PL165209B1 - S posób wytwarzania pólsyntetycznych pochodnych N,N-dilizogangliozydów GM 1 PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania pólsyntetycznych pochodnych N,N'-dilizogangliozydów GM1, zawierajacych reszte sfingozyny i reszte kwasu neuraminowego, w których N oznacza atom azotu w reszcie sfingozyny, a N' oznacza atom azotu w reszcie kwasu neuraminowego, które obejmuja N-acylo-N,N'-dilizogangliozydy, w których grupa acylowa przy azocie N pochodzi od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1 do 11 atomach wegla, N'-acylo-N,N'-dilizo- gangliozydy i N,N'-diacylo-N,N'-dilizogangliozydy, w których grupy acylowe przy N i N' pochodza od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1 do 24 atomach wegla, a w przypadku diacylowych pochodnych, w których grupa N'-acylowa jest grupa acetylowa, druga grupa acylowa pochodzi tylko od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1 do 11 atomach wegla oraz ich estrów i/lub amidów karboksylowych grup sjalowych i/lub estrów wewnetrznych i/lub pochodnych nadacylowanych oraz soli metali, soli z zasadami organicznymi lub addycyjnych soli z kwasami i mieszanin takich zwiazków, z wylaczeniem N,N'-diacetylo-N,N'-dilizo GM1, znamienny tym, ze acyluje sie N,N'-dilizogangliozyd, N-acylo-dilizogangliozyd lub N'-acylo- dilizogangliozyd lub ich mieszaniny funkcyjna pochodna kwasu, który odpowiada produktowi koncowemu lub odacylowuje sie odpowiedni N,N'-diacylo-N,N'-dilizogangliozyd lub ich mie- szaniny takich zwiazków, selektywnie przy azocie sfingozyny lub przy azocie neuraminowym i ewentualnie wytworzone zwiazki przeprowadza sie w estry, amidy lub estry wewnetrzne lub nadacylowane pochodne i ewentualnie otrzymane zwiazki przeprowadza sie w farmaceutycznie dopuszczalne sole. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania półsyntetycznych pochodnych N,N'dilizogangliozydów GM1.

Bardziej szczegółowo przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych N,N'dilizogangliozydów GM1, zawierających sfingozyny i resztę kwasu neuraminowego, w którym N oznacza atom azotu w reszcie sfingozyny, a N' oznacza atom azotu w reszcie kwasu neuraminowego, które obejmują N-acylo-N,N'-dilizogangliozydy, w których grupa acylowa przy azocie N pochodzi od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1 do 11 atomach węgla, N'-acylo-N,N'dilizogangliozydy i N,N'-diacylo-N,N'-dilizogangliozydy, w których grupy acylowe przy N i N' pochodzą od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1 do 24 atomach węgla, a w przypadku diacylowych pochodnych, w których grupą N'-acylową jest grupa acetylowa, druga grupa acylowa pochodzi tylko od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1 do 11 atomach węgla oraz ich estrów i/lub amidów karboksylowych grup sjalowych i/lub estrów wewnętrznych i/lub pochodnych nadacylowanych oraz soli metali, soli z zasadami organicznymi lub addycyjnych soli z kwasami i mieszanin takich związków z wyłączeniem N,N'-diacetylo-N,N'-dilizo GM1.

Gangliozydy są na ogół mieszaninami różnych jednostkowych związków chemicznych, które można określić przybliżonym wzorem 1, obejmującym część oligosacharydową, na ogół dobrze chemicznie zdefiniowaną dla każdego gangliozydu, część kwasu sjalowego (to jest utworzoną przez jeden, lub większą ilość kwasów sjalowych), oraz część ceramidową, przy czym te ostatnie trzy części są na ogół złożone z mieszaniny rozmaitych kwasów sjalowych i różnych reszt ceramidowych.

Kwasy sjalowe są to acylowane pochodne kwasu neuraminowego o wzorze 2, w którym grupa aminowa jest zacytowana kwasem octowym lub glikolowym, a grupy hydroksylowe też mogą być zestryfikowane tymi kwasami.

Grupa cer amidowa oznacza N-acylosfingozynę odpowiadającą wzorami 3 lub 4, w którym n = 6 - 18, a acyl pochodzi od nasyconego lub nienasyconego kwasu tłuszczowego o 16 do 22 atomach węgla lub od odpowiadającego hydroksykwasu.

Jak już powiedziano, reszty sjalowe i ceramidowe w gangliozydach są mieszankami grup o powyższych wzorach i jest tak również w przypadku oczyszczonych gangliozydów opisanych w piśmiennictwie.

Liczba kwasów sjalowych obecnych w gangliozydach zwykle waha się od 1 do 5. Reszty sjalowe związane są z ligosacharydem wiązaniem ketozowym utworzonym przez grupę hydroksylową w pozycji 2 z grupą hydroksylową ligosacharydu.

Gdy kilka kwasów sjalowych jest związanych między sobą, ich cząsteczki są połączone przez wiązanie ketozowe utworzone między grupami hydroksylowymi w pozycjach 2 i 8 dwa cząsteczek kwasu sjalowego. Kwasy sjalowe gangliozydów, w tym uprzednio wspomnianych oczyszczonych gangliozydów, są mieszaninami różnych chemicznie jednolitych kwasów, na przykład kwasu N-acetyloneuraminowego i N-glikoloneuraminowego, z których ten pierwszy jest dominujący i ewentualnie jednej lub więcej ich O-acylopochodnych, np. 8-O-acylopochodnych. Oligosacharydy złożone są maksymalnie z 5 monosacharydów lub ich pochodnych z grupami acyloaminowymi, zwłaszcza heksoz i ich pochodnych powyżej wymienionego typu. W oligosacharydzie obecna jest zawsze co najmniej jedna cząsteczka glukozy lub galaktozy, przy czym reszty najczęściej występujące, jako acyloaminowe pochodne powyżej wspomnianych cukrów to N-acetyloglukozamina i N-acetylogalaktozamina.

Termin „lizogangliozyd używa się w piśmiennictwie do opisu związków otrzymanych z naturalnych gangliozydów przez eliminację grupy acylowej obecnej w nich przy azocie sfingozyny . Eliminację można przeprowadzić enzymatycznie, na przykład przez ekspozycję gangliozydów na

165 209 działanie enzymu deacylozy glikosfingolipido-ceramidowej. Stosując tego typu hydrolizę możliwe jest pozostawienie nienaruszonych grup acyloaminowych i acylohydroksylowych kwasu neuraminowego. W celu deacylacji także i tych grup i otrzymania przez to dwóch wolnych grup aminowych, zarówno przy azocie kwasu neuraminowego jak i przy azocie sfingozyny, trzeba zastosować hydrolizę chemiczną, np. z użyciem rozcieńczonego wodorotlenku potasowego. Pochodne gangliozydów otrzymane za pomocą deacylowania przy azocie kwasu neuraminowego, jak uprzednio opisano, zazwyczaj opisywane są w piśmiennictwie jako „de-N-acetylogangliozydy“, ponieważ grupa acylowa w tej pozycji jest głównie grupą acetylową. Przez oznaczenie tych dwóch atomów azotu w resztach sfingozyny i kwasu neuraminowego, odpowiednio, N,N', nazwę „N'-lizogangliozyd“ można zastosować w odniesieniu do uprzednio wspomnianych de-N-acetylogangliozydów, tak samo jak terminu lizogangliozydy używa się dla pochodnych z wolną grupą aminową w reszcie singozyny, które powinny być zatem bardziej dokładnie określane jako „Nlizogangliozydy“. Z drugiej strony, termin N,N'-di-lizogangliozydy odnosi się do związków z obydwiema grupami aminowymi wolnymi. Jak już wspomniano we wstępie, w niniejszym zgłoszeniu będzie się używać tej właśnie nomenklatury.

Wyżej wspomniana definicja pochodnych sposobem według wynalazku obejmuje grupę pochodnych gangliozydów zawierających grupę acetylową przy azocie kwasu neuraminowego i C-i-Cn-acylową przy azocie sfingozyny.

Sposobem według wynalazku wytwarza się także N-acylo-lizogangliozydy tego typu, pochodne od wyżej wspomnianych lizogangliozydów otrzymanych enzymatycznie, a więc z grupami acylowymi w kwasach sjalowych, jakie są obecne w naturalnych gangliozydach, tj. z mieszaninami grup acyloaminowych pochodzących głównie od kwasu octowego i w mniejszym stopniu od kwasu glikolowego i ewentualnie z grupami acylowymi estryfikującymi grupy hydroksylowe. Terminu „N-lizogangliozydy“ lub „N-acylo-lizogangliozydy“ będzie się więc używać w następującym opisie wynalazku do obydwu tych pochodnych, które kwalifikuje się jako „naturalne“, (np. naturalny N-lizo GM1), i do tych, z pojedynczą grupą acetylową przy azocie kwasu neuraminowego, którą nazywać się będzie z pominięciem tego dodatku, albo korzystnie, jako pochodną N,N'-dilizogangliozydów. Jednakże, termin „acylo-dilizogangliozydy“ będzie się używać w dalszej części niniejszego opisu do oznaczania wszystkich nowych związków wytwarzanych sposobem według wynalazku. Jak to zostanie wyjaśnione w dalszej części niniejszego opisu, możliwe jest selektywne deacylowanie gangliozydu przy azocie i przy grupach hydroksylowych kwasu neuraminowego, np. przy użyciu rozcieńczonego wodorotlenku alkalicznego. W związkach tych, acylowanie grupy aminowej reszty kwasu neuraminowego acylem innym niż acetyl (i glikolil) prowadzi do wytwarzania N,N'-diacylo-N,N'-diIizogangliozydów, w których utrzymana jest naturalna część gangliozydów, to jest mieszana grupa acylowa pochodząca z wyższych kwasów tłuszczowych. Te pochodne, które stanowią korzystną grupę nowych związków wytwarzanych sposobem według wynalazku, będzie się nazywać N'-acylo-N'-lizogangliozydy, na przykład N'-propionylo-N'-lizo GM1, N'-stearoilo-N'-lizo GM1 itd.

Nowe związki wytwarzane sposobem według wynalazku są półsyntetycznymi analogami gangliozydów różniących się od gangliozydów, pod względem obecności jednolitych i dobrze zdefiniowanych grup acylowych przy atomie azotu sfingozyny i/lub przy atomie azotu kwasu neuraminowego (z wyjątkiem naturalnych N-acylo-N-lizogangliozydów i N'-acylo-N'-lizogangliozydów), oraz tym, że grupy acylowe są obecne w innych kombinacjach niż występujące w produktach naturalnych, tak więc, w N-acylo-N-lizogangliozydach wytwarzanych sposobem według wynalazku, grupy acylowe pochodzą od niższych homologów kwasów tłuszczowych występujących w produktach naturalnych, takich jak kwas stearynowy, o maksymalnie 11 atomach węgla i mogą mieć także łańcuchy rozgałęzione. W tych pochodnych z grupą acylową inną niż acetyl przy azocie kwasu neuraminowego, mogą występować grupy acylowe wyżej wspomnianego typu przy azocie sfingozyny lub grupy acylowe pochodzące od wyższych kwasów tłuszczowych typowych dla gangliozydów naturalnych , jak również homologi o wyższym ciężarze cząsteczkowym i do 24 atomów węgla. Do pochodnych z wolnymi grupami aminowymi w częściach sjalowych należą również niższe homologi „naturalnych*¹ grup acylowych przy azocie sfingozyny.

165 209

W większości, acylo-lizogangliozydy wytwarzane sposobem według wynalazku są to substancje nowe. Zostały opisane pewne pochodne objęte wyżej wspomnianą definicją, będące pochodnymi N-acylo-lizogangliozydów. Bardziej szczegółowo są to: N,N'-diacetylo-N,N'-dilizo GMi (patrz: Medical Biology, 52,229-233,1974), N-acetylo-N,N'-dilizo GM3 (Carbohydrate Research, 179, 393-410, 1988), N'-acetylo-N,N'-dilizo GM3 (Carbohydrate Research, _ 179, 393-410, 1988) oraz N,N'-diacetylo-N,N'-dilizo GM3 (Carbohydrate Research, 179, 393-410, 1988).

Według wynalazku, związki te, dla których nie istnieje w piśmiennictwie opis dotyczący ich zastosowania farmakologicznego i terapeutycznego, wykazują takie samo lub analogiczne działanie farmakologiczne, jak to opisano w dalszej części niniejszego opisu w odniesieniu do nowych związków. Zastosowanie to zawarte jest w zastrzeżeniach dotyczących terapeutycznego zastosowania tych substancji jak i preparatów farmaceutycznych zawierających je jako składnik czynny. Produkt deacylowany tak przy azocie kwasu ceraminowego jak i przy azocie sfingozyny, opisany np. w wyżej wspomnianej publikacji w Carbohydrate Research, także wykazuje podobną aktywność biologiczną i użycie tego związku oraz zawierających go preparatów farmaceutycznych także jest zastrzeżone.

Wynalazek obejmuje także swym zakresem sposób wytwarzania funkcyjnych pochodnych wywodzących się z grup karboksylowych kwasu sjalowego nowych acylo-lizogangliozydów, to jest estrów lub amidów, a także estrów wewnętrznych z wiązaniami laktonowymi między grupami karboksylowymi kwasu sjalowego a grupami hydroksylowymi ligosacharydu, analogicznych do gangliozydów, które są już znane, jak również pochodnych nadacylowanych przy gangliozydowych grupach hydroksylowych, tak w przypadku acylo-lizogangliozydów, jak i ich uprzednio wspomnianych funkcjonalnych pochodnych, oraz soli wszystkich nowych acylo-dilizogangliozydów i ich funkcjonalnych pochodnych.

Lizogangliozydy, które służą jako podstawa do otrzymywania nowych N-acylopochodnych wytwarzanych sposobem według wynalazku, są to przede wszystkim te lizogangliozydy, które można otrzymać w wyniku deacylowania gangliozydów dających się ekstrahować z produktów naturalnych, a przede wszystkim z tkanek ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego kręgowców, a także z rdzenia nadnerczy, z erytrocytów, ze śledziony i innych narządów. Mogą to być oczyszczone gangliozydy, jak zdefiniowano w piśmiennictwie, to jest takie, które mają jednolitą strukturę w części sacharydowej.

Wśród najważniejszych gangliozydów do użycia jako podstawa wyjściowa nowych pochodnych, można wymienić np. te, w których oligosacharyd utworzony jest maksymalnie z czterech reszt heksozowych i w których część sacharydowa stanowi jednostkę chemiczną. Korzystnie, heksozy wybrane są z grupy złożonej z N-acetyloglukozaminy i N-acetylogalaktozaminy (grupa gangliozydów A). Gangliozydami w omawianej grupie są np. gangliozydy ekstrahowane z mózgu kręgowców, takie jak opisane w artykule „Gangliosides of the Nervous System w „Glycolipid Methodology“, wyd. Lloyd A. Wittig, American Oil Chemists Society, Champaign, III., 187-214 (1976) (patrz zwłaszcza tabela 1), np. gangliozydy GM4, GM3, GM2, GM1-GlcNAc, GD2, GD1a-GalNAc, GTIc, GQ, GT1, a w szczególności te, w których oligosacharyd zawiera co najmniej jedną resztę glukozy lub galaktory i jedną N-acetyloglukozaminy lub N-acetylogalaktozaminy, a nade wszystko następujące (grupa gangliozydów B): GMI o wzorze 6, GD 1a o wzorze 7, GD 1b o wzorze 8 i GT1b o wzorze 9, w których to wzorach G1c oznacza glukozę, GalNAC oznacza N-acetylogalaktozaminę, Gal oznacza galaktozę, NANA oznacza kwas Nacetyloneuraminowy. Dla lepszego objaśnienia struktury gangliozydów o wyżej wspomnianym wzorze 1, który jest zasadniczo taki sam, jak w przypadku pochodnych wytwarzanych sposobem według wynalazku, a w szczególności charakteru wiązania między częściami sacharydowymi, kwasami sjalowymi i ceramidem, służy wzór 5, w którym Y = H, OH, przedstawiający sobą całkowity wzór „czystego gangliozydu GM 1 zawierającego jeden pojedynczy kwas sjalowy (reprezentowany tu przez kwas N-acetyloneuraminowy lub N-glikoliloneuraminowy).

Zasadniczo ten sam wzór ważny jest także dla pochodnej gangliozydu GMI wytwarzanej sposobem według wynalazku, z resztą ceramidową podstawioną odpowiednim „sztucznym ceramidem, w której grupa N-acylowa pochodzi z jednego z kwasów alifatycznych wspomnianych uprzednio i/lub w dalszej części niniejszego opisu i w której ewentualnie grupa acetylowa jest

165 209 podstawiona przy azocie kwasu neuraminowego jednym z kwasów objętych Wyżej wspomnianą definicją Wittiga dla nowych związków.

Zakresem wynalazku objęte są także mieszaniny nowych N-acylo-lizogangliozydów, a w szczególności te, które zostały otrzymane z mieszanin gangliozydów tak, jak są one obecne w ekstraktach z różnych tkanek zwierzęcych i to tak w ekstraktach „całkowitych jak i różnych frakcjach, np. opisanych w piśmiennictwie, np. w artykułach cytowanych powyżej, jak również w artykułach następujących: „Extraction and analysis of materials containing lipid bound sialic acid“ w powyżej wspomnianej publikacji, str. 159—186 (1976) oraz „Gangliosides of the Nervous System z tej samej książki, str. 187-214 i opis patentowy RFN nr 25 49 680. W tych nowych mieszaninach część N-acylowa mieszanin gangliozydów jest zastąpiona jedną z wyżej wspomnianych grup acylowych i można je otrzymać sposobem według wynalazku przedstawionym w dalszej części niniejszego opisu co do deacylowania tych mieszanin gangliozydów i ich następnego reacylowania, ewentualnie po reacylowaniu innych deacylowanych grup w sjalowej części gangliozydów. Wśród najważniejszych gangliozydów do użycia w charakterze produktów wyjściowych są ekstrakty gangliozydów otrzymanych z układu nerwowego, w szczególności z mózgu i zawierających gangliozydy GM1, GD1a, GD1b i GT1b, o których już wspomniano.

