NO882051L - Mrna-stabilisering i dyreceller. - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte for økning av produksjon av proteiner, f.eks. humant tPA 1 pattedyrceller soa normalt utskiller lmmunoglobullner. Nedbrytning av mSNA transkribert fra rekombinant DNA reduseres ved å redusere lengden av det lkke-translaterte området av mBNA'et. Oet lkke-translaterte området av ONA som koder for et protein av Interesse, forandres til å produsere et kortere rekombinant DBA med et lkke-translatert område, omfattende et poly A-adaisjonsslgnal (AATAAA) og mindre enn ca. 300 nukleotldbaser plassert mellom poly A-signalet og stoppkodonet 3' av kodonomr&det til genet av Interesse. Pattedyrcellellnjen transfekteres og dyrkes til å produsere større mengder av det Interessante protein enn den såmne cellelinjen transfektert med det Ikke-endrede DNA.

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen vedrører produkter og fremgangsmåter

for å øke fremstillingen av proteiner i pattedyrceller av lymfoid opprinnelse. Nærmere bestemt vedrører den produkter og fremgangsmåter for å øke proteinproduksjonen ved å øke konstantnivået for translaterbart kompetent mRNA ved å redusere den intracellulære nedbrytningshastigheten av mRNA'et.

Proteinproduksjon i de fleste dyreceller innbefatter

syntese av enzymer, strukturproteiner, overflateproteiner og tallrike proteiner med spesialiserte funksjoner så som lymfokiner og hormoner. Typisk produseres relativt moderate mengder av disse proteiner. Det finnes imidlertid typer av dyreceller som er i stand til å produsere og utskille store mengder av proteiner for systemisk bruk i det animalske legemet. Eksem-

pler på den siste typen av celler innbefatter celler i kretsløps-systemet som produserer globuliner og fibrinogen, leverceller som produserer serumalbumin og betacellene til Islets of Langerhans som produserer insulin. Hvis de genetiske mekanismer

som er ansvarlig for et slikt høyt ekspresjonsnivå kunne utnyttes til å produsere lymfokiner, antistoffer eller andre proteinaktige interessante materialer, kunne store mengder av verdifulle proteiner bli tilgjengelige.

Ekspresjon av endogent DNA i eukaryotiske celler innbefatter transkripsjon av DNA'et i mRNA, etterfølgende vandring av mRNA'et til ribosomer etterfulgt av tRNA-bevirket translasjon av mRNA'et til proteiner omfattende sekvensen av aminosyrer som kodes for av mRNA mellom dets start- og stopp-signalkodoner.

Som beskrevet av Gillies et al i Cell, Vol 33, pp 717-728,

Juli 1983, og i den samtidige svevende U.S. patentsøknad nr. 592.231, innsendt 22. mars 1984, spiller celleforøkningselementet en viktig rolle i ekspresjon av store proteinmengder i spesialiserte som fremstiller store mengder av immunoglobulin.

Forsterkerne synes å virke ved å øke hastigheten av DNA-transkripsjon til mRNA ved endogen mRNA polymerase. Økede konsentrasjoner av mRNA fører til signifikante økninger i ekspresjonsnivået i slike celler. Aktiviteten til slike forsterkerelementer er avhengig av orientering og kan observeres selv når sekvensen som omfatter forsterkeren befinner seg 10.000 basepar eller mer vekk fra promotoren for genet som koder for proteinet. Disse cellulære forsterkere synes å være vevs-spesifikke, dvs. aktiviteten til en cellulær forsterker som virker i det endogene genomet til en lymfoid celle og øker produksjonen av et spesielt mRNA reduseres sterkt eller mangler hvis forsterkeren sitter i en vektor som brukes til å transformere ikke-lymfoide celler. Imidlertid kan en vektor som

inneholder forsterkerelementet, promotor og et rekombinert gen som koder for et ønsket protein, hvis det transkripteres i en celle av den samme type som den hvori forsterkeren naturlig øker transkripsjonshastigheten, med hell transformere cellen til å uttrykke det rekombinerte gen i høye nivåer.

Eukaryotiske DNA'er omfatter en sekvens av baser forbi stopp-signalet, hvorav en del tjener som et signal til å

igangsette tilføyelse av adeninrester (heretter poly A) 3' av stopp-signalet i det translaterte mRNA. Polyadenyleringen forekommer hovedsakelig i kjernen og bevirkes med poly A

polymerase som tilsetter en adenylsyrerest av gangen. Poly A

koder ikke for en aminosyresekvens etter at stoppkodonet har avsluttet translasjon, men antas å bidra til stabiliseringen av mRNA'er og til effektiviteten av translasjon av det mRNA-

kodende området til aminosyrer.

Poly A i mRNA'et av pattedyrceller ligger i en sekvens

kjent som den 3'-ikketranslaterbare (heretter 3'UT) endedel.

3'UT strekker seg typisk fra avslutningskodonet for translasjons-produktet og enden av poly A. 3'UT-området av pattedyr-mRNA'er har typisk et homologiområde kjent som AAUAAA heksanukleotid-sekvensen. Denne sekvensen antas å være poly A-addisjons-

signalet. Det ligger ofte 11 til 30 baser foran poly A-addisjonssetet.

