PL166004B1

PL166004B1 - Sposób wytwarzania nowego peptydu PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL166004B1
Application number: PL90301975A
Authority: PL
Inventors: Pradip K Bhatnagar; William F Huffman; James E Talmadge
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1990-07-12
Publication date: 1995-03-31
Also published as: FI903571A0; FI94354C; CN1034663C; CN1054773A; JPH0356498A; PH30055A; NZ234501A; HU904201D0; PL286043A1; IL95012A0; IE902547A1; HU206889B; ZA905505B; IL95012A; CA2020838C; NO177713C; ES2064642T3; HK1004554A1; IE65533B1; EP0408371B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowego peptydu o wzorze (pGlu-Glu-Asp)2Sub(Lys)2, w którym pGlu oznacza kwas piroglutaminowy, Glu oznacza kwas glutaminowy, Asp oznacza kwas asparaginowy, Sub oznacza kwas dwuaminosuberynowy, a Lys oznacza lizyne, znamienny tym, ze a/ aminokwas Boc-Sub poddaje sie sprzeganiu ze zwiazkiem o wzorze Lys-(e-Z)COOBz · HCl w obecnosci srodka sprzegajacego, takiego jak N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimid, ewen- tualnie w obecnosci katalizatora, po czym przemywa w celu usuniecia nadmiaru reagenta i usuwa grupe ochronna, b / wytworzony Boc-Sub-(e-Z)Lys-COOBz poddaje sie sprzeganiu z Boc Asp-(ß-OBz) postepujac jak w etapie a/, c/ wytworzony Boc-(ß-OBz)Asp-Sub-(e-Z)Lys-COOBz poddaje sie sprzeganiu z Boc-Glu- (?-OBz), postepujac jak w etapie a, d / wytworzony Boc-(?-OBz)Glu-(ß-OBz)Asp-Sub-(e-Z)Lys-COOBz poddaje sie sprzega- niu z pyro-Glu-(p-Glu) postepujac jak w etapie a/, e/ usuwa sie grupe ochronna z p-Glu-(?-QBz)Glu-(ß-OBz)Asp-Sub-(e-Z)Lys-COOBz dzia- lajac kwasem, przemywa i oczyszcza, f/ ewentualnie wytwarza farmaceutycznie dopuszczalna sól, dzialajac nadmiarem reagenta kwasowego lub alkalicznego w rozpuszczalniku. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego peptydu o działaniu hemoregulującym, który może być stosowany do stymulowania tworzenia się krwinek i do leczenia infekcyjnych chorób wirusowych, grzybiczych i bakteryjnych.

Różne regulatory informujące i modyfikujące, takie jak kolonie hodowlane czynników stymulujących, interferony i różne typy peptydów odpowiedzialne są za regulowanie tworzenia się szpiku. Metcalf, Cell, 43:5 (1985); Baserga R., Foa P., Metcalf D., Polli EE (eds), Biological Regulation of Cell Proliferation (1986); Nicola i wsp., J. Cell Physiol. 128:501 (1986), Zoumbos i wsp., Proyr. Hemat. 1:341 i 14:201 (1986); Werner i wsp., Experientia 42:521 (1096). Dwadzieścia lat temu Rytomaa i Kivieniemi, Cell Tissue Kinet 1:329-340 (1968); Rytomaa i wsp., Control of Cellular Growth in Adult Organisms str. 106-138 (1967) podali, że ekstrakty granulocytów (antyhormony granulocytowe) mogły specyficznie inhibitować namnażanie się komórek szpikowych szczura w nakrytych hodowlach rozmazowych. Później wykazali oni, że czynnik, który miał ciężar cząsteczkowy mniejszy niż 3 000 daltonów, zdolny był do indukowania regresu przeszczepialnej białaczki granulocytowej u szczura, jak również opóźniania rozwoju komórek białaczkowych u ludzi. Paukovits i inni wyekstrahowali podobny czynnik z komórek szpiku kostnego szczura i wykazali, że inhibituje on pobieranie trytowanej tymidyny z komórek szpiku kostnego [Paukovits, W. R., Cell Tissue Kinet 4:539-547; Naturforsch 37:1297 (1982)]. W 1979 roku Boll i wsp., Acta Haematologica 6:130 (1979) wykazali działania inhibitujące ekstraktów z granulocytów szczura na komórki ludzkiego szpiku kostnego w hodowli, a wielu innych badaczy wykazało, że ten surowy ekstrakt granulocytowy inhibitował rozwój g-CFUC i/lub gm-CFUC in vitro z komórek szpiku kostnego gryzonia.