Dobrze wiadomo, że gangliozydy grają ważną rolę w układzie nerwowym i wykazano ostatnio, że są one użyteczne w leczeniu stanów patologicznych obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego [Acta Psychiat. Scand., II, 102 (1977); Eur. Medicophys., 13,1(1977); Ric. Sci Educ. Perm. Suppl., 9,115 (1978); Adv. Exp. Med. Bici., 71,27I (1976); Elektromyogr. Clin. Neurophysiol., 19, 353 (1979); Minerva Medica, 69, 3277 (1978); Minerva Stomat., 27,177 (1978); Med. del Lavoro, 68, 296 (1977); Brain Res., 197, 236 (1980)]. Lecznicze działanie gangliozydów, jak się wydaje, polega głównie na stymulowaniu tworzenia wypustek przez neurony i na aktywowaniu enzymów błony zaangażowanych w przewodnictwie nerwowym, takich jak enzym (Na+, K⁺) ATPaza [Brain Res., 197, 236 (1980), J. of Neurochem., 37, 350 (1981)]. Stymulowane przez gangliozydy tworzenie wypustek przez neurony zwiększa funkcjonalny powrót do stanu pierwotnego uszkodzonej tkanki nerwowej. Przeprowadzono dalsze badania zmierzające do znalezienia związków, które mogłyby się okazać skuteczniejsze od gangliozydów w leczeniu stanów patologicznych układu nerwowego. Badania te doprowadziły np. do odkrycia, że wewnętrzne estry gangliozydów, w których jedna lub większa ilość grup hydroksylowych w części sacharydowej jest zestryfikowana jedną, lub większą ilością grup karboksylowych kwasów sjalowych (reakcja wewnątrzcząsteczkowa) z utworzeniem takiej samej ilości pierścieni laktonowych, są bardziej aktywne niż same gangliozydy w pobudzaniu tworzenia wypustek przez neurony i w aktywowaniu enzymów błony zaangażowanych w przewodzeniu impulsów nerwowych, takich jak enzym (Na+, K+)ATPaza (patrz np. opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4476 119 z dnia 1984. 10. 09, nr 4 593091 z dnia 1986. 06. 03 i nr 4716223 z dnia 1987. 12. 29). „Zewnętrzne estry gangliozydów również przejawiają zwiększoną aktywność w pobudzaniu tworzenia wypustek przez neurony i przewodzenia impulsów nerwowowych, to jest estry funkcji karboksylowej kwasów sjalowych z różnymi alkoholami serii alifatycznej, aralifatycznej, alicyklicznej i heterocyklicznej. Amidy gangliozydów również wykazują te same właściwości, co właściwości nadacylowanych pochodnych amidów, estrów i pojedynczych gangliozydów.

Wszystkie te pochodne, opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 713 374 z dnia 1987. 12. 15, również można przyjąć jako substancje podstawowe dla nowych N-acylowanych pochodnych wytwarzanych sposobem według wynalazku. Podstawą sposobu według wynalazku jest odkrycie, że nowe półsyntetyczne pochodne gangliozydów opisane w niniejszym opisie i ich uprzednio wspomniane pochodne funkcjonalne oraz ich sole wykazują zasadniczo to samo działanie farmakologiczne, co naturalne gangliozydy lub ich analogiczne pochodne funkcjonalne, przy zakresie działania zmodyfikowanym w wielu parametrach, takich jak szybkość „początku, czas trwania i intensywność zjawiska tworzenia wypustek przez neurony, które można regulować zgodnie z mocniejszym lub słabszym lipofilowym lub hydrofitowym charakterem składnika acylowego, albo typem i istotą działań ubocznych, które może w pewnych przypadkach być negatywnego lub pozytywnego rodzaju, odnośnie do problemów terapeutycznych, których działanie dotyczy, takich jak, przede wszystkim, działanie hamujące dotyczące

165 209 kinazy białkowej C. W licznych przypadkach możliwe jest użycie nowych pochodnych do wykorzystania określonego działania kwasów odpowiadających danej grupie acylowej, bez odniesienia do specyficznego działania części gangliozydowej, która w takich przypadkach działa przede wszystkim jako nośnik. Jest więc tak w przypadku np. nowych związków wytwarzanych sposobem według wynalazku, w których grupy N i N'-acylowe pochodzą z kwasu, który wywiera wpływ na ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy, takiego jak kwas y-aminomasłowy.

Nowych półsyntetycznych analogów gangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku i takich, które już są znane i zostały uprzednio opisane, można użyć zamiast produktów naturalnych lub ich znanych już półsyntetycznych pochodnych. Przedstawiają one sobą wartościowe środki zastępcze w przypadku tych pacjentów, którzy nie odpowiadają zadowalająco na leczenie produktami dotychczasowymi, lub w przypadku obecności określonej idiosynkrazji lub alergii. Jak już powiedziano, można ich użyć jako nośników z powodu specyficznego działania farmakologicznego kwasu odpowiadającego grupom acylowym. Nowe analogi gangliozydów wywierają również działanie hamujące na aktywację kinazy białkowej C, która może wywierać niepożądany lub negatywny wpływ w pewnych warunkach nierównowagi w normalnych mechanizmach działania neurotransmiterów. Aktywacja ta pochodzi ze zwiększonego stężenia aminokwasów pobudzających, takich jak kwas glutaminowy i/lub asparaginowy i kwasy te, w wyżej wspomnianych nienormalnych warunkach wywierają bezpośrednie działanie toksyczne na neurony.

Główna korzyść odnoszona z produktów wytwarzanych sposobem według wynalazku, która odróżnia je od innych inhibitorów kinazy białkowej C, takich jak gangliozydy jako takie lub sfingazyna, polega na ich zdolności do zapobiegania i hamowania uprzednio wspomnianego działania neurotoksycznego. Ważne jest, aby podkreślić, że produkty wytwarzane sposobem według wynalazku, w przeciwieństwie do antagonistów wapnia i antagonistów receptorów glutaminianu (zwłaszcza NMDA), działają tylko w warunkach nienormalnych, ograniczając zlokalizowaną neurotoksyczność i utrzymując plastyczność neuronów, a przez to pozwalając na znacznie szybsze doprowadzenie do normy uszkodzonych funkcji fizjologicznych.

Wyżej wspomniane właściwości farmakologiczne nowych półsyntetycznych analogów gangliozydów można objaśnić za pomocą następujących eksperymentów przeprowadzonych z udziałem uprzednio wspomnianego N,N'-diacetylo-N,N'-di-lizo GM1 w porównaniu z gangliozydem GM1 pod względem ich zdolności do ochrony przed indukowaną glutaminianem neurotoksycznością w komórkach ziarnistych móżdżku, gdzie oszacowano także możliwe działanie cytotoksyczne, neurytogenne działanie na komórki czerwiaka niedojrzałego, jak również ich zdolność do zmniejszania uszkodzenia spowodowanego przez niedokrwienie in vivo. Stymulowanie receptorów przez pobudzające aminokwasy (EA A) może indukować translokację w błonie cytosolowej i aktywację kinazy białkowej (PKC) w pierwotnych hodowlach ziarnistych. Zjawisko to prawdopodobnie wynika ze wzmożonego wpływu Ca²⁺ indukowanego glutaminianem. Wiadomo, że dodanie glutaminianu do tych komórek powoduje uszkodzenie komórek, w którym prawdopodobnie pośredniczy zwiększone wewnątrzkomórkowe stężenie Ca²+. Ekspozycja móżdżkowych komórek ziarnistych na gangliozydy hamuje translokację i aktywację PKC indukowaną glutaminianem.

Dalej, podczas ostrego niedokrwienia mózgowego następuje ciągłe i nadmierne uwalnianie pobudzających aminokwasów (EAA). Ciągłe przedłużone działanie na receptory w niedokrwionym polu indukuje kaskadę rezultatów prowadzącą do dalszej degeneracji i śmierci neuronów. Niemożliwe jest interweniowanie w przypadkach nietypowych, ale powinno być możliwe ograniczenie zjawisk, w których niedokrwienie indukuje w niedokrwionym polu rozszerzanie się i wzmaganie zamierania neutronów.

Materiały i metody.

Eksperymenty in vitro.

1. a. Hodowla komkrek. Użyto pierwotnych hodowli móżdżóowych komkrek ziarnistych τ. 8-dniowych szczurów Sprague-Dawley jedenastego dnia hodowli.

Hodowle zawierały >90% komórek ziarnistych, 5% neuronów GABAergicznych i <5% żomZreż glejowych.

165 209

1. b. Wywołanie neurotoksyczności glutaminianem. Do komórek dodaje się glutaminian (50 μΜ i 100μM/-MgZ⁺ w roztworze Locke'a) i pozostawia na 15 minut w temperaturze pokojowej. Kontrole są bez glutaminianu. Następnie hodowle mieszano trzy razy w roztworze Locke'a, roztwór usuwa się i następnie hodowle ponownie umieszcza się w wyjściowym podłożu hodowlanym.

1. c. Solubilizacja, inkubacja związku i metody analizy. N,N'-diacetylo-N,N'-di-lizo GM1 solubilizowano w roztworze Locke'a w różnych stężeniach (0,3 μΜ - 50μM) i rozmaitych okresach:

- działanie wstępne: inkubacja w ciągu 15 minut, przemycie trzykrotne podłożem zawierającym surowicę, a następnie roztworem Locke'a bez Mg + przed wywołaniem neurotoksyczności;

- działanie równoległe: inkubowanie w ciągu 15 minut w tym samym czasie 50μM glutaminianem.

Przeżycie komórek ocenia się po upływie 24 godzin za pomocą:

- liczenia żywych komórek z wykorzystaniem kolorymetrycznej metody MTT (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolium);

- liczenia żywych komórek metodą fluorymetryczną;

barwienie hodowli w ciągu 3 minut w temperaturze 22°C roztworem zawierającym 36μΜ fluoryzujący dioctan (FDA) i 7 μ M propidium iodide (PI). Zabarwione komórki bada się bezpośrednio przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu z oświetleniem górnym. Uszkodzenie neuronów skraca barwienie dioctanem i ułatwia penetrację propidium iodide (związek polarny) oraz wzajemne oddziaływanie z DNA, co czyni kompleks czerwonym i fluoryzującym. Procentową zawartość przeżywających komórek liczby się przez pomiar fluorescencji octan/propidio iodide.

2. a. Hodowle komórek. Hodowle komórek nerwiaka niedojrzałego N2A posiewa się do gęstości 10000 komórek/dołek (24-costar) w podłożu hodowli złożonym z DMEM + 10% płodowej surowicy cielęcej. Po upływie 24 godzin od zasilania podłoże zastępuje się 350//1 podłoża świeżego.

2. b. Solubilizacja i inkubacja Liaade ai meioda analizy. N,N'-diaceialo-N,N'-di-lizo GM1 i GM1 (użyty jako kontrola pozytywna) rozpuszcza się w chloroformie/metanolu 2:1, suszy strumieniem azotu, zawiesza ponownie w podłożu hodowli i rozcieńcza do 50 μM lub 100 μM. Hodowle utrwala się po upływie 24 godzin i ocenia pod względem morfologicznym co do wzrostu neuronów.

Eksperymenty in vivo.

Model: niedokrwienie indukowane u noworodków szczurzych 7 dnia przez utrzymywanie podwiązania lewej tętnicy szyjnej.

Następnie zwierzęta zwracano ich matkom (do ssania) na 2 godziny. Następnie umieszczono je w komorze hipoksamicznaj (8% O2) na 2 godziny. Daje to w rezultacie uszkodzenie kory po stronie zamknięcia, charakterystyczne dla aminokwasów pobudzających. Następnie też zmniejszenie wagi mózgu, a bardziej szczegółowo, półkuli po stronie uszkodzenia.

balubilizacia, podawanie N,N'cdiacetylo-N,Nl-niclizo GM1 i badane parametry.

N,Nl-niacetylo-N,N'cdi-lizo GM1 solubilizuje się w roztworze soli i podaje w dawce 10 mg/kg na godzinę przed uszkodzeniem i tuż po nim.

Rozważanymi parametrami była waga mózgu, z przyjęciem przeciwnej półkuli jako kontroli.

Wyniki. Eksperymenty wykazują, że:

- N,N'cdiacetylocN,N'cdiclizo GM1 chroni (działanie wstępne w ciągu 15 minut) przed indukowaną glutaminianem neurotoksycznością in vitro w stężeniach nawet tak niskich jak 1 μM z maksymalną aktywnością (100% ochrony) przy 3-10pM, podczas gdy przy stężeniu 0,3μΜ brak jest aktywności (Fig. 1).

- Aktywność utrzymuje się do 50 μM wykazując toksyczność wewnętrzną tylko przy stężeniach >100 pM.

- N,N'cniacatylo-N,N'-ni-lizo GM1 chroni (<100%) przed śmiercią komórek indukowaną glutaminianem in vitro, nawet wtedy, gdy są indukowane łącznie (równoległe działanie w ciągu 15 minut) (Figura 2).

N,N'-diacetylo-N,Nl-nicliza GM1 jest aktywny w indukowaniu neurytogenezy na komórkach czerniaka niedojrzałego w stopniu wyższym niż GM1 (Tabela 1).

165 209 11

- In vivn podanie N,N 'NlNt^i^t^lc^-tylb^-NiMii^o GM 1 zmn izjsza utratę wagi wpółw uli mózgu po stronie zamknięcia (Tabela 2).

Omówienie wyników. Otrzymane wyniki wskazują na to, że pochodna gangliozydu nazwana N,N'-diacetylo-N,N'-di-lizo GM 1 zdolna jest do ochrony przed indukowaną glutaminianem neurotoksycznością i do indukowania neurytogenezy, a także do zmniejszenia uszkodzenia mózgu po niedokrwieniu in pipo. Aktywność biologiczna nowej pochodnej może więc być brana pod uwagę w takich stanach patologicznych, które polegają na uszkodzeniu glutaminianem, takich jak niedokrwienie mózgu, uraz, padaczka, pląsawica, choroba Parkinsona, starzenie się i demezcja, zaburzenia mózgowe, hipoglikemia i niedotlenienie.

Należy jednak zauważyć, że niektóre mechanizmy przy tworzeniu wypustek lub uszkodzeniu mózgu (uwalnianie substancji toksycznych) także są obecne, np. w uszkodzeniu neuro-kardiozaczyziowym.

T a be la 1

Związek	% z-uronów
Kontrola	3 + 2%
GM1 (100 μΜ)	77 + 8%
DADL (10O0M)	oddzi-lezi- komórek
(50pM)	83 + 7%

Tabela 2 Waga mózgu po uszkodzeniu przez ni-dotl-ni-ni- ni-dokrwi-zi- noworodków szczurzych
Działam-	Prawa półkula	Lewa półkula	Półkula
DAD1	0,394	0,271	-31,22%
DADL	0,390	0,360	- 7,69%
Roztwór soli	0,398	0,296	- 25,63%
DADL	0,417	0,386	- 7,43%
DADL	0,419	0,377	- 10,02%
Roztwór soli	0,404	0,317	-21,53%
DADL	0,416	0,302	- 27,40%
Roztwór soli	0,420	0,245	-41,67%
Roztwór soli	0,407	0,286	- 29,61
Nr = 3	0,007	0,021	6,14
DADL	0,407	0,339	- 16,75
10 mg/kg	0,006	0,022	5,18
Nr = 5

Figura 1 przedstawia zależną od dawki odpowiedź na N,N'-diacetylo-N,N'-di-lizo GM1 (DADL) w ochronie przed neurotoksycznością indukowaną glutaminianem. Ilość komórek przeżywających oszacowuje się z zastosowaniem -MTT kolorymetru (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)2,5-difenylot-traroilum).

Figura 2 przedstawia zależną od dawki odpowiedź na N,N'-diacetylo-N,N'-di-lizo GM1 (DADL) w ochronie przed neurotoksycznością indukowaną glutaminianem po 15 minutach od działania wstępnego i 15 minutach działania równoległego. Przeżycie komórek oszacowuje się przy użyciu fluorymetrii octaz/propidium iodide.

Uprzednio wspomniane półsyntetyczne analogi gazgliozydów można zastosować z uwagi na ich uprzednio opisane właściwości farmakologiczne, jako leki w następujących stanach patologicznych: niedokrwienie mózgowe, encefalopatię metaboliczne, takie jak hip-rglikemia i niedotleζϊ-ζϊ-, encefalopatię pochodzenia toksycznego, uraz, starzenie się, padaczka, choroby neurodegezeratywne, takie jak choroba Parkinsona i pląsawica Huntingtona oraz zaburzenia psychiczne.

Kwasy zawierające od 1 do 11 atomów węgla, z których pochodzą grupy acylowe N-acylolizogangllorydów i N,N'-diacylo-di-lizogangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku, są to kwasy zasycone, o łańcuchu prostym · lub rozgałęzionym, takie jak np. kwas mrów12

165 209 kowy, octowy, propionowy, masłowy i walerianowy, a zwłaszcza kwas walerianowy normalny i kwas izowalerianowy, kwas piwalinowy (trimetylooctowy), kwas kapronowy i izokapronowy, kwas enantowy, kwas oktanowy, kwas pelargonowy, kwas dekanowy i undecylowy, kwas di-tertbutylooctowy i kwas 2-propylowalerianowy.

Spośród kwasów nienasyconych można wymienić kwas angelikowy i kwas tyglinowy.

