PL163983B1 - Środek bakteriobójczy - Google Patents

Abstract

1. Środek bakteriobójczy zawierający bakteriocyne i substancje pomocnicze, znamienny tym, że zawiera bakteriocynę zawierającą lantioninę w stężeniu między 0,1 gg/ml i 300 gg/ml i czynnik chelatujący w stężeniu między 0,1 mM i 20 mM.

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek bakteriobójczy o rozszerzonym zakresie działania zawierający baktkrlocyaę zawierającą lantioninę.

Nizyna, jedna z baktkrlocyn, jest polipeptydem o własnościach przeciwdziałania drobnoustrojom, które są w przyrodzie wytwarzane przez różne szczepy bakteryjne Stokptacoccus lactis. Jest raaar jako substancja konserwująca żywność, która hamuje wzrost sporów pewnych szczepów Bacilli Gram-dodatnich.

Chociaż czasami mylnie i niedokładnie nazywana antybiotykiem, mzyna jest poprawnie zakwalifikowana jako baktkrlocyπa, czyli substancja białkowa wytwarzana przez bakterie, która ma aktywność poreclwbaktkryjną wyłącznie w stosunku do szczepów ściśle pokrewnych szczepom z jakich pochodzi. Nizy-na jest występującą w przyrodzie, naturalną substancją zabezpieczającą, znajdującą się w małym stężeniu w mleku i serze, a jak się uważa, całkowicie nieszkodliwą i nie wywołującą uczuleń u ludzi.

Nizynę określono w badaniach FDA jako bezpieczną substancję, która może być stosowana do takich produktów żywnościowych, jak pasteryzowany ser do smarowania, pasteryzowany, przetwarzany ser do smarowania i pasteryzowane, ewentualnie przetwarzane sery do smarowania z dodatkiem owoców, jarzyn lub mięsa. Ponadto, ponieważ mzyna jest poilpepSydem, wszelkie jej resztki pozostające w produktach żywnościowych, zostają szybko strawione.

163 983

Podsumowanie właściwości nizyny ukazało się w pracy A. Hurst, Advances in Applied Microbiology 27:85-123 (1981). Publikacja ta obejmuje wszystko, co wiadomo ogólnie o nizynie. Nizyna wytwarzana przez Streptococcus lactis, jest dostępna w handlu jako zanieczyszczony preparat Nisaplin, który produkuje firma Aplin and Barrett Ltd., Dorset, Wielka 8rytania, i może być otrzymana przez wyodrębnienie występującej w przyrodzie nizyny z hodowli Streptococcus lactis a następnie zatężenie nizyny znanymi metodami. Również znane są liczne metody wytwarzania nizyny z użyciem zmienionych szczepów Streptococcus (patrz opis patentowy St. Zjedn Ameryki nr 4 7(6 ((5). Można również wytwarzać nizynę stosując technologię rekombinantów DNA.

Nizynę stosowano skutecznie jako substancję zabezpieczającą w produktach mlecznych, takich jak przetwarzany ser, śmietana i mleko. Stasowanie nizyny w produktach typu przetwarzanych serów było przedmiotem opisów patentowych St. Zjedn. Ameryki nr nr 4 584 (11 i 4 517 172. Stosowanie nizyny do hamowania wzrostu pewnych bakterii Gram-dodatnich zostało dobrze udokumentowane. jednak całkowity sukces i pełna akceptacja jako środka zabezpieczającego do żywności jest, jak dotąd utrudniona, gdyż uważano, że nizyna jest nieskuteczna wobec bakterii Gramujemnych i wielu bakteriom Gram-dodatnim. Bakterie Gram-ujemne są prawie zawsze obecne w połączeniu z bakteriami Gram-dodatnimi i są podstawowym źródłem psucia się i zanieczyszczenia żywności (patrz opisy patentowe nr nr 5 584 (11 i 4 517 172, Tsau and Sandine, Conjugal Transfer of Nisin Plasmid Genes from Streptococcus Lactis 7162 to Leuconostoc Dextranicum i8i, Applied and Environmental Microbiolggy',' luty (187, str. 352, A Natural Preservative, Food Engineering Int'l, maj (184, str. 37-38; Focus on Nisin, Food Manufacture, marzec (187, str. 63.

Stwierdzono, że w przeciwieństwie do wcześniejszej wiedzy,.środki zawierające nizynę w połączeniu z różnymi czynnikami niebakteriobójczymi mają lepszą i o szerszym zakresie aktywność bakteriobójczą przeciw bakteriom Gram-ujemnym, jak również lepszą aktywność przeciw szerszej gamie bakterii Gram-dodatnich niż sama nizyna. Większa aktywność bakteriobójcza wobec bakterii gram dodatnich występuje w szerszym zakresie pH niż podawano dotychczas.

Przedmiotem wynalazku jest środek bakteriobójczy zawierający bakteriocynę zawierającą lantioninę w stężeniu między 0,( pg/ml i 300 pg/ml i czynnik chelatujący w stężeniu między 0,( mM i 20 mM. środek według wynalazku może ponadto zawierać środek powierzchniowo czynny w stężeniu między 0,0(% i (,0%. Zgodnie z wynalazkiem, środki takie rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednim nośniku dają substancję bakteriobójczą o lepszym i szerszym działaniu.

Stwierdzono więc, że roztwór około 0,( pg/ml do 300 pg/ml bakteriocyny w obecności około 0,( mM do 20 mM czynnika chelatującego na przykład kwasu etyOenodwuαminltetrαoctowegl (EDTA) faktycznie usuwa wzrost bakterii Gram-ujemnych, takich jak Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomones aeruginosa, 8acterilides gingivalis, Actinobacillus actinomycetescomitans i Klebsiella pneumoniae, a jest bardziej aktywny wobec bakterii Gram-dodatnich, takich jak Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria mlnlcgtogenes, Streptococcus agalactiae o bakteria Ceryneform, niż sama nizyna. Chociaż wzrost aktywności nizyny wywołanej chelatorem zależy od stężenia, to wbrew oczekiwaniom, stężenia EDTA przekraczające 20 mM inhibitowały aktywność bakteriobójczą nizyny'. Jednak w obecności białkoplchodnego nośnika i wielowartościowych polimerów, takich jak albumina surowicy krwi, kalogen, żelatyna, kazeina i keratyna, inhibitlwanie nizyny wywołane stężeniami EDTA ponad 20 mM było znacznie obniżone, rozszerzając wskutek tego zakres użyteczności środka zawierającego nizynę, ulepszanego dodatkiem EDTA.

Stwierdzono, że roztwór 0,( pg/ml do 300 pg/ml nizyny i 0,( mM do 20 mM czynnika chelatującego będzie miał dodatkowo poprawioną skuteczność nizyny przeciw bakteriom Gram-ujemnym i Gram-dodatnim w obecności 0,0(% do (,0% środka powierzchniowo czynnego. Stwierdzono ponadto, że w obecności samego środka powierzchniowo czynnego, nizyna ma zwiększoną aktywność przeciw bakteriom Gram-dodatnim.

