PL156255B1 - Sposób wytwarzania wektorów ekspresyjnych do transformowania Yarrowia lipoiytica - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania wektorów ckśpresyj- 57^ nych do transformowania Yarrowia lipoiytica, znamienny tym, że plazmid pXHP-24 rozszczepia się enzymami HindIII-Aval otrzymując odcinek o długości 1150 par zasad, odcinek ten izoluje się i poddaje ligacji wobec ligazy T4 z odcinkiem synte­ tycznego DNA o sekwencji: 5 ' CCGAGAITCCIGCTTCTTCTAAGTCCAAGCGA j ' J ' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5 ' następnie otrzymany produkt ligacji rozszczepia się enzymami Hindlll-BamHI z wytworzeniem odcin­ ka o długości 1196 par zasad, który to odcinek po izolacji poddaje,się ligacji w obecności ligazy T4 z odcinkiem o długości 440 par zasad pochodzącym z trawienia enzymami BamHI-XmaI plazmidu pLS- 3 i z odcinkiem o długości około 8,0 kilopar zasad pochodzącym z trawienia enzymami Hindlll- Xm,al plazmidu pLS-3, następnie tak otrzymanym produktem reakcji ligacji transformuje się E.coli, dokonuje się selekcji transformantów opornych na ampicylinę i z tych transformantów izoluje się plazmid pXX-33.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wektorów do transformowania Yarrowia lipolytica (określanego dalej jako Y. lipolytica) zawierających promotor pochodzący z genu Y. lipolytica (na przykład XPR2 lub LEU 2), sekwencję (lub presekwencję) sygnałową alkalicznej proteazy, pro-region oraz region terminatora XPR2, jak również warianty lub funkcjonalne równoważniki wynikające z degeneracji kodu genetycznego albo użycia innego składnika genu Y. lipolytica.

Za pomocą wektorów wytworzonych sposobem według wynalazku wytwarza się transformanty drożdży, zawierające powyższe wektory ekspresji i wydzielania. Transformanty te stosuje się do wytwarzania białek heterologicznych w ich natywnej, funkcjonalnej postaci.

Poszukiwania dróg równomiernego i ilościowo pokrywającego zapotrzebowania, wytwarzania białek i polipeptydów cennych dla przemysłu (na przykład proreniny, bydlęcego hormonu wzrostu) lub dla celów medycznych (urogastron, aktywator plazminogenu tkankowego, ludzka anafilotoksyna C5a) a zwłaszcza, poszukiwania źródeł, z których można byłoby uzyskiwać produkty o wysokiej jakości w łatwej do wyodrębnienia funkcjonalnej formie, skierowały wysiłki badaczy w kierunku atrakcyjnej ekonomicznie technologii rekombinacji DNA i wytwarzania heterologicznych białek w ' mikroorganizmach jako „fabrykach.

Prowadzone obecnie szerokie badania ogniskują się na wydzielaniu białka, jako na potencjalnym rozwiązaniu trudności napotykanych przy odzyskiwaniu egzogennego lub heterologicznego (obcego) białka w postaci aktywnej biologicznie a gromadzonego wewnątrz zrekombinowanych komórek gospodarza, zwłaszcza na wyodrębnianiu z komórek E.coli. W E.coli białko heterologiczne jest zazwyczaj wytwarzane we wnętrzu komórki w formie silnie uginających światło ciał inkluzyjnych. Białko to na ogół jest słabo rozpuszczalne w wodzie i wykazuje niewielką aktywność biologiczną lub wcale nie wykazuje aktywności. Ekstrakcja tego białka z tych ciał inkluzyjnych wymaga zazwyczaj ostrej obróbki chemicznej, która może być kosztowna a w wyniku jej stosowania można otrzymać niewiele, lub wcale nie uzyskać białka w żądanej, natywnej, biologicznie aktywnej postaci. Ponadto, możliwość zanieczyszczenia tego białka niepożądanymi substancjami wytwarzanymi przez E.coli zwiększa się przez konieczność niszczenia komórek w celu uwolnienia z ciał inkluzyjnych. Poza E.coli, inne organizmy również wytwarzają białko heterologiczne w nierozpuszczalnej formie wewnątrzkomórkowej. Przykładowo, w opisie patentowym Wielkiej Brytanii nr 2 091 271 ujawniono modyfikację genetyczną S. cerevisiae na drodze technologii rekombinacji DNA dla uzyskania ekspresji reniny lub chymozyny cielęcej, przy czym terminy te stosowano zamiennie. Z powodu powyższych trudności, badania skierowano na wydzielenie tego białka poza organizm gospodarza, widząc w tym możliwość opracowania drogi wytwarzania tego białka w jego natywnej, aktywnej konfiguracji.

Okazuje się, że to, czy konkretne białko, w tym białko lub polipeptyd heterologiczny jest wydzielane przez dany organizm poza komórkę, zależy od tego białka. W większości komórek eukariotycznych część aparatu syntetyzującego białko jest związana z błoną endoplazmatyczną retikulum a sekwencja aminokwasów (zwana sekwencją sygnałową) w pobliżu N-końca powstałego łańcucha polipeptydowego służy do kierowania białka do przechodzenia przez błonę.. Ta sekwencja sygnałowa jest następnie odszczepiana proteolitycznie w procesie sekrecji, w wyniku czego powstaje aktywne, dojrzałe białko. Czyniono szereg wysiłków w celu opracowania sposobów wydzielania białek heterologicznych z zastosowaniem sekwencji sygnałowych w mikroorganizmach, w tym, w Bacillus subtiłis, Saccharomyces cerevisiae i w hodowlach komórkowych ssaków. Okazało się jednak, że te organizmy nie są idealne. W wysiłkach tych przeszkodziły właściwości gatunkowe B. subtiłis. Bakteria ta wydziela wiele białek, w tym liczne proteazy, które rozkładają wydzielane białko heterologiczne. Transformowane szczepy tych bakterii są niestabilne tracąc heterologiczny DNA.

Udało się metodą inżynierii genetycznej modyfikować komórki ssaków w taki sposób, aby zachodziła w nich ekspresja i wydzielanie białek heterologicznych. Hodowla takich układów jest jednak technologicznie trudna i kosztowna, co powoduje, że wytwarzanie większości białek na skalę przemysłową staje się nieopłacalne.

156 255

Pomimo, iż badania wydzielania białka w organizmach S. cerevisiae są bardziej obiecujące niż w organizmach B. subtillis, to okazało się, że S. cerevisiae, jako układy wydzielania białek stwarzają również pewne ograniczenia wynikające z cech gatunkowych tego gospodarza. W opisie zgłoszenia patentowego europejskiego 0 123 544 opublikowanym 31 października 1984 r. ujawniono izolowanie genów czynnika-σ S. cerevisiae i użycie w plazmidzie ich części zawierających promotor i/lub sekwencję sygnałową białka w połączeniu z DNA kodującym białko heterologiczne dla drożdży, dla transformowania komórek drożdży zdolnych do wytwarzania oddzielonego od pre-sekwencji, dojrzałego białka podczas hodowli komórek. W opisie zgłoszenia patentowego europejskiego 0 088 632 opublikowanym 14 września 1983 r opisano sposób uzyskiwania ekspresji i sekrecji białka heterologicznego w S. cerevisiae. Jednak wielkość białek, które S. cerevisiae są w stanie wydajnie wydzielać w tych i innych układach wydzielniczych jest ograniczona do około 20000 daltonów. Przezwyciężenie tej ogólnej niewydolności S. cerevisiae jako organizmu wydzielniczego wymaga wielokrotnych mutacji, opisanych przez Smith'a i wsp.; Science 229, 1219-1224 (1985). Jedynym wyjątkiem od tej zasady jest obserwacja, że enzymy pochodzące z Aspergillus o masie większej od 20000 daltonów mogą być wydzielane przez S. cerevisiae, ale w gospodarzu tym, enzymy te mają wysoki stopień zglikozylowania, co może mieć wypływ na wydajność sekrecji.

Przedmiotem szczególnego zainteresowania jest Yarrowia lipolytica, ważny z punktu widzenia przemysłowego gatunek drożdży, stosowany w produkcji kwasu cytrynowego i białka komórkowego. Można go również stosować do produkcji erytrytu (butanotetraolu), mannitolu i kwasu izopropylo-jabłkowego. Są to drożdże szczególnie cenne, gdyż w przeciwieństwie do S. cerevisiae, Y. lipolytica wykazują zdolność wydajnego wydzielania białek o wysokim ciężarze cząsteczkowym (proteaza alkaliczna, proteaza kwaśna i RNA-za) do środowiska wzrostu (podłoża), co pozwala na wyodrębnienie białek heterologicznych w ich natywnej formie, bez potrzeby niszczenia wytwarzających je komórek. Ponadto, Y. lipolytica wydziela ilościowo bardzo niewiele białek, stwarzając potencjalne możliwości produkcji żądanego białka heterologicznego w środowisku wzrostu, jako białka dominującego, co ułatwia odzysk tego białka heterologicznego.

Y. lipolytica wytwarza duże ilości pozakomórkowej proteazy. Jest to główne białko wydzielane przez Y. lipolytica. Rodzaj konkretnej proteazy (alkaliczna, kwaśna lub obojętna) zależy od użytego szczepu Y. lipolytica [Ogrydziak i wsp., J. Gen. Microbiol. 128, 1225-1243 (1982)]. W publikacji tej cytuje się częściową analizę sekwencji fragmentu N-końcowych reszt aminokwasowych alkalicznej, pozakomórkowej proteazy.

W opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 634 505 z dnia 25 lipca 1984 r. opisano sposoby transformowania Y. lipolytica i klonowania genów Y. lipolytica przez komplementację mutacji. Ujawniono tam klonowanie genu XPR2 kodującego wydzielaną alkaliczną proteazę przez komplementację mutacji xpr2. Y. lipolytica. Metodologia ta obejmuje transformowanie szczepu gospodarza Y. lipolytica produktem częściowego trawienia enzymem BglII ban ku genów Y. lipolytica w wektorze pLD40, opisanym w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego 0138 508 opublikowa nym 24 kwietnia 1985 r., stanowiącego odpowiednik podanego powyżej zgłoszenia Stanów Zjednoczonych Ameryki.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wektorów, które, jeśli zostaną wprowadzone do Y. lipolytica jako gospodarza, nadają temu gospodarzowi zdolność wytwarzania i wydzielania do środowiska specyficznych białek kodowanych przez heterologiczny DNA pochodzący z dowolnego źródła, a zwłaszcza z organizmów eukariotycznych oraz przez DNA syntetyczny.

Przedmiotem wynalazku są ponadto nośniki klonujące Y. lipolytica zawierające DNA heterologiczny, kodujący ekspresję białka ssaków lub innych polipeptydów, w tym plazmidy nadające się do transformowania Y. lipolytica jako gospodarza, a zwłaszcza integracyjne wektory, zawierające gen promotora LEU2, gen promotora XPR2, prepro-region dla alkalicznej proteazy i region terminatora XPR2, jak również plazmidy ekspresyjne, zawierające heterologiczną sekwencję kodującą wraz z sygnałami wydzielniczymi XPR2 usytuowanymi za promotorem LEU2. Plazmidy te mają zdolność ekspresji i sekrecji heterologicznego białka w transformowanych nimi drożdżach Y. lipolytica.

Tak więc, można uzyskać ekspresję i wydzielanie dojrzałego białka heterologicznego, a zwłaszcza, proreniny i ludzkiej anafilotoksyny C5a, z genetycznie zmienionych hodowli komórek

156 255

Y. lipolytica. Odkrycie i dokładne oznaczenie sekwencji aminokwasowej oraz sekwencji DNA dla pozakomórkowej proteazy alkalicznej Y. lipolytica umożliwiło ustalenie, że białko heterologiczne może być wytwarzane i wydzielane na drodze rekombinacji DNA i produkowane w hodowli komórkowej. W przypadku proreniny, wytwarzana jest i wydzielana dojrzała forma zymogenu (prekursora reniny).

Okazało się, że drożdże Y lipolytica można modyfikować genetycznie na drodze technologii rekombinacji DNA, otrzymując transformanty zdolne do ekspresji i wydzielania białek heterologicznych w ich formie natywnej. Uzyskano to przez skonstruowanie wektorów zawierających cześć sygnałową lub część sygnałową i pierwszą (pro 1) lub obydwie prosekwencje (pro 1 + pro2) genu XPR2, przyłączone do sekwencji genu strukturalnego wydzielanego białka heterologicznego.

Transformanty otrzymane przez integrację w locus XPR2 wektora DNA zawierającego fragment genu XPR2, z pominięciem komponentów regulatorowych lub strukturalnych na obydwu końcach tego genu, przestają wytwarzać alkaliczną proteazę, co jest cechą pożądaną nie tylko z punktu widzenia wydzielania heterologicznego białka, lecz również dlatego, że cechę tę można wykorzystać do skriningu przewidywanych transformantów.

Ponadto, wektory zawierające promotor XPR2 i sekwencje kodujące wydzielniczą sekwencję sygnałową alkalicznej proteazy nadają transformowanej komórce Y. lipolytica zdolność wydzielania dojrzałego, heterologicznego białka. Niektóre wektory rekombinantowego DNA tego typu nadają zdolność ekspresji i wydzielania niezależnie od miejsca integracji z genomem gospodarza drożdżowego. Na ogół, wektory zawierające wystarczające boczne regiony flankujące 5' i 3' DNA, wywołują ekspresję produktu niezależnie od miejsca integracji.

Nieoczekiwanie okazało się także, że integracja plazmidu pochodzącego z pBR322 z chromosomalnym DNA Y. lipolytica daje obszar homologii, który sprzyja dalszej, kierowanej miejscem, transformacji integracyjnej. Zintegrowana kopia pBR322 służy zatem jako tzw. platforma dokowania dla przyłączonego DNA transformującego. Integracja kopii pBR322 z chromosomalnym DNA Y. lipolytica stwarza zatem znane miejsce docelowe dla integracji, pomimo tego, że pBR322 nie jest natywnym DNA Y. lipolytica. Transformanty Y. lipolytica, które przyjęły plazmid, takie, które zawierają tego rodzaju miejsce, mają dwie cechy korzystne, przewyższające transformanty, które nie mają tego miejsca, obecność regionu o znanej sekwencji i znanej mapie restrykcyjnej, który to region ma służyć jako „cel“ dla kierowanej miejscem integracji oraz sposobność do określenia (stosując pBR322 jako „cel“ integracji) czy wchodzący plazmid zawiera kompletną jednostkę funkcjonalną lub gen, czy jedynie część żądanego genu. Przykładowo, plazmid zawierający tylko fragment 3' genu XPR2 mógłby transformować przyjmujący go XPR2-1002, jeśli zawierałby on kodon typu dzikiego i integrował w locus XPR2. Jednak ten sam plazmid nie mógłby transformować gospodarza XPR2-1002 dając fenotyp proteazo-dodatni, jeśli byłby zintegrowany w . pBR322, ponieważ nie zawiera on kompletnej jednostki funkcjonalnej.

Tak więc, w transformantach Y. lipolytica posiadających obszar homologii z heterologicznym DNA wektora, obszar ten, zawierający egzogenny DNA służy jako miejsce przyjmujące podczas integracyjnej transformacji tych Y. lipolytica. Poza pBR322 i jego pochodnymi, do wytwarzania transformantów Y. lipolytica posiadających tę tzw. platformę dokowania można zastosować kosmidy, bakteriofagi, takie jak M13 i lambda, DNA otrzymany syntetycznie oraz powszechnie znane plazmidy, takie jak pUC13.

Termin sekwencja promotora LEU2 oznacza niepodlegający translacji region przez ATG. Zawiera on większość, jeśli nie wszystkie cechy wymagane dla ekspresji.

Termin sekwencja promotora XPR2 oznacza nie podlegający translacji region przed sekwencją (lub pre-sekwencją) sygnałową. Jest on niezbędny dla ekspresji. Ponadto, można zastosować sekwencję sygnałową z genu XPR2 (z/lub bez presekwencji) dla uzyskania wydzielania białek pod kontrolą promotorów ekspresyjnych Y. lipolytica innych niż gen XPR2. Zatem, wektory posiadające promotorLEU2 i sekwencje sygnałowe dla wydzielania alkalicznej proteazy są zdolne do spowodowania wydzielania przez transformowaną komórkę Y. lipolytica dojrzałego heterologicznego białka.

Ludzka anafilotoksyna C5a, znana również jako białko dopełniacza C5a (ludzka C5a) jest biologicznie aktywnym odcinkiem polipeptydowym powstającym in vivo w wyniku aktywacji

156 255 dopełniacza. Działa ona jako immunomodulator w regulacji pewnych aspektów humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Struktura pierwszorzędowa tej anafilotoksyny oraz innych anafilotoksyn została już wyjaśniona. Ich własności chemiczne, fizyczne i właściwości biologiczne zostały opisane przez Hugli'ego w „Complement, pod redakcją H. J. MullerEberhard'a i P. A. Miescher'a, str. 73-79 (1985) wydawca, Springer-Verlag, Nowy Jork.

Dla specjalistów jest zrozumiałe, że w niniejszym wynalazku, po dokonaniu niezbędnych zmian, może być zastosowany heterologiczny DNA kodujący dowolną znaną sekwencję aminokwasową.

