PL166895B1 - Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PL - Google Patents
Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PLInfo
- Publication number
- PL166895B1 PL166895B1 PL91293188A PL29318891A PL166895B1 PL 166895 B1 PL166895 B1 PL 166895B1 PL 91293188 A PL91293188 A PL 91293188A PL 29318891 A PL29318891 A PL 29318891A PL 166895 B1 PL166895 B1 PL 166895B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- primer
- dna
- nucleic acid
- nucleic acids
- extension product
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 93
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 58
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 50
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 38
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 32
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 32
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 18
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 14
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 12
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 3
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims 1
- 238000007692 polyacrylamide-agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 95
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 86
- 239000000047 product Substances 0.000 description 51
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 29
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 16
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 14
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 12
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 101001096074 Homo sapiens Regenerating islet-derived protein 4 Proteins 0.000 description 6
- 102100037889 Regenerating islet-derived protein 4 Human genes 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 5
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 5
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 5
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 5
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 2
- 235000009432 Gossypium hirsutum Nutrition 0.000 description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101001024703 Homo sapiens Nck-associated protein 5 Proteins 0.000 description 1
- HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-J ITP(4-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N Meprobamate Chemical compound NC(=O)OCC(C)(CCC)COC(N)=O NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036946 Nck-associated protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000002167 anodic stripping potentiometry Methods 0.000 description 1
- 206010003664 atrial septal defect Diseases 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N pirenzepine hydrochloride Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].C1CN(C)CCN1CC(=O)N1C2=NC=CC=C2NC(=O)C2=CC=CC=C21 FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Inverter Devices (AREA)
- Control Of Motors That Do Not Use Commutators (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych w losowych segmentach kwasów nukleinowych, znamienny tym, ze obejmuje: /a/ oddzielne przeprowadzenie reakcji przedluzenia na kazdym z co najmniej dwóch kwasów nukleinowych, która to reakcja polega na: /i/ kontaktowaniu kwasów nukleinowych z co najmniej jednym starterem oligonukleo- tydowym o dlugosci wiekszej niz 7 nukleotydów w takich warunkach, ze zachodzi synteza produktu przedluzenia co najmniej jednego startera dla co najmniej jednego kwasu nukleino- wego i /b/ porównanie wyników oddzielnie przeprowadzonych reakcji przedluzenia pod katem róznic. PL PL PL
Description
Wynalazek dotyczy sposobu coecóżniania kwasów nukleinowych. W szczególności, losowe segmenty kwasu nukleinowego coeróżnia się pczee kocdwnywanie różnic nukleotydowyrh w ucoduktach reakcji uceedłużania.
Genetyka opieca się na identyfikowaniu i charakteryzowaniu mutacji, które są emianami DNA /uolimocfiemy DNA/ spowodowanymi podstawieniem, inseccją bądź delecją nukleotydu. Roewinioto seeceg technik uocównywania homologicenych segmentów DNA w celu określenia, cey segmenty te są identycene, cey też cóżnią się jednym lub więkseą licebą nukleotydów. Pcaktycene eastosowania tych technik obejmują genetycene aiagnaeawanie chorób, stosowanie w sądownictwie, mauowanie ludekiego genomu i eastosowania w żalnictwin.
Najskuteceniejseą metodą uocównywania segmentów DNA jest ueSne okicilenie sekwencji nukleatyaawnj każdego segmentu. PczykSady stosowania sekwencjonowania do badania mutacji w genach ludekich ouisano w uublikacjach: Engelke i wsu., Pcoc. Natl. Acad. bci. U.b.A., 85:544-548 /1988/ oraz Wong i wsu., Nature 330:384-386 /1987/. Obecnie stosowanie ueSnego sekwencjonowania w celu uocównania ealeagin kilku segmentów DNA nie jest ucaktycene, kaniegaż aenaczenie, intecu^^tacja i uorównywanie infocmacji sekwencyjnych jest ebyt uracochSonne.
Dla celów makawania genetycenego najceościnj stosuje się kczeszukiwanin uod kątem uolimo^-emów DNA skawadawanych mutacjami, uolegające na trawieniu DNA endanukleazami restrykcyjnymi i analieowaniu otczymanych fragmentów, jak ouisali: Botstein i wsu. Am. J. Hum. Genet., 32:314-331 /1980/; White i wsu., bci. Am.,258:40-48 /1988/. Mutacje, któce mają wuSyw na sekwencje żozkaenawane uczee endonukleaeę uniemożliwiają enzymatycenn uczecięcie w tym miejscu, uczee co obrae DNA uoddanego takiemu cięciu ulega emirnie. Kwasy DNA uażdwnujn się seukając różnic w długościach fragmentów restrykcyjnych. Główną wadą tej metody /enanej jako mauowanie ualimażfizmu długości fragmentów cestcykcyjnych albo mauowanie RFLP/ jest bcak możliwości wykcycia takich mutacji, które nie mają wuSywu na cięcie enaanukleaeą restcykcyjną. Tak więc metoda ta nie uoewala na wykcycie seeregu mutacji. Oseacagana, że badanie wykonane uczee Jeffreys a, Cell, 18:1-18 /1979/umożliwiło wykcycie jedynie 0,7% wariantów mutacyjnych obecnych w regionie ludekiego DNA o długości 40 000 uac easad. Inną tn^<^^o.ś<riąjest to, że metody stosowane do wykcywania kalimażfizmdw długości fragmentów ^^st^^kicyjnych są budzo uracochłonne, ewSaszcea techniki obejmujące analieę blotingową bouthecn.
buosób uolegający na kczndSużaniu startera ouisany w ^ΠϊΖι^ϊ: Pcoudioot i wsu., bcience 209: 13129-1336 /1980/ stosowano seecoko do badania stcuktucy RNA, jak cównież do chacaktecyzowania DNA, uatce na uczykład Engelke i wsu., Pcoc. Natl. Acad. bci. U.b.A., 85:544-548 /1988/. buosób ten kaleza na hybżydyzawaniu enakowanego stacteca aliganuklnatyaawega e matcycą RNA lub DNA, a nastęunie na eastosowaniu kalimncazy DNA i trójfosfocanów aneaksynukleatyaawych w celu kceedłużnnia startera aż do końca 5 matcycy. Nastęunie enakowany ucodukt użzedłużenia frakcjonuje się według wielkości, ewykle uczee nlnktcafarezę w denatucującym żelu kaliakżylaamidagym. W kczyuadku każównywania homo^^nych segmentów DNA, suosób ten uoewala na wykcycie różnic suowodowanych inseccją lub delecją nukleotydu. Z uwagi na to, że jedynym kcyterium aznacznnia ucoduktu ^ze^użenia starterajest wielkość, skasabem tym nie można wykcyc różnic skagaaawanych uodstawieniem nukleotydu.
Mullis i wsu., uatent btanów Zjednoceonych Amecyki nc 4 683 195 orae Mullis, uatent btanów Zjednoceonych Amecyki nc 4 683 202 ujawniają reakcję seczekiania łańcuchów ea uomocą ualimnrazy, stosowaną do amuli^ikowania jakiegokolwiek skecyficznega segmentu kwasu nukleinowego. Te metody analitycene eastosowano do wykcycia ualimażfiemów uakczee amklifikację segmentów docelowego DNA wybranych e badanych genomów. Wada tych metod uolega na tym, że koniecena jest taka enajomość seeregu 2asad obu końców skecyficennga
166 895 segmentu, która umożliwia zaprojektowanie starterów oligonukleotydowych, które będą hybrydyzowały z różnymi nićmi docelowego segmentu. Uzyskanie wymaganych dla zaprojektowania starterów informacji odnośnie sekwencji docelowych genomów jest bardzo pracochłonne. M.H.Skolnic i R.B.Wallace, Simultaneous Analysis of Multiple Polymorphic Loci Using Amplified Sequence Polymorphisms /ASPs/, Genomics 2: 273-278.
Amplifikację przy użyciu oligonukleotydów o losowej sekwencji opisano w teoretycznych założeniach mapowania genomu wyższych eukariotów w Happy mapping: a Proposal for Rinkage Mapping the Human Genome, P.H. Dear i P.R. Cook, Nucleic Acids Research, tom 17, nr 17, 6795-6807/1989/. Autorzy proponują rozpoznanie odległości pomiędzy 5 000 różnych segmentów DNA ludzkiego genomowego DNA amplifikowanych na drodze reakcji szczepiania łańcuchów za pomocą polimerazy /PCR/ przy użyciu kombinacji różnych par starterów o dowolnej sekwencji. Matrycowy DNA izoluje się oddzielnie z pojedynczych komórek haploidalnych organizmu. Ich metoda sugeruje tworzenie map podających fizyczne umiejscowienie tych regionów DNA organizmów, które dają początek zamplifikowanym produktom.
Można tego dokonać przez identyfikowanie produktów reakcji PCR ulegających kompliiikacji z tego samego kawałka DNA, ustalając w ten sposób ich fizyczną odległość. W metodzie Dear a i Cook a polimorfizmy byłyby wyłączone z analizy. Ich idea wymaga identyfikacji tego samego segmentu DNA w wielu różnych komórkach haploidalnych, a występowanie polimorfizmów uniemożliwia spełnienie tego wymogu. Dobre zmapowanie, choć skuteczne jeśli chodzi o opisanie fizycznej odległości pomiędzy dwoma produktami PCR, nie pozwala na umiejscowienie cechy genetycznej będącej przedmiotem zainteresowania. Można tego dokonać jedynie przez skorelowanie segregacji cechy genetycznej zaistniałej w wyniku płciowego krzyżowania dwóch osobników, z szeregiem różnych polimorfizmów. Autorzy twierdzą, że konieczne jest stosowanie par starterów o długości większej niż 9-10 nukleotydów, ponieważ pary starterów 9 do 10-nukleotydowych działają jako startery niewydajnie.
Obecny wynalazek dotyczy sposobu wykrywania genetycznych polimorfizmów w losowych, niespecyficznych segmentach kwasu nukleinowego. Sposób wykorzystuje reakcję zapoczątkowaną przez oligonukleotyd /y/ wytworzony z łatwością bez wiedzy o sekwencji zasad amplikowanych segmentów.
Przedmiotem obecnego wynalazku jest sposób rozróżniania kwasów nukleinowych na podstawie różnic nukleotydowych w losowych segmentach kwasu nukleinowego, obejmujący:
/a/ oddzielne przeprowadzenie reakcji przedłużenia na każdym z co najmniej dwóch kwasów nukleinowych, która to reakcja polega na: /i/ kontaktowaniu kwasów nukleinowych z co najmniej jednym starterem oligonukleotydowym o długości większej niż 7 nukleotydów w takich warunkach, że zachodzi synteza produktu przedłużenia co najmniej jednego startera dla co najmniej jednego kwasu nukleinowego i /b/ porównaniu wyników oddzielnie przeprowadzonych reakcji przedłużenia po kątem różnic.
