NO875090L - Reagens for celleseparasjon. - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår et nytt materiale for separering og rensing av biologiske celler og subcellulære komponenter. I særdeleshet angår oppfinnelsen et nytt materiale for isolering av spesifikke celletyper eller spesifikke, subcellulære komponenter basert på deres slite-densitet (buoyant density). En annen side ved oppfinnelsen angår en ny metode og middel for anvendelse ved isolering av spesifikke celletyper og spesifikke, subcellulære komponenter som gir forbedret renhet av de gjenvundne celler og subcellulære komponenter.

Beslektet søknad

Foreliggende søknad er en continuation-in-part av

US patentsøknad 849.819 innlevert 9. april 1986.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Separering av komponenter av biologiske væsker og

vev er ofte nødvendig for kliniske, diagnostiske prosedyrer, vitenskapelig forskning og leilighetsvis behandling av pasienter. I det kliniske, diagnostiske område er det eksempelvis behov for materialer og metoder som muliggjør hurtig isolering av rensede lymfocytter for vevtypings-prosedyrer, immunologiske funksjonstester og forskjellige andre prosedyrer. Grunnforskning krever også rensede lymfocytter såvel som andre celletyper fra blod. I tillegg krever også studier av dyrkede celler og subcellulære komponenter slik som plasmider, DNA, kromosomer, mitokondrier og andre subcellulære komponenter, høyrensede preparater.

Separering og rensing kan bevirkes på flere måter.

Da imidlertid de isolerte celler ofte anvendes i prosedyrer som krever levedyktige celler, er det viktig at funksjonen av de således isolerte celler er usvekket. For å sikre levedyktighet av cellene og usvekket, biologisk funksjon av celler og subcellulære komponenter, er det viktig å unngå innføring av mulige interfererende substanser under separa-sjonsprosedyreforløpet. Eksempelvis stimuleres isolerte lymfocytter anvendt i histoforenlighetstester med forskjellige mitogener. Det anvendte medium må i seg selv ikke være et mitogen, da dette vil påvirke riktigheten av målingene av DNA-syntese.

Densitetsgradientsentrifugering er en teknikk som anvendes for separering av biologiske celler og subcellulære komponenter. Det er meget ønskelig at materialet valgt for dannelse av gradienten, har visse karakteristika som vil bibringe forenlighet med sensitive, biologiske materialer. Gradientmaterialer som har vært anvendt innen faget, innbefatter sucrose, dextran, kvegserumalbumin (BSA), "Ficoll", joderte, lavmolekylære forbindelser slik som metrizamid og tunge salter slik som cesiumklorid. Mesteparten av disse materialer har imidlertid uønskede karakteristika som potensielt kan svekke de biokjemiske funksjoner av de ønskede, isolerte fraksjoner. Eksempelvis inneholder enkelte for tiden tilgjengelige blodseparasjonsmedia erythrocytt-aggregeringspolymerer som kan nedsette mitogenresponsevne av isolerte lymfocyttpreparater (J. Immunol. Meth. 38:43-51, 1980). Disse materialer kan også danne løsninger med uønsket høy osmolalitet eller viskositet. Celleaggregering forårsakes ofte av BSA ved fysiologisk pH (7,4), og det er uønsket å anvende redusert pH (5,1) fordi dette medfører andre problemer slik som cellesvelling (som påvirker celle-densitet) og mulig svekkelse av cellefunksjon. Det er også kostbart for anvendelse ved separasjoner i stor målestokk. "Ficoll" kan på lignende måte forårsake cellulær aggregering som kan avhjelpes bare ved anvendelse av et dispergerings-middel, eller uønsket ved nedsettelse av pH. "Ficoll" er også høyviskøs, hvilket gjør det vanskelig å utvikle en lineær, isoosmotisk gradient med dette. Det er også vanskelig å separere celler med meget like flytedensiteter med

noen av disse materialer, selv ved anvendelse av diskontinuerlige gradienter.

Et densitetsgradientmateriale som har vært anvendt med et .visst hell for celleseparasjon, er kolloidalt silica. Kolloidalt silica er en vandig suspensjon av kolloidale partikler dannet ved polymerisering av monosiliciumsyre fra SiC>2 oppløst i vann. Individuelle partikler har gjennom-snittlig 130-140 Å i størrelse og varierer generelt fra 30 til 220 Å. Den kolloidale suspensjon er mest stabil for lagring ved pH 8-10 ved hvilken de kolloidale partikler har en netto negativ ladning. Dette er imidlertid ikke fullt ut tilfredsstillende. Kolloidale silicaløsninger utfelles irreversibelt ved frysing og danner geler i nærvær av proteiner under visse ioniske betingelser slik som over 0,1 M NaCl ved pH 5-7. Umodifiserte silicageler utviser også toksisitet mot et utall celletyper innbefattende makrofager og røde blodceller. Utallige forsøk er blitt gjort for å redusere denne toksisitet og øke stabiliteten av kolloidet i saltløsninger og protein ved fysiologisk pH ved belegning av det kolloidale silica med en polymer. Polymerer slik som dextran (Exp. Cell Res., 50: 355-368 (1968)), polyvinyl-alkohol (PVA) (J. Coll. and Interface Sei., 51: 388-393

(1974) , polyethylenglycol (PEG) (Exp. Cell Res., 57: 338-350

(1969), Arch. Biochem. Biophys., 168: 289-301 (1975)), dextransulfat, methylcellulose, carboxymethylcellulose

(Exp. Cell Res., 50: 355-368, (1968)), polyvinylpyrrolidon (PVP) (Exp. Cell Res., 46: 621-623 (1966); Exp. Cell Res., 50: 355-368 (1968); J. Cell Biol., 55: 579-585 (1972);

Exp. Cell Res., 110: 449-457 (1977)) og en blanding av PEG, BSA og "Ficoll" (Arch. Biochem. Biophys., 168: 289-301

(1975) ) har vært anvendt som belegg for silicasoler slik

som Ludox<®>(registrert varmerke for DuPont).

Utelukkende belegning av silicapartiklene med polymer representerer også problemer. Belegningsprosedyren krever anvendelse av et overskudd av fri polymer i løsningen. Overskuddspolymeren øker osmolaliteten og viskositeten av løsningen. Det er også vanskelig å fjerne polymeren fra det rensede, biologiske materiale. Mens de morfologiske karakteristika av celler og organeller renset med polymer-belagt, kolloidalt silica generelt er akseptable, svekkes ofte de biokjemiske karakteristika. Eksempelvis har lymfocytter isolert med blandinger av kolloidalt silica og PVP en nedsatt inkorporering av radioaktivt thymidin sammenlignet med celler i kontrollmedium. Exp. Cell Res., 50: 353 (1968).

En annen måte å redusere toksisiteten av kolloidalt silica har vært å kjemisk modifisere overflaten av silicapartiklene. Et eksempel på et kjemisk modifisert, kolloidalt silica er Ludox<®>AM (registrert varemerke for DuPont) hvori aluminium inkorporeres i det kolloidale silica. J. Colloid and Interface Science, 55:25 (1975). Dette preparat er rapportert å være stabilt over et vidt pH-område, men det er imidlertid ikke egnet for celleseparasjon med mindre det først grundig dialyseres og/eller behandles med carbon for å gjøre det ikke-toksisk overfor lymfoidceller og anvendbart for separering av lymfocytt-subpopulasjoner. J. Immunological Methods, 28:277 (1979). Ludox<®>AM bidrar bare i mindre grad til osmolariteten, og det er derfor mulig å konstruere isoosmotiske gradienter under anvendelse av denne forbindelse. Ludox<®>AM har imidlertid flere ulemper. Gradientmaterialet må lagres under sterile betingelser da det vil understøtte veksten av forskjellige mikroorganismer. Antibiotika og antifungale midler må tilsettes til gradientmaterialet for å inhibere veksten av forurensende mikroorganismer som kan finnes i forskjellig lymfoidvev. For fyllestgjørende å separere subpopulasjoner av lymfoidceller er det enn videre nødvendig å anvende diskontinuerlige gradienter. J. Immunological Methods, 28:277-292 (1979). Begrensninger tilknyttet diskontinuerlig densitetsseparering (Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1:93-130, 1972; Int. Rev. Exp. Path 14:91-204, 1975; Automated Cell Identification and Cell Sorting", Academic Press, s. 21-96, 1970) kan bidra til lavere lymfocyttgjenvinning som kan resultere i forandrede lymfocyttforhold (Scand. J. Immunol. 3:61, 1974; Clin. Immunol. Immunopath. 3:584-597, 1975). Enn videre fremstilles diskontinuerlige gradienter fra individuelle løs-ninger av varierende densiteter. Det er uhyre tidkrevende å gi de forskjellige løsninger den korrekte densitet. Ut-vikling av densitetsgradienter ved sentrifugering krever også hastigheter på 20.000 til 30.000 opm.