Funksjonen, om den foreligger, av 3'UT og poly A-området,

er nylig blitt undersøkt av Soreq et al., (Proe. Nati. Acad.

Sei. U.S.A. Vol. 78, No. 3, pp 1741 - 1745, Mars 1981); Zaret

et al., (J. Mol. Biol., 1984 Vol. 176, pp 107-135); Baralle (International Review of Cytology, Vol. 81, pp 71-106); og Ross

et al., (J. Mol. Biol., 1983, vol. 167, pp 607-617).

Soreq et al. rapporterte at fjerning av poly A og ca. 100 tilstøtende rester fra første human-fibroblast-beta-interferon-mRNA ikke forandret translasjonsaktiviteten eller funksjonsstabiliteten til dette mRNA I oocytter, mens delesjonen av poly A og ca. 200 tilstøtende rester ikke reduserte dets transla-sjonsvirkning. Fjerningen av ca. 200 poly A rester og 200 tilstøtende rester fra et andre beta-interferon mRNA forandret ikke hverken translasjonsaktiviteten eller funksjonsstabiliteten til mRNA'et i oocytter. Disse forfatter konkluderte at hverken poly A restene eller store segmenter av det 3'-ikke-kodende område kreves for å opprettholde funksjonell stabilitet av human beta-interferon mRNA'er i slike oocytter.

Zaret et al. studerte cyc 1 - 152 mutanten fra gjæren S. cerevisiae som inneholder en 38 basepars delesjon i det 3'-ikke-kodende området av CYC-1 genet som koder for iso - 1 - cytokrom c. Det rapporterte at forskjellige 3'-ikkekodende sekvenser som oppsto v ed kromosomal omleiring øket stabiliteten av CYC-1 mRNA og hadde varierende virkninger på mRNA-trans-lasj ons-vi rkning.

I Baralles publikasjon, The Functional Significance of Leader and Trailer Sequence in Eucaryotic mRNAs, rapporterte forfatteren at der er "ingen åpenbar funksjon for det 3'-ikkekodende området" og at "forekomsten av regulerbare delesjoner eller innskudd under utviklingen av disse gener tyder på at de spesielle sekvenser som omfatter det 3'-ikkekodende området ikke er vesentlige for mRNA-funksjonen." Baralle rapporterte imidlertid at poly A ikke har noen rolle ved å gi mRNA stabilitet. For eksempel er det blitt funnet at fjerning av poly A-segmentet fr globin mRNA sterkt reduserer halveringstiden til mRNA i oocytter. Imidlertid antyder Baralle at poly A åpenbart ikke er nødvendig for vellykket translasjon, hvilket er blitt demonstrert ved undersøkelser hvor poly A er blitt fjernet fra mRNA'et.

Ross og Pizarro studerte hypotesen at konstantnivåer av humant beta- og delta-globin proteiner delvis bestemmes ved den intracellulære stabiliteten til deres respektive budbringer-RNA'er. De fant at det raske skifte av delta-globin i mRNA i det minste delvis forklarer det lave nivå av delta-globin mRNA i ikke-nukleære perifere blodreticulocytter, og antok at mRNA-forfallsgraden kan bestemmes med nukleotidsekvens-signaler som befinner seg i det 3'-ikketranslaterte området. De observerte at de 5'-ikketranslaterte områder av beta- og delta-globin-mRNA'er er lignende, men at deres 3'-ikketranslaterte områder adskiller seg signifikant, og foreslo at det skulle være mulig å prøve rollen til det 3'-ikketranslaterte området ved bestemmelse av mRNA-stabilitet ved å sammenligne halveringstidene i transfekterte celler av kimere mRNA'er som inneholder beta-eller delta-3'-ender.

Europeisk patent 0077689 beskriver en fremgangsmåte for genmanipulasjon hvor en gjær transformeres med et gen hvori 3'UT av et strukturelt gen tilføyes nedstrøms fra et eksogent gen. Transformanten viser et høyere ekspresjonsnivå når det eksogene gen inneholder 3'UT'er. Faktisk viste undersøkelsen at ekspresjonen i gjæren som inneholder plasmidet med området tilsvarende 3'UT tilsatt, er ca. 10 ganger sammenlignet med gjæren som inneholder plasmidet uten noe slikt tilføyet område.

Det er et mål for denne oppfinnelsen å tilveiebringe et produkt og en fremgangsmåte for effektiv produksjon av et ønsket protein som inneholder humant tPA i visse typer dyreceller. Et annet mål er å frembringe vektorer for transfeksjon av dyreceller for å indusere sterk ekspresjon av et gen som koder for et ønsket protein. Et annet mål er å frembringe transformanter, som ved dyrking gir store mengder protein for terapeu-tiske, diagnostiske og beslektede anvendelser. Enda et annet mål for oppfinnelsen er å tilveiebringe fremgangsmåter og rekombinante DNA'er som bevirker mRNA-stabilitet i transfekterte cellelinjer ved å redusere graden av det intracellulære mRNA-forfall, og derved øke ekspresjonsnivåene.

Disse og andre mål for oppfinnelsen vil fremgå klart for

en fagmann fra den følgende beskrivelse og krav.