Ten środek biologiczny był określany antyhormonem granulocytowym, który zgodnie z tym założeniem teoretycznym, powinien być wewnątrzpochodnym inhibitorem rozmnażania komórek,

166 004 działając w tej samej tkance jak został wydzielony. Stwierdzono, że materiał otrzymany z surowych ekstraktów jest niegatunkowo specyficzny, ale wysoce tkankowo specyficzny. Ponadto stwierdzono, że jest nietoksyczny i ma działanie odwracalne.

W 1982 r. opisano syntetyczny hemoregulacyjny pentapeptyd o następującej budowie: pGluGlu-Asp-Cys-Lys, który ma selektywne działanie inhibitujące na komórki szpikowe zarówno in vitro jak i in vivo, gdzie głównym działaniem wydaje się być działanie na szpikowe komórki pnia (CFU-gm) [Paukovits i wsp., Z. Naturforsch 37:1297 (1982) i amerykański opis patentowy nr 44959081]. Przypuszcza się, że peptyd ten jest analogiem naturalnie występującego czynnika inhibitowania tworzenia się granulocytów, który został znaleziony w minimalnych ilościach w ekstraktach szpiku kostnego. Peptyd ten przez inhibitowanie tworzenia się krwinek, a w szczególności tworzenia się granulocytów wykazuje tendencję do zapobiegania aby nieruchome komórki nie wchodziły do komórkowego podziału stając się w ten sposób podatne na zaatakowanie przez cytotoksyczne leki przeciwrakowe. Poza zapewnieniem działania ochronnego w terapii stosującej leki cytotoksyczne, peptydy mogą również być stosowane do zatrzymania rozmnażania się komórek rakowych związanych z układem tworzenia się szpiku, to znaczy z białaczką szpikową.

W 1987 r. Laerum i wsp. donieśli, że produkt utleniania tego peptydu był dimerem (HP-5) utworzonym za pomocą mostku dwusiarczkowego. Ten dimer ma przeciwne działanie niż monomer, ponieważ silnie stymuluje tworzenie kolonii hodowlanych zarówno ludzkiego jak i mysiego CFU-gm in vitro i w znacznym stopniu kontroluje mysie komórki szpikowe in vivo. Zastrzeżone to było w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 87309806.5.

Ponadto, że dimer jest użyteczny w stymulowaniu tworzenia się szpiku u pacjentów o zredukowanej aktywności wytwarzania szpiku, łącznie z uszkodzeniem szpiku kostnego, agranulocytozą i aplastyczną anemią w tym pacjentów o obniżonej funkcji szpiku kostnego z uwagi na immunosupresyjne leczenie mające na celu zdławienie reakcji tkanek, np. w chirurgii przeszczepiania szpiku. Związki te mogą być również stosowane w celu promowania szybkiej regeneracji szpiku kostnego po chemioterapii cytostatycznej i po terapii radiacyjnej w chorobach nowotworowych i wirusowych. Mogą one być szczególnie cenne dla pacjentów z poważnymi infekcjami spowodowanymi brakiem reakcji odpornościowej spowodowanej uszkodzeniem szpiku.

Obecność wiązania dwusiarczkowego w dimerze HP-5 sugeruje, że monomer jest ewentualnym metabolitem in vivo. Ponieważ monomer inhibituje tworzenie się krwinek, trwałość dimeru HP-5 jest istotna przy stosowaniu in vivo w celu stymulowania tworzenia się szpiku. Zidentyfikowanie trwałego dimeru wyeliminowałoby ten potencjalny problem.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego peptydu o wzorze (p-Glu-Glu-Asp)2Sub(Lys)2, który ma działanie hemoregulacyjne i może być stosowany do stymulowania tworzenia się krwinek oraz do leczenia chorób bakteryjnych, wirusowych i grzybiczych. Peptyd ten przydatny jest do przywrócenia do stanu normalnego leukocytów u pacjentów o obniżonej liczbie komórek wynikającej z różnych sytuacji klinicznych, takich jak wywołane chirurgicznie dławienie tworzenia się szpiku, AIDS, wrodzone zaburzenia rozwojowe rdzenia, przeszczepy szpiku kostnego i organów, ochrona pacjentów przed zmniejszeniem liczby krwinek białych we krwi na skutek infekcji, w leczeniu pacjentów z poważnymi poparzeniami i dla poprawy w przypadku obniżonego tworzenia się szpiku obserwowanego przy niektórych środkach antywirusowych specyficznych wobec cyklu komórkowego. Jest on również przydatny w leczeniu chorób infekcyjnych wirusowych, grzybiczych i bakteryjnych, zwłaszcza Candida i Herpes zarówno u pacjentów, którym obniżono odporność jak i u „normalnych.