Odpowiednimi czynnikami cheOatującymi wchodzącymi w skład środka według wynalazku są następujące związki: EDTA, CaEDTA, CaNa2E0TA i inne tetraoctany aOkilodoaminy, EGTA i cytrynian, środkami powierzchniowo czynnymi, odpowiednimi jako składniki kombinacji z nizyną i z dodatkiem albo bez dodatku EDTA są następujące substancje: niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak Tweeny, Tritonyl i glicerydy, jonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak kwasy tłuszczowe, związki czwartorzędowe, anionowe środki powierzchniowo czynne, takie jak dedecylosulfonian sodu i amfoteryczne środki powierzchniowo czynne, takie jak klkamldlprlpyOobetaina i emulgatory.

163 983

Ponieważ bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie prawie zawsze znajdują się równocześnie w żywności, skuteczność środka zawierającego nizynę przeciw bakteriom Gram-ujemnym, takim jak Salmonella typhimurium, Escherichia Coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gingivalis, Actinobacillus actinomycetescomintans i przeciw innym patogenom Gramujemnym i bakteriom Gram-dodatnim będzie wysoce użyteczna, środki bakteriobójcze są szczególnie przydatne do ograniczania i zapobiegania zanieczyszczeniom surowych składników, przetwarzanej żywności i napojów przez bakteryjne czynniki chorobotwórcze i inne drobnoustroje powodujące psucie. Potencjalna użyteczność w odniesieniu do żywności obejmuje obróbkę mięsa, zwłaszcza drobiu, jaj, sera i ryb oraz stosowanie przy pakowaniu i obsłudze urządzeń używanych przy posługiwaniu się żywnością. Dalsze zastosowanie środka według wynalazku obejmuje zabezpieczanie żywności, takiej jak przetwarzane sery, kremy, mleko i produkty mleczne, mycie drobiu, ryb, mięsa i jarzyn i wyposażenia mleczarni. Zastosowanie środka zawierającego nizynę nie powinno być ograniczane do zastosowań związanych z produktami żywnościowymi, bowiem mogą być użyteczne w dowolnych sytuacjach, gdy zdarza się konieczność lub potrzeba wyeliminowania bakterii gram ujemnych i gram dodatnich.

środek może być rozpuszczalny w odpowiednim nośniku, na przykład w roztworze wodnym lub buforowym albo może być zawieszany w dowolnej, odpowiedniej, ciekłej koloidalnej lub polimerycznej zaróbce w celu otrzymania preparatu bakteriobójczego. Taki środek lub preparat bakteriobójczy można stosować do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych, wycierania lub przemywania. Preparaty bakteriobójcze mogą być używane do czyszczenia narzędzi chirurgicznych, wyposażania gabinetów chirurgicznych i podobnych. Preparaty bakteriobójcze są szczególnie użyteczne w takich okolicznościach, gdy wymagana jest dezynfekcja środowiska, ale używanie chemicznych środków dezynfekcyjnych jest zabronione ze względu na groźbę korozji lub działanie toksyczne pozostałości po tych środkach.

Inaczej niż w przypadku środków dezynfekcyjnych- o szerokim zakresie działania,, których aktywność ogranicza obecność kompleksowej materii organicznej, preparaty środka według wynalazku są skuteczne bakteriobójczo również w obecności materii organicznej, takiej jak mleko lub surowica krwi.

Nizyna była znana jako substancja optymalizująca inhibitowanie wzrostu pewnej ilości pokrewnych bakterii Gram-dodatnich, zwłaszcza przeciw niektórym gram dodatnim sporom tworzącym bakterie przy pH 5,0. Aktywność nizyny w roztworze z czynnikiem chelatującym jest niespodziewanie przyspieszona i poprawiona wobec wielu bakterii gram dodatnich przy wartościach pH większych niż 5,0, a ponadto jest zwiększona wobec bakterii Gram-ujemnych , zarówno przy kwaśnym, jak i zasadowym pH, w zakresie pH 5,0 do 8,0. Ta nieoczekiwanie przyspieszona i rozszerzona aktywność bakteriobójcza aktywowanej dodatkiem chelatora nizyny czyni są przydatną do stosowania, między innymi, jako środka dezynfekcyjnego.

Nizyna należy do klasy bakteriocyn peptydowych zawierających lantioninę. W klasie tej są zawarte również subtilina, epidermina, cynamycyna, duramycyna, ankowenina i Pep 5. Wszystkie te peptydy bakteriocynowe są produkowane przez różne drobnoustroje. Jednak subtilina otrzymywana z pewnych hodowli Bacillus subtilis i epidermina otrzymywana z pewnych hodowli Staphylococcus epidermidis mają, jak stwierdzono, bardzo pooobną uudowę cząsteczkową do uudowy nizyny (patrz Hurst, str. 85-36 i Schnell i in., Naturę, 333:276-278). Dlatego też uważa się, Ze ze względu na podobieństwa budowy cząsteczkowej, inne baktenocyny białkowe zawierające lantioninę będą w równym stopniu skuteczne jak nizyna w połączeniu z czynnikami chalatującymi i ewentualnie z niejonowymi środkami powierzchniowo czynnymi w eliminowaniu zanieczyszczeń bakteryjnych gram ujemnych i gram dodatnich.

Skuteczność nizyny, a rozszerzając ten zakres i innych białkowych bakterioc^-n zawierających lantioninę, jako środków bakteriobójczych przeciw bakteriom Gram-ujemnym Jest zaskakująca, gdyż ze stanu techniki aktywność taka nie wynikała. Wzrost aktywności nizyny wobec bakterii Gram-dodatnich w obecności EDTA przy pH wyższym niż 5,0 est t ntpectznlwana, poniewaZ Pstychczas uważano, ze optymalna jest aktywność nizyny przy pH 5,0. Ponadto, odkrycie takiej aktywności nizyny i bakterioc^-n białkowych zawierających lantioninę zaspakaja od dawna odczuwaną potrzebę występującą w dziedzinie zabezpieczania żywności, a wynikającą z braku skutecznego, naturalnego, nieszkodliwego środka aktywnego przeciw szerokiej gamie bakterii.

163 983

W celu wykazania doskonałej i nieoczekiwanie szybkiej aktywności środka zawierającego nizynę, jak również inne bakteriocyny oraz EDTA lub inne chelatory i ewentualnie różne substancje powierzchniowo czynne przeciw bakteriom zarówno gram ujemnym jak i Gram-dodatnim przeprowadzono wiele doświadczeń z tymi preparatami bakteriobójczymi. Doświadczenia te są ilustracją, a przy tym wykazują, że można oczekiwać skuteczności substytutów nizyny, czyli bakteriocyn białkowych zawierających lantioninę, a ponadto, że substytuty EDTA jako środka chelatującego będą również skuteczne.

