PL150899B2

PL150899B2 - Biotechnical process for obtaining beta fructofuranosidase

Info

Publication number: PL150899B2
Application number: PL26883787A
Authority: PL
Inventors: Oleg Kirjuschkin; Ilona Schon; Helmut Kluge; Alfred Schllenberg; Joachim Herrmann; Erhard Kuhn; Peter Willner
Original assignee: Halle Ingenieurtech
Priority date: 1986-11-20
Filing date: 1987-11-16
Publication date: 1990-07-31
Also published as: FR2607148B1; HUT48680A; CS754387A1; FR2607148A1; GB8726655D0; FI875028A; GB2198731B; FI875028A0; CS271100B1; PL268837A2; GB2198731A; DE3735534A1

Description

RZECZPOSPOLITA ^OPIS PATENTOWY 150 899

POLSKA PATENTU TYMCZASOWEGO

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent tymczasowy dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 87 11 16 (P. 268837)

Int. Cl.⁵ C12N 9/26 C12M 1/06

Pierwszeństwo: 86 11 20 Niemiecka

Republika Demokratyczna

Zgłoszenie ogłoszono: 88 07 07

Opis patentowy opublikowano: 1990 12 31

Twórcy wynalazku: Oleg Kirjuschkin, Ilona Schón, Helmut Kluge,

Alfred Schellenberger, Joachim Herrman, Erhard Kuhn,

Peter Willner

Uprawniony z patentu tymczasowego: VEB Ingenieurtechnik Halle,

Halle (Niemiecka Republika Demokratyczna)

Biotechniczny sposób wytwarzania inwertazy

Przedmiotem wynalazku jest biotechniczny sposób wytwarzania inwertazy z aktywnych drożdży piekarnianych, stosowanej korzystnie w przemyśle spożywczym.

Znane są liczne sposoby wytwarzania inwertazy z drożdży.

Cechują te sposoby następujące etapy robocze: roztwarzanie komórek drożdżowych w celu uwolnienia inwertazy, oddzielanie inwertazy od składników komórkowych, zatężanie i oczyszczanie roztworu zawierającego inwertazę oraz stabilizowanie inwertazy.

I tak np. znane jest przeprowadzanie rozkładu komórek za pomocą rozpuszczalników organicznych, np. za pomocą toluenu.Po zakończeniu plazmolizy/autolizy następuje oddzielanie nie rozpuszczonych komórek drożdżowych np. dzięki prasie filtracyjnej. Po nastawieniu w autolizacie odczynu o odpowiedniej wartości pH następuje otrzymywanie inwertazy drogą wielokrotnie przeprowadzanie strącania acetonowego. Po dalszych etapach rozdzielania i rozpuszczania otrzymany roztwór inwertazy uwalnia się od pozostałości rozpuszczalnika i zatęża np. za pomocą wyparki próżniowej. Następnie stabilizuje się gliceryną [porównaj Waldschmidt — Leitz, E. Und Balls, A. K. in Handbuch der Lebensmittelchemie tom II/2 część, wyd. Springer Verlag Berlin 1935, strony 734—738].

Niedogodności tego sposobu polegają przede wszystkim na tym, że niekiedy resztki trującego toluenu pozostają w roztworze inwertazy, roztwarzanie komórek jest długotrwałe, co zwiększa niebezpieczeństwo zakażenia, i osiągane wydajności i aktywności są małe, przy czym nakłady energetyczne są dość wysokie.

Również dodatkowa obróbka papainą autolizatu otrzymanego drogą dodawania toluenu, oraz dalsze środki techniczne, takie jak adsorpcja na wodorotlenku glinowym lub fosforanie wapniowym, eluowanie roztworem mleczanowym, wodą lub roztworem sacharozy, strącanie alkoholem lub roztworem pikrynianowym, dializa i inne operacje oczyszczające nie prowadzą do istotnej efektywności tego sposobu [Hartmeier, W. GORDIAN, 78, 320—324 (1978)].

Dalszy znany sposób omówiono w opisie patentowym Niemieckiej Republiki Demokratycznej DD—PS nr 1401.