Związek ten może być również stosowany w połączeniu z monomerami opisanymi w amerykańskim opisie patentowym nr 449*9081 dla zapewnienia zmiany szczytów wysokiej i niskiej aktywności w komórkach szpiku kostnego, wzmacniając tym sposobem naturalny dobowy rytm tworzenia się krwinek. Tym sposobem terapia cytostatyczna może być prowadzona w okresach niskiej aktywności szpiku kostnego, redukując dzięki temu ryzyko uszkodzeń szpiku kostnego, podczas gdy regeneracja będzie promowana przez kolejny szczyt aktywności.

W zakres wynalazku wchodzą również farmaceutycznie dopuszczalne kompleksy soli związków otrzymanych sposobem według wynalazku.

166 004

W niniejszym opisie stosowane są ogólnie przyjęte skróty i symbole, a mianowicie: pGlu = kwas piroglutaminowy,

Pro = prolina,

Gln = glutamina,

Glu = kwas glutaminowy,

Asp = kwas asparaginowy,

Lys = lizyna,

Sub = kwas dwuaminosuberynowy.

Zgodnie z tradycyjnym oznaczaniem zakończenie aminowe jest po lewej stronie, a zakończenie karboksylowe jest po prawej stronie. Wszystkie chiralne aminokwasy mogą być w absolutnej konfiguracji D lub L.

Końce aminowe mogą być ochraniane przez acylowanie. Przykładami takich grupa ochronnych są t-butoksykarbonyl (t-Boc), CH3CO i Ar-CO (Ar = benzyl).

Zakończenia C mogą być w postaci grupy karboksylowej jak w przypadku naturalnych aminokwasów lub w postaci karboksyamidu (-C) = O(NH2) lub hydroksymetylu (-CH2-OH).

Związki otrzymywane według wynalazku różnią się od związków znanych z europejskiego zgłoszenia patentowego nr 873098065, które mają wiązanie dwusiarczkowe między dwoma peptydami. W nowych związkach występuje pomiędzy ugrupowaniami siarczkowymi wiązanie węgielwęgiel, które nie ulega łatwo rozszczepieniu in vivo, a zatem związki wytwarzane sposobem według wynalazku są bardziej trwałe in vivo niż związki opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 87309806.5.

Sposób wytwarzania nowego peptydu o wzorze (pGlu-Glu-Asp)2 Sub(Lys)2 według wynalazku polega na tym, że a/ aminokwas Boc-Sub poddaje się sprzęganiu ze związkiem o wzorze Lys-(e-Z)COOBz · HCl, ewentualnie w obecności katalizatora, po czym przemywa w celu usunięcia nadmiaru regenta i usuwa grupę ochronną, b/ Boc-Sub-(e-Z)Lys-COOBz poddaje się sprzęganiu z Boc Asp-(^-OBz) ewentualnie w obecności katalizatora, po czym przemywa w celu usunięcia nadmiaru reagenta i usuwa grupę ochronną, c/ Boc-(e-OBz)Asp-Sub-(t-Z)Lys-COOBz poddaje się sprzęganiu z Boc-Glu-(y-OBz) ewentualnie w obecności katalizatora, po czym przemywa w celu usunięcia nadmiaru reagenta i usuwa grupę ochronną, d/ Boc-(/-OBz)Glu-(e-OBz)Asp-Sub-(c-Z)Lys-COOBz poddaje się sprzęganiu z pyro-Glu(p-Glu) ewentualnie w obecności katalizatora, po czym przemywa w celu usunięcia nadmiaru reagenta, e/ usuwa grupę ochronną z p-Glu-(y-OBz)Glu-(e-OBz)Asp-Sub-(e-Z)Lys-COOBz, działając kwasem, przemywa i oczyszcza HPLC, f/ ewentualnie wytwarza farmaceutycznie dopuszczalną sól, działając nadmiarem reagenta kwasowego lub alkalicznego w rozpuszczalniku.

Każdy aminokwas lub peptyd jest odpowiednio zabezpieczony sposobem znanym w chemii peptydów. Na przykład do ochrony grupy aminowej, zwłaszcza w pozycji α korzystne są grupy fluorenylometoksykarbonylowa (F-moc) lub t-butoksykarbonylowa (t-Boc). Odpowiednio podstawiona grupa karbobenzyloksylowa może być stosowana do grupy ε-aminowej lizny, a grupa benzylowa do grup α i β karboksylowych Asp i Glu odpowiednio. Odpowiednim podstawieniem karbobenzyloksylowej grupy ochronnej jest podstawienie orto i/lub para przez chlor, brom, nitro lub metyl i stosuje się je w celu modyfikowania reaktywności grupy ochronnej. Za wyjątkiem grupy t-Boc, grupy ochronne można dobierać tak, aby nie były usuwane w warunkach łagodnie kwasowych. Te grupy ochronne można usuwać metodami takimi jak katalityczne uwodornianie, sodem w ciekłym amoniaku lub przez traktowanie HF znanym sposobem.

