[go: up one dir, main page]

PL168597B1 - Sposób wytwarzania zmodyfikowanego duzego powierzchniowego bialka wirusa Hepatitis B PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania zmodyfikowanego duzego powierzchniowego bialka wirusa Hepatitis B PL PL

Info

Publication number
PL168597B1
PL168597B1 PL90286209A PL28620990A PL168597B1 PL 168597 B1 PL168597 B1 PL 168597B1 PL 90286209 A PL90286209 A PL 90286209A PL 28620990 A PL28620990 A PL 28620990A PL 168597 B1 PL168597 B1 PL 168597B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
pres
plasmid
expression
gene
Prior art date
Application number
PL90286209A
Other languages
English (en)
Other versions
PL286209A1 (en
Inventor
Martin Comberbach
Nigel Harford
Teresa Cabezon
Apolonia Rutgers
Pierre Voet
Eric Jacobs
Cornelis P Hollenberg
Zbigniew A Janowicz
Armin J Merckelbach
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL286209A1 publication Critical patent/PL286209A1/xx
Publication of PL168597B1 publication Critical patent/PL168597B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego duzego powierzchniowego bialka wirusa H epa- titis B, zawierajacego fragm enty aminokwasowej sekwencji bialka L (podtyp ad lub ay) i obejm ujacego reszty 12-52 lub reszte 12 z nastepujacymi po niej resztami 14-52, nastepujace po resztach 12-52 i 14-52 reszty 133-145, a po nich reszty 175-400 bialka L, znamienny tym, ze w odpowiednim podlozu hoduje sie kom órki gospodarza stransform ow ane zrekom binow anym wektorem zawierajacym zrekom binow ana czasteczke DN A obejm ujaca sekwencje D N A kodu- jaca ekspresje zm odyfikowanego bialka L okreslonego powyzej, polaczona funkcjonalnie z sekwencja regulacyjna i wydziela sie wytworzone bialko z lizatu kom órkow ego lub z ekstraktu hodowli. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zmodyfikowanego dużego powierzchniowego białka Hepatitis B.
Zapalenie wątroby (Hepatitis) jest rozpowszechnioną poważną chorobą zakaźną, którą mogą powodować różne czynniki. Jeden z istotnych czynników zidentyfikowano jako wirus Hepatitis B (HBV), mały wirion o średnicy około 43 nm zawierający szczególny genom złożony z 3200 par zasad dwuniciowego kolistego DNA z jednoniciową wstawką o długości około 200 par zasad. Zakażenie tym wirionem powoduje ciężką, czasami nawet śmiertelną chorobę. 58% zainfekowanych osób odzyskuje zdrowie po około 3 miesiącach choroby, około 1% cierpi na ostrą nekrozę tkanki wątrobowej, powodującą po krótkim czasie śmierć, a u około 10% obserwuje się nawroty choroby. U około 4% zainfekowanych osób rozwija się chroniczny stan nosicielstwa ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia pierwotnego raka wątroby lub marskości wątroby.
Zakażenie następuje przeważnie na drodze okołoporodowego lub pozajelitowego przeniesienia zakaźnego wirionu, np. w czasie transfuzji krwi, przez użycie zakażonych strzykawek lub igieł, albo też poprzez kontakt seksualny. Istnieje więc pilna potrzeba posiadania wiarygodnych środków diagnostycznych do wykrywania HBV oraz dostępnej po niskich cenach szczepionki, chroniącej ludzi o wysokim stopniu ryzyka takich jak małżonkowie chronicznych nosicieli, osoby podróżujące do obszarów o wysokim endemicznym występowaniu HBV, noworodki chronicznych
168 597 3 nosicieli, homoseksualiści, prostytutki i narkomani. Ponadto, w krajach trzeciego świata istnieje zapotrzebowanie na tanią szczepionkę dla programów szczepień masowych.
Poza cząstkami wirusowymi składającymi się z białek rdzeniowych (HBcAg) i białek kapsydu czyli antygenów powierzchniowych we krwi zainfekowanych osobników mogą występować znaczne ilości cząstek HBsAg zawierających białko antygenu powierzchniowego i lipidy gospodarza. Takie cząstki wydzielono z ludzkiej surowicy i zastosowano do wytwarzania szczepionek, które jak wykazano chronią przed infekcją HBV (Szmuness i in., 1980).
W opisie powołuje się na pewne publikacje podając w nawiasach nazwisko pierwszego autor i rok publikacji. Pełne zestawienie pozycji literaturowych w porządku alfabetycznym zamieszczono na końcu opisu.
Jednakże wytwarzanie szczepionek z HBsAg pochodzących z surowicy jest utrudnione ograniczną dostawą zakażonej krwi oraz koniecznością poddawania ich długim i rygorystycznym testom w celu zapewnienia usunięcia i/lub inaktywacji potencjalnych czynników zakaźnych.
Z infekcją wirusem Hepatitis B (HBV) u ludzi wiąże się występowanie w surowicy różnych struktur zawierających antygen powierzchniowy (HBsAg) Hepatitis B (Tiollais i wsp., Nature, 1985,17,489). Oprócz zakaźnych wirionów występują także nitkowate i sferyczne cząstki o średnicy 22 nm (zawierające około 100 białek otoczki), utworzone przez asocjację lipidów gospodarza z trzema białkami powierzchniowymi Hepatitis: głównym (S), średnim (M) i dużym (L). Białka te mają wspólną tę samą sekwencję 226 kodonów aminokwasów w genomie HBV, znaną jako sekwencja kodująca białko S. Całkowita sekwencja kodująca aminokwasy, która bezpośrednio poprzedza sekwencję kodującą białko S, określana jest w niniejszym opisie jako sekwencja kodująca preS. Ta kodująca sekwencja preS koduje sekwencję 55 aminokwasów, które bezpośrednio poprzedzają białko S, zwaną regionem preS2 i, zależnie od podtypu wirusa, sekwencję 108 lub 119 aminokwasów poprzedzającą bezpośrednio region preS2, zwaną regionem preS 1. A więc całkowita sekwencja kodująca preS koduje 163 (55preS2+ 108 preS1) aminokwasy wpodtypachay i 174(55 preS2 + 119 preS1) aminokwasy w większości podtypów ad. Porównanie sekwencji kodujących preS w genomach wirusów podtypu ad i ay wykazało, że pierwszych 11 kodonów regionu preS1 podtypu ad nie występuje w podtypach ay. Zgodnie z powszechnie przyjętą nomenklaturą, w zgłoszeniu tym przyjmuje się numerację kodonów i aminokwasów obowiązującą dla podtypów ad; tzn., że genomy HBV podtypów ad kodują region preS złożony ze 174 aminokwasów, ponumerowanych od 1 do 174, podczas gdy 163 aminokwasy regionu preS w podtypach ay są ponumerowane od 12 do 174.
Główne białko(S) kodowane jest przez 226 kodonów genu S i istnieje w formie glikozylowanej i nieglikozylowanej.
Białko średnie (M) zawiera region preS2 i białko S (białko M = 55 + 226 aminokwasów). Białko M jest glikoproteiną występującą w dwóch formach zależnie od stopnia glikozylacji (Stibbe i wsp., J. Virol., 1983,46,626-628). 55 aminokwasów kodowanych przez region preS2 ma własności hydrofilowe i zawiera epitop immunodominujący umiejscowiony na powierzchni otoczki (reszty amino kwasowe 132-137). Epitop ten jest niezależny od wiązania dwusiarczkowego oraz, jak stwierdzono, jest bardziej immunogenny niż epitopy białka S (Neurath i wsp., Science, 1984, 224, 392-394; Neurath i wsp. Nature, 1985,315,154-156). Sekwencja preS2 zawiera również receptor dla spolimeryzowanej albuminy ludzkiej (pHSA) (Machida i wsp., Gastroent., 1984,86,910-918). Ten receptor może również wiązać monomeryczną HSA i może pośredniczyć w wiązaniu HBV do hepatocytów, u których również występuje receptor dla pHSA. Sugeruje się, że wiązanie takie u ludzi może prowadzić do tolerancji albo reakcji autoimmunizacyjnych.
Duże białko (L) obejmuje region preS 1, region preS2 i sekwencję białka S (białko L = 108 (lub 119) + 55 + 226 aminokwasów). Występuje w formie glikozylowanej i nieglikolizowanej (patrz Heermann i wsp., J. Virol., 1984,52,396). Białko L ma długość zmienną, zależnie od podtypu, np. 389 lub 400 aminokwasów, odpowiednio dla podtypów ay i ad. Produkt translacji preS1 bierze również udział w wiązaniu HBV do hepatocytów:
Ponieważ promotor dla specyficznych transkryptów S i M mieści się wewnątrz otwartej ramki odczytu białka L, to transformacja komórek ssaków przy użyciu DNA kodującego całkowitą otwartą ramkę odczytu dla białka L może powodować syntezę wszystkich trzech białek powierzch4
168 597 niowych. W komórkach ssaków cząstki HBsAg są wydzielane na zewnątrz (Tiollais i wsp., jak wyżej). W organizmach ssaków ekspresja białka S powoduje zahamowanie wydzielania cząstek HBsAg (patrz np. Ou i wsp., J. Virol., 1987, 61, 782). Sugeruje się, że zjawisko to związane jest z obecnością grupy N-mirystalowej w białku L, powodującej zakłócenia w procesie zarodkowania lub wydzielania (Persing i wsp. Science, 1986, 234, 1388-1391; Persing i wsp. J. Virol., 1987, 61, 1672-1677).
Dla ułatwienia powoływania się na określone sekwencje poniższa tabela 1 przedstawia kodujące sekwencje DNA oraz sekwencje aminokwasowe dla reginów preS1, preS2 i białek HBV omawianych w niniejszym zgłoszeniu. Numery aminokwasów są umieszczone w nawiasach, powyżej kodonów i liczone są poczynając od pierwszego kodonu ATG obecnego w otwartej ramce odczytu dla białek otoczki wykrytej w sekwencji wirusa HBV adw, która została sklonowana w plazmidzie pRIT 10616. Ponieważ pierwszych 14 kodonów jest sekwencji ad nie występuje w żadnej z kaset ekspresji opisanych w niniejszym zgłoszeniu, a więc sekwencje te zostały w tabeli 1 pominięte. Plazmid pRIT 10616 w E. coli szczep 600 jest zdeponowany w American Type Culture Collection, Rockville, Marylan, USA, pod nr. ATCC39 131.
TABELA A
REGION PRE-S1
NcoI (12)
ATG GGG ACG .AAT CTT TCT TTT CCT GAVC CCT CrG GAT TCT TGT
Met Gly Thr Asn Leu Ser aal Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe
(26)
CCC GAT CAT CAG TTG GAC CTT CAA TTG GGA GCC AAT CAT ACC
Pro Asp His Gin Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn
(40)
AAT CCA GAT TGG GAC TTC ACT CCT AAT AAG GAC ACT GGT CAA
Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro
(54)
GCA GCC AAC GAG GTA GGA GGT GAT GCC TTC GGG CAT GGT TCC
Ala Ala Asn Gl n Val Gly Val Gly AAl Phe Gly Pro Gly Leu
(68)
ACC CCT CCCC GAC GGC GGT GGT GGT GGG TGG AGC CTT CGG GGT
Thr Pro Pro His GGy Gly Ile Leu GGl Trp Ser Pro Gln Ala
(82)
CAG GGC ATA TTG ACC ACA TGT TCT AAC ATT CCT CCT CCT GCC
Gin Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser TGh Ile Pro Pro Pro Ala
168 597 (96)
TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT
Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser
(110) (119)
CCA CCT CTA AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gin Ala
REGION PRE-S2
(120)
ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA GCT CTG CAG GAT
Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin Ala Leu Gin Asp
(134)
CCC AGA GTC AGG GGT CTG TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT
Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser
(148)
TCA GGA ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT CAC ATA
Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile
(162) (174)
TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG GAC CCT GTG ACG AAC
Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro val Thr Asn
BIAŁKO S
(175)
ATG GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTG CTC GTG
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val
TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC ACA ATA
Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTA
Pro Gin Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu
GGG GGA TCA CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC CCA
Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gin Asn Ser Gin Ser Pro
168 597
ACC TCC AAT CCA CCC CCA ACC TCA TCG CCC CCC ATT TGT CCT
Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro lle Cys Pro
GGT TAC CCC TTG CAC AGT CCT CCG CAG ccc TAC ATA TTC CTC
Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu
CCC ATC CTT TCC CCC CGG CCT AAT TTC TTC CTT CGT CACT CTG
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu
GAT TAT CAA CGT CAC TTG CCC GGT TCG TCC CCC ATT CCCA GGA
Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
CCA ACA AAA AAA ACG CGA CCC TCG CAA AAC ccg: ACG ACT
Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr
CCC GCT CAA CGG CAA TCT ATG ttt CCC TTC TCG TGC TGT ACTA
Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
AAA CCC AAA AGA CGG CAAT TGC AAC TTG AAT ccc: ATC CCCA TCG
Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser
TCC TGG GGA CTT CGC CATT TAC CAA TTG TGA TTG GCC TCCA GTC
Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val
CGT TTC TTA TTG CCT AGT TTA CCC GTG CCC TTT GTT CAG TC^CS
Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp
TTC GTA GGG CTPT TCC CCC ACT GTT TGG CCT TCCA CGAT ATA TGG
Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp
ATG ATG TCG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC A(GA ATC GTG AGT
Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser
CCC TTT AAC CCG CTG TTA CCCA ATT TTC ttt TGT CTC TGG GTA
Pro Phe lle Pro Leu Leu Pro lle Phe Phe Cys Leu Trp Val
(400)
TAC ATT TCA Tyr Ile Stop
168 597
Wirusowe sygnały transkrypcji umiejscowione po stronie 5' od kodonów inicjacji translacji kontrolują ekspresję in vivo każdego z białek: preS 1. preS2 i S. Przy translacji w komórkach ssaków białka te mogą być glikozylowane dając w rezultacie zestaw antygenów powierzchniowych przedstawionych w poniższej tabeli:
Białko Długość (ilość aminokwasów) Oznaczenia Glikozylacja sekwencji białka S Glikozylacja specyficznych domen preS2
P24 226 białko S _ _
GP27 226 białko S + _
GP33 281 białko preS2 — +
GP36 281 białko preS2 + +
P39* 389 białko preS1 — —
GP42* 389 białko preS1 + —
*'Podtyp ayw; białka preS1 pochodzące z podtypu adw są około 1,0-1,5kD większe, co zgodne jest z obecnością dodatkowych 11 aminokwasów przy końcu N (Hermann i wsp. 1984).
Od czasu poznania sekwencji DNA kodujących region antygenu powierzchniowego poczyniono szereg prób wyprodukowania białka S w oparciu o technikę rekombinacji DNA. Burell i wsp. (1974) oraz Murray i wsp. (1980), jak również szereg innych badaczy donosili o ekspresji HBsAg w
E. coli, Valenzuela i wsp. (1982) donosił o ekspresji HBsAg w drożdżach. Po rozbiciu komórek drożdży transformowanych przy pomocy wektora zawierającego sekwencje kodujące białko S pod kontrolą promotora drożdżowej dehydrogenazy alkoholo wej I, można było obserwować sferyczne cząstki zawierające HBsAg podobne do cząstek znajdowanych w surowicach osobników zainfekowanych HBF. W Europejskim Zgłoszeniu Patentowym 0226846 (Tschopp i wsp.) ujawnione jest wytwarzanie białka S wirusa HBV w drożdżach Pichia. Synteza białka jest pod kontrolą regionu regulatorowego reagującego na metanol.
Jednakże, chociaż szczepionki zawierające wyłącznie cząstki antygenu S mają zwykle silnie ochronne właściwości (Szmuness i wsp. 1980), to niektórzy biorcy źle znoszą takie parametry. W celu przezwyciężenia takiego nie dającego się przewidzieć niepowodzenia szczepienia zostały opracowane systemy ekspresji białek preS2 i preS1. Wiadomo jest, że preS2 jest nawet bardziej immunogenne niż białko S. Na przykład, przy immunizacji myszy subviralnymi cząstkami niosącymi specyficzne epitopy preS2 i S, reakcja przeciwciała na obecność preS2 przewyższa reakcję anty-S (Milich i wsp. 1985). Co więcej, zaobserwowano, że immunizacja cząstkami zawierającymi preS2 może indukować również reakcję anty-S. Ostatnio dokonano przeglądu literatury dotyczącej roli białek preS1 i preS2 w immunizacji oraz specyficzności rozpoznawania przez komórki T i B białek antygenu powierzchniowego HBV (Milich, 1988 i odnośniki tamże). Valenzuela i wsp. (1985) opisali ekspresję całkowitej sekwencji kodującej białko preS2 w drożdżach transformowanych plazmidem zawierającym odpowiednie sekwencje wirusowe. Należy zaznaczyć, że przy transkrypcji u drożdży inicjacja musi odbywać się pod kontrolą promotorów drożdżowych poprzedzających odpowiedni region kodujący, gdyż wirusowe sygnały inicjacji transkrypcji wewnątrz ramki odczytu HBV-ORF nie są rozpoznawane przez system transkrypcyjny drożdży.
Itoh i wsp. (1986) i innie badacze również wykrywali ekspresję białka preS2 u drożdży i jego agregację w cząstki. Dehoux i wsp. (1986) wykryli ekspresję białka preS1 o masie 39 kD u drożdży i stwierdzili, że jest ono zagregowane w formie cząstek. Imamura i wsp. (1987) w swoim doniesieniu opisują ekspresję zarówno białka preS2 jak i preS1 w S. cerevisiae. Autorzy ci stwierdzają, że to wielkie białko znajduje się w formie względnie stabilnego nieglikozylowego produktu o masie cząsteczkowej 42 kD, który niezbyt łatwo ulega agregacji w formę cząstek.
Glikozylacja białek powierzchniowych produkowanych w drożdżach S. cerevisiae różni się od glikozylacji obserwowanej w naturalnie występujących cząstkach izolowanych z osobników zarażonych HBV. Białko S nie jest glikozylowane podczas gdy białka preS2 i preS1 są wytwarzane w formach N-glikozylowanej i nieglikozylowanej. Zidentyfikowano też N-sprzężone łańcuchy o wysokiej zawartości mannozy jak i O-sprzężony łańcuch(y) oligosacharydowy (Itoch i wsp. 1986, Langley i wsp. 1988).
168 597
Przeprowadzono również ekspresję powierzchniowego antygenu HBV w komórkach ssaków. Michel i wsp. (1984) wykazali syntezę HBsAg w komórkach jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) transformowanych plazmidem zawierającym sekwencję kodującą białko preS2. Persing i wsp. (1985) stwierdzili ekspresję trzech HBsAg-pokrewnych polipeptydów o masie cząsteczkowej 24000, 27000 i 35000 daltonów w komórkach myszy transformowanych przy użyciu sekwencji kodującej białko preS2. Te trzy otrzymywane polipeptydy mogą być uorganizowane w złożone immunoaktywne cząstki HBsAg o średnicy około 22 mm.
McLachlan i wsp. (WO. 8806185) donieśli o ekspresji różnych białek pokrewnych białkom HBV w komórkach kręgowców. Jednakże ekspresja antygenu preS w komórkach ssaków jest zwykle utrudniona z powodu względnej nadprodukcji białka preS1 w stosunku do białka S, gdyż wówczas wydzielanie cząstek HBsAg zostaje zahamowane (Ou i wsp. 1987). Ponadto stosunek różnych białek S-pokrewnych nie daje się kontrolować. Wreszcie, hodowla komórkowa linii komórek zwierzęcych jest metodą kosztowną, co w rezultacie powoduje wysoką cenę otrzymywanego produktu.
Mimo iż opisywane i stosowane szczepionki wykazują wysoką skuteczność, pewien procent osób otrzymujących takie szczepionki, zwłaszcza osób immunologicznie uzależnionych, np. pacjentów poddawanych hemodializie, nie reaguje na nie lub reaguje powoli [patrz np. Hadler i inni, New Engl. J. Med., 315; 209-215 (1986); Bruguera i inni, Post Grad. Med. J., 63: 155-158 (1987)].
W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na sposoby i kompozycje przydatne do wytwarzania dodatkowych skutecznych szczepionek przeciw HBV.
Poniższe terminy występujące w niniejszym zgłoszeniu definiuje się następująco:
„Kaseta ekspresji oznacza jakikolwiek odrębny region DNA, który funkcjonuje w komórce gospodarza jako kompletna jednostka ekspresji genu.
„Kompletna jednostka ekspresji genu jest to gen strukturalny, z promotorem i regionami regulacyjnymi wymaganymi dla jego transkrypcji i translacji.
„Funkcjonalny kodujący region DNA oznacza kodującą sekwencję DNA, która, po włączeniu w fazie do sekwencji kodującej białko S, nie przeszkadza w tworzeniu się mieszanych cząstek HBsAg.
„Pochodna funkcjonalna oznacza sekwencję kodującą zawierającą takie zmiany kodonów aminokwasowych, które nie przeszkadzają w formowaniu się cząstek i które pozwalają na zachowanie niezmienionej immunogenności oraz innych funkcji. Takie funkcjonalne pochodne można otrzymać konwencjonalną metodą mutagenezy sterowanej lub przy pomocy innych standardowych technik.
„Wektor definiuje się jako DNA, które może przenosić i utrzymywać fragment DNA stanowiący przedmiot niniejszego wynalazku, łącznie np. z fagami i plazmidami.
Sposobem według wynalazku wytwarza się nowe zmodyfikowane cząstki dużego białka powierzchniowego Hepatitis B, które mogą być użyte same albo z innymi komponentami HBsAg lub HbS do wytwarzania szczepionek przeciwko zakażeniom HBV. Zmodyfikowane białko wytwarzane sposobem według wynalazku zawiera fragmenty aminokwasowej sekwencji białka L (podtyp ad lub ay) i obejmuje reszty 12-52 lub resztę 12 z następującymi po niej resztami 14-52, następujące po resztach 12-52 i 14-52 reszty 133-145, a po nich reszty 175-400 białka L.
Sposób według wynalazku polega na tym, że w odpowiednim podłożu hoduje się komórki gospodarza stransformowane zrekombinowanym wektorem zawierającym zrekombinowaną cząsteczkę DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą ekspresję zmodyfikowanego białka L określonego powyżej, połączoną funkcjonalnie z sekwencją regulacyjną i wydziela się wytworzone białko z lizatu komórkowego lub z ekstraktu hodowli.
Zmodyfikowane białko można wytwarzać przez ekspresję w drożdżach metylotroficznych oraz w innych drożdżowych układach ekspresji, które wytwarzają białka w postaci cząstek zachowujących podstawowe miejsca antygenowe zakodowane przez trzy domeny, preS1, preS2 i S.
Komórki gospodarza wybiera się z grupy obejmującej Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Candida, Kluyveromyces i Schizosaccharomyces, a korzystniej stosuje się komórkę drożdży S. cerevisiae lub Hansenula polymorpha.
168 597 9
Korzystnie hoduje się komórki gospodarza stransformowane zrekombinowanym wektorem wybranym z grupy obejmującej pRIT12979, pRIT13192 i pRIT13193.
Zmodyfikowane białko L ma sekwencję białka L, w której brak jest tych miejsc wybiórczo atakowanych przez proteazy. Eliminacja tych miejsc zapewnia uzyskanie cząsteczek o mniejszej wrażliwości na proteazę, które po ekspresji dają się łatwo oczyścić w formie cząstek.
Białko wytwarzane sposobem według wynalazku charakteryzuje się także tym, że nie zawiera aminokwasu niezbędnego przy mirystylowaniu białka oraz tym, że nie zawiera kilku potencjalnych miejsc glikozylacji. Eliminacja glikozylacji białka L poprawia dostępność epitopów, które ulegają ekranowaniu, odkształceniu lub modyfikacji podczas glikozylacji białka zachodzącej w czasie ekspresji w komórkach gospodarza. Zmodyfikowane, odglikozylowane białko L zawiera epitopy ochronne B i epitopy znaczące Th regionu preS1, preS2 i S, o prawidłowej konformacji, dobrze wyeksponowane na powierzchni uzyskanych cząstek.
Zmodyfikowane białko wytwarzane sposobem według wynalazku charakteryzuje się też delecją części regionu preS2 zawierającego miejsce wiązania albuminy surowicy ludzkiej (pHSA). Taka modyfikacja białka L eliminuje ewentualną tolerancję lub problemy autoimmunologiczne związane z obecnością recepotora pHSA, bez utraty podstawowych epitopów B w regionie preS2.
Reasumując zmodyfikowane białko L charakteryzuje się tym, że jest nieglikozylowane, wykazuje zmniejszoną wrażliwość na proteazę i obniżoną zdolność wiązania pHSA.
Sposobem według wynalazku wytwarza się również zmodyfikowane białko powierzchniowe, które oprócz określonych powyżej sekwencji aminokwasów stanowiących fragmenty białka L zawiera także sekwencję aminokwasów białka S. W przypadku wytwarzania takich białek prowadzi się hodowlę komórki gospodarza, która została dodatkowo stransformowana zrekombinowanym wektorem DNA zdolnym do ekspresji białka S oraz wydziela się z lizatu komórkowego lub ekstraktu hodowli cząstki białka o mieszanym składzie podjednostkowym.
Zmodyfikowane białko można wydzielić w postaci cząstek o mieszanym lub jednorodnym składzie podjednostkowym, zależnie od tego czy wystąpiła współekspresja zmodyfikowanego białka L wraz z białkiem S.
Sposób wytwarzania zmodyfikowanych białek L według wynalazku można prowadzić w innych układach ekspresji obejmujących bakteryjne układy ekspresji, układy ekspresji typu komórek owadów, np. układy bakulowirusowe, układy ekspresji typu komórek ssaków, układy wirusa ospy oraz roślinne układy ekspresji.
Zmodyfikowane białko L według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje delecję, insercję lub modyfikację szeregu aminokwasowych sekwencji w regionie preS. Zrozumiałe jest, że z cząsteczki L, która ma być zmodyfikowana i wytworzona na drodze ekspresji, dokonano już delecji pierwszych 11 aminokwasów, tak że zawiera ono 163 aminokwasy w regionie preS1 (patrz równocześnie wniesione zgłoszenie patentowe w Stanach Zjednoczonych Ameryki, nr 009 325). Osiągnięte w ten sposób zmniejszenie wielkości regionu preS ułatwia tworzenie się cząstek w komórce -gospodarzu i poprawia różne właściwości biofizyczne cząsteczki, dzięki czemu zmodyfikowana cząstka L szczególnie nadaje się do wytwarzania i stosowania szczepionek. Tak np. skrócenie regionów preS, zgodnie z wynalazkiem, może zapewnić dostęp epitopów S i preS na powierzchni cząstki ułatwiający oddziaływanie z układem odpornościowym, zwiększając tym samym jej immunogenność.
Zgodnie z jednym z rozwiązań wynalazek dostarcza zmodyfikowanego białka L z delecją reszty aminokwasu Gly 13 w regionie preS 1. Białko L wytworzone w wyniku ekspresji w drożdżach zawiera grupę mirystyrylową połączoną kowalencyjnie wiązaniem amidowym, jak to ujawniono w równocześnie wniesionym zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjednoczonych Ameryki, nr 07/009 325. Obecność N-końcowej reszty Gly stanowi warunek konieczny mirystylowania białka [Towler i Gordon, Ann. Rev. Biochem., 57:69-99(1983)]. Z tego względu jedno z odpowiednio zmodyfikowanych białek L według wynalazku jest kodowane przez DNA, w którym dokonano delecji kodonu Gly13 (GGG) w sekwencji nukleotydowej kodującej białko L. W wyniku tej delecji następuje synteza niemirystylowanego białka L.
W użytym znaczeniu symbol Δ oznacza .delecję. Tak np. Δ Glyl3 zmodyfikowane L oznacza zmodyfikowane białko L nie zawierające reszty aminokwasu 13 (glicyny).
168 597
W innej wersji niniejszego wynalazku wytwarza się zmodyfikowane białko L z delecją w jednym lub więcej jego potencjalnych miejsc glikozylacji. Białko L powstające w wyniku ekspresji w drożdżach posiada N-sprzężony łańcuch oligosacharydowy przy Asn123 oraz kilka O-sprzężonych łańcuchów mannozowych związanych z resztami aminokwasowymi Ser i Thr w preS1- i preS2 -regionach cząsteczki, jak opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 009 325 wymienionym wyżej (patrz również Rutgers i wsp. „Viral Hepatitis and Liver Disease“ Ed. A. J. Zuckerman, A. R. Liss, New York, 1988, pp 304-308). W celu usunięcia tego miejsca N-glikozylacji (które charakteryzuje się sekwencją Asn-X-(Ser lub Thr), gdzie X może stanowić dowolny aminokwas), zmieniona jest sekwencja aminokwasowa w pozycji 123-125. To miejsce N-glikozylacji może być usunięte poprzez delecję lub zamianę aminokwasów w pozycji 123 i 125, delecję aminokwasu 124 lub delecję całej sekwencji 123-125. W celu usunięcia miejsc O-glikozylacji, wszystkie albo niektóre z reszt aminokwasowych Ser i Thr w sekwencji L są wycięte lub podstawione innymi aminokwasami. Białko L powstające w wyniku ekspresji z przykładowego plazmidu pRIT13192 odznacza się całkowitym brakiem glikozylacji.
Inne zmodyfikowane według niniejszego wynalazku białko L zawiera delecję reszt aminokwasowych w sekwencji preS2 regionu preS2 warunkującego wiązanie spolimeryzowanej albuminy surowicy ludzkiej (pHSA) (patrz Machida i wsp., wyżej cytowani). Wiązanie pHSA do białek pozbawionych tej sekwencji jest znacznie zmniejszone.
Inne białko zmodyfikowane według niniejszego wynalazku cechuje się delecją lub zmianą miejsc wrażliwych na działanie protez. Wiązania peptydowe wrażliwe na działanie proteazy znajdują się w sekwencji preS za resztą aminokwasową Arg wokół pozycji 100 w regionie preS1 (Heermann i wsp. Intervirology, 1987,28,14-25) oraz za resztami aminokwasowymi Arg137, Gly149 i Arg167. Delecje lub inne modyfikacje wprowadzone do regionu kodującego białko L mające na celu usunięcie niektórych lub wszystkich kodonów dla tych aminokwasów, dają w rezultacie białko L mniej wrażliwe na działanie proteazy.