Sammenfatning av oppfinnelsen

En fremgangsmåte er nå oppdaget for å øke produksjonen av selekterte proteiner i pattedyrcellelinjer som normalt utskiller immunoglobuliner. Det er blitt funnet at et kort segment av et 3'UT-område og polyadenylerings-området, ved rekombinasjon 3'

av stopp-kodonet i et DNA som koder for et protein av interesse, effektivt påskynder en økning i produksjonen av det interessante protein. Sekvensene som omfatter det lille segment av 3'UT og polyadenylerings-setet viser seg å stabilisere mRNA tilsvarende det translaterte området og øke translasjonsnivåer. Konstantnivået for mRNA'et som koder for proteinet av interesse økes i forhold til mRNA'er med lengre ikke-translaterte områder.

Ifølge oppfinnelsen utnyttes denne oppdagelsen til å frembringe vektorer og fremgangsmåter for å produsere et protein av interesse og å produsere transformanter som kan dyrkes og gi slike materialer på forbedrede ekspresjonsnivåer. Enten eksogene eller endogene proteiner kan fremstilles ifølge oppfinnelsen, dvs. man kan fremstille proteiner som ikke kodes fra det naturlige genom i vertscellene, proteiner som kodes

for, men normalt ikke uttrykkes i vertscellene, eller proteiner som normalt bare uttrykkes i små mengder.

Ifølge oppfinnelsen utledes et DNA som inneholder et kodeområdet, et stoppsignalkodon og et opprinnelig 3'UT innbefattende et polyadenyleringssignal for proteinet av interesse fra en celle som naturlig produserer proteinet av interesse. Nukleotidsekvensen av 3'UT-området til dette DNA forandres til å produsere en intakt, transkriberbar kompetent, kortere rekombinant DNA med en forandret 3'UT med mindre enn ca. 300 nukleotidbaser mellom stoppsignalet og AATAAA polyadenyleringssignalet. Det rekombinante DNA transfekteres i en valgt pattedyr-cellei inje som normalt utskiller immunoglobuliner. Den resulterende transfekterte cellelinje dyrkes og fremstiller proteinet av interesse. Mengden produsert protein er større enn for den samme cellelinjen som inneholder uendret DNA for proteiner av interesse, som inneholder det lengre opprinnelige 3'UT.

I en utførelsesform inneholder det kortere rekombinante

DNA en del av 3'UT av DNA'et for proteinet av interesse, skjønt 3'UT fra andre DNA'er kan anvendes. I andre utførelsesformer oppnås minst en del av det endrede 3'UT fra et ikke-cellulært DNA, f.eks. viralt DNA, mens i andre oppnås det fra et pattedyrs DNA. Proteinet av interesse kan være et immunoglobulin eller

en fraksjon derav, et hormon, vaksine, lymfokin, cytokin, enzym eller pro-enzym. For eksempel kan de ønskede proteiner omfatte en plasminogenaktivator så som human vevsplasminogenaktivator, hvis fremstilling brukes som en modell her, og beskrives i detalj. Pattedyrcellelinjen er en dyrkbar cellelinje så som en myelomacellelinje, skjønt andre pattedyrceller som normalt utskiller immunoglobuliner kan anvendes.

Ifølge oppfinnelsen kan fremgangsmåten omfatte det ytterligere trinn å kombinere proksimalt til DNA som koder for proteinet av interesse et DNA omfattende et cellulært forsterkerelement for å øke transkripsjon av det rekombinante DNA. Oppfinnelsen kan videre tilveiebringe et blokkeringselement som beskrevet i den samtidig svevende U.S. søknad nr. 837.595 innsendt 7. mars 1986. Slike blokkeringselementer muliggjør produksjon av transformanter som produserer store mengder av et ønsket protein mens markørproteinet bare produseres i nødvendige mengder for seleksjon.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en vektor for produksjon av et protein ved transvektering i en pattedyrcellei inje som normalt utskiller immunoglobuliner. Vektoren er sammensatt av transkripsjonelt kompetent DNA fremstilt ifølge den ovenfor sammenfattede fremgangsmåten. Denne vektoren opererer ved å produsere økede mengder av det ønskede protein i forhold til forøvrig identiske vektorer med et 3'UT område naturlig for genet som koder for proteinet av interesse.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en transformant for fremstilling av et protein av interesse. Transformanten omfatter fortrinnsvis en pattedyrcelleiinje som normalt produserer immunoglobuliner så som en myelomacelle. Transformanten Inneholder vektoren som rommer det uttrykkbare DNA sammenfattet ovenfor. Transformanten er i stand til å produsere økede mengder av proteinet av interesse i forhold til forøvrig identiske transformanter som inneholder rekombinant DNA innbefattet det 3' ikke-translaterte området naturlig for genet som koder for proteinet av interesse.

De økede ekspresjonsnivåer frembragt ifølge oppfinnelsen forårsakes tydelig av en økning i konstantnivået for tilsvarende mRNA i transfekterte celler. Det antas at knappheten på 3'UT-område av det fusjonerte mRNA tjener til å redusere nedbrytning av mRNA i cellen, og derved øke den intra-cellulære halveringstiden til mRNA'et og øke ekspresjonsnivåene.