Wszystkie badania przeprowadzane w następujących przykładach wykonywano w temperaturze 37°C. Skuteczność poprawy zakresu bakteriobójczości wyznaczano przez oceną aktywności bakteriobójczej mierzoną procentem bakterii, które przeżyły traktowanie środkiem bakteriobójczym. Zwykle, po inkubowaniu zawiesiny 10? komórek/ml badanych szczepów z nowym środkiem bakteriobójczym przez określony czas, bakterie oddzielono przez wirowanie w ciągu 2 minut. Płytki bakteryjne przemywano w celu uwolnienia ich od preparatu badanego środka bakteriobójczego oczyszczającym buforem, oznaczanym tu jako Phage (50 mM Tris-HCl, pH 7,8 1 mM MgSO^, A mM CaC^, 0,1 M NaCl i 0,1% żelatyny), zawieszano ponownie i kolejno rozcieńczano buforem Phage, po czym 100 ml porcje zawiesiny bakteryjnej nanoszono na płytki z pożywką agarową. Stopień przeżycia bakterii oznaczono przez obliczenie jednostek tworzących kolonie (cfu) po inkubacji w ciągu 24 - 48 godzin w temperaturze 37°C. Skuteczność środka według wynalazku umożliwia przeżycie mniej niż 0,1% początkowej liczby żywych bakterii.

Przykład i. Aktywność nizyny i czynnika chelatującego wobec bakterii Gram-ujemnych (S. typhimurium).

Jak przedstawiono w tabeli 1, przeprowadzono dwa badania w warunkach 20 mM Tris,-pH 8-0, temperatura 37 ’C skuteczności środka bakteriobójczego zawierającego nizynę i jako czynnik chelatujący sam EDTA. Badanie kontrolne nr 1 prowadzono bez EDTA, a wykazało ono działanie samej nizyny wobec bakterii Gram-ujemnej, S. typhimurium. Podwyższone stężenia nizyny wykazują pewną aktywność, ale nawet aktywność przy wyższych stężeniach, a pod nieobecność EDTA, 1,6% przeżycia przy 100 pg/ml nizyny jest zupełnie niewystarczająca dla konserwowania żywności. Poziom aktywności bakteriobójczej uzyskanej z nizyny i EDTA jest znaczny.

Tabela 1

Numer badania	Początkowa liczba żywych bakterii	EDTA (mM)	Nizyna (pg/ml)
0	10	30	50	100	300
1 2	3,0 x K)6 5,7 x U)6	0 20	Pr< 100 2,5	icent S. tyf 51,3	Jhimurium, 10'3	<tóre przeż) 7,0	'ły po 3 god; 1.6 < 10-4	tinach <10-4

Badanie nr 2 w tabeli 1, przeprowadzone z użyciem nizyny i 20 mM EDTA, wykazało nieoczekiwaną aktywność preparatu zawierającego nizynę w eliminowaniu zwalczanej bakterii Gram ujemnej .

Tabela 1 wykazuje, że w baoaniu nr 2 przy stężeniu 20 mM EDTA i 30 pg/ml nizyny, środek bakteriobójczy ma znaczną aktywność przeciw S. typhimurium, natomiast przy stężeniach nizyny pg/ml i wyższych środek bakteriobójczy zawierający nizynę i EDTA faktycznie eliminuje bak-4 terie (procent bakterii, które przeżyły jest niższy niż 10 , co oznacza brak żywych bakterii w próbce). Wynika stąd, że połączenie EDTA i nizyny wykazuje aktywność synergiczną większą niż 1000 krotną w stosunku do aktywności samej nizyny.

Przykład ii. Aktywność nizyny, czynnika chelatującego i powierzchniowo czynnego przeciw bakteriom Gram-ujemnym (S. typhimurium).

Przeprowadzono 4 badania (tabela 2) w celu określenia wpływu na S. typhimurium środka bakteriobójczego zawierającego nizynę i zarówno EDTA jak i środek powierzchniowo czynny Triton Χ-100 w 20 mM Tris, przy pH 8,0, w temperaturze 37“C. Badanie kontrolne nr 1 było identyczne z kontrolnym badaniem nr 1 w tabeli 1.

163 983

Tabela 2

Numer badania	Początkowa liczba żywych bakterii	EDTA (mM)	Triton Χ-100 (%)	Nizyna (pg/ml)
0	10	30	50	100	300
				Procent S. typhimurium, które przeżyły	po 3 godzinach
1	3,0 x 106	0	0	100	51,3	-	7,0	1,6	-
2	3,0 x 10ć	0	1,0	37,4	93,0	-	64,0	47,0	-
3	5,7 x 106	20	0,1	0,03	-	lo'·5	-	-	-
4	5,7 x 106	20	1,0	10-4	-	10-4	-	10-4	10-4

Badanie nr 2 w tabeli 2 przeprowadzono stosując nizynę i 1,0% Triton Χ-100, ale bez EDTA. Obecność samego detergenta inhibituje aktywność nizyny wobec bakterii Gram-ujemnych i nizyna jest nieskuteczna. Jednak w badaniach nr 3 i nr 4 (tabela 2) przedstawiających środek według wynalazku obecność 20 mM EDTA w połączeniu z Triton X-100 daje środek bakteriobójczy, który znacznie podnosi aktywność bakteriobójczą nizyny wobec S. typhimurium. W istocie połączenie Triton X-100 z EDTA, ale bez nizyny, było skuteczne, jednak w mniejszym stopniu niZ w obecności nizyny. Chociaż w obu badaniach nr 3 i nr 4 (tabela 2) stężenia nizyny były bardzo skuteczne, to najskuteczniejsze było stężenie 1,0% Triton X-100 (badanie nr 4, tabela 2).

Przykład III . Aktywność nizyny, czynnika chelatującegoi’środka powierzchniowo czynnego przeciw bakteriom Gram-ujemnym (S. typhimurium).

Tabela 3 przedstawia poprawioną aktywność wobec S. typhimurium środka bakteriobójczego zawierającego nizynę, 20 mM czynnika chelatującego, EDTA i niejonowy środek powierzchniowo, czynny Tween 20 w 10 mM Tris, przy pH 8,0 w temperaturze 37*C. Jak i w przypadku Triton Χ-100 (przykład II), połączenie nizyny i EDTA z (1%) Tween było najbardziej skuteczne.

Tabela 3

Numer badania	Początkowa liczba żywych bakterii	EDTA (mM)	Tween 20 %	Nizyna (pg/ml)
0	10	30	50	100	300
1	3,0 x 106	0	0	Proce 100	nt S. typhi 51,3	murium, któ	re przeżyły 7,0	po 3 godzir 1,7	ach
2	5,7 x 106	20	0	2,5		< 10-3		<10-4	<10-4
3	4,3 x Π)6	20	1,1	<10-2	-	< 10-4	-	< 10-4	<10-4

Przykład IV. Aktywność nizyny, czynnika chelatującego i środka powierzchniowo czynnego przeciw bakteriom Gram-ujemnym (Escherichia coli).