Wskazanym jest, aby delecje wprowadzane do regionu kodującego białko L w celu jego modyfikacji pozostawały nietknięte kodony dla aminokwasów 21-47 i 133-145. Przyjmuje się, że sekwencje te nadają zmodyfikowanemu białku zdolność indukowania specyficznych przeciwciał preS związanych z osłoną immunologiczną (patrz Itoh i wsp., powyżej).
Konstrukcja wzorcowego plazmidu pRIT 12979 ulegającego ekspresji w drożdżach i kodującego Gly13 białko L opisana jest poniżej w przykładzie XXII (F). Analiza ekspresji zmodyfikowanego białka L z plazmidu pRIT 12979 pod względem poziomu ekspresji, posttranslacyjnych modyfikacji i układania się białka w makrocząsteczki opisana jest poniżej w przykładzie XXIII (F).
Inne zmodyfikowane białko L zilustrowane jest na przykładzie plazmidu pRIT 13192 jak opisano w przykładzie XXIV (F). Pozbawione jest ono wszystkich trzech wyżej wymienionych właściwości, tzn. nie funkcjonuje jako substrat dla drożdżowych enzymów glikozylujących, nie posiada zdolności wiązania pHSA oraz nie jest wrażliwe na proteazy, a zostało zmodyfikowane przez pozbawienie kodonów dla aminokwasów 53-132 i 146-174 w regionie preS. Plazmid pRIT 13192 zawiera kodony aminokwasów 12-52 i 133-145 regionu preS. Analiza ekspresji białka L z plazmidu pRIT 13192 opisana jest w przykładzie XXV (F). Białko L powstające w wyniku ekspresji z pRIT 13192 wykazuje więc znacznie zmniejszoną zdolność wiązania pHSA, większą odporność na działanie proteaz i zmniejszoną glikozylację.
Jeszcze w innym przykładem modyfikacji białka L według niniejszego wynalazku jest kombinacja delecji wprowadzonych do sekwencji kodujących białko L w plazmidzie pRIT 12979 i w plazmidzie pRIT 13192. Powstałe w wyniku ekspresji takiej sekwencji białko L jest niemirystylowane, w mniejszym stopniu glikozylowane, mniej wrażliwe na działanie proteaz i o zmniejszonej zdolności wiązania pHSA. Konstrukcja ulegającego ekspresji w drożdżach plazmidu pRIT 13193 zawierającego insercję tak zmodyfikowanej sekwencji L jest również szczegółowo opisana w przykładzie XXIV.
Sekwencje kodujące zmodyfikowane białko L wraz z całkowitą kodującą sekwencją S można otrzymać do celów niniejszego wynalazku z sekwencji kodujących białko S i preS wg. tabeli A metodą konwencjonalnej mutagenezy sterowanej (patrz np. Botstein i wsp., Science, 1985, 229, 1193) lub metodami rekombinacji DNA (patrz np. T. Maniatis i wsp., Molecular Cloning, A
168 597
Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1982). Dla jasności, numeracja aminokwasów używana poniżej zgodna jest z numeracją podaną w tabeli A. Jednakże inne publikowane wersje sekwencji i preS mogą być przez specjalistę użyte w celu przygotowania zmodyfikowanych według niniejszego wynalazku białek S.
Na przykład, sekwencje białka S można wyizolować z DNA wyekstrahowanego z cząstek Dane z surowicy zainfekowanych osobników, poprzez wypełnienie jednoniciowego regionu DNA przy pomocy polimerazy DNA (najlepiej endogennej polimerazy) i następnie trawienie endonukleazą restrykcyjną. Wybór endonukleazy będzie częściowo zależeć od typu cząstek Dane. Na przykład sekwencję kodującą HBsAg w DNA pochodzącym z cząstek Dane serotypu adw można wyizolować w pojedynczym fragmencie BamHI; sekwencję kodującą HBsAg w DNA wirusa HBV pewnych cząstek Dane serotypu ayw można wyizolować we fragmencie Hhal. DNA wirusa HBV z cząstek Dane tego samego serotypu może również wykazywać odmienny wzór restrykcyjny.
Zmodyfikowane według niniejszego wynalazku sekwencje dla białka L można też skonstruować za pomocą wektorów pośredniczących. Techniki klonowania fragmentów DNA w fagach są opisane np. przez Charnay'a i wsp. (Nature, 198, 286, 893-895) i Tiollais (brytyjskie zgłoszenie patentowe nr 2 034 323).
Zmodyfikowana według tego wynalazku sekwencja dla białka L może być skonstruowana w zrekombinowanej cząsteczce DNA czyli wektorze. Zrekombinowany wektor stosowany w sposobie według wynalazku zawiera zmodyfikowaną sekwencję kodującą białko L (według tego wynalazku) połączoną z regionem regulacyjnym w jednostkę funkcjonalną. Taki wektor może też dodatkowo zawierać replikon, zależnie od wyboru i/lub organizmu gospodarza. Pod terminem „replikon rozumie się taki najmniejszy region DNA, którego funkcjonowanie umożliwia trwałe utrzymanie zrekombinowanego wektora w formie pozachromosomalnej w eukariotycznym lub prokariotycznym organizmie transformowanym tymże wektorem. Takie replikony są dobrze znane w dziedzinie inżynierii genetycznej. Terminem „region regulacyjny określa się daną sekwencję DNA zawierającą promotor i inne sekwencje konieczne do transkrypcji sekwencji kodujących, które regulują transkrypcję sekwencji kodujących genu strukturalnego. Takie regiony regulacyjne są również dobrze znane w tej dziedzinie.
Wektor taki można sporządzić przy zastosowaniu konwencjonalnych metod; np. przez insercję sekwencji kodującej zmodyfikowane według niniejszego wynalazku białko, do wektora już zawierającego replikon i sekwencje regulacyjne. Insercja powinna być przeprowadzona w taki sposób aby ta sekwencja kodująca była połączona z regionem regulacyjnym w jednostkę funkcjonalną. Taka cząsteczka DNA czyli kaseta ekspresji zawierająca sekwencję kodującą zmodyfikowane białko L, może być skonstruowana przy zastosowaniu konwencjonalnych metod, np. przez ligację kodującej sekwencji L z sekwencją regulacyjną.
Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi w celu otrzymania fragmentów DNA stosowanych w niniejszym wynalazku, ligację takich fragmentów w celu otrzymania cząstek zrekombinowanego DNA używanych w niniejszym wynalazku oraz ich wprowadzanie do mikroorganizmów przeprowadza się przy użyciu znanych metod opisanych w uprzednio i dalej cytowanych pracach. Warunki są dobrane tak aby uniknąć denaturacji DNA i enzymów. Enzymy restrykcyjne i ligazy używane w pracach nad tym wynalazkiem są dostępne w handlu i powinny być stosowane zgodnie z instrukcjami załączonymi przez producentów; preferowane jest używanie ligazy polinukleotydowej T 4.
Różne fragmenty i konstrukcje finalne stosowane w celu ekspresji zmodyfikowanych białek L oraz części składowe wektorów przenoszących te kodujące sekwencje w celu ich ekspresji w komórkach gospodarza zgodnie z metodą niniejszego wynalazku, mogą być stosowane łącznie z konwencjonalnymi metodami znanymi specjalistom. W wielu przypadkach geny zostały już wyizolowane i zmapowane przy użyciu enzymów restrykcyjnych, jak również zsekwencjonowane. W znanym zakresie można więc wyciąć daną sekwencję enzymem restrykcyjnym, jak np. sekwencję kodującą białko otoczki HBV oraz, stosując w miarę potrzeby dalsze manipulacje takie jak ponowne nacinanie enzymem Bal31, mutagenezę in vitro, wypełnianie lepkich końców itp., otrzymać fragment o pożądanej długości, zawierający pożądaną sekwencję i mający odpowiednie zakończenia. Łączniki i adaptory mogą być używane w celu połączenia sekwencji oraz w celu
168 597 przyłączenia ponownego sekwencji utraconych w wyniku użycia miejsca restrykcyjnego położonego po stronie wewnętrznej od regionu utraconego. Różne fragmenty DNA, które zostały wyodrębnione, można oczyścić metodą elektroforezy, wymyć z żelu metodą elektroelucji, przyłączyć do innych sekwencji, sklonować, ponownie wyizolować i poddawać dalszej obróbce.
Użycie regionów regulacyjnych dla kontroli transkrypcji zmodyfikowanego genu L pozwala na wzrost komórek gospodarza do wysokich gęstości przy niskim lub zerowym poziomie transkrypcji tego genu strukturalnego i następnie, indukcję jego ekspresji przez zmianę warunków hodowli takich jak: pożywka, temperatura i temu podobne.
Transformacja komórek-biorców przy użyciu wektora przenoszącego sekwencję kodującą białko L i ekspresja tego wektora w wybranej komórce-biorcy przeprowadzana jest przy użyciu konwencjonalnych technik. Komórka ta jest następnie hodowana na odpowiednich pożywkach tzn. na pożywkach umożliwiających tym komórkom przeżycie i wytwarzanie zmodyfikowanego białka L w ilościach umożliwiających jego pozyskanie. Na przykład, jeśli jako komórkę-biorcę wybrano drożdże to właściwą do tego celu jest pożywka minimalna Yeast Nitrogen Base. Odpowiednie pożywki mogą być dobierane przez specjalistów zależnie od rodzaju gospodarza używanego w danej metodzie.
Zmodyfikowane cząsteczki białka L w sposobie według mniejszego wynalazku można wyizolować z lizatu komórkowego lub z pożywki hodowlanej, zależnie od zdolności danych komórek do wydzielania zmodyfikowanego białka. Odzyskiwanie białka wytwarzonego według niniejszego wynalazku przeprowadza się przy pomocy konwencjonalnych metod oczyszczania białek.
Do wytworzenia zmodyfikowanych białek L według tego wynalazku specjalista może wybrać jako biorców odpowiednie komórki lub linie komórkowe. Właściwymi komórkami lub liniami komórkowymi mogą być komórki drożdży. Wiele szczepów drożdży znanych specjalistom jest dostępnych w charakterze komórek - biorców do ekspresji zmodyfikowanych białek L według niniejszego wynalazku. W praktyce, według tego wynalazku, może być użyty każdy gatunek drożdży. W przykładach opisanych poniżej używane są Saccharomyces, a dokładniej - Saccharomyces cerevisiae. Szereg szczepów S. cerevisiae jest dostępnych z publicznych depozytów i laboratoriów, np. American Type Culture Collection, Rockville, Nd.
Zgodnie z innym rozwiązaniem stosować można Hansenula polymorpha. Tym niemniej inne gatunki drożdży mogą być również używane włączając w to, bez ograniczeń: Hansenula, Pichia, Candida, Kluyveromyces i Schizosaccharomyces. Ponadto inne rodzaje eukariotycznych komórek gospodarzy np. komórki ssaków takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki 3T3 mogą być stosowane jako komórki-biorcy w celu ekspresji białek L tu opisanych. Wybór odpowiednich komórek-gospodarzy ssaków oraz metod transformacji, hodowli, amplifikacji, testów eliminacyjnych oraz otrzymywania i oczyszczania produktu, są znane specjalistom z tej dziedziny. Patrz np. Gething i Sambrook, Nature, 1981, 293, 629-625 lub alternatywnie, Kaufman i wsp. Mol. Cell. Biol. 1985, 5(7), 1750-1759, lub Fowley i wsp., Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 419 446. Inne odpowiednie linie komórkowe ssaków to: linia komórkowa COS-1 z małpy i linia komórkowa CV-1.
Oczywistym jest, że niektóre z opisanych wyżej delecji wprowadzone do sekwencji kodującej białko L zmieniły wewnętrzne sekwencje biorące udział w transkrypcji i translacji mRNA specyficznych dla białek M i S w komórkach ssaków. Taka zmodyfikowana sekwencja kodująca białko L pozwala więc na niezależną ekspresję białka S i zmodyfikowanego białka L w komórce ssaka mieszczącej w sobie ich oddzielne kasety ekspresji.
Do celów niniejszego wynalazku jako komórki-biorcy nadają się także komórki bakteryjne. Na przykład, różne szczepy E. coli (np. HB101, MC1061 oraz szczepy użyte w niżej podanych przykładach) są dobrze znane jako komórki-gospodarze w dziedzienie biotechnologii. Różne szczepy B. subtilis, Pseudomonas itp. mogą być również używane w tej metodzie.
Ponadto, w miarę potrzeby, w metodzie według niniejszego wynalazku jako komórki biorcy mogą być również używane komórki owadzie. Patrz np. Miller i wsp. Genetic Engineering, (Plenum Press), 1986, 8, 277-298 i cytowane tam odnośniki.
Niektóre wirusy, takie jak baculowirusy lub wirusy vaccinia mogą także być używane do ekspresji białek L według tego wynalazku. Wybór właściwego gospodarza, odpowiednich warunków hodowli, pożywki oraz składników wektora przydatnego do ekspresji w wybranych komórkach gospodarza leżą w ramach możliwości specjalisty w dziedzinie biotechnologii.
168 597
W systemach ekspresji opisanych powyżej oraz w poniższych przykładach, może być użyty dowolny znany promotor zdolny do kontroli ekspresji sekwencji kodujących białko w wybranej komórce-gospodarzu. Jeśli wybranym biorcą są komórki drożdży, to promotory przydatne do ekspresji zmodyfikowanego białka L mogą obejmować silny promotor TDH3 lub inne konstytutywne lub regulowane promotory pozwalające na modulację poziomu białka L, zależnie od składu pożywki. Ponadto np. promotory PGK, ARG3 i APH1 są przykładowymi promotorami przydatnymi w wektorach zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
Wynalazek ten pozwala też na ekspresję zmodyfikowanych według niniejszego wynalazku białek L jako składnika cząstek HBsAg o mieszanym składzie polipeptydowym, jak to szczegółowo opisano w równoczesnym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07 368 401.
Metoda polega na koekspresji, w komórkach drożdży, pierwszego białka S i drugiego białka X-S, gdzie Sjest faktycznie głównym białkiem powierzchniowym HBV, a X - dla celów niniejszego wynalazku, stanowi zmodyfikowaną sekwencję preS zakodowaną w funkcjonalnym kodującym regionie DNA fuzjowanym w fazie z sekwencją kodującą S.
Przy odwoływaniu się do zgłoszenia patentowego w Stanach Zjedn. Amer. nr 07/368 401 należy wziąć pod uwagę, że zasadniczo takie same informacje można znaleźć w pracy Jacobsa i innych, Gene 80:279-291 (1989).
Według tej metody sekwencja kodująca białko S ulega koekspresji wraz ze zmodyfikowaną sekwencją aminokwasową białka L. Regiony kodujące to białko L, jak również i sekwencje dla białka S, można skonstruować jak opisano wyżej, przy użyciu konwencjonalnych metod syntezy chemicznej lub rekombinacji DNA. Zmodyfikowane białko L tworzy razem z białkami S cząstki o mieszanym składzie podjednostkowym.
W konstrukcji białek X-S zawierających zmodyfikowane według niniejszego wynalazku białko L lepiej jeśli S stanowi całkowite dojrzałe białko powierzchniowe HBV (około 226 aminokwasów, patrz tabela A). Alternatywnie, białko S może być kodowane przez sekwencje kodujące białko S pochodzące z genomu HBV, gdzie S jest faktycznie takie samo jak autentyczne białko S z HBsAg. Obcięte białka S mogą być również użyte w konstrukcji cząstek mieszany zawierających zmodyfikowane białko L, o ile nie zaburzy to procesu układania się białek w cząstki.
Sekwencje kodującą białko S umieszcza się w pierwszej kasecie ekspresji przy zastosowaniu konwencjonalnych technik, tak aby pozwalała na ekspresję białka S w gospodarzu-drożdżach. Kodującą sekwencję białka S albo istotną jej część stosuje się w fuzji z częściami sekwencji kodującej preS i umieszcza w drugiej kasecie ekspresji, aby umożliwić produkcję zmodyfikowanego białka L według niniejszego wynalazku.
Drożdżowe komórki gospodarza transformuje się przy użyciu konwencjonalnych technik wektorem (skonstruowanym przy użyciu opisanych wyżej konwencjonalnych metod) niosącym kasetę ekspresji białka S oraz jednym lub więcej wektorami niosącymi kasetę ekspresji zmodyfikowanego białka L. Alternatywnie, kasety ekspresji białka S i kasety ekspresji dla jednego lub więcej zmodyfikowanych białek L umieszczone są razem w tym samym wektorze, którym transformuje się komórki gospodarza-drożdży.
Jako wektorów można użyć integrujących wektorów Ty, jak to szczegółowo opisano w równoczesnym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 361 401. W innej, alternatywnej metodzie, stosuje się zgodnie autonomicznie replikujące wektory niosące pożądane kasety ekspresji i zdolne do transformacji komórek drożdżowych.
Przykładowe układy wektorów opisane są szczegółowo w następujących publikacjach: Mellor i inni, Yeast. 2:145 (1985); Boeke i inni, Celi, 40, 491 (1985); Boeke i inni, Cell, 42:507 (1985) oraz zgłoszenia patentowe w Stanach Zjednoczonych Amer. nr 101463, 233 631, 368401 i 009 325) publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego nr 0278 940).
Korzystna wersja metody według niniejszego wynalazku stosuje integracyjne wektory Ty niosące kasetę ekspresji dla białka S oraz autonomicznie replikujące wektory plazmidowe niosące kasetę ekspresji zmodyfikowanego białka L. Użycie wektorów Ty niosących kasetę ekspresji białka S umożliwia stabilną integrację tych sekwencji do chromosomów komórek drożdży. Takie integracje są stabilne dzięki niskiej częstotliwości ich wycinania. Tak więc wektory te są homogennie rozmieszczone w populacji komórek umożliwiając podobne tempo syntezy białka w każdej komórce.
168 597
Transformacja tych komórek autonomicznie replikującymi plazmidami niosącymi kasetę ekspresji zmodyfikowanego białka L zapewnia, że stosunek poziomów syntezy białka S do syntezy zmodyfikowanego białka L w każdej komórce zmienia się zgodnie z liczbą kopii plazmidu obecnego w tej komórce.
Zgodnie z kolejnym korzystnym rozwiązaniem zarówno kasetę ekspresji białka S i kasetę ekspresji zmodyfikowanego białka L można wstawić do integracyjnych wektorów Ty i oddzielnie integrować w komórkach drożdży jako żywicielach, o przeciwnych typach kojarzenia. Szczepy przynoszące pożądane ilości przypadków integracji kasety S i kasety zmodyfikowanego L można następnie krzyżować w celu uzyskania komórek diploidalnych, w których następuje ekspresja zarówno polipeptydu S jak i zmodyfikowanego L. W razie potrzeby otrzymać można haploidalne segreganty przenoszące obydwa typy kaset ekspresji, w wyniku przetrwalnikowania takich diploidów.
Następnie komórki te są hodowane w odpowiedniej pożywce, tzn. w pożywce umożliwiającej biorcy ekspresję białka S i zmodyfikowanego białka L w cząstkach o mieszanym składzie podjednostkowym, w ilościach umożliwiających ich pozyskiwanie.
Powstające zmodyfikowane białka L będą wytwarzane w komórkach drożdży jednocześnie z białkiem S i układane razem w formie mieszanych cząstek złożonych. Takie cząstki są niniejszym definiowane jako multimetryczne zestawy dwu lub więcej polipeptydów w strukturze cząstkowej, która to struktura - będąca zestawem o mieszanym składzie polipeptydowym - odznacza się swoim złożonym charakterem. Na powierzchni takich mieszanych cząstek różne peptydy są ułożone w przestrzennych konfiguracjach. Obecność nowego zmodyfikowanego białka L na cząstce HBsAg wywoła odpowiedź immunologiczną podobną do odpowiedzi wywoływanej przez determinante natywną. Niniejszy wynalazek umożliwia więc produkcję w drożdżach takich cząstek HBsAg, które imitują cząstki naturalne jeśli tylko zawierają one istotne miejsca antygenowe białek S, M i L wirusa HBV.
Wydzielenie cząstek mieszanych z lizatu komórkowego lub z pożywki hodowlanej przeprowadza się według konwencjonalnych metod otrzymywania białka.
W praktyce, według wynalezionej metody, do celów wytwarzania „mieszanych cząstek:,, HBsAg, w charakterze gospodarza może być użyty dowolny gatunek drożdży, dla którego są znane systemy transformacji, klonowania i ekspresji.
U innych rodzajów drożdży sekwencje Ty są nieobecne, a więc należy zaprojektować systemy wektorów umożliwiających koekspresję sekwencji kodujących białko S i zmodyfikowane białko L, w celu wytworzenia opisanych cząstek mieszanych. Dlatego można zaprojektować kasety ekspresji przeznaczone do integracji w chromosomach drożdżowych używając innych powtarzalnych sekwencji DNA lub plazmidów takich jak plazmidy zawierające ARS w drożdżach takich jak Pichia, umożliwiających integrację w chromosomach. Przykład takich stosownych plazmidów ARS opisany jest w pracy Craig'a i wsp., Mol. Cell. Biol. 1985, 5 (12), 3376.
W opisanych wyżej systemach ekspresji, np. oba systemy wektorów Ty, i innych, element regulacyjny zawiera promotor, który oddziaływuje na wiązanie polimerazy RNA i na transkrypcję. Mogą być także używane promotory podlegające regulacji tzn. indukowalne lub dereprymowalne. Szereg promotorów przydatnych do ekspresji heterologicznych polipeptydów w drożdżach jest już dostępnych. Są to: promotor genu metalotioneiny indukowany miedzią (CUP1) i konstytutywny promotor genów glikolitycznych, dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego (TDH3) i dehydrogenazy alkoholowej (ADH). Regiony dla terminacji transkrypcji w drożdżach pochodzą z końca 3' któregoś z genów drożdżowych np. z genu izo-1-cytochromu C (CYC1). Systemy ekspresji do zastosowania w Kluyveromyces są ujawnione np. w PCTWO 83/04050, Hollenberg i wsp.; w Schizosaccharomyces, np. w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym 107 170, Yamomoto,; w Pichia, np. Cregg i wsp., Bio Technology, 1987, 5, 479; i w Hansenula, np. w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym 299 108, Hollenberg i wsp.
Przykłady według niniejszego wynalazku dotyczą szczególnie szczepów S. cerevisiae zdolnych do syntezy białka S w wyniku integracji do genomu kaset ekspresji białka S, za pomocą wektorów typy Ty.
Jeden taki wektor, pRIT 13133-L, zawierający kasetę ekspresji; TDH3 - sekwencja kodująca białko S - ARG3 oraz marker URA3 opisany jest w przykładzie nr 1 równoczesnego zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 368 401.
168 597
Inny Tyl wektor, pRIT 13034-L zawiera tę samą kasetę ekspresji i marker URA3 ale, dodatkowo, zawiera gen CUP1, który może służyć jako dodatkowy marker w CUP1S lub ουρ1Δ szczepach - biorcach drożdży.
Preferowane szczepy drożdży są pozbawione funkcjonalnych chromosomowych genów CUP 1, które są wrażliwe na toksyczne działanie miedzi, w celu ułatwienia selekcji transformantów posiadających kilka zintegrowanych kopii wektorów. Dwa preferowane szczepy drożdży cup1: EJcuplA3d i EJcuplA7b są opisane w przykładzie nr 9 równoczesnego zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 368 401.
Szczepy drożdży zawierające kilka zintegrowanych kopii pRIT13133-L lub pRIT13034-L opisane są w przykładzie 5 niniejszego wynalazku.
Transformacja tych szczepów drożdży przy użyciu autonomicznie replikujących plazmidów ulegających ekspresji w drożdżach i niosących kasetę ekspresji zmodyfikowanego białka L opisana jest w przykładach poniżej.
Diploidalne szczepy drożdży zawierające szereg zintegrowanych kopii zarówno kaset ekspresji S jak i zmodyfikowanego L, opisane są poniżej w przykładzie XXXI (część F).
Sposób według wynalazku wytwarzania takich zmodyfikowanych białek L, samych lub w postaci cząstek o mieszanym składzie podjednostkowym, znajduje z powodzeniem zastosowanie przy wytwarzaniu szczepionek przeciw chorobotwórczym mikroorganizmom. Tak np. zmodyfikowane białka L występując w różnych preparatach szczepionkowych zawierają powierzchniowy antygen hepatitis B i mogą przynieść korzyści nie osiągane w przypadku znanych szczepionek przeciw HBV. Cząstka HBsAg z mieszanej kompozycji podjednostkowej, zawierająca zmodyfikowane białko L, jest podobna do cząstek lub włókienek wirionów występujących w krwi osób zainfekowanych HBV, które zawierają na swoich powierzchniach odsłonięte epitopy preS 1 i preS2 oprócz epitopów białek podstawowych, tak że może również znaleźć zastosowanie w nowych preparatach szczepionek. Zmodyfikowane białka L lub mieszane cząstki o mieszanym składzie podjednostkowym, zawierające to białko, mogą wykazywać właściwości odpornościowe nie uzyskiwane w przypadku indywidualnych mieszanin białek S, M i L.
Zmodyfikowane białko L lub cząstka zawierająca zmodyfikowane białko L w postaci o mieszanym składzie podjednostkowym (S, zmodyfikowane L) lub też homogennej (zmodyfikowane białko L) wytworzone sposobem według wynalazku służą do wytwarzania szczepionek.
Taka szczepionka będzie zawierać zapewniającą odporność ilość cząstek lub zmodyfikowanych białek L, to znaczy taką, przy podawaniu której ilość białek lub cząstek będzie wystarczająca do wywołania wystarczającej reakcji ochronnych przeciwciał w stosunku do HBV, bez poważnych efektów ubocznych. Szczepionki takie wytwarzać można znanymi sposobami. Tak np. szczepionka pobudzająca ochronę przed HBV-infekcją u ludzi może zawierać cząstki i/lub zmodyfikowane białka L, opisane powyżej oraz odpowiedni znany nośnik. Cząstki lub białko L mogą być w roztworze wodnym buforowanym do fizjologicznego pH, do bezpośredniego użycia. Alternatywnie białko lub cząstki mogą być wymieszane lub zaadsorbowane na zwykłym środku pomocniczym, takim jak wodorotlenek glinu lub fosforan glinu. Takie cząstki lub zmodyfikowane białko L łączyć można także z innymi immunogenami uzyskując w ten sposób szczepionki kombinowane. Patrz np. „New Trends and Developments in Vaccines“, wyd. Voller i inni, University Park Press, Baltimore, WD (1978).
Takie zmodyfikowane białka L, same lub w cząstkach o mieszanym lub homogenicznym składzie podjednostkowym, opisane powyżej, poszerzają zakres działania przeciwciał w stosunku do HBV i mogą zapewnić wcześniejszą reakcję na zmiany spowodowane atakiem wirusowym u osób zaszczepionych szczepionkami zawierającymi takie białka. Ponadto szczepionki zawierające takie zmodyfikowane białka L mogą zapewnić u osób, które nie reagują na białka S wywoływanie reakcji preS, albo powiększyć lub wzmocnić reakcję S.
Cząstki wytwarzane i/lub zmodyfikowane białka L mogą również znaleźć zastosowanie jako próbki lub reagenty do wykrywania HBV lub białek pochodzących z HBV, albo przeciwciał anty-HBV w próbkach biologicznych, na drodze zwykłych prób immunologicznych itp.
Wszystkie opisane szczepionki podawać można w odpowiedni sposób, np. podskórnie, dożylnie lub domięśniowo. Ilość immunogenu w każdej dawce szczepionki dobiera nadzorujący lekarz biorąc pod uwagę wiek pacjenta, jego wagę, płeć, ogólny stan fizyczny itp. Ilość wywołująca reakcję
168 597 odpornościową u pacjenta bez widocznych niekorzystnych efektów ubocznych może zmieniać się w zależności od stosowanego immunogenu oraz ewentualnej obecności dodatków. Zazywczaj oczekuje się, że każda dawka powinna zawierać l-1000pg białka, a korzystnie l-200//g. Dawki początkowo można ewentualnie następnie zwiększyć w razie potrzeby.
Sposób leczenia lub zapobiegania infekcji hepatitis B u ludzi polega na podawaniu pacjentowi wymagającemu tego wywołującej ochronę dawki szczepionki według wynalazku.
Szczególnie korzystne są te szczepionki, które zawierają kompozytowe cząstki o strukturze (L*, S), gdzie ma znaczenie podane poniżej, a S oznacza białko S powierzchniowego antygenu hepatitis B, najkorzystniej wytworzone w wyniku ekspresji w S. cerevisiae lub H. polymorpha.
W użytym znaczeniu symbol L* oznacza zmodyfikowano białko L zawierające reszty 12-52, 133-145 i 175-400, w odniesieniu do wielkiego otwartego szkieletu odczytywania wirusa HB, serotyp ad, przedstawionego powyżej w tabeli A. Podobnie symbol gly L* oznacza zmodyfikowane białko L zawierające resztę 12, a następnie kolejno reszty 14-52, 133-145 i 175-400.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady i rysunki.
Figura 1: Konstrukcja plazmidu pME4 z pHARSl. Fragment HARS1 został przeniesiony do pojedynczego miejsca PvuII poprzedniego pHARSl, przy czym sekwencje między poprzednią pozycją HARS i genem /3-laktamazy, a także sam koniec 5' genu /3-laktamazy, zostały wycięte.
Figura 2: Schematyczne przedstawienie fagów Λ zawierających fragmenty genomowego DNA Hansenula polymorpha, obejmujące a) gen Μ0Χ oraz b) gen FMD.
Figura 3: Mapa plazmidu pT-24. Plazmid ten zawiera fragment DNA obejmujący terminator genu ΜΟΧ klonowany w miejscu Smal wielozadaniowego miejsca klonowania pUC19.
Figura 4: Mapy plazmidów pRB-S-269 i pRB-S-271 wytwarzających w wyniku ekspresji S-gen pod kontrolą odpowiednio promotora ΜΟΧ i FMD.
Figura 5: Mapy plazmidów pBC, pMS-2, pFS-9. Ostatnie 2 plazmidy pochodzą z pBC zawierającego gen URA3 Hansenula polymorpha i powstały w wyniku insercji kaset ekspresji zawierających promotor ΜΟΧ (pMS-2) lub promotor FMD (pFS-9) do sekwencji kodującej gen URA3.