W innej postaci wynalazku, po etapie /i/, a przed etapem Pol prowadzi się dodatkowe etapy: /ii/ oddzielenia produktu przedłużenia od jego nici komplementarnej oraz /iii/ amplifikowanie losowego segmentu kwasu nukleinowego na drodze kontaktowania oddzielonego produktu przedłużenia ze starterem z etapu /i/ w takich warunkach, że następuje amplifikacja produktu przedłużenia przy użyciu jako matrycy oddzielonego produktu przedłużenia.
W jeszcze innej postaci wynalazku różnicę w produkcie przedłużenia stosuje się jako marker do konstruowania mapy genetycznej i do rozróżniania lub identyfikowania osobników.
Figura 1 przedstawia fotografię żelu porównującą produkty amplifikacji DNA wyizolowanego z nasion soi Glyine max /Bonus/ /nieparzysta numeracja linii/ i z nasion soi Glycine soja /PI 81762/ /parzysta numeracja linii/, powstałe przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych o różnych sekwencjach. Figura 2 przedstawia fotografię żelu porównującą produkty amplifikacji powstałe przy zastosowaniu startera 10b dla 19 osobników potomnych pokolenia F2, powstałych w wyniku krzyżowania pomiędzy Bonus i PI 81762. Figura 3 przedstawia fotografię żelu porównującą produkty amplifikacji DNA z Bonus /nieparzysta numeracja linii/ i z PI 81762 /parzysta numeracja linii/. Zastosowano starter AP8 oraz 10 innych starterów różniących się od AP8 pojedynczym nukleotydem. Figura 4 przedstawia fotografię żelu porów166 895 nującą produkty amplifikacji DNA pochodzącego z Zea /kukurydza/, Gossypium hirsutum /bawełna/, Saccharomyces cerevisiae /drożdże/ i Arabidopsis thaliana, powstałe przy zastosowaniu różnych starterów. Figura 5 przedstawia fotografię żelu demonstrującą wyniki amplifikacji przy użyciu starterów o długości od sześciu do dziesięciu nukleotydów. Figura 6 przedstawia fotografię żelu porównującą produkty amplifikacji DNA z sześciu transformowanych limfoblastów Homo sapiens /ludzkich/. Figura 7 przedstawia wykresy densytometryczne dotyczące osobników pokolenia F2 powstałych w wyniku krzyżowania pomiędzy Bonus i PI 81762 - homozygotycznych w odniesieniu do polimorfizmu - /2 kopie/ /7A/, heterozygotycznych /7B/ i homozygotycznych - /0 kopii/ /7C/.
Stosowane tu wyrażenie oligonukleotyd odnosi się do cząsteczki zawierającej dwa lub większą liczbę dezoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów.
Stosowane tu wyrażenie starter odnosi się do oligonukleotydu o dowolnej sekwencji, występującego albo naturalnie - jak w oczyszczonym produkcie trawienia, albo wytworzonego syntetycznie, który zdolny jest do działaniajako punkt inicjacji syntezy w warunkach, w których następuje synteza komplementarnego do nici kwasu nukleinowego produktu przedłużenia startera, to jest w obecności nukleotydów i czynnika wywołującego polimeryzację, takiego jak polimeraza DNA, w odpowiedniej temperaturze i przy odpowiednim pH. Startery korzystnie stanowią sekwencje nie tworzące ani drugorzędowej struktury przez parowanie zasad z innymi kopiami startera, ani też sekwencji o konfiguracji szpilki do włosów. Sekwencje te dogodnie projektuje się przy pomocy komputera lub wybiera się losowo z banku genów. Z uwagi na uzyskanie maksymalnej wydajności amplifikacji, korzystnie stosuje się starter jednoniciowy, lecz alternatywnie można zastosować starter dwuniciowy. W przypadku dwuniciowej budowy startera, poddaje się go obróbce rozdzielającej nici przed· zastosowaniem do wytworzenia, produktów przedłużenia. Korzystnie, jako starter stosuje się oligodezoksyrybonukleotyd.
Stosowane tu wyrażenie losowy segment kwasu nukleinowego odnosi się · do jakiejkolwiek matrycy lub segmentu kwasu nukleinowego, poddawanego działaniu startera, przy czym informacje odnośnie sekwencji tego kwasu nukleinowego nie są potrzebne przed prowadzeniem etapu przedłużania.
Zgłaszający odkryli, że do zaprojektowania starterów, które będą hybrydyzowały z róż-, nymi nićmi matrycy, nie jest wymagana szczegółowa znajomość dostatecznej liczby zasad obu końców tej matrycy.
W sposobie według wynalazku stosuje się co najmniej jeden starter o długości większej niż 7 nukleotydów. Startery krótsze niż 7-mio nukleotydowe działają niewydajnie. Startery syntetyzuje się przy użyciu standardowych technik znanych fachowcom. W korzystnej postaci wynalazku stosuje się co najmniej jeden starter o długości od 9 do 10 nukleotydów.
Dogodnie, stosuje się jeden starter. Co najmniej jeden stosowany starter może być biotynylowany. Oznacza to, że starter może być kowalentnie związany z biotyną lub z jej, analogiem. Zaleca się wybór takiej grupy wiążącej, która będzie pozwalała na zachodzenie reakcji przedłużania w opisanych tu warunkach.
W sposobie rozróżniania kwasów nukleinowych według wynalazku porównuje się różnice w produktach reakcji przedłużenia prowadzonych oddzielnie na co najmniej dwóch losowych segmentach kwasów nukleinowych.
W pierwszym etapie sposobu /a/ prowadzi się reakcję przedłużenia oddzielnie na każdym z co najmniej dwóch kwasów nukleinowych przez /i/ kontaktowanie kwasów nukleinowych z co najmniej jednym starterem oligonukleotydowym o długości większej niż 7 nukleotydów w takich warunkach, że zachodzi synteza produktu przedłużenia co najmniej jednego startera dla co najmniej jednego kwasu nukleinowego, przy czym produkt przedłużeniajest komplementarny do losowego segmentu kwasu nukleinowego. W korzystnym wykonaniu tej reakcji wykorzystuje się zdolność większości polimeraz DNA do katalizowania reakcji przedłużenia startera. Do zajścia reakcji przedłużenia startera wymagany jest substrat w postaci kwasu nukleinowego ze starterem zhybrydyzowanym z nicią matrycy tak, że koniec 3 startera znajduje się przy końcu 5 nici matrycy. Ponieważ najczęściej stosuje się metody przedłużenia startera, którym jest DNA, nicią matrycy jest albo DNA albo RNA, a do przedłużania startera stosuje się polimerazę DNA. Podstawowe warunki wymagane do przeprowadzenia reakcji przedłużenia startera omówiono
166 895 w publikacji: Mullis i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 oraz Mullis, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202.
Sposobem według wynalazku analizuje się kwasy nukleinowe DNA lub RNA, zarówno w postaci jedno- jak i dwuniciowej. Jako wyjściowy kwas nukleinowy stosuje się kwas nukleinowy z dowolnego źródła, w postaci oczyszczonej lub nieoczyszczonej. Przykładowo, stosuje się naturalny DNA lub RNA. jakiegokolwiek pochodzenia - z wirusów, bakterii i z organizmów wyższych takich jak rośliny, zwierzęta i drobnoustroje oraz klonowany DNA lub RNA. Ponadto, kwas nukleinowy może stanowić całość kwasu nukleinowego, lub frakcję wieloskładnikowej mieszaniny kwasów nukleinowych. Korzystnie jako kwas nukleinowy rozumie się kwas dezoksyrybonukleinowy. Nieoczekiwanie okazało się, że sposób według wynalazku jest użyteczny do rozróżniania kwasów nukleinowych pochodzących z różnych organizmów zarówno o krótkim DNA genomowym, jak DNA drożdży /2 x 107 par zasad w genomie/ jak i o długim DNA genomowym, jak ludzki DNA /3,0 x 109 par zasad w genomie/.
Wybór polimerazy stosowanej w reakcji przedłużenia zależy od charakteru matrycy. Dla nici matrycy w postaci DNA, odpowiednie, dostępne w handlu polimerazy DNA obejmują polimerazę DNA otrzymaną z bakterii odpornych na działanie temperatury Thermus aquaticus /polimeraza Taq/ lub inne polimerazy termostabilne.
Przypuszcza się, że w sposobie według wynalazku mogą być również użyteczne strukturalne warianty i zmodyfikowane formy tej polimerazy i innych polimeraz DNA. W przypadku, gdy matryca jest RNA, jako poiimerazę DNA stosuje się odwrotną transkryptazę. W obecności substratów w postaci trój fosforanów nukleotydowych, naturalnych bądź ich analogów, polimeraza przedłuża starter w kierunku 3 . Sekwencja produktu przedłużenia jest na ogół komplementarna do odpowiadającej jej sekwencji nici matrycy.
Trójfosforany nukleotydowe stosuje się jak opisano w PCR Protocols, A. Guide to Methods and Applications, M.A.Innis, D.H.Gelfand, J.-J.Sninsky i T.J.White, str. 3-12, wydawca Academic Press /1989/, oraz w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 i 4 683 204. Substraty można modyfikować sposobami znanymi fachowcom w celu prowadzenia różnych doświadczeń. Przykładowo, co najmniej jeden z substratów w postaci naturalnego trójfosforanu nukleotydowego można zastąpić analogiem o innej ruchliwości, jak podano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 879 214.
W innej postaci wynalazku, po przeprowadzeniu etapu /i/ prowadzi się dodatkowe etapy - /ii/ oddzielenia produktu przedłużenia od jego nici komplementarnej i /iii/ amplifikowania losowego segmentu kwasu nukleinowego poprzez kontakowanie oddzielonego produktu przedłużenia ze starterem z etapu /i/ w takich warunkach, że następuje amplifikacja produktu przedłużenia przy użyciu jako matrycy oddzielonego produktu przedłużenia. Reakcję amplifikacji ujawnili Mullis i wsp. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 oraz Mullis w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202. Szczegółowe warunki amplifikacji matrycy kwasu nukleinowego podano w publikacji M.A.Innis i D.H. Geifand, PCR Protocols, A Guode to methods and Applications, M.A.Innis, D.H.Gelfand, J.-J.Sninsky i T.J.White, str. 3,12, wydawnictwo Academic Press /1989/.