Skuteczność środka bakteriobójczego zawierającego nizynę i EDTA wobec Gram-ujemnej bakterii E. coli przedstawiono w tabeli 4.

163 983

Tabela A

Numer badania	Początkowa liczba żywych bakterii	Triton EDTA (mM)	Χ-100	Nizyna (pg/ml)
0	30	100	300
1	1,0 x 10?	0	0	Procent 100	E. coli, które 2?	przeżyły 2 25	godziny 8,5
2	1,0 x 10?	20	0	14,5	0,86	0,01	0,001
3	1,0 x 10?	0	1,0	100	-	30	-
4	1,0 x 10?	20	1,0	1,2	0,8	0,05	< 10-4

Badania z dodatkiem i bez dodatku EDTA przeprowadzono w 20 mM buforowego roztworu Tris, przy pH 8,0, w temperaturze 37“C z początkową liczbą żywych 1 x 10? komórek E. coli/ml. Wyniki działania bakteriobójczego mierzono jako funkcję procentowej liczby bakterii przeżywających 2 godziny.

W badaniu nr 1 (kontrolne, tabela 4) bez EDTA nizyna wykazywała mało znaczącą aktywność eliminowania E. coli. W badaniu nr 2 (tabela 4) jednak, gdy było 20 mM EDTA, kompozycja bakteriobójcza wykazywała znaczną aktywność wobec bakterii E. coli. Skuteczność wzrasta ze wzrostem stężenia nizyny. Kombinacja nizyny z EDTA jako środek bakteriobójczy wykazuje 1000 krotny synergiczny wzrost skuteczności wobec E. coli. W badaniach nr 3 i nr 4 (tabela 4) widać, że

-T.r_i.ton Χ-100 nie ma znaczącej aktywności bakteriobójczej przeciw JE. coli. W istocie Tnton

Χ-100 wydaje się inhibitować aktywność nizyny wobec bakterii Gram-ujemnych, co stwierdzono dla S. typhimuΓlun (tabela 2). Jednakże łączna poprawa aktywności nizyny przez EDTA praktycznie odwraca skutek inhibitowania Tnton Χ-100, co widać w tabelach 2 i 4.

Wynika stąd, że środek bakteriobójczy zawierający nizynę i czynnik chelatujący, taki jak EDTA, jest skutecznym środkiem do konserwowania żywności przeciw różnym typom bakterii Gramujemnych, nawet w obecności środków powierzchniowo czynnych.

Przykład V. Aktywność nizyny i czynnika chelatującego przeciw bakteriom Gramujemnych (Klebsiella pneumoniae).

Działanie środka bakteriobójczego zawierającego nizynę i samo EDTA wobec bakterii Gramujemnych K. pneumoniae przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Numer badania	Początkowa liczba żywych bakterii	m	Triton Χ-100 (%)	Nizyna (pg/ml)
0	30	100	300
1	10?	0	0	P 100	rzeżycie po 2	godzinach 50	38
2	10?	20	0	22	0,5	1,1	0,085

Dwa badania, jedno z a drugie bez EDTA (kontrolne) przeprowadzono w buforze 20 mM Tris, przy pH 8,0, w temperaturze 37°C, przy początkowej liczbie żywych komórek K. pneumoniae 1o7/ml. Wynik oznaczano jako funkcję procentu bakterii przeżywających ponad 2 godziny.

W badaniu nr 1 (kontrolne, tabela 5) bez EDTA, nizyna wykazywała mało znaczącą bakteriobójczość wobec K. pneumoniae. W badaniu nr 2 (tabela 5) jednak, w obecności 20 mM EDTA, środek bakteriobójczy wykazał znaczącą aktywność wobec K. pneumoniae. Aktywność wzrastała w miarę wzrostu stężenia nizyny.

Przykład VI. Aktywność nizyny przeciw bakteriom Gram-ujemnym (Salmonella typhimurium) zależy od stężenia chelatora.

Dane w tabeli 6 wykazują, że poprawa aktywności nizyny wobec bakterii Gram-ujemnych (S. typhimurium) zależy od stężenia EDTA albo w 50 mM octanie sodu, pH 5,0, albo w 20 mM Tris, pH 8,0, w temperaturze 37°C.

163 983

Tabela 6

Numer badania	PH	Początkowa liczba żywych bakterii	Nizyna pg/ml	EDTA (mM)
O	0,2	2,0	10	50	100
1 2 3 4	5,0 5,0 8,0 0,0	3 x 106 3 x 10ć 5 x 106 5 x 106	0 100 0 100	100 0,6 100 4	% p 10-4 10'4	rzeżycia po 38,7 104 8,7 10’4	2 godzinacl 15,2 0,004 14 10-4	h 3,5 0,02 11,4 0,6	45 30

W badaniach nr 1 i nr 3 (kontrolne, tabela 6) stosowana EDTA w stężeniach do 100 mM bez nizyny uzyskano małą aktywność wobec S. typhimurium zarówno przy pH 5,0 (nr 1) jak i przy pH 8,0 (nr 3). W badaniach nr 2 i nr 4 (tabela 6) jednak, gdy było obecne 100 pg/ml nizyny w połączeniu z EDTA, środki bakteriobójcze wykazywały znaczną aktywność wobec S. typhimurium. Aktywność bakteriobójcza była podobna na obu poziomach pH, przy kwaśnym pH (5,0) i zasadowym pH (8,0), pomimo, że aktywność samej nizyny wobec bakterii Gram-dodatnich jest optymalna przy pH 5,0.

Poprawa skuteczności nizyny przez EDTA zależy od stężenia, a jest optymalna w zakresie 0,2 mM do 10 mM przy wartościach pH 5,0 i 8,0. Niespodziewanie, przy stężeniach wyższych niż 10 mM EDTA, poprawa skuteczności nizyny przez EDTA zostaje obniżona. Ten spadek aktywności jest znacznie większy przy pH 8,0 niż przy pH 5,0.

Przykład VII . Nizyna i czynnik chelatujący przeciw bakteriom Gram-ujemnym (S. typhimurium).

Poprawę aktywności nizyny przez EDTA wobec bakterii Gram-ujemnych w obecności tkanki biologicznej wykazano za pomocą S. typhimurium na mięśniu kurczaka. Dane zestawiono w tabeli 7.