Syntezę peptydu prowadzi się w roztworze sposobami tradycyjnymi stosowanymi do tworzenia wiązań amidowych. Zwykle, chroniony za pomocą t-Boc aminokwas, który ma wolną grupę karboksylową sprzęga się z chronionym aminokwasem, który ma wolną grupę aminową przy użyciu odpowiedniego środka sprzęgającego, takiego jak N,N'-dwucyklcheksylGkarbodiimid (DCC), ewentualnie w obecności katalizatorów takich jak 1-hydroksybenzotriazol (HOBT) lub

166 004 można stosować dwumetyloaminopirydynę (DMAP). Odpowiednie są również inne metody, takie jak tworzenie aktywowanych estrów, bezwodników lub halogenków kwasowych, wolnej grupy karboksylowej aminokwasu zabezpieczonego przez t-Boc, i następnie reakcja z wolną aminą ochronionego aminokwasu, ewentualnie w obecności zasady. Na przykład, chroniony grupami Boc aminokwas lub peptyd można zadawać w rozpuszczalniku bezwodnym, takim jak chlorek metylenu lub tetrahydrofuran (THF) w obecności zasady, takiej jak N-metylomorfolina, DMAP (dwumetyloaminopirydyna) lub trójalkiloamina, chloromrówczan izobutylu tworząc „aktywowany bezwodnik, który jest następnie poddany reakcji z wolną aminą innego chronionego aminokwasu lub białka. Utworzony tym sposobem peptyd może być następnie selektywnie pozbawiony grup ochronnych, za pomocą znanych sposobów przy końcówce aminowej lub karboksylowej i sprzężone z innymi peptydami lub aminokwasami przy użyciu podobnych technik. Po skompletowaniu peptydu, grupy ochronne można usunąć tak jak opisano powyżej, na przykład przez uwodornienie w obecności palladu lub platyny jako katalizatora, zadanie sodem w ciekłym amoniakiem, kwasem fluorowodorowym lub alkaliami.

Jeśli końcowy peptyd, po usunięciu grup ochronnych zawiera grupę zasadową, można sporządzić sól addycyjną z kwasem. Sole addycyjne z kwasami peptydu sporządza się sposobem standardowym w odpowiednim rozpuszczalniku ze związku macierzystego i nadmiaru kwasu, takiego jak chlorowodór, bromowodór, kwas siarkowy, fosforowy, octowy, jabłkowy, bursztynowy lub metanosulfonowy. Szczególnie przydatne jest tworzenie octanu. Jeśli końcowy peptyd zawiera grupę kwasową, można sporządzić sole kationowe. Zwykle związek macierzysty zadaje się nadmiarem reagenta alkalicznego, takiego jak wodorotlenek, węglan lub alkoholan zawierający odpowiedni kation. Kationy, takie jak Na+, K+, Ca⁺⁺ i NH 4+, są przykładowymi kationami obecnymi w farmaceutycznie dopuszczalnych solach. Szczególnie korzystne są Na+ i NH4+.

Na ogół w celu wywarcia działania stymulującego, peptyd otrzymany sposobem według wynalazku można podawać ludziom przez injekcje lub doustnie w dawce 0,1-10 mg, na przykład 1-5 mg na 70 kg wagi ciała na dzień, przy podawaniu drogą infuzji lub podobnymi technikami, dawka może wynosić 30-300 mg na 70 kg wagi ciała, na przykład około 100 mg w przeciągu 6 dni. Zasadniczo pożądane jest wytwarzanie stężenia peptydu około 10^_13 do 10”⁵ w płynie zewnątrzkomórkowym pacjenta.

Nowy związek lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól stosuje się jako składnik aktywny kompozycji farmaceutycznych w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką. Kompozycjom tym można nadać postać na przykład odpowiednią do podawania doustnego, donosowego, pozajelitowego lub doodbytniczego.

W określeniu „farmaceutyczne włączone są zastosowania weterynaryjne.