150 899

Według zwykłej hodowli drożdży prowadzi się nagromadzanie substancji czynnej (heksozydaz) w masie drożdżowej. Kolejno następuje zatężanie drogą separacji z następnym dodawaniem substancji działających uwalniająco, takich jak słód mokry lub jego diastatyczne substancje czynne włącznie z cytazą.

Rozkład komórek następuje na drodze działania ultradźwięku na wirującą masą drożdżową. Po uwolnieniu swoistych substancji drożdży następuje oddzielenie roztworu inwertazy od resztek komórkowych i innych stałych składników na drodze separacji. Oczyszczanie soku komórkowego prowadzi się za pomocą słabo kwaśnej żywicy jonitowej. Niedogodność tego sposobu polega przede wszystkim na tym, że wysokie nakłady techniczno-technologiczne i z nimi związane skomplikowane prowadzenie sposobu oraz wysokie nakłady energetyczne i dość wysokie nakłady czasu na uwolnienie swoistych substancji drożdży powiązane ze zbyt małą wydajnością i dającą się osiągnąć aktywnością otrzymanej inwertazy czynią ten sposób nieekonomicznym.

Znany jest nadto sposób otrzymywania rozpuszczalnej inwertazy z drożdży, taki jaki omówiono w opisie patentowym Republiki Federalnej Niemiec nr 2 626 626.SpoSób ten zasadniczo wyróżnia się tym, że plazmoliza i autoliza zachodzi wskutek oddziaływania celulaz, proteaz i lipaz na komórki drożdżowe. Jako drożdże wyjściowe stosuje się drożdże suszone rozpyłowo, z których ponownie sporządza się zawiesinę. Po zaszłej plazmolizie/autolizie następuje oddzielanie nierozpuszczalnych fragmentów komórkowych, a następnie przesącz rozdziela się za pomocą ultrafiltracji na wyciąg z drożdży i inwertazę. Później następuje stabilizowanie lub standaryzowanie inwertazy za pomocą roztworu gliceryny lub roztworu sorbitu. Również w tym sposobie okazuje się, że nakłady energetyczne są dość wysokie. Tak jak poprzednio są też długotrwałe (8—20 godzin) czasy roztwarzania, co może prowadzić do zakażenia i tym samym do strat w aktywności.Poza tym w przypadku stosowania suszenia rozpyłowego drożdży i z nim związanej wysokiej temperatury (do 240°C) prowadzenia istnieje niebezpieczeństwo częściowej dezaktywacji enzymu.

W opisach patentowych Niemieckiej Republiki Demokratycznej DD—PS nr nr 110 425 i 116135 omówiono sposoby otrzymywania wyciągów z drożdży, glikanu drożdżowego, produktu wyodrębnienia białka z drożdży o obniżonej zawartości kwasu nukleinowego.

Komórki drożdżowe (drożdży piwnych lub piekarnianych) roztwarza się następnie w znany sposób np. drogą homogenizowania wysokociśnieniowego, ucierania w młynie piaskowym lub koloidalnym, rozdrabniania za pomocą fal dźwiękowych, powtarzanych cykli zamrażanie—tajanie, litycznych enzymów i podobnych. Następuje obróbka cieplna w celu oddzielenia kwasu nukleinowego od białka.

Następnie zachodzi bliżej nie omówione oddzielanie nierozpuszczalnej frakcji produktu białkowego od frakcji rozpuszczalnej. Otrzymywanie wyciągu z drożdży, glikanu drożdżowego i produktu wyodrębniania białka z drożdży o obniżonej zawartości kwasu nukleinowego następuje drogą odwirowania, zatężania pod próżnią i suszenia.

Sposoby te służą przede wszystkim otrzymywaniu produktów wyodrębniania białka z drożdży o obniżonej zawartości kwasu nukleinowego, otrzymywaniu glikanów drożdżowych i wyciągów z drożdży. Wprawdzie te etapy postępowania są w głównych zarysach podobne do tych, które stosuje się w przypadku otrzymywania inwertazy, to jednak w publikacjach tych nie podano żadnych wskazówek o zdatności zaproponowanych rozwiązań do przeniesienia na otrzymywanie inwertazy.

W szczególności proponowany jako korzystny sposób wysokociśnieniowego homogenizowania w celu rozszczepienia komórek i proponowane sposoby obróbki cieplnej nasuwają wątpliwości co do efektywnego wytwarzania inwertazy.

W opisie patentowym Republiki Federalnej Niemiec omówiono sposoby oddzielania enzymów, w których enzymy te na drodze roztwarzania np. komórek drożdży piwnych i/lub traktowania detergentami solubilizuje się i wraz z resztkami komórkowymi lub z komórkami rozprasza się między różne fazy wodnego układu wielofazowego o zawartości co najmniej jednego związku wielkocząsteczkowego, wybranego z grupy obejmującej ewentualnie podstawione polialkohole, polietery, poliestry, poliwinylopirolidony i polisacharydy, i co najmniej jednej soli nieorganicznej, lub o zawartości co najmniej dwóch związków wielkocząsteczkowych, po czym fazy te od siebie oddziela się np. drogą strącania, ultrafiltracji, dializy, sączenia przez żel, adsorpcji, wymiany jonowej lub elektroforezy.

150 899

W proponowanym rozwiązaniu wprawdzie mówi się o tym, że można otrzymywać dowolne enzymy, jednak konkretnie powołano się tylko na pullulanazy względnie maltazy. Osiągnięte zaproponowanym sposobem wyniki odnośnie aktywności i wydajności nie mogą jednak zadowalać w obliczu koniecznych nakładów na środki.

Cel wynalazku polega na opracowaniu energiooszczędnego, biotechnicznego sposobu wytwarzania inwertazy o wysokiej aktywności i o wysokim stopniu czystości z drożdży piekamianych, w którym to sposobie nie stosowałoby się żadnego rozpuszczalnika organicznego lub innych chemikaliów i/lub enzymów i osiągałoby Się krótkie czasy wytwarzania. Nadto sposób ten powinien być dzięki stosowaniu odpowiednich wyposażeń łatwy do opanowania i nieskomplikowany oraz zdolny do eksploatacji metodą ciągłą, przy czym równocześnie powinno osiągać się wysoką wydajnością zatężonej inwertazy i móc dalej przetwarzać otrzymane produkty odpadkowe względnie uboczne.

Sposób według wynalazku polega na niżej omówionych środkach technicznych.

Komórki drożdżowe zawiesiny aktywnych drożdży piekarnianych, zawierającej około 10% suchej substancji drożdżowej (zwanej skrótowo HTS) i wykazującej temperaturę 8—15°C, nieprzerwanie rozdrabnia się w młynie wrzecionowym, przy czym stosowane mikroperełki szklane wykazują średnicę 0,5—Umm, a prędkość obrotowa wału mieszadła wynosi 2500—4000 obrotów/minutę. W kolejno następującym separatorze nieprzerwanie zachodzi zgrubne rozdzielanie resztek komórkowych i roztworu zawierającego inwertazę. By zapobiec stratom wydajności enzymu przerywa się przed odszlamowywaniem dopływ zawiesiny i wirnik płucze się w ciągu około 5 minut wodą, przy czym komorę szlamową opróżnia się dopiero wtedy, gdy u ujścia produktu wystąpi czysta woda.

Następna nieprzerwana filtracja klarująca roztworu zawierającego inwertazę zachodzi poprzez filtr przepływowy, przy czym warstwy filtracyjne wykazują przepuszczalność 425—475 litrów /h-m². Strony klarujące tych warstw filtracyjnych są przy tym dodatkowo podłożone bibułą filtracyjną, przy czym te warstwy filtracyjne przed rozpoczęciem filtracji klarującej płucze się wodą w ciągu około 20 minut. Różnica ciśnień u wotu i wylotu filtru podczas tej filtracji nie może być większa od 200—250 kPa.

Filtr przepływowy włącza się tak, żeby obok procesu filtracji był możliwy obieg, tak więc unika się powstania nadciśnienia, które mogłoby prowadzić do uszkodzenia płyt filtru. Otrzymaną dzięki obiegowemu sposobowi ruchu pozostałość klarowanego roztworu inwertazy ponownie poddaje się separacji.

Oczyszczanie, zatężanie i odkażanie rozwtoru inwertazy zachodzi w złożonym urządzeniu ultra- i mikrofiltracyjnym. Jednostka rozdzielania ultrafitracyjnego jest względem jednostki rozdzielania mikrofiltracyjnego umieszczona tak, że najpierw roztwór oczyszcza i zatęża się dzięki jednostce rozdzielania ultrafiltracyjnego, a następnie w celu odkażania prowadzi się go przez jednostkę rozdzielania mikrofiltracyjnego.

Przpuszczalność stosowanych w jednostce rozdzielania ultrafiltracyjnego membran—UF wynosi 80—140 litrów /h-m², przy czym ciśnienie wyjściowe wynosi około 0,15—0,4 MPa, ciśnienie wyjściowe zaś około 0,1—0,3 Mpa. W celu zwiększenia trwałości mechanicznej membran płaskich wprowadza się między membrany a płyty odprowadzające filtru tkaninę podporową, przykładowo materiał włókninowy.

Roztwór inwertazy dzięki jednostce rozdzielania ultrafiltracyjnego zatęża się do około 1/10. W celu dalszego oczyszczania tego koncentratu roztworu inwertazy następuje dodatkowo diafiltracja poprzez jednostkę rozdzielania ultrafiltracyjnego. Koncentrat ten rozcieńcza się przy tym wodą w stosunku 1:1 i diafiltruje w obiegi dopóty, aż ponownie osiągnie się wyjściową objętość koncentratu.

Po tej ultra- i diafiltracji oczyszczony roztwór koncentratu inwertazy prowadzi się przez jednostkę rozdzielania mikrofiltracyjnego w celu oddzielenia zawartych w tym roztworze zdenaturowanych białek oraz mikroorganizmów. Średnica porów stosowanego materiału mikrofiltracyjnego wynosi 0,2 μπι, przy czym ciśnienie wejściowe nie powinno przewyższyć 0,3 MPa.W celu zwiększenia mechanicznej trwałości stosowanego materiału filtracyjnego, tak jak w przypadku jednostki rozdzielania ultrafiltracyjnego, stosuje się tkaninę podporową.

150 899

Za pomocą kolejno następującego, zwykłego stabilizowania nastawia się roztwór na aktywność około 1500 jedn./ml, czyniąc go zdolnym do przechowywania.

Szczególnie odpowiedni jest według wynalazku sposób do wytwarzania preparatów inwertazy o wysokiej aktywności właściwej [400—800 jedn./mg], dla których, zwłaszcza do celów analitycznych, istnieje szczególne zainteresowanie, przy czym w tym sposobie diafiltrację na wyżej omówionej drodze powtarza się 3—8 krotnie.

Osiągnięta na drodze omówionego postępowania wydajność stabilizowanego gliceryną roztworu inwertazy wynosi 75% w odniesieniu do wprowadzonych aktywnych drożdży piekarnianych.

Podany niżej przykład wykonania omówiono w oparciu o schemat ideowy, przedstawiony jako fig. na rysunku.

Ze 120 kg przechowywanych w temperaturze 2—4°C, aktywnych drożdży piekarnianych (o zawartości 30—33% HTS) sporządza się za pomocą 240 litrów wody mieszaninę w termostatowanym mieszalniku 1. Po upływie 30 minut powstaje jednorodna zawiesina drożdży o zawartości 10—15% HTS, którą utrzymuje się w temperaturze 10—12°C.

Ochłodzoną zawiesinę doprowadza się następnie pompą dozującą 2 do pracującego metodą ciągłą młyna wrzecionowego 3. Roztwarzanie komórek drożdżowych następuje przy tym w chłodzonym wodą, około 3 litrowym młynku, napełnionym za pomocą około 2400 g mikroperełek szklanych o średnicy 0,8—1 mm. Prędkość obrotowa wału mieszadła wynosi około 3000 obrotów/ minutę, a przepustowość zawiesiny 16 litrów/h. Roztworzona zawiesina drożdżowa płynie poprzez górny wylot młynka do termostatowanego mieszalnika 4. Pompą dozującą 5 doprowadza się tę zawiesinę do separatora 6. Tu oddziela się przeważającą część resztek komórkowych od roztworu zawierającego inwertazę. Z odcieku produktu z separatora 6 płynie faza, niemal uwolniona od resztek komórkowych, do zbiornika pośredniego 7. Prędkość dopływania zawiesiny poddawanej separacji wynosi około 50 litrów/h. Separator 6 jest przy tym każdorazowo po upływie około 0,75 h odszlamowywany. W celu uniknięcia większych strat wydajności enzymu, przerywa się przed odszlamowywaniem dopływ zawiesiny drożdżowej i wirnik płucze się wodą dopóty, aż u wylotu produktu wystąpi klarowna woda. Następnie włącza się wodę sterującą i spuszcza się szlam.

Ze zbiornika pośredniego 7 prowadzi się inwertazonośny roztwór za pomocą pompy dozującej 8 do filtra przepływowego 9 w celu filtracji klarującej. Klarowanie zachodzi dzięki zastosowaniu filtru przepływowego typu KP-10 A (40 X 40 cm) o przepuszczalności około 450 litrów/h-m². Aby podwyższyć jakość przesączu podkłada się stronę klarującą warstw filtracyjnych bibułą filtracyjną o nazwieNiederschlag 291 (40 x 40 cm). Ułożone warstwy filtracyjne przed rozpoczęciem tej filtracji płucze się wodą w ciągu około 20 minut.

Prędkość filtracji nastawia się na wartość około 80—100 litrów/h. Maksymalna różnica między ciśnieniem u wlotu i u wylotu filtru nie może być przy tym większa od 200—250 kPa.Filtr przepływowy 9 podłącza się przy tym tak, żeby obok procesu filtracji istniał obieg czynnika, tak więc zapobiega się powstaniu nadciśnienia, które mogłoby doprowadzić do przedwczesnego zniszczenia materiału filtracyjnego. Otrzymaną dzięki obiegowemu sposobowi ruchu pozostałość klarowanego, inwertazonośnego roztworu doprowadza się po zakończonej filtracji klarującej ponownie do separatora 6. Roztwór poddawany dalszej przeróbce wprowadza się do zbiornika pośrednika 10. Dalsze oczyszczanie, zatężanie i odkażanie roztworu zawierającego inwertazę następuje w specjalnym, złożonym urządzeniu ultra- i mikrofiltracyjnym 11

Pakiet płyt, znajdujący się na ramie, wykorzystuje 5 m² powierzchni filtru w celu ultrafitracji i 4 m² w celu mikrofiltracji. Dla jednostki rozdzielania ultrafiltracyjnego 12 stosuje się membrany-UF o przepuszczalności 80-140 litrów /h m² typu CAM-UF-120-CP (firmy VEB Zellstoff-und Zellwollewerke Wittenberge). Ten typ zapewnia odnośnie inwertazy selektywność powyżej 99%. W celu zwiększenia trwałości mechanicznej dodatkowo umieszcza się między membraną i płytą odprowadzającą filtru tkaninę podporową z materiału włókninowego.

Jednostka rozdzielania mikrofiltracyjnego 13 jest zaopatrzona w nukleośladowy mikrosączek z poliestru (firmy ZfK AdW Rossendorf) o średnicy porów 0,2pm. Także ten materiał filtracyjny w celu zwiększenia trwałości wspiera się materiałem włókninowym.

Ze zbiornika pośredniego 10 inwertazonośny roztwór przetłacza się za pomocą pompy dozującej 14 poprzez chłodnicę typu „rura w rurze 15 do jednostki rozdzielania ultrafiltracyjnego 12.

150 899

Roztwór ten na zasadzie przelewu prowadzi się poprzez płyty filtru, przy czym cząsteczki o masie powyżej 150000 zostają zatrzymane. Prędkość odcieku przesączu jest przy tym równa około 80—140 litrów/h przy wyjściowym ciśnieniu 0,1—0,3 MPa. Aktywność inwertazy w przesączu wynosi przy tym poniżej 0,5%.

Roztwór, otrzymany po filtracji klarującej, zatęża się drogą ultrafiltracji do 1/10 objętości. Koncentrat, otrzymany po ultrafiltracji, rozcieńcza się następnie wodą w stosunku 1 : 1 i w celu dalszego oczyszczenia diafiltruje w obiegu poprzez jednostkę rozdzielania ultrafiltracyjnego 12, aż ponownie osiągnie się wyjściową objętość koncentratu.

Wskutek blokowania obiegu ultrafiltracji przesyła się ultra- lub diafiltrowany koncentrat, znajdujący się w zbiorniku pośrednim 10, pompą dozującą 16 poprzez chłodnicę 15 do jednostki rozdzielania mikrofiltracyjnego 13.

Zawarte w koncentracie, denaturowane białka oraz mikroorganizmy, obniżające jakość produktu, oddziela się w tej jednostce. Wspomnianą aktywną powierzchnię filtracyjną nastawia się na przepustowość około 20 litrów /h, przy czym wejściowe nie powinno być większe od 0,3 MPa.

Oczyszczony, zatężony i odkażony roztwór inwertazy umieszcza się w termostatowanym mieszalniku 17 i tu miesza z gliceryną w stosunku 1:1, tym samym stabilizując roztwór. Wydajność stabilizowanego roztworu inwertazy wynosi 90 kg (75% w odniesieniu do wprowadzonych aktywnych drożdży piekarnianych).

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Biotechniczny sposób wytwarzania inwertazy z aktywnych drożdży piekarnianych, w którym z aktywnych drożdży piekarnianych o zawartości 30—33% suchej substancji drożdżowej (zwanej skrótowo HTS) sporządza się za pomocą wody zawiesinę o zawartości około 10% HTS i nastawia się jej temperaturę 10—12°C,znamienny tym, że komórki drożdżowe tej zawiesiny nieprzerwanie rozdrabnia się w znanym młynie wrzecionowym za pomocą mikroperełek szklanych o średnicy 0,5—1,2 mm i prędkości obrotowej wału mieszadła 2500—4000 obrotów /minutę, po czym w znanym separatorze uzyskuje się roztwór zawierający inwertazę, przy czym przed odszlamowaniem przerywa się dopływ zawiesiny i wirnik dopóty płucze się wodą, aż u ujścia produktu wystąpi klarowna woda, następnie roztwór ten poddaje się zwykłej filtracji klarującej za pomocą filtru przepływowego, przy czym warstwy filtracyjne wykazują przepuszczalność 425—475 litrów /h-m², strony klarujące tych warstw filtracyjnych są dodatkowo podłożone bibułą filtracyjną i przed rozpoczęciem filtracji klarującej te warstwy filtracyjne w ciągu około 20 minut płucze się wodą, przy czym różnica ciśnień u wlotu i wylotu filtru podczas tej filtracji jest nie większa od 200—250 kPa, filtr przepływowy włącza się tak, żeby obok procesu filtracji był możliwy obiegowy sposób ruchu i otrzymaną pozostałość klarowanego roztworu inwertazy ponownie poddaje się separacji, po czym roztwór doprowadza się do złożonego urządzenia, ultra- i mikrofiltracyjnego w taki sposób, że roztwór najpierw przeprowadza się przez jednostkę rozdzielania ultrafiltracyjnego, poddaje się obiegowi diafiltracji i następnie prowadzi się przez jednostkę rozdzielania mikrofiltracyjnego, przy czym przepuszczalność stosowanych w jednostce rozdzielania ultrafiltracyjnego membran wynosi 80—140 litrów/h-m², ciśnienie wejściowe wynosi 0,15—0,4 MPa, ciśnienie wyjściowe zaś 0,1—0,3 MPa, i między membranami a płytami odprowadzającymi filtru jest umieszczona tkanina podporowa, przykładowo materiał włókninowy, roztwór ten najpierw zatęża się do około 1/10 dzięki jednostce rozdzielania ultrafiltracyjnego, po czym koncentrat ten w stosunku 1 :1 rozcieńcza się wodą i diafiltruje w obiegu dopóty, aż ponownie uzyska się wyjściową objętość koncentratu, następnie ten oczyszczony roztwór koncentratu inwertazy przeprowadza się przez jednostkę rozdzielania mikrofiltracyjnego, przy czym średnica porów stosowanego materiału mikrofiltracyjnego wynosi 0,2 μπι, ciśnienie wejściowe jest nie większe od 0,3 MPa, a materiał filtracyjny, tak jak w przypadku jednostki rozdzielania ultrafiltracyjnego, jest zaopatrzony w tkaninę podporową, i następnie roztwór koncentratu inwertazy stabilizuje, standaryzuje i konfekcjonuje się w zwykły sposób.

150 899 ι~~ι

OJ

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz. Cena 1500 zł