Spośród kwasów długołańcuchowych o większej liczbie atomów węgla np. do 24 atomów węgla szczególną uwagę należy zwrócić na kwasy o łańcuchu prostym, a zwłaszcza na te, które zawierają od 12 do 16 atomów węgla, np. kwas laurynowy, kwas mirystynowy i kwas palmitynowy, oraz na kwasy o nawet wyższej zawartości węgla, takie jak kwas olejowy, kwas elaidynowy, kwas stearynowy, kwas ejkozakarboksylowy i kwas behamowy. Jeśli chodzi o grupy acylowe o łańcuchu rozgałęzionym, tak w przypadku grup o mniejszej liczbie atomów węgla (C1-C11), jak i w przypadku grup zawierających od 12 do 24 atomów węgla, łańcuchy boczne korzystnie stanowią niższe grupy alkilowe o nie więcej niż czterech atomach węgla, zwłaszcza grupy metylowe.

Spośród nowych acylo-lizogangliozydów szczególnie ważne są N,N'-diacylo-di-lizogangliozydy, a zwłaszcza te, które pochodzą od wyżej wymienionych kwasów, na które zwrócono specjalną uwagę. Do niektórych przykładowych związków tego typu należą następujące: N,N'-diformylo-N,N-dilizo GM1, N,N'-diacetylo-dilizo GM1, N,N-dipropionylo-N,N'-dilizo GM1, N,N'-dibutyrylo-N,N'-dilizo GM1, N,N'-dipiwaloilo-N,N'-dilizo GM1, N,N'-diwalerylo-N,N'dilizo GM1, N,N'-dioktanoilo-N,N'-dilizo GM1, N,N'-dIlauroIlo-N,N'-dilIzo GM1, N,N'-di-2propyIentanoIlo-l'-N,N'-dIlizo GM1, N,N'-dIheksanoIlo-N,N'-dIlizo GM1, N,N'-diizowaleryloN,N'-dilizo GM1, N,N'-dienantylo-N,N'-dilizo GM1, N,N'-dipelargonylo-N,N'-N,N'-dilizo GM1, N,N'-di-tert-butyloacetylo-N,N’-dIlizo GM1, N,N'-dipalmItoilo—N,N'-dIlizo GM1, N,N'-dilauroiloN,N-dilIzo GM1, N,N'-diastearoilo-N,N'-dilizo GM1, N,N'-dioleilo-N,N'-dilizo GM1. Do niektórych przykładowych pochodnych z jedną tylko grupą N- lub N'-acylową należą: N-formylo- i N'-formylo-N,N'-dilizo GM1, N-acetylo- i N'-acetylo-N,N'-dilizo GM1, N-propionylo- i N'propionylo-N,N'-dilizo GM1, N-butyrylo- i N'-butyrylo-N,N'-dilizo GM1, N-piwaloilo- i N'piwaloilo-N,N'-dilizo GM1, N-walerylo- i N'-walerylo-N,N'-dilizo GM1, N-lauroilo- i N'-lauroliloN,N'-dilizo GM1, N-2-propylopentanoilo- i N'-2-propylopentanoilo-N,N'-dilizo GM1, N-heksanoilo- i N'-heksanoilo-N,N'-dilizo GM1, N-izowalerylo- i N'-izowalerylo-N,N'-dilizo GM1, N-tertbutyloacetylo- i N'-tert-butyloacetylo-N,N'-dilizo GM1, N-palmitoilo- i N'-palmitoilo-N,N'-dilizo GM1, N-lauroilo- i N'-lauroiIo-N,N'-dilizo GM1, N-stearoilo- i N'-stearoilo-N,N-dilizo GM1, oleilo- i N'-oleilo-N,N'-dilizo GM1.

Wszystkie wyżej wspomniane pochodne nowych półsyntetycznych analogów gangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku, takie jak estry, wewnętrzne, amidy i pochodne nadacylowane można otrzymać z tych związków z wykorzystaniem sposobów postępowania opisanych w powyżej wspomnianym opisie patentowym dotyczącym rozmaitych odpowiednich pochodnych gangliozydów.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania mieszanin tych pochodnych, takich jak pochodne otrzymywane z mieszanin acylo-lizogangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku, które z kolei otrzymuje się z wyżej wspomnianych mieszanin gangliozydów.

Grupy estrowe nowych pochodnych N-acylo-lizogangliozydów pochodzą, w szczególności od alkoholi szeregu alifatycznego, a zwłaszcza od alkoholi o maksymalnie 12, a szczególnie 6, atomach węgla, albo szeregu aralifatycznego o korzystnie jednym pojedynczym pierścieniu benzenowym, ewentualnie podstawionym 1-3 niższymi grupami alkilowymi (C1-4), takimi jak grupy metylowe oraz o maksymalnie czterech atomach węgla w łańcuchu alifatycznym, albo alkoholami szeregu alicyklicznego lub alifatyczno alicyklicznego z jednym pojedynczym pierścieniem cykloalifatycznym i o maksymalnie 14 atomach węgla, albo szeregu heterocyklicznego o maksymalnie 12, a zwłaszcza 6 atomach węgla i jednym pojedynczym pierścieniu heterocyklicznym, zawierającym heteroatom wybrany z grupy utworzonej przez N, O i S. Grupy amidowe funkcji karboksylowych w pochodnych N-acylo-lizogangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku pochodzą z amoniaku lub od amin jakiejkolwiek klasy o korzystnie, nie więcej niż 12 atomach węgla.

Wspomniane powyżej alkohole i aminy mogą być związkami nie podstawionymi lub podstawionymi, zwłaszcza funkcjami wybranymi z grupy utworzonej przez grupę hydroksylową, ami165 209 nową, alkoksylową o nie więcej niż 4 atomach węgla w części alkilowej, grupę karboksylową lub karbalkoksylową o nie więcej niż 4 atomach węgla w reszcie alkilowej, grupę alkiloaminową lub dialkiloaminową o nie więcej niż 4 atomach węgla w części alkilowej, i mogą być nasycone lub nienasycone, w szczególności mogą zawierać tylko jedno wiązanie podwójne. Alkohole, których używa się do zestryfikowania funkcji karboksylowych N-acylo-lizogangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku, mogą być związkami jednowantościowymi lub wielowartościowymi, w szczególności dwuwartościowymi. Spośród alkoholi szeregu alifatycznego, szczególną uwagę należy zwrócić na alkohole niższe, o maksymalnie 6 atomach węgla, takie jak alkohol metylowy, alkohol etylowy, alkohol propylowy i izopropylowy, alkohol n-butylowy, izobutylowy i tertbutylowy, oraz alkohole awuwartościowa, takie jak glikol etylenowy i glikol propylenowy. Spośród alkoholi szeregu aralifatycznego szczególną uwagę należy zwrócić na alkohole zawierające jeden pojedynczy pierścień benzenowy, takie jak alkohol benzylowy i alkohol fenyloetylowy. Do alkoholi szeregu alicyklicznego korzystnie należą alkohole z jednym pojedynczym pierścieniem cykloalifatycznym, takie jak alkohol cykloheksylowy (cykloheksanom, alkohole terpenowe, takie jak mentanol i karwomentol, wzglęnie jeden z terpineoli lub terpineol lub piperytol.

Spośród alkoholi szeregu heterocyklicznego szczególną uwagę zwrócić należy na tetrahyarofuranol lub tetrahydropiracol.

Grupy karboksylowe N-acylo-lizogangliozydów mogą być zestryfikowane podstawionymi alkoholami alifatycznymi, zawierającymi np. funkcyjne grupy aminowe, takimi jak aminoalkohole, np. aminoalkohole zawierające nie więcej niż 4 atomy węgla, a zwłaszcza aminoalkohole zawierające grupę dialkiloaminową, takie jak aietyloaminoetαcol.

Grupy karboksyamiaowa, które wprowadza się do acylo-lizogangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku pochodzą albo z amoniaku (przy czym w tym przypadku amid jest nie podstawionym amidem-CON^), albo wywodzą się z amin pierwszorzędowych lub anugorzęaowych, a zwłaszcza zawierających nie więcej niż 12 atomów węgla. Mogą to być aminy aromatyczne, heterocykliczne, alicykliczne, a zwłaszcza alifatyczne. Korzystnie wytwarza się pochodne karboksyamidowa od amin alifatycznych o maksymalnie 12 atomach węgla, przy czym aminy te mogą mieć łańcuch otwarty, prosty lub rozgałęziony, a także mogą to być aminy cykliczne, takie jak np. alkiloaminy z grupami alkilowymi zawierającymi od 1do 6 atomów węgla, takie jak metyloamina lub etyloamina, propyloamina, haksyloamica, dimetyloamina, diety^m^, diizopropyloamina, diheksyloamina lub alżilecoamicy z grupami alkilenowymi o łańcuchu prostym, o 3-6 atomach węgla lub odpowiednich łańcuchach podstawionych 1-3 grupami metylowymi, takie jak pirolidyna, piperydyna i azepina. Łańcuch węglowy grup alkilowych lub alkilenowych tych amin, także może być przerwany i podstawiony innymi heteroatomami, w szczególności atomami azotu, i amidy wytwarzane sposobem według wynalazku w tym przypadku pochodzą od diamin, takich jak np. etylenodiamina, trimetylacoaiamina i piperazyna. W przypadku, gdy grupy alkilowe lub alżilecowa są przerwane lub podstawione atomami tlenu lub siarki, przedstawicielami amidów są pochodne aminoalkoholi, takich jak aminoetanol lub aminopropanol, względnie są to pochodne morfoliny lub tiomorfoliny.

Wynalazek obejmuje swoim zakresem także sposób wytwarzania pochodnych nadacylowanych w grupach hydroksylowych części sacharydowej, kwasów sjalowych i ceramidu oraz opisanych tu estrów i amidów. Grupy acylowe w tych pochodnych mogą pochodzić z kwasów szeregu alifatycznego, aromatycznego, aralifatycznego, alicyklicznego lub heterocyklicznego. Wytwarza się je korzystnie z kwasów szeregu alifatycznego zawierających nie więcej niż 10 atomów węgla, a zwłaszcza 6 atomów węgla, takich jak kwas mrówkowy, octowy, propionowy, masłowy, walerianowy, kapronowy lub kaprylowy. Mogą one także pochodzić z kwasów np. o takiej samej liczbie atomów węgla, ale podstawionych. W szczególności chodzi tu o hydroksykwasy, takie jak kwas mlekowy, aminokwasy, takie jak glicyna lub kwasy dwuzasadowe, takie jak kwas bursztynowy, malonowy lub maleinowy. Spośród kwasów aromatycznych należy wspomnieć kwasy zawierające jeden pojedynczy pierścień benzenowy, a w szczególności kwas benzoesowy i jego pochodne z grupami metylowymi, hydroksylowymi, aminowymi lub karboksylowymi, takie jak kwas paminobenzoesowy, kwas salicylowy lub ftalowy.

165 209

Wynalazek obejmuje także sposób wytwarzania nadacylowanych pochodnych N-acylolizogangliozydów, jednakże z wolnymi funkcjami karboksylowymi. Szczególnie ważne, jeśli chodzi o te pochodne, są acylowane pochodne kwasów wyszczególnionych poprzednio.

Szczególnie ważną grupą nowych pochodnych jest grupa złożona z gangliozydów, które są zestryfikowane, albo przekształcone w amidy, albo z nadacylowanymi grupami hydroksylowymi, w których grupy estrowe pochodzą od alkoholi alifatycznych o nie więcej niż 6 atomach węgla, nasaconych, niepodstawionych lub grupami hydroksylowymi, alkoksylowymi zawierającymi nie więcej niż 4 atomy węgla, aminowymi, alkiloaminowymi lub dialkiloaminowymi, zawierającymi nie więcej niż 4 atomy węgla w części alkilowej, grupami karboksylowymi, grupami karboalkoksylowymi zawierającymi nie więcej niż 4 atomy węgla w reszcie alkilowej, oraz od odpowiednich alkoholi nienasyconych z najwyżej jednym pojedynczym wiązaniem, alkoholi aralifatycznych z jednym pojedynczym pierścieniem benzenowym, nie podstawionych lub podstawionych 1-3 grupami metylowymi, od alkoholi cykloalifatycznych lub alifatyczno-cykloalifatycznych z pierścieniem cykloheksanowym, nie podstawionych lub podstawionych 1-3 grupami metylowymi, przy maksymalnie 4 atomach węgla w części alifatycznej, od tetrahydrofuranolu lub tetrahydropiranolu. Grupy amidowe w tego rodzaju pochodnych pochodzą z amoniaku albo z alkiloamin, dialkiloamin lub alkilenoamin o nie więcej niż 6 atomach węgla w grupie alkilowej oraz od 4 do 8 atomów węgla w grupie alkilenowej, w których grupy alkilowe lub alkilenowe mogą mieć przerwany łańcuch węglowy heteroatomami wybranymi z grupy utworzonej przez azot, tlen lub siarkę, przy czym grupą aminową może być grupa -NH w przypadku obecności atomu azotu podstawionego grupą alkilową zawierającą nie więcej niż 4 atomy węgla i/lub mogą one być podstawione grupami wybranymi z grupy utworzonej przez grupę aminową, alkiloaminową lub dialkiloaminową o nie więcej niż 4 atomach węgla w częśc. alkilowej, albo grupami hydroksylowymi lub alkoksylowymi zawierającymi nie więcej niż 4 atomy węgla w grupie alkilowej, albo aminy aralifatyczne z jednym pojedynczym pierścieniem benzenowym ewentualnie podstawionym nie więcej niż 3 grupami metylowymi, przy nie więcej niż 4 atomach węgla w części alifatycznej. Grupy acylowe, które estryfikują grupy hydroksylowe w pochodnych tego rodzaju, pochodną z nasyconych lub nienasyconych kwasów alifatycznych zawierających nie więcej niż 6 atomów węgla, które mogą być także podstawione funkcją wybraną z grupy utworzonej przez grupę hydroksylową, aminową i karbalkoksylową, oraz ich soli.

Warto zwrócić uwagę na następujące funkcjonalne pochodne nowych półsyntetycznych analogów gangliozydów, a mianowicie estry kwasu sjalowego poprzednio wspomnianych nowych związków, pochodzące od alkoholu metylowego, etylowego, propylowego, izopropylowego, nbutylowego, izobutylowego, tert-butylowego, benzylowego, allilowego, etoksykarbonylometylowego i cykloheksylowego, amidy kwasu sjalowego wywodzące się z metyloaminy, etyloaminy, propyloaminy, dimetyloaminy, dietyloaminy, pirolidyny, piperydyny, piperazyny, morfoliny, tiomorfoliny oraz nadacylany, nadpropionylany, nadmaślany, nadmaleinian, nadbursztynian i nadacylowane analogi estrów kwasu sjalowego i amidów wyżej wspomnianych.

Sposobem według wynalazku N-acylo-N,N'-dilizogangliozydy, w których grupa acylowa przy azocie N pochodzi od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1do 11 atomach węgla, N'-acyloN,N'-dilizogangliozydy i N,N'-diacylo-N,N'-dilizogangliozydy, w których grupy acylowe przy N i N' pochodzą od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1do 24 atomach węgla, a w przypadku diacylowych pochodnych, w których grupą N'-acylową jest grupa acetylowa, druga grupa acylowa pochodzi tylko od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1do 11 atomach węgla wytwarza się przez acylowanie N,N'-dilizogangliozydu, N-acylo-dilizogangliozydu lub N'-acylo-dilizogangliozydy lub ich mieszaniny funkcyjną pochodną kwasu, który odpowiada produktowi końcowemu lub przez odacylowanie odpowiedniego N,N'-diacylo-N,N'-dilizogangliozydu selektywnie przy azocie sfingozyny lub przy azocie neuraminowym.

W celu wytworzenia di-acylopochodnych, w których grupy acyloaminowe pochodzą od tego samego kwasu, korzystnie dla uproszczenia, poddaje się acylowaniu di-lizogangliozydy w jednym etapie. Di-lizogangliozydy można otrzymać z gangliozydów lub z N-lizogangliozydów na drodze hydrolizy alkalicznej, np. z użyciem wodorotlenków tetraalkiloamoniowych, wodorotlenku potasowego lub innych związków alkalicznych.

165 209

Sposobem według wynalazku w celu otrzymania produktów, w których grupy acyloaminowe pochodzą z różnych kwasów, korzystnie jako związków wyjściowych używa się pochodnych N- lub N'-monoacylowych di-lizogangliozydów. N-monoacylo-di-lizogangliozydy można otrzymać na drodze selektywnego acylowania di-lizogangliozydów, ponieważ grupa aminowa sfingozyny jest bardziej reaktywna od grupy kwasu neuraminowego. Za pomocą łagodnego acylowania dilizogangliozydów zgodnie ze znanymi metodami, np. z wykorzystaniem metod acylowania stosowanych w chemii peptydów, można otrzymać wyżej wspomnianych pochodne monoacylowe przy azocie sfingozyny. Następnie poddaje się je acylowaniu przy azocie kwasu neuraminowego typowym sposobem. Sposób postępowania przy acylowaniu zmierzający do uzyskania produktów sposobem według wynalazku obejmuje w tym przypadku dwuetapową reakcję acylowania.

Jeżeli przewiduje się użycie związków z grupami monoacylowymi przy azocie kwasu neuraminowego, można je wytworzyć różnymi sposobami. I tak np. można rozpocząć proces z użyciem di-lizogangliozydów, a następnie doprowadzić do pośredniego tymczasowego zabezpieczenia aminowych grup sfingozyny, czego dokonać można np. za pomocą hydrofobowego wzajemnego oddziaływania z fosfatydylocholiną, lub na drodze acylowania z użyciem odpowiednich grup ochronnych, następnie acylować przy azocie kwasu neuraminowego z użyciem pochodnej kwasu, który ma zostać wprowadzony w tę pozycję, a potem odblokować azot sfingozyny. W końcu, di-lizogangliozydy można poddać acylowaniu przy dwu grupach aminowych tym samym kwasem i otrzymany związek diacylowy można poddać działaniu enzymów zdolnych do selektywnego rozerwania grup acyloaminowych jedynie przy azocie sfingozyny, takich jak enzymy stosowane do otrzymywania lizogangliozydów z gangliozydów, np. enzym deacylaza glikosfingolipidoceramidowa (patrz schemat 1). N-monoacylo-N,N'-di-lizogangliozydy można jednakże otrzymać także za pomocą deacylowania N,N'-diacylo-N,N'-di-lizogangliozydów przy azocie kwasu neuraminowego na drodze selektywnej hydrolizy chemicznej, np. z zastosowaniem 0,1 M alkoholowego roztworu wodorotlenku potasowego.