Figura 6: Mapa plazmidu pHK2. Plazmid ten zawiera gen kanamycyny (pochodzący z Tn5) pod kontrolą promotora ADH1 z Saccharomyces cerevisiae. Plazmid pHK2 dodatkowo zawiera również sekwencję HARS1.
Figura 7: Mapy plazmidów pRB-S-322 i pRB-S-326. Jednostka funkcyjna zawierająca gen odporności na kanamycynę oraz promotor ADH1, występujące w plazmidzie pHK, zostały wstawione do regionów HARS plazmidów pRB-S-269 i pRB-S-271.
Figura 8: Konstrukcja pMPS-22 z pMOX-P/Tl. Gen preS wirusa Hepatitis B został wstawiony w miejsce EcoRI plazmidu pMOX-P/Tl. W uzyskanym plazmidzie pMPS-22 gen preS jest regulowany przez promotor ΜΟΧ.
Figura 9: Mapa plazmidu pMPS-9. W celu konstrukcji tego plazmidu wykonano insercję kasety ekspresji preS z pMPS-22 między miejsca Xhol i Stul fragmentu Hansenula wyjściowego plazmidu pBC.
Figura 10: Mapa genu URA3 Hansenula polymorpha wraz z sąsiednimi regionami DNA.
Figura 11: Diagram ilustrujący budowę plazmidu pMPT121, do którego można wstawić obce sekwencje genowe pod kontrolą promotora ΜΟΧ.
Figura 12: Diagram ilustrujący budowę plazmidu pKL*l, zawierającego kasetę ekspresji białka L* pod kontrolą promotora ΜΟΧ.
Figura 13: Schematyczny diagram przedstawiający etapy konstrukcji plazmidu E. coli kotwiczącego kasetę ekspresji białka L, z wyciętą Glyl3, pRIT12998.
Figura 14: Schematyczny diagram ilustrujący procedurę wytwarzania plazmidu drożdżowego pRIT12979 zdolnego do ekspresji białka L z wyciętą Glyl3.
Figura 15: Schematyczny diagram ilustrujący konstrukcję plazmidu pRIT13191 zawierającego sekwencję kodującą białko L, z którego wycięto aminokwasy 53-132 i 146-174.
Figura 16: Schematyczny diagram ilustrujący konstrukcję drożdżowych plazmidów ekspresji pRIT13192 i pRIT13193, zawierających kasety ekspresji białek odpowiednio L* i AGlyL*.
168 597
I Materiały
1. Plazmidy
Plazmidy wspomniane w opisie opisane są w części A poniżej.
2. Szczepy drożdży
Hansenula polymorpha RB 10 (ura 3) jest mutantem Hansenula polymorpha ATCC 34438 uzyskanym w wyniku mutagenezy z wykorzystaniem metanosulfonianu etylu (EMS), zasadniczo w sposób opisany przez Roggenkampa i innych (1986).
3. Enzymy
Endonukleazy restrykcyjne, ligazę T4 DNA oraz inne stosowane enzymy otrzymano z Boehringer, Mannheim, Republika Federalna Niemiec lub z Bethesda Research Laboratories, Eggenstein, Republika Federalna Niemiec. Enzymy te stosowano zgodnie z instrukcjami odpowiedniego wytwórcy.
4. Reagenty immunologiczne
a) Sl.l: monoklonalne przeciwciało mysie, specyficzne względem domeny Sl białka preSl (SmithKline Biologicals, Rixensart, Belgia).
b) S2.1, S2.2 oraz S2.5: monoklonalne przeciwciała mysie specyficzne względem domeny S2 powierzchniowego antygenu hepatitis B (SmithKline Biologicals, Rixensart, Belgia).
Przeciwciała specyficzne względem domeny Sl i domeny S2 powierzchniowego antygenu hepatitis B określane są jako „przeciwciała preS“.
c) RF6: monoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem domeny S powierzchniowego antygenu hepatitis Β (H. Thomas, Royal Free Hospital, Londyn)
d) RF1: monoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem konformacyjnie uzależnionego epitiopu zlokalizowanego w regionie S (H. Thomas, Royal Free Hospital, Londyn).
e) HBS1: monoklonalne przeciwciało mysie skierowane przeciw epitopowi odpornemu na denaturację i redukcję, pochodzącemu z plazmowego HBsAg, zlokalizowanego w regionie S (SmithKline Biologicals, Rixensart, Belgia). To monoklonalne przeciwciało stosowano w eksperymentach zamiennie z Mab RF6.
Przeciwciała a), b) oraz e) wykonano zgodnie ze standardowymi procedurami dokonując fuzji mysich komórek ze śledziony, z komórkami myeloma. Opis metody znajduje się w pracy Kohlera i Milsteina, 1978. Metody ujawnione są ponadto w książce Godinga, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, Academic Press, Londyn 1983.
f) AUSRIA (Abbott Laboratories, Wiesbaden-Delkenheim, Republika Federalna Niemiec i Louvain-Lać'Neuve, Belgia): handlowy zestaw zawierający poliklonalne przeciwciała skierowane przeciw rodzimym epitopom konformacyjnym.
g) AUSZYME (Abbott Laboratories, Wiesbaden-Delkenheim, Republika Federalna Niemiec oraz Louvain-La-Neuve, Belgia): handlowy zestaw zawierający monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw rodzimemu epitopowi konformacyjnemu.
Przeciwciała wymienione w punktach f) i g) są dostępne w handlu. Nie reagują one z monomerycznym powierzchniowym antygenem hepatitis B.
h) AUSAB (Abbott Laboratories, Louvain-La-Neuve, Belgia): handlowy zestaw do wykrywania przeciwciał anty-HBsAg.
5. Ośrodki
Pepton 190, ekstrakt drożdżowy, kwasy Casamino oraz bazę drożdżowo-azotową, stosowane do przygotowywania ośrodków, otrzymano z Gibco Ltd., Paisley, Wielka Brytania.
W celu przygotowania płytek agarowych do odpowiedniego ośrodka dodawano przed autoklawowaniem 18 g/dm3 agaru (Gibco Ltd.).
a) SMR: Średnio bogaty ośrodek nieselektywny
Składnik Ilość, g/dm3
Pepton 190 2
Ekstrakt drożdżowy 1
Kwasy Casamino (Pepton 5) 3
Baza drożdżowo-azotowa, bez (NH^SOi 1,4
(NH4)eSO4 5
Źródła węgla: glikoza 20
albo gliceryna 20
albo metanol 10
168 597
SMR zawierający metanol określany jest również jako Met-SMR.
b) YNB: Ośrodek selektywny
Baza drozdżowo-azotowa bez (NH^SO..
(Gibco lub Difco) 1,4g/dm'
(NH„)2SO4 5 g/dm3
Źródła węgla: glikoza 20g/dm3
albo gliceryna 20 g/dm3
albo metanol 10 g/dm3
c) YEPD: Nieselnktronr, bogaty ośrodek
Ekstrakt drożdżowy 10 g/dm3
Pepton 190 20 g/dm3
Glikoza 20 g/dn?
W razie potrzeby dodawano gentamycynę G418 w ilości 1 mg/ml ośrodka
d) Ośrodek S
Składnik Ilość w 1 dm3
(NH„)2SO4 5g
KH2PO4 4g
Mg4SO4 · 7H2O 2g
NaCl 0,1 g
CaCh · 2H2O 0,4 g
Monochlorowodorek L-histydyny 10 mg
LD-metionina 9 mg
LD-tryptofan 9 mg
H3BO3 2 mg
CuSO4 · 5H2O 0,16mg
KJ 0,4 mg
FeCl3‘6H2O 0,8 mg
MnSO4 · H2O 1,6 mg
Na2MoO4 · 2H2O 0,8 mg
ZnSO4 · 7H2O 1,6 mg
Biotyna 0,16 mg
Pantotenian Ca 32 mg
Kwas foliowy 0,16mg
Inozytol 160 mg
Niacyna 0,4 mg
Kwas p-aminobenzoesowy 0,2 mg
Chlorowodorek pirydoksyny 32 mg
Rrboflaoina 0,2 mg
Chlorowodorek tiaminy 32 mg
II Metody
1. Manipulowanie DNA
Rozszczepianie endonukleazami restrykcyjnymi, ligowanie z wykorzystaniem ligazy T4 DNA, fosforylowanie DNA, wydzielanie DNA z E. coli, rozdzielanie DNA metodą elektroforezy na żelu, a także inne techniki należące do dziedziny inżynierii i technologii genetycznej, wykorzystywane w przykładach, przeprowadzano zasadniczo w sposób opisany przez Maniatisa i innych, 1982.
2. Transformawanie drożdży
Drożdże metylotropowe transformuje się sposobami opisanymi uprzednio (Roggenkamp i inni, 1986).
Korzystnie stosuje się metodę z nieczynnymi zamrożonymi komórkami (Klebe i inni, 1983). a) Transformowane komórki identyfikujf się na podstawie komplementacji deficytf ura3 lub odporności na gentamycynę.
Odporność na gentamycynę G418 badano dokonując powiewu komórek na płytkach YEPD zawierających 25 ml zestalonego ośrodka. Po prowadzeniu hodowli na płytkach w ciągu 6 godzin na każdą z płytek naniesiono 1 ml roztworu wodnego zawierającego 25 mg gentamycyny 418 i inkubację kontynuowano przez 2-3 dni. Gentamycynę G418 (nazwa handlowa - Geneticin) otrzymano z Gibco Ltd.
168 597
b) Segregację mjtotycznie trwatych transformantów przeprowadzaao wybierająe transformanty z płytki do selektywnej transformacji i hodując je w ciekłym ośrodku selekcyjnym (YNB lub YEPD, z 1mg/ml G418) w ciągu 20 generacji (2 przejścia). Po tym okresie wzrostu komórki przenoszono do nieselektywnego ośrodka (SMR lub YEPD) i prowadzono hodowlę w ciągu 40-60 generacji (5-6 przejść). Z kolei komórki posiewano na selektywnej płytce (YNB lub YEPD z 1 mg/ml G418), w wyniku czego zachowane zostały klony wytwarzające w dalszym ciągu w wyniku ekspresji selektywny marker.
3. Wydzielanie DNA drożdży
Całkowity DNA z drożdży otrzymywano w sposób opisany przez Struhla i innych (1979).
4. Analiza DNA drożdży
Strukturę DNA w transformantach drożdży analizowano na drodze roztwarzania odpowiednimi enddnukleaoami restrykcyjnymi, a następnie elektroforezy na żelu agarozowym. Fragmenty DNA przenoszono na nitrocelulozę i hybrydyodwano z odpowiednią sondą radioaktywnie znaczonego DNA (Southern, 1975).
5. Analiza immunologiczna
Blotting metodą Westerna
a) Procedura Amersham
Białka uzyskane z surowych ekstraktów lub z frakcji gradientowych rozdzielano metodą elektroforezy na SDS-żelu poliwkryldamiddwym (Laemmli, 1970), stosując 12,5% rozdzielające, 5% zbierające żele. Pasma białek przenoszono następnie na nitrocelulozę zasadniczo w sposób opisany przez Towbina i innych, (1979).
Materiał antygenowy wykrywano przeprowadzając reakcję plamy ze specyficznymi przeciwciałami. Kompleks antygen-przeciwciało wilualioowand działając; na filtr biotynylowanym prze ciwciałem RPN 1001 (Amersham Buchler GmbH and Co., Ltd. Braunschweig, Republika Federalna Niemiec) w rozcieńczeniu 1:300, a następnie prowadząc inkubację z kompleksem peroksydaza-streptawidyna RPN 1051 (Amersham). Wszystkie etapy eksperymentu prowadzono zgodnie z instrukcjami producenta.
b) Alternatywnie filtr następnie inkubowano z 0,05% (wagowo/objętościowych) Tween w PBS. Po inkubacji z danym przeciwciałem mdnokldnwlnym, wiązanie przeciwciała wykrywano prowadząc kolejno inkubację z biotynyldwαnym przeciwmysim IgG z owcy (RPN 1021, Amersham) w rozcieńczeniu 1:250, z dodatkiem 0,05% Tween 20, z kompleksem streptawidyny z bidtynyldwaną peroksydazą z chrzanu (RPN 1051, Amersham, rozcieńczenie 1:400 w PBS zawierającym 1% żelatyny), w na koniec z 30 μΐ H 2O 2 i 10 ml odczynika do barwnego wywoływania HRP, zawierającego 4-chloro-1-naftol (3mg/ml metanolu) w 50 ml PBS. Między poszczególnymi inkubacjami filtr przemywano PBS zawierającym 0,05% Tween 20.
Ocenę ilościową wytworzonych monomerycznych antygentów (S i preS) wykonywano porównując próbki 0,01-0,3 μg oczyszczonego HBsAg pochodzącego z drożdży (SmithKline Biologicals) z 3-5 różnymi rozcieńcze^ami ekstraktu surowego białka Hansenula, zawierającego 2-20 μg pełnego białka komórkowego.
Stężenie białek oznaczano z wykorzystaniem zestawu do analizy białek BioRad (BioRad, Monachium, Republika Federalna Niemiec).
Przykłady.
Część A Plazmidy
Przykład I. Konstrukcja plazmidów umożliwiających ekspresję białka w Hansenula polymorpkw
w) Konstrokcja podatawowwgo plaom^ mawierającewo sekwencżę ucegającg autonumiczyej replikacji, z Hansenula pdlymorpha (pME4).
Macierzysty plazmid wykorzystywany w konstrukcji plazmidów zawierających gen S pod kontrolą promotorów Hansen^a stanowi pME4, opisany już w pracy doktorskiej M. Eckarta, 1988. pME4 jest pochodną YIp5 (Struhl i inni, 1979; Stinchcomb i inni, 1980) uzyskiwaną na drodze następujących modyfikacji:
Autonomicznie ulegają replikacji sekwencję HARS1 z Hanensula pdlymorpha klonuje się w miejscu SalI w YIp5, jak to ujawniono w pracy Roggenkampa i innych (1986) uzyskując pHARS.
168 597
Plazmid pHARS zrekonstruowano następnie dokonując delecji i ponownej insercji fragmentu HARSl-Sall o 440 parach zasad w miejscu PvuII tego samego wektora. Lepkie końce Sali fragmentu zmieniono w tępe przed ligowaniem, na drodze inkubacji z egzonukleazą VII, a następnie reakcji z polimerazą Klenowa. W wyniku takiej konstrukcji uzyskano pojedyncze miejsce Sall w genie odporności na tetracyklinę w części pBR322 plazmidu. Uzyskany w ten sposób pośredni plazmid poddano ponownie rekonstrukcji w celu uzyskania genu β-laktamazy nie zawierającego wyjściowej sekwencji sygnalnej, w którym sekwencja sygnalna została zastąpiona linkerem przedstawionym poniżej; szczegóły - patrz Eckart (1988):
SalI EcoRI BstEII
GTC GAC GAA TTC AAA ATG TCC GGT CAC
CAG CTG CTT AAG TTT TAC AGG CCA GTG
Met Ser Gly His
β-laktamaza
Ten etap, w którym uzyskuje się plazmid pME4, przedstawiono na fig. 1. b) Fragmenty promotorów MOX i FMD
Wydzielanie promotora MOX z H. polymorpha opisane jest przez Eckarta, 1988. Dla celów wynalazku genomowy fragment EcoRI-Sall o 1525 bp, zawierający górny region kontrolny genu MOX oraz kodony pierwszych pięciu aminokwasów w białku MOX, klonowano w pochodnej pBR322. Schematyczne przedstawienie genu MOX podano na fig. 2. Ten pośredni plazmid rozszczepiono za pomocą EcoRI, poddano obróbce nukleazą Ba131 i zligowano z linkierami EcoRI. Uzyskano w ten sposób szereg fragmentów promotora zawierających końce EcoRI 3' oraz Sali 5', po rozszczepieniu endonukleazą restrykcyjną SalI. Pozycje różnych końcowych punktów delecji ustalono na podstawie sekwencjonowania DNA zgodnie z metodą Maxama i Gilberta, 1977. W dalszych eksperymentach przedstawionych w tym opisie zastosowano plazmid oznaczony jako pBR322-MP zawierający delecję aż do pozycji -3 (przy czym pierwszą zasadą kodonu inicjowania translacji MOX jest zasada + 1). Plazmid pBR322-MP opisany jest przez Eckarta, 1988.
Wydzielanie i charakterystyka promotora FMD opisane są w zgłoszeniu patentowym europejskim nr 87 110417.0. Dla celów wynalazku fragment BamHI o 1,4 kb, zawierający przedni fragment promotora o około 1000 bp, klonowano w miejscu BamHI w pUC19. Wyselekcjonowano klon, w którym insert został zorientowany w taki sposób, aby przy końcu 3' wstawionego fragmentu znajdowało się pojedyncze miejsce EcoRI zpUC19. Schematyczne przedstawienie genomowego klonu zawierającego gen FMD obejmujący jego promotor, podano na fig. 2B. Wykonano szereg delecji nukleazą Bal31, poczynając od miejsca EcoRI wewnątrz linkera pUC19, w celu uzyskania plazmidów zawierających promotor bez sekwencji genu strukturalnego. Po obróbce za pomocą Bal31 DNA zligowano z linkerami EcoRI, DNA rozszczepiono za pomocą BamHI i uzyskane fragmenty BamHI-EcoRI klonowano w pBR322. Uzyskano w ten sposób różne delecje. Najbardziej efektywne w późniejszych eksperymentach okazały się delecje do pozycji -5 i -9 od pierwszego ATG. W dalszych eksperymentach przedstawionych w opisie wykorzystywano plazmid przenoszący fragment promotora zawierający delecję do pozycji -9 od pierwszego ATG (plazmid pBR322-FMD-P-9). Schematyczne przedstawienie fragmentów promotorów MOX i FMD, stosowanych w konstrukcjach kolejnych plazmidów, pokazano poniżej.
a) Fragment promotora MOX (-3)
SalI EcoRI
-15 -3 / 1500 b?/----AAACTACAAAAAC GGAATTCC
Linker
168 597
b) Fragment promotora FMD (-9)
BamHI
EcoKC
-14 19 / 1000 bp/ ——TTCATC
CGGTTTCC
Linker
C) Terminator
Wydzielanie terminatora transkrypcji z genu MOX opisano w pracy Eckarta, 1988. Schematyczne przedstawienie regionu 3' genu MOX pokazano poniżej:
Trg Phe Stop
TGT TTC TTT
SaUE---------Asp718-------------------EcoBV------Nrul < 1 Ml bp 7 < 327 bp >
< 284 bp / < 368 bp y
Fragment Sall-Nrul przedstawiony na powyższym schemacie subklonowano w pBR322 pomiędzy miejsca Sali i Nrul, po czym plazmid ten rozszczepiono za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Asp718 uzyskując dzięki temu linearyzację plazmidu na skutek pojedynczego miejsca Asp718 wewnątrz otwartego szkieletu odczytywania, który poddano delecjom Ba131.
W wyniku analizy sekwencji DNA uzyskanych fragmentów zidentyfikowano fragment terminatora o około 320 bp (Eckart, 1988), który w dalszym ciągu działa jako terminator. Ten fragment terminatora z lepkimi końcami (GACATACC-315bp-EcoRV) zligowano z miejscem Smal w pUC19. Orientację fragmentu ustalono na podstawie analizy sekwencyjnej (Maxam i Gilbert, 1977). Uzyskany klon pT-24 przedstawiono na fig. 3. Klon ten zastosowano w konstrukcji wektorów ekspresji, jak to przedstawiono poniżej.
D) Selektywne geny markerowe.
pME4 (opisany powyżej, patrz fig. 1) rozszczepiono za pomocą EcoRI, po czym lepkie końce wypełniono polimerazą Klenowa. Plazmid pT-24 roztworzono za pomocą EcoRI i Hindlll, po czym wydzielono fragment zawierający linker pUC19 i fragment terminatora MOX. Lepkie końce tego fragmentu przekształcono w końce tępe stosując obróbkę polimerazą Klenowa, po czym fragment z tępymi końcami zligowano z pME4. Uzyskany plazmid nazwano pP/T-24. Miejsca klonowania pochodzące z pUC19 wykorzystano następnie w kolejnych etapach klonowania.
Plazmid pP/T-24 zawiera gen S. cerevisiae URA3 jako selektywny marker. Jako kolejny selektywny marker wprowadzono gen nadający odporność na chloramfenikol. Gen ten wydzielono z wektora pBR325 jako fragment Aatll-Clal o 1,7 kb, który poddano krótkiemu trawieniu Bal31 w celu usunięcia po około 4 par zasad z każdej ze stron i tępo zakończono w wyniku reakcji wypełniania Klenowa. Następnie fragment zligowano z pP/T-24, który rozszczepiono za pomocą Nrul. Uzyskany plazmid wykazujący odporność na chloramfenikol nazwano pP/T-24-C.
168 597
Przykład II. Konstrukcja plazmidu zawierającego gen powierzchniowego antygenu Hepattis B w funkcjonalnej kombinacji z terminatorem Hansenula polymorpha.
W celu uzyskania funkcjonalnej jednostki zawierającej S-gen Hepatitis B oraz terminator skutecznie działający w Hansenula polymorpha, gen S wprowadzono jako Ncol-EcoRI fragment o 683 bp do miejsca BamHI plazmidu pP/T-24C występujące w części tego plazmidu odpowiadającej linkierowi pUC19. Fragment o 683 bp otrzymano z pRIT12331 będącego zwykłym wektorem pUC9 opartym na E. coli, zawierającym fragment DNA Ncol-EcoRI o 683 bp, kodujący białko S od Ncol w kodonie ATG (CCATGG) do EcoRI poza kodonem stopu TAA (TAACGAATTC). Sekwencję kodującą antygen powierzchniowy otrzymano zwykłymi technikami zrekombinowanego DNA z pRIT 10616 ujawniono w opisie patentowym europejskim nr A-0278940 oraz w pracy Harforda i innych, 1987. pRIT10616 zawiera genom wirusa HBV serotypu adw, klonowany w pACYC184. Zdeponowano go w American Type Culture Collection na warunkach Konwencji Budapeszteńskiej, dnia 2 czerwca 1982, pod nr ATCC39131.
Lepkie końce fragmentu genu S oraz pP/T-24C rozszczepionego za pomocą BamHI przekształcono w końce tępe na drodze wypełniania, przed ligowaniem. Ligowanie fragmentu z odpowiednią orientacją regeneruje sąsiednie miejsce BamHI i Ncol w konstrukcji, tuż przy 5' względem regionu kodującego genu S. Uzyskany plazmid nazwano pRB-S.
Przykład III. Konstrukcja plazmidów zawierających funkcyjną kasetę ekspresji obejmującą promotory pochodzące z Hansenula polymorpha, gen antygenu powierzchniowego Hepatitis B oraz terminator Hansenula polymorpha.
Pochodzące z pBR322, pBR322-MP i pBR322-FMD-/-9, zawierające odpowiednio promotory MOX i FMD strawiono za pomocą EcoRI, po czym lepkie końce wypełniono stosując polimerazę Klenowa. Plazmidy rozszczepiono następnie za pomocą SalI. Uzyskany fragment zawierający MOX obejmuje wyłącznie genomowy DNA z Hansenula eolymoopha, podczas gdy fragment zawierający promotor FMD obejmuje dodatkowo sekwencje pBR322 o 275 bp (pozycje od bp 375 do pb 650 na mapie pBR322).
Plazmid pRB-S przecięto przy zregenerowanym miejscu BamHI, miejsce przekształcono w tępy koniec w wyniku wypełniania polimerazą Klenowa, po czym plazmid strawiono za pomocą Sali. Fragmenty promotora zawierające lepki koniec SalI oraz tępy koniec zligowano z wielkim fragmentem pRB-S o tępym końcu Sali, zawierającym region kodujący region S oraz terminator Hansenula polymoipha. Uzyskane plazmidy nazwano pRB-S-269 (promotor MOX) oraz pRB-S271 (promotor FMD, delecja -9). Zawierają one gen S pod kontrolą promotora i terminatora Hansenula polymooeha, jak to przedstawiono na fig. 4. Sekwencję otaczającą połączenie między genem S i promotorami przedstawiono schematycznie poniżej.
a) Połączenie MOX - promotor (pRB-S-269)
-3 +1
---AAAAAC GGAATTGATCC ATG
--------->
Promotor Μ0Χ gen. S
b) Połączenie FMD - promotor (-9)
-9 +1 £---TTCCATC GGAATTGATCC ATG
-------Promotor PRED gen S
Plazmidom skonstruowanym identycznie jak pRB-S-271 i pRB-S-269, ale nie zawierającym insercji fragmentu restrykcyjnego o 440 bp, przenoszącego sekwencje HARS1, nadano nazwy pRB-S-2691 i pRB-S-2711. Plazmidy te zastosowano do wytwarzania integrantów zawierających 1-3 kopie kasety ekspresji.
168 597
Przykład IV. Konstrukcja wektorów integracyjnych zawierających gen S.
a) Konstrukcja plazmidu pBC zawierającego sekwencje autonomicznie ulegające replikacji, z Hansenula Polymorpha oraz gen URA3 Hansenula polymorpha.
Plazmid pBC stanowi pochodną plazmidu YRp7 (Tschumper i Carbon, 1980) zawierającą sekwencję ARS1 Saccharomyces cerevisiae. Ta autonomicznie ulegająca replikacji sekwencja została zdezaktyzowana w wyniku insercji fragmentu Bglll-SphI o 5400 bp, zawierającego gen URA3 z Hansenula polymorpha. Autonomicznie ulegającą replikacji sekwencję 1 (HARS1) Hansenula klonowano również w miejscu Sali genu odporności na tetracyklinę (fig. 5).
b) Insercja kaset ekspresji w plazmidzie pBC.
Plazmid pRB-S-269 poddano trawieniu za pomocą BspMII i Sali.
Uzyskany fragment zawierający kasetę ekspresji obejmującą promotor MOX, region kodujący powierzchniowy antygen Hepatitis B oraz terminator, przekształcono tak, że zawierał tępe końce, po czym zligowano z plazmidem pBC, po czym przeprowadzono rozszczepianie za pomocą Xhol i Stul i wypełnianie lepkich końców Xhol. Uzyskany plazmid pMS-2 zawiera kasetę ekspresji genu S otoczoną sekwencjami flankującymi z fragmentu genu URA3 Hansenula polymorpha.
W celu zintegrowania kasety ekspresji genu S w genomie Hansenula polymorpha, plazmid pMS2 rozszczepiono za pomocą Nhel i uzyskany fragment o 6,1 kb zastosowano do transformowania komórek.
Wektor pFS-9 skonstruowano w analogiczny sposób, z tym że kasetę ekspresji wydzielono z pRB-S-271, zawierającego promotor FMD.
Szczegółowy opis uzyskanych plazmidów przedstawiono na fig. 5.
Przykład V. Konstrukcja plazmidów zawierających kasetę ekspresji oraz dodatkowy gen selektywnego markera.
a) Konstrukcja podstawowego plazmidu pHK2.
W celu wykonania konstrukcji plazmidu pHK2 (fig. 6; zdeponowany na warunkach Konwencji budapeszteńskiej w DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) pod nr 5328 dnia 27 kwietnia 1989) gen odporności na kanamycynę wydzielono z transpozonu Tn5 (Grindley i Joyce, 1980). Niepotrzebne sekwencje wycięto stosując obróbkę genu strukturalnego za pomocą nukleazy Bal31. Uzyskany fragment obejmujący strukturalny gen kanamycyny obejmujący terminator kanamycyny, zligowano z promotorem ADH1 z Saccharomyces cerevisiae (Hitzeman i inni, 1981). Ponadto sekwencję HARS1 wprowadzono jako fragment SalI o 440 bp do plazmidu.
b) Konstrukcja szczepów odpornych na kanamycynę, pochodzących z pRB-S-269 i pRB-S-271.
Fragment HindHI z pHK obejmującego region kodujący odporność na kanamycynę (3,5 kb) klonowano w miejsce HindlU występujące w sekwencji HARS1 w plazmidach pRB-S-269 i pRB-S-271. Uzyskane plazmidy, którym nadano odpowiednio nazwy pRB-S-322 i pRB-S-326, przedstawiono na fig. 7.
Przykład VI. Konstrukcja macierzystego plazmidu dla ekspresji białek pre-S.
Plazmid pP/T-24 (przykład II) zrekonstruowano w celu uzyskania plazmidu pMOX-P/TJ (fig. 8) przenoszącego uniwersalną kasetę ekspresji zawierającą promotor MOX, miejsce wielokrotnego klonowania i termonator MOX.
W celu dokonania insersji linkera zawierającego miejsca restrykcyjne endonukleaz SalI, EcoRI, BglH i BamHI, linker pUC19 z plazmidu pP/T-24 zastąpiono częściowo syntetycznym DNA zawierającym miejsca restrykcyjne dla wyżej wspomnianych enzymów.
Plazmid pP/T-24 rozszczepiono endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i SalI. Miejsca te pochodzą z linkera pUC19 (BamHI) oraz z pME4 (SalI). Dokonano insercji linkera - cząsteczki zawierającej miejsca restrykcyjne SalI, EcoRI, BglH i BamHI. Uzyskany plazmid pT1 roztworzono za pomocą EcoRI i SalI, po czym dokonano insercji promotora MOX jako fragmentu EcoRI-Sall o
1,5 kb, uzyskując plazmid pT2. Istotne obszary plazmidu pT2 przedstawiono poniżej:
168 597
Sali
EcoRI Bglll BamHI
-1500
----//---AAAAAC GGAATTC AGATCT GGATCC AGCTT—
Promotor MOZ
-->
Terminalo r
Plazmid pT2 zawiera ponadto gen ARS Hansenula polymorpha oraz URA3 Saccharomyces cerevisiae, podobnie jak plazmid pRB-269 (fig. 3).
Następny etap konstrukcji obejmował zastąpienie genu URA3 Saccharomyces cerevisiae przez gen URA3 pochodzący z Hansenula polymorpha. Klon zawierający ten gen wydzielono w sposób opisany poniżej w przykładzie IX. Gen URA3 wydzielono jako fragment BamHI-Bglll o 1,2 kb. Podczas gdy miejsce Bglll jest oryginalnym miejscem genomowym, miejsce BamHI powstało w wyniku zligowania miejsca Sau3A z miejscem BamHI stosowanym w konstrukcji banku genomowego. Lepkie końce tego fragmentu BamHI-Bglll wypełniono polimerazą Klenowa i dokonano insercji w miejsce Aval w pBR322, które również zostało wypełnione polimerazą Klenowa. Miejsce Aval zostało zregenerowane w wyniku ligowania. Uzyskany plazmid oznaczono jako pURA-P1.