Et annet kjemisk modifisert, kolloidalt silica som er kommersielt tilgjengelig, er Percoll<®>(registrert varemerke for Pharmacia) som er en silicapartikkel til hvilken et lag av PVP er hydrogenbundet Anal.Biochem., 88: 271-282

(1978). Percoll<®>har blitt vidt anvendt for separering av blodcellekomponenter såvel som subcellulære organeller fra et utall av kilder. Som levert fra fabrikant, har Percoll<®>

en densitet på 1,130 - 0,005 g/cm<3>, en pH på 9,0 - 0,5 og en osmolalitet på < 25 mOsM/kg. Percoll<®>gjøres isoosmotisk ved tilsetning av fysiologisk saltvann og justering av pH

til 7,0-7,4 ved tilsetning av syre eller base. Densiteten må også omhyggelig justeres. Hvis celler har en flytedensitet større enn 1,11-1,12 g/cm , må Percoll<®>konsentreres. Den vanlige teknikk for anvendelse av Percoll<®>er enten å for-dampe gradienten ved lagdeling eller ved anvendelse av en gradientdanner, eller ved sentrifugering (som generelt krever 20.000 til 30.000 opm) før tilsetning av prøven. Alternativt kan cellepreparater blandes direkte med fortynnet isoosmotisk Percoll<®>før sentrifugering.

Flere faktorer begrenser lettheten, yteevnen og anvendeligheten av Percoll<®>som et blodcelleseparasjonsmedium. Percoll<®>har en sterk absorbens i den ultrafiolette region ~~~~ på grunn av PVP. Dette er en signifikant ulempe når densitetsgradienter analyseres med hensyn til nucleinsyrer og proteiner ved spektrofotometriske metoder. PVP gir også

en høy bakgrunn ved Lowry-metoden for proteinbestemmelse.

Cell Separation: Methods and Selected Applications, vol. I, 115, 134 (1982). Percoll<®>er noe stabilt ved fysiologisk pH og ionestyrke, men er imidlertid ikke stabilt overfor autoklavering etter at det er gjort isoosmotisk (ved tilsetning av salt, syre og base), og i fortynnede løsninger er det til-bøyelig til å aggregere. Det sistnevnte problem skyldes dissosiasjon av PVP fra silicaoverflaten og kan forhindres ved tilsetning av lave konsentrasjoner av fritt PVP. Som ovenfor angitt, har fritt PVP en negativ effekt på i det minste.enkelte cellefunksjoner. Det er også vanskelig å separere celler som bare har små forskjeller i flytedensitet

med Percoll<®>.

Det er nå funnet at et nytt, kolloidalt silicapreparat som er anvendbart for separering av biologiske materialer, kan fremstilles under anvendelse av en ny kjemisk modifiseringsteknikk. Materialet fremstilles ved omsetning av et organosilan under vandige betingelser med ikke-porøst, kolloidalt silica ved en forhøyet temperatur og en alkalisk pH, under dannelse av en covalent binding mellom silicapartikkelen og organosilanet. Materialet kan anvendes for isolering av spesifikke celletyper eller spesifikke subcellulære komponenter basert på deres flytedensitet. Materialet tilveiebringer forbedret renhet av de gjenvundne celler og subcellulære komponenter og redusert prøve-bearbeidelsestid. Et materiale som kombinerer forskjellige størrelser av reagens-modifiserte silicapartikler, kan også fremstilles. Dette kombinasjonsmateriale medfører den ytterligere fordel at det muliggjøres separering av celler og cellulære komponenter med bare ørsmå forskjeller i flytedensitet. Denne type av separasjon har hittil vært umulig å oppnå. Et ytterligere materiale som kan fremstilles, består av reagens-modifiserte silicapartikler til hvilke renset antistoff er blitt koplet. Dette antistoff-modifiserte materiale medfører den fordel at celler og cellekomponenter kan separeres basert på deres antigeniske determinanter såvel som deres komplement av en hvilken som helst annen cellulær komponent, slik som peptid-harmoniske reseptorer til hvilke antistoffer kan dannes.

Materialet har flere ønskelige karakteristika. Reagensmodifiseringen reduserer toksisiteten av det kolloidale silica og eliminerer aggregering av de kolloidale silicapartikler i nærvær av fysiologisk salt og protein. Materialet er forenlig med biologisk materiale og er egnet for densitetsseparasjon av både cellulære og subcellulære, biologiske partikler. Det muliggjør anvendelse av enten for-dannede gradienter eller in situ densitets-gradientdannelse og hurtig celleseparasjon under anvendelse av sentrifugering ved relativt lav hastighet. Materialet er av fysiologisk ionestyrke og pH, er isoosmolart, har lav viskositet og en densitet i omradet 1,0 til 1,4 g/cm 3. Det er stabilt over et vidt område av temperatur og pH-verdier. Som vist ved sin stabilitet er materialet fullstendig stabilt overfor autoklavering ved fysiologiske betingelser. Enn videre er det løselig eller dispergerbart i vandige løsninger, det fjernes lett fra biologiske prøver og har lav pris.

Metodene for anvendelse av dette materiale medfører også flere fordeler. Tradisjonelle blodsepareringsprosedyrer krever omhyggelig blod-lagdelingsteknikk. Den tekniske dyktighet som kreves for å utføre blodseparasjon med dette materiale, er meget mindre enn med andre teknikker. Eksempelvis er ingen lagdeling nødvendig med in situ-teknikken. Materialet som skal separeres, blandes enkelt med det reagens-modifiserte, kolloidale silica og sentrifugeres.

For å separere mononukleære celler fra helblod, anvendes den iboende densitetsforskjell som eksisterer mellom mononukleære celler og andre cellulære elementer tilstedeværende i perifert blod. En kontinuerlig densitetsgradient egnet for mononukleær celleseparasjon, dannes etter sentrifugering ved sedimenteringen av de reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler.

Hurtig gradientdannelse skyldes den høye sedimenteringsgrad av de anvendte partikler ( i 200 Å i diameter) for denne type av separering. Celleseparasjon bevirkes ved bevegelsen av de perifere blodceller under sentrifugeringen til deres respektive flytedensiteter innen den kontinuerlige densitetsgradient. Separeringsteknikken er billig og krever lite, om overhodet noe, spesialutstyr annet enn en klinisk sentrifuge.

Sammendrag av oppfinnelsen

Ifølge oppfinnelsen er det funnet en metode for fremstilling og anvendelse av ikke-porøse, kolloidale silicapartikler belagt med et reagens som bibringer en ikke-toksisk, ikke-ionisk, hydrofil overflate til silicapartiklene. Det resulterende reagens-modifiserte, kolloidale silica kan anvendes for separering av celler og subcellulære komponenter fra alle typer av kroppsvæsker slik som blod, benmarg, spinal og pleuralvæsker, og semen, såvel som dis-pergerte vevsprøver, dyrkede celler og andre kilder for biologiske celler og deres komponenter. Ifølge en utførelses-form av oppfinnelsen tilveiebringes en ny teknikk for fremstilling av et reagens-modifisert, kolloidalt silica som innbefatter trinn for blanding av kolloidalt silica med et organosilanreagens ved forhøyede temperaturer og alkalisk pH i vandige media slik at organosilanet koples til det kolloidale silica. Det resulterende reagens-modifiserte, kolloidale silica befris for reaksjonsbiprodukter ved aktiv carbonadsorpsjon og avioniseres deretter. Det reagens-modif iserte, kolloidale silica oppvarmes deretter på nytt for å danne ytterligere kovalente bindinger mellom reagenset og det reagens-modifiserte, kolloidale silica. Det osmotiske trykk og pH justeres til å være forenlig med biologiske materialer. Det reagens-modifiserte, kolloidale silica fortynnes deretter med en buffer til den densitet egnet for det biologiske materiale som skal separeres. Organosilanet, kovalent bundet til overflaten av silicaen, reduserer toksisiteten av det kolloidale silica og forhindrer koaguler-ing av de kolloidale silicapartikler i nærvær av protein ved fysiologisk pH og saltkonsentrasjon.

Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny teknikk for fremstilling av antistoff-koplet, reagens-modifisert, kolloidalt silica under anvendelse av et thiolreagens som innbefatter trinn for blanding av det reagens-modifiserte, kolloidale silica med et thiolreagens i vandig media slik at thiolgrupper inkorporeres på overflaten av det reagens-modifiserte, kolloidale silica. Thiolgruppene omsettes ytterligere med et succinimid for å tilveiebringe en binding til hvilket protein A deretter koples. Et antistoff koples deretter til protein A under dannelse av antistoff-modifisert, kolloidalt silica. Anvendelse av antistoff-modifisert, kolloidalt silica muliggjør separasjon fra en celleblanding slik som blod, av cellekomponenter med antigeniske determinanter til hvilke antistoffet kan bindes.

Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny teknikk for fremstilling av antistoff-modifisert, kolloidalt silica under anvendelse av carbodiimid som innbefatter trinn for omsetning av reagens-modifisert, kolloidalt silica med et carbodiimid i vandige media under dannelse av en bindingsarm til hvilken protein A deretter koples via en amidbinding.Antistoffet koples deretter til protein A under dannelse av antistoff-modifisert, kolloidalt silica.

Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en ny teknikk for separering av cellekomponenter fra blandinger av biologiske celler slik som helblod eller andre biologiske væsker, som innbefatter trinn for å bringe en fortynnet celleblanding i kontakt med et fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silicamateriale som har en sluttdensitet som strekker seg over flytedensi-teten av cellekomponentene av celleblandingen som skal separeres, ved å laglegge celleblandingen på toppen av materialet, sentrifugere celleblandingen og materialet i en svingende spannrotor for å bevirke celleseparasjon, og oppsamle cellekomponentene som vandrer til en karakteristisk flytedensitet for en spesifikk celletype hvor de kan danne et bånd ved denne densitet. Eksempelvis kan lymfocytter separeres fra andre celletyper i en blodprøve. Typisk har lymfocytter en flytedensitet på 1,060-1,074 g/cm 3 og vil danne et cellebånd ved densitetsgrenseflaten. Andre celletyper vil penetrere inn i gradientmaterialet. Cellebåndet kan fjernes, og cellene vaskes, pelleteres og resuspenderes i et medium egnet for vekst eller metaboliske studier,

eller annen eksperimentering.

Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en ny teknikk for separering

av cellekomponenter fra blandinger av biologiske celler

slik som helblod eller andre biologiske væsker, og som innbefatter blanding av en prøve av en celleblanding med det

fortynnede reagens-modifiserte, kolloidale silicamateriale, og sentrifugering i en rotor med fast vinkel eller en svingende spannrotor. En kontinuerlig densitetsgradient dannes etter sentrifugering. Komponentcellene vandrer til karakteristiske flytedensiteter innen gradienten og danner bånd av celler ved densiteter som er karakteristiske for spesifikke celletyper. Eksempelvis kan mononukleære celler separeres fra andre celler i en blodprøve under anvendelse av denne in situ separasjonsteknikk. De mononukleære celler danner et cellebånd like nedenfor menisken. Det mononukleære bånd, såvel som andre bånd av celler, kan hver oppsamles, vaskes, pelleteres og resuspenderes i et medium egnet for vekst eller metaboliske studier, eller annen eksperimentering.

Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en ny teknikk for separering av biologiske celler eller subcellulære komponenter med bare små forskjeller i flytedensitet. Teknikken innbefatter trinn for blanding av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler med forskjellig størrelse, med en blanding av celler slik som en blodprøve, buffy coat eller benmarg, blanding av celleblandingen og det reagens-modifiserte, kolloidale silicamateriale, sentrifugering av blandingen for å utvikle en densitetsgradient og deretter oppsamling av de individuelle bånd av celler som dannes ved spesifikke, karakteristiske flytedensiteter. De således oppsamlede celler vaskes deretter, pelletiseres og resuspenderes i et medium egnet for vekst eller metaboliske studier, eller annen eksperimentering. Eksempelvis kan B- og T-lymfocytter separeres fra andre celler i en blodprøve. B-celler har et lavere densitetsområde enn T-celler. T- og B-cellene kan separetes ved valg av en gradientform slik at B-cellebåndet er ved et skarpt brudd i gradienten, og T-cellebåndet separat ved en høyere densitet. Innbefattelse av små reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler (de som fremstilles fra kolloidale silicapartikler på i 80 Å) i gradienten utvider eller snevrer det lavere densitetsområde, mens innbefatteIse av større reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler (de som fremstilles fra kolloidale silicapartikler på f; 200 Å) komprimerer det høyere densitetsområde av gradienten. Ved valg av riktig begynnelsesdensitet og ekspandering av valgte regioner av densitetsgradienten med reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler fremstilt fra den egnede partikkelstørrelse, kan B- og T-celler separeres. Denne løsning kan også anvendes for å separere NK-celler fra B- og T-celler. Separering av B-, T- og NK-celler kan etterfølges av beising av cellene med fluorescente, monoklonale antistoffer for B-, T- og NK-celler.

Ifølge en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en ny teknikk for separering av biologiske celler eller cellulære komponenter med forskjellige antigeniske determinanter. Kolloidalt silica med en stor partikkelstørrelse (ca. 600 Å) anvendes for fremstilling av de antistoff-modifiserte, kolloidale silicapartikler. Det antistoff-modifiserte, kolloidale silica blandes med en celleblanding. Blandingen inkuberes i tilstrekkelig tid for å tillate at det antistoff-modifiserte, kolloidale silica får bindes til de antigeniske seter av komponentcellene. Blandingen sentrifugeres deretter gjennom et celle-separas jonsmateriale . Det antistoff-modifiserte, kolloidale silica med festede celler kan gjenvinnes fra bunnen av gradienten. Festede celler kan fjernes fra det antistoff-modifiserte, kolloidale silica fremstilt under anvendelse av en thiolreagens ved behandling med et sulfhydryl-reduseringsmiddel. Hvis det antistoff-modifiserte, kolloidale silica var blitt fremstilt ved kopling av protein A direkte på overflaten av det reagens-modifiserte, kolloidale silica via en amidbinding, kan de festede celler fjernes ved behandling med ethanolamin. Etter fjerning fra det antistoff-modifiserte, kolloidale silica kan cellene vaskes og resuspenderes i et medium egnet for vekst eller metaboliske studier, eller annen eksperimentering.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur la, b, c, d er grafiske avbildninger av formen av gradienene erholdt når distinkte populasjoner av fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica blandes. Figur 2 er en skjematisk angivelse av et reagens-modifisert, kolloidalt silica hvori de bundne organosilan-reagensgrupper er representert med "R".

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

Reagens-modifiserte, kolloidale silicamaterialer er beskrevet som er egnet for separering av biologiske celler og cellulære komponenter. Anvendelse av "distinkte populasjoner" som definert i det etterfølgende, av materialene vil nedsette den tid som kreves for å oppnå isolerte celler og cellulære komponenter, så vel som å øke renheten av de resulterende isolater. Anvendelse av blandinger av distinkte populasjoner av de reagens-modifiserte, kolloidale silicamaterialer vil muliggjøre separering av celletyper med meget like flytedensiteter. Anvendelse av distinkte populasjoner av reagens-modifisert, kolloidalt silica som er blitt ytterligere modifisert ved kopling til rensede, monoklonale antistoffer, vil muliggjøre separering av celler basert på deres komplement av antigeniske determinanter.

Størrelsen av de ikke-porøse, kolloidale silicapartikler anvendt i koplingsreaksjonen, varierer fra ca. 30 Å til ca. 600 Å. Utgangsmaterialet for hvert individuelt materiale omfatter et flertall av kolloidale silicapartikler som alle har ca. samme diameter. Denne "populasjon" av kolloidale silicapartikler har imidlertid et størrelses-område som kan representeres ved en fordelingskurve slik som den som kan avledes under anvendelse av partikkelstørrelse-fortynningsmetoder kjent innen faget. Mesteparten av partiklene i populasjonen vil være av størrelsen ved toppen av fordelingskurven, men hele kurven representerer populasjonen. Størrelsene spesifisert for populasjonene, er de størrelser som er angitt i fabrikantens spesifikasjoner. De aktuelle størrelser av populasjonene som mottatt fra fabrikant, kan variere fra prøve til prøve. For å avhjelpe størrelsesvariasjonene angis hver populasjon som "ca. x Å" hvori x er partikkelstørrelseangivelsen angitt i fabrikantens kataloger og produktspesifikasjoner. Kolloidale silicapartikler anvendbare ifølge oppfinnelsen, innbefatter det materiale som selges under betegnelsen "Nyacol"

av Nyacol Products, Inc. (Worchester, Mass.), hvilket materiale er en vandig suspensjon av kolloidale partikler dannet ved polymerisasjon av monosiliciumsyre fra SiC^opp-løst i vann. Så snart partiklene er covalent bundet til modifiseringsmidlet, blir partiklene en samling av reagens-modif iserte, kolloidale silicapartikler som hver har en flytedensitet innen et definert område. Det resulterende flytedensitetsområde og den mest foretrukne flytedensitet av partikkelpopulasjonene etter kopling med det modifiserende reagens, er vist i tabell 1.