Tabela 7

Numer badania	PH	Nizyna pg/ml	EDTA (mM)
0	0,1	0,3	1	3	10	20	30	100
1	5,0	0	11,8			% prze	życia po 2	godzinad 6,4	1a
2	5,0	300	0,1	0,2	0,05	0,01	0,003	0,016	0,03	0,02	0,07
3	8,0	0	100	-	-	-	-	5,2	-	-	-
4	8,0	300	7,5	0,1	0,02	0,02	0,09	0,47	0,5	-	2,2
5	3,0	300b	0,02	0,09	0,0002	10-4	0,0004	0,003	-	0,03	0,09

a Komórki niezwarte zawiera 1% albuminy osocza wołowego (BSA)

Inkubacje prowadzono albo w 50 mM octanie sodu, pH 5,0, albo w 20 mH Tris, pH 8,0, temperaturze 37’C.

Kawałki mięśni kurczęcia oczyszczono podchlorynem sodu, i jodem w poliwinylopirolidonie przed użyciem. W celu zainokulowania tkanki.kawałki mięśnia kurczęcia zanurzano w zawiesinie komórek/ml S. typhimurium w 20 mM Tris HC1, pH 8,0. Nadmiar wilgoci usuwano z zanurzonych kawałków przez usunięcie płynu. Próbki kurczęcia umieszczono we właściwym buforze zawierającym odpowiednią ilość nizyny, aoy tkanka była pokryta i inkubowano je przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Po tym czasie tkankę przenoszono do odpowiedniej ilości buforu Phage, która ją pokrywała. Bakterie pozostające w roztworze użytym w badaniu oddzielono przez wirowanie, przemyto buforem Phage i połączono z bakteriami przemytymi od tkanki buforem Phage. Połączone próbki

163 983 (określone jako komórki aierwarSe) rozcieńczono seryjnie i 100 .1 οοι^.β nanoaaoeo .a nSydel w celu określenia liczby bakterii, które przeżyły.

W badaniach no 1 i nr 3 (tabela 7), pod nieobecność aizynn, przy pH lioo 5 lio. 8, amoo

EDTA nie wykazało znaczącego wpływu na przeżycie S. nypdamuΓίum. . aa^iiu or . 1 or 4 (tabela

7) jednak, w którym było 300 pg alryay, środki bakteriobójcze wykazały znaczną aktywność wobec S. typhi.πluΓluy na mięśniu kurczęcia zarówno przy pH 5,0 jak i pH 0,0.

Poprawa skuteczności nirnay przez EDTA była ależna. od ttężenia, ozzy ryan ρsnariike stężenie było w zakresie 0,3 mM do 10 mM EDTA, zarówno przy pH 5,0, jak i przy pH 0,0. W stężeniach wyższych niż 10 mM EDTA przy pH 0,0 aktywowanie adryay przez EDTA było ograniczone. Jednak jak wynika z badania no 5 (tabela 7) w obecności 1,0% albuminy osocza wołowego przy pH 0,0 skuteczność nizyay wobec S. typhlyurluy na mięśniu kurczęcia jest przyspieszana przez zakres stężeń EDTA do 100 mM.

Tak więc środki bakteriobójcze zawierające airyat i niskie stężenie czynnika cheiaSującego, takiego jak EDTA w zakresie 0,1 mM do 20 mM mogą być wybitnie skuteczne do eliminowania lub przeciwdziałania zanieczyszczeniom żywności wywołanym przez bakterie Gram-ujemae.

Przykład VIII . Stopniowanie aktywności mzyny przeciw bakteriom Gram-ujemnym (S. tnphlyurluy).

Przy optymalnym stężeniu czynnika chelaSującego skuteczność środka bakteriobójczego w buforze Tris wobec bakterii Gram-ujemnych okazuje się znaczna, jak to przedstawiono w tabeli 0.

Tabela 0

Numer badania	Początkowa liczba żywych bakterii	EDTA (mM)	BSA (%)		jg/ml
0	0,1	0,3	1,0	3,0	10	30	100
1	6 x 106	0	0	100		% prz	eżycia pc	2 godzi	iach 51,3		1-6
2	6 x 106	1,0	1,0	62	0,7	0,00	0,01	0,05	0,01	CIO'4	-

W badaniu nr 2 (tabela 0) można stwierdzić, że zaledwie 0,3 pg/ml nirynn z 1,0 mM EDTA w 20 mM Tois, przy pH 0,0, w obecności 1% albuminy osocza wołowego (BSA) znacznie obniża czas przeżycia S. Snphlmurluy. środek bakteriobójczy jest tak aktywny wobec bakterii Gram-ujemnych jak sama aizyna wobec Gram-dodatnim bakteriom Stoeptococci.

Przykład IX . Ocena aktywności aizyny przeciw bakteriom Goam-ujkmnyy (S. typhimurium).

Pozy optymalnym stężeniu czynnika ^^atującego skuteczność środka bakteriobójczego przeciw bakteriom Gram-ujemnym w obecności tkanki biologicznej wykazano dla S. typtiimurium na mięśniu kurczaka, jak to przedstawiono w tabeli 9.

Tabela 9

Numer badania	pH	Początkową liczba żywych komórek	EDTA (y+)	BSA (%)	Nlryar pg/ml
0	10	100	200	300
1	0,0	3 x 107	0	0	100	% prze	życia po 2	godzinach
2	0,0	3 x 107	1,0	1,0	27	0,26	0,000	0,007	0,006

Kawałki mięśnia kurczęcia oczyszczono podchlorynem sodu i jodem w poiiwlnnloplrolidanie przed użyciem. W celu ralnokuiawanla tkanki, kawałki mięśnia kurczęcia zanurzono w zawiesinie

O

100 komórek/ml S. Syphlyuoluy w 20 mM Tois HC1, pH 0,0. Nadmiar wilgoci usuwano z zanurzonych kawałków przez usunięcie płynu. Tkankę umieszczano w odpowiednim buforze zawierającym odpowied10

163 983 nią ilość nizyny, aby tkanka była pokryta i inkubowano ją przez 2 godziny w temperaturze 37 C, po czym tkankę usunięto do odpowiedniego buforu Phage, który pokrywa ją. Oddzielono przez wirowanie bakterie pozostające w badanym roztworze, przemyto je buforem Phage i połączono z bakteriami przemytymi od tkanki buforem Phage. Połączone próbki (określanej jako komórki niezwarte) rozcieńczano seryjnie i 100 pl/porcje nanoszono na płytki w celu określenia liczby bakterii które przeżyły.

Przykład X. Aktywność przeciw bakteriom Gram-ujemnym (S. typhimurium) nizyny, EDTA i metyloparabenu.

środek bakteriobójczy zawierający nizynę i EDTA, który połączy się ze znanym środkiem zabezpieczającym żywność, metyloparabenem, okazał się być skuteczny wyłącznie przeciw bakteriom Gram-ujemnym, co przedstawiono w tabeli 10.