Plazmid URA3-P1 strawiono za pomocą Nrul i BspMII. Miejsca te pochodzą z pBR322, pozycje bp 974 i bp 1664 na zwykłej mapie pBR322. Plazmid pT2 poddano pełnemu roztwarzaniu za pomocą Nrul (bp 974 w pBR322) oraz częściowemu trawieniu za pomocą BspMII. Istnieją 2 miejsca BspMII w pT2: pierwsze w pBR322 (bp 1664), a drugie zlokalizowane w terminatorze MOX. Fragment NruI-BspMII w pT2 (1800 bp) zawiera gen URA3 z Saccharomyces cerevisiae. Fragment NruI-BspMII z URA3-P1 zawierający gen Hansenula polymorpha URA3 klonowano w pT2 zastępując w ten sposób gen S. cerevisiae URA3 zlokalizowany w odpowiednim fragmencie NruI-BspMII. Uzyskany plazmid pT3 zawiera terminator MOX, linker, promotor MOX oraz gen URA3 z Hansenula polymorpha, w podanej kolejności. Plazmid pT3 nie zawiera jednak funkcjonalnego genu β-laktamazy, jak w macierzystym plazmidzie pME4.
W celu zastąpienia tego zdefektowanego genu β-laktamazowego przez gen funkcjonalny, pBR322 strawiono za pomocą EcoRI, lepkie końce wypełniono polimerazą Klenowa, po czym przeprowadzono ligowanie z linkerem Asp718 o 8 bp, a następnie trawienie za pomocą Pvul (pozycja 3738 na mapie pBR322). Uzyskany w ten sposób fragment Asp718-Pvul o 633 bp zawiera oryginalny prmotor i kodon inicjowania translacji genu β-laktamazowego.
Plazmid pT3 poddano rozszczepieniu za pomocą Asp718 (Asp718 zlokalizowany jest na końcu terminatora MOX) i częściowemu trawieniu za pomocą Pvul. Fragment Asp718-Pvul uzyskany w sposób opisany powyżej wstawiono następnie w poddany wstępnej obróbce pT3 uzyskując plazmid pMOX-P/T1.
Plazmid pMOX-P/T1 przedstawiono na fig. 8. Plazmid ten zawiera funkcyjny gen β-laktamazowy.
Przykład VII. Konstrukcja plazmidów dokonujących ekspresji białek S.
Gen pre-S kodujący białko preSl-S2-S (wielkie białko) wirusa Hepatitis B otrzymano jako fragment Ncol-Hindlll z pRIT12816. pRIT12816 jest zwykłym wektorem E. coli opartym na pBR322, zawierającym fragment Ncol-Hindlll o 1185bp kodujący białko preSl-S2-S od NcoI przy kodonie ATG (CCATGG) do Hindlll przy bp 15 poza kodonem stopu TAA (....AAGCTT). Fragment sekwencji kodującej preS1-S2-S otrzymano technikami zwykłego klonowania z pRIT 10616 ujawnionego w zgłoszeniu patentowym europejskim nr A-0278940 oraz w pracy Harforda i innych, 1987. Fragment o 861 bp kodujący sekwencję preS2-S można z niego również wydzielić w zwykły sposób. Fragment Ncol-Hindlll tępo zakończono stosując wypełnianie polimerazą Klenowa, po czym przeprowadzono klonowanie w również tępo zakończone miejsce EcoRI w pMOXP/T1. W wyniku prawidłowego ligowania miejsce EcoRI na początku genu strukturalnego preS1 zostanie zregenerowane na skutek ligowania z tępo zakończonym Ncol/EcoRI. Konstrukcji dokonującej ekspresji genu preS pod kontrolą promotora MOX nadano nazwę pMPS-22. Przedstawiono ją na fig. 8.
Analogicznej konstrukcji zawierającej promotor FMD nadano nazwę pMPS-21.
168 597
Przykład VIII. Konstrukcja wektora zawierającego kasetę ekspresji preS.
Kasetę ekspresji Sall-Asp718 z plazmidu pMPS22 zakończono tępo na drodze wypełniania, po czym dokonano jej insercji wypełnione miejsce Xhol i miejsca Stul w plazmidzie pBC opisanym w przykładzie IV a) powyżej. Uzyskany plazmid, któremu nadano nazwę pMPS-9, przedstawiono na fig. 9.
Przykład IX. Klonowanie genu URA3 Hansenula polymorpha.
Gen URA3 z Hansenula polymorpha kolonowano na drodze komplementacji odpowiedniej mutacji pyrF szczepu MB 1000 E. coli.
Fragmenty genomowego DNA o wielkości w zakresie 6-9 kbp wydzielono na drodze częściowego trawienia za pomocą Sau3A, rozdzielania na niskotopliwym żelu agarozowym i wydzielania odpowiedniej frakcji DNA.
Oczyszczone fragmenty zligowano w jednostko wym miejscu BamHI wektora YRp7, zawierającego sekwencję ulegającą autonomicznej replikacji z Hansenula polymorpha, wstawioną w miejsce SalI. Uzyskaną mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania szczepu MB 1000 E. coli, po czym transformanty wyselekcjonowano na płytkach z pożywką minimum bez uracylu. Uzyskane transformanty poddano analizie, a plazmidy wydzielono. Wydzielono podfragment przedstawiony na fig. 10, który pośredniczył w odtworzeniu fenotypu URA+ w przeprowadzonych za pomocą 5'-monofosforanodekarboksylazy orotydyny mutantach E. coli, Saccharomyces cerevisiae i Hansenula polymorpha. Blotting Southerna powtwierdził, że struktura klonowanego DNA była identyczna ze strukturą genomowego regionu URA3. Mapę restrykcyjną fragmentu genu URA3 Hansenula polymorpha przedstawiono na fig. 10.
Część B
Ekspresja powierzchniowego antygenu Hepatitis B (HBsAg) w Hansenula polymorpha.
Przykład X. Konstrukcja szczepów Hansenula polymorpha zawierających gen S.
Hansenula polymorpha RB 10 transformowano wyżej opisanymi plazmidami pRB-S-269, pRB-S-269-I, pRB-S-271 i pRB-S-271-I. Otrzymano szereg klonów zawierających plazmidy ulegające autonomicznie transformacji (tranformantów) lub zintegrowane obce DNA (integrantów).
Te transformanty/integranty zbadano następnie w celu stwierdzenia, czy występuje w nich ekspresja genu S, metodami immunologicznymi. Zastosowano dwa układy badań: blotting Westerna oraz testy AUSRIA i AUSZYME (Abbott). Wytwarzanie monomeru HBsAg analizowano metodą blottingu Westerna z wykorzystaniem monoklonalnych przeciwciał RF6. Zestawy Abbotta, AUSRIA i AUSZYME zastosowano zgodnie z instrukcjami producenta w celu oceny ilości cząstek HBsAg wytwarzanych w Hansenula. Transformanty wykazujące stabilny i wysoki poziom ekspresji wyselekcjonowano, a ich DNA poddano analizie metodą blottingu Southerna, a następnie rozdzielania elektroforetycznego.
a) Transformanty
Szereg kolonii zawierających swobodnie replikujący plazmid otrzymano z Hansenula polymorpha transformowanego plazmidami pRB-S-269 i pRB-S-271. Analiza Southerna pełnego DNA uzyskanego z tych transformantów, strawionego różnymi endonukleazami restrykcyjnymi wykazała oczekiwany wzór restrykcyjny.
b) Integranty
Hansenula polymorpha można stransformować z dużą częstością wektorami integracyjnymi pRB-S-269-I oraz pRB-S-271-I. Integranty hodowane na pełnej pożywce (YEPD) są mitotycznie trwałe. Alternatywnie mitotyczną trwałość obcego DNA w Hansenula można również uzyskać w wyżej opisany sposób, zgodnie z którym wektor ulegający autonomicznej replikacji, korzystnie plazmid z dużą ilością kopii, taki jak pRB-S-269 lub pRB-S-271, integruje się spontanicznie w genomie. Uzyskane integranty również wykazują wysoką stabilność mitoryczną obcego DNA.
Obydwie wspomniane wyżej metody zastosowano w celu otrzymania szczepów dokonujących wydajnej ekspresji genu S w nieselektywnej, pełnej pożywce. Zachowano 3 szczepy: szczep o numerze identyfikacyjnym 352, który transformowano pRB-S-271, w którym gen Sjest regulowany promotorem FMD oraz szczepy nr 415 i 416, transformowane pRB-S-269 zawierającym gen S regulowany przez MOX; szczepy te zastosowano w kolejnych eksperymentach.
168 597
Przykład XI. Mitotyconw stabilność obcego DNA w imigrantach.
Stabilność oeekdmbindwauych szczepów 352, 415 i 416, zbadano zgodnie z następującą metodyką: szczepy hodowano w nieeelektywuym ośrodku SMR tak, aby uzyskać 40 pokoleń. Z hodowli wydzielono 20 niezależnych kolonii przed i po okresie 40-pdkoleniowym. Strukturę dbecegz DNA oraz ilość kopii kasety ekspresji analizowano w wydzielonych klonach metodą blottingu Sou^ema w kombinacji z elektroforezą na żelu agαedzowym fragmentów restrykcyjnych oraz elektroforezą żelową z gradientem drgającego pola pełnych chrdmozonów. Ta ostatnia technika umożliwia rozdzielanie i analizę chrdmozomów drożdży (Schwartz i Cantor, 1984).
Elektroforeza żelowa w polu drgającym (PFGE).
Komórki szczepów 415, 416 i 352 poddano łagodnej lizie w gnieździe na próbki z 0,7% (wagowo/objętościowo) żelu agαeooowego. Uwolnione in situ chromozomy oddzielono za pomocą urządzenia LKB-Pharmacia Pulsaphde Plus, zgodnie z instrukcjami LKB-Pharmacia. Po PFGE DNA peoeniesidno na nitrocelulozę, zgodnie z procedurą Southerna (1975). Plamę poddano hybrydyzacji z zastosowaniem sond znaczonych 32P, specyficznych dla MOX i/lub genu FMD albo genu URA3 z Hansenulw polymorpha, przy czym wiadomo, że genom zawiera pojedynczą kopię tego ostatniego genu.
Porównanie sygnałów pochodzących z dopuszczalnych multimerycznych integeantów i sygnałów eedudkopidwych genów (markerów wewnętrznych) umożliwiło ocenę ilości kopii związanych kaset ekspresji znajdujących się wewnątrz komórki. Analiza chromozomów metodą PFGE wykazała, że klon 415 zawiera około 30-50 kopii kasety ekspresji, podczas gdy klon 416 zawiera około 5-6 kaset ekspresji, a klon 352 około 10 kaset ekspresji. Analiza wykazała, że obcy DNA jest zintegrowany w genomie Hansen^a.
Analiza Southerna.
Szczepy 352,415 i 416 hodowano przez 40 pokoleń w ośrodku SMR. Z każdej partii wydzielono 12 niezależnych kolonii, przed i po wyżej wspomnianym okresie hodowli. Preparaty DNA z tych sub-klonów poddano analizie Sou^ema po rozszczepianiu różnymi enzymami restrykcyjnymi, z zastosowaniem sond DNA znaczonych 32P. Analiza wzorów restrykcyjnych wykazała, że kasety ekspresji pozostały nienaruszone, oraz że wprowadzony DNA był genetycznie trwały. Analiza potwierdziła ponadto, że genom szczepu 415 zawiera długie powtórki z szeregu kopii plazmidu. Wywnioskowano, że w powtórce takiej występuje połączenie plazmidów typu głowa do ogona.
Przykład XII. Badania ekspresji.
Zeekdmbiudwane szczepy badano rutynowo w celu stwierdzenia obecności HBsAg, metodą blottingu Westerna oraz za pomocą testów AUSRIA/AUSZYME.
a) Wzrost hodowli i blotting Westerna.
Szczepy 352,415 i 416 hodowano w 11 kolbach z 200 ml ośrodka SMR-gliceryna, w temperaturze 37°C, z intensywnym napowietrzaniem. Na początku fwzy stacjonarnej, która charakteryzuje się wyczerpaniem gliceryny, dodano 50 ml/dm3 5-kedtuie stężonego ośrodka SMR bez gliceryny oraz metanol w ilości odpowiadającej jego ostatecznemu stężeni 10g/dm3. Próbki objętości 10 ml pobrano z hodowli przed dodaniem metanolu oraz w 24 godziny po dodaniu metanolu. W celach porównawczych te swmea szczepy hodowano również w ośrodku SMR zawierającym 30 g/dm3 glikozy (depresja promotorów). Komórki zebrano w późnej fwzie dłużyzn.
Z zebranych komórek wykonano surowe ekstrakty białkowe na drodze dyspergowania pastylki komórek odpowiadającej około 0,1 g suchej masy, w 5 ml buforu PE (0,5 M NaCl, 0,1% Triton Χ-100, 10 mM bufor fosforanowy pH 7,5, 2nM PMSF). Dodano w przybliżeniu równą objętość kuleczek szklanych o średnicy 0,45 mm, tak że uzyskano prawie stałą mieszaninę. Mieszaninę intensywnie wytrząsano w ciągu 4 minut w temperaturze 4°C, w hdmogenizatdrze Braun MSK (B. Braun i Diessel Biotech GmbH, Me^u^en, Republika Federalna Niemiec). Następnie dodano 4 ml buforu PE i produkt homogenizacji wymieszano i odwirowano w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C, przy przeciążeniu 40000xg. Próbki po 5-25 μg cieczy znad osadu nanoszono na żel do elektroforezy ^DS-poliakryloamid), stosując jako wzorce kontrolne 0,05-0,5 μg HBsAg. Obecność materiału antygenowego wykazano przenosząc białko na nitrocelulozę, zgodnie z metodyką Towbina (1979), z detekcją mono^o^lnego przeciwciała RF6 w sposób opisany powyżej w metodzie 5a. Blotting Westernw umożliwił dokonanie oceny ilości antygenu wytworzonego w klonach 352,415 i 416, w odniesieniu do znanych ilości czystego HBsAg pochodzącego z drożdży.
168 597
Wyniki zestawino w tabeli 1. W hodowli w kolbach indukowanej metanolem (ośrodek SMR) przy gęstości komórek około 5 g suchej masy/dm^ białko S stanowi około 2-5% całości białka wyesktrahowanego z transformowanych szczepów.
Porównanie ekspresji w komórkach hodowanych w warunkach indukcji (metanol), derepresji (gliceryna) i represji (glikoza) wykazuje ścisłą regulację promotorów MOX i FMD. Ekspresja jest całkowicie zablokowana w komórkach hodowanych na glikozie. W glicerynie poziom syntezy HBsAg stanowi około 30% poziomu uzyskiwanego w komórkach indukowanych.
b) Antygenowość HBs Ag wytworzonogo w wyn^u ekspeesji w Hansenule polymorpaa.
Antygenowość materiału zawartego w surowych ekstraktach oznaczano wykonując test AUSZYME Abbotta oparty na monoklonalnych przeciwciałach. Wyniki podawano w umownych jednostkach (absorbancja przy 492 nm na 0,1 pg białka; rozcieńczanie surowych ekstraktów i reakcję prowadzono w 150 mM NaCl, 25 mM buforze fosforanowym o pH 7,4,0,01 % BSA, 0,01 % Toenn 20). Reaktywność w teście AUSZYME wykazuje obecność koofoomauyjoych eeitoeów charakterystycznych dla cząstek sub-wirusowych.
Tabela 1
Wytwarzanie AgsAg w szczepach z ekspresją genu S
Szczep Promotor Z'ródło węgla HBsAg oceniany metodą blottmgu Westerna, mg/100mg białka HBsAg oceniany w teście AUSZYME, umowne jednostki A492/0,1pg białka
352 FMD glikoza brak sygnału 0,3
gliceryna 0,8-1,2 10,0
metanol 2,5-3,0 25,0
415 MOX glikoza brak sygnału 0,1
gliceryna 1,0-1,5 12,0
metanol 4,0-5,0 45,0
416 MOX glikoza brak sygnału brak sygnału
gliceryna 0,5-0,8 5,0
metanol 2,0-3,0 22,0
c) Wirowanie z gradientem gęstości surowych ekstraktów' H. polymorpha.
Surowe ekstrakty otrzymane zgodnie z metodyką opisaną powyżej poddano wirowaniu z gradientem gęstości, stosując CsCl lub sacharozę jako gradienty. Sedymentacyjne wirowanie gradientowe z równowagą sacharozową wykonywano dodając 100-200pg (200pl) surowego ekstraktu białkowego na wierzch 20-50% gradientu sacharozowego, w 50 mM NaCl, 2mM EDTA, 25 mM NaH2PO 4 o pH 7,2. Probówki o objętości 5 ml wirowano w ciągu 18 godzin z szybkością 40 000 obrotów/minutę w wirniku Beckman SW 50.1.
Wirowanie z gradientem chlorku cezowego przeprowadzano rozcieńczając 1 objętość surowego ekstraktu białkowego 1 objętością 3 M CsCl w 25 mM buforze fosforanowym o pH 7,4. Wirowanie prowadzono w temperaturze 4°C z szybkością 40 obrotów/minutę w wirniku Beckman 50 Ti, w ciągu 40 godzin.
Gradienty poddano frakcjonowaniu, po czym różne frakcje przetestowano z zastosowaniem przeciwciał RF6, metodą blottingu Westerna lub/i z wykorzystaniem testów AUSRIA i/lub AUSZYME. Stwierdzono, że pik materiału ABjAg o gęstości około 1,16-1,19 g/ml tworzy się w gradiencie gęstościowym CsCl. Materiał występujący w tym piku reaguje bardzo dobrze nie tylko z przeciwciałami RF6 w plamach Westerna, ale również w próbie AUSRIA i AUSZYME. Gęstość ta, a także reaktywność w testach AUSRIA/AUSZYME wskazują na obecność konfoi^n^i^c^yjnych epitopów charakterystycznych dla cząstek. Ponadto w kolejnym eksperymencie porównano gęstości uzyskiwanego materiału i jub-oirusooych cząstek wydzielonych z surowicy ludzkiej. Stwierdzono, że obydwa materiały wykazują zbliżone gęstości przy izopiknometoycznym wirowaniu w roztworach CsCl.
Przy wirowaniu surowych ekstraktów z gradientem sacharozowym uzyskano frakcje pików reagujące z AUSRIA i AUSZYME, zawierające co najmniej 80% AgsAg, na co wskazuje analiza frakcji gradientowych prowadzona równolegle z AUSRIA/AUSZYME i blottmgiem Westerna.
168 597
Stwierdzono, że pozostałe 20% materiału znajduje się w wierzchnich i spodnich frakcjach gradientu i wykazuje reaktywność tylko przy analizie metodą blottingu Westerna, co oznacza, iż materiał ten stanowi monomeryczna forma białka. Analiza frakcji pikowych uzyskanych z gradientów CsCl również potwierdziła, że co najmniej 80% materiału tworzy cząstki.
Cząstki pochodzące z Hansenula są odporne na proteolizę. Inkubacja surowych ekstraktów białkowych zawierających cząstki w ciągu kilku godzin w różnych temperaturach wykazała jedynie bardzo mały stopień degradacji, co stwierdzono analizując wielkości AUSZYME oraz badając stopień nienaruszenia polipeptydu z wykorzystaniem denaturacji w SDS-PAGE, a następnie blottingu Westerna. Materiał analizowano również metodą mikroskopii elektronowej. Obrazy z mikroskopu elektronowego wyraźnie pokazują obecność cząstek o średnicy około 22 nm.
Wyżej opisane wyniki uzyskano w przypadku wszystkich 3 szczepów, 352, 415 i 416.
Część C
Ekspresja białka preSl-Sl-S w Hansenula polymorpha
Przykład XIII. Konstrukcja szczepów Hansenula polymorpha zawierających gen preS1-S2-S.
Hansenula polymorpha RB 10 transformowano fragmentem Pvul-Asp718 o 5570 bp, pochodzącym z pMPS-22, obejmującego gen URA3 i gen preS1 pod kontrolą promotora MOX (patrz fig.8). Odpowiedni fragment zawierający gen preS1 pod kontrolą promotora FMD (delecja -9) otrzymano ponadto z plazmidu pMPS-21. Stwierdzono, że integranty uzyskane z tych transformacji zawierają 1-2 kasety ekspresji, co wykazała analiza metodą Southerna. Integrantom zawierającym gen preS1 pod kontrolą promotora MOX nadano nazwę preS-AM, a integrantom zawierającym gen preS pod kontrolą promotora FMD nadano nazwę preS-AF.
Integranty zawierające szereg kaset ekspresji uzyskano wykonując transformację Hansenula polymorpha autonomicznie replikującymi plazmidami pMPS22 i pMPS21, zawierającymi sekwencję HARS. Integranty powstały w wyniku samorzutnej integracji tych plazmidów, jak to opisano w części „Materiały i metody, punkt 2b. Tego typu integrantom (transformantom) nadano ogólną nazwę preS-BM (promotor MOX) oraz preS-BF (promotor FMD).
Szczepy preS-AM-405, preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-BM-454, w których ekspresja genu preS1 jest kontrolowana przez promotor MOX, zachowano do dalszej analizy.
2. Stabilność mitotyczna.
Stabilność mitotyczną obcego DNA występującego w 4 szczepach zidentyfikowanych w przykładzie XIII powyżej zbadano wykonując analizę Southerna 12 niezależnych subklonów wydzielonych przed i po okresie hodowli przez 40 pokoleń, w sposób opisany w części B. Analiza potwierdziła genetyczną stabilność zintegrowanych wektorów (patrz również przykład XVI w części D).
3. Ekspresja białka preS w Hansenula polymorpha.
Szczepy preS-BM-402, preS-BM-403, preS-AM-405 i preS-BM-454 hodowano w ośrodku SMR zawierającym glicerynę, a następnie prowadzono indukowanie komórek metanolem (10g/dm3) dokładnie w taki sam sposób, jak to opisano w części B. Komórki zebrano po 25 godzinach od dodania metanolu, po czym przygotowano surowe ekstrakty w sposób opisany w części B.
a) Ilości po 12pg surowych ekstraktów ze szczepów preS-BM-402, preS-AM-405 i preS-BM454 analizowano wykonując najpierw elektroforezę na poliakryloamidowym żelu SDS, a następnie blotting Westerna z zastosowaniem mieszaniny monoklonalnych przeciwciał (S1.1, S2.2 i S2.5), w sposób opisany w „Metody 5(a)“. Obydwa typy szczepów wykazały obecność podwójnego pasma antygenowego przy 38/39 kD oraz dodatkowego pasma przy 45 kD.
Szczep preS-AM-405 wykazał mniejszą zawartość składników 45 kD w stosunku do składników 39 kD niż szczep preS-BM-402. Szczep preS-BM-454 wykazał największą względną zawartość składników o 45 kD.
Profil elektroforetyczny białka preS z powyższych szczepów porównano z antygenem pochodzącym z cząstek z ludzkiej surowicy. Z porównania plam Westerna wynika, że preparaty, zarówno ludzki jak i drożdżowy, wykazują pasmo przy około 38/39 kD.
b) Zaobserwowano również różne poziomy ekspresji w przypadku różnych szczepów. Różnice te są spowodowane przede wszystkim różnicami w liczbie kopii kasety ekspresji między szczepami.
168 597 29
Na podstawie blottingu Westerna oceniono, że antygen preS stanowi 0,1-1,5% całości białka komórkowego w różnych szczepach preS-A i preS-B, jak to przedstawiono w tabeli 2.
Na surowych ekstraktach wykonano również test AUSZYME w celu zbadania obecności cząstek. Wyniki zamieszczone w tabeli 2 wykazują bardzo małą reaktywność podaną w jednostkach A492 na 0,1 pg białka.
Tabela 2
Ekspresja preS w H. polymorpha
Klon Zawartość białka preS oceniana metodą Blottingu Westerna mg preS1/100mg AUSZYME jednostki A492 na 0,1 pg białka
preS-AM-405 0,1-0,2 0,01
preS-BM-402 0,3-0,5 0,02
preS-BM-403 0,4-0,6 0,02
preS-BM-454 1,2-1,5 0,1-0,2
c) Glikozylowanie: Szczep preS-BM-453 charakteryzujący się wysoką produkcją białka preS (około 1,5% całości białka komórkowego) oraz silnym pasmem 45 kD wybrano do badań glikozylowania. Białko preS z preS-BM-454 analizowano prowadząc inkubację surowych ekstraktów białkowych z endoglikozydazą EndoH. Uzyskane wyniki wyraźnie wskazują, że materiał 45kD stanowi glikozylowaną formę białka preS.
W wyniku inkubacji 45 pg surowego białka w ciągu 0,5,1,0 i 24 godzin z 0,5 mU endoglikozydazy EndoH, zgodnie z instrukcjami producenta (Boehringer Mannheim, Republika Federalna Niemiec), nastąpiło przesunięcie pasma 45 kD do pozornej masy cząsteczkowej 42 kD. To przesunięcie oznacza, że materiał 45 kD stanowi N-glikozylowaną formę białka preS, zawierającą jedną grupę „rdzeniową o około 3000 D.
Do badania glikozylowania białka preS w Hansenula polymorpha wykorzystano również tunikamycynę, znaną jako silny inhibitor N-glikozylowania. Szczep preS-BM-454 hodowano do uzyskania gęstości A60o=10,0, w ośrodku YNB zawierającym glikozę (10 mg/dm3). Porcją 10 ml tej hodowli zaszczepiono 100 ml YNB zawierającego 10g/dm3 metanolu oraz 50 gg/ml tunikamycyny. pH ośrodka utrzymywano na stałym poziomie 7,2-7,5. Doświadczenie kontrolne prowadzono bez dodatku tunikamycyny. Komórki zbierano po 10, 15 i 30 godzinach od momentu zaszczepienia ośrodka zawierającego tunikamycynę.
Surowe ekstrakty białkowe analizowano metodą blottingu Westerna. Badania wykazały, że w komórkach hodowanych w obecności tunikamycyny widoczne jest pojedyncze pasmo przy 42 kD oraz podwójne pasmo przy 38/39 kD. W doświadczeniu kontrolnym pasmo 24 kD zostało zastąpione przez pasmo 45 kD. Podobne wyniki uzyskano w przypadku ekstraktów ze szczepów preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-AM-405, które jednak wytwarzają znacznie mniejsze ilości partii białka o 45 kD (nie więcej niż 5-10% całkowitego zsyntetyzowanego białka; preS). Wyniki te sugerują, że pasmo 42 kD reprezentuje O-glikozylowaną formę białka preS.
d) Wirowanie z gradientem gęstości.
Surowe ekstrakty szczepu preS-AM-405 oraz szczepów preS-BM-402, preS-BM-403 i preSBM-454 poddano analizie metodą gradientowego wirowania z sacharozą i CsCl. Warunki wirowania podano w przykładzie XII (c), część B. Frakcje gradientowe badano metodą blottingu Westerna i testów AUSZYME.
Analiza potwierdziła, że w przeciwieństwie do szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji antygen S (część B) albo zarówno antygeny preS1 jak i S (część D), szczepy preS nie wytwarzają wydajnie cząstek sub-wirusowych. Ani przy izopiknometrycznym wirowaniu z CsCl, ani przy gradientowym wirowaniu z sacharozą nie zaobserwowano tworzenia się pasma o wymaganej gęstości. Potwierdziło to również fakt, że materiał zbliżony do HBsAg z frakcji gradientowych oraz surowe ekstrakty źle reagują w testach AUSRIA i AUSZYME.
168 597
Część D
Wytwarzanie cząstek kompozytowych zawierających zarówno antygeny preS i jak i S.
Przykład XIV. Konstrukcja szczepów.
Skonstruowano szereg szczepów charakteryzujących się różnymi stosunkami ekspresji preS1 do S oraz różnymi całkowitymi poziomami ekspresji.
Różnice te osiągnięto zmieniając się liczbę kopii kaset ekspresji przypadających na genom. Dodatkową zmienność uzyskano umieszczając geny pod kontrolą tht różnych promotorów Hansenula.
Trzy podstawowe typy szczepów rekombinantowych uzyskano w następujący sposób:
a) Szczepy zawierające jedną kopię genu preS1 oraz jedną kopię genu S (szczepy A).
Fragment DNA Nhel o 6,6 kb, zawierający kasetę preS1 oraz gen URA3 wydzielono z plazmidu pMPS9 (fig. 9). Fragment DNA Nhel zawierający gen S wydzielono z plazmidu pMPS2 (fig. 5). Fragmenty zligowano następnie stosując ligazę T4 DNA, po czym połączone fragmenty zawierające po jednej kopii każdego z genów wydzielono z żeli agarozowych. Fragmenty te zastosowano do transformowania szczepu RB 10 Hansenula polymorpha aż do osiągnięcia niezależności od uracylu.
Uzyskane transformanty analizowano metodą blottingu Southerna, selekcjonując następnie klony zawierające po jednej zintegrowanej kopii każdej kasety. Szczep preS/Λ-A-293 zachowano do dalszej analizy.
b) Szczepy zawierające jedną kasetę ekspresji preS oraz szereg kaset ekspresji S (szczepy B).
Hansenula polymorpha stransformowano fragmentem Asp718-Pvul o 5570 bp, z pMPS-22 zawierającego kasetę ekspresji preS1. Wyselekcjonowano transformanty zawierające jedną zintegrowaną kopię kasety. Uzyskanym szczepem byą preS-AM-405 opisany w części C, przykład XIII, powyżej.
Szczep preS-AM-405 stransformowano następnie plazmidami ulegającymi autonomicznie replikacji pRB-S-322 (promotor MOX) lub pBR-S-326 (promotor FMD) (fig. 7), zawierającymi gen S pod kontrolą odpowiednich promotorów. Obydwa plazmidy dodatkowo zawierają gen kodujący odporność na gentamycynę G418 jako selektywny marker. Gen Kan jest pod kontrolą promotora ADH1 z Saccharomyces cerevisiae (fig. 1), jak to opisano powyżej. W wyniku transformacji uzyskano szereg szczepów zawierających w każdym przypadku jedną zintegrowaną kopię kasety preS1 oraz szereg zintegrowanych kopii (30-100) kasety zawierającej gen S, co wykazały analizy metodą blottingu Southerna i PFGE.