Peptyd może być kapsułkowy, tabletkowy lub sporządzony w postaci emulsji lub syropów do podawania doustnego. Można dodawać farmaceutycznie dopuszczalne stałe do lub ciekłe nośniki w celu wzmocnienia lub stabilizowania kompozycji lub dla ułatwienia sporządzenia kompozycji. Ciekłe nośniki obejmują syrop, olej arachidowy, olej z oliwek, glicerynę, solankę i wodę. Stałe nośniki obejmują skrobię, laktozę, dwuwodzian siarczanu wapnia, białą ziemię, stearynian magnezu lub kwas stearynowy, talk, pektynę, gumę arabską, agar lub żelatynę. Nośnik może również obejmować materiał podtrzymujący uwalnianie, taki jak monostearynian glicerylu lub dwustearynian glicerylu, sam lub z woskiem. Ilość stałego nośnika może być różna, ale korzystnie będzie zawarta w zakresie od około 20 mg do około 1g na poszczególną dawkę. Preparaty farmaceutyczne sporządza się zgodnie z tradycyjną techniką farmaceutyczną obejmującą mielenie, mieszanie, granulowanie i prasowanie tam, gdzie jest to konieczne w celu sporządzenia tabletek; lub mielenie, mieszanie i napełnianie dla uzyskania postaci twardej kapsułki żelatynowej. Gdy stosuje się ciekły nośnik, preparat może mieć postać syropu, eliksiru lub zawiesiny wodnej lub niewodnej. Takie preparaty ciekłe mogą być podawane bezpośrednio doustnie lub mogą nimi być napełnione miękkie kapsułki żelatynowe. Można stosować również nośniki specyficzne dla danego organu.

Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne zawierające peptyd otrzymany sposobem według wynalazku lub jego pochodne mogą być sporządzane w postaci roztworów lub proszków liofilizowanych do podawania pozajelitowego. Proszek można przekształcić w ciecz przez dodanie odpowiedniego rozcieńczalnika lub innego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika, przed użyciem.

Preparaty ciekłe na ogół stanowią buforowe izotoniczne roztwory wodne. Przykładami odpowiednich rozcieńczalników są normalnie izotoniczne roztwory solanki, standardowa 5% dekstroza w wodzie lub buforowany roztwór octanu sodu lub amonu. Takie preparaty są szczególnie odpowiednie do podawania pozajelitowego, ale mogą one być stosowane do podawania doustnego lub zawarte w inhalatorze o dozowanych dawkach lub rozpylaczu do nadmuchiwania. Może być pożądane dodawanie zarobek, takich jak poliwinylopirolidon, żelatyna, hydroksyceluloza, guma arabska, glikol polietylenowy, mannit, chlorek sodu lub cytrynian sodu.

Do podawania doodbytniczego, sproszkowany peptyd wytworzony sposobem według wynalazku może być łączony z wypełniaczami - zarobkami, takimi jak masło kakaowe, gliceryna, żelatyna lub glikole polietylenowe i odlewane do form na czopki. Proszki mogą również być łączone z preparatami olejowymi, żelami, kremami lub emulsjami, buforowane lub niebuforowane i podawane poprzez smarowanie i wcieranie przez skórę.

Spraye do nosa można sporządzać podobnie w postaci wodnego roztworu i pakować w pojemniki rozpylaczy zarówno z propelentem aerozolowym lub zaopatrzone w środki do ręcznego sprężania. Można produkować kapsułki zawierające jeden lub kilka składników aktywnych, na przykład, przez mieszanie składników aktywnych z obojętnymi nośnikami, takimi jak laktoza lub sorbit i napełniać tą mieszaninę kapsułki żelatynowe.

Pojedyncze dawki zawierające nowy związek korzystnie obejmują 0,1-10 mg, na przykład, 1-5 mg peptydu lub jego soli.

Zastosowanie nowego peptydu obejmuje sposób stymulowania tworzenia się szpiku, który polega na podawaniu skutecznej ilości powyższej kompozycji pacjentowi.

Inną cechą obecnego wynalazku jest sposób leczenia infekcji wirusowych, grzybiczych i bakteryjnych u zwierząt normalnych i o obniżonej odporności, polegający na podawaniu zwierzęciu w razie potrzeby skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej zdefiniowanej powyżej.

Działanie biologiczne nowego związku wykazano w następujących próbach:

Wzbudzanie działania stymulującego kolonie przez komórki zrębowe.

Ludzkie komórki zrębowe szpiku kostnego linii Ce hodowano do zlania w plastykowych szalkach do hodowli tkankowej w pożywce RPMI-1640 i 5% FBS. Dzień przed próbą, pożywkę tę zamieniono na DMEM bez dodawania surowicy. Do tych hodowli, dodano w czasie 1 godziny związki, po czym przemyto od hodowli. Pożywkę zastąpiono świeżym DMEM i komórki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO2. Po 24 godzinach supernatant hodowli komórkowej Ce odebrano, poddano sterylizacji przez filtrację i wymrożono, aż można go było oznaczyć na obecność aktywności stymulującej kolonie krwiotwórcze (CSA) jak podano poniżej.

Miękka próba agarowa.