Tabela 10

Numer badania	Początkowa liczba żywych bakterii	Nizyna (g/ml)	EDTAb (mM)	% Metyloparabenu
0	0,1	1,0
1	3 x ^()6	0	10	% pr 11,8	zeżycia po 2 god 1,0	zinach c 1O-4
2	3 x 1θ6	300	10	0,03	< 10-3	< 10-4

b5O mM bufor octanu sodu, pH 5,0 ckomórki niezwarte

Kawałki mięśni kurczaka oczyszczono podchlorynem- sodu f jodem w poliwinylopirolidonie· przed użyciem. W celu zainokulowania tkanki kawałki mięśnia kurczaka zanurzono w zawiesinie

O komórek/ml S. typhimurium w 50 mM buforu octanu sodu, pH 5,0. Nadmiar wilgoci usuwano z zanurzonych kawałków przez wypuszczenie płynu. Tkankę umieszczono w odpowiednim buforze zawierającym odpowiednią ilość nizyny tak, aby tkanka była pokryta i inkubowano ją 2 godziny w temperaturze 37 C, po czym tkankę usunięto i pokryto odpowiednim buforem Phage. Bakterie pozostające w badanym roztworze oddzielono przez wirowanie, przemyto je buforem Phage i połączono z bakteriami odmytymi z tkanki buforem Phage. Połączone próbki, (określane jako komórki niezwarte) rozcieńczono seryjnie i 100 pl porcje nanoszono na płytki w celu określenia liczby bakterii, które przeżyły.

W badaniu nr 1 (tabela 10) metyloparaben w obecności 10 mM EDTA okazał się skuteczny wobec S. typhimurium tylko w stężeniu 1,0%. W badaniu nr 2 (tabela 10) jednak, w obecności 300 pg/ml nizyny, skuteczność metyloparabenu i nizyny wobec S. typhimurium była znacznie podwyższona .

Preparaty środka zawierające nizynę i EDTA znacznie poprawiają użyteczność metyloparabenu będącego konserwantem żywności. Ponadto substancje te mogą prowadzić do znacznego zmniejszenia stężeń, albo eliminacji konieczności stosowania takich znanych, jednak mniej pożądanych substancji do konserwowania żywności, jak metyloparaben.

Przykład XI. Aktywność przeciw bakteriom Gram-dodatnim (Staphylococcus aureus) nizyny i czynnika chelatującego.

Aktywowanie nizyny czynnikiem chelatującym zależy od pH. Dane z tabeli 11 potwierdzają, że przy pH 5,0, nizyna jest cokolwiek bardziej bakteriobójcza wobec S. aureus, niż przy pH 8,0 Przy pH 5,0 EDTA nie poprawia aktywności nizyny wobec S. aureus a przy stężeniach EDTA wyższych niZ 10 mM EDTA jest inhibitorem bakteriobójczej aktywności nizyny. Jednak aktywność bakteriobójcza nizyny wzmagana przez EDTA przy pH 8,0 jest znacznie wyższa od aktywności samej nizyny albo w kombinacji z EDTA przy pH 5,0.

163 983

Tabela 11

Wpływ pH na działanie EDTA na aktywność bakteriobójczą nizyny wobec Staphyllcoccus aureus

Nizyna	EDTA mM
PH	ug/ml	O	0,(	0,3	(,0	3,0	(0	30	100
				%	przeżycia po 2 godzinach
8,0	0	00	-	(00	8(	H)0	HU	HU	-
8,0	3,0	7,4	0,03	0,0(	0,2	0,4	3	56	-
5,0	0	(00	-	-	-	(00	-	-	-
5,0	3,0	0,6	(,0	(,3	(,4	(,8	-	34	80

aLiczba początkowo żywych bakterii: 8,0 x ^6 cfu/ml

Inkubacje prowadzono w 50 mM buforze octanu sodu, pH 5,0 lub 20 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0 w temperaturze 37*C.

Aktywność bakteriobójcza samej nizyny według doniesień literaturowych (patrz Hurst) jest największa przy pH 5,0 lub niższym, a dane z tablicy (ł potwierdzają to. Na tej podstawie uważano, że aktywowanie bakteriobójczości nizyny przez EDTA wobec S. aureus będzi· największe przy niższym pH. jednak, jak widać z tabeli K, przeciwni· do tych oczekiwań (patrz tabela 6), nie zauważono aby EDTA poprawiało aktywność nizyny wobec bakterii Gram-dodatnich przy pH 5,0. jednak inhibitowanie aktywności nizyny przez wysokie stężenia EDTA obserwowano nadal przy pH 5,0. Wynika stąd, że aktywowanie nizyny czynnikiem chelatującym występuje tylko w zakresie pewnego - zakresu- stężeń cheOatora, a w odniesieniu do bakterii Gram-dodatnich zależy od pH, przy korzystnym zakresie pH wyższym niż pH 5,0.

Przykład XII . Aktywność przeciw bakteriom Gram-dodatnim nizyny i czynnika chelatującego .

Wpływy EDTA na aktywność bakteriobójczą nizyny przy pH 8,0 nie ograniczają się do S. aureus, ważnego łuJzkiego czynnika chorobotwórczego, ale obserwuje się je również na Streptococcus mutans^-odpowiedzialnym za próchnicę zębów (tabela (2A), Listeria monocytogenes, patogenie pochodzącym z żywności (tabela i28) i na mieszanych populacjach pachowych bakterii Coryneform, odpowiedzialnych za woń ciała (tabela (2C).

Tabela (2A

Wpływy EDTA na bakteriobójczą aktywność nizyny wobec streptococcus Putans

Nizyna	EDTA mM
pH	ug/ml	0	0,0(	0,(	0,3	(,0	3,0		30	(00
					X przeżycia po	2 godzinach
8,0	0	00	-	-	-	-	-	-	-	-
8,0	0,(	4,3	(,8	0,04	0,02	0,06		25	H)0	(00

aLiczba początkowo żywych bakterii 6,0 · i06 cfu/ml

Inkubację prowadzono 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 w temperaturze 37’C.

163 983

Tabela 128

Wpływy EDTA na aktywność bakteriobójczą nizyny wobec Listeria monpcySogenes

Nizyna	EDTA rtM
pH	pg/ml	0	0,1	0,3	1,0	3,0	10	30	100
8,0	0	100		% pr	zeżycia po 84	2 godzinach3
8,0	3,0	0,71	0,04	0,04	0,02	0,1	0,64	10	14

a 6

Liczba początkowo żywych bakterii: 6,0 · 10 cfu/ml

Inkubacje prowadzono w 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 w temperaturze 37*C.

Tabela 12C

Wpływy EDTA na aktywność bakteriobójczą nizyny wobec Coryneform bacteria

Nizyna	EDTA mM
pH	pg/ml	0	0,1	0,3	1,0	3,0	10
			h przeżycia po 2 godzinach a
8,0	0	100	-	4,6	3,6	8	36
0,0	3	0,22	0,03	0,0009	0,1	-	0,16

a) 6

Liczba początkowo żywych bakterii: 10 · 10 cfu/n^l.

Inkubacje prowadzono w 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, w temperaturze 37°C.