En populasjon av reagens-modifiserte,

kolloidale silicapartikler som kan skilles fra en annen populasjon ved diameteren av partiklene anvendt ved koplingsreaksjonen og dens flytedensitet etter kopling med det modifiserende reagens, angis som en "distinkt populasjon" selv om karakteristikaene av enkelte av partiklene i to distinkte populasjoner kan være like. En eller flere distinkte populasjoner kan blandes under dannelse av en celle-separas jonsmaterialblanding med bestemte separasjonsegen-skaper.

Reagenset som er covalent bundet til de kolloidale silicapartikler, kan være et hvilket som helst organosilanreagens. Organosilaner er de eneste forbindelser som kan danne stabile, covalente siloxanbindinger med silanol (Si-O-Si)-gruppene på overflaten av det kolloidale silica. Den funksjonelle gruppe i organosilanet må være ikke-ionisk og hydrofil. Ioniske, funksjonelle grupper vil være uønsket da ioneladningen vil være følsom overfor forandringer i pH og salt, og således resultere i gelering. Hydrofobe, funksjonelle grupper gjør det kolloidale silica sensibelt overfor gelering ved nøytral pH og fysiologisk saltkonsentrasjon. Hydrofile, funksjonelle grupper binder H2O til kolloidoverflaten. Det bundne H2O tjener som et beskyttende skall som er uavhengig av forandringer i pH, ionestyrke og protein, og som således beskytter kolloidet mot gelering.

Organosilanet bibringer en 11 ikke-toksisk" , ikke-ionisk, hydrofil overflate til silicapartiklene. Ikke-toksisk betyr at materialet ikke påvirker integriteten eller funksjonen av det biologiske materiale som skal separeres. Eksempler på organosilaner som kan anvendes, er oppført i tabell 2. Det foretrukne organosilan er gamma-glycidoxypropyltrimethoxysilan.

Det reagens-modifiserte, kolloidale silica kan ytterligere modifiseres ved kopling med et antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff og helst et renset, monoklonalt antistoff. Først koples protein A til overflaten av det reagens-modifiserte, kolloidale silica eller via en amidbinding. Antistoffet bindes deretter til protein A under dannelse av antistoff-modifisert, kolloidalt silica. Kolloidalt silica av enhver størrelse kan anvendes, men

den foretrukne størrelse er imidlertid ca. 600 Å kolloidalt silica. Hvis protein A koples direkte til det reagens-

modifiserte, kolloidale silica via en amidbinding, kan bare det reagens-modifiserte, kolloidale silica fremstilt under anvendelse av organosilanet angitt i tabell 3, anvendes.

Materialet ifølge oppfinnelsen kan generelt fremstilles som følger: det kolloidale silica blandes med et organosilanreagens som vil stabilisere den kolloide tilstand. Fortrinnsvis oppvarmes det kolloidale silica til ca. 75°C

før og under tilsetning av reagenset. Den vandige, kolloidale silicaløsning kan være av hvilken som helst egnet konsen-trasjon slik at når denønskede mengde av reagens blandes med det kolloidale silica, forblir silica alltid i overskudd i forhold til reagenset. Dette kan utføres ved styrt reagenstilsetning til det kolloidale silica. Reagens-tilsetningshastigheten er fortrinnsvis fra 0,5 til 2,0 ml reagens pr. liter kolloidalt silica pr. minutt, og fortrinnsvis 0,7 ml reagens pr. liter kolloidalt silica pr. minutt.

Mengden av anvendt reagens avhenger av det totale antall overflatesilanoler tilstedeværende i det bestemte kolloidale silica som skal kjemisk modifiseres. Det totale antall overflatesilanolgrupper innen et bestemt kolloidalt silica kan beregnes som følger: Totale overflatesilanoler = volum (ml) x densitet (g/ml) x % silicatørrstoff (fabrikantens data) x overflate-areal, nm 2 /g (fabrikantens data) x 4,5 silanoler/nm 2 (verdi fra The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties, and Biochemistry, s. 633-636, 1979). Et reagensmoleky1 kan omsettes og danne covalente bindinger med ett, to eller tre overflatesilanolmolekyler. Et overslag over volumet av reagens som må anvendes for kjemisk å modifisere et kolloidalt silica, kan beregnes som følger: Reagensvolum = (totale overflatesilanoler/Avogadros tall)/Z) x (reagensmolekylvekt) x (reagensdensitet) hvori Z fortrinnsvis er 1, 2 eller 3 og er helst z = 3. Det kolloidale silica er "fullt modifisert" når Z = 3. For å danne "delvis modifisert", kolloidalt silica for anvendelse ved fremstilling av antistoff-modifisert, kolloidalt silica fremstilt med et thiolreagens, anvendes ca. 50-75% av mengden av reagens beregnet til å danne fullt modifisert, kolloidalt silica.

Etter at reagenstilsetningen er fullført, oppvarmes reaksjonsblandingen til fra 70 til 80°C under omrøring i 1 time til 3 timer. Reaksjonsbiprodukter fjernes fortrinnsvis ved å føre reaksjonsblandingen gjennom aktivert carbon og ved avionisering av reaksjonblandingen. Avionisering av det reagens-modifiserte, kolloidale silica utføres fortrinnsvis ved å føre reaksjonsblandingen gjennom en kation-bytterharpiks (hydrogenform) og gjennom en anionbytter-harpiks (hydroxydform). Ethvert reagens-modifisert, kolloidalt silica gjenværende i enten carbon- eller harpiks-kolonnene, gjenvinnes fortrinnsvis ved å føre vann gjennom de respektive kolonner. Ytterligere covalent binding mellom reagenset og silicaoverflaten kan lettes ved ytterligere oppvarming av det reagens-modifiserte, kolloidale silica under kraftig omrøring. Dette trinn utføres fortrinnsvis ved fra 90 til 100°C i fra 3 timer til 6 timer. Det utføres enda mer fordelaktig ved ca. 95°C i 3 timer.

Det reagens-modifiserte, kolloidale silicapreparat justeres deretter til fysiologisk, osmotisk trykk og pH.

Det osmotiske trykk justeres fortrinnsvis under anvendelse

av fast natriumklorid og kaliumklorid. pH justeres fortrinnsvis medHEPES-buffer i hydrogen- og natriumformene. Densiteten av den resulterende løsning justeres deretter før anvendelse med buffer (20 mM, pH 7,4) under dannelse av fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica med en sluttdensitet som strekker seg over densitetsområdet til det materiale som skal separeres.

Bufferen i hvilken det reagens-modifiserte, kolloidale silica fortynnes, kan være en hvilken som helst buffer som er "forenlig" med det biologiske materiale som skal separeres og renses. For å være "forenlig" må bærer-væsken være av fysiologisk ionestyrke og pH, og ikke påvirke strukturen eller funksjonen av det materiale som skal separeres. Eksempler på buffere som kan anvendes, innbefatter 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinpropansulfonsyre (HEPES), N-N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethansulfonsyre (BES), bis-2-hydroxyethylimino-TRIS-hydroxymethylmethan-2-bis-2-hydroxyethylamino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (BIS-TRIS), 1,3-bis-TRIS-hydroxymethylmethylaminopropan (BIS-TRIS-PROPAN), N-2-hyroxyethylpiperazin-N-3-propansulfonsyre (EPPS), N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-hydroxypropan-sulfonsyre (HEPPSO), 3-N-morfolinopropansulfonsyre (MOPS), piperazin-N-N-bis-2-ethan-sulfonsyre (PIPES), piperazin-N-N-bis-2-hydroxypropansulfonsyre (POPSO), 3-N-TRIS-hydroxy-methylmethylamino-2-hydroxypropansulfonsyre (TAPSO), N-TRIS-hydroxymethylmethyl-2-aminoethansulfonsyre (TES).