Det er kjent at fosfodiester-broer av DNA og RNA angripes av eksonukleaser som virker på enten 3'- eller 5'-enden til molekylet. Enzymer som virker på 3'-enden hydrolyserer esterbindingen mellom 3'-karbonet og fosforgruppen, mens 5'-enzymene hydrolyserer esterbindingen mellom fosforgruppen og 5'-karbonet til fosfodiester-broen. Endonukleaser krever ikke en fri endestående 3'- eller 5'-hydroksylgruppe; de angriper 3'- eller 5'-bindinger uansett hvor de forekommer i polynukleo-tid-kj eden.

Det formodes at rekombinante DNA'er omfattende en lang

3'UT nedbrytes når en endonuklease spalter en del av mRNA'et til 3'-UT ikke bundet av et ribosom, etterfulgt av eksonuklease-spaltning. På grunn av kortheten til mRNA'ets 3'UT-område, forblir mindre mRNA ikke bundet til ribosomer når det forbinder seg til ribosomer, og antallet seter for endonuklease-angrep reduseres. Tilstedeværelsen av poly A setet beskytter 3'-enden mot eksonukleaser. Nedbrytningsgraden av mRNA reduseres derfor p.g.a. 3'UT-områdets korthet. Ved mekanismen ifølge oppfinnelsen stabiliseres derfor mRNA, og dets biologiske funksjon økes til å resultere i den økede ekspresjon av ønskede proteiner.

For en mer fullstendig forståelse av oppfinnelsens

karakter og hensikt skal det vises til den følgende detaljerte beskrivelse og medfølgende tegninger.

Kort beskrivelse av tegningen

Fig. 1 er et skjematisk diagram som illustrerer den totale fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen; Fig. 2 er et diagram som illustrerer forskjellige segmenter av DNA sammensmeltet med gen som koder for et ønsket protein-produkt (tPA); og Fig. 3 er et diagram for plasmid pEMp-tPA, den foretrukne ekspresjonsvektor for bruk i fremstillingen av tPA i myeloma celler. Denne vektoren representerer den for tiden foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte, en vektor og transformant for å øke produksjonen av utvalgte proteiner i pattedyrceller. 3'UT-området av et DNA som koder for et protein av interesse forandres til å produsere et kortere rekombinant DNA med et 3'UT-område, generelt omfattende mindre enn ca. 300 nukleotidbaser, og kan omfatte mindre enn 200 baser mellom stoppkodonet til genet og AATAAA poly A-signalet. En pattedyrcellelinje som normalt produserer og utskiller immunoglobuliner transfekteres med det resulterende rekombinante DNA-Transformanten dyrkes og produserer økende mengder av proteinet

av interesse sammenlignet med den samme cellelinje transfektert

med et ikke-endret 3'UT-område.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er vi-st-på fig.^--r. "- DNA

2 omfatter et kodende område 6 som koder for et protein av

interesse. Det stammer fra en celle som naturlig produserer proteinet, f.eks. syntetisert ved vanlige teknikker med kjenskap til DNA-sekvensen. For eksempel kan DNA'et være et naturlig forekommende DNA elelr et kjemisk syntetisert DNA. Alternativt kan DNA'et være et reverst transkribert cDNA som stammer fra cDNA-teknikker. Den typisk lange nukleotidsekvensen til det ikke-translaterte området 4 av dette DNA 2, forandres til å gi et intakt, transkripsjonelt kompetent, kortere rekombinant DNA 5 inneholdende område 6 som koder for proteinet av interesse, og forbid stoffsignaler; et 3'UT (7) mindre enn ca. 300 nukleotidbaser langt bundet til et polyadenylerings-addisjonssignal 8. Det rekombinante DNA 5 omfatter derfor et kodeområde for proteinet av interesse 6, et stoppsignal 12 og et kortere 3'UT kallt 7, plassert mellom stoppsignalet 12 og et poly A-addisjonssignal 8. 3'UT'et inneholdende poly A setet til det rekombinante DNA kan oppnås fra DNA 2 som koder for proteinet av interesse ved å spleise ut et segment av 3'UT

eller fra annet DNA. Det rekombinante DNA 5 innsettes i et plasmid 10 for å produsere en ekspresjonsvektor 14. Plasmidet inneholder en promotorsekvens 16 og et uttrykkbart markørgen

18. En pattedyrcellelinje transfekteres med det rekombinante DNA, klones og undersøkes etter en subpopulasjon av celler som

har suksessivt innbygget og kan uttrykket genet 6. Den transfekterte cellelinjen dyrkes og fremstiller det ønskede protein som deretter isoleres og renses.

Det er blitt funnet at 3'UT'ene av de sterkt utbredte immunoglobulin-mRNA'er i lymfoidceller som utskiller immunoglobuliner er relativt korte (mindre enn ca. 300 nukleotider),

mens 3'UT'ene til flere gener av interesse som ikke uttrykkes i lymfoidceller er relativt lange. For eksempel er UT-området for tPA ca. 800 nukleotider langt (Pennica et al., Nature, V,

301, 214-231, Jan 10. 1983), faktor VIII's ca. 1.800 nukleotider (Wood et al., Nature, V. 312, 330-337, nov. 1984), og erytro-poietins ca. 560 nukleotider langt (Jacobs et al., Nature, V.

313, 806-810, feb. 1985).