Komórki szpiku kostnego otrzymanego ze szczurów Lewisa. Nastawiono je na 10⁶ komórek/ml w DMEM bez surowicy. Zastosowano układ agarowy z pojedynczą warstwą wykorzystującą następujące: DMEM wzbogacony substancjami odżywczymi (NaHCO3, pirogronian, aminokwasy, witaminy i bufor HEPES); 0,3% agar Bacto i 20% surowicę szczurów Lewisa. Do tego dodano rozcieńczalnika supernatantu linii komórkowej C6 (10-2,5%) z powyższego wraz z komórkami szpiku kostnego szczura (końcowe stężenie = 10⁵ komórek/ml). Płytki agarowe inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 w czasie 7-8 dni. Kolonie rozmnażające komórki szpiku kostnego (CFU-C) policzono za pomocą mikroskopu. Liczba policzonych kolonii agarowych była proporcjonalna do ilości CSA obecnego w supernatancie zrębowych komórek szpiku kostnego linii C6.

Tabela

Aktywność stymulująca kolonię krwiotwórczą przy użyciu 5% supernatantu

Dawka ng/ml	% w stosunku do próby kontrolnej (pGlu-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2
1000	192
100	241
10	207
1	188
0,1	154
0,01	97
0,001	-

166 004

Ί

Model Herpes Simplex myszy.

Siedem dni przed infekcją myszom Balb/c wystrzykiwano dootrzewnowo raz dziennie 0,2 objętości o dawce 10 i 1 ng/kg związku. Myszy kontrolne otrzymały iniekcje 0,2 ml mieszaniny buforu rozcieńczającego, DPBS i 0,5% normalnej surowicy mysiej dezaktywowanej przez ogrzewanie.

Myszy zakażono wirusem Herpes Simplex (szczep MS) przez wstrzyknięcie 5,0 X 10⁵/pfu zawieszonego w 0,5 ml PBS do każdej poduszeczki tylnej łapy. Podawanie myszom iniekcji związku lub kontrolnej, kontynuowano aż do agonii (zaprzestanie przyjmowania pożywienia i wody). Zwykle paraliż pojawiał się w tylnej łapie w osiem dni po zakażeniu. Paraliż postępował aż do wystąpienia zapalenia mózgu.

Alternatywnie, wirus wszczepiono drogą dopochwową. Tampon z waty zawierający 5,0 X 10⁵/pfu szczepu MS-NAP umieszczano w pochwie myszy.

Stosowano test Wilcoxina do oznaczenia czy stwierdzono znaczny wzrost przeżycia w grupie traktowanej w stosunku do grupy kontrolnej.

Test prowokacji Candida.

Stosowano szczep B311a Candida albicans. Szczep ten przeprowadzono przez mysz, a następnie zamrożono do temperatury -70°C. B311a jest zjadliwy wobec myszy o obniżonej odporności w zakresie 5,0-8,0 X 10⁴ cfu/mysz i dla myszy normalnych w zakresie 1,0-2,0 X 10⁵ cfu/mysz. Próbkę z zamrożonego zapasu Candida hodowano na skosie dekstrozowym Sabourauda, a następnie przeniesiono do 50 ml wytrząsanej hodowli bulionu Sabourouda na 18 godzin. Komórki przemyto trzykrotnie, następnie policzono na hemocytometrze i żywotność potwierdzono przez wyeliminowanie barwnika metylenowego. Obliczenie żywotności przeprowadzono na inokulum w celu potwierdzenia obliczeń.

Wszystkie myszy (Balb/c) zainfekowane Candida były zainfekowane i. v. komórkami zawieszonymi w 0,2 ml solanki. Niektórym myszom subletalnie zmniejszono ilość szpiku przez napromieniowanie 300 radami. W 2 godziny po napromienieniu zwierzętom wstrzyknięto związek CSF jako pozytywną próbę kontrolną lub zaróbkę, dziennie. Siedem dni po napromienieniu i rozpoczęciu leczenia, myszy narażono na Candida albicans przez podanie dożylne. Należy zauważyć, że stanowiło to w przybliżeniu LD75 dla normalnych myszy. W innych badaniach myszom nie zmniejszono odporności. W tych badaniach myszy były traktowane począwszy od siódmego dnia po zainfekowaniu w taki sam sposób jak myszy napromienione. W obu modelach myszy traktowano aż do agonii i zmiany w przeżyciu porównano stosując test Wilcoxina.

Poniższy przykład ilustruje przedmiot wynalazku. Przykład ten, w żaden sposób nie ogranicza zakresu wynalazku.