Det reagens-modifiserte, kolloidale silica eller

det fortynnede reagens-modifiserte, kolloidale materiale kan steriliseres under anvendelse av steriliseringsmetoder kjent innen faget. Materialene er stabile overfor autoklavering, men en foretrukket steriliseringsmetode er imidler-

tid å føre dette gjennom et 0,2 mikrometers filter. Det steriliserte produkt kan anvendes under aseptiske betingelser for celleseparasjon, eksempelvis for å separere celler for etterfølgende vekst i kultur eller for anvendelse i tester som krever sterilitet av utgangsmaterialene.

Effektiviteten av in situ-separering av komponentceller fra en celleblanding ved kontinuerlig densitetsgradientsentrifugering er avhengig av densiteten av den resulterende blanding av celler og det fortynnede reagens-modif iserte, kolloidale silica. Ved separering av mononukleære celler fra helblod kan eksempelvis densiteten av blandingen beregnes under anvendelse av følgende formel:

, ncn ,3 (1.024 q/cm3 (X ml) + (Y1 q/cm3) (Y ml)

i. 067 g/cm - — —

(X ml + Y ml)

hvori 1,067 g/cm 3 er den resulterende densitet av en optimal blanding av helblod og fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica, og hvori 1,024 g/cm 3 er den effektive densitet av helblod (densiteten av blod minus densitets-bidraget av røde blodceller i blodet) og hvori X = volumet av blod som skal separeres og hvori Y^"= densiteten av fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica og hvori Y = volumet av fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica.

Enhver kombinasjon av helblod og fortynnet reagens-modif isert, kolloidalt silica kan anvendes. Den eneste begrensning er at den resulterende densitet av blandingen må være ca. 1,067 - 0,001 g/cm<3>. Erythrocytt-densitet er pH-avhengig. Densiteten av erythrocytter er størst ved pH 7,40 - 0,03 i fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica. Følgelig oppnås den mest effektive separasjon av erythrocytter fra mononukleære celler ved denne pH.

Strukturen av det reagens-modifiserte, kolloidale silica er som følger: og R er reagenset, kjedet til den kolloidale silicapartikkel. Når reagenset er ga"mma-glycidoxypropyltrimethoxysilan, er strukturen av reaksjonsproduktet som følger:

hvori to X-grupper utgjør enten to -OH-grupper eller fortrinnsvis en -0H og en ytterligere binding, eller fortrinnsvis to ytterligere bindinger med silicaoverflaten. Ingen tverr-binding eller polymerisering mellom R-grupper finner sted. Den skjematiske angivelse av den sluttelige, kolloidale silicapartikkel er vist i figur 2 hvori de bundne reagens-grupper er representert ved "R".

Ved bruk bringes det fortynnede reagens-modifiserte, kolloidale silica i kontakt på en egnet måte med en prøve inneholdende celler eller cellulære komponenter som skal separeres. Valget av hvilket partikkelstørrelsemateriale som skal anvendes, er basert på området av flytedensiteter av cellene eller de cellulære komponenter som skal separeres, og sentrifugalkraften og varigheten som må anvendes ved separeringen. Anvendelse av større partikkelstørrelse er foretrukket fordi det reduserer tid og g-kraft som er nød- vendig for å utvikle en densitetsgradient sammenlignet med mindre partikkelstørrelser. Store partikkelstørrelser har en større sedimenteringsgrad enn små partikkelstørrelser da sedimenteringsgraden er proporsjonal med kvadratet av par-tikkeldiameteren. Lavere sentrifugeringstider og g-krefter reduserer skaden på cellene eller de cellulære komponenter som oppstår fra sentrifugeringen.

Celleseparasjon i det reagens-modifiserte, kolloidale silica utføres ved bevegelse av cellene eller de cellulære komponenter under sentrifugeringen mot deres flytedensiteter innen densitetsgradienteni Cellebåndene som dannes ved de respektive flytedensiteter, kan deretter individuelt overføres til sentrifugerør med pipette eller fortrinnsvis med cellefjerningsrør. Fremgangsmåtene for fremstilling og bruk av angitte cellefjerningsrør er beskrevet i US patentsøknad 849.698 innlevert 9. april 1986, hvis beskrivelse herved inkorporeres ved henvisning. Cellesepara-sjonsreagenset kan fjernes ved vasking. Cellene kan deretter pelleteres og resuspenderes i buffer eller vekstmedium.

Oppfinnelsen vil ytterligere forstås ved å betrakte de etterfølgende eksempler. Det skal imidlertid forstås at disse eksempler er gitt av illustrative grunner og er ikke begrensende, og at mange forandringer kan foretas i f.eks. mengder eller valg av materiale uten å avvike fra oppfinn-elsens ramme slik denne er angitt i kravene.

Eksempel 1

Fremstilling av reagens- modifisert, kolloidalt silica

Tre liter 70 Å kolloidalt silica (50 vekt% silica)

(levert fra Nyacol Products, Inc., Worchester, Mass.) ble oppvarmet til 7 5°C. 210 ml gamma-glycidoxypropyltrimethoxysilan (levert fra Petrarch Systems, Inc.) ble tilsatt med 0,2 ml pr. minutt og under kontinuerlig omrøring. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 75°C under omrøring, og i ytterligere 60 minutter etter den siste tilsetning av reagens. Reaksjonsblandingen ble deretter ført gjennom en aktivert carbonkolonne (diameter 8 cm, høyde 40 cm) for å fjerne

ethvert reaksjonsbiprodukt. Det reagens-modifiserte, kolloidale silica ble deretter avionisert ved at det ble ført gjennom først en kationbytterharpikskolonne (hydrogenform) (8 cm x 40 cm) og deretter en anionbytterharpiks-kolonne (hydroxydform) (8 cm x 40 cm) med 3,8 liter pr. time. Tre liter vann ble deretter ført gjennom carbon- og ione-bytterharpiksene for å fjerne ethvert gjenværende reagens-modifisert, kolloidalt silica.

For å lette dannelsen av ytterligere covalente bindinger mellom reagenset og silicaoverflaten ble det reagens-modifiserte, kolloidale silica deretter oppvarmet til 95°C under kraftig omrøring i 3 timer. 8 til 9 g/l fast natriumklorid og 0,3 til 0,4 g/l kaliumklorid og 20 mM HEPES-buffer i hydrogen-(2,51 g/1) og natrium- (2 , 47 g/1) form ble deretter tilsatt til det reagens-modifiserte, kolloidale silicapreparat for å justere det osmotiske trykk og pH til fysiologiske nivåer. Den resulterende løsning ble deretter fortynnet til en sluttelig densitet på

1,074-1,099 g/cm 3 ved blanding med en HEPES-bufret løsning med identisk, osmotisk trykk og pH. (Se tabell 4 hvori egenskapene av to av de fortynnede reagens-modifiserte, kolloidale silicamaterialer fremstilt som ovenfor angitt,

er blitt sammenlignet med to kommersielt tilgjengelige celleseparasjonsreagenser, Percoll<®>(registrert varemerke for Pharmacia) og Ludox<®>HS-30 (registrert varemerke for DuPont)).

Eksempel 2

Separering av mononukleære celler fra blod

3 ml fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica fremstilt fra kolloidalt silica med en partikkeldia-meter på ca. 70 Å og med en densitet etter fortynning på ca. 1,074 g/cm 3, ble anbragt i et 15 ml konisk sentrifugerør. 3 ml blod fortynnet 1:1 med fosfatbufret saltvann (natriumklorid, 8 g/l; kaliumklorid, 0,2 g/l; dinatriumhydrogenfosfat, 1,15 g/l; kaliumdihydrogenfosfat, 0,2 g/l, pH 7,4) ble laglagt på det reagens-modifiserte, kolloidale silica. Røret ble sentrifugert ved 900 x g i 20 minutter ved romtemperatur i en svingende spannrotor. Det mononukleære cellebånd som ble oppsamlet ved menisken, ble fjernet med et cellefjerningsrør eller en pipette. De mononukleære celler ble vasket ved tilsetning av 10 ml Hanks balanserte saltløsning (kaliumklorid, 0,4 g/l; kaliumdihydrogenfosfat, 60 mg/l; natriumklorid, 8,0 g/l; natriumbicarbonat,

0,35 g/l; dinatriumhydrogenfosfat, 48 mg/l; glucose, 1 g/l; fenolrødt 10 mg/l, pH 7,4) og sentrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Den midlere prosentvise gjenvinning av lymfocytter var 6 2,3, den midlere levedyktighet av cellene var mer enn 95%, den midlere prosent av lymfocytter var 77,6%. (Se tabell 4 for en sammenligning med gjenvinninger erholdt med de valgte, kommersielt tilgjengelige celleseparasjonsreagenser).