W szczególności, opracowanie Mullisa dotyczy sposobu amplifikowania jakiejkolwiek pożądanej sekwencji kwasu nukleinowego zawartej w kwasie nukleinowym lub w mieszaninie kwasów. Sposób Mullisa polega na traktowaniu osobnych komplementarnych nici kwasu nukleinowego molowym nadmiarem dwóch starterów oligonukleotydowych i wydłużaniu startera, w wyniku czego powstają komplementarne produkty przedłużenia startera, stanowiące matrycę do syntetyzowania pożądanej sekwencji kwasu nukleinowego. Startery Mullisa są zaprojektowane tak, aby były komplementarne w wystarczającym stopniu w stosunku do różnych nici każdej specyficznej sekwencji poddawanej amplifikacji. Poszczególne etapy reakcji można prowadzić stopniowo lub jednocześnie, przy czym można je powtarzać tak często, jak jest to pożądane.
W reakcjach przedłużania według wynalazku, kwas nukleinowy kontaktuje się z co najmniej jednym opisanym tu starterem. Produkt przedłużenia oddziela się od komplementarnej nici losowego kwasu nukleinowego, na której zachodziła synteza, otrzymując cząsteczkę jednoniciową, a losowy segment kwasu nukleinowego amplifikuje się przez skontaktowanie jednoni166 895 ciowego produktu przedłużenia z poprzednim starterem, jak ujawniono na przykład w PCR Protocols i w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202, w wyniku czego zachodzi amplifikacja produktu przedłużenia na matrycy w postaci uprzednio otrzymanej pojedynczej nici /to jest oddzielonego produktu przedłużenia/.
Opisane tu etapy prowadzi się kolejno lub jednocześnie, jak podano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 i 4 683 202. Ponadto, etapy te można powtarzać aż do osiągnięcia pożądanego poziomu amplifikacji sekwencji, jak ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 i 4 683 202.
Po zakończeniu reakcji przedłużenia, wyniki otrzymane w etapie /b/ porównuje się pod kątem różnic. Na ogół wynikiem jest wytworzony produkt lub brak produktu. Bardziej szczegółowo, produkty porównuje się pod 'kątem określenia, czy segmenty są identyczne, lub czy występują różnice w jednym, lub większej liczbie nukleotydów, spowodowane podstawieniem, insercją lub delecją nukleotydu. Różnice pomiędzy produktami przybierają postać, na przykład różnicy w wielkości, w sekwencji, w ilości wytworzonego produktu oraz w liczbie powstałych produktów.
Porównań dokonuje się przy użyciu szeregu technik znanych fachowcom, przykładowo, przez określenie sekwencji nukleotydowej amplifikowanego segmentu lub na drodze analizy RELP. Dogodnie, porównania dokonuje się przy zastosowaniu środka frakcjonującego pod względem wielkości. W przypadku uzyskania dostatecznie dobrego wyniku, można wykryć różnice w pojedyńczych nukleotydach. Korzystnie stosuje się elektroforezę w żelu poliakryloamidowym lub agarozowym.
Proste obejrzenie wyniku elektroforezy w żelu może ujawnić polimorfizmy, które rzutują na wielkość i ilość amplikowanego segmentu, jak również te polimorfizmy, które determinują, czy dany segment ulegnie amplifikacji.
Polimorfizmy wykryte sposobem według wynalazku można określić ilościowo przez poddanie zamplifikowanego produktu umiejscowionego w żelu znanym technikom densytometrycznym. Takie określenie ilościowe jest ważne w niektórych zastosowaniach, gdzie konieczne jest odróżnienie polimorfizmów homozygotycznych od heterozygotycznych. Zgłaszający wykazali, że homozygota posiadająca dwie kopie polimorfizmu tworzy dwa razy więcej produktu, niż heterozygota.
Sposób według wynalazku znajduje praktyczne zastosowania. Przykłady takich zastosowań obejmują mapowanie genetyczne oraz rozróżnianie i identyfikowanie osobników.
Zgłaszający wykazali, że polimorfizmy lub różnice ujawnione sposobem według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie przy tworzeniu map genetycznych. Na ogół mapę genetyczną konstruuje się przy zastosowaniu analizy RELP. Można skonstruować mapę genetyczną organizmu zastępując markery genetyczne RELP opisane przykładowo przez Bolsein’ a D. w Construction of a Genetic Linkage Map in Man Using Restriction Fragment Length Polymorfisms, Am.J.Hum.Genet 32: 314-331 /1980/ , markerami genetycznymi w postaci polimorfizmów wykrytych sposobem według wynalazku. Mapowanie genetyczne przy użyciu jako markerów polimorfizmów, według wynalazku, znajduje ważne zastosowanie w hodowli roślin, jako że zgłaszający dowiedli, że polimorfizmy wykryte sposobem według wynalazku stanowią dziedziczne markery genetyczne. Markery te, tak samo jak markery RELP opisane w publikacji: Tanksley S.D. RELP Mapping in Plant Breeding: Nev Tools for an Old Science, Bio/Technology tom 7, Marzec 1989, str. 257-264, można zastosować jako sondy do badania obecności lub nieobecności niektórych części chromosonu, jako że zgłaszający wykazali, że polimorfizmy wykryte sposobem według wynalazku ulegają segregacji razem ze standardowymi markerami rElP. Ponadto, sposób według wynalazku można zastosować do skonstruowania tak zwanego odcisku palca kwasu nukleinowego. Takie odciski są .specyficzne dla poszczególnych osobników i mogą znaleźć zastosowanie do identyfikowania lub rozróżniania osobników. Można je konstruować stosując szereg polimorfizmów otrzymanych przy użyciu różnych starterów, które to polimorfizmy wykrywa się sposobem według wynalazku, tak jak do skonstruowania odcisku palca stosuje się polimorfizmy, według opracowania: Jeffrey A.J., Individual-Specific Fingerprints of Human DNA, Nature, tom 316, 4 lipca 1985. Tak więc, genomy porównuje się pod kątem obecności lub nieobecności polimorfizmów.
166 895
Przykład 1 obrazuje syntezę i oczyszczanie starterów oligonukleotydowych. Przykład 2 służy wykazaniu, że 10 różnych starterów oligonukleotydowych zdolnych jest do amplifikowania losowych segmentów kwasu nukleinowego i że możliwe jest wykrycie polimorfizmów pomiędzy próbkami genomowego DNA pochodzącego z dwóch upraw soi. Przykład 3 wykazuje, że polimorfizmy wykryte sposobem według wynalazku podlegają normalnemu dziedziczeniu przez potomstwo powstałe w wyniku krzyżowania dwóch linii soi. Przykład ten dowodzi użyteczności polimorfizmów jako markerów genetycznych. W przykładzie 4 wykazano, że obraz pasm amplifikowanych produktów jest specyficzny dla danej sekwencji startera. Większość zmian w pojedynczym nukleotydzie w sekwencji startera powoduje całkowitą zmianę w obrazie amplifikowanych segmentów DNA. Sugeruje to, że większość jednonukleotydowych polimorfizmów w odpowiadających miejscach startu w genomie będzie wykrywalna sposobem według wynalazku jako różnica w obrazie amplifikowanych segmentów DnA. Przykład 5 dowodzi, że 10-cio nukleotydowe startery amplifikują na ogół równoważne liczby segmentów DNA zarówno z małych, jak i z dużych genomów. Przykład 6 wykazuje użyteczność starterów o długości od 6 do 10 nukleotydów. Przykład 8 dowodzi, że sposobem według wynalazku wykrywa się polimorfizm, co może znaleźć zastosowanie o rozróżnianiu próbek ludzkiego DNA. Przykład 9 ilustruje ilościowe oznaczenie amplifikowanych produktów.
Przykład 1. Synteza i oczyszczanie starterów oligonukleotydowych,
Zsyntetyzowano osiem starterów oligonukleotydowych /Tabela 1 przy użyciu znanych metod w fazie stałej i z zastosowaniem chemii fosforoamidynów w automatycznym syntetyzerze DNA Du Pont Model Coder 300 /E.I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE/. Osiem starterów miało dowolne sekwencje nukleotydowe. Każdy starter zawierał taki sam stosunek ilości zasad A i T jak G i C, w celu uzyskania jednakowej trwałości po przyłączeniu do matrycy.
Po odbezpieczeniu w wodorotlenku amonowym znaną metodą, próbki wysuszono pod próżnią, rozpuszczono w 0,2 ml TEN /10mM Tris-Cl, pH 7,5, 1mM NaEDTA, 10 mM NaCl/ i oczyszczono przy użyciu chromatografii żelowej na kolumnie Sephadex G25 z wypełnieniem NAP-5 /Pharmacia, Piscataway, N.J./ zrównoważonej TEN, następnie na szczyt kolumny wprowadzono 0,5 ml TEN, zbierając 0,5 ml eluenta. Stężenie oczyszczonego oligonukleotydu obliczono spektrofotometrycznie przy absorbancji 260 nm. Wartość absorbancji równa 1 odpowiadała stężeniu 33 gg/ml.
T ab e 1 al
| Sekwencja startera | Nazwa startera | Stężenie roztworu podstawowego kg |
| 5'-AGCACTGTCA | 10b | 10 |
| 5'-TCGTAGCCAA | AP3 | 10 |
| 5'-TCACGATGCA | AP4 | 10 |
| 5'-CTGATGCTAC | AP5 | 10 |
| 5'-GCAAGTAGCT | AP6 | 10 |
| 5'-CTGATACGGA | AP7 | 10 |
| 5'-TGGTCACTGA | AP8 | 10 |
| 5'-ACGGTACACT | AP9 | 10 |
Przykład 2. Startery /Tabela V wykrywają polimorfizmy w matrycach w postaci DNA soi.
Genomowy DNA wyizolowano z hodowli nasion soi PI 81762 i Bonus przez odwirowanie w CsCl/bromek etydyny jak opisano w pracy: Murray, M.G. Rapid isolation of High Molecular Weight Plant DNA, Nucleic Acids Res., tom, 8 /1980/, str. 4321-4326. Hodowle nasion soi pochodziły od profesora Theodore a Hymowitz a, University of Illinois.
Startery w postaci oligonukleotydów, każdy o długości 10 nukleotydów /Tabela I/ testowano osobno w reakcji amplifikacji opisanej niżej, pod kątem ich zdolności amplifikowania segmentów DNA pochodzących z dwóch różnych odmian soi.