W takich wytworzonych acylo-di-lizogangliozydach można, w razie potrzeby przekształcić funkcjonalnie grupy karboksylowe kwasów sjalowych lub grupy hydroksylowe tych kwasów, np. przeprowadzić je w estry lub amidy, względnie przekształcić grupy hydroksylowe w grupy zestryfikowane kwasami (nadacylany). Związki można przekształcić w estry, amidy lub estry wewnętrzne, względnie związki otrzymane można przekształcić w hydroksynadacylany oraz, jeżeli jest to pożądane, otrzymane produkty można przekształcić w ich sole.

Reakcję N-acylowania prowadzi się środkiem acylującym, który stanowi funkcyjna pochodna kwasu, którego reszta ma zostać wprowadzona. Tak więc, jako funkcyjną pochodną kwasu można stosować halogenek lub bezwodnik kwasu, a acylowanie korzystnie przeprowadza się w obecności zasady trzeciorzędowej, takiej jak pirydyna lub kolidyna. Można przyjąć warunki bezwodne i temperaturę pokojową lub wyższą, względnie można wykorzystać metodą Schotten- Baumanna, prowadząc z korzyścią proces w warunkach wodnych, w obecności zasady organicznej. W niektórych przypadkach można także stosować estry kwasów jako reaktywne pochodne funkcyjne. Aby dokonać acetylowania, można także stosować metody z użyciem zaktywowanych pochodnych karboksylowych, takich jak metody stosowane w chemii peptydów, np. metodą z użyciem bezwodników mieszanych lub pochodnych dających się uzyskać przy udziale pochodnych karbodiimidu lub soli izoksazolu. Ze wszystkich metod wytwarzania, najbardziej odpowiednie są sposoby następujące:

1. reakcja pochodnej lizogangliozydu z azydkiem kwasu,

2. reakcja pochodnej lizogangliozydu z acyloimidazolem kwasu dającym się uzyskać z kwasu przy użyciu N,N'-karbonylodiimidazolu,

3. reakcja pochodnej lizogangliozydu z mieszanym bezwodnikiem kwasu i kwasem trifluorooctowym,

4. reakcja pochodnej lizogangliozydu z chlorkiem kwasu,

5. reakcja pochodnej lizogangliozydu z kwasem w obecności karbodiimidu (takiego jak dicykloheksylokarbodiimid) i ewentualnie substancji takiej jak 1-hydroksybenzotriazol,

6. reakcja ” pochodnej lizogangliozydu z kwasem przy ogrzewaniu,

7. reakcja pochodnej lizogangliozydu z estrem metylowym kwasu w wysokiej temperaturze,

165 209

8. reakcja pochodnej lizogangliozydu z fenolowym estrem kwasu, np. estrem z p-nitrofenolem,

9. reakcja pochodnej lizogangliozydu z estrem wywodzącym się z wymiany między solą kwasu i jodkiem l-metylo-2-chloropirydyniowym.

Zostało już wyjaśnione, w jaki sposób możliwe jest uzyskanie selektywnego częściowego acylowania tak przy azocie sfingozyny jak i kwasu neuraminowego. Omawiane sposoby postępowania objaśnia schemat 1. Enzymatyczną deacylację N,N'-diacylo-N,N'-di-lizogangliozydów przy azocie sfingozyny, jak uprzednio doniesiono, można przeprowadzić w warunkach takich samych jak warunki przyjęte dla częściowej deacylacji gangliozydów, np. jak opisano w J. Biochem., 103,1 (1988). Podwójnej deacylacji N,N'-diacylo-N,N'-di-lizogangliozydów do N,N'-di-lizogangliozydów dokonać można w taki sam sposób jak w przypadku otrzymywania de-N-acetylolizogangliozydów, jak to opisano np. w Biochemistry, 24, 525 (1985); J.Biol. Chem., 255, 7657 (1980); Biol. Chem. Hoppe Seyler, 367, 241 (1986); Carbohydr. Research 179, 393 (1988); Bioch. Bioph. Res. Comn., 147, 127 (1987).

Wspomniana powyżej publikacja zamieszczona w Carbohydr. Research, 179, także opisuje sposób selektywnego deacylowania azotu kwasu neuraminowego dającego się uzyskać w wyniku działania 0,1 M KOH w 90% n-butanolu z gangliozydem GM3. Reakcję deacylacji tego typu można zastosować w przypadku N,N'-diacylo-N,N'-di-lizogangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku w celu wytworzenia N-acylo-N,N'-di-lizogangliozydów. Oczywiście, w zakres niniejszego wynalazku wchodzą wszelkie chemiczne odpowiedniki sposobu wytwarzania tego typu, które będą oczywiste dla fachowca w tej dziedzinie techniki.

Pochodne karboksylowe lub hydroksylowe nowych acylo-lizogangliozydów otrzymanych zgodnie z wyżej wspomnianymi metodami, można wytworzyć według metod znanych, z wyłączeniem tych metod, które wywierałyby efekt zmiany zasadniczej struktury gangliozydu, takich jak metody z udziałem czynników silnie kwaśnych, lub które realizuje się w warunkach drastycznie zasadowych lub kwaśnych, albo, także tych metod, które prowadziłyby do niepożądanego alkilowania grup hydroksylowych w części sacharydowej. Ekstrakcji grup karboksylowych N-acylogangliozydów, albo ich przekształcenia w amidy dokonać można np. sposobem opisanym w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 713 374 w odniesieniu do gangliozydów. Estry wewnętrzne nowych pochodnych można utworzyć także w taki sam sposób jak w przypadku estrów wewnętrznych gangliozydów, jak to opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4593091 oraz w opisie patentowym EP nr 0072722. Te estry wewnętrzne obejmują nie tylko związki utworzone na drodze laktonizacji grup karboksylowych kwasu sjalowego z grupami hydroksylowymi sacharydu, ale także np. te związki, które zawierają pierścienie laktonowe utworzone między grupami karboksylowymi kwasu sjalowego i grupami hydroksylowymi kwasu sjalowego, ponieważ te ostatnie grupy same z siebie związane są z częścią sacharydową, a także inne możliwe struktury laktonowe. Sposób postępowania przy wytwarzaniu estrów wewnętrznych podany w wyżej wspomnianych opisach patentowych, obejmuje poddanie gangliozydu w środowisku niewodnego rozpuszczalnika organicznego, w warunkach bezwodnych, działaniu środka laktonizującego. Do stosownych rozpuszczalników organicznych należy sulfotlenek dimetylowy, dimetyloformamid, sulfolan, tetrahydrofuran, dimetoksyetan, pirydyna albo mieszaniny tych rozpuszczalników. Do odpowiednich odczynników laktonizujących należą karbodiimidy rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, takie jak dicykloheksylokarbodiimid, benzyloizopropylokarbodiimid, benzyloetylokarbodiimid, sole 2-chloro-1-metylopirydyny, etoksyacetylen i odczynnik Woodwarda (N-etylo-5-fenyloizoksazolo-3'-sulfonian). W dawniejszych metodach prowadzi się reakcję między gangliozydem a kwasem octowym lub trichlorooctowym, albo z rozpuszczalnym karbodiimidem, w wodzie lub w środowisku wodnym. Wszystkie te sposoby można także stosować do wytwarzania estrów wewnętrznych nowych N-acylo-lizogangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku.

Dla dokonania estryfikacji „zewnętrznej grup karboksylowych, to znaczy estryfikacji z udziałem alkoholi powyżej wspomnianego szeregu, jest rzeczą możliwą np. poddać reakcji Nacylo-lizogangliozydy z pożądanym alkoholem, w obecności jonitu, takiego jak żywica typu Dowex 50, przy czym ograniczenie wydajności wynika zjednoczesnego tworzenia estrów wewnętrznych i długiego czasu reakcji. Inna metoda estryfikacji obejmuje przepuszczanie alkoholu przez żywicę typu Dowex-50Wx8 (100 - 200 mesh, forma H) i zadanie eluatu rozpuszczonego w tym samym alkoholu odpowiednim diazoalkanem.

165 209 φ

•Η

&	>>
•k	Tj
a	>>
1	N
o	O	1
rd	•H
>»	<—ł	rf
o	to	Φ«Η fi fi
rf	S	fi COrd-P
1	rf	Η O Φ O
	to	Φ <H O N

·Γ“3 α} ν »« α> πΓ·η •Η fi C ω fi ·η ω > ri ι—ι Ν ο > ο ο ω

OrM Ο·Η <fi rf ο . . _ Ο Ή Η Ν to fi Ν >,Ο C Ό Τ3 Ό £> ·Η >>Ό Μ<Η 34 Ο Ρ Ν C0

Ν ·>

ω >> fi >> Ν ft ο

I (β

Ν fi fi ω ftfi ω fi •η <η fi rf rf ⁵ £ X ο η ω ω >>·η > -μ Ο * Φ Ο Ο Ν rf rf ο

C

Ή ε

O	rf
24	3
•H	o
rd	TJ
to	•H
	ε
rf	rf
N	fi
rt	φ
rd	u
>»	|
O	O
rf	TJ
Φ	•rt
Tj	P.
χ.	•H
	rd
>>	O
ε	to
>>	fi
Ν	H
fi	«fi
W	CO

ο rd ο

«4 >> TJ >ϊ Ν Ο •Η ι—I tO

-Η ri

Ł0

Ο

Ν •Η

Ή

TJ

J 'Ά «fc

Φ
—d
O Ή
O	Ę	1
N	3	ri		fi
rf	PcH	>»fi		•P
>»	3 £	N fi fi Φ		o N
N	to o	p fi		rf
fi	nr
Pi Ν ·η	Φ fi		Φ
	rf	•H CO		•H
Φ	>» N	fi rf		fi	>»
•H	fi O	rf £		rf	fi
fi	£>φ	3 24	O	3	£>
rf	N -H	O	to	O	CS)
3	O ft	ι—1 Φ	Φ	^4	o
O	tO N	>ł-H	3	O	to
r—1	fi Φ	-P O	o	rd	fi
PO	Φ O	fi	<O Ή
O «Η rf	O N	•H	Ό M
rf	CO N	rf rf	ε	o	co

£0

Φ •Η ι S rf ο fi w -Ρ φ

-Ρ •Η fi Φ γ-I •Ρ Ο fi γΗ Ο ·Η

3= rf

Φ Λί 3 ·Η Ο fi

Ο Ν S ϋ rf Ό Ο Ο φ

fi fi •Η ο

γΗ >>

ο

C

N-acylo-Ν,Ν'-di-lizogangliozydy _acylowanie—N,N'-diacylo-N,N'© di-lizogangliozydy

165 209

Inna dobra metoda wytwarzania estrów obejmuje poddanie soli metalu pochodnej lizogangliozydu działaniu środka eteryfikującego. Stosuje się sole metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych, ale także i innych jakichkolwiek soli metali można użyć w tym przypadku. Możliwe jest zastosowanie, jako środka eteryfikującego, tych środków, które wspomniane są w piśmiennictwie, a zwłaszcza estrów rozmaitych kwasów nieorganicznych, lub organicznych kwasów sulfonowych, takich jak kwasy beztlenowe, to jest, innymi słowy, halogenowęglowodorów, takich jak jodek metylu lub etylu itd., albo obojętnych siarczanów lub kwasów z rodnikiem węglowodorowym, siarczynów, węglanów, krzemianów, fosforynów lub sulfonianów węglowodorów, takich jak np. benzenosulfonian lub p-toluenosulfonian metylu. Reakcję przeprowadzić można w środowisku odpowiedniego rozpuszczalnika, takiego jak alkohol, korzystnie alkohol odpowiadający grupie alkilowej, jaka ma zostać wprowadzona, ale także w środowisku rozpuszczalników niepolarnych, takich jak ketony lub etery, np. w dioksanie lub sulfotlenku dimetylowym.

Jeden szczególnie korzystny sposób estryfikacji obejmuje działanie na ester wewnętrzny pochodnej lizogangliozydu mieszaniną pożądanego alkoholu i jego odpowiedniego alkoholanu. Reakcję można prowadzić w temperaturze odpowiadającej temperaturze wrzenia alkoholu, jednakże jest także rzeczą możliwą prowadzić proces w temperaturze niższej i w tym przypadku czas reakcji będzie dłuższy.

Amidy pochodnych lizogangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku można otrzymywać metodami znanymi, a zwłaszcza jak następuje:

a/ reakcja estrów wewnętrznych pochodnych N-acylo-lizogangliozydów z amoniakiem lub aminami, b/ reakcja estrów karboksylowych pochodnych N-acylo-lizogangliozydów z amoniakiem lub aminami, c/ reakcja pochodnych N-acylo-lizogangliozydów, z aktywnymi grupami karboksylowymi, z amoniakiem lub aminami.

Reakcję a/ można przeprowadzić bezpośrednio, z udziałem rozpuszczalnika lub bez niego, za pomocą działania na ester wewnętrzny gangliozydu amoniakiem lub aminą odpowiadającą amidowi, który ma się wytworzyć. Reakcję, także można przeprowadzić w całkiem niskiej temperaturze, takiej jak temperatura od -5 do 10°C, ale korzystnie w temperaturze pokojowej lub wyższej, np. w temperaturze od 30 do 120°C. Jako rozpuszczalniki stosować można ketony, węglowodory aromatyczne, dimetyloformamid, sulfotlenek dimetylowy, dioksan lub tetrahydrofuran.

Reakcję b/ można przeprowadzić korzystnie w warunkach opisanych odnośnie do pkt. a/. Na równi z estrami opisanymi w odniesieniu do niniejszego wynalazku, możliwe jest użycie innych estrów, np. estrów utworzonych z fenolami. Dla zaktywowania grup karboksylowych w reakcji opisanej w pkt. c/, stosuje się metody dotychczas stosowane w chemii peptydów, jednakże z unikaniem sposobów, w których używa się nadmiernie kwasowych lub zasadowych środowisk, gdyż tego rodzaju warunki prowadziłyby do dezintegracji cząsteczki gangliozydu. W przypadku, gdy wyjściowe gangliozydy występują w postaci soli sodowej, celowe jest podziałanie na sól wpierw żywicą jonowymienną typu Dowex lub innym kwaśnym jonitem. I tak np., jest rzeczą możliwą prowadzić proces z wykorzystaniem kondensacji w obecności karbodiimidów, takich jak np. dicykloheksylokarbodiimid, benzyloizopropylokarbodiimid, lub benzyloetylokarbodiimid, lub w obecności 1-hydroksybenzotriazolu lub w obecności N,N'-karbonylodiimidoazolu.

Acylowanie grup hydroksylowych sacharydu, części kwasu sjalowego, i możliwie reszty ceramidu można przeprowadzić także w sposób znany, np. na drodze acylowania z udziałem halogenu lub bezwodnika kwasowego użytego do acylowania, korzystnie w obecności zasady trzeciorzędowej, takiej jak np. pirydyna lub kolidyna. Otrzymuje się w ten sposób wyżej opisane pochodne nadacylowane. Jest także rzeczą możliwą, zgodnie z definicją sposobu według wynalazku, dokonanie acylowania de-N-acetylo-lizogangliozydu i po acylowaniu odzyskanie grupy acetyloaminowej w kwasie neuraminowym. Acetylowanie można przeprowadzić sposobem znanym. W tym przypadku, wybiera się względnie łagodne metody N-acylowania, dzięki czemu grupa hydroksylowa kwasu neuraminowego pozostaje niezmieniona. Zacetylowania tej grupy, czego

165 209 dokonuje się po reakcji acylowania przy azocie sfingozyny, dokonać można z zastosowaniem metod bardziej drastycznych, a zwłaszcza z użyciem bezwodnika octowego. W końcu, dla wszystkich związków dających się wytworzyć zgodnie z wyżej opisanymi sposobami postępowania i które wykazują grupy dające sole, możliwe jest przeprowadzenie tych grup w postać soli w sposób znany, w wyniku czego otrzymuje się pożądane sole wspomnianych związków.

Wynalazek obejmuje swym zakresem także modyfikacje sposobu postępowania przy otrzymywaniu nowych pochodnych wytwarzanych sposobem według wynalazku, w których to mody!!kacjach proces przerywa się w jakimkolwiek stadium, względnie rozpoczyna się go od związku pośredniego i następnie etapy przeprowadza się potem, albo też związki wyjściowe wytwarza się in situ.

Nowe pochodne acyloclizogangliozynów nadają się do wytwarzania preparatów farmaceutycznych.

Preparaty farmaceutyczne mogą to być środki lub kompozycje do zastosowania doustnego, doodbytniczego, pozajelitowego, miejscowego lub przezskórnego. Stąd, są one w postaci stałej lub półstałej, np. w postaci pigułek, tabletek, galaretowatych kapsułek, kapsułek, czopków lub kapsułek żelatynowych miękkich. W zastosowaniu pozajelitowym możliwe jest użycie środków farmaceutycznych do podawania domięśniowego, podskórnego lub przezskórnego, względnie nadających się do infuzji lub wstrzyknięć dożylnych, a stąd możliwe jest występowanie związków czynnych jako roztworów lub zliofilizowanych proszków przeznaczonych do zmieszania z jednym lub więcej niż jednym farmaceutycznie dozwolonym rozcieńczalnikiem lub zaróbką, onpawiedc nimi do wyżej wspomnianych zastosowań, o osmalarnaści zgodnej z płynami fizjologicznymi. Do zastosowania niejonowego można wziąć pod uwagę preparaty w postaci aerozolu, takie jak aerozole ^nosowe, kremów lub maści do stosowania miejscowego względnie odpowiednio sporządzonych plastrów do podawania przezskórnego.