W przykładach wszystkie temperatury podano w stopniach Celsjusza. Analizę aminokwasu przeprowadzono na Dionex Autoion 100. Analiza na zawartość białka bazowała na analizie aminokwasu. Widma masowe FAB oznaczano na spektrometrze masowym VG ZAB przy użyciu bombardowania szybkimi atomami. Stosowano następujące skróty:

Asp = kwas asaraginowy, t-Boc = trzeciorzędowy butoksykarbonyl,

Bz = benzyl,

Cl-Z = p-chlorokarbobenzyloksykarbonyl (Z = karbobenzyloksykarbonyl),

DCC = dwucykloheksylokarbodwuimid,

DIEA = dwuizopropyloetyloamina,

EDC = (N-etylo-N'-(3-dwumetyloaminopropylo)karbodiimid,

Glu = kwas glutaminowy, p-Glu = kwas piroglutaminowy,

HOBT = hydroksybenzotriazol,

Lys = lizyna,

NMP — N-metylo-2-pirolidynon,

OBz = benzyl, w którym atom O jest w miejsce atomu H,

Sub = kwas dwuaminosuberynowy.

166 004

Przykład. Wytwarzanie (p-Glu-Glu-Asp)2Sub-(Lys)2.

A. Synteza Boc-SUB—Lys-(e-Z)COOBz: Kwas bis-Boc (1,1) dwuaminosuberynowy (Sub) syntezowano metodą R. Nutta (J. Org. Chem. 45, 3078, 1980).

mM Boc-Sub (808 mg), 4 mM Lys-(t'-Z)COOBz · HCl (1,56 g) i 4 mM HOBT (0,613 g) rozpuszczono w 10 ml chlorku metylenu (CH2 Cls) i roztwór oziębiono do temperatury -15°C przy użyciu łaźni lód/aceton. Dodano 4 mM (0,692 ml) dwuizopropyloetyloaminy (DIEA), a następnie dodano 0,772 g (4mM) rozpuszczalnego w wodzie karbodiimidu (EDC). Mieszano przez 1 godzinę, po czym mieszaninę odstawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej. Po 3 godzinach odparowano chlorek metylenu a pozostałość rozpuszczono w 200 ml octanu etylu. Roztwór najpierw przemyto 1 n HCl, a następnie 1 n NaOH, nasyconym roztworem NaCl i wodą. Przemywanie powtarzano trzykrotnie i do każdego przemywania stosowano około 100 ml. Warstwą organiczną osuszono nad MgSOą i odparowano. Otrzymano 1,86g Boc-Sub-(z-Z)Lys-COOBz (wydajność 79%) i stosowano dalej bez oczyszczania.

B. Synteza Boc-Asp-(e-OBz)Sub-Lys-(c-Z)-COOBz: Boc-Sub-Lys(e-Z)-COOBz (1,8 g) rozpuszczono w 4 n HCl-dioksanie w ciągu pół godziny, po czym odparowano do sucha. Pozostałość przemyto eterem i suszono przez noc. Chlorowodorek rozpuszczono w 30 ml CH2Cfe i dodano BocAsp-(e-OBz) (1,292 g). Roztwór oziębiono do temperatury -15°C i dodano 0,613 g HOBT, 0,554 ml DIEA i 0,772 g EDC. Mieszano przez 2 godziny, po czym mieszaninę odstawiono, aby ogrzała się do temperatury pokojowej. Po 18 godzinach (po nocy) mieszaninę reakcyjną poddano obróbce. Odparowano CH2Cl2, a pozostałość rozpuszczono w 200 ml octanu etylu. Roztwór przemyto 1 n HCl, 1 n NaOH, nasyconym roztworem NaCl i wodą (przemyto trzykrotnie za każdym razem stosując około 100 ml). Warstwę organiczną osuszono nad MgSOą i odparowano. Boc-Asp-(S-OBz)-Sub-Lys-(c-Z)COOBz 1,9 g (wydajność 73%). Białko to stosowano dalej bez dalszego oczyszczania.

C. Synteza Boc-Glu-(y-OBz) Asp-(e-OBz)Sub-Lys-(e-Z)COOBz: Boc-(S-OBz) Asp-Sub-(zZ)Lys-COOBz 1,8 g rozpuszczono w 15 ml 4n HCl dioksanu. Po 15 minutach rozpuszczalnik usunięto, a pozostałość przemyto eterem i osuszono. Chlorowodorek rozpuszczono w 15 ml N-metylopirolidonu (NMP). Roztwór oziębiono do temperatury -15°C i dodano 4mM (1,338) Boc-Glu-(y-OBz), 0,204 ml DIEA, 0,772 g EDC i 0,612 g HOBT. Mieszaninę mieszano przez noc przy stopniowym ogrzaniu się do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną dodano do kolby zawierającej 1 litr oziębionego 10% Na2COe w nasyconym roztworze NaCl. Wytrącony osad przesączono, przemyto wodą i osuszono pod próżnią. Otrzymane Boc-(y-OBz) Glu-(^-OBz)AspSub-(c-Z)Lys-COOBz (1,3 g) stosowano dalej bez jakiegokolwiek dalszego oczyszczania. Wydajność: 68%.