166 895
Reakcję według wynalazku przeprowadzono w 50 ml roztworze reakcyjnego zawierającego mieszaniny genomowego DNA, które zawierały: 10 mM Tris-Cl, pH 8,3,50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,001 % żelatyny /Sigma, St.Louis, MO, katalog: /1990/ nr G-2500/, 0,1 μg sojowego DNA, 20 pikomoli oligonukleotydów, 200 pM każdego z trójfosforanów dezoksynukleotydowych-dATP, dCTP, dGTP, dTTO oraz 1,25 jednostek polimerazy DNA Amplitag /Perkin-Elmer Cetus, nr katalog. N801-0060, Norwalk, CN/. Mieszaninę genomowego DNA przygotowano przez zmieszanie składników 1-5 /Tabela II/ i ogrzewanie w temperaturze 99°C w ciągu 4 minut w bloku grzewczym urządzenia do cyklicznego wygrzewania DNA. Następnie przed dodaniem składników 6 i 7 /Tabela II/ mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej. Amplifikację prowadzono w próbkach do ultrawirowania o pojemności 6 ml /kat. nr 1048-00-0, Robbins Scientific Corp., 1280 Space Park Way, Mtn. View, CA 94943 /1990/, reakcję zainicjowano przez dodanie do 2 pl każdego startera z Tabeli 148 pl mieszaniny genomowego DNA /Tabela II/, przy czym mieszaninę reakcyjną pokryto warstwą 40 pl oleju mineralnego /Sigma, katalog: nr M 3516/.
Tabela II
| Mieszaniny genomowego DNA | Objętość | |
| PI 81762 pl | Bonus pl | |
| Zdejonizowana woda | 309,0 | 308,0 |
| 10x Bufor | 45,0 | 45,0 |
| MgCl2,200 mM | 2,2 | 2,2 |
| DNA z PI 81762,672 pg/ml | 1,3 | - |
| DNA z Bonus, 448 pg/ml | - | 2,0 |
| Mieszanina dATP, dCTP, dGTP, ITP, 1,25 mM każdego | 72,0 | 72,0 |
| Polimeraza Amplitag, 5 jednostek / pl | 2,2 | 2,2 |
* 10 x Bufor składa się z: 100 mM TrisCl, /pH 8,3/, 500 mM KCl, 15mM MgCl2 i 0,01% żelatyny według zalecenia Perkin-Elmer Cetus, katalog, nr N801-0060
Polimeraza DNA Amplitaq.
Okresowych zmian temperatury amplifikacji dokonano w urządzeniu do cyklicznego wygrzewania DNA - DNA Thermal Cycler /Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CN/ przez zastosowanie 30 cykli o parametrach: 94°C przez 1 minutę, 35°C przez 30 sekund, zmiana do 72°C w ciągu 1 minuty i 51 sekund, 72°C przez 2 minuty.
Po zakończeniu 16-tu oddzielnych reakcji amplifikacji, 5 pl każdej próbki zanalizowano przez elektroforezę prowadzoną na 1,4% żelu agarozowym przy napięciu 8,5 V/cm w ciągu 60 minut. Elektroforezę prowadzono zgodnie ze znaną praktyką, jak opisano w publikacji: J.Sambrook, E.F.Fritsch i T.Maniatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring-Harbor Laboratory Press, str. 6.3-6.19 /1989/. Żel zabarwiono bromkiem etydyny i sfotografowano.
Polimorfizmy, to znaczy różnice w otrzymanych obrazach DNA dla produktów reakcji, były ewidentne dla wszystkich starterów poza starterem AP6, przy porównaniu ścieżek DNA zarówno z Bonus jak i z PI 81762 /Figura 1/, który to DNA amplifikowano przy użyciu danego startera. Figura 1 przedstawia fotografię zabarwionego żelu, w którym prowadzono elektroforezę. Linia O stanowi wzorzec masy cząsteczkowej. Linie oznaczone cyframi nieparzystymi odpowiadają produktom amplifikacji DNA z Bonus, prowadzonej przy użyciu ośmiu starterów /Tabela I/, a linie oznaczone cyframi parzystymi odpowiadają produktom amplifikacji DNA z PI 81762, prowadzonej przy użyciu tych samych starterów. Z fotografii tej wynika, że losowe segmenty kwasu nukleinowego można rozróżnić na podstawie różnic nukleotydowych. Przykładowo, dwie ścieżki oznaczone A i B obrazujące wyniki amplifikacji przy użyciu startera 10b są widoczne w DNA z PI 81762 /linia 2/, a nie są widoczne w DNA z Bonus /linia 1/.
Przykład3. Zamplifikowane polimorfizmy są użyteczne dla genetycznego mapowania.
W celu określenia, czy polimorfizmy uwidocznione w Przykładzie 2 znajdują zastosowanie w genetycznym mapowaniu, polimorfizm ścieżki A wykryty starterem 10b /figura 2/
166 895 naniesiono na mapę genomu soi. Dokonano tego przez ocenianie każdego z 66 segregujących osobników F2 /T.Hymowitz, U. of I11 / pod kątem dziedziczenia przez nich polimorfizmu ścieżki A i przez porównanie z danymi odnośnie segregacji wśród tych samych 66 osobników, uzyskanymi przy użyciu 430 markerów RFLP wprowadzonych wcześniej na mapę genomu soi /J.A.Rafalski i S.V.Tingey, Abstract, Genome Mapping and Sequencing, 26-30 kwietnia, 1989/. Próbki genomowego DNA z F2 poddano procedurze według wynalazku przy zastosowaniu startera 10b w warunkach opisanych w Przykładzie 2 i analizowano przez elektroforezę w 1,4% żelu agarozowym. Linia O stanowi wzorzec masy cząsteczkowej, a pozostałe linie obrazują produkty reakcji DNA z osobników F2. Tabela 3 przedstawia obraz dziedziczenia po rodzicach polimorfizmu ścieżki A uwidocznionego przy użyciu startera 10b. Ponieważ ścieżka A jest zamplifikowana z PI 81762 a nie z Bonus, /Figura 2/, obecność ścieżki A w pojedynczej próbce wskazuje na to, że próbka ta ma co najmniej jedną kopię segmentu DNA z PI 181762. Przy pierwszym sprawdzeniu trudno jest rozróżnić homozygoty, które otrzymały duże kopie ścieżki A z PI 181762 od heterozygot, które otrzymały tylko jedną kopię ścieżki A z PI 181762. Dlatego ten polimorfizm ocenia się jako marker dominujący /patrz objaśnienie do Tabeli 3/. Osobniki, które nie zawierają ścieżki A odziedziczyły ten segment z Bonus. W celu oznaczenia pozycji locus ścieżki A w genomie soi konieczne było skorelowanie dziedziczenia tego locus z dziedziczeniem różnych markerów RELP naniesionych wcześniej na mapę genomu soi. /J.A.Rafalski i S. V. Tingey, Abstract, Genome Mapping and Sequencing, 26-30 kwietnia, 1989/. Tę mapę genetyczną /dane nie pokazane/ skonstruowano w oparciu o standardową metodykę RFLP na podstawie analizy segregacji obrazów różnych markerów RFLP w tej samej populacji F2, którą stosowano w tym przykładzie /odnośnie standardowej technologii mapowania RFLP - patrz T.Helentjaris, M.Slocum, S.Wright, A. Schaefer i J.Nienhuis, 1986, Theor. Appl. Genet., 72, 761-769/. Podstawą analizy genetycznego mapowania jest to, że markery umiejscowione w genomie blisko siebie dziedziczą się razem w potomstwie F2, a markery umiejscowione dalej podlegają współdziedziczeniu rzadziej.
Przeprowadzono analizę segregacji i obliczono pozycje markerów na mapie przy zastosowaniu programu MapMaker/E.S.Lander, P.Green, J. Abrahamson, A.Barlow, J.F.Daly, S.E.Lincoln i L.Newburg, 1987, Genomics, 1: 174-181/. Wyniki wskazują na to, że na mapie polimorfizm ścieżki A uwidoczniony starterem 10b w grupie A jest sprzężony genetycznie z markerami RFLP 249 i 7315, leżąc pomiędzy nimi w odległości 9,4 i 9,2 centymorganów, odpowiednio. Prawdopodobieństwo, że polimorfizm ścieżki A ulega segregacji jedynie przez przypadek, według obserwowanych danych, wynosiło 1 do 10'H’8, co wskazuje na ważność tej pozycji mapy. Przykład ten dowodzi, że polimorfizmy uwidocznione sposobem według wynalazku znajdują zastosowanie jako markery genetyczne.
T abe l a III
| Osobnik F2 | |||||||||||||||||||||||
| Nazwa markera | 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 25 | 26 | 27 |
| Parker RFLP 249 | B | A | H | H | H | H | A | H | B | H | H | H | A | H | H | H | A | H | A | H | m | H | A |
| Marker RFLP 7315 | B | A | H | m | H | A | H | H | B | B | H | A | H | H | H | E | A | H | H | m | H | a | m |
| Ścieżka A startera 10b | b | A | b | m | b | b | m | b | b | b | b | A | A | A | b | b | A | b | A | m | b | m | A |
| Nazwa markera | Osobnik F2 28 29 30 31 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | |||
| Marker RFLP 249 | H | A | B | A | B | A | H | H | B | a | H | A | A | m | A | B | B | H | B | H | A | B | A |
| Marker RFLP 7315 | H | A | B | A | B | H | H | H | B | H | H | A | A | A | A | H | H | H | B | H | H | B | H |
| ścieżka A startera 10b | b | A | b | A | b | b | b | b | b | b | b | A | A | A | A | b | b | b | b | b | b | b | A |
166 895
c.d. tabeli III
Osobnik F2
| Nazwa | 52 | 5 54 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 68 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 |
| Marker RFLP 249 | H | B H B | A | A | B | m | m | m | m | m | m | H A | H | B | A | A | H | B | B | H |
| Marker RFLP 7315 | H | B H H | A | A | B | H | H | A | H | A | m | H m | A | m | m | A | m | B | B | H |
| ścieżka A startera 10b | b | b b b | A | A | b | b | b | m | m | A | m | b m | m | m | A | m | b | b | A | |
| Osobnik | F2 | |||||||||||||||||||
| Nazwa markera | 80 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 88 | 90 | 91 | 96 | |||||||||||
| Marker RFLP 249 | H A | B | A | A | B | m | El | m | m | |||||||||||
| Marker RFLP 7315 | H H | H | A | A | A | m | m | B | A | |||||||||||
| Ścieżka A startera 10b | b b | b | A | A | b | m | m | b | A |
Objaśnienie do Tabeli III
DNA wyizolowany z 88 osobników F2 powstałych w wyniku krzyżowania pomiędzy Bonus i PI 81762. Genotyp każdego osobnika w miejscach każdego powyższego markera określono albo przy użyciu analizy RFLP lub sposobem według wynalazku /patrz tekst/. Pojedyncze litery oznaczają genotyp rodzicielski locus markera. Znak A lub B oznacza, że locus zostało odziedziczone po Bonus lub po PI 181762 odpowiednio. Znak H oznacza, że locus zostało odziedziczone zarówno po Bonus jak i po PI 181762. Znak A oznacza, że locus zostało odziedziczone albo jedynie po Bonus, albo zarówno po Bonus jak i po PI 181762. Znak b oznacza, że locus zostało odziedziczone albo po PI 181762, albo zarówno po Bonus jak i po PI 81762 Znak m oznacza brak danych.