Szczepy preS/S-B-431, preS/S-B-432 i preS/S-B-433 zachowano do dalszej analizy. Szczep preS/S-B-431 przenosi gen S kontrolowany promotorem MOX, podczas gdy szczepy preS/S-B-432 i preS/S-B-433 zawierają kasety ekspresji obejmujące promotor FMD.
c) Szczepy zawierające szereg kaset ekspresji zarówno genu S jak i genu preS (szczepy C).
Hansenula polymorpha stransformowano plazmidem pMBS-22 ulegającym autonomicznie replikacji, zawierającym gen preS-1 (fig. 8). W wyniku transformacji uzyskano szereg szczepów zawierających zmienne ilości kaset ekspresji zintegrowanych w jednym genomie. Izolaty zawierające 2-20 kaset ekspresji preS1 zidentyfikowano metodą blottingu Southerna. Szczepy te opisano w części C jako preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-BM-454, wytwarzają w wyniku ekspresji różne ilości antygenu preS. Takie szczepy preS stransformowano następnie ponownie plazmidami ulegającymi autonomicznie replikacji, pRB-S-322 (promotor MOX) i pRB-S-326 (promotor FMD), zawierającymi gen S (fig. 7). Jako marker transformacji zastosowano odporność na G418. W wyniku selekcji stabilnych integrantów uzyskano szereg klonów w przypadku każdej z transformacji, przy czym część z nich poddano dalszej analizie. Do dalszej analizy zachowano następujące szczepy: preS/S-C-452, preS/S-C-465 pochodzący ze szczepu preS-BM-402, szczep preS/S-C-466 pochodzący ze szczepu preS-BM-403, szczep preS/S-C-448-C4 pochodzący ze szczepu preS-BM454, w którym kasety ekspresji gen S zawierają promotor FMD. W tabeli 3 przedstawiono szczegółowe informacje dotyczące pochodzenia i przeznaczenia wyżej wymienionych szczepów.
168 597
Tabela 3
Charakterystyka szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji zarówno białko preS jak i S
Szczep Szacunkowa liczba kaset preS Szacunkowa liczba kaset S Ekspresja całkowita preS/S (Western/ /mg/100 mg Reaktywność z AUSZYME jednostki umowne A492 Szacunkowy stosunek preS/S na podstawie immunoblottingu
preS/S-A-293 1 1 ok. 0,3-0,4 5,0 ok. 1:1
preS/S-B-431 1 ok.10 1,5-2,0 10-15 ok. 1:15
preS/S-B-432 1 ok.10-15 2,5-3,0 10-20 ok. 1:15
preS/S-B-433 1 ok.20 2,0-2,5 10-15 ok. 1:20
preS/S-C-452 kilka ok.30-50 3,0-4,0 20-30 ok. 1:8
preS/S-C-453 kilka 30-60 3,5-4,5 15-25 ok. 1:10
preS/S-C-465 kilka 30-50 3,5-4,5 25-35 ok. 1:5
preS/S-C-466 kilka 50-80 3,5-4,5 25-35 ok. 1:8
preS/S-C-448-C4 20-30 10-20 3,0-3,5 10-20 ok. 5:3
x Liczby reprezentują najmniejsze i największe wielkości wyznaczone dla danego szczepu.
Przykład XV. Ekspresja białek preS i S w H. polymorpha.
Ekspresję białek preS i S w różnych stransformowanych szczepach H. polymorpha zbadano metodą immunoblottingu opisaną w części „Materiały i metody, 5a“ oraz testu AUSZYME. Podsumowanie wyników i właściwości różnych zbadanych szczepów podano w tabeli 3.
Szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji zarówno białko preS jak i S hodowano i indukowano w sposób opisany w przykładzie XII, część B, z tym że objętość hodowli wynosiła 30 ml. Surowe ekstrakty komórkowe przygotowano w sposób opisany powyżej i poddawano je elektroforezie na żelu SDS-poliakryloamidowym, a następnie blottingowi Westerna z wykorzystaniem do detekcji RF6 lub mieszanych przeciwciał monoklonalnych S1.1 i S2.1. ^^-15^g surowych ekstraktów z indukowanych metanolem komórek szczepów preS/S-A-293, preS/S-B-431, preS/S-B-432, preS/S-B-433, preS/S-C-453, preS/S-C-465, preS/S-C-466 i preS/S-C-448-C4 poddawano immunoblottingowi stosując do detekcji monoklonalny RF6. Analiza ta wykazała, że można uzyskać cały zakres szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji białka preS i S w różnych stosunkach. Na podstawie tych i innych pomiarów immunoblottingowych oszacowano, że stosunek białka preS do S w przypadku szczepu preS/S-B431 wynosi około 1:15, w przypadku szczepu preS/S-B-431 wynosi około 1:15, w przypadku szczepu preS/S-C-452 około 1:8, a w przypadku szczepu preS/S448-C4 około 5:3. Stwierdzono również, że szczepy różnią się poziomem wytwarzania białek, na co wskazują wyniki zarówno immunoblottingu jak i testu AUSZYME, przedstawione w tabeli 3. Dokonano także immunoblottingu ekstraktów komórkowych z tych szczepów z wykorzystaniem do detekcji monoklonalnego S1.1. W przypadku większości szczepów białko preS wykryto w postaci podwójnego pasma białkowego przy 38-39 kD z mniejszymi ilościami pasma 45 kD (które, jak to oszacowano, stanowi zaledwie około 5% całości wykrytego białka preS). W przeciwieństwie do powyższego szczep preS/S-C-448-C4 wytwarza w wyniku ekspresji w przybliżeniu takie same ilości materiałów o 38-39 kD i 45 kD.
Przykład XVI. Stabilność obcego DNA.
Stabilność obcego DNA w wyżej opisanych transformantach i integrantach preS/S analizowano w sposób opisany w części B. Badania wykazały bardzo dobrą stabilność mitotyczną zrekombinowanych klonów. Analiza Southerna 12 niezależnych kolonii wydzielonych przed i po 40-pokoleniowej fermentacji szczepów preS/S-453 i preS/S-431 wykazała, że we wszystkich przypadkach zaobserwować można ten sam wzór fragmentów restrykcyjnych. Szczepy zestawione w tabeli 3, perS/S, analizowano ponadto metodą elektroforezy gradientowej w polu drgającym. Dokonano blottingu wydzielonych chromozomów na membranach nitrocelulozowych, po czym hybrydyzowano je z różnymi sondami radioaktywnego DNA. Procedura taka umożliwia oszacowanie ilości kopii kasety ekspresji S. Potwierdziła ona ostatecznie, że szczepy preS/S są integrantami. Wyniki tych eksperymentów zestawiono w tabeli 3 powyżej.
168 597
Przykład XVIII. Wydzielanie i charakteryzowanie kompozytowych cząstek. w) Częściowe oczyszczanie kompozytowych cząstek z Hansen^a polymorpha.
Hodowlę z fermeutαtorα, szczep peeS/S-B-431 Hansen^a pdlymdrpha, hodowano w ośrodku
S opisanym powyżej w Materiałach, 5d, po czym komórki oddzielono przez odwirowanie, po 78-godziuuce indukcji metanolem. Pastylkę komórek ponownie zawieszono do uzyskania stężenia około 120 g suchej masy komórek/dm3, w buforze zawierającym 0,5% (wagowo/objętościowych) Tween 20, 2mM EDTA, 4mM PMSF, 5% (objętościowych) ^propanolu i 50 mM bufor z fosforanu sodowego, o pH 9,0. Komórki rozbito w młynie perełkowym (Dynomill Type KLD, Bachofen AG, Bazylea, Szwajcaria) zawierającym perełki szklane o średnicy 0,45-0,7 mm, wykonując 4 przejścia z szybkością przepływu 6 dm^godzinę przy czasie przebywania w komorze 7 minut.
Ekstrakt komórkowy wyklarowano w wyniku wirowania przez 45 minut przy przeciążeniu 16000g, w temperaturze 4°C, po czym ciecz znad osadu oddzielono.
Do cieczy znad osadu dodano 1% (wagowo-objętościowy) krzemionki koloidalnej (Aerosil 380, Degussa, Frankfurt, Republika Federalna Niemiec) i całość mieszano przez noc w temperaturze 4°C w celu doprowadzenia do adsorpcji HBsAg. Krzemionkę odwirowano w ciągu 30 minut przy 4000 g w temperaturze 4°C, po czym dwukrotnie przemyto 0,9% (wagowo-objętościowych) NaCl stosując ponowne dyspergowanie pastylki i ponowne wirowanie. HBsAg oaadsorbowαny na krzemionce zdesorbdwano w wyniku ponownego zawieszenia przemytej pastylki w 10 mM pirofosfora^e sodowym o pH i inkubowanie w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C, z mieszaniem. Bufor z pirofosforwnu sodowego dodano w objętości stanowiącej około 1/8-1/10 początkowej objętości wyklarowanego ekstraktu komórkowego. Roztwór odwirowano przez 60 minut w temperaturze 4°C przy 17 000g, po czym ciecz znad osadu oddzielono.
Do cieczy znad osadu dodano CsCl do uzyskania stężenia 1,5 M, po czym mieszaninę wirowano do uzyskania równowagi iodpikuometeycznej, w ciągu 70 godzin z szybkością 45 000 obrotów uw minutę, w wirniku 50.2 Ti (Spinco D^sion, Beckmwn Instruments, Palo Alto, St. Zjedn. Amer.). Uzyskane gradienty CsCl rozfeakcednowano, po czym frakcje poddano analizie w celu wykrycia obecności HBsAg, z wykorzystaniem zestawu Elisa (Enzygnost, Behring-Werke AG, Marburg, Rep. Feder. Niemiec), w sposób podany przez producenta. Frakcje pikowe połączono i dializowano względem 10 mM fosforanu sodowo/potasowego, 0,15 M NaCl, pH 6,8. Testy wykonane z tym materiałem oraz z surowym ekstraktem komórkowym wykazały, że przy zastosowaniu tej metodyki odzyskuje się 48% całości materiału reaktywnego według AUSRIA, mniej niż 3% całości biwłek, mniej niż 0,2% całości cukrów oraz mniej niż 2% całości lipidów.
Pastylkę komórek szczepu preS/S-C-452 HwuscuuIw po^mio^ha ekstrahowano również w dokładnie taki sam sposób, uzyskując podobne wyniki.
Próbki częściowo oczyszczonych preparatów HBsAg ze szczepów preS/S-B-431 i preS/S-C452 analizowano metodami elektroforezy żelowej i immunoblottingu z zastosowaniem moudkldnwli HBS1 i S1.1 jako detektorów HBsAg-pdddbnych białek, w sposób opisany w przykładzie XVII, poniżej.
Immunoblotting z mdndklonalnymi HBS1 wykazał obecność reaktywnego pasma przy 24 kD, a ponadto pasma o około 38/39 kD w obydwu preparatach. Immunoblotting z mono^o^lnym S1.1 doprowadził do wykrycia jedynie białka preS1-pokrewnego w paśmie 38/39 kD, w obydwu preparatach.
Badania te wykazały, że zarówno białka preS1 jak i białka S ulegają współdcoysocoaniu nw drodze adsorpcji na krzemionce koloidalnej oraz izopikuometrycznegd wirowania z gradientem gęstości CsCl.
b) Wirowanie kompozytowych cząstek z gradientem gęstości CsCl.
Pobraną z fermentatdea hodowlę szczepu preS/S-B-431 H. polymdrphα hodowano w ośrodku S (Materiały, 5d), przy czym zbioru dokonano po 73 godzinach indukcji metanolem. Pastylkę komórek oddzieloną po wirowaniu ponownie zawieszono, po czym ekstrakt komórkowy oddzielono w wyniku przepuszczania zawiesiny przez prasę Frech Press, w sposób opisany poniżej. Okruchy komórek usunięto z pokruszonego lizatu na drodze wirowania przez 30 minut przy 17 000 g. Surowe ekstrakty komórkowe wirowano do stanu równowagi przy 245 000 g, 1,5 M CsCl, w roztworze soli buforowanym fosforanem do pH 7,5. Gradienty edzfeakcedndwauo, po czym
168 597 przeprowadzono analizę każdej z frakcji pod kątem antygeniczności, stosując testy ELISA (Enzygnost: Behringwerke AG, Marburg, Rep. Feder. Niemiec) specyficzne względem HBsAg oraz względem białka preS 1. W testach Enzygnost oznacza się tylko cząstki zgrupowanego HBsAg, a nie monomery białkowe. W teście Elisa specyficznym względem białka preSł stosuje się mysie monoklonalne przeciwciało S1.1 do wychwytywania i detekcji antygenu, opisane poniżej w przykładzie XVIII, część D.
Szczytową aktywność HBsAg zaobserwowano przy gęstości 1,18-1,19 g/cm3, w gradiencie CsCl. Podstawowy pik białka preS1 zaobserwowano przy tej samej gęstości, wraz z pikiem ubocznym przy gęstości 1,26 g/cm3.
Gradientowe frakcje analizowano również pod kątem obecności białka preS1 i białka S, metodą immunoblottingu. Po elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodowym, zgodnie z Laemmli'm (1970) i blottingu na nitrocelulozie, Towbin i inni, 1979, arkusz nitrocelulozy inkubowano z poliklonalną surowicą króliczą nastawioną na HBsAg pochodzący z surowicy. Detekcję wiązania przeciwciał wykonywaną metodą fosfatazy alkalicznej.
Zaobserwowano podstawowe pasmo białka przy 24 kD odpowiadające białku S oraz podwójne pasmo przy 38/39 kD. Maksymalną aktywność immunoblottingu w przypadku wszystkich trzech rodzajów białek zaobserwowano w przypadku frakcji z gradientu CsCl o gęstości 1,181,19 g/dm3, co odpowiada pikowi aktywności HBsAg ustalonemu w teście Enzygnost. Oznacza to, że większość białek powierzchniowego antygenu HBV w surowym ekstrakcie występuje w strukturach lipoproteinowych o gęstości charakterystycznej dla HBsAg.
Kolejny arkusz nitrocelulozowy inkubowano z mysim monoklonalnym przeciwciałem S1.1. Przeciwciało to wykrywało jedynie pasma białek przy 38/39 kD, we frakcjach odpowiadających gęstości CsCl 1,18-1,19 g/cm3. Surowe ekstrakty komórkowe poddano także strefowemu przy gradiencie sacharozy. Surowe ekstrakty komórkowe naniesiono na 5-20% (wagowo-objętościowo) gradienty sacharozy przygotowane w 50 mM buforze Tris-HCl o pH 8,1, po czym wirowano przy 288 000 g w ciągu 200 minut. Gradienty rozfrakcjonowano, po czym frakcje analizowano pod kątem obecności HBsAg z wykorzystaniem testu Enzygnost Elisa oraz pod kątem obecności HBsAg zawierającego białko preS1, wychwytując antygen przeciwciałami specyficznymi dla HBsAg, z testu Enzygnost i dokonując detekcji za pomocą Mab S1.1 specyficznego względem białka preS 1. Test Enzygnost wykazał obecność piku o aktywności HBsAg sedymentującego przez gradient.
Mab. 1.1 Elisa wykazał obecność tego samego piku, co test Enzygnost, ale z „ramieniem aktywności rozciągającym się do większych gęstości sacharozy. To ramię materiału o większym współczynniku sedymentacji zostaje wyeliminowane, gdy surowe ekstrakty ze szczepu preS/S-B431 Hansenula polymorpha częściowo oczyszcza się metodą adsorpcji/desorpcji na krzemionce koloidalnej i odwirowuje się z gradientem CsCl przed wirowaniem z gradientem gęstości sacharozy. Wyniki te wykazują, że HBsAg i białko preS1 ulegają współsedymentacji w gradientach gęstości CsCl i wykazują charakterystykę gęstości cząstek lipoproteinowych.
c) Antygenywość komkozytowych ccąstck HBsAg wytworzooyzo w wyniku ekspresji es H. pol^o^ha.
Cząstki powierzchniowego antygenu HBsAg z surckegc ekstraktu szczepu preS/S-B-431 H. pclrmorpha oczyszczono częściowo w sposób opisany powyżej w punkcie a. Preparat ten badano pod kątem reakcji z mysimi przeciwciałami mono^o^lnym (Mabs) skierowanymi przeciw epitopom zlokalizowanym w regionach preS1, preS2 i S białka powierzchniowego antygenu oraz pod kątem obecności receptora polimerów albuminy z ludzkiej surowicy (receptora pHSA) w regionie preS2.
C1. Reakcja z MabSl.
Mysie monklona^ przeciwciało (Mab) S1.1 skierowanie przeciw epitopowi preS1 białka powierzchniowego antygenu HBV zastosowano w celu wykrywania obecności tego miejsca na cząstce kompozytowej, w teście ELISA. Za pomocą MabS1.1 powleczono zagłębienia płytki do mikrcmiaeckaeia (Immunoplate I; Nunc, Gibco Europe, Ghent, Belgia), po czym prowadzono inkubację z częściowo oczyszczonym surowym ekstraktem. Po przemyciu w celu usunięcia nie związanego materiału wychwycenie reaktywnych cząstek potwierdzono prowadząc inkubację z MabS.1 sprzężonym z peroksydazą chrzanową, metodą Wilsona i Nakame, 1978.
168 597
Wywoływanie barwne potwierdzające wiązanie drugiego przeciwciała wykonano stosując o-fenylenodiaminę jako chromogen. Absorbancję mierzono przy 490 nm (względem filtru wzorcowego przy 620 nm) w urządzeniu Intermed Immunoreader, NJ 2000 (Analis, Ghent, Belgia).
Częściowo oczyszczony ekstrakt szczepu preS/-S-B-431 H. polymorpha dawał reakcję dodatnią w próbie, świadczącą o wychwytywaniu i wiązaniu MabS1.1 wykazującemu specyficzność względem regionu preS1. Oczyszczone cząstki powierzchniowego antygenu zawierające jedynie białko S, z S. cerevisiae RIT4376 (Harford i inni, 1987) nie dawało reakcji w tym teście.
C2. Reakcja z MabS2.5
Mysie monoklonalne przeciwciało S2.5 jest skierowane przeciw regionowi preS2 powierzchniowego antygenu HBV. To Mab zastosowano w teście ELISA w celu stwierdzenia obecności epitopu preS2 na cząstkach kompozytowych. Za pomocą MabS2.5 powleczono zagłębienia płytki do mikromianowania, po czym prowadzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem komórkowym z H. polymorpha preS/S-B-431. Wiązanie antygenu potwierdzono na drodze inkubacji z MabS2.5 sprzężonego z peroksydazą chrzanową oraz barwnego wywoływania w sposób opisany powyżej. W przeprowadzonym teście częściowo oczyszczony ekstrakt komórkowy z H. polymorpha preS/S-B-431 dawał reakcję dodatnią, co wskazywało na obecność epitopu regionu preS2 na cząstkach powierzchniowego antygenu. Cząstki powierzchniowego antygenu zawierające wyłącznie oczyszczone białko S z S. cerevisiae RIT4376 nie dawały reakcji w tej próbie.
C3. Reakcja z Mabs RF1 i S1.1 (HRP).
Mysie monoklonalne przeciwciało RF1 (H. Thomas, Royal Free Hospital, Londyn), skierowane przeciw epitopowi zależnemu od konformacji, zlokalizowanemu w regionie S, zastosowano w teście ELISA. Mab ten zastosowano do powlekania zagłębień płytkach do mikromianowania, po czym prowadzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem szczepu preS/S-B-431 H. polymorpha. Wiązanie cząstek potwierdzono na drodze inkubacji Mab S1.1 sprzężonego z peroksydazą chrzanową, w sposób opisany w części C1 powyżej. Częściowo oczyszczony ekstrakt H. polymorpha dawał w tej próbie reakcję dodatnią, podczas gdy oczyszczone cząstki powierzchniowego antygenu z S. cerevisiae RIT4376 nie dawały reakcji.
C4. Test dotyczący receptora pHSA.
Test wykrywania z receptora pHSA obecnego w regionie preS2 wykonano zgodnie z procedurą Pontisso i innych (1983).
Polimeryzowaną albuminą z ludzkiej surowicy pokryto zagłębienia w płytce do mikromianowania, po czym prowadzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem komórkowym szczepu preS/S-B-431 H. polymorpha. Po przemyciu w celu usunięcia nie związanego materiału cząstki wychwycone na płytce wykrywano prowadząc inkubację z poliklonalnymi przeciwciałami króliczymi przeciw-HBsAg, znaczonymi J125 (zestaw AUSAB). Częściowo oczyszczony ekstrakt z H. polymorpha daje w tej próbie reakcję dodatnią, podczas gdy oczyszczony HBsAg z S. cerevisiae RIT4376 nie daje reakcji w tej próbie.
Powyższe wyniki wykazały, że HBsAg-reaktywny materiał występujący w częściowo oczyszczonym ekstrakcie z H. polymorpha zawiera miejsca antygenowe specyficznie wiązane przez Mabs skierowane przeciw epitopom w regionach preS1, preS2 i S powierzchniowego antygenu HBV oraz że materiał ten zawiera również miejsce reagujące z pHSA.
d) Immuno-strącanie cząstek kompozytowych.
W celu stwierdzenia, czy materiał reaktywny w teście AUSRIA, występujący w częściowo oczyszczonym ekstrakcie szczepu preS/S-B-431 H. polymorpha zawierał cząstki kompozytowe, przeprowadzono immuno-strącanie z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla białka preS1.
Immonokompleksy wychwycono przez utrwalone formaliną komórki Staphylococcus aureus (Staph A) (Immunoprecipitin, BRL, Gaithesburg, MD, St. Zjedn. Amer.), stosując przeciwmysią surowicę królika jako przeciwciało przekładkowe między przeciwciałem monoklonalnym i komórkami Staph A. Komórki Staph A poddano wstępnej obróbce, zgodnie z zaleceniami dostawcy, po czym ponownie zawieszono uzyskując 10%o (wagowo-objętościowo) zawiesinę w PBS. Staph A komórki (120pl 10%o wag.-objęt. zawiesiny) inkubowano następnie z 20pl przeciwmysiej surowicy króliczej (RAM) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Kompleks Staph A-Ram odwirowano, przemyto dwukrotnie PBS zawierającym 0,1% objęt. Tween 20 i na koniec ponownie zawieszono do uzyskania około 10%o (wag.-objęt.) zawiesiny w PBS zawierającym 0,1% objęt. Tween 20.
168 597
Do częściowo oczyszczonego preparatu cząstek szczepu preS/S-B-431 H. polymorpha, otrzymanych w sposób opisany powyżej oraz do próbek cząstek HBsAg pochodzącego z drożdży białka S (partia HB193, Smith Kline Biologicals, Rixensart, Belgia), z których każdy zawierał po 2pg materiału reaktywnego w teście AUSRIA, w 500pl, dodano 1 pl MabS 1.1 (638pg białka na ml) mieszaniny inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Z kolei dodano 20 pl kompleksu Staph A-RAM i inkubację kontynuuowano przez noc w temperaturze 4°C. Utworzone immunokompleksy odwirowano, przemyto 5 razy PBS zawierającego 0,1% objęt. Tween 20 i raz samym PBS, przed ponownym zawieszeniem pastylek w buforze do prowadzenia elektroforezy na SDS-żelu poliakryloamidowym. Wytrącone immuno-osady analizowano metodą immunoblottingu w sposób opisany poniżej, stosując mysie monoklonalne przeciwciało RF6 (H. Thomas, Royal Free Hospital, Londyn) do wykrywania składników zawierających białko HBsAg. Monoklonalne przeciwciało RF6 skierowane jest przeciw epitopowi odporności na denaturację i redukcję w HBsAg pochodzącym z plazmy i konkuruje w wiązaniu z monoklonalnym HBS1.
Immunoblotting wykazał, że immuno-strącenia uzyskane z cząstek H. polymorpha preS/S-B431 zawierały nie tylko białko preS 1. ale również białko SI, podczas gdy immuno-strącenia z HBsAg pochodzącego z Saccharomyces nie zawierały białka S.
Potwierdza to, że kompozytowe cząstki o mieszanym składzie polipeptydowym występują w oczyszczonym częściowo materiale z esktraktów komórkowych szczepu preS/S-B-431 H. polymorpha.
e) Mikroskopia elektronowa.
Częściowo oczyszczone cząstki HBsAg ze szczepu preS/S-B-431 H. polymorpha zbadano w mikroskopie elektronowym. Materiał rozcieńczono 20 mM buforem Tris-HCl o pH 8,2, z 0,1% wag.-objęt. albuminy z surowicy bydlęcej, po czym osadzono na siarkach miedziano-rodowych pokrytych błoną z celloidyny, przed barwieniem octanem uranylu. Obserwacje w mikroskopie elektronowym wykazały obecność sferoidalnych lub kulistych cząstek o przeciętnej średnicy 27 nm. Wielkość ta leży w zakresie przeciętnej średnicy cząstek zmierzonej w ten sam sposób dla szeregu oczyszczonych preparatów HBsAg ze szczepu RIT 4376 S. cerevisiae (Harford i inni, 1987).
Przykład XVIII. 5. Porównanie kompozytowych cząstek wytworzonych w wyniku ekspresji w H. polymorpha i S. cerevisiae.
Hodowle szczepu preS/S-B-453 H. polymorpha i szczepu Y1108 S. cerevisiae hodowano w ośrodku S, w sposób opisany w Materiałach 5d. Szczep Y1108 jest diploidalnym szczepem S. cerevisiae wytwarzającym w wyniku ekspresji zarówno białko preS1 jak i S, z kaset ekspresji zintegrowanych w genomie przez wektory Ty. Szczep zawiera 5-7 kopii kasety ekspresji preS 1 oraz 3-4 kopie kasety ekspresji S. Do wzrostu szczepu konieczna jest obecność tryptofanu. Konstrukcja i integracja chromozomowa takich kaset ekspresji z zastosowaniem wektorów Ty opisana jest w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjedn. Amer. nr 07/292 202. Jako źródło węgla do wzrostu H. polymorpha zastosowano glicerynę w ilości 1,5% wag.-objęt. Szereg 2-litrowych kolb Erlenmeyera zawierających po 400 ml ośrodka zaszczepiono szczepem preS/S-C-453, po czym prowadzono inkubację w wytrząsarce obiegowej w ciągu około33 godzin w temperaturze 30°C, do wyczerpania gliceryny. Komórki z trzech kolb odwirowano, a pastylkę komórkową przechowywano w temperaturze -70°C przed późniejszym wykorzystaniem. Z każdej z 6 kolb odlano po 100 ml ośrodka hodowli i zastąpiono go 100 ml świeżego ośrodka zawierającego 4% wag.-objęt. metanolu, po czym kontynuowano inkubację.
Trzy hodowle zebrano i odwirowano po kolejnych 14 godzinach inkubacji, a kolejne 3 po 38 godzinach inkubacji w obecności metanolu. Komórki odwirowano, a pastylkę komórkową przechowywano w temperaturze -70°C przed późniejszym wykorzystaniem.
W drugim eskperymencie kultury S cerevisiae Y1108 hodowano w sposób opisany powyżej, zbierając je po 19,5 godzinach inkubacji. Kultury H. polymorpha preS/S-C-453 również hodowano w sposób opisany powyżej, z tym że komórki zbierano po 26 godzinach wzrostu w ośrodku glicerynowym i po 45 godzinach w ośrodku zawierającym metanol.
Pastylko komórkowe Hansenula polymorpha ponownie zawieszono, do uzyskania stężenia około 25% wag.-objęt. wilgotnych komórek w buforze zawierającym 0,5% wag.-objęt. Tween 20, mM EDTA, 4 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu), 5% wag.-objęt. izopropanolu i 50 mM fosforan sodowy, pH 9,0. 10 ml uzyskanej mieszaniny przepuszczono 6 razy przez prasę French
168 597
Press pod ciśnieniem 140 MPa w celu rozbicia komórek. Surowy ekstrakt komórkowy wyklarowano na drodze odwirowania przy 17 000 g w ciągu 45 minut w temperaturze 4°C, po czym ciecz znad osadu oddzielono. Pastylki komórkowe S. cerevisiae obrabiano w identyczny sposób, z tym że komórki zawieszano do uzyskania stężenia około 50% wag.-objęt. wilgotnych komórek w buforze opisanym powyżej.
Zawartość białka w każdej z cieczy znad osadów oznaczano metodą Lowry'ego i innych (1951). Wyklarowane ekstrakty komórkowe analizowano pod kątem obecności HBsAg stosując test AUSRIA i pod kątem obecności epitopu białka preS1 stosując test Elisa. Zagłębienia w plastikowych tackach (Nunc Immunoplate 1. Gibco Europe, Ghent, Belgia) powleczono mysim przeciwciałem monoklonalnym S 1.1 w 50 mM wodorowęglanie sodowym jako buforze o pH 9,6, w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C, po czym roztwór przeciwciał usunięto. Zagłębienia zablokowano prowadząc inkubację roztworem PBS zawierającym 1% wag.-objęt. albuminy z surowicy bydlęcej, w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Wykonano dwa kolejne dwukrotne rozcieńczenia ekstraktów komórek w PBS, dodano następnie do zagłębień 0,2% wag.-objęt. albuminy z surowicy bydlęcej i prowadzono inkubację w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C.
Zagłębienia przemyto następnie 3 razy roztworem zawierającym 0,9% wag.-objęt. NaCl i 0,05% wag.-objęt. Tween 20. Wychwytywanie przeciwciał potwierdzono prowadząc inkubację z monoklonalnym przeciwciałem S1.1 sprzężonym z peroksydazą chrzanową, w sposób opisany przez Wilsona i Nakane (1978).
Do każdego z zagłębień dodano skoniugowane przeciwciało w PBS, 0,2% wag.-objęt. albuminy surowicy bydlęcej, po czym prowadzono inkubację w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Wiązanie drugiego przeciwciała potwierdzono dodając 100 μΐ roztworu zawierającego 4 mg ofenylenodiaminy (Sigma) i 15 μΐ nadtlenku wodoru rozpuszczonego w 10 ml 0,1 M KH 2PO 4, pH 6,0 i prowadząc inkubację w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zablokowano dodając 25 μΐ 1N H2SO4, po czym zmierzono gęstość optyczną przy 490nm (wobec filtru wzorcowego 620 nm) w urządzeniu Intermed Immunoreader, NJ200 (Analis, Ghent, Belgia). Wyniki wyliczano z liniowych części uzyskanych krzywych gęstości optycznej, przedstawiając je w jednostkach gęstości optycznej (OD) na mg białka.