Środki farmaceutyczne nadają się do podawania chorym ludziom lub zwierzętom. Zawierają one, korzystnie od 0,01% do 10% wag. składnika czynnego w przypadku roztworów, aerozoli, maści i kremów, oraz od 1% do 100% wag., korzystnie od 5% do 50% wag. składnika czynnego w przypadku preparatów w postaci stałej. Stosowane dawkowanie zależy od wskazań w każdym przypadku, od pożądanego skutku i od wybranej drogi podawania.

Nowe acylo-lizogangliazyny można stosować razem zjuż znanymi i uprzednio wymienionymi. Tego rodzaju zastosowanie terapeutyczne dotyczy zwłaszcza wskazań omówionych powyżej. Dzienne dawkowanie dla człowieka drogą wstrzyknięcia (podskórnego lub domięśniowego), podskórną lub doustną, waha się od 0,05 mg do 5 mg substancji czynnej na kg wagi ciała.

Następujące przykłady objaśniają sposób wytwarzania acylo-lizogangliazydów według wynalazku.

Przykład 1.

N,N'cdic|izo GM1.

g GM1 rozpuszcza się w 200 ml 3N KOH i poddaje hydrolizie w ciągu 72 godzin w temperaturze 90°C.

Następnie roztwór ochładza się i doprowadza do pH 6,5 z użyciem kwasu chlorowodorowego. Odstawia się go na 18 godzin w temperaturze 4°C, a następnie wytrącone kwasy tłuszczowe wyodrębnia się za pomocą odsączenia. Po dializie wobec wody i zatężeniu do objętości 500 ml dokonuje się wytrącenia w 5 litrach acetonu.

Produkt suszy się i przeprowadza chromatografię wysokosprawną na żelu krzemionkowym z użyciem do elucji mieszaniny chloroform, metanolu i 5N NH3 55 : 45 : 10. Frakcje zawierające N,N'-ni-lizo GM1, suszy się, po czym ponownie rozpuszcza w wodzie. Po doprowadzeniu do pH 10 z użyciem 0,01 N NaOH, dializie i zatężeniu do 100 mg/ml, dokonuje się wytrącenia w 5 objętościach acetonu. Wydajność N,N'cdi-lizo GMi wynosi 5,7 g (70% wydajności teoretycznej).

Po chromatografii na płytce pokrytej żelem krzemionkowym z użyciem układu rozpuszczalników chloroform/metanol 5 N NH3 55 : 45 : 10, okazuje się, że otrzymany produkt jest związkiem jednolitym o Rf = 0,05 (GM1 =0,35).

Przykład 11.

165 209

N,N'-aiformylo-N,N'-ai-lizo GM1.

500 mg (0,39 mM) N,N'-di-lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml dimetyloformamidu i w temperaturze pokojowej wprowadza się 0,88 ml (6,35 mM) trietyloaminy, 190μΐ (3,17 mM) kwasu mrówkowego i 0,4 g (1,58 mM) jodku chlorometylopirydyniowego rozpuszczonego w 2,5 ml dimetyloformamidu.

Mieszaninę reakcyjną pozostawia się w celu przereagowania, na 18 godzin w temperaturze pokojowej, po czym dokonuje wytrącenia w 100 ml acetonu, sączenia i suszenia. Produkt poddaje się oczyszczaniu metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem do elucji mieszaniny chloroformu, metanolu i wody 60 : 25 i 4.

Czyste frakcje łączy się, odparowuje, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej i następnie zatęża do objętości 5 ml, po czym dokonuje się wytrącenia w ml acetonu, w wyniku czego otrzymuje się 412mg (90% wydajności teoretycznej) N,N'-difonmylo-N,N'-di-lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym z użyciem układu rozpuszczalników chloroform/metanol 0,3% CaCl2 60 : 35 : 8, wykazuje, że jest to związek jednolity o Rf = 0,27.

Przykład III.

N,N'-diacetylo-N,N'-ai Lizo GM1.

Rozpuszcza się 500 mg (0,39 mM) N,N'-di Lizo GM1 w 30 ml mieszaniny: chloroform/metanol/woda(1: 1:0,1). Do roztworu dodaje się 0,104 ml (0,75 mM) trietyloaminy i 0,2 ml (1,80 mM) bezwodnika octowego. Pozostawia się na 2 godziny w temperaturze pokojowej do przereagowania.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 25 ml acetonu.

Surowy produkt otrzymany w ten sposób (475 mg) oczyszcza się za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60: 35 : 8)jako eluenta.

Czyste frakcje łączy się, odparowuje, powtórnie rozpuszcza w 2,0 ml mieszaniny chloroform/ /metanol (1 : 1) i produkt strąca w 10ml acetonu.

Otrzymuje się 355 mg N,N'-aiacetylo-N,N'-di Lizo GM1 (85,3% wydajności teoretycznej).

Po chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako eluenta produkt okazuje się być jednolitym związkiem o Rf = 0,29.

Przykład IV.

N,N'-dipropionylo-N,N'-di Lizo GM1.

Rozpuszcza się 500 mg (0,39 mM) N,N'-di Lizo GM1 w 2,5 ml mieszaniny: dimetyloformamid/ /metanol (1:1) i dodaje się w 0°C: 0,22 ml (1,6 mM) trietyloaminy oraz 0,204 ml (1,6 mM) bezwodnika kwasu propionowego. Pozostawia się do przereagowania w temperaturze pokojowej na 168 godzin. Produkt wytrąca się w 20 objętościach octanu etylu, odfiltrowywuje się i suszy. Oczyszcza się go za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60:25:4) jako eluenta.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, a potem zatęża do 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 466 mg N,N^/-dipiΌpiocylo-N,N'-di Lizo GM1 (82% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych Oalam krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chlonofoΓm/metαcol/chlorak wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) wskazuje, że produkt jest jednolitym związkiem o Rt = 0,44.

Przykłady.

N^-dipiwaloilo-N^-di Lizo GM1.

500 mg (0,39 mM) N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml mieszaniny: dimetyloformamid/ /metanol (1:1) i dodaje do tego w 0°C 1,1 ml (7,92 mM) triaeyloaminy oraz 0,80 ml (3,96 mM) bezwodnika kwasu piwalonowego i pozostawia przez 168 godzin w temperaturze pokojowej do przereagowania. Produkt wytrąca się w 20 objętościach octanu etylu, oafiltrowywuja i suszy. Oczyszcza się go za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 25 : 4).

Czyste frakcje łączy się, odparowyw^e, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej i następnie zatęża do objętości 5 ml oraz wytrąca w 50 ml acetonu.

165 209

Otrzymuje się 436 mg N,N'-dipiwaloilo-N,N'-di Lizo GM1 (77% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,57.

Przykład VI.

N,N'-di tert-butyloacetylo-N,N'-di Lizo GM1.

500 mg (0,39 mM) N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml dimetyloformamidu i dodaje do tego w temperaturze pokojowej 0,33 ml (2,37 mM) trietyloaminy, 0,165 ml (1,18 mM) kwasu tertbutylooctowego i 0,2 g (0,79 mM) jodku chlorometylopirydyniowego rozpuszczonego w 2,5 ml dimetyloformamidu.

Mieszaninę pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania, a następnie wytrąca w 100 ml acetonu. Produkt odfiltrowywuje się i suszy. Następnie oczyszcza się go poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 25 : 4).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 289 mg N,N'-di tert-butyloacetylo-N,N'-di Lizo GM1 (50% wydajności teoret ycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) pokazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,30.

Przykład VII.

N,N'-di(2-propylopentanoilo)-N,N'-di Lizo GM1.

500 mg (0,39 mM) N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml dimetyloformamidu i dodaje się do tego w temperaturze pokojowej 0,33 ml (2,37 mM) trietyloaminy, 0,186 ml (1,18 mM) kwasu 2-propylopentanowego i 0,2 g (0,79 mM) jodku chlorometylopirydyniowego, rozpuszczonego w

2,5 ml dimetyloformamidu.

Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania i następnie wytrąca w 100 ml acetonu. Produkt odfiltrowywuje się i suszy. Następnie oczyszcza się go poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 25 : 4).

Czyste frakcje łączy się, odparowuje, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 570 mg N,N'-di(2-propylopentanoilo)-N,N'-di Lizo GM1 (95% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,32.

Przykład VIII.

N-acetylo-N,N'-di Lizo GM1.

500 mg N,N'-di Lizo GM1 (0,39 mM) rozpuszcza się w 5 ml dimetyloformamidu, do tego roztworu dodaje się powoli 145 mg (0,43 mM) 9-fluorenylo metoksykarbonylo-N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego (NFMOCS) i pozostawia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej do przereagowania.

Po zakończeniu reakcji produkt wytrąca się w 100 ml acetonu, odfiltrowywuje i suszy. Następnie oczyszcza się go poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6).

Frakcje zawierające produkt pośredni, N-FMOC-N,N'-di Lizo GM1, łączy się, suszy i ponownie rozpuszcza w 2,5 ml mieszaniny: dimetyloformamid/metanol (1:1). Dodaje się do tego, w temperaturze 0°C, 1,1 ml (7,92 mM) trietyloaminy oraz 0,40 ml (3,96 mM) trifluorooctanu metylu i pozostawia w temperaturze pokojowej na 3 dni do przereagowania.

165 209

Następnie dodaje się 1 ml piperydyny, aby usunąć grupę fluorenylową. Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania i wytrąca w 100 ml mieszaniny: aceton/ /woda (9 : 1), odfiltrowywuje i suszy.

Produkt pośredni rozpuszcza się w 30 ml mieszaniny: chloroform/metanol/woda (1:1:0,1) i dodaje do tego 0,250 ml (1,80 mM) trietyloaminy oraz 0,100 ml (0,90 mM) bezwodnika octowego. Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 2 godziny do przereagowania, suszy, ponownie rozpuszcza w 5 ml wody i doprowadza za pomocą 0,01 N NaOH do pH 9,0. Pozostawia się w temperaturze pokojowej w celu usunięcia grupy trifluoroacetylowej. Następnie dializuje się, zatęża do objętości 3 ml i wytrąca w 15 ml acetonu.

Surowy produkt otrzymany w ten sposób oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 35 : 8).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, ponownie rozpuszcza w 2,0 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 10 ml acetonu.

Otrzymuje się 243,8 mg N-acetylo-N,N'-di Lizo GMi (48% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (50:42:11) jako eluenta pokazuje produkt jako jednolity związek o Ri = 0,12 i dający pozytywny wynik próby ninhydrynowej.

Przykład IX.

N-acetyIo-N,N'-butyrylo-N,N'-di Lizo GMi.

500 mg N,N'-di Lizo GMi (0,39 mM) rozpuszcza się w 5 ml dimetyloformamidu, do roztworu dodaje się powoli 145 mg (0,43 mM) 9-fluorenylometyloksykarbonylo-N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego (NFMOCS) i pozostawia w temperaturze pokojowej na 1 godzinę do przereagowania.

Po zakończeniu reakcji produkt wytrąca się w 100 ml acetonu, odfiltrowywuje i suszy. Następnie oczyszcza się go poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6).

Frakcje zawierające produkt pośredni (N-FMOC-N,N'-di Lizo GMi) łączy się, suszy i powtórnie rozpuszcza w 2,5 ml mieszaniny: dimetyloformamid/metanol (1 : 1) i dodaje do tego, w temperaturze 0°C, 1,1 ml (7,92 mM) trietyloaminy oraz 626 mg (3,96 mM) bezwodnika kwasu masłowego.

Następnie dodaje się do tej mieszaniny reakcyjnej 1 ml piperydyny w celu usunięcia grupy fluorenylowej. Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania i wytrąca w 100 ml mieszaniny: aceton/woda (9:1), odfiltrowywuje oraz suszy.

Produkt pośredni rozpuszcza się w 30 ml mieszaniny: chloroform/metanol/woda (1:1; 0,1) i dodaje do tego 1,1 ml (7,92 mM) trietyloaminy oraz 0,373 ml (3,96 mM) bezwodnika octowego. Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 2 godziny do przereagowania, suszy, ponownie rozpuszcza w 5ml IN NazCCh i utrzymuje przez 1 godzinę w temperaturze 60°C. Dializuje się, zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 5 objętościach acetonu.

Surowy produkt reakcji oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 35 : 8).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, ponownie rozpuszcza w 2,0 ml mieszaniny: chloroform/metanol/woda (1 : 1) i wytrąca w 10 ml acetonu.

Otrzymuje się 278 mg N-acetylo-N'-butyrylo-N,N'-di Lizo GMi (52% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (50:42:11) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,32.

Przykład X.

N-acetylo-N'-lauroilo-N,N'-di Lizo GMi.

500 mg N,N'-di Lizo GMi (0,39 mM) rozpuszcza się w 5 ml dimetyloformamidu, do tego roztworu powoli dodaje się 145 mg (0,43 mM) 9-fluorenylometyloksykarbonylo-N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego (NFMOCS) i pozostawia w temperaturze pokojowej na 1 godzinę do przereagowania.

165 209

Po zakończeniu reakcji produkt wytrąca się w 100 ml acetonu, odfiltrowywuje i suszy. Następnie oczyszcza się go poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako -luenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6).

Frakcje zawierające produkt pośredni (N-FMOC-N,N'-di Lizo GMO łączy się, suszy i ponownie rozpuszcza w 2,5 ml mieszaniny: dimetyloformamid/metanol (1 : 1). Dodaje się do tego w temperaturze 0°C1,1 ml (7,92 mM) trietyloaminy oraz 1,51 g (3,96 mM) bezwodnika kwasu laurynowego i pozostawia w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania.

Do tej mieszaniny r-akcyjz-j dodaje się następnie 1 ml pip-rydyzy w celu usunięcia grupy fluorenylowej. Pozostawia sięw temperaturze pokojowej na 18 godzin do przer-agowazia i wytrąca w 100 ml mieszaniny; aceton/woda (9 : 1), odfiltrowywuje i suszy.

Produkt pośredni rozpuszcza się w 30 ml mieszaniny: chloroform/metazoL/woda (1: 1:0),1) i dodaje do tego 1,1 ml (7,92 mM) trietyloaminy oraz 0,373 ml (3,96 mM) bezwodnika octowego. Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 2 godziny do przer-agowazia, suszy, ponownie rozpuszcza w 5 ml 1N NazCOe i utrzymuje w temperaturze 60°C przez 1 godzinę. Dializuje się, zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 5 objętościach acetonu.

Surowy produkt reakcji oczyszcza się za pomocą chromatografii na ż-lu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 35 : 8).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, ponowni- rozpuszcza w 2,0 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1:1) i wytrąca w 10 ml acetonu.

Otrzymuje się 295 mg N-acetylo-N'-lauroilo-N,N'-di Lizo GM1 (51% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (50 : 42 : 11) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rt = 0,55.

Przykład XI.

N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1.

g (6,37 mM) GM1 rozpuszcza się w 200 ml 3N KOH i hydrolizuje przez 72 godziny w temperaturze 90°C.

Następnie roztwór chłodzi się i doprowadza przy pomocy kwasu solnego do pH 6,5. Pozostawia się go w temperaturze 4°C na 18 godziz do odstania, a następnie wytrącone kwasy tłuszczowe usuwa się poprzez filtrację. Dializuje się wobec wody i zatęża do 500 ml oraz wytrąca w 5 litrach acetonu. ·

Produkt suszy się próżniowo, a następnie rozpuszcza ponownie w 100 ml dimetyloformamidu.

Następnie dodaje się do tego powoli 2,15 g (6,37 mM) 9-fluorenylometyloksykarbonylo-Nhydroksyimidu kwasu bursztynowego rozpuszczonego w 20 ml tetrahydrofuranu i pozostawia w temperaturze pokojowej za 1 godzinę do przereagowania. Następnie dodaje się 3 ml (31,85 mM) bezwodnika octowego i 0,09 ml (6,37 mM) trietyloaminy.

mizut później dodaje się 12,5 ml piperydyny w celu usunięcia grupy zabezpieczającej. Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania, a następnie wytrąca w 2 litrach acetonu i suszy. Otrzymany w ten sposób materiał rozpuszcza się w 1N NazCOe i utrzymuje w temperaturze 60°C przez 1 godzinę. Dializuje się, zatęża do 100 mg/ml i wytrąca w 5 objętościach acetonu.

Produkt przepuszcza się przez kolumnę wypełnioną S-Sepharosą (w formie H⁺) równowagowaną metanolem. Eluuje się metanolem, otrzymując w ten sposób N-acetylo-N,N-pochodną Lizo GM1, wymywając ją za pomocą NH 4 Cl o stężeniu 10 mM w metanolu. Frakcje zawierające produkt suszy się, a następnie rozpuszcza ponownie w wodzie. Doprowadza się do pH 10 za pomocą 0,01N NaOH i dializuje, zatęża do 100 mg/ml oraz wytrąca w 5 objętościach acetonu. N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1, którą otrzymuje się w ten sposób, wynosi 5g (60% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/amoniak 5 N roztwór wodny (55:45 : 10) jako eluenta, pokazuje, że produkt jest jednolity o Rt = 0,11.

Przykład XII.

N'-nronionylo-N,N'-di Lizo GMó

165 209

500 mg N,N'-di Lizo GM1 (0,39 mM) rozpuszcza się w 5 ml dimetyloformamidu, do tego roztworu dodaje się powoli 145 mg (0,43 mM) 9-fluorenylometyloksykarbonylo-N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego, rozpuszczone w 2 ml tetrahydrofuranu i pozostawia w temperaturze pokojowej na 1 godzinę do przereagowania.

Po reakcji dodaje się 253,7 mg (1,95 mM) bezwodnika kwasu n-propionowego oraz 0,0545 ml (0,39 mM) trietyloaminy.

minut później dodaje się 2 ml piperydyny w celu usunięcia grupy zabezpieczającej. Pozostawia się na 18 godzin w temperaturze pokojowej do przereagowania i wytrąca w 100 ml acetonu.