Przykład 4. Obraz produktów amplifikacji segmentów DNA jest czuły na zmiany pojedyńczych nukleotydów w sekwencji startera.
Na bazie startera oligonukleotydowego AP8 z Przykładu 2 /Tabela I/ zsyntetyzowano serie starterów. Każdy wariant różnił się od sekwencji podstawowej pojedyńczym nukleotydem w kolejnych miejscach wzdłuż całej sekwencji startera. W każdym wariancie utrzymywano taki skład nukleotydów, że zasady A+T stanowiły 50%, jak w Przykładzie 2. W tablicy IV małymi literami oznaczono nukleotydy, które różnią się od nukleotydów z sekwencji podstawowej.
Tabela IV
| Sekwencja startera | Nazwa startera | Stężenie roztworu podstawowego |
| 5'-TGGTCACTGA | AP8 podstawowy | 10 μ-iM |
| 5'^^GGTCACTGA | APS—a | 10 ^uM |
| 5'—TcGTCACTGA | AP8—b | 10 ^uM |
| 5'-TGcTCACTGA | APS—C | 10 μ-iM |
| 5* —TGGaCACTGA | AP8—d | 10 yUM |
| 5' —KiGTgACTGA | AP8~e | 10 zuM |
| 5'-l\iGTCtCTGA | AP8—f | 10 ^uM |
| 5' —BGGtCAgTGA | AP8—g | 10 |
| 5'—TGGPGAGaGA | AP8~h | 10 ^uM |
| 5'—TiGTCAGTcA | AP8~i | 10 ^uM |
| 5'—TGGl’CAGTBGt | AP8~j | 10 μ-iM |
166 895
Mieszaniny zawierające genomowy DNA z Bonus i z PI 81762 przygotowano tak, jak opisano w Przykładzie 2 /Tabela II/. Zamiast stosowania probówek do ultrawirowania jako naczyń reakcyjnych, próbki umieszczono w studzienkach 96-ścio studzienkowej płytki do mikromiareczkowania z polichlorku winylu /PVC/ Falcon, 1989, 3911, Becton Dickinson Labware, Oxnard, CA/. Próbki pokryto warstwą 40 μ! oleju mineralnego /Sigma, St.Louis, MO, nr katalog. M 3516 1990/. Nieużywane studzienki wypełniono 50 μl wody plus 40 μl oleju. 96-ścio studzienkową płytkę bez przykrywki umieszczono w przedmuchiwanym powietrzem piecu do cyklicznego wygrzewania /BSC 1000 zaopatrzonego w sondę temperatury BSC-2005, Bios, Corp., 291 Whitney Ave., New Haven, cT 06511/ na szczycie metalowego statywu do probówek z rusztem o powierzchni 6,45 cm2. Statyw miał 5,08 cm wysokości na skutek usunięcia górnej półki ze statywu trójpoziomego /szerokość 12,07 cm x długość 29,21 cm x wysokość 10,16 cm/. Tę usuniętą półkę umieszczono na wierzchu 96-studzienkowej płytki. Piec znajdował się w pomieszczeniu o temperaturze otoczenia wynoszącej 22°C; jego pracę zaprogramowano na 35 cykli o następujących parametrach: 93°C przez 1 minutę, 35°C przez 1 minutę, zmiana do 72°C w ciągu 2 minut, 72°C przez 2 minuty. Tolerancję temperatury wygrzewania ustalono na 2°C.
Po zakończeniu reakcji amplifikacji według wynalazku, 12 μl każdej próbki analizowano przy zastosowaniu elektroforezy w 1,4% żelu agarozowym, jak opisano w Przykładzie 2.
Figura 3 przedstawia fotografię barwionego żelu po elektroforezie. Linia O stanowi wzorzec masy cząsteczkowej. Uwidocznione są produkty amplifikacji DNA z Bonus /linie oznaczone cyframi nieparzystymi/ oraz produkty amplifikacji DNA z PI 81762 /linie oznaczone cyframi parzystymi/. Strzałki pokazują pozycję w każdym starterze, w której występuje różnica w stosunku do sekwencji startera AP8. Każdy starter wytwarzał bardzo różne obrazy amplifikowanych segmentów DNA, za wyjątkiem AP8 i AP8-a, dla których obrazy wydawały się różnić jakościowo tylko w jednej ścieżce /patrz ścieżki odpowiadające 250 bp znalezione jedynie dla startera AP8-a; Figura 3, linie 1-4/. Chociaż ogólny obraz ścieżek różnił się dla większości starterów, było co najmniej kilka ścieżek, które mogą być wspólne dla różnych starterów /należy zauważyć polimorficzne ścieżki odpowiadające 1kb, które wydają się być amplifikowane przez AP8, AP8-a i AP8-b; Figura 3, linie 1-6/. Za wyjątkiem AP8 i AP8-a, każdy starter uwidaczniał różne polimorfizmy pomiędzy Bonus a PI 81762. Wśród obrazów utworzonych przez wszystkie 11 starterów, wystąpiło około 22 różnych polimorfizmów uwidocznionych obecnością ścieżki w jednym genomie i odpowiadającą nieobecnością ścieżki w drugim genomie.
Poza kilkoma wyjątkami, zmiana pojedyńczego nukleotydu w starterze powodowała na ogół znaczącą zmianę w obrazie amplifikowanych ścieżek i ujawniła nowe polimorfizmy. Sugeruje to, że warunki tego doświadczenia są wystarczające na to, aby udział brała większość, jeżeli nie wszystkie, z zasad w danym starterze.
Przykład 5. Amplifikacja DNA pochodzącego z różnych gatunków przy użyciu 10-cio nukleotydowych starterów o dowolnej sekwencji.
W tym przykładzie badano genomowy DNA pochodzący z bawełny /line 315, Coker Seed Co., Hartsville, S.C. 29550/, z drożdży /linia DB Y 931, E.I. du Pont de Nemours and Co., Wilmington, DE/, z Arabidopsis /linia W5, patrz K.A.Feldman i wsp., Science, /1989/ 243: 1351-1354/ oraz z kukurydzy /linia B73, University of Illinois/. Próbki DNA przygotowano znanymi metodami jak następuje: Gossypium hirsutum /bawełna/, R.Bernatzky i S.D.Tanksley, 1986, Theor. Appl. Genet. 72, 314-321; Saccharomyces cerevisiae /drożdże/, R.W.Davis, M.-Thomas, J.Cameron, T.P. St. John, S.Scherer i R.-A.Padget, 1980, Methods Enzymol. 65, 404-411; Arabidopsis thalina /Arabidopsis/, Shure, Wessler, Fedoroff, 1983, Cell, 35, 225-233; oraz Zea mays /kukurydza/, Dellaporta, S.L. Molecular Biology of Plants a Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 11724 /1985/, str. 36-37. Stosowano reagenty w stężeniach wyszczególnionych w Przykładzie 2, przygotowano je jak pokazano w Tabeli V.
166 895
Tabel a V
| Mieszanina | Objętość gl |
| Dejonizowana woda | 1837,0 |
| 10 x Bufor | 550,0 |
| MgCl2, 1M | 5,5 |
| Mieszanina dATP, dCTP, dGTP | 880,0 |
| TTP, 1,25 mM każdego | |
| Polimeraza Amplitaq, 5 jednostek/ gl | 27,0 |
Startery AP3, AP4, AP5, AP6, AP7 i AP8 /Tabela I/ rozcieńczono wodą do stężeń 2 gM. Próbki genomowego DNA rozcieńczono wodą do stężeń 10 mg/ml, ogrzewano w temperaturze 99°C w ciągu 4 minut w urządzeniu do cyklicznego wygrzewania Perkin-Elmer i oziębiono do temperatury pokojowej przed użyciem. Mieszaniny reakcyjne do amplifikacji przygotowano na 96-ścio studzienkowej płytce przez zmieszanie 10 gl genomowego DNA, 10 gl startera z Tabeli I, i 30 gl mieszaniny z Tabeli V. Zastosowano wszystkie studzienki i wszystkie pokryto kropią /40 ul/ oleju mineralnego. Prowadzono wygrzewanie cykliczne w piecu do wygrzewania cyklicznego, jak opisano w Przykładzie 4. Temperaturę renaturacji zaprogramowano na 36°C.
Produkty reakcji amplifikacji analizowano na drodze elektroforezy w żelu agarozowym jak w Przykładzie 3. Figura 4 przedstawia fotografię barwionego żelu po elektroforezie. Linie
1-6 odpowiadają produktom amplifikacji DNA z bawełny, linie 7-12 - z drożdży, linie 13-18 z Arabidopsis, a linie 19-20 - z kukurydzy. Wyniki wykazują, że wszystkie próbki z powodzeniem uległy amplifikacji za pomocą badanych starterów. Jest to nieoczekiwane w świetle małych rozmiarów genomów drożdży, i arabidopsis w porównaniu z rozmiarami genomów bawełny, kukurydzy i soi.
Przykład 6. Startery o długości większej niż 7 nukleotydów sprzyjają amplifikacji
DNA
W tym Przykładzie porównywano sześć różnych starterów o długości od 6 do 10 nukleotydów' /Tabela VII/ pod kątem ich zdolności do pełnienia funkcji starterów w reakcji amplifikacji. Stosowano reagenty opisane w Przykładzie 2 przygotowane jak pokazano w Tabeli VI.