Przykład XIII . Szybkość aktywności bakteriobójczej nizyny aktywowanej chelaSorem.

Preparat bakteriobójczy zawierający nizynę z EDTA jest szybko działającym środkiem bakteriobójczym, co ilustrują dane w tabeli 13A. Zawiesiny Gram-dodatnich bakterii S. mutans w stężeniu 1q7 komórek/ml mkubowano w 20 mM buforze Tris, pH 7,3 w temperaturze 37*C, przy podanych stężeniach nizyny aktywowanej 1 mM EDTA. Zawiesiny inkubowano przez różne okresy czasu w zakresie od 0,5 do 60 minut z preparatem bakteriobójczym. Bakteriobójczą skuteczność preparatu bakteriobójczego szacowano przez określanie procentu bakterii, które przeżyły. Uaktywniona EDTA tak mała ilość nizyny jak 10 pg/ml w tym preparacie ma zdolność obniżenia liczby bakterii 6 krotnie w ciągu 1 minuty.

Szybka aktywność bakteriobójcza jest wstępnym warunkiem skutecznej dezynfekcji. Tak więc preparaty, zwłaszcza tu przedstawione, są przewidziane jako skuteczne substancje bakteriobójcze do preparatów do płukania ust, płukanek, pasty do zębów lub innych podobnych środków do czyszczenia zębów aktywnych wobec wywołujących próchnicę S. mutans.

Skuteczne działanie nizyny aktywowanej EDTA przeciw bakteriom Gram-ujemnym po 2-3 godzinach, pokazano w przykładach I-VII. Szybka aktywność nizyny poprawiona dodatkiem EDTA jest również widoczna wobec bakterii Gram-ujemnych i jest to zilustrowane danymi z tabeli 138.

163 983

Tabela 13A

Kinetyka aktywności bakteriobójczej wobec Streptococcus mutans nizyny uaktywnionej EDTA

Czas inkubacji (minuty)	Nizyna pg/ml z 1,0 mM EDTA
°	1	’ ..	10	30	100
0,5			% prze	życia a		< 10‘4
1	-	-	-	< 10-4	<10-4	<110-4
3	100	0,5	0,002	<110-4	<10-4	-
15	-	0,03	<10-4	<104	-	-
30	-	-	CIO'4	-	-	-
60	100	0,003	-	-	-	-

Liczba kontrolnych, żywych komórek: 1,0 · 10⁷ cfu/ml inkubację prowadzono w 20 mM Tris-HCl, pH 7,3 w temperaturze 37“C.

Tabela 136

Szybka aktywność bakteriobójcza wobec Escherichia coli nizyny aktywowanej EDTA

mM	Nizyna pg/ml
0	0,3	1,0	3	10	30	100
			S przeżycia po 1	minuciea
1,0	100	100	56	0,37	0,013	0,015	0,008

1,0 · 10⁷ cfu/ml s, pH 7,0 w temperaturze

Liczba początkowa żywych bakterii: inkubację prowadzono w 20 mM Tri *C.

Przykład XiV . Wpływ dwuwartościowych kationów na E0TA poprawiające aktywność nizyny.

Dwuwartościowe kationy łączą się EDTA i innymi czynnikami chelatującymi i można było oczekiwać zobojętnienia aktywowania nizyny przez EDTA. Jednak jak widać z danych w tabeli 14 aktywność bakteriobójcza nizyny przeciw S. mutans jest wzmagana przez 1 mM EDTA nawet w obecności 1 mM jonu Ca⁺⁷, a jedynie stężenie ponad 3 mM jonu Ca⁺⁷ działało inhibitująco na nizynę aktywowaną EDTA. Jest to szczególnie ważne przy zastosowaniach w środkach doustnych, z którymi związane są duże stężenia jonów wapniowych.

Tabela 14

Szybka aktywność bakteriobójcza wobec Streptococcus mutans nizyny aktywowanej EDTA w obecności dwuwartościowego kationu

Nizyna	CaCl2 mM
0	0,1	0,3	1,0	3	10
			% przeżycia po 1 minucie a
0	100
3	2,9
3E	0,0042	0,0042	0,052			18
30e	0,0019		0,0003	0,0004	0,06	6,8
100E	10-4		10-4	10-4	0,0001	1,5

163 983 ^Ε 1 mM Na₂ EDTA a 2

Liczba początkowa żywych bakterii.: 1,0 · 10 cfu/ml

Inkubacje prowadzono w 10% cielęcym płynie płodowym w temperaturze 3?*C.

Przykład Χν . Aktywność nizyny i środka powierzchniowo czynnego wobec bakterii Gram-dodatnich.

Aktywność bakteriobójczą nizyny można również znacząco poprawić przez dodanie samego środka powierzchniowo czynnego. Najlepiej ilustruje to ograniczenie stężenia nizyny (0,2 pg/ml) przedstawione w tabeli 15A. W stężeniach do 0,1% dozwolonego do stosowania w żywności środka powierzchniowo czynnego, monolaurynianu, ma mało znaczącą aktywność bakteriobójczą wobec Streptococcus agalactiae w mlecznym środowisku kompleksowym. Nizyna, w stężeniu do 0,2 pg/ml, podobnie nie wykazuje znaczącej aktywności bakteriobójczej w mleku. Jednak kombinacja tych dwóch czynników, 0,1H monolaurynianu i nizyny w stężeniu 0,2 pg/ml jest wybitnie skuteczna wobec S. agalactiae. Ten preparat bakteriobójczy jest ponad 100 krotnie bardziej aktywny niż można byłoby oczekiwać, gdyby efekt ten był addytywny a 10.000 krotnie bardziej aktywny niż dowolny z pojedynczych składników. A więc, jeżeli stosowanie nizyny jest ograniczone możliwą do uzyskania aktywnością, to można będzie oczekiwać, że środek bakteriobójczy zawierający nizynę ze środkiem powierzchniowo czynnym, będzie bardziej skuteczny.

Przypadek, w którym stosowanie nizyny jest ograniczone możliwą do uzyskania jej aktywnością, ilustrują dane w tabeli 158. Chociaż nizyna, a zwłaszcza środek bakteriobójczy zawierający nizynę i EDTA, jest bakteriobójczy wobec L. monocytogenes, dane w tabeli 15B wykazują, że w kompleksowym środowisku podobnym do mleka możliwa do uzyskania aktywność nizyny wobec tego drobnoustroju jest ograniczona. Jednak środek bakteriobójczy złożony z nizyny z glicerydem, nonooleinianem, jest skuteczna w mleku wobec pochodzącego z żywności patogenu, mimo że monooleinian jako taki me ma aktywności bakteriobójczej wobec tego drobnoustroju.