Surowy produkt reakcji oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chloroform/metanol/amoniak 2,5 N roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako eluenta. Frakcje zawierające czysty produkt suszy się, a następnie rozpuszcza ponownie w 5 ml wody. Doprowadza się do pH 10 za pomocą 0,01 N NaOH i dializuje, zatęża do 5 ml i wytrąca w 5 ml acetonu.

Otrzymuje się 310 mg N'-propionylo-N,N'-di Lizo GM1 (60,4% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (50:42:11) jako eluenta, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,27, dający pozytywną próbę ninhydynową.

Przykład XIII.

N-formylo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,38 mM) N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml dimetyloformamidu i dodaje się do tego w temperaturze pokojowej 1,056 ml (7,6 mM) trietyloaminy, 0,237 ml (3,8 mM) kwasu mrówkowego i 194,2 mg (0,76 mM) jodku chlorometylopirydyniowego rozpuszczone w

2,5 ml dimetyloformamidu.

Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania, a następnie wytrąca w 100 ml acetonu. Odfiltrowywuje się i suszy. Następnie produkt oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 391 mg N-formylo-N'-acetylo-di Lizo GM1 (75% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako eluenta, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,27.

Przykład XIV.

N-propionylo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,38 mM) N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 5 ml mieszaniny: dimetyloformamid/metanol (1:1) i dodaje do tego w temperaturze 0°C: 0,422 ml (3,04 mM) trietyloaminy oraz0,196ml (1,52mM) bezwodnika kwasu propionowego i pozostawia w temperaturze pokojowej na 72 godziny do przereagowania. Wytrąca się w 20 objętościach octanu etylu, odfiltrowywuje i suszy.

Następnie produkt oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 35 : 8) jako eluenta.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 522 mg N-propionylo-N'-acetylo-di Lizo GM1 (70,0% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako eluenta, pokazuje, że produkt jest jednolity o Rf = 0,31.

Przykład XV.

N-butyrylo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,38 mM) N-N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 5 ml mieszaniny: dimetyloformamid/metanol (1:1) i dodaje do tego w temperaturze 0°C: 0.422 ml (3,04 mM) trietyloaminy oraz 0,249 ml (1,52 mM) bezwodnika kwasu masłowego. Pozostawia się w temperaturze pokojowej

165 209 25 na 72 godziny do przereagowania. Wytrąca się w 20 objętościach octanu etylu, odfiltrowywuje i suszy.

Produkt oczyszcza się następnie poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 35 : 8).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1 N NazCOe, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 527 mg (68,0% wydajności teoretycznej) N-butyiylo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako eluenta, pokazuje, że produkt jest jednolity o Rf = 0,32.

Przykład XVI.

N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,38 mM) N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 5 ml mieszaniny: dimetyloformamid/metanol (1 : 1) i dodaje do tego w temperaturze 0°C: 0,528 ml (3,8 mM) trietyloaminy oraz 0,780 ml (3,8 mM) bezwodnika kwasu piwalonowego i pozostawia w temperaturze pokojowej na 72 godziny do przereagowania. Wytrąca się w 20 objętościach octanu etylu, odfiltrowywuje i suszy.

Następnie produkt oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 35 : 8).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1 N NazCOe, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 490 ml N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GMi (94,0% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,2% roztwór wodny (50 : 42 : 11) jako eluenta pokazuje, że produkt jest jednolity o Rf = 0,34.

Przykład XVII.

N-heksanoilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,38 mM) N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml dimetyloformamidu i dodaje się do tego w temperaturze pokojowej 0,316 ml (2,28 mM) trietyloaminy, 0,143 ml (1,14 mM) kwasu heksanowego i 194,2 mg (0,76 mM) jodku chlorometylopirydyniowego rozpuszczone w 2,5 ml dimetyloformamidu.

Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania, a następnie wytrąca w 100 ml acetonu. Odfiltrowywuje się i suszy. Następnie produkt oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1 N NaaCOe, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętści 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 392 mg N-heksanoilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 (73% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako eluenta ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,33.

Przykład XVIII.

N-(2-propyIopentanoilo)-N'-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,38 mM) N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml dimetyloformamidu i dodaje do tego w temperaturze pokojowej: 1.056 ml (7,6 mM) trietyloaminy, 0,595 ml (3,8 mM) kwasu 2-propylopentanowego i 194,2 mg (0,76 mM) jodku chlorometylopirydyniowego rozpuszczone w 2,5 ml dimetyloformamidu.

Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania, a następnie wytrąca w 100 ml acetonu. Odfiltrowywuje się i suszy. Z kolei produkt oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6) jako eluenta.

165 209

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 428 mg N-^-propylopentanonoj-N-acetylo-di Lizo GM1 (75% wydajność teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chloreż wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,35.

Przykład XIX.

N-oktanoHo-W-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,38 mM) N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml dimetyloformamidu i dodaje do tego w temperaturze pokojowej: 0,316ml (2,28 mM) trietyloaminy, 0,181 ml (l,14mM) kwasu oktanowego i 194,2 mg (0,76 mM) jodku chlonometylopiryayniowego rozpuszczone w

2,5 ml dimetyloformamidu.

Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania, a następnie wytrąca w 100 ml acetonu. Oafilenowywuje się i suszy. Produkt jest następnie oczyszczany poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym przy użyciu jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1N Na2CO3 dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 427 mg N-oktanoilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 (78,0% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,34.

Przykład XX.

N-laurono-W-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,38 mM) N'-acetylo-N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 2,5 ml dimetyloformamidu i dodaje do tego w temperaturze pokojowej: 0,316ml (2,28mM) trietyloaminy, 152mg (1,14mM) kwasu laurynowego i 194,2 mg (0,76 mM) jodku chlonometylopiryayniowego rozpuszczone w

2,5 ml dimetyloformamidu.

Pozostawia się w temperaturze pokojowej na 18 godzin do przereagowania, a następnie wytrąca w 100 ml acetonu. Oafiltrowywuje się i suszy. Następnie produkt oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6).

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, a następnie zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 50 ml acetonu.

Otrzymuje się 353 mg N-lauroilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 (62% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,37.

Przykład XXI.

N-dekadnlo-W-acetylo-di Lizo GM1.

500 mg (0,39 mM) N,N'-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 5 ml dimetyloformamidu i dodaje do tego 1ml odczynnika Triton X 100 oraz 0,104 ml (0,75 mM) trietyloaminy. Miesza się aż do uzyskania klarownego roztworu. Następnie dodaje się do tego 25 ml tetrahydrofuracu, zawierającego 380 mg (1,5 mM) N-sukcynimidylowej pochodnej kwasu aeżanowego, otrzymanej w reakcji prowadzonej w temperaturze pokojowej przez 18 godzin pomiędzy kwasem dekanowym, rozpuszczonym w w 15 ml bezwodnego taerahydrofuranu, a 742 mg (2,9 mM) węglanu N-sukcynimidylowego i 0,550 ml (4,39 mM) trietyloaminy w 40 ml acetonu. Do reakcji używa się 500 mg (2,9 mM) kwasu aażanowego.

Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym roztwór jest zatężony do objętości 5 ml. Produkt wytrąca się w 100 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako el^nta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6).

165 209

Czyste frakcje łączy się, odparowyw^je, ponownie rozpuszcza w 2 ml mieszaniny: chloroform/ /metanol (1 : 1), a następnie nadaja do tego 0,0735 ml (0,78 mM) bezwodnika octowego oraz 0,108 ml (0,78 mM) trietyloaminy. Pozostawia się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny do przereagowania i następnie wytrąca w 100 ml acetonu. Następnie produkt oczyszcza się poprzez kolejną chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/ /metanol/woda (60: 35 : 8). Czyste frakcje łączy się, odparowyw^e, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymuje się 184 mg NcnekanailacN'-acetylacdi Lizo GM1 (32% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chlorofarm/metanal/chlarak wapnia 0,3% roztwór wodny (60: 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,34.

Przykład XX11.

Ncmirystoilo-N'-acatylacni Lizo GM1.

500 mg (0,39 mM) N,N'cni Lizo GM1 rozpuszcza się w 5 ml dimetyloformamidu i dodaje do tego l ml odczynnika Triton X 100 oraz 0,104 ml (0,75 mM) trietyloaminy. Miesza się aż do uzyskania klarownego roztworu. Następnie dodaje się do tego 25 ml tetrahydrofuranu, zawierającego 380 mg (1,5 mM) N-sukcyniminylawej pochodnej kwasu mirystynowaga, otrzymanej w reakcji prowadzonej w temperaturze pokojowej przez 18 godzin pomiędzy 500 mg (2,2 mM) kwasu mirystynowego w 15 ml bezwodnego tetrahydrofuranu, a 742 mg (2,9 mM) węglanu N-sukcynimidylawago i 0,550 ml (4,39 mM) trietyloaminy w 40 ml acetonu.

Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym roztwór zatęża się do objętości 5 ml i wytrąca w 100 ml acetonu.

Surowy produkt otrzymany w ten sposób oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 30 : 6) jako eluenta.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje oraz rozpuszcza ponownie w 2 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1: 1), a następnie dodaje do tego 0,0735 ml (0,78 mM) bezwodnika octowego oraz 0,108 ml (0,78 mM) triatylaaminy. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie mieszaninę reakcyjną wytrąca się w 100 ml acetonu. Następnie produkt oczyszcza się poprzez kolejną chromatografię na żelu krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 35 : 8) jako eluenta. Czyste frakcje łączy się, odparowyw^je, zadaje 1 N Na2CO3, dializuje wobec wody destylowanej, zatęża do objętości 5 ml i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymuje się 210 mg N-mirystailacN'cacetylo-ni Lizo GM1 (35% wydajności teoretycznej). Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,38.

Przykład XX111.

Naturalny Nl-diza GM1.

500 mg (0,31 mM)GM1 rozpuszcza się w 50 ml 1NNaOH. Mieszaninę reakcyjną utrzymuje się następnie w temperaturze 90°C przez 18 godzin. Otrzymany w ten sposób roztwór dializuje się, zatęża do objętości 2,5 ml i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się poprzez chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chlarofarm/matanal/wada (60 : 30 : 6) jako eluenta.

Czyste frakcje łączy się, odparowywaje, ponownie rozpuszcz w 2,5 ml mieszaniny: chlorofarm/matanal (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymuje się 350 mg naturalnego Nlclizo GM1 (72% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlarak wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) pokazuje produkt o Rf = 0,20.

Zawartoś kwasów tłuszczowych, związanych z azotem sfingozyny poprzez wiązanie amidowe, przedstawia się, jak następuje: 95% kwasu stearynowego, 4% kwasu olejowego, 0,5% kwasu palmitynowego, 0,5% innych kwasów tłuszczowych. Oznaczenia dokonano za pomocą chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych, uzyskanych poprzez estryfikację produktu hydrolizy naturalnego N'-liza GM1.

Przykład XX1V.

165 209

Naturalny N'-mirystoilo-N'-lizo GM1.

500 mg (0,33 mM) naturalnego N'-lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/ /metanol (1 : 1) i do tego roztworu dodaje się 0,5 ml buforu octowego pH 5,7,80 mM oraz 750 mg (1,7 mM) bezwodnika kwasu mirystynowego.

Reakcję kondensacji prowadzi się w temperaturze 25°C przez 18 godzin przy ciągłym mieszaniu.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny chloroform/metanol/woda (60 : 20 : 3) jako rozpuszczalnika.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, ponownie rozpuszcza w 5 ml mieszaniny: chloroform/ /metanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymuje się 500 mg naturalnego N'-mirystoilo-N'-lizo GM1 (87,8% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60:35:8) pokazuje produkt charakteryzujący się Rf = 0,53.

Przykład XXV.

Naturalny N'-palmitoilo-N'-lizo GM1.

500 mg (0,33 mM) naturalnego N'-lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny: chloroform/ /metanol (1: 1) i dodaje się do tego roztworu 0,5 ml buforu octanowego pH 5,7,80 mM oraz 900 mg (1,82 mM) bezwodnika kwasu palmitynowego. Reakcję kondensacji prowadzi się w temperaturze 25°C przez 18 godzin przy ciągłym mieszaniu.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu.

Surowy produkt otrzymany w ten sposób oczyszcza się poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 20 : 3) jako rozpuszczalnika.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje i ponownie rozpuszcza w 5 ml mieszaniny chloroform/ /metanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 100 ml acetonu. Otrzymuje się 520 mg naturalnego N'palmitoilo-N'-lizo GM1 (89,9% wydajności teoretycznej). Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika ukazuje produkt mający Rf = 0,55.

Przykład XXVI.

Naturalny N'-stearoilo-N'-lizo GM1.

500 mg (0,33 mM) naturalnego N'-lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny: chloroform/ /metanol (1 : 1) i dodaje do tego roztworu 0,5 ml buforu octanowego pH 5,7, 80 mM oraz 100 mg (1,81 mM) bezwodnika kwasu stearynowego rozpuszczone w 20 ml tetrahydrofuranu.

Reakcję kondensacji prowadzi się w temperaturze 25°C przez 18 godzin przy ciągłym mieszaniu.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 20 : 3) jako rozpuszczalnika.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje i ponownie rozpuszcza w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 100 ml acetonu. Otrzymuje się 525 mg (83,4% wydajności teoretycznej) naturalnego N'-stearoilo-N'-lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika ukazuje produkt mający Rf = 0,57.

165 209

Przykład XXVII.

Naturalny N'-piwaloilo-N'-lizo GM1.

500 mg (0,33 mM) naturalnego N'-lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny: chloroform/ /metanol (1:1) i dodaje się do tego roztworu 0,75 ml (0,54 mM) trietyloaminy oraz 0,75 ml (6,75 mM) bezwodnika kwasu piwalonowego.

Reakcję kondensacji prowadzi się w temperaturze 25°C przez 18 godzin przy ciągłym mieszaniu.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu. Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 20 : 3) jako rozpuszczalnika.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje i ponownie rozpuszcza w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymuje się 440 mg naturalnego N'-piwaloilo-N'-lizo GM1 (83,3% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt mający Rf = 0,52.

Przykład XXVIII.

Naturalny N'-propionylo-N'-lizo GM1.

500 mg (0,33 mM) naturalnego N'-lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny: chloroform/ /metanol (1 : 1) i dodaje do tego roztworu 0,5 ml buforu octanowego pH 5,7, 50 mM oraz 0,25 ml (1,95 mM) bezwodnika kwasu propionowego.

Reakcję kondensacji prowadzi się w temperaturze 25°C przez 18 godzin przy ciągłym mieszaniu.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się za pomocą preparatywnej chromatografii na żelu krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60: 20: 3) jako rozpuszczalnika.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje i ponownie rozpuszcza w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 100 ml acetonu. Otrzymuje się 430 mg (82,8% wydajności teoretycznej) naturalnego N'-propionylo-N'-lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika ukazuje produkt mający Rf = 0,45.

Przykład XXIX.

Naturalny N'-butyrylo-N'-lizo GM1.

500 mg (0,33 mM) naturalnego N'-lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny: chloroform/ /metanol (1 : 1) i dodaje do tego roztworu 0,5 ml buforu octowego pH 5,7, 50 mM oraz 0,25 mg (1,53 mM) bezwodnika kwasu n-masłowego.

Reakcję kondensacji prowadzi się w temperaturze 25°C przez 18 godzin przy ciągłym mieszaniu.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 20 : 3) jako rozpuszczalnika.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje i ponownie rozpuszcza w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymuje się 450 mg naturalnego N'-butyrylo-N'-lizo GM1 (85,9% wydajności teoretycznej).

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt mający Rf = 0,51.

165 209

Przykład XXX.

Naturalny N'-izobutyrylo-N'-lizo GM1.

500 mg (0,33 mM) naturalnego N'-lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny: chloroform./ /metanol (1 : 1) i dodaje do tego roztworu 0,5 ml buforu octowego pH 5,7, 50 mM oraz 0,25 mg (1,51 mM) bezwodnika kwasu izomasłowego.

Reakcję kondensacji prowadzi się w temperaturze 25°C przez 18 godzin przy ciągłym mieszaniu.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 20 : 3) jako rozpuszczalnika.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje i ponownie rozpuszcza w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymuje się 450 mg (85,9% wydajności teoretycznej) naturalnego N'-izobutyrylo-N'-lizo GM1. Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika ukazuje produkt mający Rf = 0,49.

Przykład XXXI.

Naturalny N'-lauroilo-N'-Iizo GM1.

500 mg (0,33 mM) naturalnego N'-lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny: chloroform./ /metanol (1 : 1) i dodaje do tego roztworu 0,5 ml buforu octowego pH 5,7, 50 mM oraz 600 mg (1057 mM) bezwodnika kwasu laurynowego. Reakcję kondensacji prowadzi się w temperaturze 25°C przez 18 godzin przy ciągłym mieszaniu.

Po zakończeniu reakcji produkt suszy się, gromadzi w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt oczyszcza się poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 20 : 3) jako rozpuszczalnika.

Czyste frakcje łączy się, odparowywuje, ponownie rozpuszcza w 5 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 100 ml acetonu.

Otrzymuje się 495 mg naturalnego N'-lauroilo-N'-lizo GMi (88,4% wydajności teoretycznej). Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform./ metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60: 35: 8) ukazuje produkt mający Rf = 0,51.

Przykład XXXII.

Ester wewnętrzny N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

g (3,1 mM) N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml N-metylopirolidonu i dodaje do tego 0,95 g (3,72 mM) jodku 2-chloro-1-metylopirydyniowego oraz 0,52 ml (3,72 mM) trietyloaminy przy ciągłym mieszaniu.

Reakcję prowadzi się przez 18 godzin w temperaturze 4°C, po czym roztwór filtruje się i wytrąca w 500 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (4,7 g) gromadzi się w 25 ml mieszaniny : chloroform/ /izopropanol (1 : 1), filtruje, wytrąca w 125 ml acetonu i suszy próżniowo.

Otrzymuje się 4,5 g (91,2% wydajności teoretycznej) estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'acetylo-di Lizo GM1.