Eksempel 3

Aseptisk separering av mononuklære celler fra et stort volum av anti- koagulert helblod 4 til 15 ml EDTA anti-koagulert helblod ble tilsatt aseptisk til et rør inneholdende 6,7 ml av et filter-sterilisert, fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica med en flytedensitet etter fortynning på ca. 1,089 til 1,099 g/cm 3. Blodet og kolloidalt silica ble blandet forsiktig ved snuing av røret flere ganger. De mononukleære celler ble separert ved sentrifugering ved 2000 x g i 10 minutter ved romtemperatur i en rotor med en fast vinkel. Det mononukleære cellebånd som ble dannet like under menisken, ble fjernet aseptisk med et sterilt cellefjerningsrør.

De gjenvundne celler ble vasket ved tilsetning av 10 ml av steril Hanks balanserte saltløsning, hvorpå røret ble snudd opp ned. Røret ble deretter sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. For maksimal lymfocyttgjenvinning ble 0,1% BSA innbefattet i vaskebufferen. Den midlere gjenvinning av lymfocytter var 84,8%, den midlere levedyktighet var 98,0%, og den midlere renhet av lymfocytt-populasjonen var 76,4%. (Se tabell 5 for en sammenligning av gjenvinninger erholdt med utvalgte kommersielt tilgjengelige celleseparasjonsreagenser. Se også tabell 6 for en analyse av prosenten av blodkomponentcelletyper gjenvunnet med produkt anvendt ifølge dette eksempel).

Eksempel 4

Separering av mononuklære celler fra et lite volum av anti- koagulert helblod

1 til 3 ml EDTA anti-koagulert helblod ble tilsatt til et rør inneholdende 6,7 ml fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica med en densitet etter fortynning på ca. 1,089 til 1,099 g/cm<3>. 1 ml Hanks bufret saltløsning, pH 7,4, ble tilsatt. Blodet og kolloidalt silica ble blandet forsiktig ved at røret ble snudd flere ganger. De mono-

nuklære celler ble separert ved sentrifugering ved 2000 x g i 10 minutter ved romtemperatur i en rotor med fast vinkel. Det mononukleære cellebånd som ble dannet like nedenfor menisken, ble fjernet med et cellefjerningsrør. De gjenvundne celler ble vasket ved tilsetning av 10 ml Hanks balanserte saltløsning, og røret ble snudd opp ned. Røret ble deretter

sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. For maksimal lymfocyttgjenvinning ble 0,1% BSA innbefattet i vaskebufferen.

Eksempel 5

Aseptisk separering av lymfocytter fra et stort volum anti- koagulert helblod 4 til 15 ml EDTA anti-koagulert helblod ble tilsatt aseptisk til et rør inneholdende 6,7 ml filter-sterilisert, fortynnet, reagens-modifisert, kolloidalt silica med en densitet etter fortynning på ca. 1,079 til 1,089 g/cm 3. Blodet og det fortynnede reagens-modifiserte, kolloidale silica ble blandet forsiktig ved at røret ble snudd opp ned flere ganger. De mononukleære celler ble separert ved sentrifugering ved 2000 x g i 15 minutter ved romtemperatur i en rotor med fast vinkel. Det monocytte og blodplate-cellebånd som ble dannet like nedenfor menisken, ble fjernet med en steril pipette og et sterilt cellefjerningsrør. Lymfocyttbåndet som ble dannet under det foregående bånd, ble fjernet med cellefjerningsrøret. De gjenvundne cellebånd ble hvert vasket ved tilsetning av 10 ml steril Hanks balanserte saltløsning og snuing av røret. Røret ble deretter sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. For maksimal lymfocyttgjenvinning ble 0,1% BSA innbefattet i vaskebufferen.

Eksempel 6

Separering av lymfocytter fra et lite volum av anti- koagulert helblod 1 til 3 ml av EDTA anti-koagulert helblod ble tilsatt til et rør inneholdende 6,7 ml av et fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica med en flytedensitet etter fortynning på ca. 1,079 til 1,089 g/cm 3. Blodet og fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica ble blandet forsiktig ved at røret ble snudd flere ganger. De mononukleære celler ble separert ved sentrifugering ved 2000 x g i 15 minutter ved romtemperatur i en rotor med fast vinkel. Cellebåndet omfattende monocytter og blodplater som ble dannet like under menisken, ble fjernet med en pipette og cellefjerningsrør. Lymfocyttbåndet som ble dannet under det foregående bånd, ble fjernet med cellefjerningsrøret. De gjenvundne bånd av celler ble hvert vasket ved tilsetning av 10 ml Hanks balanserte saltløsning, og røret ble snudd. Røret ble deretter sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. For maksimal lymfocyttgjenvinning ble 0,1% BSA innbefattet i vaskebufferen.

Eksempel 7

Separering av B- og T- lymfocyttceller fra helblod under anvendelse av klinisk forsøkssett

Totalt 6,7 ml fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica som omfatter 1,7 ml reagens-modifisert, kolloidalt silica fremstilt fra ca. 70 Å kolloidalt silica,

4,0 ml reagens-modifisert, kolloidalt silica fremstilt fra 130-200 Å kolloidalt silica og 1,0 ml reagens-modifisert, kolloidalt silica fremstilt fra 600 Å kolloidalt silica,

ble blandet med 1 til 5,0 ml helblod og sentrifugert ved 2000 x g i 15 minutter i en rotor med fast vinkel. B-lymfocyttene dannet et bånd ved et skarpt brudd i gradienten. B-lymfocyttene dannet et bånd separat over T-cellebåndet. B-cellebåndet ble fjernet med en pipette og et cellefjern-ingsrør. T-cellebåndet ble deretter fjernet under anvendelse av cellefjerningsrøret. De oppsamlede cellebånd ble hvert vasket med 10 ml Hanks balanserte saltløsning, pH 7,4, og ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur.

Eksempel 8

Separering av B- lymfocytter før fusjon med myelomaceller

7

1 til 6 ml av en musemiltcellesuspensjon, 1 x 10 til 5 x 10 7 celler/ml i Hanks balanserte saltløsning, pH 7,4, ble blandet med 6,7 ml fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica og ble sentrifugert ved 2000 x g i 10 til 15 minutter i en rotor med fast vinkel. B-lymfocyttene er mindre tette enn mesteparten av de andre celler i milten og vil danne et bånd noen få millimeter under menisken. Båndet av celler ble oppsamlet under anvendelse av et cellefjernings-rør. Cellene ble vasket ved tilsetning av 10 ml Hanks balanserte saltløsning, pH 7,4 og sentrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. De separerte celler kan deretter anvendes direkte for fusjon med myleomaceller.

Eksempel 9

Separering av celler under anvendelse av silicapartikler modifisert med monoklonale antistoffer

100 ml delvis reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler (fremstilt fra kolloidale silicapartikler på ca. 600 Å) ble omsatt under vandige betingelser med 0,5 til 1,0 ml 3-mercaptopropyltrimethoxysilan under dannelse av thiol-modifisert, kolloidalt silica som nå inneholder thiolgrupper på den reagens-modifiserte, kolloidale silica-overflate. Det thiol-modifiserte, kolloidale silica ble omsatt under vandige betingelser med 0,25 til 1,50 g N-succinimidyl, 3-(2-pyridylthio)-proprionat (SPDP) som rea-gerer med thiolene under dannelse av SPDP-modifisert, kolloidalt silica. 20 til 2000 mg protein A ble deretter tilsatt til det SPDP-modifiserte, kolloidale silica. SPDP danner en amidbinding med protein A og kopler det således til partiklene under dannelse av protein A-modifisert, kolloidalt silica. 5 til 200 ug monoklonalt antistoff (Mab) ble deretter blandet med 0,1-1,0 ml protein A-modifisert, kolloidalt silica. Protein A binder Mab under dannelse av antistoff-modifisert, kolloidalt silica. Det antistoff-modifiserte, kolloidale silica ble blandet med 1 til 5,0 ml helblod og inkubert i 15 minutter for å tillate at antistoffet fikk bindes til antigenet på cellene. Blandingen ble deretter separert ved densitetsgradientsentrifugering på fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica. Cellene til hvilke antistoff-modifisert, kolloidalt silica er bundet, var forandret i densitet og kan således lett separeres. Det antistoff-modifiserte, kolloidale silica med

bundne celler ble oppsamlet under anvendelse av et celle-fjerningsrør. Cellene ble fjernet fra det antistoff-modifiserte, kolloidale silica ved behandling med dithio-threitol eller andre sulfhydrylreduserende midler slik som glutathion eller beta-mercaptoethanol. Cellene ble deretter vasket med 10 ml Hanks balanserte saltløsning, pH 7,4, og ble oppsamlet ved sentrifugering ved 300 x g i 10 minutter.