D. Synteza pGlu-(y-OBz) Glu-(e-OBz) Asp-Sub-(e-Z)Lys-COOBz: Boc-(y-OBz) Glu-(^OBz)Asp-Sub(e-Z)Lys-COOBz 1,2 g rozpuszczono w 15 ml 4n HCl dioksanu. Po 15 minutach rozpuszczalnik usunięto, a pozostałość przemyto eterem i osuszono. Chlorowodorek rozpuszczono w 15ml (NMP). Roztwór oziębiono do temperatury -15°C i dodano 4mM (0,516g) piro-Glu(p-Glu), 0,1O6ml DIEA, 0,772g EDC i 0,612g HOBT. Mieszaninę mieszano przez noc przy stopniowym ogrzaniu się do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną dodano do kolby zawierającej 1 litr oziębionego 10% Na2CO3 w nasyconym roztworze NaCl. Osad wytrącony odsączono, przemyto wodą i osuszono pod próżnią. Otrzymane pGlu-(y-OBz) Glu-(^-OBz) Asp-Sub-(e-Z)Lys-COOBz (0,830 g) stosowano dalej bez jakiegokolwiek oczyszczania. Wydajność: 69%.

E. Synteza pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH: Z pGlu-(y-OBz) Glu-(^-OBz)Asp-Sub(f-Z)COOBz (0,200 g) usunięto grupy ochronne przy użyciu 5 ml HF/1,5 ml anizolu w temperaturze 0°C. Usunięto HF i peptyd rozdzielono na fazy pomiędzy eter i 0,1 n kwas octowy. Warstwę wodną przemyto i liofilizowano. Otrzymano pGlu-Glu-Asp-Lys-COOH w ilości 0,089 g. 20 mg tego białka oczyszczano na kolumnie C18 prep Vyadec w warunkach izokratycznych (10% acetonitryl, 90% woda i 0,1% kwas trójfluorooctowy, szybkość przepływu 5,6 ml/minutę). Widmo masowe FAB: M + H= 1171,4. Analiza aminokwasu: Asp(1,0), Glu (2,19)1, Lys(1,01), Sub-niema danych. HPLC: czas retencji w analitycznej kolumnie C18 Vyadec 0,23X25 mm 7,01 minuty (szybkość przepływu 1,5 ml gradient 0% do 80% B A = 0,1% TFA w wodzie i B = 0,1% TFA w acetonitrylu).

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowego peptydu o wzorze (pGlu-Glu-Asp)₂ Sub(Lys)2, w którym pGlu oznacza kwas piroglutaminowy, Glu oznacza kwas glutaminowy, Asp oznacza kwas asparaginowy, Sub oznacza kwas dwuaminosuberynowy, a Lys oznacza lizynę, znamienny tym, że a/ aminokwas Boc-Sub poddaje się sprzęganiu ze związkiem o wzorze Lys-(c-Z)COOBz · HCl w obecności środka sprzęgającego, takiego jak N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimid, ewentualnie w obecności katalizatora, po czym przemywa w celu usunięcia nadmiaru reagenta i usuwa grupę ochronną, b/ wytworzony Boc-Sub-(t-Z)Lys-COOBz poddaje się sprzęganiu z Boc Asp-(^-OBz) postępując jak w etapie a/, c/ wytworzony Boc-(8-OBz)Asp-Sub-(c-Z)Lys-COOBz poddaje się sprzęganiu z Boc-Glu-(yOBz), postępując jak w etapie a, d/ wytworzony Boc-(/-OBz)Glu-(e-OBz)Asp-Sub-(£-Z)Lys-COOBz poddaje się sprzęganiu z pyro-Glu-(p-Glu) postępując jak w etapie a/, e/ usuwa się grupę ochronną z p-Glu-(/-OBz)Glu-(e-OBz)Asp-Sub-(e-Z)Lys-COOBz działając kwasem, przemywa i oczyszcza, f/ ewentualnie wytwarza farmaceutycznie dopuszczalną sól, działając nadmiarem reagenta kwasowego lub alkalicznego w rozpuszczalniku.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako katalizator w etapie sprzęgania stosuje się hydroksybenzotriazol oznaczony skrótem HOBT.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie a/jako kwas stosuje się HF, a oczyszczanie przeprowadza się wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC).