PL141118B1 - Process for preparing pancreatin - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia pankreatyny.Jako pankreatyne okresla sie wyeksstrahowana mieszanine enzymów trzustki, skladajaca sie glów¬ nie z lipaz, amylazy i proteaz. Pankreatyne stosuje sie jako substancje czynna do leczenia zaburzen trawienia, które polegaja na niewydolnosci trzust¬ ki. Jako material wyjsciowy do otrzymywania pankreatyny sluzy przede wszystkim trzustka wie¬ przowa w stanie swiezym lub zamrozonym, z któ¬ rej pierwotnie odciagnieto tylko wode i tluszcz. Ze wzgledu na wrazliwosc enzymów odciaganie to na¬ lezy przeprowadzac bardzo ostroznie.Wedlug jeszcze dzis stosowanych sposobów su¬ szenie i odtluszczanie prowadzi sie rozpuszczalni¬ kami, które rozpuszczaja jednoczesnie wode i tluszcz, np. acetonem lub wyzszymi alkoholami. Wedlug innych znanych metod obydwa procesy prowadzi sie kolejno, przewaznie najpierw suszenie {meto¬ da suszenia w stanie zamrozenia), a potem od¬ tluszczanie latwo lotnym rozpuszczalnikiem tlusz¬ czu, albo tez odwrotnie, a mianowicie odtluszcze¬ nie w fazie cieklej chlorowcowanymi weglowo¬ dorami, a potem suszenie wodnej fazy.Wszystkie preparaty pankreatyny, które otrzy¬ mano wedlug jednego z tych sposobów, wykazu¬ ja te niedogodnosc, ze proteazy, np. trypsyna i chymotropsyna nie wystepuja w nich w stanie wolnym, lecz w nieaktywnej postaci enzymoge- nu. Dlatego wlasnie u pacjentów, którzy nie pro- 10 15 20 25 30 dukuja wlasciwych cialu enterokinaz, nie moga one byc aktywne, sa wiec calkowicie nieskutecz¬ ne.Dalsza niedogodnoscia jest to, ze te pankreaty¬ ny zawieraja wlókna, które pochodza z tkanki lacznej gruczolów i sa bezwartosciowe pod wzgle¬ dem leczniczym. Ten udzial wlókien przy gale¬ nowych preparatach nie tylko przeszkadza w pro¬ cesie prasowania, lecz takze utrudnia pozadany rozpad wypraski w miejscu dzialania i przez to enzymy w duzej czesci sa nieuzyteczne.W niektórych nowszych metodach dostosowano sie do tego rozpoznania. Usuwa sie wlókna i w celu otrzymania aktywnych enzymów przeprowa¬ dza sie autolize. Ale przez autolize enzymy zosta¬ ja nie tylko uwolnione, lecz takze uszkodzone, co prowadzi do tego, ze nie uzyskuje sie tymi sposobami pelnej wydajnosci enzymów.Autolize przeprowadza sie w bardzo rózny spo¬ sób. Wedlug sposobu opisanego w opisie paten¬ towym St. Zjed. Am nr 3 223 594 autolize prowa¬ dzi sie np. przez 2 godziny w temperaturze poko¬ jowej w obecnosci duzej ilosci wody, a wedlug opisów patentowych RFN nr nr DOS 26 20 289 i 2716 719 autolizuje sie przez 15 godzin w tempe¬ raturze 15°C wzglednie przez 4 godziny w tempe¬ raturze 15°C w obecnosci nie mieszajacych sie z woda rozpuszczalników tluszczu. Wedlug opisu patentowego Wielkiej Brytanii nr 1328 202 auto¬ lize prowadzi sie w ciagu 1/2 — 2 godzin w tem- 141 118 ^141118 3 peraturze 20—30°C z dodatkiem lugu sodowego lub amoniaku. W wylozeniowym opisie patento¬ wym RFN DAS 2106 706 przedstawiona jest auto- liza, która, dla poprawienia- aktywnosci entero- kinazy, prowadzi sie w temperaturze 4°C przez 7 dni w obecnosci dwunastnicy wieprzowej.Wedlug opisu patentowego St. Zjed. Am. nr 3 223 594 podana jest wydajnosc 11% wagowych z jednostkami enzymatycznymi do 10XNF gkt od¬ powiada, okolo 69°/o mozliwej wydajnosci enzy¬ mów, poniewaz na ogól! 100 g tkanki gruczolowej, wysuszonej i odtluszczonej bez strat, daje 20 g Jankrsatyny o jakosci 8XNF.W opisie patentowym Wielkiej Brytanii nr 1328 202 znajduja sie dane jakosciowe 6 — 10XNF, »przy wydajnosci wagowej sterylnie przesaczonej' pankreatyny. 3,4*/o,. co zatem odpowiada tylko 13— 21%*' obliczeniowo mozliwej wydajnosch enzymów, W opisach patentowych. RFN nr nr DOS 26 20 289 i 2716 719 donosza o pelnej wydajnosci enzymów tylko odnosnie lipazy, natomiast wydajnosci amy- lazy i proteaz sa widocznie tak znacznie nizsze, ze nie mówi- siec tu wiccjboi er* flaaakreattoila^ leta* o preparacie enzymatycznym bogatym w lipaze..Obliczeniowo mozliwej wydajnosci aktywnowa- nych enzymów dotychczas oczywiscie jeszcze nie otrzymano; Nie ma takze zadnych danych odnos¬ nie rozmiaru aktywowania proteaz; który, moi* na okreslic przez porównanie aktywnosci proteaz z aktywowaniem i bez aktywowania enterokina- za. Bez aktywowania znajduje sie tu ponizej 0,5 jednostki FlP/mg.W powyzszym oposie stanu techniki NF oznacza skrót National Formulary, urzedowa amerykanska farmakopee, wydana .przez American. Pharmaceu- tical Association. Na stronie 514 13. wydania (NF XIII) opisanar jest pankreatyna jako zawierajaca enzymy substancja, której aktywnosc amylazy wyr starcza, aby co najmniej 25-krotny ciezar skrobi ziemniaczanej przeksztalcic w rozpuszczalne weglo¬ wodany oraz. takze przeprowadzic, proteolize na 25-krotnym ciezarze kazeiny.. Pankreatyny o wiek- szej, sile. trawiennej zaopatrzone sa w odpowied¬ ni wspólczynnik wielokrotnosci.Tak na przyklad 4-krotne NF, albo 4XNF, ozna¬ cza pankreatyne która zawiera tak duzo amyla¬ zy, proteaz i lipazy, ze. 1 g tej pankreatyny moze katalizowac przeksztalcenie 100 g (=4 razy jej 25-krotny ciezar) kazdorazowo odpowiedniego, sub- stratu, jak skrobi, kazeiny, oleju z oliwek.Okreslenie jednostek FIP jest podane przez „Commissisn on Pbarmaceutical Enzymes" pod gjótwnym, zwiazkiem. „Federation Internationale Ehaffmaceutiaue" (=~FIP) w monografii „PfcarmaT ceutieal rEnzymefi" R. Ruyssen i A, Lauwers, 1978, Scientific, Publishing Company, Gent/Belgien. Na stronie;. 22 znajduje^ sie, ogólna wypowiedz, ze 1 FIP katalizuje reakcje, 1 mikromola wzglednie 1 mikrorównowaznika, substratu jia minute przy po¬ za tym dobrze okreslonych warunkach, zewnetrz¬ nych. allx, w przypadkach.w których substrat pod wzgledem chemicznym jest okreslony niewystar¬ czajaco, zostaje wytworzony 1 mikromol wzglednie 1 mikrorównowaznik produktu reakcji na minute. 10 15 2fr 25 30 40 45 50 55 Stosowane do oznaczania poszczególnych enzymów warunki zewnetrzne opisane sa na stronach 21— 84.Jednostki FIP oznacza sie zatem przez pomiar katalizowanej predkosci reakcji poczatkowej i dla¬ tego otóeslfer sie' je takze szybciej i dokladniej niz wczesniej1 uzywana? wielokrotnosc NF.Nizej podane jest przydatne przeliczenie jednos¬ tek FIP na. iakosó »-krotne NF (doswiadczalne), które obejmuje takze jednostki lipazy, chociaz w NF XIII oznaczanie lipazy nie jest opisane. Przy tym przyjeta; ze preparat pankreatyny, który od¬ nosnie amylazy zanalizowano np. jako 6-krotne NF, równiez odnosnie proteaz i lipazy' mialby 6- -krotne NF, a wiec stosunek aktywnosci enzymów w naturalnej trzustce- wieprzowej i w wytworzo¬ nym z niej preparacie pankreatyny jest uwazany za. staly.Praktyczna korzyscia przy podawaniu wspólczyn¬ nika NF jest moznosc wyrazenia jedna jedyna liczba jakosci pankreatyny odnosnie aktywnosci wszystkich zawartych w niej enzymów.Wedlug wynalazku; odpowiadai tto 1-krotne NF = 6 250 FlP/g pankreatyny dla amy¬ lazy = 5 000 FlP/g pankreatyny dla li¬ pazy 4 =*- 375 FlP/g pankreatyny dla tryp- syny = 1 250 FlP/g pankreatyny dla chy- motrypsyny Przez podwojenie wartosci FIP* dochodzi sie do 2-krotnego NF itd.Wedlug opublikowanych sposobów, które wy¬ chodza z autolizatu, pankreatyna nigdy nie wy¬ traca sie w postaci, która mozna bezproblemowo przerabiac dalej. Równiez' sposoby, wedltig których z trzustki uzyskuje sie bezposrednio pankreatyne, i to o wysokim ciezarze nasypowym, nie istnieja w scislym zrozumieniu; moznaby zaliczyc'tu ewen¬ tualnie wytwarzanie preparatu enzymatycznego bo¬ gatego w lipaze wedlug powyzszych ogloszenio¬ wych opisów patentowych RFN, które wprawdzie prowadzi sie ze znacznym nakladem technicz¬ nym i trzema róznymi rozpuszczalnikami.Celem wynalazku bylo opracowanie jak naj¬ prostszego i bezpiecznego sposobu, którym bez du¬ zego nakladu technicznego i przy pelnej wydaj¬ nosci enzymów otrzymuje sie. pnkreatyne o nai- wyzszej aktywnosci enzymatycznej i z wolnymi proteazami, które poza tym zawiera mala v ilosc' za¬ razków, jest sypka, posiada wysoki ciezar nasy¬ powy i wolna jest od wlókien oraz, która imozna praktycznie bez straty enzymów przerabiac i' skla¬ dowac, przy czym sposób polega na autcrlizie wod¬ nej, ewentualnie zawierajacej jony wapnia' pap¬ ki tkanki trzustki wzglednie wodnej zawiesiny tkanki, usunieciu i wysuszeniu otrzymanego osadu": Sposób otrzymywania pankreatyny wedlug, wy¬ nalazku polega na tym, ze autolize prowadzi sie w srodowisku wodnym zawierajacym do 20°/o wago¬ wych alkoholu izopropylowego, w odniesieniu do zawiesiny, przy pH 6,5—8,5, przewaznie w obec-ftlffc rf tfosfci1 bttfo» rtastawiajacegb Warttfslf pff 6,5—7-5, korzystnie do4 3«7*, a zwlaszcza 1—l4,5"f» wodoft)we<- glanu metalu* alkalicznego; w1 odniesieniu do uzy^ tef tlhmki, i; eWenttiafnie. W dbettnósei mafef Ab^ ci' soli1 wapnic, w teniperaturfce* ponizej' 3&9G iv prz^* rywa* sie Jfc gdy tylka* próba! zawiesiny autblizd^ wartej1 w 3^##o uwodnionym* alkoHoilr ifcbpró^ pylowym osiagnie predkosc sedymentacji* od- c&o* lb* 3 db< 10 mrtt/r do^ 3* minut Darte odhosza* si^ do walnej* s€fdymentajeji; w polu ciezkosci ziemia a wiec bez* odwirowania*.Autolize przerywa sie przez dodanie1 do autoliza- tu alkoholu izopropylowego az do stezenia 30—35*fb wagowych, liczac na sume Wody f alKoliblU izopro¬ pylowego; otrzymany" przy tyttl Jednoczesnie cie¬ kly autblizat1 oddziela si(f od wl&kien tkanki licz¬ nej przez sito. N&st&nle aiitóliZaf wprowadza sie W temperaturze 15—2'5^fc do alkoholu izopropylo¬ wego, tistit ze po-wstkie^ 55^65*/* roztwór, zhbWu liteap nl stffiiC. WbdV i ^Ik&hditr izopropylowego, z\kttfrea«r wytraca sl$" pankreatyna Wr grubbziar- niirtef pbstSd' i iWtytUmflkrt ulega ,kedymenta;cji; Pb otilknlu ustale^ cteezy^ osadzona pankileatyne eweirttlaln^ przemywa^ sie, dla Mwóhiienia Jej od tlttózTOT i* tryptbnu; przez' gili&tót)trie Tpmieszanie z- aiKDllóiettt Iz^pro^yibwym^ aiife- acetonem i* po¬ zostawienie* der s*etTJrmentaicJi: dsatf pówiiliert osta¬ tecznie wykazywac stezenie* kotfeowe alkoholu' izo- propyloWfegof wynoszace' 7t)—#5* zwlaszcza okolo 75—76«fe Wafeftwycli wzglednie 80^95*W acetbnu i po ddbi^ghlecltó go lUb* odwirowaniu suszy'sie; osad korzystnie* pot*- zmniejszonym cisnieniem i przy traktowaniu w temperaturze ponizej 2ft°Cl suszym powietrzem; wykazuJsfcynr wilgotnosc wzgledna w temperaturze 20^C'ponizej'zt)*/©,. albo azotem, dpi1 sarre' wyzej przemywanie osadu mozna prowadzic równiez'przy uzycltr acetonu zamiast* alkoholu iZo- propyibwegóc Btair przemywania nie' jestv konieczny i stosuje sie" gb W* zaleznosci' od* zadanej; czystosci koncowe¬ gopTodtikttr. przy powyzszych' danyctf odhosnie zawartbsti^alkonoltt w wodnych róztwbraclf Wzgled¬ nie- ustalycfr cieczach; jezeli wcflbdzi w rachube ciezar uzytego' stirbwegó materialu, przyjmuje sie Jegbv zawartosc wody 6W' wagowych.Dla podanego osfatftib stezenia koncowego al- koribltr izopropylowego w' osadzie trzeba przede wszystkim przestrzegac, aze^y ustawianie równo¬ wagi miedzy* osatiem i,ustala ciecza* moglo' trWac l^rtJtó dlugó; poniewaz ciala bialkowe bardzo upor¬ czywie zatrzymuja wode i dlatego w obrebie wy¬ traconych czastek utrzymuje sie najpierw faza bo¬ gata W~ Wode." Dlatego równiez te dkrte stezenia ftfofibowegó* odfrosza sie nie do analitycznego skla¬ du l fazy' roztworu, lecz" sa one, Jak podarhó wyzej, obliczone.Przy prowadzeniu procesu sposobem Wedlug* wy¬ nalazku' praktycznie postepuje sie nastepujaco: zmielona lub pokrojona trzustke, celem lepszej ifl&ziiwoseiH misszanfat zadaje* sie 2&^-#W WWdy.Za* potttotas- olltolo l^-l,5fA Wod&WCg&ftu" s&tffeWe^ gfc" proces- awtoiizyl w? pozadany* speratfbl sl$fct&wi*^ Je* sie* r przyspiesza* detifcatrtie^ ttf zna**y ¦ tfe**wy^ stepowania* ifsztfotfieftia* enzymów.* Efodatefc* wieK*- szy niz ^wodoroweglanu mógltty z^tgfazaó ^wa*- lbtó pankreatyny podczas1 skladowania, tf&dafek malej; iitóci rtp: ponizej l6/o, a61V wapniowej1 srirzy- jaj au^rfizie. *#" miare' UWaihiatila"l {tfote&tf t' fcB 5 pr^enzymóWi wskutek ciagle rtisnacej* ilosci' wbl^ nych pr^teaz-; przyspiesza sie ^z^de1 wszystkim trWanre^ tbwarzyszadych1 substancji BialftoWycli trzustki; Trawienie rozszerzaloby sie Wreszcie na wrazli¬ we enzymy, tak ze szczególnie arnylaza i takze same prbteazy' bylyby uszkadzane. Ispecjalnie dla ochronienia prbteaz dodaje* sie do mieszaniny do ZO^/ó; zwlaszcza okolo 10—lWe, alk^oholu* izopropy¬ lowego. Jednak' sam ten dodatek' nie wystarcza, aby' calkowicie utrzymac' aktywnosci enzymatycz¬ ne: 71 tego" wzgledu wazne jest ustalenie momeri- tti, W' którym* najlepiej' jest p"rzerwa£V autolize a mianowicie nas krótko przed Rozpoczeciem" uszka- ^ dtónia* enz^ltiow^ Tak1 wietf, cz*s' trWanta aiitóllzy Jest^ bartfeo r*ózny w; tyt?h s-amycfr warunkach; za¬ leznie otl' pochodzenia, Wieku i Sllladbwania' trztife- te». Ogólhe1^ pddatliir ciasu jfest' wl^fc niemozliwe; gdyz: róznice W cza%iel docttbdzal dfe- 6(WW.( ^ Wedlug' wynalazku naJkorzysthiejszy moment us*alk sleLw ten^ s^ósóH; ze prostym testem^ szyb^ kyrteiowymr na* praUie^ autoiizatii' oznacrza* sie opty- maift^ pr^dftos^ ^edymeritatji wl sS^S«/i alkohol lu iz^«*y!bWfed Tert-t^st 'settymetrtatfi' je^tf prak- OT tyczfti^ w^rt^ie ^04^^^' rta' malytrttA prótóadh dklsiym przeTotóettr autbllzatu azf dó wytfacenia F«nl*e^tyhy i- óbseTWcrwanient1 stale^ zmieniaj^ce- go ski postepowania1 Jej' sed^entaejt.W tym ceitti mozna" rtflf; l/z godzifiy, a" potf koTliec 3j taicze itp. co 10' alBtr li* mintit, riobietac' kazdora¬ zowo- IV g1 zawiesiny atitblizatti, wy*m1eszac zl 5 ml a^'aiktrtfc!u izotJr^^ló^ne?gty i poWstaiy rifetWóf Whtf p«y mieszaniu'dó 20 nil1 S'11/© aikOWólll4 izo¬ propylowego. Nastepnie oznacza sie predkosc tfe*- ^ di^nent^cji wytratbne^ó osadti.v JezeMJ 0o'3' rMtiu- tacH' sedym«itacjfi w- zlfewtel O' tidJetnnbSbi1 5b mi Wió^czrtar Jest^np/ wieksza*1 riiz 3^5^ mm'kiafbwna górna watstwa, z* nejguiy osiagnieta4 jest bfrlyrtiai^ na pr^dkos6: sis^trierttatiji i; r/rz*ez tb takie sztl- ^ kana cbwfla* przeti tlszkadzarfiem^ enzymów: róz- poezynajace^ si^ u^kótlzerfie- eWzymów^ moznal rbz- pozarta^ po* tym; ze" yjtslalk* górtta* warstwo riler Jest1 Marcrwna- wzglednie- osatT odo^leloYry jest dd Ustir- lej cieczy metna strefa: f1j '¦'•¦'•¦ s^ W tdtii- ttzysfenia tferdzief jefhffblite^ó1 pteti*fk)- wattia4 autblizy** rtizttycti w^aWw- Itbtzystn^4 jest^b^ dittie rtiettf patórt^eatyn^ z-J W(*^nie^itógtf * wsatftfr Mrtblize' |frb#adz?' dxj» w^ tetn^etatlffze^ ±4 cfc —30^, zwiasztza^poffizej 2lt*£, $tz? czym nie Jtet' «T potrzebne*' zachowanie^ stalej-! tettrjp«atuty. Przezd W wylim« sf^ mtfóstw^ moilfwosli; dzytttb^yei^ j*kl zaiosztz^tlzeMe^ettergfi, mdzlfw^s^' prb^atJ4etiiav att^ tolizy noca i pod koniec tygodnia oraz zaoszcz^1 dzeme' cia»u ^racy. lft^órzystft*e*tey^' pmm* Wtn- <& cow^r r^z^oznafe" si^ stkl^ zA^i^Wio^tt^fk's^dy^l m*nt^ejiv Caiy Wsad^zatfale sie*tfeff^* <&&m ifó&i¥attfe*^' m izttproptffiweW aby p^etW^c'' aiAoffi^ Stffr sobem wedlug wynalazku, droga mieszania prze# & krottó cza* rnHesttonfaf j^zy za^a^i PL PL PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania pankreatyny przez au- tolize wodnej, ewentualnie zawierajacej jony wap¬ nia zawiesiny tkanki trzustki, polegajacy na usu¬ nieciu wlókien, ewentualnym odwodnieniu, odtlu- 18 szczeniu, wytraceniu i wysuszeniu otrzymanego osa¬ du, znamienny tym, ze autolize prowadzi sie w srodowisku wodnym zawierajacym do 20f/o wago¬ wych alkoholu izopropylowego, w odniesieniu do zawiesiny, przy wartosci pH 6,5—8,5, w tempera¬ turze ponizej 30°C i przerywa sie ja przez doda¬ nie alkoholu izopropylowego do stezenia 30—35%, liczac na sume wody i alkoholu izopropylowego, gdy tylko próba w 55—65% uwodnionym alkoholu izopropylowym osiagnie mierzona w polu ciezkos¬ ci ziemi predkosc sedymentacji od okolo 3 do 10 mm/l do 3 minut, po czym otrzymany ciekly pre¬ parat oddziela sie od wlókien tkanki lacznej, roz¬ twór wprowadza przy temperaturze 15—25°C do 15 takiej ilosci alkoholu izopropylowego, ze powsta¬ je 55—65% wagowo wodny roztwór alkoholu izo¬ propylowego, wytracona penkreatyna w ziarnistej postaci pozostawia sie do sedymentacji, po odla¬ niu ustalej cieczy ewentualnie przemywa sie dla uwolnienia od tluszczu i tryptonu przez kilkakrot¬ ne wymieszanie z alkoholem izopropylowym i se¬ dymentacje oraz suszy, korzystnie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem,

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wytracona pankreatyne pozostawia sie do sedy¬ mentacji i po odlaniu lub odciagnieciu ustalej cie¬ czy przemywa sie dla uwolnienia od tluszczu i tryptonu przez ewentualnie kilkakrotne wymiesza¬ nie z alkoholem izopropylowym albo acetonem az powstanie osad o stezeniu 70—85% alkoholu izo¬ propylowego wzglednie 80—95% acetonu, który od¬ sacza sie pod zmniejszonym cisnieniem lub odwiro¬ wuje i przy traktowaniu suchym powietrzem lub azotem suszy w temperaturze ponizej 25°C, ko¬ rzystnie pod zmniejszonym cisnieniem.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze nastawienie wartosci pH prowadzi sie pizy uzy¬ ciu 3%, liczac na uzyta tkanke, wodoroweglanu metalu alkalicznego.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze autolize prowadzi sie w obecnosci pankreatyny z wczesniejszego wsadu. 20 25 40 45 WZGraf. Z-d 2, — zam. 404/87 — 80 + 16 Cena 130 zl PL PL PL PL PL