De rekombinante DNA teknikker for fremstilling av ekspresjonsvektorer og transformanter som er anvendelige i denne oppfinnelsen er velkjente og utviklede. De medfører bruk av forskjellige restriksjonsenzymer som gjør sekvens-spesifikke innsnitt i DNA og gir stumpe ender eller heftende ender, DNA-ligaser, teknikker som muliggjør enzymatisk addisjon av klebende ender til stumpendede DNA-molekyler, cDNA-syntese teknikker, syntetiske prober for isolering av gener med en spesiell funksjon, sammensetning av oligonukleotider under fremstilling av syntetiske DNA'er, vanlige transfeksjons-

teknikker og likeledes vanlige teknikker for kloning og subkloning av DNA.

Forskjellige typer vektorer kan brukes så som plasmider og virus innbefattende dyrevirus og fager. Vektoren vil normalt benytte et markørgen 18 som gir til en med hell transfektert celle en påviselig fenotypisk egenskap som kan brukes til å identifisere hvilke individer en populasjon av celler som med hell har fått innbygget det rekombinante DNA av vektoren 14. Foretrukne markører for bruk i myelomacellelinjene omfatter

DNA'er som koder for ett normalt ikke uttrykt enzym (eller bare uttrykt i små menger) av cellene som gjør cellene i stand til å overleve i et medium som inneholder et toksin. Eksempler på

slike enzymer er thymidin-kinase (TK), adenosin-fosforisboysyl-

transferase (APRT), og hypoksanthinfosforibosyltranserase (HPRT), som muliggjør TK, APRT, eller HPRT-manglende celler, henholdsvis, å vokse i hypoksanthin/aminopterin/thymidin medium; dihydrofolatreduktase (DHFR), som muliggjør DHRF-manglende celler å vokse i nærvær av methotreksat; E.coli enzymet xantin-guanosin-fosforibosyltransferase (XGPRT), produktet av gpt genet), som gjør normale celler i stand til å vokse i nærvær av mykofenolsyre; og det prokaryotiske enzym Tn5 fosfotransferase, som gjør normale celler i stand til å vokse i nærvær av neomycin. Andre egnede markørgener vil være anvendelige i vektorene som brukes til å transformere myelomaceller ifølge oppfinnelsen.

Vektorer ifølge oppfinnelsen kan inneholde et forsterkerelement av den type som virker på promotorer plassert på både 5'- og 3'-enden av forsterkerelementet, eller adskilt fra hver ende, for å øke transkripsjonen av gener som befinner seg på 3'-enden av promotorene. Forsterkerelementet kan inneholde DNA av virusopprinnelse, så som de som er beskrevet av Banerji et al., (Cell, V. 27, 299-308, 1981), deVilliers and Shaffner (Nucl. Acids Res., V. 9, 6351-6264, 1981), eller Levinson et al., (Nature, V. 295, 568-572, 1982), men er fortrinnsvis et cellulært forsterkerelement av den type som nylig er oppdaget av Gillies og Tonegawa og beskrevet i Cell, (V. 33, 717-728, 1983), og i nærmere detalj i den svevende U.S. patent søknad nr. 592.231, innsendt 22. mars 1984. Vektoren kan videre inneholde et blokkeringselement som beskrevet i den samtidig svevende U.S. patentsøknad nr. 837.595 innsendt 7. mars 1986, hvilket muliggjør produksjon av transformanter som produserer store mengder av et ønsket protein under innvirkning av forsterkeren, mens markørproteinet bare produseres 1 lavere nivåer som er nødvendig for seleksjonen.

Figur 3 representerer restriksjonskartet for den foretrukne plasmidvektor som brukes for produksjonen av tPA ifølge oppfinnelsen. Denne vektoren kalles pEMp-tPA og omfatter 7498 basepar. Den inneholder et forsterkerelement av en myelomacelle som øker transkripsjon av mRNA fra innskutt DNA som koder for protein, her human tPA (se Gillies et al. Cell, 1983, supra),

og utnytter vektorkonstruksjonsprinsipper som regulerer

selektivt forsterkerfunksjonen ifølge det som er beskrevet i den samtidig svevende U.S. patentsøknad nr. 837.595. Detaljer ved vektorens konstruksjoner er beskrevet nedenunder.

I foretrukne utførelsesformer er vertscellesystemet som skal transfekteres med det rekombinante DNA en sammenhengende eller etablert cellelinje som har gjennomgått en forandring som gjør cellene i stand til å vokse uendelig. Disse celler er derfor forskjellige fra normale celler som deler seg i kultur i et begrenset antall generasjoner før de opphører. Evnen til å vokse uendelig hjelper videre scale-up produksjon av proteiner av interesse.

Vertscellene som brukes for utførelsen av oppfinnelsen er pattedyrceller som normalt produserer og utskiller immunoglobuliner. Disse celler holder normalt til i kretsløpsystemet.

Den anvendte cellen kan faktisk ha tapt evnen til å utskille immunoglobuliner gjennom forutgående seleksjon.

Det foretrekkes videre at vertssystemet omfatter celler fra mus eller rotte (i motsetning til menneskeceller) for å redusere muligheten for kontaminasjon av produktprotein med humanvirus. I foretrukne utførelsesformer utgjør myelomaceller vertskultursystemet. Myelomaceller er gjerne lette å dyrke og utskiller ekspresjonsprodukter i det ekstracellulære medium.