Ilość HBsAg i białka preS1 reagującego w teście AUSRIA, wyznaczoną w komórkach (ekstraktach) S. cerevisiae i H. polymorpha, z dwóch eksperymentów, przedstawiono w tabelach 4 i 5. Ilości materiałów reaktywnych w teście AUSRIA, stwierdzone w surowych ekstraktach z S. cerevisiae, szczep Y1108, są około 100 razy mniejsze od ilości w ekstraktach z H. polymorpha preS/S-C-453 indukowanego w ciągu 38-45 godzin w metanolu. Ilość białka preS stwierdzona w próbie Elisa jest około 3-8 razy mniejsza, co oznacza iż w szczepie Y1108 S. cerevisiae stosunek białka preS do białka S jest znacznie większy niż w szczepie preS/S-C-453 H. polymorpha.
Tabela 4
Test AUSRIA w przypadku surowych ekstraktów komórkowych
Ekstrakt komórkowy Nr kolby Białko (mg/ml) HBsAg (AUSRIA) % całkowitej ilości białka Białko preSl (Elisa); jednostki OD na mg białka
S. cerevisiae a 16,2 0,011 2,9
Y 1108 b 18,0 0,008 3,0
c 12,0 0,010 4,4
H. polymorpha a 6,8 0,077 2,4
preS/S-C-453 b 7,4 0,123 2,3
hodowla w c 9,2 0,143 1,7
glicerynie Indukowanie a 5,5 1,15 9,2
metanolem d 7,0 1,40 11,3
38 godzin c 7,4 1,46 8,8
168 597
Tabela 5
Test AUSRIA w przypadku surowych ekstraktów komórkowych
Ekstrakt komórkowy Nr kolby Białko (mg/ml) (AUSRIA) % całkowitej ilości białka Białko eoeS1 (Elisa); jednostki OD na mg białka
S. cerevijiae a 13,3 0,009 8,3
Y 1108 b 15,0 0,015 9,7
c 17,1 0,013 8,9
H. eolrmoopha a 8,4 0,070 1,3
eoeS/S-C-453 b 8,2 0,061 0,3
hodowla w c 7,9 0,082 0,3
glicerynie
Indukowanie a 6,3 1,106 4,1
metanolem b 6,5 1,314 6,8
45 godzin c 7,7 1,688 5,1
Wyniki te potwierdzono przeprowadzając immunoblotting ekstraktów z pinowszego eksperymentu oraz ekstraktów hodowli indukowanych metanolem, szczepów 454 i 448-C4 jako szczepów kontrolnych.
Próbki zawierające 15 pg białka poddano elektroforezie przez 5% zatrzymujące, 12,5% rozdzielające żele, zgodnie z metodą Laemmli'ego (1971), po czym poddano immunoblottingowi w sposób opisany w Materiałach i Metodach, 5a, z zastosowaniem do detekcji moooklooalnego HBS1.
Ekstrakty ze szczepu preS/S-C-453 wykazują silnie reaktywne pasmo przy 24 kD, zbliżone do białka S oraz pasmo przy 38-39 kD, zbliżone do białka preS. Pasmo 45 kD jest słabo wykrywalne. W przeciwieństwie do powyższego ekstrakty z S. cerevisiae, szczep Y1108, wykazują słabe pasma przy 24 kD i 45 kD. Pasmo dubletowe 38-39 kD białka preS jest słabo wykrywalne. Wyniki immuooblottiogu potwierdziły, że S. cerevisiae wytwarza w wyniku ekspresji mniej białka S i preS niż H. polymorpha indukowany metanolem oraz że białko wytworzone w wyniku nskpresji (jako białko preS) z S. cerevisiae jest przede wszystkim w formie glikozylowanej o 45 kD.
Przykład XIX. Mioyjtyloilowanie białka preS w H. polymorpha.
Kultury szczepu LR9, szczepy 452 i 453 hodowano w wytrząsanych kolbach, w ośrodku minimum, z 2,5% objęt. gliceryny w ciągu 24 godzin, po czym dodano 1% objęt. metanolu. 6 godzin po dodaniu metanolu dodano znaczony trytem kwas miryjtyoowy i inkubację hodowli kontynuowano przez 16 godzin. Komórki zebrano, przemyto i rozbito szklanymi perełkami w obecności 1% SDS i e-merkaptoetanolu. Wyekstrahowane białka oddzielono na drodze elektroforezy na SDSżel PAGE, po czym wizualizowano je metodą immunoblottmgu z monoklonalnym HBS1 i fluorograficznie. Wyniki wykazały, że pasmo odpowiadające białku preS1 przy 38-/39 kD uległo znakowaniu w przypadku esktraktów ze szczepów 452 i 453, ale nie uległo znakowaniu w przypadku ekstraktu ze szczepu LR9. Zgadza się to z eost-toauslacrjnym usuwaniem N-końcowej metioniny i mirrjtyloilooaniem reszty glicynowej przy pozycji 2 w eolieeetydzie (Towler i Gordon, Ann. Rev. Biochem., 57:69-99, 1988).
Przykład XX. Immunogeoiczność antygenów preS z H. eolymorpha.
Z hodowanych w obecności metanolu kultur szczepów 452 i 454 wykonano surowe ekstrakty białkowe i zaadsorbowano je na wodorotlenku glinu do uzyskania ostatecznego stężenia 1 mg/ml. Zawartość epitopu ereS1 w każdym z ekstraktów zmierzono techniką ELISA z zastosowaniem jako wzorców monoklooαloego przeciwciała S1.1 i częściowo oczyszczonego białka preS1 z S. ceoevisiae. Immunokompleksy do wstrzykiwania wykonano również prowadząc inkubację 600pl moooklonαloego przeciwciała S1.1 z 1ml Sepharose Protem G 4 Fast Flow (otrzymanego z Pharmacia LKB, Bruksela, Belgia) w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C. Mieszaninę odwirowano następnie, przemyto PBS i uzyskaną pastylkę ponownie zawieszono w 1 ml PBS. 250 pl tej zawiejior dodano do 3,4 ml każdego z surowych ekstraktów komórkowych i uzyskane mieszaniny iokubooαoo w ciągu 1 godziny w temperaturze 20°C.
168 597
Po inkubacji mieszaninę Sephaedse Protein G/S1.1/surowe białko odwirowano, a pastylkę zawieszono w 10 mM fosforanie sodowym jako buforze. Połowę tego materiału zaadsorbowand na wodorotlenku glinu do uzyskania ostatecznego stężenia 1 mg/ml.
Grupom po 5 myszy Balb/c wstrzyknięto dootrzewnowo 4 preparaty. Po upływie miesiąca myszom zaaplikowano dodatkowy zastrzyk z zααdsoebdwanych na wodorotlenku glinu 1 pg cząstek, częściowo oczyszczonych, z hodowanej w obecności metanolu kultury szczepu 453. Po upływie 15 dni myszom upuszczono krew. Miana przeciwciał anty-S, auty-preS2 i anty-pr^eS1 w surowicy wyznaczono w sposób opisany powyżej.
W tabeli 6 przedstawiono miana odpowiednich przeciwciał indukowane w myszach Balb/c, wyrażone jako miana średnie geometryczne (GMT).
Wyniki te wskazują, że przeciwciała wnty-preS są indukowane u myszy, którym wstrzyknięto ekstrakt zawierający preS1-S2-S (szczep 454) lub ekstrakt zawierający cząstki kompozytowe (szczep 452), po uzupełnieniu cząstkami kompozytowymi (szczep 453).
Tabela 6
Preparat pg wstrzykniętego antygenu (a) (b) α-HBS GMT w mIU/m α-120-145 GMT (c) α-12-32 GMT (c) α 32-47 GMT (c)
Szczep 454 ekstrakt
surowy lmmuno- 222 17755 688 240 612
precypitat Szczep 452 ekstrakt 155 616 518 59 1400
surowy immuno- 48 124803 426 59 <100
precypitat 48 119903 487 64 784
(w) W stosunku do antygenu preS1-S2-S z S. ceyevίsiae (b) Wszystkim myszom zaaplikowano zastrzyki w 30 dniu (dodatkowo) zawierające częściowo oczyszczone cząstki ze szczepu 453.
(c) Miana wyrażono jako odwrotności rozcieńczenia, przy którym uzyskuje się gęstość optyczną (OD) 1,0.
Część E
Przykład XXI. Ekspresja cząstek kompozytowych zawierających zarówno zmodyfikowane antygeny preS1-S2-S (Lx) jak i antygeny S, pojedynczego lub mieszanego podtypu.
1) Konstrukcja sekwencji kodującej L (ad)
Sekwencję kodującą zmodyfikowane preS1-S2-S (LX) nadającą się do bezpośredniej insercji nw wektorze ekspresji Hanemu^ pMPT-121 (fig. 11) skonstruowano w sposób następujący. Plazmidowy DNA z pRIT13192 opisanego poniżej strawiono eudonukleaoą HmdlH w celu uzyskania fragmentów liniowych. Około 1 ng tego DNA wymieszano z dligonukleotydami BC74 i BC75 i poddano reakcji amplifikacji łańcucha pdlimerwoowego (PCR). Technika PCR jest dobrze znana i opisanw w „PCR Proto^s, A guide to methods and applicwtions“, M. A. Innes i inni (wyd.), Academic Press Inc., San Diego Ca, 1989.
Oligonukledtydy BC71 i BC75, zawierające sekwencje przedstawione poniżej osyntetyodwaud na drodze zwykłej chemicznej syntezy fdsfdroamidy'towee.
BC74 5' CCC AGA TCT AAG CTT ATT AAA TGT ATA CCC A 3'
BC75 5' CCC GAA TTC AAA ATG GGG ACG AAT CTT TCT 3'
Oligonukleotyd BC74 wykazuje homologię z końcem 3' w sekwencji kodującej Lx w pRIT13192 wraz z wydłużeniami, miejscami restrykcyjnymi HmdlH i BglH. Oligonukleotyd BC75 wykazuje homo^ię z końcem 5' sekwencji kodującej Lx w pRIT13192 wraz z miejscem EcoRI i krótką sekwencją liderującą przed kodonem ATG, jako wydłużeniem. Około 1 ng templatowego DNA zpRIT13192 wymieszano z 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl o pH 8,3, 1,5 mM MgCh, 0,01% wag^objęt. żelatyny, po 200μM każdego z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, po 1pM każdego z podkładów oligonukledtyddwych oraz z 2,5 jednostkami polimerazy Taq, do uzyskania ostatecznej objętości 100μΐ, stosując dostępne w handlu reagenty do amplifikacji DNA (zestaw Gene Amp DNA Amplification Reagent z Perkin Elmer Cetus, otrzymany z bander Heyden, Bruksela).
168 597
Mieszaninę poddano 25 cyklom denaturacji (2 minuty, 92°C), wygrzewania (2 minuty, 48°C) i wydłużania (2 minuty, 72°C) w urządzeniu DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, otrzymane z Vander Heyden, Bruksela). 1 ng uzyskanego zmodyfikowanego fragmentu zamplifikowanej sekwencji kodującej Lx poddano powtórnej amplifikacji w drugiej rundzie z tymi samymi oligoeukIeotydami w takich samych warunkach, po czym wydzielono z mieszaniny reakcyjnej na drodze strącania etanolem. '
Próbkę około 250 ng przystosowanego fragmentu Lx z DNA o 870 bp strawiono endonuklrazami EcoRI i BglH i sklonowano między miejsca EcoRI i BglU plazmidu pRIT12555, będącego pochodną pBR327, uzyskując pRIT13488. pRIT12555 zawiera replikon pBR327 wraz z miejscem BglH wprowadzonym w wyniku insercji linkera między miejsca EcoRI i ClaI wyjściowego plazmidu.
Kolejną próbkę przystosowanego fragmentu Lx strawiono eedoeukleazami EcoRI i Bglll, po czym wykonano insercję między miejsca EcoRI i BglH w plazmidzie pMPT121 (fig. 11). Powoduje to umieszczenie sekwencji kodującej Lx między promotorem MOX i terminatorem MOX w plazmidzie ekspresji nadającym się do wprowadzenia do H. polymorpha w wyniku transformacji. Sekwencjonowanie DNA uzyskane plazmidu pLX-11 wykazało, że sekwencja regionu kodującego Lx jest prawidłowa.
2) Konstrokcja sekwencji kodujkodj S-(aj) pRIT 13490 jest plazmidem pochodnym pBR322, zawierającym pełną sekwencję kodującą preS2-S uzyskaną w wyniku zwykłych manipulacji ^kombinowanym DNA z pRITWóGL który zawiera pełny genom wirusa hepatitis B subtypu ay, klonowany w pBR322. pRIT10601 zdeponowano w American Type Culture CoIlecticn, Rockville, MD, dnia 2 czerwca 1982 roku, pod nr ATCC 39132.
Dla specjalistów zrozumiałe jest, że w manipulacjach opisanych poniżej pRIT13490 można zastąpić przez pRIT 10601 lub inny dowolny sklonowany fragment HBV zawierający pełną sekwencję kodującą S-(ay). DNA z pRIT13490 strawiono eedoeukIeaką HindlU w celu uzyskania linearyzacji plazmidu i wymieszano z oligonuklectydrm BC74 opisanym powyżej oraz z oligonukleotydem BC74 wykazującym homologię z końcem 5' sekwencji kodującej S w pRIT 13490, wraz z miejscem EcoRI i krótką sekwencją liderującą przed kodonem ATG jako wydłużeniem.
BC73 5' CCC GAA TTC AAA ATG GAC AAC ATC ACA TCA 3'.
Mieszaninę pRIT 13490 strawionego za pomocą HindlU oraz cIigonuklectydów amplifikowano wykonując 2 rundy PCR w sposób opisany powyżej, w celu wytworzenia fragmentu sekwencji kodującej S-(ay) o 700 bp, oflaekckanegc miejscami restrykcyjnymi EcoRI i BglH. Około 250 ng tego materiału strawiono eedceukleazami EcoRI i BglH i sklonowano między miejsca EcoRI i Bglll w pRIT12555 uzyskując pRIT13438 potwierdzono na podstawie sekwencjonowania DNA.
3) Konstrukcja sekwencji kodującej L* (ad/ay)
Około 1 ng fragmentu kamplifikckaeegc metodą PCR, stosowanego w konstrukcji pRIT13488, zamplifikowano wykonując 2 rundy amplifikacji PCR w obecności oligonukleotydu BC75 (opisanego powyżej) oraz BC30, o następującej sekwencji
BC30 5' ACG AGT CTA GAC TCT GCG GTA 3'
BC30 jest homologiczny z regionem wokół miejsca XbaI w sekwencji kodującej S pochodzącej z klonu pRIT10616 wirusa HB subtypu ad. Z amplifikacji wydzielono fragment o 280 bp i około 250 ng tego fragmentu strawiono endonukleazami EcoRI i Xbal.
Około 1 ng fragmentu kampIiflkckaeegc metodą PCR, stosowanego do konstrukcji pRn'13438, zamplifikowano ponownie wykonując 2 rundy amplifikacji PCR w obecności oligonuk^^dów BC74 (opisanego powyżej) oraz BC12, o następującej sekwencji: BC125' ATG GAG AAC ATC ACA TCA 3'.
BC12 jest homologiczny z pierwszymi 6 kodonami sekwencji kodującej S wirionów HB klonowanych w pRIT1^(^01 i pRITMóte. Po amplifikacji PCR około 250 ng fragmentu o 700 bp strawiono endceukleakami Xbal i BglH.
Fragmenty zamplifikowane metodą PCR, strawione dwoma endoeukleakami, zligowano następnie z DNA z pRIT12555, strawionym za pomocą EcoRI i BglH.
168 597
Wydzielono plazmid pRIT 13491 zawierający pRIT 12555 wraz z EcoRI-XbaI fragmentem z PCR-amplifikowanego fragmentu stosowanego w konstrukcji pRIT13488 oraz XbaI-BglII fragmentem z PCR-amplifikacji fragmentu stosowanego w konstrukcji pRIT13438. Sekwencjonowanie DNA insertu kodującego Lx wpRIT13491 wykazało, że wprowadzono błąd w 5 aminokwasie w regionie kodującym S. W celu skorygowania błędu PCR-amplifikowany fragment, zastosowany powyżej w konstrukcji pRIT 13488 strawiono endonukleazami EcoRI i Xbal i zastosowano w celu zastąpienia odpowiedniego fragmentu EcoRI-XbaI w pRIT 13491, zawierającego błąd. Uzyskany plazmid pRIT13489 określa sekwencję kodującą „hyorydowy Lx, w której część od kodonu inicjowania ATG do miejsca Xbal pochodzi z sekwencji wirusa subtypu ad, a część od miejsca Xbal do kodonu terminacji pochodzi z sekwencji wirusa podtypu ay. Odpowiedni polipeptyd będzie należał do subtypu ay.
Następnie dokonano insercji fragmentu EcoRI-Bglll z pRIT13489 zawierającego sekwencją kodującą hybrydowy Lx (ad-ay) między miejsca EcoRI i Bglll w plazmidzie pMPT-121 uzyskując wektor ekspresji pLx 13 H. polymorpha.
4) Ekspresjk p H. polymorpha zmodyfikowanych antygenów pecSl-S2-S i a2tygenaw S n wytworzeniem cząstek kompozytowych
Skonstruowano szereg szczepów charakteryzujących się różnymi stosunkami ekspresji Lx i S oraz różnym łącznym poziomem ekspresji. Różnice te uzyskano zmieniając ilość kopii kaset ekspresji przypadającą na genom.
Szczep RB 10 H. polymorpha stransformowano w sposób opisany powyżej plazmidem pLx 11 zawierającym kasetę ekspresji Lx (ad). W wyniku transformacji uzyskano szereg szczepów zawierających różne ilości kaset ekspresji zintegrowanych w genomie. Dwa takie szczepy, oznaczone symbolami L13/1 i L19/1 zbadano bardziej szczegółowo. Analiza metodą blottingu Southerna potwierdziła, że szczepy te zawierają szereg kopii kasety ekspresji Lx (ad). Poziom ekspresji Lx (ad) w tych szczepach oceniono na podstawie analizy metodą blottingu Westerna z zastosowaniem monoklonalnego przeciwciała HBS 1. Wykryto pasmo 33 kD odpowiadające antygenowi Lx. Oszacowano, że poziom ekspresji stanowi około 0,5-2% całości białka komórkowego, gdy komórki hoduje się w ośrodku glicerynowym, dodając następnie metanol.
Szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji Lx (ad) stransformowano ponownie plazmidem pRB-S-322 zawierającym gen S(ad) pod kontrolą promotora MOX. pRB-S-322 opisano powyżej (patrz. fig. 7). Jako marker transformacji wykorzystano odporność na gentamycynę. Uzyskano trwałe integranty wykorzystując wyżej opisane metody. Dwa z uzyskanych szczepów zbadano bardziej szczegółowo: szczep LMS9/1 i szczep LMS26/2, obydwa pochodzące ze szczepu biorczego L13/1. Analiza metodą blottingu Southerna potwierdziła, że szczepy te zawierają szereg kopii kasety ekspresji L* (ad) a także szereg kopii kasety ekspresji S(ad).
Ekspresję antygenów Lx i S w transformantach H. polymorpha zbadano metodą blottingu Westerna z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał HBS1 i S1.1, w sposób opisany powyżej. Uzyskano grupę szczepów, w których w wyniku ekspresji uzyskuje się antygeny Lx i S w różnych stosunkach. Przeciwciała HBS1 wykrywają białko o 24 kD odpowiadające antygenowi S oraz pasma 30 i 33kD odpowiadające antygenowi Lx. Przeciwciała S1.1 specyficzne względem regionu preS 1 potwierdzają występowanie pasma 33 kD oraz pasma 30 kD. Oszacowano, że stosunek Lx/S wynosi około 1:1 w przypadku szczepu LMS9/1 oraz około 1:10 w przypadku szczepu LMS26/2. Oszacowano, że poziom ekspresji wynosi około 5-6% całości białka komórkowego w przypadku, gdy komórki hoduje się w warunkach indukcji metanolem.
Badania glikozylowania wykazały, że białko o 33 kD reprezentuje glikozylowaną postać antygenu Lx. Podczas inkubowania surowych ekstraktów białkowych ze szczepów LMS9/1 i LMS26/2 z endoglikozydazą H następuje przesunięcie pasma 33 kD do pozornej masy cząsteczkowej 30 kD. 30 kD to oczekiwana masa cząsteczkowa antygenu Lx. W związku z tym część antygenu Lx wytworzonego w H. polymorpha zawiera glikozylowany rdzeń, podczas gdy resztę stanowi nieglikozylowana forma Lx.
W celu sprawdzenia, czy tworzą się cząstki, surowy ekstrakt komórkowy ze szczepu LMS9/1 poddano wirowaniu z gradientem gęstości CsCl. Frakcje gradientowe analizowano metodą immunoblottingu z zastosowaniem przeciwciała HBS 1. Pig materiału reagującego z HBsAg zawierający antygen S o 24 kD oraz formy antygenowe Lx o 30 i 33 kD zaobserwowano przy gęstości 1,18 g/cm3. Wynik ten wskazuje, że w wyniku współekspresji w H. polymorpha tworzą się kompozytowe cząstki zawierające polipeptydy Lx i S.
168 597
Zgodnie z kolejnym wariantem według wynalazku uzyskano szczep H. poiymdyphα wytwarzający w wyniku współekspresei białka Lx i S, dokonując dalszej transformacji szczepu 415 opisanego powyżej. Szczep 415 zawiera 5-100 kaset ekspresji S(wd) pod kontrolą promotora MOX i charakteryzuje się wysokim poziomem ekspresji antygenu S.
Skonstruowano wektor ekspresji Lx (ad) zawierający gen odporności uw kanamycyny Fragment Nrul o 3,5 kb, kodujący gen odporności na kana^mycynę pod kontrolą promotora ADHI oraz sekwencję HARS wydzielono z plazmidu pHK2 (fig. 6). Plazmid pLx 11 strawiono eudouukiewzwmi Nrul i SalI, po czym tępo zakończono stosując wypełnianie polimerazą DNA Klenowa. Trawienie Nrul/Sall wyeliminowało sekwencję HARS z wektora pLx 11. Fragment Nrul zpHK2 oiigdwαuo następnie z tępo-zakończonym wielkim fragmentem Mrul-Swll wektora pLx11, wprowadzając w ten sposób gen odporności na kanamycynę oraz ponownie wprowadzając sekwencję HARS, która została wyeliminowana. Uzyskany plazmid oznaczono jako pK^ł lub pKLx10, zależnie od orientacji kasety genu odporności nw kanamycynę. Strukturę pKU^l przedstawiono na fig. 12. Plazmidy te można wprowadzać do H. polymorpha uw drodze transformowania i selekcji w oparciu o odporność na geutwmycyuę, jwk to opisano powyżej w Metodach.
Szczep 415 etrαnsformdwαnd za pomocą pKL*1 i pKLx10, zawierającymi kasetę ekspresji Lx(ad) i po selekcji w oparciu o odporność na geutamycynę uzyskano trwałe transformaty. Szereg szczepów poddano dalszej analizie. Analiza metodą blottingu Westerna z zastosowaniem przeciwciała HBS1 wykazała obecność białka 24 kD odpowiadającego antygenowi S oraz pasm 30 i 33 kD odpowiadających glikdoyldwauee i uieglikozylowwuee formie antygenu Lx. W tych szczepach ze szczepu 415 stosunek Lx/S wahwł się od około 1:1 w przypadku szczepu LMS05-14-1 do około 1:20 w przypadku szczepu KMS05-12-1. Szczepy rosną w warunkach pełnej indukcji metanolowej. Oszacowano, że poziom ekspresji antygenu Lx/S stanowi 5-6% całości białka komórkowego. Nie zaobserwowano różnicy między szczepami transformowanymi z.a pomocą pKLx1 i szczepami transformowanymi za pomocą pKLx10.
5) Współekspresjk antygenów Li i S prowadaącs do ącąstok kompozytowych mieszanego subtypu.
W celu uzyskania szczepów H. polymorpha wytwarzających cząstki Lx/S mieszanego subtypu (wd/ay), plazmid pLx13 przenoszący kasetę ekspresji Lx (wd/wy) strausfoymdwwuo w H. polymorphw RB 10. ,
Stabilne klony wytwarzające w wyniku ekspresji antygen Lx można wytworzyć i strαusfdrmdwać plazmidem z pRB-S-322 przenoszącym kasetę ekspresji S/ad/ z wykorzystaniem do selekcji odporności na gentamycynę. Stabilne szczepy z drugiej transformacji analizowano metodą blottingu Westerna oraz przy pomocy tekstu AUSRIA, w celu ustalenia odpowiednich poziomów ekspresji antygenów Lx (wd/wy) oraz S (ad), a także całkowitego poziomu ekspresji powierzchniowego antygenu.
Szczep 145 wytwarzający w wyniku ekspresji białko S (ad) można również retyansfoymować pochodną pLx13, która przenosi funkcyjny marker odporności na gentwmycynę, w celu wytworzenia trwałych transformantów wytwarzających w wyniku ekspresji zarówno polipeptydy Lx (wd/ws) jwk i S(wd), w postaci cząstek kompozytowych o specyficzności zarówno subtypu wd jwk i wy.
Część F
Przykład XXII. Konstrukcja plazmidu pRIT12979 kodującego nie mirystylowane wielkie białko HBV.
Zarys konstrukcji plazmidu pRIT12979 przedstawiono nw fig. 13 i 14. Nw fig. 13 przedstawiono etapy konstrukcji plazmidu E. coli z zakotwiczoną kasetą ekspresji białka Gly 13 P, pRIT12998. Nw fig. 14 przedstawiono procedurę wytwarzania plazmidu drożdżowego pRIT 12979 zdolnego do ekspresji białka Glyl3L.
Zrozumiałe jest, że reszta Gly 13 jest kodowana przez drugi kodon sekwencji kodującej białko L, przedstawionej w tabeli A.
Substancją wyjściową w tej konstrukcji jest plazmid pRIT12863, pochodna pBR327 zawierającego promotor TDH3 (region) oraz region termiuαcji transkrypcji AGR3 [Cabeodn i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6594-6598 (1984)], rozdzielone lmkerem BwmHI, Smal, EcoRI. Linker zawierający miejsce BglH usytuowany jest w górę od sekwencji promotora TDH3. pBR327 opisany w pracy Soberona i innych, Gene, 9:287-305 (1980), otrzymano od F. Bolivara (Departament of Moleculwr Biology, Na^onal University of Mexicd). Plazmid ten można wydzielać w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325.
168 597
Kasetę ekspresji nie mirystylowanego białka L konstruuje się w regionie linkera w pRIT12863.
Plazmid pRIT12816 będący plazmidem E. coli pochodzącym z pASl [Rosenberg i inni, Methods Enzymol., 101:123-164 (1983)], zawiera region kodujący wielkie białko HBV (serotyp adw) oflankowane miejscem Ncol (zachodzącym na ATG w pozycji kodonu 12 sekwencji kodującej białko L) oraz miejscem EcoRI poza kodonem stopu. Plazmid ten konstruuje się zwykłymi technikami zrekombinowanego DNA (patrz T. Maniatis i inni, op. cit.).
Plazmid pRIT12816 trawi się BstXI i EcoRI, po czym odzyskuje się fragment BstXI-EcoRI o 304bp, kodujący N-końcową część regionu preS1, i liguje się z następującym syntetycznym adapterem BamHI-BstXI:
BamHT Xbal BstXI
GAT CCCTCTAG A CG AAT CTT TCT GTT CCC AAC C
GGAGATC TGG TTA TAA AGA CAA GGG TT
Fragment ten wstawia się do pRIT12863, strawionego uprzednio enzymami BamHI i EcoRI, uzyskując plazmid pRIT 12996. Syntetyczny adapter BamHI-BstXI kotwiczy N-końcowy region preS 1. ale nie zapewnia prawidłowego odczytywania szkieletu z miejscem BamHI umieszczonym w reszcie ATG promotora TDH3. Prawidłowy szkielet odczytywania uzyskuje się trawiąc pRIT 12996 za pomocą BamHI i Xbal, a następnie stosując obróbkę enzymem ze strąków mung, w celu wyeliminowania wystających przedłużeń i ligowania. Uzyskuje się w ten sposób plazmid pRIT12997.
Na koniec dokonano insercji fragmentu EcoRI o 839 bp, z pRIT12816, w miejsce EcoRI w pRIT 12997, przy prawidłowym zorientowaniu, aby odzyskać całkowitą sekwencję kodującą białko Δ Gly L. Uzyskany plazmid pRIT 12998 zawiera kasetę ekspresji kodującą białko L, z delecją Gly 13 i nie może służyć jako substrat dla transferazy mirystoilowej.
W celu skonstruowania plazmidu drożdżowego zdolnego do ekspresji białka Δ Gly L plazmid pRIT12998 strawiono enzymami Bglll i SalI. Fragment Bglll-Sall o 5822 bp, zawierający kasetę ekspresji, oczyszczono i wstawiono do zwykłego wektora drożdżowego pRIT12741 będącego pochodną pBR327, dostarczającego gen AmpR, sekwencje 2μ, replikon E. coli oraz marker drożdżowego LEU2 w celu wykonania selekcji.
Uzyskany plazmid pRIT12979 zastosowano do transformowania LEU-S. cerevisiae szczep 10S44cir° (pep4-3, leu2-3, leu2-112), określanego również symbolami TCY1 lub Y482, zdeponowanego w American Type Culture Collecitio, Rockville, Maryland St. Zjedn. Amer. pod nr ATCC 20818. Po transformacji uzyskany szczep drożdży LEU+ nazwano Y720.
Przykład XXIII. Charakterystyka porównawcza białka Δ Gly L i białka L.
Szczep drożdży Y720 z przykładu XXII zbadano pod względem ekspresji białka Δ Gly L w porównaniu ze szczepem drożdży Y587 (TCY1 stransformowany plazmidem pRIT12845), wytwarzającym w wyniku ekspresji białko L. pRIT 12845), zawiera kasetę ekspresji o 3370 bp obejmującą pochodzącą z DNA HBV sekwencję kodującą 389 aminokwasów białka L, 5'-flankowaną i będącą pod kontrolą fragmentu promotora TDH3 o 1050 bp oraz 3'-flankowaną fragmentem o 1150 bp, przenoszącym terminator transkrypcji ARG3. pRIT-12845 opisano szczegółowo w przykładzie 16A zgłoszenia patentowego w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325. Szczep drożdży Y1017, będący szczepem T C Y1 stranformowanym plazmidem pRIT 1:2741, służyłjako ujemny szczep kontrolony.