Tabe 1 a VI
| Mieszanina genomowego DNA | Objętość gl | |
| Bonus | PI 81762 | |
| Zdejonizowana woda | 1240 | 1242 |
| 10 x Bufor | 175 | 175 |
| MgCl2, 200 mM | 3,5 | 3,5 |
| Mieszanina dATP, dCTP, dGTP, TTP, 1,25 mM każdego | 140 | 140 |
| Polimeraza Amplitaq, 5 jednostek/ gl | 9 | 9 |
| DNA z Bonus, 448 gg/ml | 7,8 | - |
| NA z PI 81762,670 gg/ml | - | 7,8 |
Tabela VII
| Sekwencja startera | Nazwa startera | Stężenie roztworu podstawowego |
| 5’-ATTGCGTCCA | AP13 | 4 gM |
| 5’TTGCGTCCA | AP13a | 4 gM |
| 5’-TGCGTCCA | AP13b | 4 gM |
| 5’-GCGTCCA | AP13c | 4 gM |
| 5’-CGTCCA | AP13d | 4 gM |
| 5’-CGCCCA | AP13e | 4 gM |
Starter AP13 stanowił dowolną sekwencję zawierającą 50% zasad A+T jak w Przykładzie 1. Startery AP13a do AP13e zaprojektowano przez kolejne usuwanie nukleotydów z końca 5 . Starter AP13c posiadał dodatkową T podstawioną przez C w celu nadania mu trwałości. Każdy starter /2,5 μΐ/ zmieszano oddzielnie w probówkach do ultrawirowania o pojemności 0,6 ml jak w Przykładzie 2 z 22,5 μΐ każdej mieszaniny zawierającej matrycowy DNA pochodzący bądź z Bonus, bądź z PI 81762. Każdą mieszaninę pokryto warstwą 40 μΐ oleju mineralnego /Przykład 2/. Obróbkę cyklicznego wygrzewania prowadzono w urządzeniu do cyklicznego wygrzewania DNA - DNA Thermał Cycler /Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT/ stosując 35 cykli o następujących parametrach: 94°Ć przez 1 minutę, 35°C przez 1 minutę, zmiana temperatury do 72°C w ciągu 2 minut, 72°C przez 2 minuty. Po zakończeniu reakcji amplifikacji według wynalazku, 12 μΐ każdej próbki analizowano przez elektroforezę na 1,4% żelu agarozowym jak opisano w Przykładzie 2.
Figura 5 przedstawia fotografię barwionego żelu po elektroforezie. Linia O stanowi wzorzec masy cząsteczkowej. Wyniki wskazują na to, że w wybranych warunkach amplifikacji startery o długości mniejszej niż 8 nukleotydów nie wywołują wykrywalnych poziomów amplifikacji.
Przykład 7. Amplifikacja ludzkiego DNA przy użyciu startera o długości 10 nukleotydów o dowolnej sekwencji /AP9/.
Tabela VIII
| Mieszanina | Objętość μΐ |
| Zdejonizowana woda | 103,5 |
| 10 x Bufor | 45,0 |
| MgCl2, 50 mM | 9,0 |
| Mieszanina dATP, dCTP, dGTP, TTP, 2 mM każdego | 45,0 |
| Starter AP9, 10 μΜ /patrz Przykład 2/ | 18,0 |
| Polimeraza Amplitaą, 5 jednostek/ μΐ | 4,5 |
* (Użyty tu 10 x Bufor składa się z 100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 500 mMKCl; 15mM MgCh; 50 μΜ EDTA; 0,1% żelatyny.)
W każdej z siedmiu probówek reakcyjnych umieszczono 25 mikrolitrów mieszaniny /Tabela VIII/. Próbki genomowego DNA przygotowane z transformowanych limfoblastów pochodziły od sześciu anonimowych osób, oznaczono je Hu 1-6. Próbki genomowego DNA otrzymano od dr Johna Gilbert a i Allen a Roses a z Duke Medical Center, Durham, NC. Każdą próbkę genomowego DNA przygotowano przez dodanie do 25 μΐ H2O 10 ng DNA /2-3 μΐ/, ogrzewanie w kąpieli wrzącej wody w ciągu 1 minuty i umieszczenie na lodzie. Do każdej reakcji amplifikacji do mieszaniny reakcyjnej dodano 25 μΐ DNA. Przygotowano również ślepą próbę przez dodanie 25 μΐ H2O do probówki zawierającej mieszaninę reakcyjną. Reagenty pokryto kroplą oleju mineralnego. Prowadzono wygrzewanie cykliczne w urządzeniu DNA Thermal Cycler zgodnie z następującym programem: wstępna 4-minutowa inkubacja w temperaturze 93°C; 30 następujących cykli: 1 minuta w temperaturze 93°C; 30 sekund w temperaturze 35°C; zmiana temperatury do 72°C w ciągu 2 minut i 10 sekund, 2 minuty w temperaturze 72°C, po czym końcowa 5-minutowa inkubacja w temperaturze 72°C. Po przeniesieniu do świeżych probówek, do każdej probówki dodano 50 μΐ 5M octanu amonowego i 250 μΐ etanolu. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze -20°C każdą próbkę DNA zebrano przez odwirowanie, wysuszono i rozpuszczono w 20 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA.
Dwa mikrolitry każdej próbki poddano elektroforezie na 1,4% żelu agarozowym /8,3 cm x 6 cm/ w buforze TAE /40 mM octanu Tris, pH 7,8, 5 mM octanu sodowego; 1 mM ESTA/, przy napięciu 50V w ciągu 160 minut. Po zabarwieniu przy użyciu etydyny, żel sfotografowano oświetlając światłem ultrafioletowym. Wyniki przedstawione na figurze 6 wykazują, że próbki Hul i HU2 mają dodatkową ścieżkę odpowiadającą w przybliżeniu wartości 1,3 kb, która nie występuje w czterech innych próbkach. Tak więc, reakcja amplifikacji przy użyciu startera AP9
166 895 o długości 10 nukleotydów pozwoliła na wykrycie polimorfizmu genetycznego, który można stosować do rozróżniania próbek ludzkiego DNA.
Przykład 8. Ilościowe oznaczenie produktów PCR.
W Przykładzie 3 stosowano sposób według wynalazku do genetycznego mapowania polimorfizmu. Dokonano tego przez zbadanie dziedziczenia rodzicielskiego obrazu polimorfizmu u kilku osobników, u których następowała segregacja. Jak wykazano w Przykładzie 3, nie było możliwe rozróżnienie osobników heterozygotycznych wobec markera od homozygotycznych wobec tego samego markera, przy czym polimorfizm uznano za cechę dominującą. Osobnik heterozygotyczny zawiera dwie różne kopie /allele/ szczególnego segmentu DNA w danym miejscu /locus/ w genomie. Osobnik homozygotyczny będzie zawierał w tym miejscu dwa identyczne allele. Dla niektórych zastosowań /na przykład przy ilościowym mapowaniu cech/ konieczna jest możliwość odróżnienia osobników heterozygotycznych. Należy oczekiwać, że osobniki, które odziedziczyły dwie kopie pojedynczego allelu, wykażą w sposobie według wynalazku dwa razy więcej zamplifikowanego produktu, niż osobniki, które odziedziczyły jedną kopię tego samego allelu. W celu zbadania, czy heterozygoty można odróżnić od homozygot przez ilościowe określenie wyników testu, wybrano osobniki, o których było wiadomo, że są homozygotami Bonus, heterozygotami Bonus i PI 81762 lub homozygotami PI 81762 w odniesieniu do segmentów DNA w regionie chromosomalnym zawierającym polimorfizm ścieżki A. Osobniki te wybrano na podstawie genotypu flankujących markerów RFLP /patrz Przykład 3 i Tabela III/. Zele z Przykładu 3 analizowano densytometrycznie w celu określenia ilości zamplifikowanego produktu odpowiadającego ścieżce A /patrz objaśnienie do figury 7/. Figura 7A przedstawia wynik dla osobnika 30 /patrz Przykład 3/ homozygotycznego w odniesieniu do allelu PI 81762. Figura 7B przedstawia wynik dla osobnika 9 /patrz Przykład 3/ heterozygotycznego w odniesieniu do alleli Bonus i PI 81762. Figura 7C przedstawia wynik dla osobnika 57 /patrz Przykład 3/ homozygotycznego w odniesieniu do allelu Bonus. Zaznaczono pik odpowiadający polimorfizmowi ścieżki A. Wynik pomiaru densytometrycznego wykazuje, że osobniki homozygotyczne w odniesieniu do alleli PI 81762 zawierają dwa razy więcej DNA w polimorfizmie ścieżki A, niż osobniki heterozygotyczne, zawierające allele PI 81762 i Bonus. Osobniki homozygotyczne w odniesieniu do alleli Bonus nie zawierają DNA odpowiadającego ścieżce A. Ten przykład wykazuje, że produkty amplifikacji można oznaczać ilościowo w celu identyfikowania osobników heterozygotycznych i ujawnienia współdominującego polimorfizmu. Takie postępowanie znajdzie zastosowanie tam, gdzie konieczne jest odróżnienie heterozygot od odpowiadających homozygot.
Wyniki uwidocznione na fotografiach żelu na figurze 2 przetworzono w postać cyfrową przy użyciu aparatu fotograficznego Monochrome CCD /model 4815-5000, Cohn Inc., San Diego. CA /połączonego z komputerem Macintosh IIex /Apple Computer Corp., Cupertino, CA/. Dane analogowe przekształcono na cyfrowe przy użyciu karty QuickCapture /Data Translations Inc., Marlboro, MA/. Pojedyncze linie skanowano w,celach obliczeniowych przy użyciu programu Scan Analysis /wersja 2.11, Biosoft Inc., Miltown, N.J./. Wartości zaznaczone na osi X odpowiadają odległości elektroforetycznej, a zaznaczone na osi Y odpowiadają wielkości piku.
Claims (19)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób rozróżniania kwasów nukleinowych na podstawie różnic nukleotydowych w losowych segmentach kwasów nukleinowych, znamienny tym, że obejmuje:/a/ oddzielne przeprowadzenie reakcji przedłużenia na każdym z co najmniej dwóch kwasów nukleinowych, która to reakcja polega na:/i/ kontaktowaniu kwasów nukleinowych z co najmniej jednym starterem oligonukleotydowym o długości większej niż 7 nukleotydów w takich warunkach, że zachodzi synteza produktu przedłużenia co najmniej jednego startera dla co najmniej jednego kwasu nukleinowego i /b/ porównanie wyników oddzielnie przeprowadzonych reakcji przedłużenia pod kątem różnic.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje po etapie /i/, a przed etapem /b/ dodatkowe etapy /ii/ oddzielenia produktu przedłużenia od jego nici komplementarnej oraz /iii/ amplifikowanie losowego segmentu kwasu nukleinowego na drodze kontaktowania oddzielonego produktu przedłużenia ze starterem z etapu /i/ w takich warunkach, że następuje amplifikacja produktu przedłużenia przy użyciu jako matrycy oddzielonego produktu przedłużenia.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etapy prowadzi się co najmniej dwukrotnie.