Vektoren som er beskrevet på figur 3, og andre egnede ekspresjonsvektorer brukes ifølge oppfinnelsen til å transfektere myelomaceller, fortrinnsvis av museopprinnelse, så som cellelinjen J558 (ATCOTIB 6), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), og P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Den foretrukne myelomacelleiinje er J558L (ATCC CRL 9132, se 01 et al. Proe. Nati. Acad. Sei., USA, V. 80, p 825 1983). Disse celler omfatter kreftaktige transformanter av B celler fra kretsløpssystemet til Balb/C mus, og stammer fra myeloidvevet.

Transformanten av cellene av den type som er beskrevet ovenfor kan dyrkes i suspensjon, eller fortrinnsvis med mikrokapsler ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i U.S. patent nr. 4.409.331 (F. Lim). For å lette rensing og for å øke post-utskillelses-stabilitet av proteinproduktet, foretrekkes det at cellene dyrkes i serumfritt medium. Det ekstracellulære protein høstes daglig, mens medium erstattes. Denne metoden har den fordel at det produseres protein som er fritt for forurensende proteolytiske enzymer og andre inaktiverende faktorer som ofte er tilstede i storfe- eller hestesera. Den foretrukne J558L-celle utskiller lambda lett kjede av immunoglobulin A i betydelige mengder. Dette og andre forurensende proteiner kan lett skilles fra proteinproduktet.

Oppfinnelsen kan brukes til å fremstille store mengder av verdifulle proteiner i tillegg til tPA i celler som er konstruert genetisk som er beskrevet. Ikke-begrensende eksempler innbefatter andre plasminogenaktivatorer og proaktivatorer, blodkoagulerings-faktorer, hormoner, interferoner, antistoffer, enzymer og pro-enzymer, vaksiner og forskjellige lymfokiner og cytokiner.

Eksempelet som følger bør bare oppfattes som et eksempel i alle henseender, og som gir en detaljert beskrivelse av en tPA-produksjonsforskrifts-utførelsesform av oppfinnelsen, og en beskrivelse av den for tiden beste kjente form for utøvelse av"denne.

Eksempel -

Produksjons av tPA- produserende myeloma transformanter

Den grunnleggende ekspresjonsvektor, kalt pEMpl, ble konstruert fra de følgende fragmenter: (a) et 2,25 PvuII-BamHI fragment fra pSV2-gp_t (Mulligan and Berg, Science; V. 209, 1422-1427, 1980) inneholdende SV40-forsterkeren og tidlig område promotor, E.coli gpt genet, den lille SV40 tumor-

antigen intervenerende sekvens, og SV40 transkripsjons-avslut-ningen og polyadenyleringssignaler; (b) et 2,3 kb pVuII-EcoRI fragment fra pBR322 inneholdende ampicillinasegenet og den bakterielle replikasjonsopprinnelse (Sutcliffe, Proe. Nati.

Acad. Sei., U.S.A., V. 75, 3737, 1978); (c) et 0,3 kb PvuII-

EcoRI fragment inneholdende en immunoglobulin tungkjede

forsterker (Gillies et al., Cell, V. 33, pp 717-728, 1983); (d)

et 2,25 kg Sacl-Bglll fragment inneholdende metallothionein I promotoren (Brinster et al., Nature, V. 296, 39-42, 1982); og (e) et 0,4 kb Avall-Haelll fragment fra 3'UT-området av det lettkjedede immunoglobulin kappa genet, som inneholder poly-adenyler ingssignalet (Max et al., J. Biol. Chem., V. 256, 5116-

5120, 1981). Disse fragmenter ble ligert sammen i en rekke reaksjoner ifølge velkjente metodikker, (se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).

Den grunnleggende ekspresjonsvektor ble brukt til å konstruere en rekke vektorer som uttrykkte tPA. Kalt pEMl-tPA-A, -B, og -C, inneholdt disse tre vektorene alle det fullstendige kodeområdet for tPA cDNA, men adskilte seg i sine 3<*->ikke translaterte områder som beskrevet nedenunder.

cDNA'et for tPA ble fremstilt ved standard teknikker (Maniatis, ovenfor). tPA klonene som inneholdt hele kodeområdet og ca. 800 basepar av 3'UT område ble Identifisert og bekreftet ved nukleotidsekvensbestemmelse. tPA cDNA ble avstumpet ved Bgl II setet ca. 400 basepar nedstrøms for translasjons stopp-kodonet, og innsatt gjennom Xhol linkere i det eneste Xhol-setet i den grunnleggende vektor. tPA 3"UT-området i denne ekspresjonsvektoren, pEMl-tPA-A, var derfor sammensatt av ca. 400 basepar av det naturlige tPA 3'UT og 200 basepar av 3"UT-området hav det lettkjedede immunoglobulIngkappa genet.

I vektoren pEMl-tPA-B ble hovedmengden av det opprinnelige tPA 3'UT fjernet ved kloning ved Sau 3A setet som befant set 34 basepar nedstrøms for translasjonsstopp-signalet og skjøtt til de 200 basepar 3'UT av det lettkjedede Immunoglobulinkappa genet.

Vektor pEMl-tPA-C adskilte seg fra pEMl-B ved at 3'UT-området av det lettkjedede kappagen ble erstattet med et ca. 200 basepar fragment fra 3'UT område av de sene SV40 gener.

De rekombinante tPA gener med de forskjellige 3'UT områder beskrevet ovenfor er vist på fig. 2. Det er ca. 0,59 kb mellom stoppkodonet og AATAAA polyaddisjonssignalet i vektoren pEMl-tPA-A, 0,23 kb i pEMl-tPA-B, og 0,16 kb i pEMl-tPA-C.

De tPA-holdige plasmider ble transfektert i J558L myelomaceller ved protoplastfusjonsmetoden (Gillies et al., ovenfor). Celler som inneholdt plasmidet og derfor gpt genet, ble selektert ved dyrking i medier som inneholdt mykofenolsyre. Resistente kolonier som inneholdt plasmidene ble subklonet og undersøkt etter tPA-ekspresjon. Syntesen og sekresjon av tPA i mediet ble bestemt ved hjelp av en måling hvori tPA overfører plasminogen i plasmin, som deretter spalter det kromogene tripeptid S2251 (Pennica et al., ovenfor). Fordi det er kjent at serum inneholder inhibitorer for både tPA og plasmin (Coilen and Lijnen, CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, V. 4, 249-301, 1986), var transformanter kulturer i 48 timer i serumfritt medium før måling. Aktivitet ble målt i internasjo-nale enheter (IU), basert på en standard levert av World Health Organization og bekreftet med en tPA standard fra American Diagnostics, Inc.

Ingen kloning som uttrykte signifikante mengder av tPA kunne finnes i cellene som var transfektert med vektor pEMl-tPA-A, skjønt analyse viste tilstedeværelsen av lave nivåer av mRNA som kodet for tPA. Av 26 kloner transfektert med pEMl-tPA-B, uttrykte 5 tPA. Hvis det høyeste ekspresjonsnivået gis en relativ verdi på 1,00, varierte ekspresjonen av tPA med pEMl-tPA-B transfektanter mellom 0,28 og 1,00. Av 14 kloner transfektert med pEMl-tPA-C, uttrykte 6 tPA på et relativt nivå på 0,12 til 0,44.

Oppfinnelsen kan utføres i andre spesifikke former uten at man går ut over dens idé og omfang.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein i en pattedyrcellelinje som normalt utskiller immunoglobuliner, hvilken fremgangsmåte omfatter trinnene: a) tilveiebringelse av et DNA som stammer fra en celle som naturlig fremstiller proteinet, hvilket DNA omfatter i rekkefølge et kodende område, et stoppsignalkodon og et ikke-translatert område inneholdende et polyadenyleringssignal; b) endring av nukleotidsekvensen til det ikke-translaterte området av nevnte DNA under dannelse av et intakt, transkripsjonerbart kompetent, kortere rekombinant DNA med et endret ikke-translatert område omfattende mindre enn ca. 300 nukleotid baser mellom stoppsignalkodonet og et polyadenyleringssignal; c) transfektering av pattedyrcellelinjen med det rekombinante DNA; og * • d) dyrking av den transfekterte cellelinje under produksjon av nevnte protein, idet mengden av protein fremstilt med den transfekterte cellelinje er større enn mengden av protein fremstilt med en forøvrig identisk cellelinje som inneholder DNA'et beskrevet i trinn a.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori det endrede ikke-translaterte området inneholder sekvensen AATAAA, hvor A er adenin og T er thymin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori det kortere DNA omfatter en del av det ikke-translaterte området av nevnte DNA.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori minst en del av det endrede ikke-translaterte området er oppnådd fra et ikke-pattedyr DNA.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori minst en del av det endrede ikke-translaterte området er oppnådd fra et pattedyrsgen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori det kodende området koder for et protein valgt fra gruppen bestående av immunoglobuliner, hormoner, vaksiner, lymfokiner, cytokiner, enzymer og pro-enzymer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori det kodende området koder for en plasminogenaktivator.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvori aktivatoren er menneskevevs-plasminogenaktivator.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori pattedyrcellelinjen er en myelomacelleiinje.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, omfattende det ytterligere trinn å kombinere DNA omfattende et cellulært forsterkerelement proksimalt til nevnte DNA som koder' for proteinet for å øke transkripsjon av det rekombinante DNA.

11. Vektor for fremstilling av et protein ved transfektering i en pattedyrcellelinje som normalt utskiller immunoglobuliner, hvilken vektor omfatter replikerbart transkripsjonerbart kompetent DNA med i rekkefølge et første DNA-segment omfattende en promotorsekvens, et andre DNA-segment som koder for proteinet bundet til det første segment, og et stoppsignalkodon, hvori nevnte DNA videre omfatter et tredje DNA-segment 3' for stoppslgnalkodonet omfattende et ikke-naturllg ikke-translatert område inneholdende et polyadenyleringssignal og mindre enn ca. 300 basepar mellom stoppkodonet og polyadenyleringssignalet, idet vektoren er operabel til å fremstille økede mengder av protein i forhold til forøvrig identiske vektorer, omfattende det 3' ikke-translaterte området som er naturlig for genet som koder for proteinet.

12. Vektor Ifølge krav 11, hvori det tredje DNA-segment inneholder sekvensen AATAAA, hvor A er adenin og T er thymin.

13. Vektor ifølge krav 11, hvori det andre DNA-segment koder for et materiale valgt fra gruppen bestående av immunoglobuliner, vaksiner, lymfokiner, cytokiner, enzymer og pro-enzymer.

14. Vektor ifølge krav 11, hvori det andre DNA-segment koder for en plasminogenaktivator.

15. Vektor ifølge krav 14, hvori aktivatoren er menneske-vevs-plasminogenaktivator.

16. Transformant for produksjon av et protein omfattende en pattedyrcelle som normalt produserer immunoglobulin, hvilken transformant omfatter uttrykkbart DNA omfattende i rekkefølge: a) et første DNA-segment omfattende en promotorsekvens; b) et andre DNA-segment bundet til det første segment og som koder for proteinet; c) et stoppsignalkodon; og d) et tredje DNA-segment 3' for stoppsignalkodonet omfattende et ikke-naturllg ikke-translatert område inneholdende et polyadenyleringssignal og med mindre enn ca. 300 basepar mellom stoppkodonet og polyadenyleringssignalet, hvilken transformant er i stand til å produsere økede mengder av proteinet i forhold til forøvrig identiske transformanter inneholdende rekombinant DNA, innbefattende det 3' ikke-translaterte området naturlig for genet som koder for proteinet.

17. Transformant ifølge krav 16, hvori det tredje DNA-segment inneholder sekvensen AATAAA, hvor A er adenin og T er thymin.

18. Transformant ifølge krav 16, hvori det andre DNA-segment koder for og transformanten uttrykker et materiale valgt fra gruppen bestående av immun oglobuliner, vaksiner, lymfocytter, cytokiner, hormoner, enzymer og pro-enzymer.

19. Transformant ifølge krav 16, hvori det andre DNA-segment koder for en plasminogenaktivator.

20. Transformant ifølge krav 19, hvori aktivatoren er menneskevevs-plasminogenaktivator.

21. Transformant ifølge krav 19, hvori pattedyrcellen er en myelomacelle.

1. Vektor for fremstilling av et protein ved transfektering i en pattedyrcellelinje som normalt utskiller immunoglobuliner, hvilken vektor omfatter replikerbart transkripsjonerbart kompetent DNA med i rekkefølge et første DNA-segment omfattende en promotorsekvens, et andre DNA-segment som koder for proteinet bundet til det første segment, og et stoppsignalkodon, hvori nevnte DNA videre omfatter et tredje DNA-segment 3' for stoppsignalkodonet omfattende et ikke-naturlig ikke-translatert område inneholdende et polyadenyleringssignal og mindre enn ca. 300 basepar mellom stoppkodonet og polyadenyleringssignalet, idet vektoren er operabel til å fremstille økede mengder av protein i forhold til forøvrig identiske vektorer, omfattende det 3' ikke-translaterte området som er naturlig for genet som koder for proteinet.

2. Vektor ifølge krav 1, hvori det tredje DNA-segment inneholder sekvensen AATAAA, hvor A er adenin og T er thymin.

3. Vektor ifølge krav 1, hvori det andre DNA-segment koder for et materiale valgt fra gruppen bestående av immunoglobuliner, vaksiner, lymfokiner, cytokiner, enzymer og pro-enzymer.

4. Vektor ifølge krav 1, hvori det andre DNA-segment koder for en plasminogenaktivator.

5. Vektor ifølge krav 4, hvori aktivatoren er menneske-vevs-plasminogenaktivator.

6. Transformant for produksjon av et protein omfattende en pattedyrcelle som normalt produserer immunoglobulin, hvilken transformant omfatter uttrykkbart DNA omfattende i rekkefølge: a) et første DNA-segment omfattende en promotorsekvens; b) et andre DNA-segment bundet til det første segment og som koder for proteinet; c) et stoppsignalkodon; og d) et tredje DNA-segment 3' for stoppsignalkodonet omfattende et ikke-naturlig ikke-translatert område inneholdende et polyadenyleringssignal og med mindre enn ca. 300 basepar mellom stoppkodonet og polyadenyleringssignalet, hvilken transformant er i stand til å produsere økede mengder av proteinet i forhold til forøvrig identiske transformanter inneholdende rekombinant DNA, innbefattende det 3' ikke-translaterte området naturlig for genet som koder for proteinet.

7. Transformant ifølge krav 6, hvori det tredje DNA-segment inneholder sekvensen AATAAA, hvor A er adenin og T er thymin.

8. Transformant ifølge krav 6, hvori det andre DNA-segment koder for og transformanten uttrykker et materiale valgt fra gruppen bestående immunoglobuliner, vaksiner, lymfocytter, cytokiner, hormoner, enzymer og pro-enzymer.

9. Transformant ifølge krav 6, hvori det andre DNA-segment koder for en plasminogenaktivator.

10. Transformant ifølge krav 9, hvori aktivatoren er menneskevevs-plasminogenaktivator.

11. Transformant ifølge krav 9, hvori pattedyrcellen er en myelomacelle.