A. Mirystylowanie
Wykonano znaczenie komórek Y720, Y587 i Y1017 za pomocą kwasu 3H-mirystylowego w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325. Ekstrakty SDS z tych komórek analizowano metodą elektroforezy w układzie SDS-żel poliakryloamidowy (SDSPAGE), a następnie immunoblottingu i fluorograficzną [patrz np. Towler i Glaser, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 83:2812-2816 (1986)].
168 597
Immunoblotting, opisany w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325, obejmował detekcję za pomocą S-specyficznych moecklonaInych przeciwciał (Mab), Mab RF6 (H. Thomas, Royal Free Hospital, Londyn) lub Man HBsl (SmithOne Biologicals). Przeciwciała te rozpoznają nakładanie się epitopów odporności na denaturację i redukcję w białku S. Immunoblotting wykazał ekspresję dwóch form białka L, o 38 kD i 45 kD, zarówno w Y720 jak i w Y587.
Flucycgram wykazał obecność znacznika 3H w białku L o 38 kD, pochodzącym z komórek Y587, jak to opisano w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325. Niewielkie ilości znacznika zaobserwowano również w pochodzącym z niego białku L 45 kD. W przeciwieństwie do powyższego, ani w białku Δ Gly L o 38 kD, ani o 45 kD, pochodzącym z komórek Y720, nie stwierdzono wbudowania znacznika. Wykazało to, że eliminacja kodonu glicyny w pRIT12979 likwiduje mirystylowanie białka Δ Gly L w S. cerevisiae.
B. Poziom ekcprecji
Komórki Y720, Y587 i Y1017 hodowano w identycznych warunkach w YNB bez aminokwasów (Difco Labs), przy stężeniu 0,675%, z dodatkiem 2% glikozy, w kolbach Erlenmeyera. Zarówno całość rozbitych komórek jak i surowe ekstrakty analizowano metodą ilościowego immunoblottingu w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325.
Analizowano dwukrotne kolejne rozcieńczenia próbek, przy czym immuno-detekcję oparto na S-specyflcznych Mabs RF6 lub HBs1, albo na preSł-specyficknym monokIcealnym przeciwciele S 1.1 (SmithKline Biologicals). lmmueoblottieg wykazał 2-5-kycteie większy poziom ekspresji w przypadku białka Δ Gly L (Y720) niż białka L mirystylowanego w Y587. Wydajność ekstrakcji okazała się w przybliżeniu taka sama w przypadku białek nie mirystylowanych jak i mirystylowanych. Udział białka L stwierdzony w formie gIikozylckaeej o 45 kD nie uległ zmianie w wyniku eliminacji mirystylowania.
C. Struktura lipoprotein
Surowe ekstrakty z komórek Y720 i Y587 poddano równowagowemu wirowaniu z CsCl. Frakcje gradientowe analizowano przy pomocy immuncblottingu, testu AUSRIA (Abbott Labs) oraz testu ELISA specyfickyeego dla epitopu preS1 z zastosowaniem Mab S1.1, przy czym za pomocą MabS1.1 powleczono zagłębienia w płytkach do mikromianowania (Immunoplate I; Gibco Europe), po czym prowadzono inkubację z badanymi próbkami. Po przemyciu w celu usunięcia eiezwiąkanegc materiału wychwycenie reaktywnych cząstek oceniano na podstawie inkubacji z MabS1.1 sprzężonym z peroksydazą chrzanową, sposobem Wilsona i Nakane (1978) opisaną w „lmmueofluorescence and Related Tecąniques“, W. Knapp i inni (wydawcy), Elsevier, Amsterdam (1978). Wywoływanie barwne w celu potwierdzenia wiązania drugiego przeciwciała prowadzono za pomocą c-fenylodiamier jako chromogenu. Absorbancję mierzono przy 490 nm względem filtra wzorcowego o 620 nm, w urządzeniu Intermed Immuncyeader, NJ2000 (Analis, Ghent, Belgia).
Profil antygenowy i wynikający z immuncblcttiegu był identyczy. Zarówno w przypadku Δ Gly L jak i białka L dzikiego typu zaobserwowano pasma przy gęstości około 1,25 g/dm3, co wskazuje, iż zarówno mirystylowane jak i niemirystrlckane białka występują w postaci struktur lipopycteincwrch w surowych ekstraktach komórkowych. Wirowanie z gradientem prędkości w sacharozie materiału oczyszczonego na drodze równowagowego gradientowego wirowania w CsCl wykazało identyczne charakterystyki sedymentacyjne struktur lipoproteinowych zawierających mirystylckaee i niemirystylowane białko L, co wskazuje, że takie struktury lipcproteinowe charakteryzują się zbliżonymi właściwościami fizycznymi.
Przykład XXIV. Konstrukcja plazmidów kodujących zmodyfikowane białko L HBV nie zawierające potencjalnych miejsc O- i N-glikczylowaela, potencjalnych miejsc wiązania pHSA i potencjalnych miejsc wrażliwych na proteazę.
Zarys konstrukcji dwóch wektorów drożdżowych, pRIT 13192, kodującego ekspresję mirysty^wanego modyfikowanego białka L (Lx) oraz pRIT13193, kodującego ekspresję niemirystylowanego modyfikowanego białka L (Δ Gly Lx), przedstawiono na fig. 15 i 16.
pRIT10616, zdeponowany jako ATCC 39131, trawi się enzymem Bglll i największy fragment ligujesię kyeplikoeempAC177 [Changi Cohen, J. Barteriol., 134:1141 (1987)], uprzednio strawionym enzymem BamHI. Pośredni plazmid uzyskany w ten sposób strawiono enzymem EcoRI i ponownie zligowano uzyskując pRIT10633, który zawiera kompletny gen kopertowy HBV.
168 597
Plazmid pRIT12331 stanowi pochodną pUC9 (Amersham, Wielka Brytania i Pharmacia, Szwecja) zawierającą fragment promotora Hindlll-Ncol ARG3 o 1500 bp, z pRIT10779 [Cabezon i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6594-6598 (1984) połączony w odpowiedniej orientacji z fragmentem Ncol-EcoRI o 681 bp, zawierającym sekwencje kodujące S, z miejscem Ncol obejmującym kodon ATG oraz miejscem EcoRI na zewnątrz i w sąsiedztwie kodonu stopu, wstawiony między miejsca restrykcyjne Hindffl i EcoRI w pUC9.
pRIT10633 strawiono enzymami BstEII i Xbal. Fragment BstEII-Xbal o 648 bp, w którym wydłużenie BstEII zostało wypełnione polimerazą Klenowa, zawierający pełny region preS1-PreS2 oraz N-końcowe sekwencje regionu S, oczyszczono i wstawiono między miejsca Smal i Xbal w pUC12 (Amersham). Uzyskano w ten sposób plazmid pRIT13188.
Plazmid pRIT13188 strawiono za pomocą BalI i BamHI, w wyniku czego nastąpiła delecja regionu preS 1 kodującego aminokwasy rozciągające się od reszty 52 do 133 (kodony aminokwasów 53 i 132 zostały objęte delecją). Wielki fragment potraktowano polimerazą Klenowa, a następnie zligowano uzyskując plazmid pRIT13189, w którym miejsce BamHI zostało odtworzone.
DNA odpowiadające regionowi preS aminokwasów rozciągającemu się od reszty 145 do 175 (kodony aminokwasów 146-174) wycięto w wyniku trawienia pRIT13189 za pomocą BamHI i Xbal. Wektor ten zligowano z następującym syntetycznym adapterem:
Wydłużenie BamHI Wydłużenie Ncol
GATCCCAGAGTCAGG- GGTCTG -TATTTTCCTGCTGGTGG
GGTCTCAGTCCC-CAGACA-TAAAAGGACGACCACCGTAC
AspProArgV alArgGlyLeuTyrPheProAlaGlyGly
135 145 oraz fragmentem Ncol-Xbal z pRIT12331, zawierającym N-końcową część genu S. Uzyskano w ten sposób plazmid pRIT13190.
C-końcowy region genu S, zakończenie regionu transkrypcji ARG3 oraz gen drożdżowy LEU2 dodano w wyniku insercji fragmentu Xbal-Sall o 4145 bp z pRIT12660, między miejsca Xbal i SalI w pRIT13190. [pRIT 12660 zawiera kasetę ekspresji o 3050 bp, obejmującą pochodzącą z DNA HBV sekwencję kodującą 281 aminokwasów białka M, 5'-flankowanych przez oraz pod kontrolą, fragmentu promotora TDH o 1050 bp oraz 3'-flankowanych fragmentem o 1150 bp zawierającym terminator transkrypcji ARG3. pRIT12660 opisany jest szczegółowo w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325]. Uzyskano w ten sposób plazmid pRIT13191.
W celu odtworzenia kaset ekspresji dla białka Lx i Δ Gly Lx, promotor TDH3 zasocjowany z N-końcowym regionem kodującym białko L lub z N-końcowym regionem kodującym białko Δ Gly L, wstawiono w pRIT13191.
Z pRIT12845 wydzielono fragment EcoRI-Ball o 1234 bp, zawierający sekwencję kodującą białko L, opisaną powyżej oraz w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325, a z pRIT12979 wydzielono fragment Bglll-Ball o 1227 bp, zawierający sekwencję kodującą białko Δ Gly L, opisaną powyżej.
Każdy z fragmentów wymieszano z wielkim fragmentem Scal-BamHI z pRIT13191, po czym całość zadano polimerazą T4 i zligowano. Uzyskanym plazmidom nadano symbole pRIT13220 i pRIT 13222. Sekwencja kodująca występująca w kasecie ekspresji obecnej w pRIT 13220 zawiera sekwencję preS1 reszt aminokwasowych od 12 do 52, sekwencję preS2 reszt 133-145 oraz pełną sekwencję S, jak to przedstawiono w tabeli A. pRIT13222 jest identyczny z pRIT13220 z wyjątkiem delecji kodonu Gly13 (GGG).
Ostatni etap obejmował wytwarzanie z pRIT13220 i pRIT13222 fragmentu Clal-Clal zawierającą kasety ekspresji zarówno białka Lx jak i Δ Gly Lx oraz jej zligowanie z fragmentem Clal-Clal z plazmidu pRIT12845; uzyskano w ten sposób odpowiednio plazmidy pRIT13192 i pRIT13193.
Te ostatnie plazmidy zastosowano do transformowania szczepu TCY1 S. cerevisiae uzyskując szczepy LEU +, odpowiednio Y1139 i Y1140.
168 597
Przykład XXV. Ekspresja Lx i Δ Gly Lx w drożdżach.
Surowe ekstrakty drożdży z Y587 (białko L), Y1139 i Y1140 (odpowiednio Lx i A GlyLx) z przykładu XXIV oraz Y724 (kontrolony szczep S. cerevisiae bez insersji kaset ekspresji) poddano SDS-PAGE oraz immunoblottingowi z detekcją za pomocą S-specyficznego Mab HBs1 lub Mab S1.1. Ekstrakty Y1139 i Y1140 wykazały obecność dwóch pasm o oczekiwanych masach cząsteczkowych około 33 i 30 kD, specyficznie rozpoznawane przez obydwa preS1- oraz S-specyficzne przeciwciała.
W wyniku obróbki ekstraktów endoglikozydazą H (New England Nuclear lub Boehringer) lub glikopepsydazą F (Boehronger) wystąpił zanik pasma 33 kD oraz zwiększenie pasma 30 kD. Oznacza to, że pasmo 33 kD reprezentuje glikozylowaną formę białka Lx i Δ Gly Lx z przykładu XXIV, zawierającą N-połączony glikan typu wysoko-mannozowego.
Znaczenie hodowli komórkowych kwasem 3H-mirystynowym, a następnie analiza ekstraktów komórkowych metodą SDS-PAGE, blottingu białek i fluorografii lub immuno-detekcji, wykazała silną obecność znacznika 3h w paśmie 30 kD oraz słabe wprowadzenie znacznika 3H w paśmie 33 kD, pochodzącym z ekstraktu Y1139. 3h obecny w tych pasmach jest odporny na obróbkę hydroksyloaminą. Nie zaobserwowano wprowadzania znacznika 3h w przypadku odpowiednich pasm białek z esktraktu Y1140. Wykazuje to, że białko Lx uzyskane w wyniku ekspresji w komórkach Y1139 służy jako substrat dla drożdżowej transferazy N-mirystylowej oraz że delecją reszty Gly 13 w białku Δ Gly Lx z Y1140 zapobiega mirystylowaniu białka.
Analiza ekstraktów z Y1189 i Y1140 metodami równowagowego wirowania z CsCl oraz wirowania z gradientem prędkości w sacharozie wykazała obecność w ekstraktach cząstek lipoproteinowych.
Przykład XXVI. Szczepy drożdżowe Y1088 i Y1295 zawierające zintegrowane kopie kasety ekspresji białka S.
Wykonano konstrukcje szczepów drożdży zawierających szereg kopii kasety ekspresji S zintegrowanych w genomie.
A. Szczep drożdży Y1088
Liniowy wektor pRIT13133-L oparty na Ty, opisany w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 368 401, zawierający kasetę ekspresji białka S (promotor TDH3 - sekwencja kodująca białko S - region terminacji ARG3) zastosowano do transformowania obydwu sparowanych typów szczepu S. cerevisiae 10S69d (ura3, leu2, trp1, gal1, cir0) opisanego w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 368401. Różne transformanty haploidalne przenoszące szereg kopii wektora zintegrowanych ich genomach skrzyżowano ze szczepami haploidalnymi o przeciwnie sparowanym typie. Analiza metodą blottingu Southerna genomowego DNA wydzielonego z segregantów z wykorzystaniem fragmentu DNA S jako sondy, wykazała segregacje 2/2 fragmentów wektorów w analizach tetrad. Uzyskano w ten sposób jeden segregant haploidalny, zawierający 5-7 kopii wektora pRIT13133-L, oznaczony symbolem Y957. Uzyskano również TRP+-rewertant Y957, który oznaczono symbolem Y1088.
B. Szczep drożdży Y1295
Liniowy wektor pRIT13034-L, oparty na Ty, opisany w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 368 401, zawiera kasetę ekspresji białka S, identyczną z kasetą w pRIT13133-L. pRIT13034-L zawiera gen CUP1 jako dodatkowy marker, który może być wykorzystywany w szczepach przejmujących CUP1S lub cup1 Δ.
Dwa haploidalne szczepy cup^ S. cerevisiae (gen CUP1 zniszczony w szczepie zawierającym pojedynczą kopię tego genu) stosuje się korzystnie jako przejmujące szczepy drożdży dla tego liniowego wektora Ty. Szczepy te zawierają odpowiednio genomy: EJ cup^3d(ura 3, leu 2, trp 1, gal 1Δ, cup 1Δ, a) oraz Ej cup 1A7b (ura 3, trp 1, gal 1Δ, cup 1Δ, α) i opisane są w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 368 401.
Liniowy wektor pRIT13034-L oparty na Ty, zawierający kasetę ekspresji białka S zastosowano do transformowania szczepów S cerevisiae EJ cupl Δ 3d, a także EJ cupł Δ7b, transformanty URA3 wydzielono i poddano selekcji pod kątem odporności na zatrucie miedzią. Okazało się, że najbardziej odporne transformanty zawierały 2-5 kopii zintegrowanych wektorów. W wyniku klasycznego krzyżowania genetycznego między tymi szczepami i selekcji haploidalnego segreganta LEU” TRP uzyskano szczep haploidalny zawierający 4-5 kopii kasety ekspresji S. TRP+ - rewertant tego szczepu oznaczono symbolem Y1295.
168 597
Przykład XXVII. Konstrukcja szczepów drożdży wytwarzających w wyniku współekspresji antygeny S i L.
Każdy z następujących plazmidów:pRIT 12845 (białko L), pRIT12979 (białko Δ Gly L, przykład XXII), pRIT13192 (białko Lx, przykład XXIV), pRIT13193 (białko Δ Gly Lx, przykład XXIV) oraz pRIT12914 (bez ιο^ο^ϊ genu hepatitis) zastosowano do transformacji szczepu drożdży Y1088 do LEU+. Uzyskanym szczepom drożdży nadano odpowiednio następujące symbole: Y1301 (S, L), Y1302 (S, Δ Gly L), Y1142 (S, LX), Y1261 (S, Δ Gly LX) oraz Y1141 (szczep kontrolny wytwarzający w wyniku ekspresji tylko białko S).
Plazmidy pRIT 12845, pRIT 12979, pRIT 13192, pRIT 13193 ooaz pRIT12377 (bez inserj genu hepatitis) wprowadzono rówoież do szczepu drożdży Y1295. Uzyskanym szczepom drożdży Y1295. Uzyskanym szczepom drożdży uadaoo odpowiednio następujące symbole: Y1304 (S, L), Y1305 (S, Δ Gly L), Y1306 (S, LX), Y1307 (S, Δ Gly LX) oraz Y1308 (szczep kontrolny wytwarzający w wyniku ekspresji tylko białko S).
Wseółnksprejję białek S i L wykazała analiza surowych ekstraktów komórkowych metodą immunoblott^ingu. Reakcja plamy z Mab HBs1 specyficznym względem epitopu S wykazała obecność pasma o ocenianej masie cząsteczkowej około 23 kD, migrującego do pozycji przewidywanej dla białka S w każdym z ekstraktów z wyżej wymienionych szczepów.
Ekstrakty z Y1301, Y1302, Y1304 i Y1305 wykazały oprócz pasma 23 kD również pasma 38 kD i 45 kD, migrujące w podobny sposób jak nieglikozylowane i glikozylowane formy białka L, opisane uprzednio w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325 oraz w przykładzie XXIII powyżej. W wyniku obróbki ekstraktów endoglikozydazą H następuje konwersja pasma 45 kD do pasma 41 kD, podczas gdy pasma 23 kD i 38 kD pozostały nie zmienione.
Ekstrakty z Y1142, Y1261, Y1306 i Y1307 wykazały oprócz pasma 23 kD również pasma 30 kD i 33 kD, migrujące w podobny sposób jak meglikozylowane i glikozylowane formy białka Lx ϊ Δ Gly Lx, ορΪ83πο w opiy^azie XXV. W wwnikk oOródbi oestraktów onUoolikkeydazą H następuje konwersja pasma 33 kD do pasma 30 kD, identycznie jak w przypadku wyników uzyskanych w przykładzie XXV.
Znakowanie komórek kwasem 3h mirystnnownm ooaz analiza ekstraktów metodą SDSPAGE, a następnie metodą immuneblottingu i fluerografii, wykazała obecność odpornego na obróbkę hydrpkjyaminą znacznika 3h w pasmach 38 kD (ekstrakty z Y1301 i Y1304) oraz 30 kD (ekstrakty z Y1142 i Y1306) eoaz niewielkie jedynie ilości znacznika 3h w pasmach białek o 45 kD (ekstrakty z Y1301 i Y1304) oraz 33 kD (ekstrakty z Y1142 i Y1306). Odpowiednie pasma w ekstraktach z Y1302, Y1305, Y1261 i Y1307 nie zawierały wykrywalnych ilości znacznika 3h.
Formy 38 kD i 45 kD białek L i Gly L są rozpoznawane w immunoblottingu przez preS1jpecyficyoe Mab S1.1 eraz MA18/7 (W.H. Gerlich, Univeosity of Gottingen, Rep. Feder. Niemiec) oraz preS-2-jpecyfϊcyne Mab S2.4, S2.5, S2.7, S2.8, S2.9 i S.2.10 (Smith Kline Biolog^aL). Fermy 30 kD i 33kD białek Lx i Δ Gly Lx są rozpoznawane przez Mab S.1.1 (rozpoznawanie epitepu występującego w sekwencji aminokwasów 12-32), MA18/7 (rozpoznawanie epitopu występującego w sekwencji aminokwasów 28-47) oraz S2.5 (rozpoznawanie epitopu występującego w sekwencji aminokwasów 133-145). Doniesiono, że MA 18/7 inhibituje wiązanie wirionów z membranami komórek wątroby [Pontisso P. i inni, Vioelogy, 173:522-530 (1989)]. Formy 30 kD i 33 kD białek Lx i Gly Lx nie są rozpoznawane przez Mab S.2.4, S2.8 i S2.9, które nie reagują z peptydem 120-145 w teście ELISA, ani przez Mab S2.7 i S2.10, które przypuszczalnie rozpoznają epitop zlokalizowany w aminokwasach 120-137. Monoklenaluy F35-25 (otrzymany od M-A Petita, INSERM unite' 131, Clamart, Francja) wiąże się z oczyszczonymi cząstkami ze szczepu Y1307, ce wykazał test ELISA, ale nie wiąże się z cząstkami S. Moneklenal ten rozpoznaje sekwencję peptydewą (M-A Petit i inni, Molec. Immunol., 26:531-537,1989), która jak to wykazano, odgrywa oolę w wiązaniu wirusa z komórkami HepG2 hepatoma (Neurath i inni, Cell, 46:429-436, 1986). Stwierdzone ponadto, że cząstki (S, Lx) wiążą się z komórkami HepG2 hepatoma eraz że wiązaniu temu, jak również wiązaniu cząstek wirusa HB może zapobiec mouoklouklny F35. 15 (M-A Petit i inni, The Intl. Sympesium en Viral Hepatitis and Liver Dϊjease, Abstract 105, Houston, USA, 4-8 kwietnia 1990). Mab Q19/10(W. H. Gerlich, Univerjity of Gettingen, Rep. Feder. Niemiec), który rozpoznaje epitep ereS2 uzależniony od glikeyyleoaniα (Heermann i inni, w „Viral Hepatitis and
168 597
Liver Disease, wyd. A. Zuckerman i Alan R. Liss, Inc. New York, str. 697-700,1988) oraz reaguje z formą 45 kD białek L i Gly L, nie reaguje z formami 30 lub 33 kD białek Lx lub Gly Lx. Wyniki te zgodne są z delecjami aminokwasu wprowadzonymi w białkach Lx i Gly Lx.
Przykład XXVIII. Współekspresja białek S i L lub zmodyfikowanego L prowadzi do tworzenia się cząstek o mieszanym składzie subjednostkowym.
Ekstrakty wykonane z każdego ze szczepów opisanych w przykładzie XXVII wykazują HBsAg-pokrewną antygenowość, co wykazują dodatnie wyniki testu AUSRIA przeprowadzonego zgodnie z instrukcjami producenta (Abbott Lab.). Ekstrakty z Y1301, Y1302, Y1142, Y1261, Y1304, Y1305, Y1306 i Y1307, ale nie z Y1141 i Y1308, dają dodatnią reakcję w teście ELISA-S 1.1. Przy równowagowym wirowaniu z CsCl materiał dający dodatnią reakcję w testach AUSRIA i ELIS A-S 1.1 współtworzył pasmo wokół gęstości 1,2 g/cm3. Immunoblotting potwierdził profile antygenowości wykazując, że rodzaje białka, których obecność stwierdzono w surowych ekstraktach, wspólnie skupiają się w dodatnim piku AUSRIA i ELIS A-S 1.1. Wirowanie przy gradiencie prędkości z sacharozą dializowanych frakcji pikowych pochodzących z równowagowych gradientów z CsCl, wykazują współsedymentację białek S i L lub zmodyfikowanych białek L, co potwierdziły testy AUSRIA i ELIS A-S 1.1 oraz immunoblotting. Potwierdza to, że białka S i L lub zmodyfikowane L skupione są w cząstkach lipoproteinowych.
Reakcje immunostrącania z Mab Sl.l zastosowano do wykazania, że białka S i L lub zmodyfikowane L są zasocjowane tworząc pod względem fizycznym jedną całość, to znaczy cząstki o mieszanym składzie subjednostkowym. Wykonano ekstrakty ze szczepów drożdży wytwarzających w wyniku ekspresji białka S i L lub zmodyfikowane L, pojedynczo lub wspólnie, np. z Y1139 (białko Lx, przykład XXIV), Y1141 (białko S, przykład XXVII) oraz Y1142 (białko S i Lx, przykład XXVII). Po częściowym oczyszczaniu cząstek na drodze wirowania z CsCl i dializie frakcji pikowych cząstki poddano reakcji immuno-strącania z Mab S.l.ł. Jako dodatkową próbę kontrolną zastosowano mieszaninę cząstek zY1139iY1141. Białko Lx ulegało immuno-strącaniu w każdym przypadku. Współstrącanie białka S z białkiem Lx zaobserwowano tylko w reakcji z cząstkami pochodzącymi z Y1142.
Identyczne wyniki uzyskano w przypadku innych szczepów wytwarzających w wyniku współekspresji białka S i L lub zmodyfikowane L (Y1301, Y1302, Y1261, Y1304, Y1305, Y1306 i Y1307).
Przykład XXIX. Stabilność i wiązanie z pHSA cząstek zawierających zmodyfikowane białko L.
Wrażliwość na degradację proteolityczną pod wpływem proteaz drożdżowych białek Lx i Δ Gly Lx zbadano prowadząc inkubację surowych ekstraktów komórkowych z Y1142 i Y1161 w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C lub w ciągu 65 godzin w temperaturze 4°C.
Ekstrakty z Y1301 i Y1302 służyły jako porównawcze źródła białka L i Δ Gly L. Analiza ekstraktów metodą immunoblottingu przed i po inkubacji wykazała prawie całkowity zanik białek L i Δ Gly L w wyniku inkubacji, podczas gdy białka Lx i Δ Gly Lx były w dalszym ciągu wykrywalne.
Oczyszczone preparaty cząstek ze szczepów Y1306 i Y1307 inkubowano w ciągu 7 dni w temperaturze 37°C, po czym zbadano je metodą SDS-PAGE i zabarwiania srebrem w celu wykazania obecności polipeptydów. Nie można było zaobserwować żadnej wykrywalnej degradacji polipeptydów Lx lub S.
Cząstki wyodrębnione z Y1142 metodą wirowania z CsCl zbadano w zmodyfikowanym teście wiązania pHSA, opisanym przez Pontisso i innych, J. Virol. Methods, 6, 151-159 (1983). Mikropłytki (Immunoplate I; Nunc, Gibco Europe) pokryto albuminą z ludzkiej surowicy spolimeryzowaną aldehydem glutarowym (5 ^g/ml pHSA w PBS, 2 godziny w temperaturze 37°C) i niespecyficzne miejsca wiązania białka na płytkach wysycono na drodze inkubacji (1 godzina w temperaturze 37°C) z PBS zawierającym 1% albuminy z surowicy bydlęcej (BSA). Kolejne rozcieńczenia badanych próbek w PBS zawierającym 0,2% BSA pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze 37°C do przereagowania z płytkami pokrytymi pHSA, po czym związane cząstki wykrywano na drodze inkubacji (1 godzina w temperaturze 37°C) z kompleksem o nieorganiczonym stężeniu peroksydazy chrzanowej sprzężonej z monoklonalnym przeciwciałem anty-S 1 (RF1, H. C. Thomas, Royal
168 597
Free Hdspitαl, Londyn) w PBS zawierającym 0,2% BSA, a następnie wizualizowano za pomocą H 2O 2 z o-fenylenddiamiuą jako podkładem. Między inkubacjami płytki przemywano 0,15 M NaCl zawierającym 0,05% Tween 20.
Cząstki pochodzącej z Y1141 służyły jako negatywna próbka kontrolna, a oczyszczone cząstki ze szczepu 10S44C cir° zawierające pRIT 12660, jwko dodatnia próbka kontrolna. Wiązanie pHSA uległo znacznemu zmniejszeniu w cząstkach pochodzących z Y1142 (aktywność szczątkowa 2%) w porównaniu z cząstkami pochodzącymi z 10S44C cir° zawierającego pRIT 12660.
Nie wykrywa się również wiązania pHSA w przypadku preparatów oczyszczonych ze szczepów Y1306 i Y1307.
Przykład XXX. Immundgeuiczuość cząstek zawierających białko Lx.
Immuudgeuiczuość cząstek (S, Lx) według wynalazku badano na myszach Baab/c. Cząstki pochodzące z Y1142 (S, Lx) lub z Y1141 (S) częściowo oczyszczono nw drodze wirowania z CsCl, po czym oaadsdrbowano nw Al(OH)3. Grupom po 8 myszy wstrzyknięto po 50 lub 5 pg całkowitego białka (co odpowiada 1 lub 0,1 pg antygenu na podstawie testu AUSRIA), z każdego z preparatów antygenowych w dniach 0 i 30. W 45 dniu dokonano upustu, krwi, po czym na różnych surowicach wykonano różne testy. Przeciwciała Anty-HBs zmierzono zw pomocą zestawu AusAb (Abbott, St. Zjedn. Amer.). Wyniki podano w mIU/ml, wykorzystując wzór Hollingerw [Hollinger i inni, w „Virwl Hepwtitis“, Soumuess i inni. Franklin Institute Press, Philwdelphia, str. 451-466 (1982)].
Przeciwciała anty-preS oznaczono w bezpośrednim teście ELISA, zgodnie z którym wybrane syntetyczne peptydy (peptyd 12-32, peptyd 32-47 i peptyd 120-145) zaadsorbowauo na polistyrenowych ściankach mikropłytki (Immunoplate I; Nunc, Gibco Europe). Adsorpcję prowadzono przez noc w temperaturze 4°C z roztworu 0,5 pg/ml peptydu w 0,05 M buforze Na 2CO 3/NaHCO 3 o pH 9,6,100 μl/owgłębieuie. Niespecyficzne miejsca nw płytkach zablokowano na drodze inkubacji z 250 μl 5% płodowej surowicy bydlęcej w PBS w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C.
Dwukrotne rozcieńczenia surowicy mysiej w PBS zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej, 0,05% Tween 20, w ilości 100μl/zαgłębieuie, pozostawiono do proeyeagowwuia z płytką pokrytą peptydem w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C. Po przemyciu związane przeciwciała wykrywano za pomocą biotynyldwauego przeciwmysiego Ig z owcy (Amersham, 500-krdtnie rozcieńczenie w PBS zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej, 0,05% Tween 20,100pl/zagłębienie, inkubacja przez 1 godzinę w temperaturze 37°C), a następnie kompleksu streptawidyny z bidtyuyidwaną peroksydazą chrzanową (Amersham, 1000-krotnie rozcieńczenie w PBS zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej i 0,05% Tween 20) w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C, 100 pl/zagłębienie.
Między poszczególnymi inkubacjami płytki przemywano 0,15 M NaCl z 0,05% Tween 20. Ostatecznej wizualizacji dokonano za pomocą H2O2 i o-fcnyleuodiαminy jako chromogenu (15 pl H2O2 i 4 mg d-fenylenodiamiuy w 10 ml 0,1 M fosforanu potasu jako buforu o pH 6,0, 100pl (zagłębienie). Reakcję przerywano po upływie 20 minut dodając 25 pl 1N H2SO4, po czym mierzono abszybaucję przy 490 nm w urządzeniu Intermed Immuudreαdey, NJ 2000, Analis. Miano każdej z surowic wyliczano jako odwrotność największego rozcieńczenia zapewniającego gęstość optyczną 1,00.
W tabeli 7 przedstawiono odpowiednie miana przeciwciał wywołanych w myszach Balb/c, wyrażone jwko miano średnie geometryczne (GMT).
Tabela 7
Cząstki pochodzące z Dwwkw pg α-HBs GMT w mIU/ml «120-145 GMT α 12-32 gmtx α32-47 gmtx
Y1142 50 304000 629 5222 2255
(S, Lx) 5 234000 212 1490 785
Y1141 50 128000 202 211 <200
(S) 5 29000 <202 203 <200
(Miwuw wyrażano jako odwrotności rozcieńczenia przy OD równy 1,0.
168 597
Oczyszczone cząstki ze szczepów Y1307 (S, Δ gly Lx) lub RIT4376 [J. Petre i inni, Postgrad. Med. J. 63 (Suppl. 2), 73-81 (1987)] kaadsoybckanc na Al(OH )3 i wstrzyknięto grupom po 10 myszy Balb/c w dniach 0 i 30. Myszom spuszczono krew w dniu 45, po czym zebrane surowice badano pod kątem obecności przeciwciał anty-S i anty-preS, w sposób opisany powyżej. W tabeli 8 przedstawiono miana odpowiednich przeciwciał wywołanych u myszy Balb/c.
Tabela 8
Oczyszczone cząstki z Dawka pg -HBs mlU/ml 12-32x 32-47x
Y1307 1 7335 3128 658
(S, gly lx)
RIT4376 1 5232 100 100
(S)
Przykład XXXI. Integracja kasety ekspresji Lx w genomie S. cerevisiae na drodze homologicznej rekombinacji z udziałem Tyl.
Pożądane jest dokonanie integracji kaset ekspresji zarówno L/ jak i S w genomie żywiciela, aby uzyskać genetycznie stabilne szczepy i uniknąć 20-30% komórek bezplakmidokych obserwowanych zazwyczaj w 2 μ wektorach opartych na S. cerevisiae.
Plazmidy pRIT 13459 i pRIT13460 skonstruowano w sposób opisany dla wektora pRIT13009p w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr 009 325 oraz w pracy Jacobsa i innych, (Gene 80:279-291, 1989). Gel LEU2, wydzielony jako fragment XhoI-SalI o 2200 bp z wektora pCV9 (Peters i inni, Cell 19:765,1980), wstawiono między miejsca SalI elementu Tyl w pRIT12927, zastępując fragment oryginalny. Otrzymano w ten sposób pRIT13144. Fragment HindΠI-KpeI o 3050 bp, zawierający kasetę ekspresji Lx z pRIT13220 opisanego w przykładzie XXIV, zadano polimerazą T4 i zligowano z zadanym polimerazą T4 miejscem SalI pozostającym w pRIT13144, z zastosowaniem szczepu XL1-Blue z E. coli jako biorcy transformacji. XL1-Blue, opisany przez D. Hanahana w J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983) jest dostępny do kupna z Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, Kalifornia. Uzyskano obydwie orientacje insercji fragmentu kasety Hindlll-KpnI. pRIT13459 zawiera region terminatora ARG3 kasety w sąsiedztwie genu LEU2, a pRIT13460 zawiera promotor TDH3 kasety w sąsiedztwie genu LEU2.
Wielkie fragmenty XhoI o około 7700bp, zarówno z pRIT13459 jak i pRIT13460, oczyszczono na 1% żelach agarozowych i zastosowano do transformowania szczepu EJ cupl Δ 3d (patrz przykład XXVI powyżej) w celu uzyskania niezależności leucynowej, metodą Hinnena i innych (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929, 1978).
Z obydwu fragmentów uzyskano transformanty LEU+, po czym po 12 kolonii z każdej serii analizowano metodą blottingu Westerna pod kątem ekspresji białka Lx oraz metodą blottingu Southerna pod kątem liczby zintegrowanych kaset. W wyniku transformowania EJ cup 1 Δ 3d fragmentem z pRIT13459 uzyskano szczep Y1528, który wykazywał poziom ekspresji Lx równoważny z Y1306 i zawierał 3-5 kopii kasety. W wyniku transformowania EJ cup1 Δ 3d fragmentem z pRIT13460 uzyskano szczep Y1529 o właściwościach zbliżonych do Y1528.
Y1528 i Y1529 skojarzono ze szczepem Y1295 i jego matecznym trp- szczepem Y1215 (patrz przykład XXVI powyżej) oraz ze szczepem Y1367, uzyskując następujące diploidy: Y1528 X Y1295 = Y1586', Y1528 X Y1215 = Y1587, Y1528 X Y1367 = Y1588, Y1529 X Y1295 = Y1589, Y1529XY1215 = Y1590 oraz Y1529XY1367 = Y1591. Szczep Y1367, będący a, leu2, trpl, i zawierający 6-8 kopii tej samej kasety białka S co szczep Y1295, otrzymano z wykorzystaniem szczepów i technik opisanych w przypadku konstrukcji Y1295 w przykładzie XXVI.
Diploidalne szczepy wymienione powyżej selekcjonuje się pod względem poziomów ekspresji antygenu powierzchniowego oraz stosunku polipeptydów Lx i S w cząstkach, z wykorzystaniem blottingu Westerna, testu AUSRIA i epltcpcko-specrfickeego testu ELISA, stosując reagenty i metody opisane powyżej, zwłaszcza w przykładach XXIII i XXVII. Liczbę i stabilność zintegrowanych kaset ekspresji ustalono metodą blottingu Southerna. W razie potrzeby diploidalne szczepy można zarodnikować w celu uzyskania segregantów haplcidalnycą, które można następnie selekcjonować pod kątem ekspresji i stabilności genetycznej, w sposób opisany powyżej.
168 597
W wyniku insercji fragmentu HindllI-KpnI o 3050 bp zpRIT13222 wpRIT13144,a następnie postępowania w wyżej opisany sposób uzyskać można szczepy S. cerevisiae zawierające zintegrowane kopie kasety ekspresji Δ gly Lx oraz szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji cząstki S, Δ gly Lx.
Zgodnie z kolejnym rozwiązaniem dokonuje się insercji kasety ekspresji Lx w wektorze zbliżonym do pRIT13134-P (Jacobs i inni, Gene 80: 279-291, 1989), przenoszącym geny URA3 i CUP1 jako selektywne markery wstawione wewnątrz elementu Tyl w pRIT12927. Z wektora tego, o symbolu pRIT13501, odzyskać można fragment Bglll o około 6500 bp i zastosować go do transformowania i integracji w odpowiednich drożdżach-żywicielach, dokonując selekcji pod kątem transformantów URA+. Po transformacji ilość zintegrowanych kaset można dogodnie zwiększyć dokonując selekcji pod kątem zwiększonych poziomów odporności na miedź, jak to ujawniono w opisie patentowego zgłoszenia w Stanach Zjedn. Amer. nr 07/368 401.
Przykład XXXII. Ekspresja mieszanych cząstek S, Lx z determinantami subtypu ad i ay.
Wykonano konstrukcję integracyjnego wektora z kasetą ekpresji białka Lx subtypu ay dokonując wymiany fragmentu XbaI-SaCII kodującego C-końcową część białka S subtypu ad oraz część terminatora transkrypcji ARG na odpowiedni fragment genu S s subtypu ay. Plazmid pRIT13459 (przykład XXXI) strawiono endonukleazami Xbal i Scali, po czym największy fragment oczyszczono na 1% żelu agarozowym i zligowano z oczyszczonym fragmentem Xbal-Sacll o 1000 bp, z pRIT10780, uzyskując pRIT13500. pRIT10780 opisano w pracy De Wilde i innych, Develop. Biol. Standard, 59:99-107 (1985).
Sekwencja kodująca Lx w pRIT13500 zawiera DNA z sekwencjami takimi samymi jak w wirusie o specyficzności ad, od kodonu ATG do miejsca Xbal oraz DNA pochodzące z wirusa o specyficzności ayw, od miejsca Xbal do kodonu terminacji. Wytworzony w wyniku ekspresji polipeptyd Lx będzie zawierał determinanty subtypu ay.
Fragment Xhol o około 7700 bp z pRIT13500 można zintegrować w genomie drożdżowym i uzyskane transformanty skojarzyć ze szczepami takimi jak Y1295 i Y1367, sposobami opisanymi powyżej, tak aby uzyskać szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji mieszane cząstki, w których polipeptyd Lx należy do subtypu ay, a polipeptyd S do subtypu ad.
Powyższy opis i przykłady ilustrują wynalazek, nie ograniczając go. Wykonać można np. szereg dodatkowych modyfikacji białka L, takich jak częściowe deglikozylowanie lub kombinacja różnych wykonywanych w nim modyfikacji, oprócz wspomnianych w przykładach, w celu wytworzenia zmodyfikowanych białek L oraz cząstek o mieszanym lub jednorodnym składzie podjednostkowym, zawierających takie zmodyfikowane białka L, o składzie odpowiednim dla zastosowania w szczepionkach.
Do dodatkowych modyfikacji, które można wykonać, należy ponowne wprowadzanie sekwencji preS, wprowadzanie sekwencji kodujących pochodzących z sekwencji kodujących białko HBV, innych niż z genu kopertowego HBV, np. sekwencji z genu rdzeniowego HBV, albo też sekwencji kodujących immunologicznie istotne regiony aminokwasów z innych patogenów. Stosować można dodatkowe znane składniki wektorowe w celu zastąpienia specyficznych genów markerowych, promotorów i sekwencji linkerowych oraz innych elementów stosowanych w przykładach. Wykorzystywać można także komórki-żywiciele innego typu. Komórki-żywiciele, wektory oraz składniki wektorów zastosowane w przykładach stanowią jedynie ilustracje, tak że mogą być zastąpione innymi szczepami lub modyfikacjami. Wynalazek obejmuje swym zakresem wszystkie ulepszenia i modyfikacje objęte zastrzeżeniami.
168 597
Zestawienie pozycji literaturowych
Burrell i inni, Nature 279, 43-47 (1979)
Charney i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 2222-2226 (1979) Cregg i inni, Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985)
Dehoux i inni, Gene 48, 155-163 (1986)
Eble i inni, Mol. Cell. Biol. 6, 1454-63 (1986)
Eckart i inni, Klonierung und Chayakterlsleyueg der Gene fur die Dihydroxyacetoesynthease und Methano^idase aus der methylotrophen Hafe Hansenula polymcypha, praca dokt., Uiiiyersity Dusseldorf (1988)
Ellis i inni, Mol. Cell, Biol. 5, 1111-1121 (1985)
Galibert i inni, Nature 281, 646-650 (1979)
Grindley i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7176-7180 (1980) Harford i inni, Postgrad. Medical J. 63, Suppl. 2, 65-70 (1987) Heermann i inni, J. Virol. 52, 396-402 (1984)
Hitzemann i inni, Nature 293, 717-722 (1981)
Imamura i inni, J. Virclcgy 61, 3543-3549 (1987)
Itoh i inni, Biochem. Biophys. Res. Comm. 138, 268 (1986) Jacobs i inni, Gene 67, 259-269 (1988)
Janowicz i inni, Nuci. Acid. Res. 13, 3043-3062 (1985)
Jimenez i Davies, Nature 287, 869-871 (1980)
Kiegsmae i inni, Biotech. Gen. Eng. Res. 3, 377 (1985)
Klebe i inni, Gene 25, 333-341 (1983)
Kniskern i inni, Hepatology 8, 82-87 (1988)
Kohler i Milstein, Nature 227, 680-685 (1970)
Langley i inni, Gene 67, 229 (1988)
Ledeboer i inni, Nucleic Acid Res. 13, 3063-3081 (1985)
Lowry i inni, J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951)
Maniatis i inni, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982)
Maxam i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-64 (1977) McLachlan i inni, patent WO88/06185 (1988)
Michel i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7708-7712 (1984) Milich i inni, Science 228, 1195-1199 (1985)
Milich i inni, Immueologr Today 9, 380-386 (1988)
Murray i inni, zgłoszenie patentowe EP-A-13828 (1980)
Ou i inni, J. Virol. 61, 782 (1987)
Persing i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3440-44 (1985) Pontisso i inni, J. Virological Methods 6, 151-159 (1983) Roggenkamp i inni, Mol. Gen. Genetics. 302, (1986)
Rutgers i inni, Viral Hepatitis and Liver Disease: wyd. A. S. Zuckermann i A. R. Liss, New York 304-308 (1988)
R^gers i inni, Biotech. 6, 1065-1070 (1988)
Schwartz i Cantor, Cell. 37, 67 (1984)
Sninsky i inni, Nature 279, 346-348 (1979)
Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)
Stinchcomb i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4559-4563 Struhl i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 103^^1039 (1979) Szumeness i inni, New England J. Med. 303, 833-841 (1980)
Tischopp i inni, zgłoszenie patentowe EP-A-226 846
Tschumper i Carbon, Gene 10, 157-166 (1980)
Towbin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979) Valenzuela i inni, Nature 280, 815-819 (1979)
Valenzuela i inni, Nature 298, 347 (1982)
Valenzuela i inni, Biotech. 3, 317 (1985)
Wilson i Nakame w „Immunofluorescence and Related Techniques“
168 597
EcoRI
otwarty Sad - BsfnHI traktowany polimerazg T4
Ciał-Ciał duży- fragment oczyszczony
168 597
HBV adw
-pRIT 10616 (H8C3) pRIT 10633 (HB ίή)
Bst Ε II — Xba I fragment wstawiony pomiędzy miejsca Smal ; Xbal sites z pUC12 pRIT 13189
EcoRI SacI pRIT 13168 —pRIT 13190
BstX u ATG Bal 1 BamHI l AT6 1 , , Sali *TP XbaIii<>'Pst I ΑΤ» —Hindlll
1 1 PreS1 | preS2 T5T^~
u 21 52 120 133 175
.trawienie . .ligacja Bali, BamHI/TL polymeraza
Bst X 1 Barn ATG Xbal 1 1
21 52\ ,z133 175
otwarty fragment BamHI, Xba I + Synt adaptor-tNcol Xba I z pRIT 12331
Bst X . 1 Bam 1—Jt5 z'133 \ , ATG Xba
21 S2\ ΖΠ5
pRIT 13191
XbaI Sali + fragment Xbal Sali z pRIT 12660
BstX Barn ATG Xba BstX _i_ J—j-1-1—
52\ z133 \ z'175
Fig.15
168 597
Fig. 14
168 597
Fig.13
Sal I
Bst XI preSl
EcoRI pre S2
Xbal
EcoRI
BamHI ,(.112.65 p-)™1 , tARG3 'Sali syntetyczny fragment otwartyBamHI, Eco RI
BstXI //////////77//J EcoRI preSl . BamHI Xbal . M. Bean tra ktowany • ligowany
Xbal
EcoRI EcoRI · preS2+ S
168 597
Fig.11
Bam HI
Hind III
EcoRI
URA 3 lkb
-I
Fig .10
m
ifl.6
Sali
Xbal
HindIII
Pstl
EcoRI Nhel ggin
BamHI
EcoRI
Ncol
Fig.9
HindIII Bglll Hind III .EcoRI Xhol/Sal)
Pstl koniec
Psi I Pstl
H.polymorpha sekwencje
EcoRI Bglll BamHI | BspMII (S t u I/Asp 718) tępy koniecEcoRI EcoRI Pstl BamHI
σ»
X
ΜΟΧ
-Hansenula DNAFragment użyty do otrzymania I promotora [Fragmetit użyty d
EcoRI Sali 5 8 <2
EcoRI
I {ag λ
FMD {ag λ
Ikb
ORF
Hansenula ONA
EcoRI BamHI BamHI |~^fSŁ00bp
ORF fag λ otrzymania promotora
BamHI EcoRI
Fig.2 pUC19
168 597
os
La—
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (7)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego dużego powierzchniowego białka wirusa Hepatitis B, zawierającego fragmenty aminokwasowej sekwencji białka L (podtyp ad lub ay) i obejmującego reszty 12-52 lub resztę 12 z następującymi po niej resztami 14-52, następujące po resztach 12-52 i 14-52 reszty 133-145, a po nich reszty 175-400 białka L, znamienny tym, że w odpowiednim podłożu hoduje się komórki gospodarza stransformowane zrekombinowanym wektorem zawierającym zrekombinowaną cząsteczkę DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą ekspresję zmodyfikowanego białka L określonego powyżej, połączoną funkcjonalnie z sekwencją regulacyjną i wydziela się wytworzone białko z lizatu komórkowego lub z ekstraktu hodowli.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórka gospodarza wybrana jest z grupy obejmującej Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Candida, Kluyveromyces i Schizosaccharomyces.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę drożdży S. cerevisiae lub Hansenula polymorpha.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się komórki gospodarza stransformowane zrekombinowanym wektorem wybranym z grupy obejmującej pRIT12979, pRIT13192 i pRIT13193.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza, która została dodatkowo stransformowana zrekombinowanym wektorem DNA zdolnym do ekspresji białka S oraz wydziela się z lizatu komórkowego lub ekstraktu hodowli cząstki białka o mieszanym składzie podjednostkowym, obejmujące określone w zastrz. 1 reszty aminokwasów i sekwencję aminokwasów białka S.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że cząstka o mieszanym składzie podjednostkowym określona jest wzorem (L*, S), w którym L* oznacza zmodyfikowane białko L wirusa Hepatitis B zawierające sekwencję aminokwasów obejmującą reszty 12-52, a następnie kolejno reszty 133-145 i reszty 175-400 białka L, a S oznacza białko S powierzchniowego antygenu Hepatitis B.
  7. 7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że białko S należy do podtypu ad, a zmodyfikowane białko L należy do podtypu ay, lub odwrotnie.
PL90286209A 1989-07-25 1990-07-25 Sposób wytwarzania zmodyfikowanego duzego powierzchniowego bialka wirusa Hepatitis B PL PL PL168597B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38534289A 1989-07-25 1989-07-25
US38918489A 1989-08-03 1989-08-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL286209A1 PL286209A1 (en) 1991-04-08
PL168597B1 true PL168597B1 (pl) 1996-03-29

Family

ID=27010975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL90286209A PL168597B1 (pl) 1989-07-25 1990-07-25 Sposób wytwarzania zmodyfikowanego duzego powierzchniowego bialka wirusa Hepatitis B PL PL

Country Status (22)

Country Link
EP (1) EP0414374B1 (pl)
JP (1) JP3069907B2 (pl)
KR (1) KR0181940B1 (pl)
CN (1) CN1080304C (pl)
AT (1) ATE159031T1 (pl)
AU (3) AU5972890A (pl)
CA (1) CA2021762C (pl)
DE (1) DE69031556T2 (pl)
DK (1) DK0414374T3 (pl)
ES (1) ES2109921T3 (pl)
FI (1) FI903721A0 (pl)
GR (1) GR3025819T3 (pl)
HK (1) HK1003032A1 (pl)
HU (1) HU216013B (pl)
IE (1) IE902690A1 (pl)
IL (1) IL95153A0 (pl)
MA (1) MA21911A1 (pl)
NO (1) NO304268B1 (pl)
NZ (1) NZ234615A (pl)
PL (1) PL168597B1 (pl)
PT (1) PT94791B (pl)
SG (1) SG48175A1 (pl)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3856496T2 (de) * 1987-06-22 2002-06-27 Medeva Holdings B.V., Amsterdam Hepatitis-B-Oberflächenantigen enthaltendes Peptid
PL168408B1 (pl) * 1989-08-03 1996-02-29 Smithkline Beecham Biolog Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
IL101653A0 (en) * 1991-04-29 1992-12-30 Merck & Co Inc Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles
IL101651A0 (en) * 1991-04-29 1992-12-30 Merck & Co Inc Hepatitis b virus surface proteins with reduced host carbohydrate content
US6620414B2 (en) 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
MA22842A1 (fr) * 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
PT835663E (pt) 1992-05-23 2010-01-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacinas combinadas compreendendo o antigénio de superfície da hepatite b e outros antigénios
DK0671948T3 (da) 1992-06-25 1997-09-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparat indeholdende adjuvanser
AU685443B2 (en) * 1993-03-23 1998-01-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
EP0637631A3 (de) * 1993-07-30 1996-08-21 Immuno Ag Hoch effiziente Expression eines Polypeptids, das eine modifizierte preS1-Region des grossen Hepatitis B-Virus-Antigens enthält.
GB9503863D0 (en) * 1995-02-25 1995-04-19 Smithkline Beecham Biolog Vaccine compositions
US6488934B1 (en) 1995-02-25 2002-12-03 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Hepatitis B vaccine
US5658579A (en) * 1995-07-31 1997-08-19 The Procter & Gamble Company Cosmetic powder compositions having improved skin coverage
GB9623233D0 (en) 1996-11-07 1997-01-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
KR100372233B1 (ko) * 1997-03-12 2003-06-11 주식회사 코리아나화장품 미백 파우더, 그의 제조방법 및 그를 함유하는 메이크업 미백 화장료
EP1126876B1 (en) 1998-10-16 2007-03-21 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvant systems and vaccines
HUP0105070A2 (hu) * 1999-01-12 2002-04-29 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Hepatitis B vírus fertőzések megelőzésére és kezelésére szolgáló készlet
FR2803599B1 (fr) * 2000-01-06 2004-11-19 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau virus mute de l'hepatite b, ses constituants nucleiques et proteiques et leurs applications
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1648931B1 (en) 2003-07-21 2011-02-09 Transgene S.A. Multifunctional cytokines
CA2535562A1 (en) 2003-08-13 2005-03-03 Chiron Corporation Improved method of purifying tfpi and tfpi analogs
CA2605179A1 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Expressing hepatitis b virus surface antigen for vaccine preparation
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
MX2009002560A (es) 2006-09-07 2009-03-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna.
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
ES2822058T3 (es) 2006-09-26 2021-04-28 Infectious Disease Res Inst Composición de vacuna que contiene un adyuvante sintético
MX2009003325A (es) 2006-10-12 2009-04-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna que comprende un adyuvante de emulsion de aceite en agua.
SI2086582T1 (sl) 2006-10-12 2013-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cepivo, ki obsega emulzijo olja v vodi kot adjuvans
TW200908994A (en) 2007-04-20 2009-03-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2008248640A1 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
PT2437753T (pt) 2009-06-05 2016-11-23 Infectious Disease Res Inst Adjuvantes lipídicos de glucopiranosilo sintéticos e composições de vacina contendo os mesmos
CN102038948B (zh) * 2009-10-10 2013-04-10 复旦大学 一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗
EP2489724A4 (en) * 2009-10-16 2013-05-01 Kaneka Corp HANSENULA POLYMORPHA SUITABLE FOR ANTIBODY PRODUCTION, ANTIBODY MANUFACTURING METHODS THEREFOR AND ANTIBODIES MANUFACTURED IN THIS PROCEDURE
BR112012026227A2 (pt) 2010-04-13 2020-08-04 Celldex Therapeutics, Inc. anticorpo monoclonal humano ou humanizado, molécula biespecífica, vetor de expressão, célula transformada, composição, e, usos de um anticorpo
GB201105981D0 (en) 2011-04-08 2011-05-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
CA2832307A1 (en) 2011-04-08 2012-10-18 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
CN103087933B (zh) * 2011-11-08 2015-07-22 北京生物制品研究所 一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法
PT2811981T (pt) 2012-02-07 2019-06-12 Infectious Disease Res Inst Formulações adjuvantes melhoradas que compreendem os agonistas de tlr4 e os seus métodos de utilização
CN102643349B (zh) * 2012-04-17 2013-12-18 中国医学科学院医学生物学研究所 携带乙肝病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备
DK2850431T3 (en) 2012-05-16 2018-07-16 Immune Design Corp Vaccines against HSV-2
US9657076B2 (en) 2012-10-23 2017-05-23 Emory University GM-CSF and IL-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
CN105209047B (zh) 2013-04-18 2020-08-18 免疫设计股份有限公司 用于癌症治疗的gla单一疗法
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
CN106163551A (zh) 2013-12-31 2016-11-23 传染性疾病研究院 单瓶疫苗制剂
EP3268037B1 (en) 2015-03-09 2022-08-31 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
CN105797151A (zh) * 2016-03-25 2016-07-27 汪和睦 一种基于重组汉逊酵母的高剂量乙型肝炎疫苗
US20200377606A1 (en) 2016-04-18 2020-12-03 Celldex Therapeutics, Inc. Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof
IL299285B2 (en) 2016-05-16 2024-12-01 Access To Advanced Health Inst Formulation containing tlr agonist and methods of use
US11266602B2 (en) 2016-05-16 2022-03-08 Infectious Disease Research Institute PEGylated liposomes and methods of use
JP7140684B2 (ja) 2016-06-01 2022-09-21 アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート サイジング剤含有ナノアラム粒子
BR112019026615B1 (pt) 2017-06-15 2022-08-02 Infectious Disease Research Institute Carreadores lipídicos nanoestruturados e emulsões estáveis e usos dos mesmos
EP3678695A1 (en) 2017-09-08 2020-07-15 Infectious Disease Research Institute Liposomal formulations comprising saponin and methods of use
AU2019256383A1 (en) 2018-04-17 2020-11-26 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-CD27 and anti-PD-L1 antibodies and bispecific constructs
WO2020123444A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy
MX2021014363A (es) 2019-05-25 2022-02-21 Infectious Disease Res Inst Composicion y metodo para secar por pulverizacion una emulsion de vacuna adyuvante.
AU2021337493A1 (en) 2020-09-04 2023-05-18 Access To Advanced Health Institute Co-lyophilized rna and nanostructured lipid carrier
BR112023020303A2 (pt) 2021-04-09 2023-11-14 Celldex Therapeutics Inc Anticorpos contra ilt4, anticorpo anti-ilt4/pd-l1 bispecífico e seus usos
WO2023077521A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Celldex Therapeutics, Inc Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs
WO2024052882A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Access To Advanced Health Institute Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0288198A3 (en) * 1987-04-20 1989-03-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of peptide

Also Published As

Publication number Publication date
DE69031556D1 (de) 1997-11-13
HK1003032A1 (en) 1998-09-30
CN1080304C (zh) 2002-03-06
NO903285D0 (no) 1990-07-24
PT94791A (pt) 1991-03-20
HU216013B (hu) 1999-04-28
CA2021762C (en) 2000-09-12
IL95153A0 (en) 1991-06-10
ATE159031T1 (de) 1997-10-15
EP0414374B1 (en) 1997-10-08
KR910003103A (ko) 1991-02-26
NZ234615A (en) 1992-12-23
HU904615D0 (en) 1991-01-28
NO304268B1 (no) 1998-11-23
IE902690A1 (en) 1991-02-27
ES2109921T3 (es) 1998-02-01
AU7752894A (en) 1995-02-16
CN1052331A (zh) 1991-06-19
DK0414374T3 (da) 1998-03-09
PL286209A1 (en) 1991-04-08
EP0414374A3 (en) 1992-12-16
AU714652B2 (en) 2000-01-06
GR3025819T3 (en) 1998-03-31
FI903721A0 (fi) 1990-07-24
CA2021762A1 (en) 1991-01-26
EP0414374A2 (en) 1991-02-27
HUT57266A (en) 1991-11-28
DE69031556T2 (de) 1998-05-14
NO903285L (no) 1991-01-28
MA21911A1 (fr) 1991-04-01
PT94791B (pt) 1997-09-30
KR0181940B1 (ko) 1999-04-01
JPH0380083A (ja) 1991-04-04
AU5972890A (en) 1991-01-31
JP3069907B2 (ja) 2000-07-24
AU1896897A (en) 1997-06-19
SG48175A1 (en) 1998-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL168597B1 (pl) Sposób wytwarzania zmodyfikowanego duzego powierzchniowego bialka wirusa Hepatitis B PL PL
Cheng et al. Hepatitis B virus large surface protein is not secreted but is immunogenic when selectively expressed by recombinant vaccinia virus
Charbit et al. Presentation of two epitopes of the preS2 region of hepatitis B virus on live recombinant bacteria.
Wu et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.
AP56A (en) Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them.
US6306625B1 (en) Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast
CA1341642C (en) Synthesis of hepatitis b virus surface antigen by yeast
KR940005588B1 (ko) 효모에서 b형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법
KR100208129B1 (ko) B형 간염 백신
US6544757B1 (en) Synthesis of human virus antigens by yeast
EP0563093B1 (en) A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
Gerlich et al. Functions of hepatitis B virus proteins and molecular targets for protective immunity
IL74544A (en) GAXBH peptide antigens and tests using the above
US5324513A (en) Composition useful for the fabrication of vaccines
Cheng et al. Selective synthesis and secretion of particles composed of the hepatitis B virus middle surface protein directed by a recombinant vaccinia virus: induction of antibodies to pre-S and S epitopes
US6103519A (en) Antigens and methods therefor
KR930003609B1 (ko) B형간염 비루스표면 항원 및 중합된 인체혈청 알부민의 수용체를 함유하는 폴리펩티드의 제조방법
KR970007153B1 (ko) B형 간염 표면 항원 백신
CA2067590A1 (en) Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles
Kniskern et al. The application of molecular biology to the development of novel vaccines
WO1994001132A1 (en) VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE
EP0533263A2 (en) A multivalent hepatitis B virus vaccine
EP0340806B1 (en) Synthesis of human virus antigens by yeast
CA1340934C (en) Hepatitis b surface antigen formed by recombinant dna techniques, vaccines, diagnostics, cell lines and method of forming same
Persing Identification and characterization of the presurface proteins of hepatitis B virus