Tabela 15A

Aktywność bakteriobójcza nizyny wobec Streptococcus agalactiae w mleku w temperaturze 3?*C (Aktywowanie nizyny monolaurynianem)

Nizyna	% Monolaurynian
0	| 0,01	0,1
		% przeżycia w 2 godzinie	a
0	100	100	4,5
0,02	100	100	0,2
0,2	2,2	0,05	0,0008

Liczba początkowa żywych bakterii: 6,0 · 10? cfu/ml Inkubacje prowadzono w mleku w temperaturze 3?°C.

Tabela 158

Aktywność bakteriobójcza nizyny wobec Listeria monocytogenes w mleku w temperaturze 3?’C (Aktywowanie nizyny monooleinianem)

Nizyna (pg/ml)	% Monooleinian
0	0,1	1,0
	%	przeżycia w 2 godzinie	a
0	100	6?	63
100	0,56	10-3	10-4

a ?

Liczba początkowa żywych bakterii: 5,0 x 10' cfu/ml

Inkubacje prowadzono w mleku w temperaturze 31*C.

163 983

Przykład XVI. W następujących tabelach 16A - 16G zilustrowano aktywności biobójcze różnych preparatów środka według wynalazku.

Tabela 16A

Aktywność subtiliny i czynnika chelatującego wobec bakterii Gram-ujemnych Salmonella typKimurium

Podłoże	Subtilina (ug/ml)	E0TA iM
Bufor o pH 8,ob	0 5	% przeżycia 2 godzin3
100a 5	0,008	0,0004	0,004	0,04	11,3
Bufor o pH 5,0°	5	0,06	0,04	0,0003	0,0003	0,08	6

a Początkowa liczba żywych bakterii: 3 x 106 cfu/ml ^b 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 c 50 mM octan Na, pH 5,0

Tabela 16B

Aktywność nizyny i czynników chelatujących wobec Escherichia coli

Nizyna (ug/ml)	0	Czynnik chelatujący 1 mM b
EDTA	DTPA	COTA	EGTA
100	100a	0,61	% przeżycia 1 minuty 4,2 | 4,3	10,9

a 7

Początkowa liczba żywych bakterii: 1 x 10' cfu/ml b 10-mM Tris-HCl, pH 7,3

Tabela 16C

Aktywność nizyny i CaNajEOTA wobec Streptococcus mutans

Podłoże	Nizyna (ug/ml)	Cal^EDTA mM
0	1
		% przeżycia 1 minuty
10% FCSb	3,0	3,0	0,052

Początkowa liczba żywych bakterii: 3 x 106 cfu/ml b 10% cielęcy płyn płodowy

163 983

Tabela 16D

Aktywność nizyny i cytrynianu wobec Streptococcus mutans

Podłoże	Ni^na (pg/ml)	Cytrynian mM
0	0,1	1	3	10	100
Bufor o			% przeżycia 2 godzin
pH 7,3b	0.3	3,65	1,25	0,1	0,42	0.2	0,35

Początkowa liczba żywych bakterii: 3 x 1(]6 cfu/ml b 10 mM Tois-HCl, pH 7,3

Tabela 16E

Aktywność mzyny i cytrynianu wobec Escheoichia coli

Podłoże	Nizyna	% cytrynianu
(pg/ml)	O	0,1	0,3	1	3
Bufor o	0	100	% przeżycia 100	1 minuty 56	73	100
PH 3,5	100	100	0,0025	0,0006	0,56	14,6

Początkowa liczba żywych bakterii: 5 x 10⁷ cfu/ml

Tabela 16F

Aktywność ndryny i niejonowych środków powierzchniowo czynnych wobec Escheoichia coli

Podłoże	Ni^na (pg/ml) + 1 mM EDTA	Tweeny
0	Tw2O	Tw4O	Tw0O
Bufor o	0	100a	% przeżyci 100	a 1 minuty 100	100
pH 7,0b	3	0,25	0.001	0,007	0,007

a Początkowa liczba żywych bakterii: 1 x 1O⁷ cfu/ml b 20 mM Tris-HCl, pH 7,0

Tabela 16G

Aktywność nlznan i αιafaSkoycrac^a środka powierzchniowo czynnego wobec 3SrepSococcus mutans

Podłoże	Nizyna (pg/ml) + 1 ml EDTA	% kokaradopoopniabkSaina
0	0,1
		% przeżycia 1 yinuSya
10% FCSb	0	100	11
	3	30—.— ..i	0,07

³ Początkowa liczba żywych bakterii: 1 x 10⁷ cfu/ml 10% cielęcy płyn płodowy.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. środek bakteriobójczy zawierający bakteriocynę i substancje pomocnicze, znamienny tym, że zawiera bakteriocynę zawierającą lantioninę w stężeniu między 0,1 μ/ml i 300 pg/ml i czynnik chelatujący w stężeniu między 0,1 mM i 20 mM.
2. 2. śśooek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto środek powierzchniowo czynny w stężeniu między 0,01% i 1,0%.
3. 3. środek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako bakteriocynę zawierającą lantioninę zawiera substancję wybraną z grupy obejmującej nizynę, subtilinę, epideominę, cynamycynę, ankoweninę i Pep 5.

   i. środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako czynnik chelatujący zawiera substancję wybraną z grupy obejmującej tetraoctany alkilodiaminy, taką jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (E0TA), CaEDTA, NajCa EDTA lub cytrynian.
4. 5. środek eedłgg zasrrz. 4 , znameenny tym , e e a^ak o eerracctan alkllddiaminy zawiera kwas etylknodiayinoSetrrocSawy (EDTA) a jako bakterio^^ę zawiera niznnę.
5. 6. śrroee według zastrz. 2. znamienny t y rn. że jako środek powierzchniowo czynny zawiera substancję wybraną z grupy obejmującej ToiSann, Tweeny, Glicerydy, kwasy tłuszczowe, emulgatory, związki czwartorzędowe, amfaSeoncrae i anionowe środki powierzchniowo czynne .
6. 7. śśroee według zastrz. 1 albo 2, znamienny t y rn, że zawiera bαkteriacyaę zawierającą lanSloninę wybraną z grupy obejmującej mzyn^, subt^inę, epid^miną, cnnamycynę, duramycynę, αnkawealnę i Pep 5 oraz czynnik chelatujący wybrany z grupy obejmującej tetrαactαny alkllodlaylan i cytrynian, obecne w takich ilościach, żeby środek bakteriobójczy miał wyższą skuteczność przeciw co najmniej jednej bakterii wybranej z grupy obejmującej Stap^'^coccus aureus, Streptococcu s muisnn, Listeri a monocytogenme, Streptococcu s agataca^., Cornyeform bacteria, Salmonella typhimurium, Es^erich^ coli, Klebsien a ρηθυΐϋ^,., Pseudornonas aeruginosa, Bacterioides gingiualis i A^^oba^l^s actlaamycetescomitans.
7. 8. środek eełłu . ast^z . , , znaminnne t m m , e. a^o . ksraaosαan ildlaodrydiny zawiera (EDTA) kwas etylenoddαminoSetoaoctowy.

   * * *