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako substraty stosuje się polimerazę kwasu nukleinowego i trójfosforany nukleotydowe lub ich analogi i mieszaniny.
- 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się jeden starter.
- 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się starter o długości od 9 do 10 nukleotydów.
- 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że co najmniej jeden starter jest biotynylowany.
- 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że kwasy nukleinowe pochodzą od różnych osobników.
- 9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako polimerazę kwasu nukleinowego stosuje się polimerazę DNA ajako substraty trójfosforanowonukleotydowe stosuje się trój fosforany dezoksyrybonukleotydowe.
- 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako polimerazę DNA stosuje się termostabilną polimerazę.
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako polimerazę DNA stosuje się polimerazę Taq.
- 12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że porównania dokonuje się przez frakcjonowanie pod względem wielkości.
- 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że porównania dokonuje się na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym lub w żelu agarozowym.
- 14. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że porównania dokonuje się przez analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych.
- 15. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że porównania dokonuje się przez określenie sekwencji nukleotydowej.
- 16. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że źródło kwasu nukleinowego wybrane jest z grupy obejmującej rośliny, zwierzęta i drobnoustroje.
- 17. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że źródłem kwasu nukleinowego jest człowiek.
- 18. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że różnicę w produkcie przedłużenia stosuje się jako marker do konstruowania mapy genetycznej.166 895
- 19. Sposób wedhig zastrz . 1 albo 1, znamienny tym, że różnicę w produkcie przedłużenia stosuje się jaka macknc da caecdżniania lub identyfikowania osobników.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/494,258 US5126239A (en) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences |
| PCT/US1991/000841 WO1991014001A2 (en) | 1990-03-14 | 1991-02-12 | A process for distinguishing nucleic acids on the basis of nucleotide differences |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL293188A1 PL293188A1 (en) | 1992-11-02 |
| PL166895B1 true PL166895B1 (pl) | 1995-06-30 |
Family
ID=23963743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91293188A PL166895B1 (pl) | 1990-03-14 | 1991-02-12 | Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PL |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5126239A (pl) |
| EP (1) | EP0520039B1 (pl) |
| JP (1) | JP2818486B2 (pl) |
| AT (1) | ATE115634T1 (pl) |
| AU (1) | AU639565B2 (pl) |
| BR (1) | BR9106151A (pl) |
| CA (1) | CA2078132C (pl) |
| DE (1) | DE69105959T2 (pl) |
| DK (1) | DK0520039T3 (pl) |
| ES (1) | ES2065684T3 (pl) |
| FI (1) | FI924049A0 (pl) |
| IL (1) | IL97503A (pl) |
| NO (1) | NO304655B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ237396A (pl) |
| PL (1) | PL166895B1 (pl) |
| WO (1) | WO1991014001A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA911891B (pl) |
Families Citing this family (101)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5595870A (en) * | 1989-02-17 | 1997-01-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Identifying nucleic acids by restriction digestion and hybridization with random or pseudorandom oligonucleotides |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| WO1992003567A1 (en) * | 1990-08-24 | 1992-03-05 | The University Of Tennessee Research Corporation | Dna amplification fingerprinting |
| US6074818A (en) * | 1990-08-24 | 2000-06-13 | The University Of Tennessee Research Corporation | Fingerprinting of nucleic acids, products and methods |
| WO1992004458A1 (en) * | 1990-09-11 | 1992-03-19 | The Brookdale Hospital Medical Center | Drug resistance screening method |
| WO1992007095A1 (en) * | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
| US5635354A (en) * | 1991-01-09 | 1997-06-03 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method for describing the repertoires of antibodies (Ab) and of T-cell receptors (TcR) of an individual's immune system |
| US5401630A (en) * | 1991-05-03 | 1995-03-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Species-specific DNA-DNA hybridization probe prepared using chromosome size DNA |
| CA2077135A1 (en) * | 1991-08-30 | 1993-03-01 | Joh-E Ikeda | A method of dna amplification |
| DK0534858T4 (da) * | 1991-09-24 | 2005-08-08 | Keygene Nv | Selektiv restriktionsfragmentamplifikation: en general fremgangsmåde til DNA-fingeraftryk-dannelse |
| US7026115B1 (en) | 1991-09-24 | 2006-04-11 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
| US20100267023A1 (en) | 1992-09-24 | 2010-10-21 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
| EP0642590A1 (en) * | 1992-05-27 | 1995-03-15 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Rna fingerprint analysis |
| US5340728A (en) * | 1992-12-09 | 1994-08-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction |
| US5962221A (en) * | 1993-01-19 | 1999-10-05 | Univ Tennessee Res Corp | Oligonucleotide constructs and methods for the generation of sequence signatures from nucleic acids |
| US5759821A (en) * | 1993-04-16 | 1998-06-02 | F B Investments Pty Ltd | Method of random amplification of polymorphic DNA |
| WO1995019697A1 (en) * | 1994-01-21 | 1995-07-27 | North Carolina State University | Methods for within family selection in woody perennials using genetic markers |
| WO1995021269A1 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | Perlin Mark K | Method and apparatus for analyzing genetic material |
| US6037127A (en) * | 1994-03-31 | 2000-03-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for detection of non-denatured nucleic acid fragments |
| US5714330A (en) * | 1994-04-04 | 1998-02-03 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage |
| US5831065A (en) * | 1994-04-04 | 1998-11-03 | Lynx Therapeutics, Inc. | Kits for DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage |
| US5552278A (en) * | 1994-04-04 | 1996-09-03 | Spectragen, Inc. | DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage |
| US5547861A (en) * | 1994-04-18 | 1996-08-20 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acid amplification |
| US5585238A (en) * | 1994-04-25 | 1996-12-17 | Ciba-Geigy Corporation | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US5660981A (en) * | 1994-06-06 | 1997-08-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Selection of diagnostic genetic markers in microorganisms and use of a specific marker for detection of salmonella |
| USRE43097E1 (en) | 1994-10-13 | 2012-01-10 | Illumina, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
| US6013445A (en) * | 1996-06-06 | 2000-01-11 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
| DE69507646T2 (de) * | 1994-11-28 | 1999-09-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington | Mikrosatelliteverbindung für detektion genetisches polymorphismen |
| ES2097701B1 (es) * | 1995-02-09 | 1997-11-16 | Consejo Superior Investigacion | Procedimiento para obtener sondas especificas de estirpe o de especie. |
| JPH09149799A (ja) * | 1995-11-30 | 1997-06-10 | Hitachi Ltd | 核酸の分析方法又は検査方法、及び核酸の分析装置又は検査装置 |
| US5670325A (en) * | 1996-08-14 | 1997-09-23 | Exact Laboratories, Inc. | Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample |
| US5741650A (en) * | 1996-01-30 | 1998-04-21 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting colon cancer from stool samples |
| US5747257A (en) * | 1996-02-29 | 1998-05-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genetic markers and methods for the detection of escherichia coli serotype-0157:H7 |
| ATE366418T1 (de) | 1996-04-25 | 2007-07-15 | Bioarray Solutions Ltd | Licht-regulierte, elektrokinetische zusammensetzung von partikeln an oberflächen |
| US5811239A (en) * | 1996-05-13 | 1998-09-22 | Frayne Consultants | Method for single base-pair DNA sequence variation detection |
| US6203993B1 (en) | 1996-08-14 | 2001-03-20 | Exact Science Corp. | Methods for the detection of nucleic acids |
| US6300077B1 (en) | 1996-08-14 | 2001-10-09 | Exact Sciences Corporation | Methods for the detection of nucleic acids |
| US5952178A (en) | 1996-08-14 | 1999-09-14 | Exact Laboratories | Methods for disease diagnosis from stool samples |
| US6020137A (en) * | 1996-08-14 | 2000-02-01 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
| US6100029A (en) * | 1996-08-14 | 2000-08-08 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of chromosomal aberrations |
| US6146828A (en) * | 1996-08-14 | 2000-11-14 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor |
| US5928870A (en) * | 1997-06-16 | 1999-07-27 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
| US5814453A (en) * | 1996-10-15 | 1998-09-29 | Novartis Finance Corporation | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US5800997A (en) * | 1996-11-01 | 1998-09-01 | Novartis Finance Corporation | Detection of maize fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US5922538A (en) * | 1996-11-08 | 1999-07-13 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Genetic markers and methods for the detection of Listeria monocytogenes and Listeria spp |
| US6406857B1 (en) | 1997-06-16 | 2002-06-18 | Exact Sciences Corporation | Methods for stool sample preparation |
| US6268136B1 (en) | 1997-06-16 | 2001-07-31 | Exact Science Corporation | Methods for stool sample preparation |
| US5827695A (en) * | 1997-08-04 | 1998-10-27 | Novartis Finance Corporation | Detection of wheat fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US6173525B1 (en) | 1997-09-19 | 2001-01-16 | Cantharellus Ab | Chanterelle mycelium |
| US20020064792A1 (en) * | 1997-11-13 | 2002-05-30 | Lincoln Stephen E. | Database for storage and analysis of full-length sequences |
| JP2002501760A (ja) * | 1998-02-02 | 2002-01-22 | アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ | 核酸解析方法 |
| US7078224B1 (en) | 1999-05-14 | 2006-07-18 | Promega Corporation | Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles |
| EP1930078A1 (en) | 1998-05-01 | 2008-06-11 | Gen-Probe Incorporated | Method for agitating the contents of a container |
| US8337753B2 (en) * | 1998-05-01 | 2012-12-25 | Gen-Probe Incorporated | Temperature-controlled incubator having a receptacle mixing mechanism |
| US6284466B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-09-04 | The Board Of Regents Of University Of Nebraska | Method of detecting genetic polymorphisms using over represented sequences |
| US6703228B1 (en) | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| EP1001037A3 (en) * | 1998-09-28 | 2003-10-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms |
| CA2352534A1 (en) * | 1998-12-08 | 2000-06-15 | Children's Hospital And Regional Medical Center | Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:h7 from other strains |
| US6280947B1 (en) | 1999-08-11 | 2001-08-28 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension |
| US6503718B2 (en) | 1999-01-10 | 2003-01-07 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease |
| ATE330032T1 (de) | 1999-02-25 | 2006-07-15 | Exact Sciences Corp | Verfahren zur erhaltung der dns-integrität |
| FR2792000B1 (fr) * | 1999-04-08 | 2003-04-11 | Centre Nat Rech Scient | Procede de cartographie d'une molecule d'adn comprenant une etape d'amplification ad infinitum |
| DE60029092T2 (de) * | 1999-04-09 | 2007-02-01 | Exact Sciences Corp., Marlborough | Verfahren zur detektion von nukleinsäuren, welche auf krebs hinweisen |
| US6586177B1 (en) * | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| US6849403B1 (en) | 1999-09-08 | 2005-02-01 | Exact Sciences Corporation | Apparatus and method for drug screening |
| US6919174B1 (en) * | 1999-12-07 | 2005-07-19 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| US7368233B2 (en) * | 1999-12-07 | 2008-05-06 | Exact Sciences Corporation | Methods of screening for lung neoplasm based on stool samples containing a nucleic acid marker indicative of a neoplasm |
| US6242191B1 (en) * | 1999-12-30 | 2001-06-05 | The Ohio State University Research Foundation | Methods for assessing the beef characteristics of live cattle |
| WO2001073119A2 (en) * | 2000-03-29 | 2001-10-04 | Cambia | Methods for genotyping by hybridization analysis |
| US9709559B2 (en) | 2000-06-21 | 2017-07-18 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays |
| CA2413978C (en) | 2000-06-21 | 2008-12-16 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis |
| US7695901B2 (en) * | 2000-07-26 | 2010-04-13 | North Carolina State University | Identification of poinsettia cultivars |
| EP1207209A3 (en) * | 2000-11-09 | 2002-09-11 | Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) | Methods using arrays for detection of single nucleotide polymorphisms |
| US6428964B1 (en) | 2001-03-15 | 2002-08-06 | Exact Sciences Corporation | Method for alteration detection |
| US7262063B2 (en) | 2001-06-21 | 2007-08-28 | Bio Array Solutions, Ltd. | Directed assembly of functional heterostructures |
| CA2497740C (en) | 2001-10-15 | 2011-06-21 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection |
| US20030166190A1 (en) * | 2001-12-10 | 2003-09-04 | Wright David A. | Nucleic acids related to plant retroelements |
| AU2003213107A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-09-09 | Exact Sciences Corporation | Methods for analysis of molecular events |
| US7157228B2 (en) * | 2002-09-09 | 2007-01-02 | Bioarray Solutions Ltd. | Genetic analysis and authentication |
| US7526114B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-04-28 | Bioarray Solutions Ltd. | Analysis, secure access to, and transmission of array images |
| US20060068036A1 (en) | 2002-12-31 | 2006-03-30 | National Yang-Ming University | Extract of Dioscorea sp. and the medical uses thereof |
| US20040259101A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Shuber Anthony P. | Methods for disease screening |
| US7927796B2 (en) | 2003-09-18 | 2011-04-19 | Bioarray Solutions, Ltd. | Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers |
| EP1664722B1 (en) | 2003-09-22 | 2011-11-02 | Bioarray Solutions Ltd | Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules |
| CA2544041C (en) | 2003-10-28 | 2015-12-08 | Bioarray Solutions Ltd. | Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes |
| WO2005045060A2 (en) | 2003-10-29 | 2005-05-19 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna |
| US20080241827A1 (en) * | 2004-05-10 | 2008-10-02 | Exact Sciences Corporation | Methods For Detecting A Mutant Nucleic Acid |
| WO2005113769A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-01 | Exact Sciences Corporation | Method for stabilizing biological samples for nucleic acid analysis |
| US7848889B2 (en) | 2004-08-02 | 2010-12-07 | Bioarray Solutions, Ltd. | Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification |
| EP1623996A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Improved method of selecting a desired protein from a library |
| WO2006026654A2 (en) | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Exact Sciences Corporation | Method for detecting a recombinant event |
| US9109256B2 (en) | 2004-10-27 | 2015-08-18 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Method for monitoring disease progression or recurrence |
| US9777314B2 (en) * | 2005-04-21 | 2017-10-03 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Analysis of heterogeneous nucleic acid samples |
| US8486629B2 (en) | 2005-06-01 | 2013-07-16 | Bioarray Solutions, Ltd. | Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation |
| EP1907585A4 (en) * | 2005-07-01 | 2010-04-07 | Promega Corp | FLOATING PARTICLE ARRAY FOR PURIFYING BIOMOLECULES AND USES THEREOF OR FLOATING PARTICLE ARRAY FOR PURIFYING BIOMOLECULES |
| WO2007070381A2 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-21 | Promega Corporation | Nucleic acid purification with a binding matrix |
| US20110086343A1 (en) * | 2006-03-10 | 2011-04-14 | Hemant Jyotiswarup Purohit | Method for the screening of bacterial isolates |
| US8481267B2 (en) * | 2009-08-21 | 2013-07-09 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genetic fingerprinting and identification method |
| US8039613B2 (en) | 2009-08-28 | 2011-10-18 | Promega Corporation | Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods |
| US8222397B2 (en) * | 2009-08-28 | 2012-07-17 | Promega Corporation | Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods |
| EP2737080A1 (en) | 2011-07-25 | 2014-06-04 | E. I. Du Pont de Nemours and Company | Method to amplify nucleic acids to generate fluorescence labeled fragments of conserved and arbitrary products |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4851331A (en) * | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
| EP0317239A3 (en) * | 1987-11-13 | 1990-01-17 | Native Plants Incorporated | Method and device for improved restriction fragment length polymorphism analysis |
| EP0426756A4 (en) * | 1988-07-26 | 1991-11-21 | Genelabs Incorporated | Rna and dna amplification techniques |
| US4879214A (en) * | 1988-11-15 | 1989-11-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Differentiation of nucleic acid segments on the basis of nucleotide differences |
| CA2044591C (en) * | 1989-02-13 | 2002-08-13 | James Langham Dale | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
| US5043272A (en) * | 1989-04-27 | 1991-08-27 | Life Technologies, Incorporated | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers |
-
1990
- 1990-03-14 US US07/494,258 patent/US5126239A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-02-12 CA CA002078132A patent/CA2078132C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-12 AU AU77820/91A patent/AU639565B2/en not_active Ceased
- 1991-02-12 WO PCT/US1991/000841 patent/WO1991014001A2/en active IP Right Grant
- 1991-02-12 DE DE69105959T patent/DE69105959T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-12 AT AT91908846T patent/ATE115634T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-12 JP JP3508563A patent/JP2818486B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-12 BR BR919106151A patent/BR9106151A/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-02-12 ES ES91908846T patent/ES2065684T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-12 PL PL91293188A patent/PL166895B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-02-12 EP EP91908846A patent/EP0520039B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-12 DK DK91908846.8T patent/DK0520039T3/da active
- 1991-03-11 IL IL9750391A patent/IL97503A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-12 NZ NZ237396A patent/NZ237396A/en unknown
- 1991-03-14 ZA ZA911891A patent/ZA911891B/xx unknown
-
1992
- 1992-09-10 FI FI924049A patent/FI924049A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1992-09-11 NO NO922800A patent/NO304655B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA911891B (en) | 1992-11-25 |
| WO1991014001A3 (en) | 1991-10-31 |
| ES2065684T3 (es) | 1995-02-16 |
| IL97503A0 (en) | 1992-06-21 |
| JPH05505528A (ja) | 1993-08-19 |
| BR9106151A (pt) | 1993-03-09 |
| FI924049L (fi) | 1992-09-10 |
| DK0520039T3 (da) | 1995-02-20 |
| ATE115634T1 (de) | 1994-12-15 |
| NO923544L (no) | 1992-09-11 |
| WO1991014001A2 (en) | 1991-09-19 |
| US5126239A (en) | 1992-06-30 |
| NZ237396A (en) | 1993-08-26 |
| CA2078132A1 (en) | 1991-09-15 |
| EP0520039A1 (en) | 1992-12-30 |
| FI924049A0 (fi) | 1992-09-10 |
| DE69105959D1 (de) | 1995-01-26 |
| NO923544D0 (no) | 1992-09-11 |
| NO304655B1 (no) | 1999-01-25 |
| IL97503A (en) | 1995-05-26 |
| AU7782091A (en) | 1991-10-10 |
| PL293188A1 (en) | 1992-11-02 |
| JP2818486B2 (ja) | 1998-10-30 |
| DE69105959T2 (de) | 1995-05-18 |
| CA2078132C (en) | 1999-08-31 |
| AU639565B2 (en) | 1993-07-29 |
| EP0520039B1 (en) | 1994-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL166895B1 (pl) | Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PL | |
| US5861245A (en) | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes | |
| US5437975A (en) | Consensus sequence primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes | |
| US5766847A (en) | Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions | |
| US5674686A (en) | Allelic ladders for short tandem repeat loci | |
| EP0726905B1 (en) | Single nucleotide polymorphisms and their use in genetic analysis | |
| US8999644B2 (en) | Method for detecting the presence of a DNA minor contributor in a DNA mixture | |
| NO174825B (no) | Fremgangsmåte ved påvisning av nukleotidsekvenser, nukleotidsekvens for bruk i denne og diagnostisk sett | |
| KR20070011354A (ko) | 취약 ｘ염색체 증후군과 같은 ｓｔｒｐ의 검출 방법 | |
| EP0812211A4 (en) | METHODS OF DETECTING ENHANCED POLYMORPHISMS AND RESTRICTION SITE CLIVES | |
| CA2366374C (en) | Method for the detection and/or analysis, by means of primer extension techniques, of single nucleotide polymorphisms in restriction fragments, in particular in amplified restriction fragments generated using aflp | |
| EP1021559B1 (en) | Method and kit for amplification, sequencing and typing of classical hla class i genes | |
| KR102265417B1 (ko) | 단일염기다형성 다중 분석용 프라이머 | |
| AU2008301233A1 (en) | Method of amplifying nucleic acid | |
| JPH08297A (ja) | バクテリアを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ | |
| JP2007330260A (ja) | イヌ科動物の遺伝子型決定のためのマイクロサテライト配列 | |
| US20050244830A1 (en) | Quantitative multiplex amplification on a genomic scale, and applications for detecting genomic rearrangements | |
| US6383747B1 (en) | Method for determining ancestral haplotypes using haplospecific geometric elements within the major histocompatibility complex multigene cluster | |
| US20030022163A1 (en) | Detection of repeated nucleic acid sequences | |
| CA2009870A1 (en) | Metod for determining the origin of a human dna-containing sample | |
| EP1066413A1 (en) | Polymorphism iii : linkage of atopy to a locus on chromosome 13 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20100212 |