Po chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy zastosowaniu mieszaniny: chloroform/metanol/kwas octowy (30 : 40 : 20) jako rozpuszczalnika, produkt okazuje się być jednolitym związkiem o Rf = 0,42. Działanie 0,1 N Na2CO3 w temperaturze 60°C przez 1 godzinę powoduje hydrolizę wiązania estrowego i ponownie otrzymuje się wyjściowy gangliozyd.

Widmo w podczerwieni estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1, wykonane przy użyciu pastylki z KBr, ukazuje typową absorpcję wiązania estrowego przy 1750 cm^d.

Przykład XXXIII.

Ester etylowy N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

165 209

5g (3,18 mM) estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 200 ml bezwodnej mieszaniny: chlorek metylenu/etanol (2 : 1). Dodaje się do tego 184 mg (3,18 mM) etanolanu sodowego rozpuszczone w 50 ml bezwodnego etanolu i mieszaninę pozostawia na 2 godziny pod reflużsem (tj.: w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną-przyp. tłum.).

Po zakończeniu reakcji mieszaninę zobojętnia się za pomocą bezwodnej żywicy Dowex AG 50 X 8, w formie H+, żywicę oddziela się poprzez filtrację i przemywa mieszaniną: etanol/chlorek metylenu (1 : 1), a roztwór następnie suszy się. Pozostałość gromadzi się w 50 ml mieszaniny: chlorek metylenu/etanol (1 : 1), a produkt wytrąca za pomocą 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (4,9 g) oczyszcza się poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym firmy Merck, przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/ /izopropanol/węglan amonu 2% roztwór wodny (1140 : 620 :180 :140). Czyste frakcje łączy się, bdpαnowywuja do suchości i ponownie rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1:1), a produkt wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,3 g (83,7% wydajności teoretycznej) estru etylowego N-piwaloilo-N'-acetylodi Lizo GM1. Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60: 35:8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,49. Działanie 0,1 N Na2CC>3 w temperaturze 60°C przez 1 godzinę powoduje hydrolizę wiązania estrowego i otrzymuje się ponownie wyjściowy gangliozyd.

Widmo w podczerwieni estru etylowego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1, wykonane przy użyciu pastylki z KBr, ukazuje typową absorpcję przy 1750 cm’\

Przykład XXXIV.

Ester izopropylowy N^walono^-acetylo-di Lizo GM1.

5g (3,18 mM) estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'-acaeylo-ai Lizo GM1 rozpuszcza się w 200 ml bezwodnej mieszaniny: chlorek metyli^^^./izopropanol (2 : 1). Do roztworu dodaje się 261 mg (3,18 mM) izopropanolanu sodowego rozpuszczone w 50 ml bezwodnego izopropanolu i pozostawia mieszaninę pod refluksem na 2 godziny.

Po zakończeniu reakcji mieszaninę zobojętnia się za pomocą bezwodnej żywicy Dowex AG 50 X 8 w formie H+, żywicę oddziela się poprzez filtrację i przemywa mieszaniną: izopropanol/ /chlorek metylenu (1:1), a następnie suszy roztwór. Pozostałość gromadzi się w 50 ml mieszaniny: chlorek matylenu/izopropacol (1 : 1), a produkt wytrąca przy pomocy 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (4,9 g) oczyszcza się poprzez średniociśnieniową preparatywną chromatografię (12 atm) na żelu krzemionkowym firmy Merck, przy użyciu jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/izopropanol/węglan amonu 2% roztwór wodny (1140 : : 620 : 180 : 140). Czyste frakcje łączy się, odparowywuje do suchości i ponownie rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt wytrąca przy pomocy 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,2 g (81,0% wydajności teoretycznej) estru izopropylowego N-piwaloilo-N'acetylo-di Lizo GM1. Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu jako rozpuszczalnika mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,52. Działanie 0,1 N Na2CO3 w temperaturze 60°C przez 1 godzinę powoduje hydrolizę wiązania estrowego i ponownie otrzymuje się wyjściowy gangliozyd. Widmo w podczerwieni estru izopropylowego N^walono-W-acetylo-di Lizo GM1, wykonane przy użyciu pastylki z KBr, ukazuje typową absorpcję przy 1750cm1.

Przykład XXXV.

Ester tert-butylowy N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

5g (3,18 mM) estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 200 ml bezwodnej mieszaniny: chlorek metylenu/tert-butanol. Do roztworu dodaje się 305 mg (3,18 mM) tart-butanolanu sodowego rozpuszczone w 50 ml bezwodnego tert-butanolu i pozostawia mieszaninę pod raflużsam na 2 godziny.

Po zakończeniu reakcji mieszaninę zobojętnia się za pomocą bezwodnej żywicy Dowex AG 50X8 w formie H+, żywicę oddziela się poprzez filtrację i przemywa mieszaniną: tert32

165 209 butanol/chlorek metylenu (1 : 1), a następnie suszy roztwór. Pozostałość gromadzi się w 50 ml mieszaniny: chlorek metylenu/tert-butanol (1:1), a produkt wytrąca przy pomocy 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (4,9 g) oczyszcza się poprzez średniociśnieniową chromatografię preparatywną (12 atm) na żelu krzemionkowym firmy Merck, używając jako rozpuszczalnika mieszaniny: chlorofoΓm/metanoi/iropropanol/wgglan amonu 2% roztwór wodny (1140 : 620 : 180 : 140). Czyste frakcje łączy się, odparowywuje do suchości i ponownie rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1:1), a produkt wytrąca przy pomocy 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,1 g (78,4% wydajności teoretycznej) estru tert-butylowego N-piwaloilo-N'acetylo-di Lizo GM1. Po chromatografii za płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chioroform/metazoi/chiorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, produkt okazuje się być jednolitym związkiem o Rt = 0,52. Działanie 0,1 N Na2C03 w temperaturze 60°C przez 1 godzinę powoduje hydrolizę wiązania estrowego i ponownie otrzymuje się wyjściowy gangliozyd.

Widmo w podczerwieni estru tert-butylowego N^walono-W-acetylo-di Lizo GM1, wykonane przy użyciu pastylki z KBr, ukazuje typową absorpcję przy 1750 cm¹.

Przykład XXXVI.

Ester benzylowy N-piwaLoϊlo-N'acetylOdϊ Lizo GM1.

5g (3,14 mM) soli potasowej N-piwaloilo-N^acetylo-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i do roztworu dodaje się 1,58 g (12,5 mM) chlorku benzylu oraz 2,08 g (12,5 mM) KI. Pozostawia się w temperaturze 25°C w atmosferze azotu na 24 godziny do przereagowania.

Po zakończeniu reakcji roztwór równowaguje się za pomocą mieszaniny: z-butazol/woda (2 : 1) w celu wyellminowania DMSO i soli. Roztwór butanolowy odparowywuje się, gromadzi pozostałość w 50 ml mi-szazizy: chloroform/alkohol benzylowy (1: 1), a produkt reakcji wytrąca przy pomocy 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (5,3 g) oczyszcza się poprzez preparaty wzą chromatografię na żelu krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/woda (65 : 32 : 7) jako rozpuszczalnika. Czyste frakcje łączy się, odparowywuje i ponownie rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/izopropanol (1 : 1), a produkt wytrąca w 75 ml ac-tozu.

Otrzymuje się 4,8 g (91,0% w/ydajności teoretycznej) estru benzylowego N-piwaloilo-N'acetylo-di Lizo GM1. Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metazol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt jako jednolity związek o Ri = 0,65. Działanie 0,1 N Na2CO3 w temperaturze 60°C przez 1 godzinę powoduje hydrolizę wiązania estrowego i ponownie otrzymuje się wyjściowy gangliozyd.

Widmo w podczerwieni estru benzylowego N-piwaloilo-N^acetylo-di Lizo GM1 wykonane przy użyciu pastylki KBr, ukazuje typową absorpcję przy 1750 cm^, a spektroskopia w nadfiolecie przy użyciu absolutnego alkoholu etylowego pokazuje obecność trzech maksimów przy 250, 255 oraz 261 nm.

Przykład XXXVII.

Amid N-piwaloilo-N^acetylo-di Lizo GM1.

Przygotowuje się zawiesinę 5 g (3,18 mM) estru w-wnętrzz-go N-piwaloilo-N^acetylo-di Lizo GM1 w 100 ml bezwodnego izopropanolu. Zawiesinę miesza się w niskiej temperaturze (-5°C) i barbokuje poprzez nią suchy amoniak przez 3 godziny przy zachowaniu bezwodnych warunków. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik usuwa się przez odparowanie, pozostałość gromadzi się w 50 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt reakcji wytrąca przy pomocy 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (4,8 g) zadaje się 100 ml 1% roztworu wodnego Na2CO3 i przez 30 minut w temperaturze 25°C poddaje się hydrolizie pozostałe grupy estrowe, dializuje wobec wody, suszy próżniowo, a następnie oczyszcza poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako pierwszego eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60:40: 9), a jako drugiego eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (55 : 45: 10).

165 209 33

Czyste frakcje, wymyte i połączone, odparowywuje się i rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a amid wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,6 g (91,1% wydajności teoretycznej) amidu N-piwaloiIo-N'-acetylo-di Lizo GM\. Po chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, produkt okazuje się być jednolitym związkiem o Rf = 0,20. Widmo w podczerwieni nie wykazuje już typowego pasma estrowego przy 1750 cm'1

Przykład XXXVIII.

Etyloamid N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

Przygotowuje się zawiesinę 5 g (3,18 mM) estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 w 100 ml bezwodnego izopropanolu. Zawiesinę miesza się w niskiej temperaturze (-5°C) i barbotuje się przez nią suchą etyloaminę przez 3 godziny przy zachowaniu bezwodnych warunków. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik usuwa się przez odparowanie, a pozostałość gromadzi w 50 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), i produkt reakcji wytrąca przy pomocy 250 ml acetonu.

Otrzymuje się w ten sposób 4,9 g surowego produktu, który zadaje się 100 ml roztworu wodnego Na2CO3 i przez 30 minut w temperaturze 25°C prowadzi się hydrolizę pozostałych grup estrowych, dializuje wobec wody, suszy próżniowo, a następnie oczyszcza poprzez preparatywną chromatografię przy użyciu jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/woda (30 : 60 : 8). Połączone frakcje objęte odparowywuje się, rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a amid wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,7 g (91,5% wydajności teoretycznej)etyloamidu N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1. Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60: 35 : 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,46. Widmo w podczerwieni nie wykazuje już typowego pasma estrowego przy 1750 cm1.

Przykład XXXIX.

Izopropyloamid N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

g(3,18 mM) estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 25 ml bezwodnej izopropyloaminy i roztwór miesza się przez 24 godziny w 25°C przy zachowaniu bezwodnych warunków.

Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik usuwa się poprzez odparowanie, a pozostałość gromadzi w 50 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca produkt reakcji za pomocą 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (4,8 g) zadaje się 100 ml 1% roztworu wodnego Na2CO3 w temperaturze 25°C przez 30 minut w celu hydrolizy pozostałych grup estrowych, dializuje w wodzie, suszy próżniowo, a następnie oczyszcza poprzez preparatywną chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym, używając jako eluenta mieszaniny: chloroform/metanol/ /woda roztwór amoniaku o stężeniu * * * (60 : 40 : 9). Czyste frakcje, wymyte i połączone, odparowywuje się, a produkt wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,2 g (81,1% wydajności teoretycznej) izopropyloamidu N-piwaloilo-N'acetylo-di Lizo GMi. Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rt = 0,66. Widmo w podczerwieni nie wykazuje już typowego pasma estrowego przy 1750 cm'\

Przykład XL.

2-butyloamid N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GMi.

g (3,18 mM) estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 25 ml bezwodnej pirydyny i do roztworu dodaje 12,5 ml 2-butyloaminy, a roztwór miesza przez 24 godziny w temperaturze 25°C przy zapewnieniu bezwodnych warunków.

Po zakończeniu reakcji usuwa się rozpuszczalnik poprzez odparowanie, a pozostałość gromadzi w 50 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca produkt reakcji za pomocą 250 ml acetonu.

165 209

Otrzymany w ten sposób surowy produkt zadaje się 100 ml 1% wodnego roztworu Na2CO3 i przez 30 minut w temperaturze 25°C prowadzi się hydrolizę resztkowych grup estrowych, dializuje w wodzie, suszy pod próżnią, a następnie oczyszcza poprzez preparatywną chromatografię na żelu krzemionkowym, używając jako rozpuszczalnika mieszaniny: chloroform/metanol/woda (110:40 : 9). Wymywa się czyste frakcje, łączy, odparowywuje, rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a amid wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,7 g (88,1% wydajności teoretycznej) 2-butyloamidu N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1. Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60:35: 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,50. Widmo w podczerwieni nie wykazuje już typowego pasma estrowego przy 1750 cm1.

Przykład XLI.

Dimetyloaminoetyloamid N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

g (3,18 mM) estru wewnętrznego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml bezwodnej mieszaniny: chloroform/izopropanol (1 : 1), po czym dodaje się 599 mg (6,36 mM) dimetyloaminoetyloaminy. Roztwór miesza się w temperaturze 25°C przez 24 godziny przy zapewnieniu bezwodnych warunków. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik usuwa się przez odparowanie, a pozostałość gromadzi w 50 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1) i wytrąca produkt reakcji za pomocą 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (5,2g) zadaje się 100 ml 1% roztworu Na2CO3 i prowadzi przez 30 minut w temperaturze 25°C hydrolizę resztkowych grup estrowych, dializuje w wodzie, suszy próżniowo, a następnie oczyszcza * * *, używając jako pierwszego rozpuszczalnika mieszaniny: chloroform/metanol/amoniak 2,5 N roztwór wodny (60 : 40 : 9) i jako drugiego rozpuszczalnika mieszaniny: chlorofo rm/metanol/woda (60: 40:9). Czyste, wymyte frakcje łączy się, odparowywuje, rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1: 1), a amid wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,9 g (92,9% wydajności teoretycznej) dimetyloaminoetyloamidu N-piwaloiloN'-acetyIo-di Lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chloroform/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) ukazuje produkt jako jednolity związek mający Rf = 0,14.

Widmo w podczerwieni nie wykazuje już typowego pasma estrowego przy 1750 cm\

Przykład XLII.

Dimetyloamid N-piwaloilo-N'-acctylo-di Lizo GM1.

g (3,18 mM) estru wtwnętrznęgo N-piwaloilo-Nilacetylo-di Lizo GMi rozpuszcza sic za 25 ml dietyloaminy. Roztwór miesza się w niskiej temperaturze (-^C) przez 24 godziny przy zapewnieniu bezwodnych warunków. Po zakończeniu reakcji usuwa się rozpuszczalnik poprzez odparowanie, a pozostałość gromadzi w 50 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1:1) i wytrąca produkt reakcji za pomocą 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (5,1 g) zadaje się 100 ml 1% wodnego roztworu Na2CO3 i przez 30 minut w temperaturze 25°C prowadzi hydrolizę resztkowych grup estrowych, dializuje w wodzie, suszy próżniowo, a następnie oczyszcza * * *, używając jako pierwszego rozpuszczalnika mieszaniny: chloroform/metanol/amoniak 2,5 N roztwór wodny (60:40:9) i jako drugiego rozpuszczalnika mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 40 : 9). Czyste, wymyte frakcje łączy się, adpαromymuje, rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a amid wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,7 g (90,0% wydajności t-or-tyczn-j) dietyloamidu NcpiwaloilacN'-acetylo-di Lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chlorafarm/m-tanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rt = 0,50. Widmo w podczerwieni nie wykazuje już typowego pasma estrowego przy 1750 cm^.

165 209

Przykład XL111.

Etano^am^ N-piwaloila-N'-acatylacdi Lizo GM1.

g (3,18 mM) estru wewnętrznego Ncpiwalailo-Nlcacetylacni Lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml bezwodnej mieszaniny: chlarofarm/izaprapanal (1 : 1) i dodaje do tego roztworu 388 mg (6,36 mM) etanoloaminy, ciągle mieszając w temperaturze 25°C przy zachowaniu bezwodnych warunków.

Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik usuwa się przez odparowanie, a pozostałość gromadzi w 50 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt reakcji wytrąca za pomocą 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (5,1 g) zadaje się 100 ml 1% roztworu wodnego Na2C03 i przez 30 minut w temperaturze 25°C prowadzi hydrolizę resztkowych grup estrowych, dializuje w wodzie, suszy próżniowo, a następnie oczyszcza, używając mieszaniny: chloroform/metanol/amoniak 2,5 N roztwór wodny (60 : 40 : 9) jako pierwszego rozpuszczalnika, a mieszaniny: chloroform/metanol/woda (60 : 40 : 9) jako drugiego rozpuszczalnika. Czyste, wymyte frakcje łączy się, odparowywuje, rozpuszcza w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a amid wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,8 g (82,5% wydajności teoretycznej) etaloamidu NcpiwaloilacN'-acetyla-ni Lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chlorafarm/matanol/chlarak wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,49. Widmo w podczerwieni nie wykazuje już typowego pasma estrowego przy 1750 ^¹.

Przykład XL1V.

Benzyloamid N-piwalailocN'cacetylo-di Lizo GM1.

g (3,18 mM. metru wewnęerznęgo N-pi waloilo-N'-acetcioadi oto) GM. rozpuozcza sic w 20 m 1 bezwodnej pirydyny i dodaje do roztworu 374 mg (3,50 mM) benzyloaminy, a uzyskany roztwór miesza w temperaturze 25°C przez 24 godziny przy zachowaniu bezwodnych warunków. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik usuwa się poprzez odparowanie, pozostałość gromadzi w 50 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1 : 1), a produkt reakcji wytrąca za pomocą 250 ml acetonu.

Otrzymany w ten sposób surowy produkt (5,1 g) zadaje się 100 ml 1% wodnego roztworu Na2CO3 i przez 30 minut w temperaturze 25°C prowadzi hydrolizę resztkowych grup estrowych, dializuje w wodzie, suszy próżniowo, a następnie oczyszcza poprzez preparatyką chromatografię przy użyciu nośnika: Sephadex DEAE A25, w formie octanowej, używając mieszaniny: chloroform/matanal/mΌda (30 : 60 : 8) jako eluenta. Połączone obojętne frakcje odparawywwja się, rozpuszcza się w 15 ml mieszaniny: chloroform/metanol (1: 1), a amid wytrąca za pomocą 75 ml acetonu.

Otrzymuje się 4,6 g (78,8% wydajności teoretycznej) banzylaamidu N-piwalailocN'-acetylo-di Lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chlorotorm/metanol/chlorek wapnia 0,3% roztwór wodny (60 : 35 : 8) jako rozpuszczalnika, ukazuje produkt jako jednolity związek o Rf = 0,69. Widmo w podczerwieni nie wykazuje już typowego pasma estrowego przy 1750 ^¹.

Przykład XLV.

Peracetylamy pochodna estru etylowego NcpiwaloilocN'-acetylocni Lizo GM1.

5g (3,09 mM) estru etylowego NcpimaloilacN'cacetylocni Lizo GM1 rozpuszcza się w 50 ml bezwodnej pirydyny i dodaje do roztworu, w temperaturze 25°C, 25 ml świeżo destylowanego bewadnika octowego. Roztwór trzyma się, ciągle mieszając, w temperaturze pokojowej przez 72 godziny. Po zakończeniu reakcji roztwór suszy się próżniowo, a pozostałość rozdziela pomiędzy 100 ml lodowatej wody, a 200 ml octanuetylu. Następnie przemywa się octan etylu zimnym 0,1 M kwasem solnym, wodą i 0,1 M roztworem NaHCO3. Fazy organiczne odwadnia się następnie siarczanem sodowym, suszy próżniowo, a pozostałość oczyszcza poprzez ^paryt^ną chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny: dichlorometan/octan etylu/

165 209 /izopropanol (70 : 30 : 45) jako etaema. Czyste frakcje łączy się, odparowywuje i ponownie rozpuszcza w 20 ml eteru etylowego oraz wytrąca w 100 ml heksanu.

Otrzymuje się 4,5 g (63,2% wydajności teoretycznej) penaceeylowej pochodnej estru etylowego N-piwaloilo-N'-acetylo-di Lizo GM1.

Chromatografia na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny: chlorotorm/octan etylu/metanol (70: 30:10), jak również mieszaniny: octan etylu/izopropanol (95:5) jako rozpuszczalników, ukazuje produkt jako jednolity związek mający Rf = 0,49 i odpowiednio Rf = 0,28.

Przykład XLVI.

Wytwarzanie mieszaniny gangliozydów (GA) poprzez ekstrakcję wołowej tkanki mózgowej.

Wołową tkankę mózgową, pozyskaną ze zwierzęcia, homogenizuje się w buforze fosforanowym przy pH 6,8. Następnie dodaje się 6 objętości tetramyarofunacu i oawinowywuja uzyskaną mieszaninę. Górną warstwę ekstrahuje się dwa razy tetrahydrofurαcem. Po odwirowaniu składniki ^polarne usuwa się poprzez ekstrakcję eterem etylowym, a fazę woaco-tetrahyanofuranową wprowadza na kolumnę jonowymienną, równowagowaną za pomocą 50% etanolu. Wodorotlenek baru i cztery objętości lodowato zimnego etanolu dodaje się do wycisku z kolumny. Po 18godzinnym ziębieniu gromadzi się osad, który następnie lekko zakwasza się kwasem solnym rozpuszczonym w wodzie. Otrzymany w ten sposób roztwór dialkiluje się i liofilizuje. Wydajność na tym etapie wynosi około 0,6 mg surowej mieszaniny gangliozydów na gram użytej tkanki nerwowej. Proszek po liofilizacji aesperguje się w 20 objętościach mieszaniny: chloroform/metanol (2 : 1), uzyskany roztwór filtruje aż do uzyskania całkowitej przejrzystości, a następnie równowaguje, dodając 0,2 objętości 0,88% wodnego roztworu chlorku potasu.

Oddziela się górną warstwę, dializuje oraz liofilizuje. Końcowa wydajność wynosi około 0,3 mg oczyszczonej mieszaniny soli gangliozydów na gram tkanki mózgowej.

Otrzymana mieszanina gangliozydów może być w różnych udziałach dzielona na frakcje, reprezentujące zasadniczo czyste gangliozydy (w znaczeniu użytym w opisie ogólnym), używając kolumn z kwasem krzemowym i mieszanin: metanol-chloroform jako eluenta. Przeciętnie, uzyskano następujący skład: 40% gangliozydu GDLa, 21% hangliozydu GMt, 19% gangliozydu GT1b oraz gangliozydu GD 1b : 16%.

HOOCIIIIII	kwas sjalowy	IIIIIIOH IIIIIIOH	III I OH
hooc iiiiii	Ó Ó	4 OH OH	cerami d
		£ £	es 0 L — j

oligosacharyd

WZÓR 1

WZÓR 2 ch₉-oI ^z

CH - NH - acyl I

CH - OH I

CH %H (ĆH₂)_n-CH₃ WZÓR 3 ch₂- 0CH-NH-acyl

CH-OH

I

CH₂ \

ch₂ (CH₂)_n -CH₃

WZÓR 4

— ceramid

WZÓR 5

Gal (1*3)GalNAC fi

4)Gal(1-»4)Glc(1-*1)

NA NA

Ceramid

WZÓR 6

Gal (1 * 3) GalNAC (1*4 )Gal (1 -4 )Glc (1*1) Ceramid ł

NA NA ł

NANA

WZÓR 7

Gal (1-*3)GatNAC (1 *4 )Gal (1*4 )Glc (1*1) Ceramid 3

NANA ł

NANA WZÓR 8

Gal (1 *3)GalNAC(1 *4)Gal(1 *4)Gic (1*1) Ceramid

NANA ł

NANA

NANA

WZÓR 9

Wstępne działanie DADL przez 15min. przed działaniem 50LM glutaminianu

T próba koątrolna DADL ^m'ⁿ)

100

N N © -o

Eo cn y -<x a 50 ·— υ °

Μ ^υ 8 nr fr

10 20 30 40 50 uM DADL FIG.2A

Równoczesne działanie DADL i 50uM T glutaminianu (15 min.) 100; próba kontrolna £? N co o

-a s £

N S dZ fr 0

20 30 40 50 uM DADL

FIG. 2B

FIG.1

(O

XI £

o.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (41)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania półsyntetycznych pochodnych N,N'-dilizogangliozydów GMi, zawierających resztę sfingozyny i resztę kwasu neuraminowego, w których N oznacza atom azotu w reszcie sfingozyny, a N' oznacza atom azotu w reszcie kwasu neuraminowego, które obejmują N-acylo-N,N'-dilizogangliozydy, w których grupa acylowa przy azocie N pochodzi od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1do 11 atomach węgla, N'-acylo-N,N'-dilizogangliozydy i N,N'diacylo-N,N'-dilizogangliozydy, w których grupy acylowe przy N i N' pochodzą od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1do 24 atomach węgla, a w przypadku diacylowych pochodnych, w których grupą N'-acylową jest grupa acetylowa, druga grupa acylowa pochodzi tylko od niepodstawionych kwasów alifatycznych o 1do 11 atomach węgla oraz ich estrów i/lub amidów karboksylowych grup sjalowych i/lub estrów wewnętrznych i/lub pochodnych nadacylowanych oraz soli metali, soli z zasadami organicznymi lub addycyjnych soli z kwasami i mieszanin takich związków, z wyłączeniem N,N'-diacetylo-N,N'-dilizo GMi, znamienny tym, że acyluje się N,N'-dilizogangliozyd, N-acylo-dilizogangliozyd lub N'-acylo-dilizogangliozyd lub ich mieszaniny funkcyjną pochodną kwasu, który odpowiada produktowi końcowemu lub odacylowuje się odpowiedni N,N'-diacylo-N,N'-dilizogangliozyd lub ich mieszaniny takich związków, selektywnie przy azocie sfingozyny lub przy azocie neuraminowym i ewentualnie wytworzone związki przeprowadza się w estry, amidy lub estry wewnętrzne lub nadacylowane pochodne i ewentualnie otrzymane związki przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalne sole.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję acylowania prowadzi się za pomocą jednej z następujących pochodnych kwasu: bezwodnik kwasowy i trietyloamina, sam bezwodnik kwasowy, N-sukcynoimidylowa pochodna kwasu w bezwodnym zetrahydrofuranie i ester otrzymany przez reakcję soli kwasu z jodkiem l-metylo-2-chloropirydyniowym.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się łagodne acylowanie, gdy jako związek wyjściowy stosuje się N,N'-dilizogangliozyd.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odacylowanie N,N'-diacylo-N,N'-dilizogangliozydu na azocie neuraminowym przeprowadza się przez chemiczną hydrolizę rozcieńczonym roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces przerywa się na dowolnym etapie lub zaczyna się od etapu przejściowego, po czym prowadzi się dalsze etapy.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że N,N'-dilizogangliozyd, N-acylo-dilizogangliozyd lub N'-acylo-dilizogangliozyd poddaje się reakcji z funkcyjną pochodną nasyconego kwasu o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu, zawierającego 1 do 11 atomów węgla.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w reakcji acylowania stosuje się funkcyjną pochodną kwasu wybranego z grupy obejmującej kwas mrówkowy, octowy, propionowy, masłowy, walerianowy, kapronowy, izokapronowy, enantowy, kaprylowy, pelargonowy, kaprynowy, undecylenowy, tert-butylooctowy i 2-propylowalerianowy.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że N,N'-dilizogangliozyd, N-acylo-dilizogangliozyd lub N'-acylo-N,N'-dilizogangliozyd poddaje się reakcji z funkcyjną pochodną nienasyconego kwasu zawierającego 1 do 11 atomów węgla.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że N,N'-dilizogangliozyd, N-acylo-dilizogangliozyd lub N'-acylo-dilizogangliozyd poddaje się reakcji z funkcyjną pochodną kwasu o prostym łańcuchu zawierającego 1 do 24 atomów węgla.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się funkcyjną pochodną kwasu zawierającego 12 do 16 atomów węgla.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się funkcyjną pochodną kwasu wybranego z grupy obejmującej kwas laurynowy, mirystynowy, palmitynowy, oleinowy, elaidynowy i stearynowy.

    165 209
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że acylowanie prowadzi się za pomocą pochodnych kwasów o rozgałęzionych łańcuchach, w których boczne łańcuchy stanowią grupy alkilowe o najwyżej 4 atomach węgla.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania estrów karboksylowych grup kwasów sjalowych acylo-lizogangliozydów, acylo-lizogangliozydy poddaje się reakcji estryfikacji, w której wprowadza się grupy pochodzące od alkoholi alifatycznych zawierających najwyżej 12 atomów węgla, alkoholi aralifatycznych z najwyżej 4 atomami węgla w części alifatycznej i jednym pojedynczym pierścieniem benzenowym ewentualnie podstawionym 1-3 niższymi grupami alkilowymi zawierającymi 1 do 4 atomów węgla, od alkoholi alicyklicznych lub alifatyczno-alicyklicznych z jednym pojedynczym pierścieniem cykloalifatycznym i najwyżej 14 atomami węgla lub od alkoholi heterocyklicznych zawierających najwyżej 12 atomów węgla i jeden pierścień heterocykliczny z heteroatomem wybranym spośród N, O i S.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że acylo-lizogangliozydy poddaje się reakcji estryfikacji, w której wprowadza się grupy pochodzące od alkoholi podstawionych grupami funkcyjnymi wybranymi spośród grup hydroksylowych, aminowych lub alkoksylowych zawierających najwyżej 4 atomy węgla w części alkilowej, grup alkilo- lub dialkiloaminowych z najwyżej 4 atomami węgla w części alkilowej.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że acylo-lizogangliozydy poddaje się estryfikacji, w której wprowadza się grupy pochodzące od alkoholi alifatycznych zawierających najwyżej 6 atomów węgla.
16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania amidów karboksylowych grup sjalowych acylo-lizogangliozydy poddaje się reakcji z aminami zawierającymi najwyżej 12 atomów węgla.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że w reakcji amidowania stosuje się podstawione aminy alifatyczne z grupami węglowodorowymi zawierającymi najwyżej 12 atomów węgla i ewentualnie przerwanymi heteroatomami wybranymi spośród N, O i S lub podstawionymi grupami funkcyjnymi wybranymi spośród grup hydroksylowej, aminowej lub merkaptanowej.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że w reakcji amidowania stosuje się aminy alifatyczne podstawione grupami alkilowymi zawierającymi najwyżej 6 atomów węgla lub grupami alkilenowymi o 3 do 6 atomach węgla i ewentualnie przerwanymi heteroatomami wybranymi z grupy N, O i S lub podstawionymi grupami funkcyjnymi wybranymi spośród grup hydroksylowej, aminowej lub merkaptanowej.
19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że w reakcji amidowania stosuje się aminy podstawione grupami alkilowymi o najwyżej 4 atomach węgla lub grupami aralkilowymi zawierającymi najwyżej 4 atomy węgla i pierścień benzenowy ewentualnie podstawiony 1 do 3 niższymi grupami alkilowymi, hydroksylowymi lub alkoksylowymi lub jednym lub więcej niż jednym atomem chlorowca.
20. 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania estrów wewnętrznych diacylo-lizogangliozydów poddaje się laktonizacji grupy karboksylowe kwasów sjalowych z grupami hydroksylowymi części cukrowej w cząsteczce.
21. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że poddaje się laktonizacji grupy karboksylowe kwasów sjalowych z grupami hydroksylowymi kwasów sjalowych w cząsteczce.
22. 22. Sposób według zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że poddaje się reakcji środek laktonizujący z acylo-lizogangliozydem w niewodnym rozpuszczalniku organicznym, w bezwodnych warunkach.
23. 23. Sposób według zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że poddaje się reakcji kwas octowy lub trichlorooctowy lub karbodiimid rozpuszczalny w wodzie lub w wodnym środowisku z acylo-lizogangliozydem.
24. 24. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania nadacylowanych pochodnych diacylo-lizogangliozydów, wytwarzane diacylo-lizogangliozydy acyluje się resztą kwasu alifatycznego zawierającego najwyżej 6 atomów węgla.

    165 209
25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że diacylo-lizogangliozydy acyluje się resztą kwasu mrówkowego, octowego, propionowego, masłowego, Walerianowego, kapronowego lub kaprynowego.
26. 26. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że diacylo-lizogangliozydy acyluje się resztą hydrokwasów, aminokwasów lub kwasów dwuzasadowych.
27. 27. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że diacylo-lizogangliozydy acyluje się resztą kwasów aromatycznych z jednym pierścieniem benzenowym, ewentualnie podstawionymi grupami hydroksylowymi, aminowymi lub karboksylowymi.
28. 28. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N,N'-diformyloN,N'-dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z solą kwasu mrówkowego i jodkiem 1 -metylo-2-chloropirydyniowym.
29. 29. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N,N'-di-tertbutyloacetylo-N,N'-dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z solą kwasu tert-butylooctowego i jodkiem l-metylo-2-chloropirymidyniowym.
30. 30. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N,N'-di-(2propylopentanoiIo)-N,N'-dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z solą kwasu 2propylopentanowego i jodkiem 1-metylo-2-chloropirydyniowym.
31. 31. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N,N'-diacetyloN,N'-dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z bezwodnikiem kwasu octowego trietyloaminą.
32. 32. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N,N'-dipropionyloN,N'-dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z bezwodnikiem kwasu propionowego i trietyloaminą.
33. 33. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N,N'-dipiwaloiloN,N'-dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z bezwodnikiem kwasu piwalinowego i trietyloaminą.
34. 34. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N-acetylo-N,N'dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z 9-fluorenylo-metyloksykarbonylo-N-hydroksysukcynoimidem, wytworzony produkt z chronionym azotem N poddaje się reakcji z trifluorooctanem metylu i trietyloaminą z produktu, w którym oba atomy azotu N i N' są zabezpieczone usuwa się grupą ochronną przy atomie azotu N i poddaje się reakcji z bezwodnikiem octowym i trietyloaminą i usuwa się grupę ochronną przy atomie azotu N'.
35. 35. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N'-acetylo-N,N'dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z 9-fluoΓenyio-metyioksykarbonyio-N-hydroksysukcynoimidem, produkt z zabezpieczonym atomem azotu N poddaje się reakcji z bezwodnikiem octowym i trietyloaminą i z wytworzonego związku usuwa się grupę ochronną przy atomie azotu N.
36. 36. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N'-propionyloN,N'-dilizo GM1, N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z 9-fluorenylo-metyloksykarbonylo-Nhydroksysukcynoimidem, produkt z zabezpieczonym atomem azotu N poddaje się reakcji z bezwodnikiem propionowym i trietyloaminą i z wytworzonego związku usuwa się grupę ochronną przy atomie azotu N.
37. 37. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania nadacylowanej pochodnej estru etylowego N-piwaloilo-N'-acetylo-N,N'-dnizo GM1, ester etylowy N-piwaloiloN'-acetylo-N,N'-dilizo GM1 poddaje się reakcji z bezwodnikiem octowym.
38. 38. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że acylo-lizogangliozydy z co najmniej jedną grupą kwasową w cząsteczce przekształca się w farmaceutycznie dopuszczalne sole z metalami.
39. 39. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że acylo-lizogangliozydy z co najmniej jedną grupą kwasową w cząsteczce przekształca się w sole potasowe, amonowe, wapniowe, magnezowe lub glinowe.
40. 40. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że acylo-lizogangliozydy z co najmniej jedną grupą kwasową w cząsteczce poddaje się reakcji z farmaceutycznie dopuszczalnymi zasadami organicznymi.

    165 209
41. 41. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że acylo-di-lizogangliozydy zawierające co najmniej jedną grupę zasadową w cząsteczce poddaje się reakcji z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami.