.

μΐ trypsynianu lub pozostałości komórek dodawano do 940 μΐ buforu Tris i 10 μΐ roztworu substratu.

179 432

Inkubacje prowadzono w 37°C przez 3 godziny w przypadku ośrodka hodowli i przez 1 godzinę w przypadku trypsynianu i pozostałości komórek.

Gęstość optyczną żółtego zabarwienia pojawiającego się w wyniku działania enzymu na substrat oznaczano przy 410 nm za pomocą spektrofotometru.

Wszystkie doświadczenia prowadzono równocześnie na 4-6 hodowlach porównując wielkości średnie statystycznie z wykorzystaniem testu t Studenta.

Aktywność enzymatyczną wyrażano w nM substratu hydrolizowanego na godzinę i na 10⁶ komórek, wyliczając ją w sposób następujący

OD · v całkowita „

EA =--10⁶

8,8 · v próbki · N T gdzie

- OD oznacza gęstość optyczną

- N oznacza liczbę komórek w objętości mieszaniny reakcyjnej

- T oznacza czas inkubacji, a

- 8,8 stanowi molowy współczynnik ekstynkcji odpowiadający OD molowego roztworu substratu w belce o grubości 1 cm.

W przedstawionych poniżej różnych przykładach zbadano wpływ galaktozy i jej pochodnych na modyfikację aktywności elastazowej fibroblastów oznaczają modyfikację tej aktywności przez peptyd elastynowy - κ-elastynę (KE); peptyd ten uzyskano przez hydrolizę elastyny z wiązadła karkowego wołu, prowadząc hydrolizę alkaliczną w uwodnionym etanolu w sposób opisany przez L. Roberta i N. Pollain'a (Etudes sur la structure de 1'elastine et le modę d'action de 1'elastase. I. Nouvelle mćthode de prćparation do derives solubles de 1'elastine. [Badanie struktury elastyny i sposobu działania elastazy. I Nowy sposób preparowania rozpuszczalnych pochodnych elastyny]. Buli. Soc. Dim. Biol. 45: 1317-1326 (1963)).

Uzyskany peptyd jest agonistem receptora elastyny, to znaczy jego obecność prowadzi do wzrostu aktywności elastynowej fibroblastów w hodowli.

W tabeli 1 poniżej podano parametry kinetyczne wpływu κ-elastyny w ilości 1 mg/płytkę na aktywność ełastazową ludzkich fibroblastów w 20 pasażowaniu w funkcji czasu inkubacji.

Tabela 1

	Czas inkubacji z KE (godziny)
0	2	6	24	48
EADMEM	0,04	0,04	0,03	0,21	0,99
EA TRYPS	0.267	0,2	0,207	0,190	0,123

Znaczny wzrost aktywności elastazowej (związany z wydzielaniem) zaobserwowano w ośrodku hodowli po okresie utajenia 24 godziny. W tym samym czasie aktywność błony w trypsynianie spada. Wynika stąd, że wzrost aktywności ośrodka może być związany z uwalnianiem enzymy z błony do ośrodka.

Przykład I. Badanie działania laktozy

Zastosowano laktozę w stężeniu 10 mM lub 3,6 mg/ml. W poniższej tabeli 2 przedstawiono wpływ 10 mM laktozy na aktywność ełastazową ludzkich fibroblastów w 21 pasażowaniu oraz jej rozdział między postacią wolną, postacią w błonie (trypsynian) i postacią związaną z komórką (po obróbce środkiem Triton).

Aktywność podano jako gęstość optyczną zhydrolizowanego substratu pomnożoną przez 10³/godzinę dla 10⁶ komórek. Wyliczono wielkość średnią dla 4 równoległych pomiarów dokonanych na różnych hodowlach.

179 432

Rozdział aktywności między trzema przedziałami podano jako procent aktywności całkowitej; inhibitujące działanie laktozy podano jako procent odpowiedniej aktywności przy braku laktozy.

Tabela 2

	Kontrolna	Z laktozą
Aktywność	% aktywności całkowitej	Aktywność	% aktywności całkowitej	%
Aktywność całkowita	588,1	100	262,2	100	55
Ośrodek hodowli	56,1±7,6	10	18,8±1,1	7	66
Trypsynian	359,5±41,7	61	91,3±31,7*	35	74
Komórki	172.5±16,8	29	151,5±28,8	58	12

p<0,05 z porównania hodowli kontrolnej i hodowli z laktozą.

Z tabeli tej wynika zmniejszenie o 55% aktywności całkowitej oraz zmiana rozdziału aktywności enzymatycznej dla 3 frakcji.

Zawartość wolnego enzymu w ośrodku hodowli zmniejszyła się o 66% w porównaniu z hodowlą kontrolną, a zawartość enzymu zasocjowanego z błoną, który może być uwolniony przez trypsynę spadła o 74%, podczas gdy pozostała (komórka) aktywność nie wykazywała znaczącej różnicy w porównaniu z hodowlą kontrolną.

Takie selektywne inhibitowanie aktywności związanych z błoną i uwalnianych do ośrodka modyfikuje rozdział aktywności całkowitej.

W hodowlach kontrolnych znacząca część całkowitej aktywności związana jest z błoną komórkową (61%) i może być uwolniona przez trypsynę; w hodowlach z dodatkiem laktozy tylko 35% aktywności jest uwalniane przez trypsynę; 58% związane jest z pozostałością komórkową.

W związku z tym można stwierdzić, że laktoza wywiera wpływ na osłabienie syntezy enzymu i jego uwalnianie.

Przykład II. Badanie wpływu melibiozy na syntezę elastazy

Melibiozę dodawano do ośrodka hodowli w stężeniu 10 mM czyli 3,4 mg/ml, prowadząc hodowlę w takich samych warunkach jak z laktozą.

Melibioza powoduje zmniejszenie o około 60% aktywności enzymatycznej w ośrodku w porównaniu z hodowlą kontrolną i zmniejszenie o 80% w trypsynianie, a także nieznaczne zmniejszenie w osadzie komórkowym.

Całkowita aktywność enzymatyczna zmniejszyła się o 50%.

Przykład III. Działanie stachiozy

Stachioza jest tetrasacharydem otrzymywanym techniką M.L. Wolframa i A. Thompsona, opisaną w Methods of Carbohydrate Chemistry I, 368-369, Academic Press, 1962.

Stachiozę dodawano do ośrodka hodowli w stężeniu 10 mM czyli 6,6 mg/ml.

Powoduje ona obniżenie aktywności enzymatycznej w trypsynianie o 30% w stosunku do hodowli kontrolnej, oraz nieznaczne jej zwiększenie w ośrodku.

W obecności κ-elastyny w stężeniu 1 mg/ml obniża ona znacznie aktywność enzymatyczną w ośrodku (o 52%) w stosunku do wpływu samej κ-elastyny.

W trypsynianie zaobserwowano wzrost o 32% w stosunku do wpływu samej κ-elastyny. Aktywność enzymatyczna w osadzie komórkowym nie zmieniała się znacząco.

179 432

Przykład IV. Działanie oleoilolaktozyloaminy

Oleoilolaktozyloamina jest związkiem o poniższym wzorze , a sposób jej wytwarzania jest nowy.

a) Wytwarzanie

1-aminolaktoza reaguje z chlorkiem oleoilu tworząc laktobionylooleilaminę o wzorze

galaktoza glukoza

3,3, g laktozyloaminy rozpuszczono w 30 ml metanolu w 80°C i dodano 1,2 g dietyloaminy. Do mieszanego roztworu dodano 4 g chlorku oleilu w temperaturze nie przekraczającej 30°C.

pH mieszaniny doprowadzono do 3 dodając HC1. Kwas oleinowy usunięto przez ekstrakcję heptanem. Fazę wodnometanolową przepuszczono kolejno przez kolumnę kationitową i amonitową, po czym rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem.

Uzyskany produkt zawierał w dalszym ciągu około 20% laktozy. Oleilolaktozyloaminę oczyszczać można w kolumnie z oktylosefarozą.

Rf na krzemionce (cienka warstwa MeOH) 0,8 (chloroform/metanol 1/1 objętościowo).

b) Wpływ na zestarzałe kolonie fibroblastów

Oleoilolaktozyloaminę dodawano w stężeniu 0,5 mM.

Przy takim stężeniu powoduje ona nieznaczny wzrost aktywności w trypsynianie i spadek w pozostałości komórkowej o około 20%.

Przykład V. Wpływdimelibionitylodiaminoheksanu

a) Wytwarzanie dimelibionitylodiaminoheksanu

Produkt ten zsyntetyzowano nowym sposobem opisanym poniżej.

374 mg melibiozy (1,1 mM i 116 mg (0,5 mM) diaminoheksanu rozpuszczono w 5 ml 0,2 M buforu fosforanowego o pH 8 i do roztworu dodano 270 mg (4,4 mM) cyjanoborowodorku sodowego. Mieszaninę odstawiono w temperaturze pokojowej na 11 dni, po czym ogrzewano w 37°C przez 2 dni. Roztwór przepuszczono przez kolumnę kationitową (H⁺), po czym kolumnę przemyto wodą.

Następnie substancję eluowano 0,5 M roztworem amoniaku i roztwór liofilizowano. Otrzymano 200 mg dimelibionitylodiaminoheksanu.

Rf na krzemionce = 0,2 (butanoł/kwas octowy/woda, h = 1:1).

Na figurze 1 przedstawiono schemat reakcji prowadzących do pochodnych dimelibionitylodiaminoheksanu.

b) Wpływ dimelibionitylodiaminoheksanu na aktywność enzymatyczną hodowli ludzkich fibroblastów.

Zaobserwowano wzrost aktywności enzymatycznej w ośrodku oraz spadek o 40% w trypsynianie w stosunku do hodowli kontrolnej.

W obecności κ-elastyny aktywność w ośrodku zmniejsza się o 71%, bez wzrostu w przypadku trypsynianu.

Natomiast aktywność w pozostałości komórek zwiększa się nieznacznie w porównaniu z działaniem samej κ-elastyny, z tym że nie przekracza wielkości dla hodowli kontrolnej.

179 432

c) Porównanie różnych efektów

W poniższej tabeli 3 zestawiono ogólne wyniki wpływu różnych pochodnych galaktozydowych na aktywność elastazową ludzkich fibroblastów.

Tabela 3

Wpływ na aktywność elastazową

Substancja	Łączenie	DMEM	Trypsynian	Pozostałość komórek
1	2	3	4	5
Laktoza	T27%	T30%	T70%	T30%
Laktoza + KE	T13,5%	T20%	T50%	T30%
Melibioza	4-58%	T60%	T80%	T30%
Melibioza + KE	Tl 5%	T27%	T31%	T9%
Stachioza	Tl 7%	T14%	T35%	-
Stachioza + KE	Tl 7%	T56%	T32%	-
Karaginan	T28%	•	T66%	T30%
Karaginan + KE	-	T28%	T29%	-
L,0. Amina	Tl 5%	T44%	T61%	Tl 9%
L.O. Amina + KE	T27%	-	T41%	T32%
M.L. Amina	Tl 3%	Tio%	Tl 5%	T50%
M.L. Amina + KE	T40%	Tn%	Tl 7%	T50%
MBA	T23%	T67%	-	T35%
MBA + KE	T7%	T60%	T20%	T23%
DMDAH	-	T67%	T53%	-
DMDAH + KE	T23%	T70%	Tl 8%	T34%
MDH	T58%	T60%	T37%	T60%
MDH + KE	T54%	T80%	Tl 4%	T56%

L.O. Amina = Laktobionylooleiloamina

M.L. Amin = Mirystoilolaktozyloamina

MBA = Kwas melibionowy

DMDAH = Dimelibionitoilodiaminoheksan

MDH = Dimelibiotylodiaminoheksan

KE = κ-elastyna

Podkreślone pochodne opisano w powyższych przykładach.

Przykład VI. Wpływ laktozy i melibiozy na gołe szczury

Porównano dwie grupy szczurów, przy czym jednej grupie podawano laktozę lub melibiozę, a drugiej placebo.

Szczury napromieniowano następnie dawką 3 x MED (minimalna dawka wywołująca rumień).

Testy aktywności elastazowej oznaczano na biopsjach pobranych z napromieniowanych szczurów w sposób opisany w części „materiały i metody”.

179 432

Melibioza

Aldehydowa postać

-0 melibiozy (Melibioza-CHO

0H\ .

Ćh₂-choh-choh-choh-choh-choh (CH₂)g - NH₂ + OHC - Melibioza

1,6-diaminoheksan

Melibioza - CH = N - (CH?) θ - N = CH - Melibioza

NaCNBH^ (nietrwała zasada Schiffa) v

Melibioza-CH₂ - NH - (CH₂) θ - NH - CH₂ - Melibioza

Melibionitol

Melibionitol - NH (Cł^) θ - NH - Melibionitol

Dimelibionitylodiaminoheksan

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja kosmetyczna do zwalniania starzenia się tkanki łącznej zawierająca oligosacharyd i kosmetycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera związek wybrany z grupy obejmującej melibiozę i pochodne olisacharydów zawierających 2-5 reszt glikozydowych oraz galaktozę w nieredukującej końcowej pozycji, przy czym pochodne te są podstawione hydrofobowym rodnikiem i są wybrane z grupy obejmującej.

wzór (I) oligoglikozyd-l-O-R, w którym R oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1-18 atomach węgla, z tym, że jeśli we wzorze ogólnym galaktoza-_n-(a lub βχΧ)_η, (A) w którym n oznacza pozycję 1, 2, 3, 4 lub 6, X oznacza pentozę lub heksozę połączoną w konfiguracji a lub β, a ń oznacza liczbę od 1 do 5,

X oznacza gal, a n równe jest 1, to R oznacza grupę inną niż etyl lub metyl oraz jeśli oligosacharyd stanowi laktoza, to R oznacza grupę inną niż reszta alkilowa o 1-6 atomach węgla, wzór (Π) oligoglikozyd 1-O-R-O-l-oligoglikozyd, w którym R oznacza (CH₂)_n, gdzie n wynosi od 2 do 10,

wzór (III) oligoglikozyd 1-NH-CO-R, w którym R oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 2-18 atomach węgla, zawierającą 0, 1 lub dwa wiązania podwójne, wzór (IV) oligoglikozyd-1-NH-CO-R-CO-NH-l-oligoglikozyd, w którym R oznacza (CH₂)_n, gdzie n oznacza liczbę od 2 do 8,

c) alkiloaminę acylowaną kwasem aldonowym stanowiącym produkt utleniania oligoglikozydu o jednym z następujących wzorów wzór (V) oligoglikozyd-CO-NH-R, w którym R ma to samo znaczenie co we wzorze (ΠΙ), wzór (VI) oligoglikozyd-CO-NH-R-CO-oligoglikozyd, w którym R ma to samo znaczenie co we wzorze (III),

Hex oznacza heksozę (lub pentozę), n oznacza 0, 1 lub 2,

X oznacza resztę heksytolu (lub pentytolu), a

R ma to samo znaczenie co we wzorze (III).

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera melibiozę.

3. Sposób wytwarzania kompozycji kosmetycznej do zwalniania starzenia się tkanki łącznej zawierającej oligosacharyd i kosmetycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że do kosmetycznie akceptowalnego nośnika wprowadza się składnik aktywny wybrany z grupy

179 432 obejmującej melibiozę i pochodne oligosacharydów zawierających 2-5 reszt glikozydowych oraz galaktozę w nieredukującej końcowej pozycji, przy czym pochodne te są podstawione hydrofobowym rodnikiem i są wybrane z grupy obejmującej.

wzór (I) oligoglikozyd-l-O-R, w którym R oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową ol-18 atomach węgla, z tym, że jeśli we wzorze ogólnym galaktoza-_n(a lub β)-(Χ)_η- (A) w którym n oznacza pozycję 1, 2, 3, 4 lub 6, X oznacza pentozę lub heksozę połączoną w konfiguracji a lub β, a ń oznacza liczbę od 1 do 5,

wzór (III) oligoglikozyd-l-NH-CO-R, w którym R oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 2-18 atomach węgla, zawierającą 0, 1 lub dwa wiązania podwójne, wzór (IV) oligoglikozyd-l-NH-CO-R-CO-NH-l-oligoglikozyd, w którym R oznacza (CH₂)_n, gdzie n oznacza liczbę od 2 do 8,

c) alkiloaminę acylowaną kwasem aldonowym stanowiącym produkt utleniania oligoglikozydu o jednym z następujących wzorów wzór (V) ohgoglikozyd-CO-NH-R, w którym R ma to samo znaczenie co we wzorze (ΙΠ), wzór (VI) oligoglikozyd-CO-NH-R-CO-oligoglikozyd, w którym R ma to samo znaczenie co we wzorze (III),

Hex oznacza heksozę (lub pentozę), n oznacza 0, 1 lub 2,

X oznacza resztę heksytolu (lub pentytolu), a

R ma to samo znaczenie co we wzorze (III).

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do kosmetycznie akceptowalnego nośnika wprowadza się oligosacharyd z 2-5 resztami glikozydowymi zawierający galaktozę w nieredukującej końcowej pozycji, albo pochodną takiego oligosacharydu, w ilości stanowiącej 0,5-6%, korzystnie 1-4% wagowo/objętościowych kompozycji.

* * *