Ujawniona tutaj metodologia, po dokonaniu niezbędnych zmian, nadaje się do zastosowania w produkcji i wydzielaniu dowolnego znanego białka heterologicznego. Przykłady takich białek są podane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 532 207. Poza tym, zamiast genu XPR2 można zastosować dowolny inny gen z Y. lipolytica kierujący wydzielaniem białek, na przykład geny dla rybonukleazy czy kwaśnej proteazy oraz geny hybrydowe, konstruowane przez połączenie fragmentów dwóch lub więcej tych genów, na przykład sekwencji sygnałowej genu XPR2 i sekwencji promotora genu dla rybonukleazy.

Zakresem wynalazku objęte są również funkcjonalne równoważniki opisanych powyżej DNA lub sekwencji nukleotydowych. Degeneracja kodu genetycznego pozwala na podstawienie niektórych kodonów innymi kodonami określającymi ten sam aminokwas, przez co można uzyskać zwiększone wytwarzanie tego samego białka.

DNA lub nukleotydowe sekwencje mogą różnić się znacznie, ponieważ z wyjątkiem metioniny i tryptofanu, znane aminokwasy kodowane są przez więcej niż jeden kodon. Tak więc część lub cały gen XPR2 można syntetyzować, otrzymując sekwencję DNA znacznie się różniącą od przedstawionej na fig. 3. Powinna być jednak zachowana kodowana przez ten gen sekwencja aminokwasowa. Takie funkcjonalne zmiany danej sekwencji DNA lub nukleotydowej dają sposobność do pobudzania wydzielania i/lub przetwarzania heterologicznych białek kodowanych przez przyłączone do niej sekwencje obcego DNA. Wszystkie zmiany sekwencji nukleotydowej genu XPR2 i jej fragmentów dopuszczalne w zakresie kodu genetycznego są zatem również objęte zakresem wynalazku.

Jest również możliwe wykonanie delecji kodonów lub podstawienie jednego lub więcej kodonów przez kodony inne niż kodony zdegenerowane, co prowadzi do wytworzenia polipeptydu o zmodyfikowanej strukturze, ale takiego, który ma takie samo zastosowanie lub aktywność jak polipeptyd wytwarzany przez cząsteczkę niezmodyfikowanego DNA. Te dwa polipeptydy są funkcjonalnie równoważne, tak jak równoważne są te dwie cząsteczki DNA, które wywołują ich zwiększone wytwarzanie, nawet jeśli różnice między tymi cząsteczkami DNA nie są związane z degeneracją kodu genetycznego. Najprostszym tego przykładem jest prorenina A i prorenina B, dwie formy alleliczne proreniny, różnicące się jedynie obecnością reszty kwasu asparaginowego w pozycji 286 w proreninie A i obecnością reszty glicyny w tej samej pozycji w proreninieB.

Stosując tę metodologię, uzyskano ekspresję i wydzielanie heterologicznych białek ssaków -proreniny i ludzkiej anafilotoksyny C5a w Y. lipolytica, stosując sygnały ekspresji i wydzielania z genów Y. lipolytica XPR2 i/lub LEU2. Sekwencje DNA dla proreniny lub ludzkiej anafilotoksyny C5a łączy się poprzez syntetyczne oligonukleotydy z sekwencją genu XPR2 w miejscach, które przypuszczalnie zawierają kod dla peptydu sygnałowego alkalicznej proteazy albo w miejscach kierujących przetwarzaniem prekursora proteazy, oznaczonych jako pro 1 i pro 2 i stosuje się je do wytworzenia konstruktorów genu. Następnie, dokonuje się insercji tych konstruktów do Y. lipolytica poprzez transformację integracyjną. Hodowle rekombinantowe wytwarzają heterologiczne białka o ciężarze cząsteczkowym i reaktywności immunologicznej znamiennej dla proreniny i ludzkiej anafilotoksyny C5a i wydzielają te białka do środowiska wzrostu. Przypuszcza się, że tak wytworzona prorenina jest pofałdowana w konfiguracji natywnego białka, gdyż po usunięciu propeptydu wykazuje pełną aktywność enzymatyczną.

Termin materiał rekombinantowego DNA oznacza każdy materiał zawierający co najmniej jeden z następujących składników: gen XPR2 z Y. lipolytica; sekwencję sygnałową (lub presygnałową), pro 1 - i pro 2- (które łącznie stanowią proregion); sekwencję promotora lub terminatora tego genu; promotor LEU2, oraz funkcjonalne równoważniki powyższych sekwencji możliwe z racji degeneracji kodu genetycznego.

156 255

Takim reprezentatywnym materiałem rekombinantowego DNA są fragmenty DNA, plazmidy lub wektory albo transformanty, zawierające niektóre lub wszystkie z wyżej wymienionych sekwencji.

Materiały. Endonukleazy, restrykcyjne i ligazę T4 otrzymano z New England Biolabs, bakteryjną fosfatazę alkaliczną otrzymano z Bethesda Research Laboratories, kinaza polinukleotydowa T4 pochodziła z Pl-Biochemicals a y-³⁴ P-ATP pochodził z firmy New England Nuclear. Wszystkie enzymy stosowano w warunkach zalecanych przez dostawcę.

Podłoża. Podłoże GPP (glicerol/pożywka: proteaza-pepton) zawierała w litrze: 6,7 g glicerolu, 1,6 g proteaza-pepton „lDfco“, 1 ,'7 g wyciągu (drożdżowego „Difco Xeass Nitrogen Base“ bez aminokwasów i siarczanu amonowego, 30 mg uracylu i 0,5 ml/litr glikolu polipropylenowego o ciężarze cząsteczkowym 2000 (Polysciences) w 40 mM buforze fosforanowym (pH 6,8) (w hodowlach przeznaczonych do stosowania w próbach oznaczania reniny glikol polipropylenowy nie występował). Pożywkę proteazowo-paptynową oddzielnie sterylizuje się w autoklawie w buforze fosforanowym.

Podłoże YEPD - (podłoże: wyciąg drożdżowy /pepton?/ /glikoza/ zawierało w litrze: 5g wyciągu drożdżowego, 10 g peptonu i 20 g giikozy.

Hodowlę E.coli prowadzono na podłożu LB w temperaturze 37°C. Podłoże LB zawierało w litrze: 10 g Bactotryptonu, 10 g wyciągu drożdżowego „Bacto“, 10 g chlorku sodowego; pH podłoża doprowadzano do wartości 7,5 wodorotlenkiem sodowym.

Analiza sekwencji · DNA. Odcinki DNA z różnych plazmidów izolowano w żelach poliakryloamidowych i oznaczano ich sekwencje metodą Maxam'a i wsp., Methods in Enzymology 65,449 (1980).

Metody ligacji. Odcinki DNA, w tym pocięte wektory plazmidowe poddawano ligaj przez zmieszanie żądanych komponentów (odcinków DNA z końcami odpowiednio zmodyfikowanymi, aby zapewnić prawidłowe łączenie z ligazą DNA T4. Na mikrogramowe ilości fragmentów wektora i insertu stosowano około 10 jednostek ligazy. Produktami reakcji ligacji transformowano kompetentne komórki E.coli K12, szczep MM294 (ATCC 33625) lub HB101 (ATCC, 33694).

Wytwarzanie syntetyzowanego chemicznie DNA. W celu skonstruowania genów hybrydowych kodujących ekspresję i sekrecję proreniny, syntetyzuje się 8 oligonukleotydów zmodyfikowaną metodą z zastosowaniem pochodnych amidofosfinowych (Sinha i wsp., Tetrahedron Letters 24, 5843 (1983) w automatycznym aparacie do syntezy DNA „Genetic Design 6500“ (Watertown, MA). Oligonukleotydy te oczyszcza się w 20% żelach poliakryloamidowych z dodatkiem 6M mocznika. Odpowiednie ilości komplementarnych oligonukleotydów miesza się i łączy ze sobą w odcinki dwuniciowe (przyżarza) w temperaturze 4°C przez dobę w buforze TE (10 mM tris-HCl; pH 8'0,1 mMNaEDTA). Odpowiednie ilości (około 2//g)dwuniciowych oligonukleotydów fosforyluje się w 20μ1 mieszaniny reakcyjnej zawierającej 70 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCh, 5 mM ditiotreitolu, 5 mM ATP, w temperaturze 37°C, stosując kinazę polinukleotydową T4.

Wytwarzanie plazmidowego DNA. Wytwarzanie plazmidowego DNA na dużą skalę prowadzi się metodą Holmes'a i wsp., Anal. Biochem. 114, 195-197 (1981) i następnie wiruje się w gradiencie gęstości bromku etidium i CaCl. Minipreparatywne ilości plazmidowego DNA przygotowuje się stosując metodę alkalicznej ekstrakcji w połączeniu z elektroforezą żelową - wobec SDS, opisaną przez Birmboim'a i wsp., NAR1, 1513 (1979).

Konstrukcja wektorów ekspresyjno-wydzielniczych dla proreniny. Dla otrzymania finalnych wektorów ekspresyjnych wykonuje się serię różnych konstrukcji. Wszystkie etapy są schematycznie przedstawione na załączonych figurach. Na ogół, odcinki DNA izoluje się w procesie elektroforezy żelowej i poddaje ligacji z innymi odcinkami albo z przeciętnym plazmidowym DNA w 20 μ1 buforu 50 mM Tris HC1 (pH7,5), 10 mM MgCh, 20 mM ditiotreizolu, 1 mM ATP, wobec 200 jednostek ligazy T4, w temperaturze 4°C. Tam, gdzie wymagane jest częściowe trawienie DNA endonukleazą restrykcyjną, optymalny czas reakcji rozszczepiania oznacza się eksperymentalnie.

Identyfikacja proreniny w płynie hodowli, Transformanty drożdży zawierające wektory ekspresyjne hoduje się przez dobę na podłożu GPP (patrz powyżej). Po odwirowaniu komórek drożdży do każdej próbki płynu hodowli w ilości 5 ml dodaje się 1 ml 50% TCA i utrzymuje się w temperaturze 4°C w czasie 60 minut. Osady otrzymane w wyniku wirowania przemywa się dwu8

156 255 krotnie 2 ml zimnego acetonu. Wytrącone białko rozpuszcza się w 100μ1 buforu próbki SDS i poddaje elektroforezie na 10% żelach poliakryloamidowych - wobec SDS [Laemmli U.K., Naturę 227, 680 (1970)]. Białka rozdzielone na żelu przenosi się elektroforetycznie na nitrocelulozę (Schleicher i Schuell; 0,22μπι) i identyfikuje proreninę wykonując analizę immunologiczną typu „biot (bibułowa) wycinków żelu [Hawkes R. i wsp., Anal. Biochem. 119, 142 (1982)]. Na filtry nawarstwia się przeciwciała przeciw proreninie królika i inkubuje się ze skonjugowanymi peroksydazą kozimi przeciwciałami przeciw IgG królika (Cappel, Malvern, Pa). Związane przeciwciała wykrywa się przez barwienie 4-chloro-ł-naftolem i nadtlenkiem wodoru.

Oznaczanie aktywności proreniny w płynie hodowli w próbie ścinania mleka. Płyny hodowli różnych transformantów Y. lipolytica oznacza się na aktywność ścinania mleka stosując modyfikację Ernstroma J. Dairy Sci. 41,1664(1958). Pokrótce, metoda polega na pomiarze czasu, w którym renina zawarta w aktywowanych supernantach hodowli ścina buforowane oddzielone od śmietanki mleko i porównaniu tych wartości ze standardem oczyszczonej reniny. Hodowle drożdży (25 ml) poddaje się wzrostowi przez dobę w podłożu GPP. Po odwirowaniu komórek, próbki po 5 ml supernantów hodowli liofilizuje się. Każdą próbkę liofilizowanego supernantu zawiesza się ponownie w 300 μ1 wody destylowanej. Jako standardowe próbki kontrolne przygotowuje się seryjne rozcieńczenia oczyszczonej proreniny cielęcej. Proreninę zawartą w koncentratach podłoży i w próbkach kontrolnych aktywuje się przez dodanie około 5 do 10μ1 stężonego HC1, do osiągnięcia pH około 2 i inkubację przez godzinę w temperaturze 22°C. Zbierane mleko przygotowuje się przez dodanie 60 g suchego sproszkowanego zbieranego mleka (Difco) do 500 ml roztworu zawierającego 41,5 mM octanu sodowego (ph 6,3) i 13,6 mM CaCb t mieszanie w czasie 20 minut w temperaturze 4°C. Mleko to stosuje się do prób bezpośrednio po przygotowaniu. Do ilości 1 ml tego zbieranego mleka w temperaturze 37°C dodaje się po 60μ1 (ilość równoważna 1 ml supernantu hodowli) każdego preparatu enzymu i mierzy czas ścinania mleka.

Wytwarzanie syntetycznych oligonukleotydów dla genu anafilotoksyny C5a. Oligonukleotydy stosowane do syntezy genu strukturalnego dla anafilotoksyny C5a przygotowuje się na drodze chemicznej zmodyfikowaną metodą poprzez pochodne amidofosfinowe (Sinha i wsp. cyt. powyżej) w automatycznym aparacie do syntezy DN A „Genetic Design 6500“ (Watertown, MA) z nośnikiem szklanym o kontrolowanej wielkości porów. Według przepisu, do odszczepiania grupy trójfenylometylowej stosuje się 3% (wag./obj.) kwas dwuchlorooctowy w dwuchlorometanie, liniowe aktywowanie pochodnej amidofosfinowej nasyconym roztworem tetrazolu w acetonitrylu, zablokowanie nieprzereagowanych grup OH nukleozydu związanego z nośnikiem za pomocą tetrazolidu diotoksyfosfiny i utlenianie mieszaniną: wodny roztwór jodu/THF (Matteucci i wsp., J. Amer, Chem Soc. 105, 3183). Całkowity czas jednego cyklu addycji wynosi 14 minut. Otrzymuje się dziesięć 47-merów (segmenty A-J na fig. 9) ze średnią wydajnością 98,8%/etap (oznaczoną metodą analizy grupy trójfenylometylowej). Segmenty te odblokowuje się metodą Matteucci i wsp. (cyt. powyżej), wytrąca etanolem z 0,3 M roztworu octanu sodowego i izoluje metodą preparatywnej elektroforezy na 10% żelach denaturujących: poliakryloamid-mocznik, po czym prowadzi się reakcję tworzenia odcinków dwuniciowych (przyżarzania).

Konstruowanie, klonowanie i analiza sekwencji genu ludzkiej anafilotoksyny C5a. Na fig. 9 przedstawiono sekwencję aminokwasową tego białka oraz rozmieszczenie syntetycznych oligonukleotydów wymagane dla powstania genu kodującego białko ludzkiej anafilotoksyny C5a. Wszystkie oligomery, z wyjątkiem A i F fosforyluje się na końcach 5', stosując kinazę polinukleotydową T4. Skonstruowanie tego genu wymaga przeprowadzenia dwóch pierwszorzędowych reakcji tworzenia odcinków' 'dwuniciowych („przyżarzania) i ligacji oligomerów A, B, I i J oraz oligomerów C, D. E, F, G i H. Otrzymane odcinki dwuniciowego DNA o długości 94 pary zasad i 141 par zasad izoluje się po elektroforezie w 10% żelu poliakryloamidowym, poddaje reakcji ligacji i otrzymany produkt o długości 235 par zasad izoluje się metodą elektroforezy żelowej. Ten odcinek DNA o długości 235 par zasad, zawierający gen strukturalny anafilotoksyny C5a włącza się przez insercję pomiędzy miejsca EcoRI i Hindlll w DNA wektora pBr322 i transformuje do kompetentnych komórek F.coii K12, szczep HB101. Analiza restrykcyjna plazmidowego DNA wyizolowanego z 6 transformantów wykazuje, że 5 spośród 6 klonów zawiera fragment. EcoRI/Hindlll o właściwej długości. Sekwencję nukleotydową regionu genu anafilotoksyny C5a każdego z tych plazmidów oznacza się metodą Maxam'a i wsp., Methods Enzymol. 65, 499 (1980).

156 255

Konstrukcja i charakteryzacja plazmidu zawierającego gen ekspresji anafilotoksyny C5a do transformowania E.coli. Postępowanie przy izolacji odcinka DNA i warunki reakcji ligacji są opisane przez Maniatisa i wsp., Molecular Cloning: A laboratory Manuał, Cold Spring Harbor (1982). region promotor trp-operator z E.coli otrzymano po raz pierwszy z ptrpLl [Edman i wsp., Naturę, 291,503 (1981)]. Odcinek EcoRI o długości 360 par zasad, zawierający sekwencję: promotor trp-operator, stosowany w plazmidzie ekspresyj nym genu anafilotoksyny C5a (pC5a-48) izoluje się z plazmidu ekspresyjnego genu proreniny pPFZ-R2, opisanego w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0 147 178 z 3 lipca 1985 r.

Identyfikacja anafilotoksyny C5a w płynie hodowli Y. lipolytica. Stosuje się taką samą procedurę, jak opisano powyżej dla proreniny, z tym, że w teście immunologicznym stosuje się kozie przeciwciała przeciw anafilotoksynie C5a i królicze przeciwciała przeciw IgG kozy (Cappel). Kozie przeciwciała przeciw ludzkiej anafilotoksynie C5a otrzymuje się metodą Manderino i wsp., J. Immunol. Methods 53, 41-50 (1982).

Wektory. pLD40 - opisany w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0 138 508 z 24 kwietnia 1985 r.

Mikroorganizmy:

ATCC 20774 Yarrowia lipolytica PC 30869

ATCC 20781 Yarrowia lipolytica DLI 12-PC-30869 transformowany genem XPR2,

ATCC 20776 Yarrowia lipolytica DL-148. Transformant Y. lipolytica ATCC 20688 zawierający plazmid pLS-3 trawiony Sna BI,

ATCC 20775 Yarrowia lipolytica DL-144. Transformant

Y. lipolytica'ATCC 20688 zawierający niecięty pLS-3

ATCC 20777 Transformant Y. lipolytica PC-30869 zawierający plazmid pC5aX-3 trawiony SnaBI,

ATCC 20778 Transformant Y. lipolytica PC-30869 zawierający plazmid pXX-l 1 trawiony SnaBI,

ATCC 20779 Transformant Y. lipolytica PC-30869 zawierający plazmid pXX-22 trawiony SnaBI,

ATCC 20780 Transformant Y. lipolytica PC-30869 zawierający plazmid pXX-33 trawiony SnaBI,

ATCC 20794 Transformant Y. lipolytica PC-30869 zawierający plazmid pLD56,

ATCC 20795 Transformant Y. lipolytica ATCC 20794 zawierający plazmid pLX-34 trawiony Nrul.

Na mocy porozumienia Budapesztańskiego mikroorganizmy te są zdeponowane w American

Type Culture Collection, Rockville, Maryland ogólnie znanym muzeum, zapewniającym niezmienność szczepów i powszechną dostępność, jeśli na to zgłoszenie zostanie udzielony patent. Zdeponowane szczepy są dostępne w czasie trwania tymczasowej ochrony zgłoszenia osobom określonym przez Komisarza Urzędu Patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki jako do tego uprawnionych, zgodnie z 37 CFR 1.14 i 35 Kodeksu Stanów Zjednoczonych Ameryki 122 oraz w krajach, w których dokonano zgłoszenia niniejszego wynalazku, zgodnie z prawem patentowym danego kraju. Wszystkie ograniczenia dostępności zdeponowanych mikroorganizmów będą nieodwołalnie zniesione po udzieleniu patentu.

Badania -taksonomiczne Y. lipolytica ATCC 20774 (w kolekcji firmy Pfizer Inc. oznaczone jako PC 30869) zostały przeprowadzone przez dr J. R. DeZeeuw, który sporządził poniższy opis. W badaniach tych zastosowano metody zalecane przez J. L. Lodder'a w „The Yeasts“, II wydanie, N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970.

Dla porównania prowadzono badania CBS 599, hodowli typowej dla gatunku Candida lipolytica („The Yeasts“, II wydanie, N. Holland Publishing Co., Amsterdam 1970) i CBS 6124, hodowli typowej dla Saccharomcopsis lipolytica („The Yeasts, III wydanie). Wcześniej gatunek ten był

156 255 oznaczony jako Endomycopsis lipolytica. Jego niedoskonałą formą jest Candida lipolytica. Pozycję taksonomiczną tego gatunku ustalił van de Walt i von Arx, Antonie van Leeuwenboek, 46, 517-521 (1980). Obecnie zalecaną nazwą jest Yarrowia lipolytica.

Charakterystyka hodowlana, morfologiczna i fizjologiczna szczepu PC-30869 odpowiada standardowemu opisowi dla gatunku opisanego jako Saccharomycopsis lipolytica w „The Yeasts“, III wydanie, pod redakcją Kryger-va Rij, str. 406-408, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam 1984.

Tabela 1

Oznaczenie firmy Pfizer	Źródło	Genotyp
PC-30265	NRRL YB-423 (również CBS 6124), typowa hodowla w „The Yeasts, III wyd.	Diploid typu dzikiego
PC-286	CBS 599, typowa hodowla w „The Yeasts, II wyd.	Haploid MATA typu dzikiego
PC-30869	patrz poniżej	MATB bio-6 lcu2-40 xpr2-1002

PC-30869 otrzymuje się przez genetyczną rekombinację odpowiednich mutantów Y. lipolytica PC-22208, wyizolowanych w firmie Pfizer z gleby i Y. lipolytica PC-30026, podhodowli NRRL-Y1094. Pod względem fenotypowym PC-30869 różni się od szczepów rodzicielskich dzikiego typu tym, że: (1) nie wytwarza aktywnej pozakomórkowej proteazy alkalicznej, (2) do wzrostu wymaga biotyny i (3) wymaga źródła L-leucyny.

Podczas fazy wzrostu logarytmicznego PC-30869 na podłożu: ekstrakt drożdżowy-peptonglikoza (YEPD) pączkujące komórki są owalne i mają średnie wymiary 2,6 X 5,5 mikronów. Na agarze YEPD wyróżniają się: pseudo-grzybnia i grzybnia właściwa. Obecne są blastospory występujące głównie pojedynczo w pozycjach pleuralnych. Nie stwierdza się barwników karoteonoidowych. Hodowla zachowuje się jak haploid o typie kojarzenia „B“ w próbach krzyżowania z porównawczymi, szczepami testowymi tego gatunku (tabela 5).

Na agarze V8 obserwuje się typową askosporulację. Dane dotyczące asymilacji węgla przedstawiono w tabeli 2. Fermentacja nie zachodzi. Jedynymi źródłami azotu przyswajalnego są: jon amoniowy i mocznik ale nie azotan (tabela 3).

Szczep PC-30869 wymaga jako witamin tiaminy i D-biotyny (tabela 4). Hodowle rodzicielskie dzikiego typu wymagają tylko tiaminy. W temperaturze 37°C nie obserwuje się wzrostu.

Szczep PC-30869 różni się od innych szczepów Y. lipolytica opisanych w literaturze patentowej, czego dowodzi porównanie ich cech fenotypowych (tabela 7 i 8).

Szczep 20228 (Nubel i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr4 155 811) cechuje odżywianie dzikiego typu. Zachowuje się on tak, jak szczepy typowe dla gatunku, CBS 599 i CBS 6124. Nie wymaga on do wzrostu uracylu, leucyny lub biotyny i rozpłynnia żelatynę.

Szczep ATCC 20628 (DeZeeuw i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 407 953) odmiennie niż ATCC 20228 wymaga do wzrostu dodatku leucyny. Podobnie jak ATCC 20228 nie wymaga do wzrostu uracylu lub biotyny i również rozpłynnia żelatynę.

Szczep ATCC 20688 (opis zgłoszenia patentowego europejskiego nrO 138 508) rośnie tylko wówczas, jeśli podłoże zawiera zarówno uracyl jak leucynę. Te wymagania w stosunku do uracylu odróżniają szczep ATCC 20688 zarówno od ATCC 20228 jak i ATCC 20628. ATCC 20688 nie wymaga biotyny i rozpłynnia żelatynę.

Hodowla PC-30869 różni się od wszystkich powyższych. Wymaga ona do wzrostu biotyny i leucyny ale nie uracylu. Nie rozpłynnia żelatyny.

156 255

T a b e1a 2 Asymilacja węgla

Źródło węgla	Odniesienie do opisu w literaturze'67	Hodowla
3X265	3X286	3X869
L-arabinoza	-	-	-	-
Celobioza	-	-	-	-
Erytryt (butanotetraol)	+	+++	+++	+++
D-galaktoza	-	-	-	-
D-glikoza	+	+++	+++	+++
Inozytol	-	-	-	-
Laktoza	-	-	-	-
Maltoza	-	-	-	-
D-Mannito!	-r	+++	+++	+++
Rafinoza	-	-	-	-
Rybitol	-	-	-	-
D-ryboza	-./+/	-	-	++
L-Ramnoza	-	-	-	-
Skrobia rozpuszczalna	•	-	-	-
Sacharoza	-	-	-	-
Trechaloza	-	-	-	-
D-Ksyloza	-	-	-	-
Kwas bursztynowy	+	+++	+++	+++
Kwas cytrynowy	+	+++	+++	+++

(a) Jako podłoże podstawowe stosowano podłoże azotowe, Bactoyeast z dodatkiem 10pg/litr D-biotyny i 149 mg/litr chlorowodorku estru etylowego L-leucyny, co odpowiada 11X)mg/litr L-leucyny.

(b) Kreger-van Rij (cytowany powyżej).

Tabela 3 Przyswajanie azotu

Źródło azotu	Odniesienie do opisu . w literaturze767	Hodowla
3X265	3X286	3X869
/NH4/2SO4	+	+++	+++	+++
KNO3	-	-	-	-
Mocznik	+	+++	+++	+++

^a' Jako podłoże podstawowe stosowano podłoże wąglowe Bacto-yeast z dodatkiem 116mg/litr soli sodowej kwasu keto-izokapronowego (co jest równoważne 1X) mg/litr L-leucyny) i 10pg/litr D-biotyny.

/b/ Kreger-van Rij (cytowany powyżej).

Tabela 4

Wymagania witaminowe ^/a/

Dodatek do podłoża podstawowego 7c7	Odniesienie do opisu w hteratuize76'	Hodowla
3Θ265	3Θ286	3Θ869
Bez dodatku	-	ślady	ślady	-
Tiamina HC1	-(-	+++	+++	-
D-biotyna	-	ślady	ślady	ślady
Tiamina Tbiotyna		+++	+++	+++

/a/ Jako podłoże podstawowe stosowano podłoże drozdzowe Bacto bez witamin oraz 149 mg/litr chlorowodorku estiu etylowego L-leucyny (co odpowiada 100mg/litr L-leucyny).

/b/ Kreger-van-Rij (cytowany powyżej).

/c/ 2XX//g/htr chlorowodorku tiaminy i/lub !Xpg/litr D-biotyny, według wskazania w' tabeli.

156 255

Tabela 5 Askosporulacja

Szczep porównawczy _	Hodowla
30265	30286	30869
Brak (samoskojarzenie)	-i-+	-	-
30264 (typ kojarzenia A)	++	-	+++
30267(typ kojarzenia B)	++	+++	-

/a/ Hodowle 30264 i 30267 są szczepami haploidalnymi o typie kojarzenia odwrotnego, udostępnionymi grzecznościowo przez dr L. J. Wickerham'a. Są one opisane w Science 167, 1141 (1970).

/b/ 30264 jest szczepem C. lipolytica YB-421 opisanym przez Wickerham'a.

/c/ 30267 jest szczepem C. lipolytica YB-423-12 opisanym przez Wickerham'a.

Tabela 6

Inne cechy charakterystyczne

Hodowla

30869

Odniesienie do opisu_ w literaturz.e^/a/

30265

30286

Kształt komórek	owalny	owalny	owalny	owalny
Średnie wymiary komórek
(w mikronach)	/2-4,5/x/4-22/	3,3x9,1	3,0 x 8,2	2,6 x 5,5
Rozmnażanie wegetatywne	pączkowanie	pączkowanie	pączkowanie	pączkowanie
Fermentacja	nie zachodzi	nie zachodzi	nie zachodzi	nie zachodzi
Wzrost w temperaturze 37°C	brak	brak	brak	brak

Wzrost kolonii

Te trzy kolonie rosną podobnie, zgodnie z opisem literaturowym. Wyróżnia się grzybnia rzekoma i właściwa. Obecne są plastospory, głównie pojedynczo w pozycjach pleuralnych. Nie stwierdza się barwników karotenoidowych.

/a/ Kreger-\an Rij (cytowany powyżej).

Tabela 7

Wymagania składników odżywczych

Hodowla .	Składniki odżywcze pominięte w podłożu
brak	leucyna	uracyl	biotyna
CBS 599	+++	+++	+++	+++
CBS 6124	+++	+++	+++
ATCC 20228	+++	+++	+ H-	+++
ATCC 20628	+++	-	+++	+++
ATCC 20688	+++	-	-	+++
PC-30869	+++	-	+++	-

Pełne podłoże zawiera 16,7 g/litr wyciągu drożdżowego Bacto bez witamin 4- lOOmg/litr uracylu, lOOmg/litr L-leucyny, 10gg/litr D-biotyny i 200/zg/litr chlorowodorku tiaminy.

Tabela 8

Hodowla	Rozpłynnianie
CBS 599	+
CBS 6124	+
ATCC 20228	+
ATCC 20628	+
ATCC 20688	+
PC-30869	-

Podłoże zawiera 120 g/litr żelatyny i 16,7 g/litr wyciągu drożdżowego Bacto bez witamin oraz lOOmg/litr uracylu, lOOmg/litr L-leucyny, Dgg/litr D-biotyny i 200gg/litr chlorowodorku tiaminy.

156 255 13

Figura 1 przedstawia częściową liniową mapę restrykcyjną częściowo pokrywających się plazmidów pLD 57, pLD 58 i pLD 62, wyizolowanych z Y. lipolytica, szczep DL 112;

Figura 2 - syntetyczne oligonukleotydowe sondy dla genu XPR2. W opublikowanej sekwencji dla większości z pierwszych 25 reszt aminokwasowych dojrzałej proteazy (Ogrydziak i wsp., cytowany powyżej) dwa regiony (oznaczone jako I i II) stwarzają możliwość zsyntetyzowania 14-merowych sond oligonukleotydowych z 32-krotną lub mniejszą degeneracją. Te dwa regiony zaczynają się odpowiednio od aminokwasów 7 i 18. Dla każdego regionu przygotowano cztery różne mieszane sondy o 8-krotnej degeneracji i oznaczono numerami od 170 do 186. W przewidywanych kwasach nukleinowych, sekwencje oznaczone znakiem X oznaczają wszystkie cztery zasady, sekwencje oznaczone jako U oznaczają obydwie zasady purynowe a sekwencje oznaczone jako Y oznaczają obydwie zasady pirymidynowe. Fig. 3 - sekwencję nukleotydową genu XPR2, w której uwidoczniony jest promotor, pre-sekwencja (-157 do -136), prol (-135 do -98), pro2 (-97 do -1), oraz sekwencje dla zewnątrzkomórkowej proteazy i sekwencje terminatora; Fig. 4 - schemat konstruowania sekwencji dla wektora terminatora pterm 4; Fig. 5 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pIS-3; Fig. 6 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pXX-33; Fig. 7 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pXX-22; Fig. 8 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pXX11; Fig. 9 - sekwencję aminokwasową ludzkiej anafilotoksyny C5a; Fig. 10 - mapę restrykcyjną plazmidu pC5a-48; Fig. 11 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pC5aX-3; Fig. 12-sekwencję nukleotydową genu LEU 2; Fig. 13-schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pLX-34.

Analiza sekwencji genu XPR2. Analizę sekwencji DNA w sklonowanym genie XPR2 prowadzi się metodą degradacji chemicznej [Maxam i wsp., Methods Enzymol, 65,499 (1980)] pokrywających się częściowo odcinków restrykcyjnych otrzymanych z plazmidów pLD 57, pLD 58, pLD 62 (fig. 1) oraz pLD 84 i pLD 86 (patrz poniżej). Wyniki analizy wskazują, że sklonowane genomowe DNA drożdży rzeczywiście zawierają gen dla pozakomórkowej alkalicznej proteazy. Sekwencja nukleotydową genu XPR2 oraz wyprowadzona z sekwencji nukleotydowej sekwencja aminokwasowa prekursora alkalicznej proteazy łącznie z jego sekwencją sygnałową przedstawiona jest na fig. 3. Dotychczas duża część sekwencji aminokwasowej pozakomórkowej proteazy była nieoznaczona (Ogrydziąk i wsp., cytowany powyżej) i w niniejszym opisie jest przedstawiona po raz pierwszy.

Ponadto, po raz pierwszy opisane są tu sekwencje wymagane dla ekspresji i wydzielania pozakomórkowej proteazy. Sekwencja DNA kodująca alkaliczną proteazę, jej prekursor i sekwencje sygnałowe składają się z 1362 par zasad (fig. 3). Z sekwencji tej wyprowadzono strukturę pierwszorzędową łańcucha tego polipeptydu. Zawiera ona 454 reszt aminokwasowych. Alkaliczna proteaza jest syntetyzowana w komórce w formie prekursora, który jest proteolitycznie przetwarzany w formę dojrzałą, wydzielaną poza komórkę. Analiza N-terminalnej sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z sekwencji nukleotydowej ujawniła w cząsteczce prekursora obecność dotychczas domniemanego peptydu sygnałowego. Ten peptyd sygnałowy zawiera 22 reszty aminokwasowe a jego cechy strukturalne są podobne do cech peptydów sygnałowych w wyższych organizmach prokariotycznych i eukariotycznych [Perlman i wsp., J. Mol. Biol., 167, 391 (1983)]. Region w wyprowadzonej sekwencji aminokwasowej, zasadniczo zgodny ze znaną N-terminalną sekwencją 25 aminokwasów dojrzałej alkalicznej proteazy [Ogrydziąk i wsp., J. Gen. Microbiol., 128,1225 (1982)], jest poprzedzony 157-mioma resztami aminokwasowymi, zawierającymi peptyd sygnałowy i dwa miejsca podlegające trawieniu trypsyną (Lys-Arg). Te miejsca rozszczepia się do podzielenia pro-regionu na pro 1 (-135 do -98) oraz pro 2 (-97 do -1), (patrz fig. 3).

Jak wynika z sekwencji nukleotydowej, dojrzała alkaliczna proteaza zawiera 297 aminokwasów. Sekwencje aminokwasowe różnych form proteazy, wyprowadzone z sekwencji nukleotydowej są w zgodzie z rozmiarami oczyszczonych form tego enzymu. Poza strukturalną sekwencją prekursora alkalicznej proteazy oznaczono sekwencję flankującą -5' o wielkości około 500 par zasad i sekwencję flankującą -3' o wielkości 600 par zasad. Analiza tych regionów wykazała, że zawierają one sekwencje analogiczne do sekwencji innych promotorów i terminatorów eukariotycznych i również są niezbędne dla ekspresji alkalicznej proteazy.

156 255

Jak wspomniano powyżej, w opisie patentowym europejskim nrEPO1385O8 podana jest metodologia transformowania Y. lipolytica i klonowania genów Y. lipolytica przez komplementację mutacji, łącznie z klonowaniem genu XPR2 zawierającego kod dla wydzielania alkalicznej proteazy na drodze komplementacji mutacji xpr2. Opisana tam metoda polega na transformowaniu szczepu gospodarza Y. lipolytica produktem częściowego trawienia banku genów Y. lipolytica w wektorze pLD40 enzymem Bg III. Wektor ten charakteryzuje się tym, że zawiera mały segment zawierający region LEU 2 z Y. lipolytica oraz następujące miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych: 3 miejsca dla Eco RI, 4 miejsca dla Eco RV, 6 miejsc dla Aval, 1 miejsce dla Bg III, 1 miejsce dla Nco I, 1 miejsce dla Apa I, 2 miejsca dla Xho I i 1 miejsce dla Bst XI. Jeden z transformantów Y. lipolytica XPR2 użyto do wyodrębnienia genu typu dzikiego (plD84 i pLD86) pochodzącego z Y. lipolytica NRRL Y-1094 i użyto go do konstruowania wektora ekspresyjno-wydzielniczego, co jest opisane w przykładzie I.

Analiza sekwencji genu LEU 2. Analizę sekwencji DNA genu LEU 2 klonowanego w plazmidzie pLD25 (opis patentowy europejski nr 0 138 508) wykonuje się metodą degradacji chemicznej [Maxam i wsp., Methods Enzymol. 65,499 (1980)] pokrywających się częściowo odcinków restrykcyjnych. Dla zlokalizowania regionu kodującego dehydrogenazę β-izopropylojabłczanu (IPM) i właściwej ramy odczytu wykorzystano sekwencję aminokwasową wyprowadzoną z oznaczonego wcześniej genu LEU 2 z S. cerevisiae [Andreatis i wsp., J. Biol. Chem. 259,8059 (1984)]. Zidentyfikowano region genomowej sekwencji Y. lipolytica, kodujący sekwencję aminokwasową, homologiczny z regionem dla sekwencji białkowej w S. cerevisiae. Sekwencja nukleotydowa genu LEU 2 o wielkości 2,8 kilopar zasad oraz wyprowadzona z sekwencji nukleotydowej sekwencja aminokwasowa β-dyhydrogenazy-IPM jest przedstawiona na fig. 12. Ponadto w niniejszym opisie po raz pierwszy opisano sekwencje wymagane dla ekspresji /3-dyhydrogenazy-IPM w Y. lipolytica. Sekwencja DNA zawierająca kod dla tego białka złożonego z 405 aminokwasów, składa się z 1215 par zasad (fig. 12).

Poza sekwencją kodującą /3-dyhydrogenazę-IPM, oznaczono sekwencję flankującą -5' o długości 798 par zasad oraz sekwencję flankującą -3' o długości 797 par zasad (w tym kodon zakończenia translacji TAA). Analiza tych regionów wykazała, że zawierają one sekwencje analogiczne do sekwencji innych promotorów i terminatorów eukariotycznych i że odgrywają one podstawową rolę w ekspresji.

W genie Y. lipolytica LEU 2, region znajdujący się „w górę od 5' zawiera sekwencję TATATATA zlokalizowaną w odległości 78 par zasad przed początkiem translacji i 30 par zasad przed przypuszczalnym miejscem startowym dla informacyjnego RNA. Następną sekwencją ważną dla inicjowania transkrypcji u eukariotów jest tzw. skrzynka CATT, która w genie LEU 2 jest zlokalizowana w odległości 74 par zasad przed przypuszczalnym miejscem początku transkrypcji znajdującym się w odległości -48 par zasad od ATG (fig. 12).

Region „w dół“ od 3', za kodonem stopu TAA zawiera sekwencję od siedemdziesiątego drugiego do studwudziestego nukleotydu, homologiczną do proponowanej przez Zareta sekwencji 5'-TAG....TA/T/GT...TTT-3' [Zaret i wsp., Celi., 28, 563 (1982)], odpowiedzialnej według tego autora za zakończanie transkrypcji w S. cerevisiae.

Przykład I. Jako szczep gospodarza stosuje się ATCC20774 (MATB leu-2-40 bio-6 xpr21002). Transformant XPR2, Y. lipolytica ATCC 20781, wykrywa się jako kolonię tworzącą strefę na płytkach indykatorowych zbieranego mleka po posiewach na płytki-repliki z płytek z podłożem bez leucyny. Z tego transformantu wypreparowuje się chromosomalny DNA stosując metodę podaną w opisie patentowym europejskim nr 0 138 508. DNA ten stosuje się do wyizolowania genu dla wydzielanej proteazy. Ten chromosomalny DNA trawi się częściowo enzymem Bg lii, poddaje ligacji z odcinkiem wektora zawierającym zarówno replikon E.coli jak i gen oporności na ampicylinę, z utworzeniem cząsteczki kolistej i stosuje się do transformowania E.coli. Chromosomalny DNA trawi się również enzymem Sali i stosuje w próbie Southern'a, która wykazuje, że normalny region LEU 2 w transformancie nie jest uszkodzony (jako sondę stosuje się odcinek Sal-I-Eco RI o długości 520 par zasad z regionu LEU 2, znajdujący się w kierunku 5' od odcinka LEU 2 zawartego w plazmidzie pLD40). Ponieważ do integracji plazmidu pochodzącego z banku w Y. lipolytica wymagana jest homologia, to miejscem integracji musi być region XPR2.

156 255 15

Z Y. lipolytica ATCC 20781 wyodrębnia się początkowo 3 częściowo pokrywające się lecz różne plazmidy: pLD 57, pLD 58 i pLD 62. Są one przedstawione na fig. 1. Próby hybrydyzacji z sondami syntetycznych oligonukleotydów dla genu XPR2, zsyntetyzowanych w oparciu o znaną sekwencję pierwszych 25 reszt aminokwasowych dojrzałego wydzielanego białka proteazy (fig. 2 i 3) wykazują, że gen dla wydzielanej proteazy został skolonowany. Dla określenia, czy wyodrębniony gen jest kopią typu dzikiego, czy kopią zmutowaną, przyjmujący ten gen szczep Y. lipolytica transformuje się plazmidem pLD 58. Ponieważ nie otrzymano proteazo-dodatnich transformantów z żadnego z transformantów niezależnych od leucyny, wyciągnięto wniosek, że pLD 58 zawiera zmutowaną allelę tego genu.

Formę genu XPR2 obecną w szczepie dzikiego typu - NRRL Y-1094 otrzymuje się w próbach hybrydyzacji kolonii E.coli. Jako sondę stosuje się odcinek Pvul do EcoRI o długości 2 kilopary zasad, który, jak wynika z danych dotyczących sekwencji, powinien zawierać cały gen strukturalny. Z oryginalnego banku odcinków DNA pochodzących z częściowego trawienia enzymem Sau3A DNA NRRL Y-1094 w plazmidzie pLD40, opisanego w opisie patentowym europejskim nr 0138508 otrzymuje się szereg kolonii, które hybrydyzują z tą sondą. Dwie z tych kolonii zawierają bardzo podobne plazmidy oznaczone symbolami pLD 84 i pLD 86. Plazmidy te stosuje się do przygotowania wektorów ekspresyjnych. Obydwa te plazmidy zawierają ten sam koniec 5': region XPR2 - miejsce dla Sau -3A (które przyłącza się i regeneruje miejsce dla BamHI w wektorze), od którego zaczyna się sekwencja przedstawiona na fig. 3. Każdy z tych plazmidów zawiera cały gen strukturalny dla proteazy, przypuszczalny terminator transkrypcji oraz cały insert z regionu XPR2 szczepu NRRL Y-1094 o wielkości 4 do 5 kilopar zasad. Insert w plazmidzie pLD 86 zawiera przy końcu 3' kilkaset dodatkowych par zasad. Ponieważ do konstruowania wektora ekspresyjnego użyliśmy przedłużenie 3' jako miejsca dla Bg lii (para zasad 2655) plazmidy te zawierają DNA, który jest funkcjonalnie identyczny co do sekwencji z DNA przedstawionym na fig. 3.

Konstruowanie wektorów ekspresyjno-wydzielniczych. Dla uzyskania ekspresji i wydzielania proreniny w Y. lipolytica opracowano plan skonstruowania różnych genów hybrydowych w integrującym wektorze przeznaczonym do klonowania. W takim podejściu, konstruuje się szereg różnych plazmidów posiadających długie regiony zwykłych sekwencji DNA. W rzeczywistości, zastosowano modułowy schemat konstrukcji wektorów z insercją genu dla proreniny w kierunku 3' do przypuszczalnego miejsca przetwarzania peptydu sygnałowego XPR2, przypuszczalnego miejsca przetwarzania pro 1- oraz miejsca rozszczepiania, o którym wiadomo, że generuje dojrzałą alkaliczną proteazę. W zasadzie, dla uzyskania ekspresji jest pożądane, aby dokonywać insercji heterologicznego genu pomiędzy sekwencjami promotora i terminatora drożdżowego. Zakłada się, że część N-terminalna sekwencji genu hybrydowego będzie się różnić w różnych konstrukcjach plazmidowych, lecz w każdej konstrukcji plazmidu ekspresyjnego powinna być zawarta taka sama sekwencja genu strukturalnego proreniny, sekwencja terminatora XPR2 oraz DNA wahadłowego wektora drożdżowo-bakteryjnego (shuttle vector).

W założeniach planu przyjąto, że w każdej konstrukcji plazmidu ekspresyjnego powinien być użyty ten sam odcinek genu strukturalnego dla proreniny i terminator/wektor, co jest opisane poniżej. Różne konstrukcje plazmidów dla ekspresji i wydzielania proreniny różnią się w regionie bezpośrednio za sekwencją promotora genu XPR2 pod względem długości N-terminalnej sekwencji dla prekursora alkalicznej proteazy, która poprzedza sekwencję genu dla proreniny. Tak więc, komponentę odcinka promotora w każdym plazmidzie ekspresyjnym zaprojektowano jako sekwencję zmienną w regionie połączenia: XPR2 - prorenina. Wszystkie wektory ekspresyjnowydzielnicze skonstruowano w podobnych reakcjach ligacji z użyciem trzech odcinków składowych.

Etapy doświadczalne zastosowane podczas konstruowania wektora terminatora pterm4 przedstawione są na fig. 4. Syntetyczny linker poddaje się ligacji z odcinkiem zawierającym koniec 3' genu XPR2 łącznie z sygnałami zakańczania transkrypcji i poliadenylacji. Pokrótce, plazmid pLD84 trawi się endonukleazą KpnI i poddaje ligacji z syntetycznym, dwuniciowym linkerem DNA przedstawionym na fig. 4. Produkt ligacji rozszczepia się endonukleazami Hindlll i Bg III i wyizolowany odcinek o długości 760 par zasad włącza się przez insercję do plazmidu pLD41 doprowadzonego upizednio do postaci liniowej tymi samymi dwiema endonukleazami. Otrzymuje

156 255 się plazmid pterm4. Plazmid ten jest scharakteryzowany mapą restrykcyjną. Zanalizowano odcinki powstałe w wyniku seryjnego trawienia endonukleazami restrykcyjnymi: EcoRV, KpnI, BglU-Hindllł i BglH-Bcll. W wyniku tego trawienia otrzymuje się odpowiednie odcinki potwierdzające obecność syntetycznego linkera i „całkowitego końca 3' genu XPR2 w wahadłowym (shuttle) plazmidzie pLD41 opisanym w publikacji zgłoszenia europejskiego nrO 138 508. Częściowa mapa restrykcyjna tego wektora terminatora o długości 7,3 kilopar zasad jest przedstawiona na fig. 4.

Konstruowanie plazmidu ekspresyjno-wydzielniczego pLS-3. Na fig. 5 przedstawiona jest konstrukcja pierwszego plazmidu użytego do wywołania sekrecji proreniny w Y. lipolytica. Na tej figurze jest przedstawiona mapa restrykcyjna tego plazmidu. Konstrukcję plazmidu zawierającego kod dla wydzielania proreniny rozpoczyna się od przygotowania odcinka zawierającego główną część genu strukturalnego dla proreniny. Z plazmidu pPFZ-84A E.coli zawierającego kod ekspresji proreniny izoluje się po częściowym trawieniu enzymami BclI-BamHI, fragment DNA o długości 1080 par zasad, zawierający sekwencje kodujące reszty aminokwasowe proreniny od 6 do 365. (Plazmid pPFZ-84A jest pochodną plazmidu ekspresyjnego dla proreniny pPFZ-R2, którego konstruowanie jest opisane w opisie patentowym europejskim nr 0 147 178. Plazmid ten otrzymano na drodze mutagenezy kierowanej syntetycznym oligonukleotydem, z zastosowaniem wymiany odcinka restrykcyjnego. Plazmid pPFZ-84A różni się od plazmidu pPFZ-R2 tylko dwiema parami zasad kodującymi reszty aminokwasowe proreniny 214 (Asn -— Asp) i 286 (Asp -— Gly), to znaczy, zawiera on kod tak zwanej alleli proreniny A. Obydwa plazmidy zawierają jednakże potrzebną sekwencję dla proreniny i w tym przykładzie są równoważne).

Komponentę odcinka promotora, zawierającą sekwencje kodujące prekursor alkalicznej proteazy, aminokwasy 1 do 157 i proreninę, aminokwasy 1 do 5, przygotowuje się w sposób następujący:

Z pod-klonowego genem XPR plazmidu pLD 90 izoluje się odcinek DNA HindIII-Aval o długości 870 par zasad, zawierający region promotora i koniec 5' genu alkalicznej proteazy. Odcinek ten poddaje się ligacji z syntetycznym fragmentem o strukturze:

5' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3'

3' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTATGGATCCTAG 5' kierunek odczytu -———--—

Powstała sekwencja zawiera lepki koniec Ava I, po którym następują sekwencje ostatnich 9 kodonów dla propeptydu alkalicznej proteazy, a za nimi, sekwencje kodujące cztery pierwsze aminokwasy proreniny i kończy się miejscem dla BamHI.

Komponentę odcinka promotora przygotowuje się w standardowej reakcji ligacji fragmentu syntetycznego z odcinkiem HindIII-AvaI o długości 870 par zasad, wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hindlll i BamHI. Powstałe zligowane sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, oddzielając odcinek DNA Hindlll-BamHI o długości 916 par zasad. Koniec 3' genu hybrydowego otrzymuje się z plazmidu: terminator/wektor, pterm 4, opisanego powyżej. Plazmid pterm 4 trawi się enzymami Hindlll i Bc II, po czym z żelu agarozowego izoluje się fragment terminator/wektor Hindlll-Bc II o długości 7,3 kilopar zasad, zawierający terminator XPR2, marker selekcyjny LEU 2 i pBR322.

Plazmid pLS-3, zawierający kod ekspresji i wydzielania proreniny otrzymuje się przez inkubację trzech opisanych powyżej składowych odcinków DNA (trawiony HindUI-BclI plazmid pterm 4, promotor Hindlll-BamHI o długości 916 par zasad oraz odcinek BAMHI-Bcl I o długości 1080 par zasad, zawierający gen proreniny) w obecności ligazy T4 (patrz fig. 5).

Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczep MM 294 metodą Dagerta i wsp. z użyciem CaCk [Gene, 6,23-28 (1979)]. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pLS-3 identyfikuje się jego mapę restrykcyjną (fig. 6A). Dla potwierdzenia prawidłowej sekwencji syntetycznego DNA i właściwego połączenia żądanych odcinków prowadzi się analizę sekwencji regionu XPR2 - prorenina w tym plazmidzie.

156 255

Przygotowanie plazmidu pLD 90. Plazmid ten zawiera podklon z plazmidu pLD 84. Region DNA rozciągający się od miejsca dla Pvul w regionie promotora XPR2 do miejsca dla EcoRI w regionie terminatora podklonowuje się do miejsca dla Hindlll w plazmidzie pBR322 w sposób następujący: Kilka (kilkanaście) mikrogramów pLD 84 trawi się wyżej wymienionymi enzymami restrykcyjnymi: Następnie, na lepkie końce trawionych cząsteczek DNA działa się fragmentem Klenowa polimerazy DNA I. Następnie, końce łączy się z poddanymi uprzednio działaniu kinazy linkerami Hindlll (CAAGCTTG, z firmy New England Biolabs) za pomocą ligazy DNA T4. Nadmiar linkerów usuwa się i generuje się lepkie końce Hindlll przez następne trawienie tym enzymem. Mieszaninę cząsteczek DNA rozdziela się w preparatywnym żelu agarazowym i wycina się żądane pasmo o długości 2 kilopar zasad. Po oczyszczeniu stosuje się go do reakcji ligacji z traktowanym bakteryjną fosfatazą alkaliczną wektorem pBR322 po jego uprzednim trawieniu enzymem Hindlll. Mieszaninę po ligacji stosuje się do transformowania kompetentnych komórek E.coli. Plazmid o orientacji takiej, że miejsce dla Eco RI terminatora XPR2 jest bliżej miejsca dla Eco RI w plazmidzie pBR322 nazwano pLD 90 a plazmid o orientacji odwrotnej nazwano pLD 91.

Kraniec 5' regionu promotora XPR2 włączony do pLS-3 jest miejscem dla Pru I o długości około 280 par zasad, licząc od początku obszaru podanego na fig. 3. Okazało się, że plazmidy zawierające gen proteazy dzikiego typu pod kontrolą jedynie tej części promotora, jeśli zostaną zintegrowane z genomem w miejscu z dala od znajdującego się w nim locus xpr2, nie nadają transformantowi zdolności wytwarzania dużych ilości proteazy (co określono wielkością strefy klarowania na płytkach ze zbieranym mlekiem).

Zauważyliśmy, że jeśli pLS-3 zawiera skrócony, a zatem jakby niekompletny promotor, to wówczas zintegrowana cząstka, powstała w wyniku rekombinacji między plazmidem a. obecnym tam genem XPR2 dzikiego typu mogłaby dawać kompletny promotor kierujący ekspresją produktu fuzyjnego prochymozyny ale niekompletny promotor kierujący ekspresją proteazy. Analogiczny typ doświadczenia przerywania genu przeprowadził z genem aktyny S.cerevisiae Shortle i wsp. [Science 217, 371-373 (1982)]. Zgodnie z naszymi oczekiwaniami, niektóre leucyno-niezależne transformanty pLS-3 były istotnie ubogie w proteazę. Być może transformanty ubogie w proteazę są bardziej pożądanymi produktami integracji w locus XPR2 niż niepożądane produkty uboczne, takie jak konwertanty genowe w locus leu 2. Okazało się, że w przyjmującym szczepie ATCC 20688, niecięty pLS-3 generował 6,5% transformantów ubogich w proteazę, podczas gdy plazmid cięty enzymem SnaBI dawał około 70% transformantów ubogich w proteazę. Aspekt rozerwania genu w tej transformacji został zastosowany dla ominięcia potrzeby wykonania wielkiej ilości prób Southerna dla znalezienia właściwie zintegrowanej cząstki spośród wszystkich transformantów.

Plazmidy zawierające gen strukturalny proteazy dzikiego typu pod kontrolą promotora XPR2 (zaczynający się sekwencjami przedstawionymi na fig. 3), jeśli zostaną włączone do komórek Y. lipolytica i zintegrowane w miejscu innym niż locus xpr2, wywołują ekspresję znacznych ilości proteazy. Jednak wydajna ekspresja genów heterologicznych z tego rodzaju integrantów może wymagać dalszej modyfikacji tego kontrolnego regionu DNA.

Wydzielanie proreniny. Y. lipolytica, szczep ATCC 20688 transformuje się DNA nieciętego plazmidu pLS-3 i DNA plazmidu pLS-3 trawionego przez SnaBI, otrzymując odpowiednio transformanty xpr” leu+ AtCc 20775 (DL 144) i ATCC 20776 (DL 148). Te szczepy transformantów posiewa się do probówek testowych na podłoże YEPD i poddaje wzrostowi przez dobę w temperaturze 28°C. Ilość 250/1 tych hodowli rozcieńcza się ilością 25 ml podłoża GPP (rozcieńczanie 1: 100) i prowadzi hodowlę w kolbach w trzęsąwce w temperaturze 28°C przez 16-18 godzin, do czasu uzyskania absorbancji przy 600 nM = 5,0-7,0. Komórki zbiera się przez wirowanie. Otrzymany płyn hodowli lub supernatant analizuje się na obecność proreniny przez zatężenie supernantu i poddanie analizie elektroforetycznej w żelu poliakryloamidowym wobec SDS. Wycinek żelu przenosi się elektroforetycznie na bibułę nitrocelulozową w roztworze zawierającym 20 mM zasady Tris, 150 mM glicyny, 20% metanolu i 500 jednostek ampicyliny przez 2 godziny w temperaturze 4°C. Usunięcie białka z wycinka żelu sprawdza się przez barwienie błękitem Coomassie.

Bibułę nitrocelulozową suszy się w temperaturze 37°C i ogrzewa w temperaturze 65°C przez godzinę, po czym przemywa w roztworze TBS (200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). Bibułę tę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut w roztworze TBS zawierającym 10%

156 255 surowicy końskiej (Gibco, Chagrin Falls, Ohio) i następnie inkubuje w roztworze TBS zawierającym 10% surowicy końskiej i odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała przeciw proreninie przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Bibułę przemywa trzykrotnie przez 10 minut w roztworze TBS, następnie inkubuje w roztworze TBS zawierającym 1(0¹% surowicy końskiej, a po tym inkubuje przez 2 godziny w roztworze TBS zawierającym 10%c surowicy końskiej i odpowiednie rozcieńczenie koziego przeciwciała przeciw IgG królika skonjugowanego z peroksydazą chrzanu.

Bibułę przemywa się trzykrotnie przez 10 minut w roztworze TBS i wywołuje w roztworze TBS z dodatkiem 0,01% nadtlenku wodoru, w obecności 4-chłoro-l-naftolu (3mg/ml, w metanolu), dodanego w takiej ilości, aby uzyskać stężenie 0,5 mg/ml.

W obydwu supernantach stwierdza się obecność proreniny o ciężarze cząsteczkowym 40000.

W próbkach przygotowanych z hodowli transformantów ATCC 20775 i 20776, zawierających pLS-3, występuje znaczna aktywność ścinania mleka po aktywacji kwasem zatężonych supernantów hodowli (patrz powyżej). Jak oczekiwano, w supernancie kontrolnej hodowli szczepu wyjściowego Y. lipolytica ATCC 20688 nie stwierdza się aktywności ścinania mleka.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-33. Na fig. 6 przedstawiona jest modyfikacja polegająca na przeprowadzeniu plazmidu pLS-3 w ulepszony plazmid ekspresyjny pXX-33. W modyfikacji tej, powiększa się region promotora XPR2 o 280 par zasad. Tak jak w przypadku plazmidu pLS-3, ekspresyjny plazmid pXX-33 zawiera gen hybrydowy kodujący cały pre-propeptyd (157 reszt aminokwasowych) alkalicznej proteazy, który to gen jest przyłączony do sekwencji kompletnego genu strukturalnego kodującego proreninę.

Przed konstruowaniem plazmidów ekspresyjno-wydzielniczych dla proreniny zawierających sekwencję promotora XPR2 powiększoną o 280 par zasad w stosunku do pLS-3, niezbędne jest podklonowanie odcinka restrykcyjnego zawierającego kompletny gen alkalicznej proteazy do miejsca Hindlll. Taki podklon preparuje się przez podłączenie syntetycznych linkerów do odcinka restrykcyjnego wyizolowanego z banku klonów genomowego XPR2 w pLD86. Konstruowanie podklonu XPR2 z „górnym miejscem dla Hindlll rozpoczyna się od przygotowania odcinka DNA zawierającego cały gen alkalicznej proteazy. Fragment otrzymany w wyniku częściowego trawienia enzymami EcoRI-BamHI o długości 2,3 kilopar zasad genomowego regionu klonu XPR2 w pLD-86 oczyszcza się przez elektroforezę w żelu agarozowym i poddaje ligacji z syntetycznym fragmentem o sekwencji:

5' GATCGAAGCTTG 3'

3' TTCGAACTTAA 5'

Ta sekwencja linkera zawiera lepki koniec BamHI (lecz nie regeneruje miejsca BamHI), po którym następuje miejsce dla Hindlll a następnie lepki koniec EcoRI. Produkt ligacji trawi się za pomocą Hindlll i dokonuje insercji w miejscu dla Hindlll w plazmidzie pBR322. Plazmid pXHP24 identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne. Stanowi on źródło odcinków promotora XPR2 dla następnych konstrukcji plazmidowych.

Gen XPR2 podklonowany w plazmidzie pXHP-24 zawiera w swej sekwencji 5' promotora XPR2 o około 280 par zasad więcej niż sekwencja promotora XPR2 w plazmidzie pLS-3. Komponentę odcinka promotora wytwarza się w standardowej reakcji ligacji odcinka syntetycznego DNA (opisanego powyżej dla pLS-3) z odcinkiem HindIII-Aval o długości 1150 par zasad, pochodzącym z pXHP-24, za pomocą ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hindlll i BamHI. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy żelowej, oddzielając fragment HindUI-BarnHI o długości około 1196 par zasad. Drugi odcinek zawierający sekwencje kodujące reszty aminokwasowe proreniny od 6 do 151 preparuje się z plazmidu pLS-3 przez trawienie enzymami BamHI i Xmal i następne oczyszczanie na drodze elektroforezy żelowej otrzymanego odcinka BamHI-XmaI o długości 440 par zasad.

Trzeci odcinek zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora, wytwarza się z pLS-3 przez trawienie za pomocą Hindlll i Xmal i następne oczyszczanie na drodze

156 255 elektroforezy żelowej fragmentu wektora HindIII-XmaI o długości 8,0 kilopar zasad. Te trzy odcinki poddaje się ligacji metodą standardową opisaną powyżej. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coliK12, szczep MM 294. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pXX-33 identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne (fig. 6). Dla właściwego potwierdzenia żądanych odcinków wykonuje się analizę sekwencji regionu proteaza-prorenina w tym plazmidzie.

Plazmidem pXX-30, po jego uprzednim trawieniu enzymem SnaBI transformuje się Y. lipolytica ATCC 20774, otrzymując Y. lipolytica ATCC 20780. Proreninę wydzielaną do podłoża przez transformowane hodowle oznacza się w sposób opisany powyżej dla pLS-3. Stwierdza się obecność proreniny w supernancie hodowli. Po aktywacji kwasem zatężonych supernantów hodowli obserwuje się znaczną aktywność ścinania mleka w próbkach przygotowanych z transformantowej hodowli Y. lipolytica ATCC 20780.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-22. Etapy konstruowania ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-22 przedstawione są na fig. 7. Między tym wektorem ekspresyjnym a pLS-3 występują dwie różnice. Podobnie jak pXX-33, zawiera on dodatkowy segment o długości 280 par zasad w sekwencji promotora XPR2. Po drugie, zawiera on sekwencję kodującą peptyd sygnałowy alkalicznej proteazy i tylko 38 reszt aminokwasowych pro-peptydu (pro 1).

Schemat konstruowania pXX-22 jest analogiczny do schematu dla pXX-33. Na początku przygotowuje się komponentę odcinka promotora w standardowej ligacji odcinka HindlH-BglH o długości 890 par zasad, pochodzącego z pXHP-24 z syntetycznym odcinkiem o sekwencji:

5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3'

3' AACGACTCTAGTGATCCTAG 5' wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hindlll i BamHI. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się na drodze elektroforezy w żelu, izolując odcinek DNA HindlII-BamHI o długości 920 par zasad.

Drugi odcinek, kodujący reszty aminokwasowe proreniny od 6 do 151 izoluje się z pLS-3 przez trawienie BaMHI i Xmal i następne oczyszczanie w żelu, otrzymanego odcinka BamHI-XmaI o długości 440 par zasad. Trzeci odcinek, zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora preparuje się przez trawienie pLS-3 enzymami Hindlll i Xmal i oczyszczanie na drodze elektroforezy żelowej fragmentu wektora o długości około 8,0 kilopar zasad. Następnie dokonuje się ligacji tych trzech odcinków DNA, stosując standardową, opisaną powyżej procedurę. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coliK12, szczep MM294. Z wyselekcjonowanych transformantów izoluje się plazmidy i plazmid pXX-22 identyfikuje się przez mapę restrykcyjną (fig. 7).

Plazmidem pXX-22 uprzednio trawionym enzymem SnaBI transformuje się Y. lipolytica ATCC 20774 otrzymując Y. lipolytica ATCC 20779. Proreninę wydzielaną przez transformowane hodowle do podłoża hodowli oznacza się w sposób opisany dla pLS-3. Obecność proreniny w supernancie hodowli stwierdza się wyżej opisaną metodą. Po aktywacji kwasem zatężonych supernantów hodowli (patrz powyżej) obserwuje się znaczną aktywność ścinania mleka w próbkach transformowanych hodowli Y. lipolytica ATCC 20779.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-ll. Etapy eksperymentalne zastosowane do konstruowania plazmidu ekspresyjno-wydzielniczego proreniny pXX-ll przedstawiono na fig. 8. Ten plazmid zawiera sekwencję promotora XPR2 i sekwencję dla 22 reszt aminokwasowych peptydu sygnałowego, przyłączone do sekwencji kodującej proreninę. Schemat konstruowania plazmidu pXX-ł 1 jest podobny do schematu zastosowanego dla pXX-22 i pXX-33. Pokrótce, komponentę odcinka promotora przygotowuje się w standardowej reakcji ligacji fragmentu Hindlll-Bg 11 o długości 750 par zasad pochodzącego z pXHP-24 z syntetycznym odcinkiem o sekwencji:

156 255

TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG

5'

3' AGGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5' wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hindlll i BamHI. Połączone sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy izolując odcinek DNA Hindlll-BamHI o długości 790 par zasad. Drugi odcinek, kodujący reszty aminokwasowe proreniny od 6 do 151 izoluje się z pLS-3 przez cięcie enzymami BamHI i Xmal i oczyszcza się na drodze elektroforezy żelowej izolując odcinek DNA BamHI-XmaI o długości 440 par zasad. Trzeci odcinek zawierający pozostałą część genu strukturalnego proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora wahadłowego (shuttle vector) preparuje się przez trawienie plazmidu pLS-3 enzymami Hindlll i Xmal i oczyszcza na drodze elektroforezy żelowej. Izoluje się odcinek wektora długości około 8,0 kilopar zasad.

Następnie, te trzy odcinki DNA poddaje się ligacji stosując opisaną powyżej metodę standardową. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczep MM294. Z wyselekcjonowanych transformantów izoluje się plazmidy i plazmid pXX-l 1 identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne (fig. 8). Dla potwierdzenia właściwej sekwencji tego syntetycznego DNA i prawidłowego połączenia żądanych odcinków, prowadzi się analizę sekwencji części XPR2prorenina w tym plazmidzie.

Plazmidem pXX-1l, uprzednio trawionym enzymem SnaBI transformuje się Y. lipolytica ATCC 20774 otrzymując Y. lipolytica ATCC 20778. Proreninę wydzielaną do podłoża hodowli przez transformowane komórki oznacza się w sposób opisany dla pLS-3. Obecność proreniny w supernancie hodowli stwierdza się wyżej opisaną metodą. Próba na ścinanie mleka (patrz powyżej) wykazuje znaczną aktywność ścinania mleka w supernancie hodowli transformantów ATCC 20778 zawierających plazmid pXX-l 1.

Przykład II. Konstruowanie tzw.platformy dokowania. Gen BIO dzikiego typu, odpowiadający alleli bio-6 w szczepie ATCC 20774 klonuje się przez komplementację w sposób następujący.

Konstruuje się bank genów trawionego częściowo enzymem Sau 3A chromosomalnego DNA Y. lipolytica, włączonych w miejscu dla BamHI w plazmidzie pLD40 (pLD40 jest plazmidem pBR322 + LEU 2 w miejscu dla EcoRI) i przygotowuje się dużą ilość DNA tego banku w postaci mieszaniny z preparatem plazmidowym z hodowli E.coli (jest to ten sam bank, który stosuje się do klonowania genu XPR2). Kilka (kilkanaście) mikrogramów DNA z tego banku trawi się enzymem Apal (który daje jedno cięcie w regionie Leu-2). Następnie, ten DNA stosuje się do transformowania AT CC 20774 (leu 2 xpr2 bio), posiewając mieszaninę transformacyjną na płytki z syntetycznym podłożem nie zawierającym leucyny. Otrzymuje się dziesiątki tysiący transformantów leucynoniezależnych. Dla wykrycia kolonii, które zawierają plazmidy banku z genem BIO, transformanty leucyno-niezależne posiewa się techniką replik na płytki agarowe z podłożem selekcyjnym pod względem biotyny. Podłoże to w ł litrze zawiera: 25 mg destiobiotyny,· 20 g glikozy, 5 g siarczanu amonowego, 1 gKH2PO4,0,5g MgSOę X7HaO,0,l gCaCl2,0,l gNaCl, 500pg kwasu borowego, 400//g chlorowodorku tiaminy, 400pg ZnSO4X7H2O, 400pg MnSO4XH2O, 200jug Na2MoO X 2 H2O, 200pg FeCla X 6 H2O, 100pg KJ i 40pg CuSO4 X H2O.

Jeden z kilku transformantów BIO+ Y. lipolytica mających zdolność wzrostu na podłożu selekcyjnym pod względem biotyny nazwano DL31. Następnie, ze szczepu Y. lipolytica DL31 odzyskuje się plazmid z banku genów, zawierający gen BIO. Z hodowli szczepu DL31 preparuje się chromosomalny DNA. Kilka mikrogramów tego chromosomalnego DNA trawi się enzymem restrykcyjnym Apa I dla wycięcia plazmidu pochodzącego z banku. Pewną ilość trawionego DNA poddaje się reakcji ligacji dla zamknięcia pierścienia nieznanego plazmidu z banku.

Następnie, mieszaninę ligacyjną stosuje się do transformowania hodowli . E.coli dla nadania jej oporności na ampicylinę, w celu odzyskania nieznanego plazmidu zawierającego BIO w E.coli. Otrzymuje się kilka opornych na ampicylinę transformantów E.coli. Z tych transformantów E.coli wykonuje się preparaty plazmidowe w małej skali.

Produkty trawienia enzymami restrykcyjnymi tak otrzymanego plazmidowego DNA dowodzą, że jak oczekiwano, nieznany plazmid zawierający gen BIO jest równoważny z plazmidem pLD40 z insercją w miejscu BamHI. Plazmid ten musi pochodzić z banku genów - nadano mu nazwę pLD51.

156 255 21

Plazmid pLD56 generuje się jako podklon plazmidu pLD51 przez usunięcie z pLD51 genu Leu 2 w sposób następujęcy: Pewną ilość plazmidu pLD51 trawi się enzymem E.coRI dla usunięcia regionu LEU2. Trawiony DNA poddaje się reakcji ligacji dla utworzenia postaci kolistej plazmidu, następnie prowadzi się transformację E.coli w celu podklonowania mniejszego plazmidu zawierającego gen BIO. Jeden z opornych na ampicylinę transformantów E.coli zawiera oczekiwany mniejszy plazmid, któremu nadano nazwę pLD56. Prowadzi się szereg reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi tego plazmidu. Segment zawierający gen BIO w plazmidzie pLD56 jest insertem w pBR322 w miejscu dla BamHI i ma długość około 3,6 kilopar zasad.

Poniżej podana jest bardzo pobieżna mapa restrykcyjna insertu o długości 3,6 kilopar zasad DNA Y. lipolytica, podłączonego w miejscu dla BamHI plazmidu pBR322 (zawierającego pLD56). Przybliżone odległości (wyrażone w parach zasad) od początku insercji podane są w nawiasach. Oznaczeń wielkości dokonano na podstawie kilku analiz w żelach agarozowych; są one obarczone stosunkowo dużymi błędami ilościowymi: PvuII (800), PvuII (1200), Pstl (1800), Mlul (2000), Pstl (2300), EcoRV (2700), Ncol (3200). Dla orientacji, miejsce dla Sal I w plazmidzie pBr322 powinno poprzedzać opisane miejsca a miejsce dla Hindlll powinno znajdować się za nimi.

Szczep ATCC 20774 (MATB leu-2-40 bio-6 xpr2-1002) transformuje się intaktnym pLD56 (pBr322 + około 3,6 kilopar zasad chromosomalnego DNA Y. lipolytica zawierających gen BIO). Trzy różne transformanty biotyno-niezależne testuje się na wysoką częstość transformacji ciętego przez Nrul (cel w pBr322) pLD40 (gen LEU 2 wpBr322) w stosunku do szczepu rodzicielskiego, dla określenia, który z nich zawiera region tkwiącego w nim pBr322 zintegrowany z genem BIO. Wszystkie trzy transformanty mają zdolność transformacji z wysoką częstością ponieważ pLD40 jest zintegrowany z zawartym w nich pBr322. Potwierdzają to próby hybrydyzacji Southerna typu „blot“. Jeden z trzech nowych transformantów ΒΙΟ Y. lipolytica otrzymał nazwę DL 118 i został użyty jako biorca DNA. Sporządzenie powyższej mapy restrykcyjnej było potrzebne w celu określenia: (I) co można zastosować jako ΒΙΟ-specyficzną sondę hybrydyzacyjną (odcinek NcolPvuII), (II) jaki enzym jest potrzebny dla prawidłowego cięcia plazmidu pLD56 (Mlu I), (III) który enzym tnie tylko raz w obszarze pBr322 (Ciał) i (IV) jaki enzym nie dokonuje żadnych cięć w plazmidzie (Apal).

Próby hybrydyzacji Sothcrna produktów trawienia DNA z ATCC 20774 i DL 118 enzymami Ciał i Apal (jako sondę stosuje się odcinek - BIO) wykazują, że jak oczekiwano, region biotyny w DL 118 (w porównaniu do regionu BIO w ATCC 20774) jest rozdzielony insercją DNA o wielkości odpowiadającej pLD56. Produkty trawienia DNA DL 118 przez Mlul (jako sondę stosuje się pBR322) również wykazują insercję o takiej samej wielkości jak intaktny pLD56.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pLX-34. Konstruje się plazmid ekspresyjny, który umieszcza sekwencję kodującą proreniny wraz z sygnałami wydzielniczymi XPR2 (157 aminokwasów pre-pro-sekwencji) w dół od promotora LEU2. Ten plazmid ekspresyjny jest dowodem na to, że dla uzyskania wydzielania heterologicznych białek można użyć promotora innego niż promotor XPR2. Ten wektor ma ponadto zdolność wywoływania ekspresji i wydzielania niezależnie od miejsca integracji w genomie Y. lipolytica. Uzyskanie wydzielania proreniny z użyciem promotora innego niż promotor XPR2 demonstruje możliwość skonstruowania wektora ekspresyjnego w celu identyfikacji nowych alternatywnych silnych promotorów w Y. lipolytica. Takie założenie może być zastosowane do wytwarzania hodowli szczepu wykazującego ekspresję, z dwoma oddzielnymi hybrydowymi genami proreniny, zintegrowanymi w różnych miejscach w genamie gospodarza, przy czym ekspresja jednego jest wywołana przez promotor LEU2, a drugiego - przez promotor XPR2.

Na figurze 13 przedstawione są etapy eksperymentalnie konstruowania wektora ekspresyjnego,· który zawiera gen proreniny z sygnałami sekrecji alkalicznej proteazy (157 aminokwasów prepro-sekwencji XPR2), przy czym ekspresja tego genu jest wywoływana przez sekwencję promotora LEU2. Konstruowanie tego plazmidu rozpoczyna się od preparowania odcinka promotora LEU2 zawierającego około 300 par zasad nie podlegającej translacji sekwencji 5', poprzedzającej kodon inicjacji translacji ATG w genie dehydrogenezy /J-izopropylojabłezanu (fig. 12). Z wektora wahadłowego (shuttle vector) pLD40 izoluje się odcinek DNA Hindlll-FokI o długości 300 par zasad, zawierający porcję 270 par zasad sekwencji promotora LEU2. Ten odcinek poddaje się ligacji wobec ligazy T4 z syntetycznym linkerem o długości 54 pary zasad o sekwencji;

156 255 ______ Leu2 ------Foki

5' - ATACAACCACACACATCCACAATG 3' - TTGGTGTGTGTAGGTGTTAC

—.-χ p _r 2AAGCTCGTTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC -3'

TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC -5' a następnie poddaje się trawieniu enzymem Hindlll. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się na drodze elektroforezy żelowej izolując odcinek DNA HindIII-BgII o długości około 360 par zasad. Następną komponentę, to znaczy odcinek kodujący pozostałą część prepor-sekwencji XPR2 i pierwsze 152 reszty aminokwasowe proreniny izoluje się z plazmidu ekspresyjnego pXX-33 (fig. 6) przez trawienie enzymami Bgll i Xmal. Otrzymany odcinek DNA o długości 887 par zasad oczyszcza się przez elektroforezę żelową. Trzeci odcinek zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora preparuje się przez cięcie plazmidu pXX-33 enzymami Hindlll i Xmal i oczyszczanie na żelu fragmentu wektora o długości około 8,0 kilopar zasad. Te trzy odcinki DNA poddaje się ligacji standardową metodą opisaną powyżej. Mieszaninę ligacyjną stosuje się do transformowania E.coliK12 szczep HB101. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pLX-34 identyfikuje się poprzez jego mapę restrykcyjną (fig. 13).

Plazmidem pLX-34 trawionym uprzednio enzymem Nrul transformuje się Y. lipolytica ATCC 20794 (Dl 118) otrzymując Y. lipolytica ATCC 20795 (DL 251). Proreninę wydzielaną do płynu hodowli przez hodowlę tego leucyno-niezależnego transformantu oznacza się w sposób opisany dla pLS-3. Ta procedura transformacji ukierunkowuje integrację plazmidu pLX-34 do sekwencji pBr322 wprowadzonych uprzednio do locus bio w chromosomie gospodarza (co jest opisane powyżej). Integrację pLX-34 w tym miejscu potwierdza analiza Sotherna.

Użycie DL 118 jako biorcy. Próby hybrydyzacji Southerna prowadzi się w sposób następujący: Trawienie enzymem Nrul DNA pochodzącego z transformantów DL 118 (produkty trawienia hybrydyzuje się z sondą, na przykład prochymozyny jeśli wchodzący plazmid był plazmidem ekspresyjnym prochymozyny) dokładnie wycina wchodzący plazmid. Próbka kilku nanogramów transformującego plazmidu trawionego Nrul służy do sprawdzenia dokładnego miejsca hybrydyzującego pasma. Również produkty trawienia enzymem Mlul (Mlul nie ma miejsca cięcia w transformujących plazmidach) DNA pochodzącego z tych transformantów (hybrydyzowane z sondą znaczonego ³²P-pBr322), wykazują, że sekwencja pBR322 znajdująca się w DL 118 jest przedzielona insercją jednej lub więcej cząsteczek transformującego plazmidu. Dowodzi to, że integracja zachodzi w żądanym miejscu.

Transformowany szczep Y. lipolytica ATCC 20795 (DL 251) hoduje się na podłożu YEPD w temperaturze 22°C, w warunkach sprzyjających ekspresji promotora LEU2. Obecność proreniny w supernancie hodowli wykrywa się w próbie ścinania mleka przez aktywowane kwasem supernanty hodowli i potwierdza się poprzez analizę immunologiczną (patrz powyżej). Powyższe wyniki wskazują, że ten gen hybrydowy jest niezależną jednostką ekspresyjną zdolną do ekspresji i wydzielania, jeśli zintegrowana jest w miejscu innym niż XPR2 lub LEU2. Ta cecha pozwala na konstruowanie szczepu ekspresyjnego genami hybrydowymi, co daje potencjalne możliwości ' uzyskiwania zwiększonych poziomów pozakomórkowej proreniny.

Przykład III. Sekwencja syntetycznego genu dla ludzkiej anafilotoksynyC5a.

Zaprojektowany plan uzyskania produkcji ludzkiej anafilotoksyny C5a w organizmach bakteryjnych jest analogiczny do metod poprzednich stosowanych do syntezy i ekspresji EGF, opisanych w zgłoszeniu patentowym europejskim nr 0 147 178. W planie tym stosuje się konstrukcję genu, w

156 255 23 którym sekwencja kodująca aktywowaną komponentę dopełniacza C5a jest otrzymana syntetycznie. Wychodząc ze znanej sekwencji aminokwasowej ludzkiej C5a zaprojektowaliśmy fragment DNA kodujący informację dla jej 74 aminokwasów (fig. 9). Sekwencja syntetycznego genu została wybrana dla maksymalnego zużytkowania kodonu preferowanego przez E.coli i S.cerevisiae. Pozwala to również na wprowadzenie szeregu miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych dla ułatwienia charakteryzacji. Takie podejście umożliwia ponadto bezpośrednią ekspresję anafilotoksyny C5a w E.coli przez wprowadzenie kodonu ATG inicjującego syntezę białka przed tripletem kodującym pierwszy aminokwas polipeptydu C5a. Dla ułatwienia insercji tego syntetycznego genu w plazmidzie pBr322 w żądanej orientacji, gen C5a tak skonstruowano, aby na swych końcach zawierał miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne EcoRI i Hindlll.

W celu wytworzenia sekwencji genu C5a zsyntetyzowano 10-47 merów metodą poprzez pochodne aminofosfinowe i połączono je w dwuniciowy fragment DNA o długości 235 par zasad. Następnie dokonuje się insercji tego fragmentu DNA do odpowiednio przejętego plazmidu pBR322 i klonowany gen identyfikuje się metodą analizy odcinków restrykcyjnych plazmidowego DNA z arbitralnie wybranych transformantów. Następnie analizuje się kilka klonów zawierających gen anafilotoksyny C5a na drodze sekwencjonowania DNA w celu zidentyfikowania klonu zawierającego właściwą sekwencję. Właściwą sekwencję nukleotydową dla regionu genu C5a wykryto w 2 spośród 5 badanych klonów.

Ekspresja ludzkiej anafilotoksyny C5a w bakteriach. Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych dla ludzkiej anafilotoksyny C5a rozpoczyna się przez rozszczepienie podklonu C5a endonukleazą restrykcyjną EcoRI. Następnie prowadzi się defosforylację przez traktowanie bakteryjną fosfatazę alkaliczną. Plazmid ekspresyjny C5a konstruuje się stosując odcinek DNA EcoRI o długości 360 par zasad z plazmidu pPFZ-R2 zawierający region promotor trp-operator i sekwencje posiadające miejsca wiązania z ribosomem. Kompetentne komórki E.coli szczep HB 101 transformuje się mieszaniną ligacyjną. Kilka opornych na lek kolonii pochodzących z każdej transformacji oczyszcza się i ich plazmidowy DNA analizuje przez mapowanie miejsc restrykcyjnych w celu identyfikacji tych, w których orientacja promotora trp umożliwiłaby transkrypcję genu C5a. Po wielokrotnej izolacji produktów, z tej mieszaniny ligacyjnej wyodrębnia się plazmidy zawierające gen anafilotoksyny C5a sąsiadujący z sekwencją promotora bakteryjnego w konfiguracji wymaganej dla bezpośredniej ekspresji anafilotoksyny C5a. Mapa restrykcyjna plazmidu ekspresyjnego pC5a-48 zawierającego gen ludzkiej anafilotoksyny C5a jest przedstawiona na fig. 10.' Ekspresja i wydzielanie ludzkiej anafilotoksyny C5a w Y. lipolytica.

Ekspresyjno-wydzielniczy wektor pC5aX-3 kodujący wydzielanie ludzkiej anafilotoksyny C5a preparuje się techniką podaną w przykładzie I dla plazmidu pXX-33. Następnie tym wektorem wydzielniczym transformuje się Y. lipolytica ATCC 20774. Ludzką anafilotoksynę C5a wytwarzaną przez hodowle transformantów oznacza się w sposób podany powyżej, z tym, że w próbie immunologicznej stosuje się kozie przeciwciała przeciw anafilotoksynie C5a i przeciwciała królika przeciw koziej IgG. Dla plazmidu opisanego w tym przykładzie stwierdzono obecność ludzkiej anafilotoksyny C5a w supernancie hodowli.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pC5aX-3. Etapy konstruowania plazmidu pC5aX-3 zawierającego kod ekspresji i wydzielania anafilotoksyny C5a są przedstawione na fig. 11. Ten plazmid zawiera sekwencje dla „całego promotora XPR2,157 aminokwasów sygnałowych i propeptydu, przyłączone do syntetycznej sekwencji kodującej 74 reszty aminokwasowe ludzkiej anafilotoksyny C5a. Plan konstruowania pC5aX-3 jest podobny do planu konstruowania pXX-33. Na początku, plazmid pXHP-24 (lub inny plazmid zawierający żądaną sekwencję) rozszczepia się enzymami Hindlll i Aval i izoluje się w żelu odcinek o długości 1150 par zasad, zawierający promotor XPR2. Drugi odcinek zawierający sekwencje końca 3' pro-peptydu XPR2 i genu strukturalnego C5a wytwarza się w standardowej reakcji ligacji odcinka Hindl-HindlH o długości około 220 par zasad, pochodzącego z ekspresyjnego plazmidu pC5a-48 E.coli z syntetycznym fragmentem o sekwencji:

5' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGACCTGAGATCACTAG 3'

CTAAGGACCAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG

156 255 wobec ligazy T4 i następnie trawi się enzymami Aval i Hindlll. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy żelowej izolując odcinek Aval - Hindlll o długości około 250 par zasad. Następnie poddaje się ligacji odcinek Hindlll - Aval zawierający promotor z odcinkiem Aval - Hindlll kodującym anafilotoksynę C5a wobec ligazy T4, po czym trawi się enzymem Hindlll. Fragment o długości około 1,4 kilopar zasad oczyszcza się w żelu i stosuje do ligacji z trawionym Hindlll plazmidem pterm 4 (opisanym powyżej). Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczep MM294. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pC5aX-3 identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne.

Plazmidem pC5aX-3 po uprzednim trawieniu enzymem SnaBI transformuje się Y. lipolytica szczep PC-30869, ATCC 20774. Anafilotoksynę C5a wydzielaną do podłoża hodowli przez transformowane komórki oznacza się w sposób opisany powyżej. Stwierdza się obecność ludzkiej anafilotoksyny C5a w supernancie hodowli.

Wiadomo, że wiele białek syntetyzowanych przez ribosomy związane z retikulum endoplazmatycznym powstaje w formie glikoprotein. W istocie, glikozylacja może wpływać na wydzielanie danego białka. Glikozylacja przy grupie aminowej w białkach aukariotycznych występuje w trójpeptydowych sekwencjach arginina-X-treonina i asparagina-X-seryna, gdzie X oznacza dowolny aminokwas oprócz przypuszczalnie kwasu asparaginowego [Hubbard S. i wsp., Ann. Rev. Biochem. 50,555 (1981)]. Sekwencja aminokwasowaproreniny zawiera dwie takie trójpeptydowe sekwencje, jednakże analiza metodą elektroforezy żelowej proreniny wydzielanej przez hodowle Y. lipolytica nie wykazała glikozylacji. W innych wydzielanych białkach eukariotycznych nie wszystkie miejsca asparagina-X-treonina lub seryna są zglikozylowane. Jest prawdopodobne, że niektóre reszty asparaginy w obrębie sekwencji trójpeptydowych nie są zglikozylowane, gdyż są niedostępne dla enzymów glikozylujących.

W przypadku ludzkiej anafilotoksyny C5a, sekwencja aminokwasowa zawiera jedno miejsce glikozylacji lub sekwencję trójpeptydową (Asn-Ile-Ser), przy której normalnie występuje złożony oligosacharyd przyłączony do asparaginy [Fernandez H. i wsp., J. Immunol, 117, 1688 (1976)]. Pewna część cząsteczek anafilotoksyny C5a wydzielanych do podłoża hodowli Y. lipolytica jest zglikozylowana, ponieważ w próbie immunologicznej jest widoczny szeroki region aktywności antygenowej w części o wysokim ciężarze cząsteczkowym. Ta heterogeniczna ruchliwość elektroforetyczna jest analogiczna do obserwowanej dla innych wydzielanych białek i prawdopodobnie wynika z różnych stopni podstawienia węglowodanami.

W przypadku wynalazku, widoczna glikozylacja niektórych wydzielanych białek heterologicznych wykazuje, że sposób ekspresji i wydzielania białek z użyciem Y. lipolytica może być użyteczny do wytwarzania wielu normalnie zglikozylowanych białek eukariotycznych.

odporność ηα tetracyklin

na ampicylinę i^Hnj · ffk¹

ES”Xpr-p ramotor/pre pro odporność no tetracyklinę ' Hindlll snn |

prorenina

Xpr-terminator

Rg. 13 c.d.

ł lizolacja odcinka 300bp

Xmal, Hind lii I (Bgll, Xmal 'bolacja fragmentuj j rataja «teina 8&7 bp ligacja z syntetycznym 54-merem Hind III ¹ 'izolacja ^fra^gmentu |36O bp I ligaza T4 transformacja E.coli

Leu 2 promotor xpr/prepro

Fig. 13 odporność a ampicylinę

prorenina

Xpr- terminator

156 255

GTGGATAGAT ATCT TT AAGCTGGCGACTGC ACCC AACGAGTGTGGTGGTAGCTTGTTACTGTATATTC GGTAAGATATAT TTTGTGGGGT TTTAGTGGTGTT TGGTAGGTTAGTGCTTGGTATATGAGTTGTAGGC ATGACAAT TTGGAAAGGGGTGGACT T TGGGAATA T TGTGGGATTTC AAT ACCT T AGT T TGTACAGGGT AATTGTTACAAATGATACAAAGAACTGTATTTCT TTTCATTTGTITTAATTGGTTGTATATCAAGTCCG T TAGAGGAGCTCAGTGCCATGGC T T T TGGCACTG T ATTTCAT T TT TAGAGGTACACT AC A T TCAGTGA GGTATGGTAAGGTTGAGGGCATAATGAAGGCACC T TGTACTGACAGT CACAGACCTC , TC ACCGAGAATT TTATGAGATATACT CGGGT TCAT T T TAGGCTCCGA T TCGAT TCAAAT TAT T AC T GTCGAAATCGGTTGAG CAT^^^TTTGATTTCCGAAC^^T^C^^^^C^/^^^TC TCGGATGTAGAATTAGGT T T CC T TGAGGCGAAGAT CGGTTTGTGTGACATGAATT

Fig. 12-8

ser	ser	ser	360 thr	ser	glu	vdl	giy	asp
TCT	TCC	TCC	ACC	TCC	GAG	GTC	GGA	GAC
leu	leu	pro	thr	370 arg	ser	arg	ser	cys
TTG	TTG	CCA	ACA	AGG	TCA	AGG	AGC	TGC
ser	arg	arg	ser	lys	380 ser	phe	leu	arg
TCA	AGA	AGG	AGT	AAG	TCG	TTT	CTA	CGA
arg	ile	asp	gly	arg	ser	390 lys	leu	thr
CGC ATT	GAT	GGA	AGG	AGC	AAA CTG	ACG
arg	leu	arg	val	gly	leu	pro	400 ala	giy
CGC CTG	CGG	GTT	GGT	CTA	CCG GCA	GGG
ser TCC	ala GCT	ser AGT	405 val GTA	OC TAA	GACTCTATAAAAAG

GGCCCTGCCCTGCTAATGAAATGATGATTTATAAT T TACCGG TG TAGCAACCT TG ACTAGAAGAAGCAGA TTGGGTGTGTTTGTAGTGGAGGAGAGTGGTACGTT TTGGMACAGTCTTCTTGAAAGTGTCTTGTCTACA GTA T AT TC AC TCAT AACC TC A A T AGCCAAGGGTGT AGTCGGT TTATTAAAGGAAGGGAGTTGTGGCTGAT

Fiq.12-7

156 255

ser	leu	pro	asp	thr	290 asn	glu	ala	phe
TCT	CTG	CCC	GAC	ACC	AAC	GAG	GCG	TTC
giy	leu	tyr	glu	pro	cys	300 his	giy	ser
GGT	CTG	TAC	GAG	CCC	TGT	CAC	GGA	TCT
ala	pro	asp	leu	giy	lys	gin	310 lys	val
GCC CCC	GAT	CTC	GGC	AAG	CAG	AAG	GTC
asn	pro	ile	ala	thr	ile	leu	ser	320 akt
AAC	CCC	ATT	GCC	ACC	ATT	CTG	TCT	GCC
ala	met	met	leu	lys	phe	ser	leu	asn
GCC	ATG	ATG	CTC	AAG	TTC	TCT	CTT	AAC
330
met	lys	pro	ala	giy	asp	ala	val	glu
ATG	AAG	CCC	GCC	GGT	GAC	GCT	GTT	GAG
ala	340 ala	val	lys	glu	ser	val	glu	ala
GCT	GCC	GTC	AAG	GAG	TCC	GTC	GAG	GCT c. Δη ,
giy	ile	350 thr	thr	ala	asp	ile	giy	Fig. 12-6 gly
GGT	ATC	ACT	ACC	GCC	GAT	ATC	GGA	GGC

leu	trp	arg	lys	thr	val	thr	220 arg	val
CTT	TGG	CGA	AAG	ACT	GTC	ACT	CGA	GTC
leu	lys	asp	glu	phe	pro	gin	leu	230 glu
CTC	AAG	GAC	GAA TTC	CCC	CAG	CTC	GAG
leu	asn	his	gin	leu	ile	asp	ser	ala
CTC	AAC	CAC	CAG	CTG	ATC	GAC	TCG	GCC
240
ala	met	ile	leu	ile	lys	gin	pro	ser
GCC	ATG	ATC	CTC	ATC	AAG	CAG	CCC	TCC
lys	250 met	asn	giy	ile	ile	ile	thr	thr
AAG ATG	AAT	GGT	ATC	ATC	ATC	ACC	ACC
asn	met	260 phe	giy	asp	ile	ile	ser	asp
AAC	ATG	TTT	GGC	GAT	ATC	ATC	TCC	GAC
glu	ala	ser	270 val	ile	pro	giy	ser	leu
Fig. 12-5 GAG GCC	TCC	GTC	ATC	CCC	GGT	TCT	CTG
giy	leu	leu	pro	280 ser	ala	ser	leu	ala
GGT CTG	CTG	CCC	TCC	GCC	TCT	CTG	GCT

156 255

giy	thr	asp	phe	ile	ile	val	arg	glu
GGC ACC	GAC	TTC	ATC	ATT	GTC	CGA	GAG
ISO
leu	val	giy	giy	ile	tyr	phe	giy	glu
CTC	GTC	GGA	GGT	ATC	TAC	TTT	GGA	GAG
org	,60 lys	glu	asp	asp	giy	ser	giy	val
CGA AAG	GAG	GAT	GAC	GGA	TCT	GGC	GTC
ala	ser	170 asp	thr	glu	thr	tyr	ser	val
GCT	TCC	GAC	ACC	GAG	ACC	TAC	TCC	GTT
pro	glu	val	,80 glu	arg	ile	ala	arg	met
CCT	GAG	GTT	GAG	CGA	ATT	GCC	CGA	ATG
ala	ala	phe	leu	190 ala	leu	gin	his	asn
GCC	GCC	TTC	CTG	GCC	CTT	CAG	CAC	AAC
pro	pro	leu	pro	val	200 Up	ser	leu	asp
CCC	CCT	CTT	CCC	GTG	TGG	TCT	CTT	GAC
lys	ala	asn	val	leu	ala	2,0 ser	ser	Fig. 1^-k arg
AAG	GCC	AAC	GTG	CTG	GCC	TCC	TCT	CGA

thr	70 leu	asp	ile	cys	arg	lys	ala	asp
ACT	CTC	GAC	ATC	TGC	CGA	AAG	GCT	GAC
ser	ile	80 met	leu	giy	ala	val	giy	giy
TCT	ATT	ATG	CTC	GGT	GCT	GTC	GGA	GGC
ala	ala	asn	90 thr	val	trp	thr	thr	pro
GCT	GCC	AAC	ACC	GTA	TGG	ACC	ACT	CCC
asp	giy	arg	thr	100 asp	val	arg	pro	glu
GAC	GGA	CGA	ACC	GAC	GTG	CGA CCC	GAG
gin	giy	leu	leu	lys	„0 leu	arg	lys	asp
CAG GGT	CTC	CTC	AAG	CTG	CGA	AAG	GAC
leu	asn	leu	tyr	ala	asn	,20 leu	arg	pro
CTG	AAC	CTG	TAC	GCC	AAC	CTG	CGA	CCC
cys	gin	leu	leu	ser	pro	lys	,30 leu	ala
Fig. 12-3 TGC	CAG	CTG	CTG	TCG	CCC	AAG	CTC	GCC
asp	leu	ser	pro	ile	arg	asn	val	140 giu
GAT	CTC	TCC	CCC	ATC	CGA	AAC	GTT	GAG

156 255

				met	glu	pro	glu	thr
CAG	ACATC	:caca	AGT	GAA	CCC	GAA	ACT
lys	lys	thr	lys	10 thr	asp	ser	lys	lys
AAG	AAG	ACC	AAG	ACT	GAC	TCC	AAG	AAG
					20
ile	val	leu	leu	gly	gly	asp	phe	cys
ATT	GTT	CTT	CTC	GGC	GGC	GAC	TTC	TGT
						30
gly	pro	glu	val	ile	ala	glu	ala	val
GGC	CCC	GAG	GTG	ATT	GCC	GAG	GCC	GTC
lys	val	leu	lys	ser	val	ala	40 glu	ala
AAG	GTG	CTC	AAG	TCT	GTT	GCT	GAG	GCC
								50
ser	gly	thr	glu	phe	val	phe	glu	asp
TCC	GGC	ACC	GAG	TTT	GTG	TTT	GAG	GAC
arg	leu	ile	gly	giy	ala	ala	ile	glu
CGA	CTC	ATT	GGA	GGA	GCT	GCC	ATT	GAG
60								Fig. 12-2
lys	glu	gly	glu	pro	ile	thr	asp	ala
AAG	GAG	GGC	GAG	CCC	ATC	ACC	GAC	GCT

TGCTTATTACGAAGACTACCCGTTGCTATCTCCA CACCGTTATCTCCACGGTCCAAAGGCTGCTCAAT GTGCTGCATACGTAACGTGGGGTGCAACCTTGAG CACATAG T ACTT T TCCGAAAACCGGCGATAATTA AGTGTGCACTCCAACT T T TCACACTGAGCGTAAA A TGTGGAGAAGAAA TCGG CACTAAAAAGTCAGGT AGACTGG/AAATGCGCCATGAAATGAATATCTCT TGCTACAGT AATGCCC AGCATCGTGGGGGAGTGT GTCACCMCACTATAG TGGCAGC T GAAGCGCTCG TGΔTTGTΔGTΔTGΔGTCTTTAGTGGGGATGGGΔA GAGT TCΔCTGGΔTGTTC TCGTTACGGCCAAAACA CCACGGTA TGCGGCCTGTCTCCTGGGAT G T AGA TC ACCAAG(^(^'^(3TGAATG TTAGGGGAGCTAAAATGGA GAGGGTTGGGGAM<GG^GTAGTTGCTGTCGAAGTG CGT^^^(^(^<^^^^(^G^^TG^ZXT<^/^T^^^^G^TTGACCAGGTG GCCACAMCCC T T G ACGATC TCG T ATGTCCCCTC CGACTGΔCGCCCGGCCGGCGGGGGGACGTTCGAG AGGGCGΔTCGGCATCGAGAAGGGTTGGGGGCGTA GG<^^>Δ'^^^^C^CG^C^1^G^^^(GTGTGGGTGΛ_ΛGCGGCGG ^Η9'^2_1 TQQJGGTG^GG^GGCGT^GTGT^(^CAC(GGG3G3T^TT^TGGQ, CGTTGTGTGTG AAGAGCGTT GGCGAGCCACAGAG T GGCAGGGGAGAGAGC AGATCACAGAT AC AACCA

156 255

Hind ΙΙΙ,ΒΑΡ izolacja odcinka 7,

Hind III, Avat izolacja odcinka H50bp

Hind III izolacja odcinka 5Obp

Hinf I izolacja odcinka 221 bp

Fig. 11 c.d. I

T4 ligaza Hind Ul izolacja odcinka 1,4 kb

Hind III, Ανα I ligacja z 23-merem izolacja odcinka '250bp ligaza T4 transformacja E.coli MM294

Xjęr-(promotor/prepłO Hind lll^^igen C⁵a

Xpr-terminator

Fig. 11

Leu2

PBR322 \ \l⁷759bp)

Fig. 10

156 255 t 10

EcoRI thr leu gin lys lys ile glu glu ile αία αία lys __(A)_

AATTCT ĄTG ACT CTG CAA AAG AAG ATC GAA GAA ATC GCT GCT AAG GA TAC TGA GAC GTT TTC TTC TAG CTT CTT TAG CGA CGA TTC tyr lys his ser ναΐ val lyy lys cys cys tr r osp gly αία (8)

TAC AAG CAC ΠΧ GTC GTT MG AAG TGT TAC GAT GGT GCA

ATG TTC GGG AGG CAG ACC TTC TTC ACA ACA ATG CTA CCA CGT cys val asn asn asp glu thr cys glu gin arg ala ala arg _ μ._(Cl_

TGC GTC AAC GAC GAA ACC TGT GM ΑCC CGA GCT GCT CGT

ACG CAG TrG“ HG CTG CTT TGG ACA CTT GTT GCT CGA CGA GCA (H)

Fig. 9 c.d.J

i le

ser

leu

giy

pro

arg

cys

ile

lys

.» ala

phe

thr

glu IOL

ATT

TCT

CTG

GGC

CCT

CGC

TGT

ATC

AAG

GCT

TTC

ACT

GAA

TAA

AGA

GAC

CCG

GGA

GCG

ACA

TAG

TTC

CGA

AAG

TGA

CTT

60

(G)

cys

cys

val

val

ala

ser

gin

leu

arg

ala

asn

ile

ser

(E)

TGT

TGT

GTT

GTC

GCT

TCC

cm'

CTG

CGC

GCT

AAC

ATT

TCT

ACA ACA

CAA

CAG

CGA

AGG

GTT

GAC

GCG

CGA TTG

TAA

AGA

70

74

(F)

his

lys

asp

met

gin

leu

gly

arg

stop

_ Hind III

CAC AAG	GAC	ATG	CAA	CTC	GGC	CGC	TAA	A
GTG TTC	CTG	TAC	GTT	GAG	CCG	GCG	ATT	TTCGA

Fig.9

Hind III, Bgll izolacja odcinka 750bp ligacja z 40-merem ^Xpr-promotor/prepro

Hind 111, Bam HI izolacja odcinka 79Obp

Bam HI, Xma I izolacja odcinka 440 bp

Hind III, Xma I izolacja odcinka ~ 8,0 kb

Fig.8 c.d.

156 255 ligaza T4__ transformacja E.coli

Fig. 8 “^ΧΧρΓ- promotw/prepro

Hind BI, Bgl II izolacja odcinka 890 bp , ligacja z 16 - merem

Hind III, BamHI izolacja odcinka 920bp jCjT-promotor/ prepro

Hind lll,Xmal iz^^racja odcinka * 8,0kb

BamHI, Xma I izolacja odcinka 440 bp

Fig. 7 c.d.

ligaza T4 _| transformacja E.coli

Fig. 7 odporność reg.

cs Xpr-promotor/prepro

odporność na,_ I_eu2-: ampicylinę — irorenina ^r- terminator

156 255

ESjXpr- promotor/prepro ^-XPR2-gene pBR3:

CTjPpr-prwootor/prepro Hind III . ^pnrnmina ^x*mal Π

Hind III, Ava1 izolacja odcinka !15Obp BamHI?Xmal ligacja z42-merem

Hind III, Barn HI izolacja odcinka 1196 bp izolacja odcinka 440bp

Bell

Hind lll,Xmal izolacja odcinka ~8,Okb

Xpr9 terminator

Fig. 6 c.d. i ligaza T4

Transformacja E.cdi odporność na tetrac^klinin?^ odporność na^ ampicylinę

Xpr-terminator

Fig. 6

Hind III

odporność

Aval

Hindlll

W\JL^HIWJV .

na ampięylinę^^^^^n x »_ ^proren,na

Htrp-promotor

Λ

Hind ΙΙΙ,Δνα I izolacja odcinka 870 bp

pBR 32 jeu 2 ligacja z 42-merem izolacja odcinka 916 bp Hind III. Barn ΗI

X pr- promotor/prepro

Χ\(™αΙ\\ prorenina xpr-terminator

Hind IIIiBcII izolacja odcinki 7 3kb

Barn HI (partial) izolacja odcinka 9080bp

Fig. 5 c.d. 4

156 255

E.coli MM 294 _xpr-pramcOor/prepro Hindlll ligaza T4 __

J Transformacja

prorenina xpr- terminator

Fig. 5

Bam HI

b——U^yKpnl Bglll κρηΐ Bglll

Κρη I

Bgl u Eco R| οφοπτκέ na ampicylinę^

^rpLD41 U '®^u2 'Hindlll .z _—j>0aornoic na

---'tetracyklinę

Hind III, Bglll ligacja z 16 merem 5'AGCTTGATATCTGATCATAGGTAC 3' 3' ACTATAGACTAGWC 5'

Fig. 4c.d.

Hind III. Bglll izolacja odcinka 760bp (par zasad)

Kpnl Boi II Himllll

Fig. 4 ligaza T4

Transformacja E.coli

terminator xpr

156 255

AA ACAAAAGCAACAGAA ACTGCTGTAGTGTGT T G CAGTGAGGCGGAGAT T TAACCGTATAATTCACGC TCAGATCT

Fig. 3-9

asn	thr	gty	val	leu	pro	280 thr	thr	asn
AAC ACC	GGT	GTT	CTT	COC	ACC	ACC	AAC
leu	lys	gly	ser	pro	asn	ala	290 val	ala
CTC	AAG	GGC	TCT	CCC	AAC	GCT	GTT	GCC
					297
tyr	asn	gly	val	gly	ile
TAC	AAC	GGT	GTT	GGC	ATT	TAG	GCAATTAA

CAGATAGTT^^C^TTGTTATT(^^T^^TAACCTCCC

ACACTCCTTTGACAMC6AHTATGTAACGAAACT

GAAAT T TTTCCTTTTTT TG T TGTATTTTGA AAATCT

GGCT rGTAGGTGGCAAAATCCCGTCT TTGT TCGTCG

GHCCCTCTGTGACTGCTCGTCGTCCCTTTGTGTTC

GACTTTCGTTTTTTGTTTTCCGTTCGTTCGCAAGTG

AGATGCCCGTTTTCGAATTCGTTAGTCGCACGGACC

ATCGGT TGCTC TGCAC ACACACACACTCGAGGCTGG

AAG^'(ACAAGATAGGACTAGTTTGATGTTTGATGGA

ACATTCAAGAAAAGCGCAAGCAGTGGGTGATGTATA

GCAGCTAlAOC^A^^t^lA^AT^CAT^OCGlAA^AAT^^I^AAGGA

TGGTGTTAATACTTCCAAGACTTCT Γ TCTGTG TACG

GGTTTG(CTTCTTTAGA(T<clTTCTGTGGATCAGATA

ATCGCCTACGGAGACAGAGAGAGAGACAGAAACAG

Fig. 3-8

210 ser gly gly gin gly ser asn tyr gly TCC GGT GGA CAG GGA TCC AAC TAC GGA

thr	cys	val	asp	val	phe
ACT	TGT	GTT	GAT	GTC	TTT
220		ile	ile		ala
ser	asp	ser
TCC	GAT	ATC	ATC	TCT	GCC
	230		giy	thr
ser	asp	ser	leu
TCC	GAC	TCT	GGT	ACT	TTG
giy	thr	240 ser	met	ala	cys
GGT	ACC	TCC	ATG	GCC	TGT
			250
a la	giy	leu	ala	ser	tyr
Gd	GGT	CTT	GCC	TCC	TAC
				260
ile	asn	asp	glu	val	leu
ATC	AAT	GAC	GAG	GTT	CTC
					270
gin	val	glu	ala	leu	ile
CAG	GTC	GAG	GCT	CTT	ATT

αία pro gly GCC CCC GGC ser tyr gin TCT TAC CAG val tyr ser GTC TAC TCC pro his val CCC CAC GTT tyr leu ser TAC CTG TCC thr pro a la ACC CCT GCC

Fig. 3-7 thr glu ser ACT GAG TCC

130

pro	arg	giy	val	leu	asn	phe	ser	giy
CCT	CGA	GGA	GTG	CTG	AAC	TTC	TCT	GGA
	140
giy	giy	pro	lys	ser	ala	ser	gin	asp
GGA	GGA	CCC	AAG	TCC	GCT	TCC	CAG	GAC
		150
ala	leu	trp	ser	arg	ala	thr	gin	glu
GCC	CTA	TGG	TCT	CGA	GCT	ACC	CAG	GAG
			160
giy	leu	leu	val	ala	ile	ala	ala	giy
GGT	CTG	CTT	GTC	GCC	ATC	GCT	GCG	GGA
				170
asn	asp	ala	val	asp	ala	cys	asn	asp
AAC	GAT	GCC	GTG	GAC	GCC	TGT	AAC	GAC
					180
ser	pro	gly	asn	ile	giy	giy	ser	thr
TCT	CCC	GGT	AAC	ATT	GGA	GGC	TCC	ACC
						190
ser	giy	ile	ile	thr	val	giy	ser	ile
TCT	GGT	ATC	ATC	ACT	GTG	GGT	TCC	ATT
					ile		200
asp	ser	ser	asp	iys	ser	val	trp
GAC	TCT	AGC	GAT	AAG	ATC	TCC	GTC	TGG

156 255

		60
val	trp	giy	ala	asn	phe	ala	asp	thr
GTC	TGG	GGA	GCC	AAC	TTC	GCT	GAC	ACA
gin	asn	ala	70 asp	leu	leu	giy	his	giy
CAG	AAC	GCT	GAT	CTT	CTC	GGT	CAC	GGC
				80
thr	his	val	ala	giy	thr	val	giy	giy
ACT	CAC	GTT	GCA	GGT	ACC	GTG	GGA	GGA
				val	90
lys	thr	tyr	giy	asp	ala	asn	thr
AAG	ACA	TAC	GGA	GTC	GAC	GCC	AAC	ACC
						100
lys	leu	val	ala	val	lys	val	phe	ala
AAG	CTG	GTG	GCC	GTC	AAG	GTG	TTT	GCA
							110
giy	arg	ser	ala	ala	leu	ser	val	ile
GGC	CGA	TCC	GCA	GCT	CTC	TCC	GTC	ATC
								120
asn	gin	giy	phe	thr	trp	ala	leu	asn
AAC	CAG	GGC	TTC	ACC	TGG	GCT	CTC	AAC
								Fig. 3-5
asp	tyr	ile	ser	lys	arg	asp	thr	leu
GAC	TAC	ATC	TCC	AAG	CGA	GAC	ACT	CTG

					10
i le	val	ser	leu	pro	glu	ile	pro	ala
ATT	GTG	TCT	CTC	CCC	GAG	ATT	CCT	GCT
ser	ser	asn	ala	lys	arg	1 ala	ile	gin
TCT	TCT	ΑΔΤ	GCC	AAG	CGA	GCT	ATC	CAG
thr	thr	pro	val	thr	gin	10 trp	giy	leu
ACT	ACT	CCC	GTC	ACT	CAA	TGG	GGC	CTG
							20
ser	arg	ile	ser	his	lys	lys	ala	gin
TCT	AGA	ATC	TCT	CAT	AAG	AAG	GCC	CAG
								30
thr	giy	asn	yr	ala	tyr	val	arg	glu
ACT	GGA AAC	TAC	GCC	TAC	GTT	CGA	GAG
thr	val	giy	lys	his	pro	thr	val	ser
ACA	GTT	GGC	AAG	CAC	CCC	ACC	GTT	TCT
40
tyr	val	val	asp	ser	giy	ile	arg	thr
TAC	GTT	GTT	GAC	. TCT	GGT	ATC	CGA	ACC
Fig. 3 -«f	50
thr	his	ser	glu	phe	giy	giy	arg	ala
ACC	CAC TCC	GAG	' TTC	GGA	GGC	; CGA	GCT

156 255 asp ser ser ala thr val asp gin ile GAC AGT AGC GCT ACT GTT GAC CAG ATC

	ala GCC	ser TCC	glu GAA	ile ATC	gin CAG	lys AAG	leu CTG
asp	ser	leu	val	asp	glu	asp	ser	ser
GAC	TCT	CTG	GTC	GAC	GAG	GAC	TCG	TCC
-60
asn	gly	ile	thr	ser	ala	leu	asp	leu
AAC	GGT	ATC	ACC	TCT	GCT	CTT	GAT	CTT
	-50
pro	val	tyr	thr	asp	giy	ser	giy	phe
CCT	GTC	TAC	ACG	GAT	GGA	TCT	GGC	TTT
		-40
leu	giy	phe	val	giy	lys	phe	asn	ser
CTC	GGA	TTT	GTT	GGA	AAG	TTC	AAC	TCC
			-30
thr	ile	val	asp	iys	leu	lys	glu	ser
ACT	ATC	GTT	GAC	AAG	CTC	AAG	GAG TCG
				-20
ser	val	leu	thr	val	glu	pro	asp	thr
TCT	GTT	CTG	ACG	GTC	GAG	CCC	GAT	ACC

Fig. 3-3

-157							-1!
met	lys	leu *	ala	thr	ala	phe	thr	ile
ATG	AAG	CTC	GCT	ACC	GCC	TTT	ACT	ATT
								-140
leu	thr	ala	val	leu	ala	ala	pro	leu
CTC	ACT	GCC	GTT	CTG	GCC	GCT	CCC	CTG
a la	ala	pro	ala	pro	ala	pro	asp	ala
GCC	GCC	CCT	GCC	CCT	GCT	CCT	GAT	GCT
-130
a la	pro	ala	ala	val	pro	glu	giy	pro
GCC	CCT	GCT	GCT	GTG	CCT	GAG	GGC	CCT
	-120
a la	ala	ala	ala	tyr	ser	ser	ile	leu
GCC	GCC	GCT	GCC	TAC	TCA	TCT	ATT	CTG
		-110
ser	val	val	ala	lys	gin	ser	lys	lys
TCC	GTG	GTC	GCT	AAG	CAG	TCC	AAG	AAG
			-100
phe	lys	his	his	lys	arg	asp	leu	asp
TTT	AAG	CAC	CAC	AAG	CGA	GAT	CTT	GAT
				-90
glu	lys	asp	gin	phe	ile	val	val	phe
GAG	AAG	GAT	CAG	TTC	ATC	GTT	GTC	TTT

Fig. 3-2

156 255

GATCCGGGGT TCTATGCATCCCTCAAACATTGATTGGAAATrAACATATGAGCT GCG TG C T Γ T T T GC A TT C A AGGGCGCAGCT TAT C T TG TA T C C T TAA T TACACATG ACCTCT T GAGCGCCACG^CTTAA(SATTC^(;T(^(^(^(3T(^/^GTT(^<^GTGAG<^(^(^(j^CACTT TTCTCTCCTT TGTCTGACATGT TGTTTAA'GTTGTAGTCCAG(TGACACAAGGGGT TTCAACGGCAGTGGCAGCTTACTTTACGCTACCCACCATTGGTCCTGGTCTAACT XCTACGATCGGCATCAG&TTXCATGTAXATTTTTXTTTAXXXACGAXTTTAXTGA CAATGTTATAGAGATCCCACTACTTTXAGXCATTCTAXTTTTTACGTACTCACXT XACCATGAT6TCAATTTATXAXTAXTAACCTACXXXTΔ6AGACXCACATCTTCCT AACACCATGT T TTAGCGGAATTCGACT XTCAACTCAAACTTA AGCCCCTG TCAGA XATCTTTATAAGGCACGGCACCAACrAATGCATACATXTTACTTGXATTTTATTA AGATAATGAGGGCATCGTTT TGGCGTGTCT XTTTGAG(TT;TTXTXXTCGTGATGC AATCAGAGCAGT T TC TGGATAGTATCT TTXCCATAAACACTAXATAAACCTCAXC TACTTTGKTTAGAtATACACTTCACTCATGCGCTAC(T(TJ^ClACX¢¢AClTA

Fig. 3-1 sekwencja białka ναl thr gin trp gly mRNA 5' GGX ACC CCU TTG GG sondy 3‘ CCA TTG GTT^ ACC CC

170 3' CAA T^G GGY A<X CC

172 3' CCI TTG GTY A(X CC

174 3' CAG TGX GTY ACC CC

176 3' CCG TGX GTY ACC CC

3'

5'

5'

5'

5'

5’

sekwer	icja białka	lys	lys	ala	gin	thr
mRNA	5'	AAU	AAU	GCX	CAU	AC	2
sondy	3'	TTY	TTY	CGX	GTY	TG	5'
180	3'	TTC	TTY	CGX	GTC	TG	5
182	3'	TTT	TTY	CGX	GTC	TG	5‘
184	3'	TTT	TTY	CGX	GTT	TG	5'
186	3'	TTC	TTY	CGX	GTT	TG	5'

Fig. 2 i___________________pLD 58_________________j l-----------------’t?.⁵Z.-.-p-LD-62-;:; ::7-¹ h-Ylip -|^Pi—LEU2—>> ^4kb_pBR t-»fp· 2-1002->

.®F F F V 8 BE e ,1--------------------------------------I_tlooo

Schematyczne przedstawienie plazmidów wyodrębnionych z transformantu Ylipolitica, szczep DL 112, zawierającego gen.XPR2.

Zaznaczone regiony zawierają (od strony lewej do prawej) materiał z Y lipolytica, który nie byt sekwencjoncwany, maty segment plazmidu pBR 322 pomiędzy miejscem dla EcoRl a miejscem łączenia z DNA Y. lipolytica (poprzednio miejsce dla Barn HI), gen L EU 2 z Y. lipolytica, duży segment plazmidu pBR322 «raz zmutowaną allelę XPR2,której sekwencje zostały zanalizowane.

Miejsca dla Bg1 II są oznaczone symbolem B, a miejsca dla EcoRl symbolem E.

Te trzy plazmidy, przedstawione w postaci liniowej wyodrębniono jako cząsteczki koliste, połączone końcami w miejscu dla Bgtll.

Fig. 1.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 5000 zł.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania wektorów ekspresyjnych do transformowania Yarrowia lipolytica, znamienny tym, że plazmid pXHP-24 rozszczepia się enzymami HindIII-Aval otrzymując odcinek o długości 1150 par zasad, odcinek ten izoluje się i poddaje ligacji wobec Iigazy T4 z odcinkiem syntetycznego DNA o sekwencji:

   5' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAAGTCCAAGCGA 3'

   3' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5' następnie otrzymany produkt ligacji rozszczepia się enzymami Hindlll-BamHI z wytworzeniem odcinka o długości 1196 par zasad, który to odcinek po izolacji poddaje się ligacji w obecności Iigazy T4 z odcinkiem o długości 440 par zasad pochodzącym z trawienia enzymami BamHI-XmaI plazmidu pLS-3 i z odcinkiem o długości około 8,0 kilopar zasad pochodzącym z trawienia enzymami HindIII-XmaI plazmidu pLS-3, następnie tak otrzymanym produktem reakcji ligacji transformuje się E.coli, dokonuje się selekcji transformantów opornych na ampicylinę i z tych transformantów izoluje się plazmid pXX-33.
2. 2. Sposób wytwarzania wektorów ekspresyjnych do transformowania Yarrowia lipolytica, znamienny tym, że plazmid pXHP24 rozszczepia się enzymami Hindlll-Bglll otrzymując odcinek o długości 890 par zasad, odcinek ten izoluje się i poddaje się ligacji wobec Iigazy T4 z odcinkiem syntetycznego DNA o sekwencji:

   5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3'
3. 3' AACGACTCTAGTGATCCTAG 5' następnie otrzymany produkt ligacji rozszczepia się enzymami Hindlll-BamHI z wytworzeniem odcinka o długości 920 par zasad, który to odcinek po izolacji poddaje się ligacji w obecności ligazy T
4. 4 z odcinkiem o długości 440 par zasad pochodzącym z trawienia enzymami BamHI-XmaI plazmidu pLS-3 i z odcinkiem o długości około 8,0 kilopar zasad pochodzącym z trawienia enzymami HindIII-XmaI plazmidu pLS-3, następnie tak otrzymanym produktem reakcji ligacji transformuje się E.coli, dokonuje się selekcji transformantów opornych na ampicylinę i z tych transformantów izoluje się plazmid pXX22.

   3. Sposób wytwarzania wektorów ekspresyjnych do transformowania Yarrowia lipolytica, znamienny tym, że plazmid pXHP24 rozszczepia się enzymami Hindlll-Bglll otrzymując odcinek o długości 750 par zasad, odcinek ten izoluje się i poddaje się ligacji wobec Iigazy T4 z odcinkiem syntetycznym DNA o sekwencji:
5. 5' TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3'

   3' AAGACCGGCCAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5' następnie otrzymany produkt ligacji rozszczepia się enzymami Hindlll-BamHI z wytworzeniem odcinka o długości 790 par zasad, który to odcinek po izolacji poddaje się ligacji wobec Iigazy T4 z odcinkiem o długości 440 par zasad pochodzącym z trawienia enzymami BamHI-Xmai plazmidu pLS-3 i z odcinkiem o długości około 8,0 kilopar zasad pochodzącym z trawienia enzymami HindIII-XmaI plazmidu pLS-3, następnie tak otrzymanym produktem reakcji ligacji transformuje się E.coli, dokonuje się selekcji transformantów opornych na ampicylinę i z tych transformantów izoluje się plazmid ρΧΧΙΙ.

   156 255