Eksempel 10

Separering av celler under anvendelse av silicapartikler modifisert med monoklonale antistoffer

Fullt reagens-modifisert, kolloidalt silica ble fremstilt under anvendelse av epoxyorganosilan eller hvilke som helst av de organosilaner som er oppført i tabell 3. 100 ml fullt reagens-modifisert, kolloidalt silica (fremstilt fra kolloidale silicapartikler på ca. 600 Å) ble omsatt med 0,5 til 5,0 g 1,1-carbonyldiimidazol eller 0,3 til 3,0 g s.uccinimid under vandige betingelser, under dannelse av carbodiimid-modifisert, kolloidalt silica. Det carbodiimid-modifiserte, kolloidale silica ble deretter omsatt direkte med 13 til 1300 mg protein A i vann under dannelse av protein A-modifisert, kolloidalt silica. Renset, monoklonalt antistoff (Mab), 5 ug til 200 ug, ble deretter blandet med 0,1 til 1,0 ml protein A-modifisert, kolloidalt silica. Protein A binder Mab under dannelse av antistoff-modifisert, kolloidalt silica. Det antistoff-modifiserte, kolloidale silica ble blandet med 1 til 6,0 ml helblod og inkubert i 15 minutter for å tillate at det antistoff-modifiserte, kolloidale silica fikk bindes til antigen på cellene.

. Blandingen ble deretter separert ved densitetsgradientsentrifugering gjennom fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica. Cellene til hvilke antistoff-modifisert, kolloidalt silica var bundet, var forandret i densitet og kunne således lett separeres. Det antistoff-modifiserte, kolloidale silica med bundne celler ble oppsamlet under anvendelse av et cellefjerningsrør. Cellene ble fjernet fra det antistoff-modifiserte, kolloidale silica ved behandling

med ethanolamin. Cellene ble deretter vasket med 10 ml Hanks balanserte saltløsning, pH 7,4, og ble oppsamlet ved sentrifugering ved 300 x g i 10 minutter.

Eksempel 11

Separering av X- og Y- bærende spermaceller fra semenprøver

7

1 til 6 ml av en semenprøve inneholdende 1 x 10

til 2 x 10 7sperma/nl, ble blandet med 6,7 ml fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica som hadde en densitet etter fortynning pa 1,185 g/cm 3, en densitet som ligger mellom densitetene for X- og Y-sperma. Gradientmaterialet besto av 1,7 ml reagens-modifisert, kolloidalt silica fremstilt fra kolloidalt silica på ca. 70 Å og 5,0 ml reagens-modifisert, kolloidalt silica fremstilt fra kolloidalt silica på ca. 200 Å. Blandingen ble sentrifugert ved 2000

x g i 10 til 15 minutter i en rotor med fast vinkel. Densiteten av Y-sperma er mindre enn X-sperma på grunn av det lavere DNA-innhold pr. sperma. Y-spermaet ble fjernet under anvendelse av en pipette og cellefjerningsrør. X-spermaet ble fjernet under anvendelse av et cellefjerningsrør.

Separeringen ble overvåket ved fluorescensbeising

av de separerte spermatozoer under anvendelse av acridin-orange og ble kvantifisert under anvendelse av et Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) lasersystem. Det større DNA-innhold av X-spermaet gir en større fluorescent avbildning i forhold til Y-spermaet. Biol. Reprod. 28: 312-321 (1983).

Eksempel 12

Dannelse av gradientformer under anvendelse av en kombinasjon av partikkelstørrelser

Totalt 6,0 ml av en blanding av distinkte populasjoner av fortynnet reagens-modifisert, kolloidalt silica, hver med en densitet på 1,089 g/cm 3 etter fortynning, ble blandet med 3,0 ml helblod og sentrifugert i 10 minutter i en rotor med fast vinkel med 2000 x g ved romtemperatur. Distinkte populasjoner av reagens-modifisert, kolloidalt silica ble blandet som angitt i tabell 7. Densitetsmarkørperler (Pharmacia) ble anvendt for å måle densiteten ved hvilken celler i blodprøven dannet bånd. Resultatene for kombinasjonene angitt i tabell 7, er vist i figur 1.

Claims (22)

1. Celleseparasjonsmateriale omfattende: (a) et flertall av kolloidale silicapartikler; og (b) en effektiv mengde av et modifiserende reagens covalent bundet til angitte, kolloidale silicapartikler under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler som har en ikke-ionisk, hydrofil overflate.

2. Materiale ifølge krav 1, karakterisert ved at angitte, modifiserende reagens omfatter et organosilan med en vannlø selig, funksjonell gruppe.

3. Materiale ifølge krav 2, karakterisert ved at angitte organosilan er av generell formel:

4. Materiale iføgle krav 3, karakterisert ved at "Y" er valgt fra gruppen bestående av OCH2 CHCH2 0, 02 CCH3 , N(CH2 CH2 OH)2 , C02 CH3 , NH(CH2 )2 NH(CH2 )2 C02 CH3 , NHCOCf^NHC(CH3)0, N(CH2 CH2 )2 0 og N(CH=CH2 )2 .

5. Materiale ifølge krav 3, karakterisert ved at "X" er valgt fra gruppen bestående av H3 CO, Cl, H5 C2 0, H3 CC02 , H3 C og (H3 C)2 .

6. Materiale ifølge krav 2, karakterisert ved at angitte organosilan er av generell formel:

7. Materiale ifølge krav 6, karakterisert ved at "Y" er valgt fra gruppen bestående av OCH2 CHCH2 0,■02 CCH3 , N(CH2 CH2 OH)2 , C02 CH3 , NH(CH2 )2 NH(CH2 )2 C02 CH3 , NHCOCf^ NHC(CH3 >0, N(CH2 CH2 )2 0 og N(CH=CH2 )2 .

8. Materiale ifølge krav 6, karakterisert ved at "X" er valgt fra gruppen bestående av H3 C0, Cl, H5 C2 0, H3CC02, H3C og (H3 C)2 -

9. Materiale ifølge krav 2, karakterisert ved at organosilanet omfatter gamma-glycidoxypropyltrimethoxysilan.

10. Materiale ifølge krav 1, karakterisert ved at hver av angitte, kolloidale silicapartikler har tilnærmet samme størrelse og hvori angitte reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler resulterende derfra, omfatter en distinkt populasjon.

11. Materiale ifølge krav 10, karakterisert ved at angitte størrelse av de kolloidale silicapartikler er mellom 30 Å og 600 Å i diameter.

12. Materiale ifølge krav 10, karakterisert ved at én eller flere distinkte populasjoner av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler er suspendert i en buffer og blandet under dannelse av en celleseparasjonsmaterialblanding med en ønsket sluttelig densitet.

13. Fremgangsmåte for separering av komponentcelletyper fra en celleblanding, omfattende trinn for: (a) anbringelse av en celleblanding på toppen av et celleseparasjonsmateriale omfattende et flertall av kolloidale silicapartikler covalent bundet til et modifiserende reagens, under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapar tikler med en ikke-ionisk, hydrofil overflate, hvilket celleseparasjonsmateriale er suspendert i en buffer; og (b) sentrifugering av celleprøven gjennom angitte celleseparasjonsmateriale under dannelse av minst ett komponentcellebånd med en karakteristisk flytedensitet.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at angitte, modifiserende reagens omfatter et organosilan med en vannløselig, funksjonell gruppe.

15. Fremgangsmåte for separering av komponentcelletyper fra en celleblanding omfattende trinn for: (a) tilsetning av en celleblanding til et rør inneholdende et celleseparasjonsmateriale omfattende et flertall av kolloidale silicapartikler covalent bundet til et modifiserende reagens under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler som har en ikke-ionisk, hydrofil overflate, hvilket celleseparasjonsmateriale er suspendert i en buffer; (b) blanding av angitte celleblanding og angitte celleseparasjonsmateriale ved omsnuing; og (c) sentrifugering av angitte celleblanding og angitte celleseparasjonsmateriale for å utvikle en densitetsgradient hvori angitte komponentceller av angitte celleblanding danner minst ett cellebånd som har en karakteristisk flytedensitet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at angitte modifiser-ingsreagens er et organosilan.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at minst to cellebånd som har en karakteristisk flytedensitet, dannes, idet ett av angitte to cellebånd har en høyere densitet enn det andre av angitte to cellebånd.

18. Fremgangsmåte for separering av komponentcelletyper fra en celleblanding ifølge krav 15, karakterisert ved at minst to distinkte populasjoner av angitte celleseparasjonsmateriale blandes, hvor hver av angitte populasjoner omfatter et flertall av kolloidale silicapartikler med tilnærmet ensartet størrelse, covalent bundet til et modifiserende reagens under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler som har en ikke-ionisk, hydrofil overflate.

19. Celleseparasjonsmateriale fremstilt ved en fremgangsmåte omfattende trinn for: (a) blanding av en kolloidal silicapartikkel covalent bundet til et organosilan som har en vannløselig, funksjonell gruppe, med et mercaptosilan som er i stand til å danne thiolgrupper på overflaten av angitte partikler, under dannelse av thiol-modifisert, kolloidalt silica; (b) omsetning av angitte thiol-modifiserte, kolloidale silica med et succinimid som er i stand til å reagere med angitte thiolgrupper under dannelse av succinimid-modifisert, kolloidalt silica; (c) omsetning av angitte succinimid-modifisert, kolloidalt silica med protein A under dannelse av protein A-modifisert, kolloidalt silica; og (d) omsetning av angitte protein A-modifisert, kolloidalt silica med et renset antistoff under dannelse av antistoff-modifisert, kolloidalt silica.

20. Celleseparasjonsmateriale fremstilt ved fremgangs-måten omfattende trinn for: (a) blanding av et flertall av kolloidale silicapartikler covalent bundet til et organosilan som har en vannløselig, funksjonell gruppe, med et koplingsreagens som er i stand til å reagere med angitte, kolloidale silicapartikler under dannelse av aktiverte partikler; (b) omsetning av angitte, aktiverte partikler med protein A under dannelse av protein A-modifisert, kolloidalt silica; og (c) omsetning av angitte protein A-modifisert, kolloidalt silica med et antistoff under dannelse av anti-stof f-modif isert , kolloidalt silica.

21. Celleseparasjonsmateriale ifølge krav 20, karakterisert ved at angitte koplingsreagens er valgt fra 1,1-carbonyldiimidazol og succinimid.

22. Fremgangsmåte for separering av spesifikke celletyper fra en celleblanding omfattende trinn for: (a) blanding av et antistoff-modifisert, kolloidalt silica og en celleblanding under dannelse av en partikkel-celleblanding; (b) inkubering av angitte partikkel-celleblanding i tilstrekkelig tid til å tillate at komponentcelletyper får bindes til angitte antistoff-modifiserte partikler under dannelse av en inkubert partikkel-celleblanding og partikkel-bundne celler; (c) blanding av angitte, inkuberte partikkel-celleblanding og angitte partikkel-bundne celler med et celle-separas jonsmateriale omfattende et flertall av kolloidale silicapartikler covalent bundet til et organosilan under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler som har en ikke-ionisk, hydrofil overflate, idet angitte celleseparasjonsmateriale er suspendert i en buffer; og (d) sentrifugering av angitte partikkel-bundne celler og inkubert partikkel-celleblanding gjennom angitte celleseparasjonsmateriale under dannelse av minst ett komponentcellebånd som har en karakteristisk flytedensitet og minst ett bånd av partikkel-bundne celler.

1. Celleseparasjonsmateriale omfattende: (a) et flertall av kolloidale silicapartikler; og (b) en effektiv mengde av et modifiserende reagens covalent bundet til angitte, kolloidale silicapartikler under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler som er ikke-toksiske overfor biologiske materialer og som har en ikke-ionisk, hydrofil overflate, som er stabil i vandige media og som kollektivt danner et stabilt kolloid i vandige media.

2. Materiale ifølge krav 1, karakterisert ved at angitte, modifiserende reagens omfatter et organosilan som har en vannløselig, funksjonell gruppe.

3. Materiale ifølge krav 2, karakterisert ved at organosilanet er av generell formel:

4. Materiale ifølge krav 3, karakterisert ved at "Y" er valgt fra gruppen bestående av OCH2 CHCH2 0, 02 CCH3 , N(CH2 CH2 OH)2 , C02 CH3 , NH(CH2 )2 NH(CH2 )2 C02 CH3 , NHCOCI^NHC(CHg)0, N(CH2 CH2 )2 0 og N(CH=CH2 )2 .

5. Materiale ifølge krav 3, karakterisert ved at "X" er valgt fra gruppen bestående av H3 C0, Cl, H5 C2 0, H3CC02, H3C og (H3 C)2 .

6. Materiale ifølge krav 2, karakterisert ved at angitte organosilan er av generell formel: (X)3 -Si-(CH2 )2 -Y.

7. Materiale ifølge krav 6, karakterisert ved at "Y" er valgt fra gruppen bestående av OCH2CHCH20, 02CCH3, N(CH2 CH2 OH)2 , C02 CH3 , NH(CH2 )2 NH(CH2 )2 C02 CH3 , NHCOCf^ NHC(CH3 )0, N(CH2 CH2 )2 0 og N(CH=CH2 )2 .

8. Materiale ifølge krav 6, karakterisert ved at "X" er valgt fra gruppen bestående av H3 CO, Cl, H5 C2 0, H3 CC02 , H3 C og (H3 C)2 .

9. Materiale ifølge krav 2, karakterisert ved at organosilanet omfatter gamma-glycidoxypropyltrimethoxysilan.

10. Materiale ifølge krav 1, karakterisert ved at hver av angitte, kolloidale silicapartikler har tilnærmet samme størrelse og hvori angitte reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler resulterende derfra, omfatter en distinkt populasjon.

11. Materiale ifølge krav 10, karakterisert ved at angitte størrelse av de kolloidale silicapartikler er mellom 30 Å og 600 Å i diameter.

12. Materiale ifølge krav 10, karakterisert ved at én eller flere distinkte populasjoner av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler er suspendert i en buffer og blandet under dannelse av en celleseparasjonsmaterialblanding med en ønsket sluttelig densitet.

13. Fremgangsmåte for separering av komponentcelletyper fra en celleblanding, omfattende trinn for: (a) anbringelse av en celleblanding på toppen av et celleseparasjonsmateriale omfattende et flertall av kolloidale silicapartikler covalent bundet til et modifiserende reagens, under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler med en ikke-ionisk, hydrofil overflate, hvilket celleseparasjonsmateriale er suspendert i en buffer; og (b) sentrifugering av celleprøven gjennom angitte celleseparasjonsmateriale under dannelse av minst ett komponentcellebånd med en karakteristisk flytedensitet.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at angitte, modifiserende reagens omfatter et organosilan med en vannløselig, funksjonell gruppe.

15. Fremgangsmåte for separering av komponentcelletyper fra en celleblanding omfattende trinn for: (a) tilsetning av en celleblanding til et rør inneholdende et celleseparasjonsmateriale omfattende et flertall av kolloidale silicapartikler covalent bundet til et modifiserende reagens under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler som har en ikke-ionisk, hydrofil overflate, hvilket celleseparasjonsmateriale er suspendert i en buffer; (b) blanding av angitte celleblanding og angitte celleseparasjonsmateriale ved omsnuing; og (c) sentrifugering av angitte celleblanding og angitte celleseparasjonsmateriale for å utvikle en densitetsgradient hvori angitte komponentceller av angitte celleblanding danner minst ett cellebånd som har en karakteristisk flytedensitet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at angitte modifiser-ingsreagens er et organosilan.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at minst to cellebånd som har en karakteristisk flytedensitet, dannes, idet ett av angitte to cellebånd har en høyere densitet enn det andre av angitte to cellebånd.

18. Fremgangsmåte for separering av komponentcelletyper fra en celleblanding ifølge krav 15, karakterisert ved at minst to distinkte populasjoner av angitte celleseparasjonsmateriale blandes, hvor hver av angitte populasjoner omfatter et flertall av kolloidale silicapartikler med tilnærmet ensartet størrelse, covalent bundet til et modifiserende reagens under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler som har en ikke-ionisk, hydrofil overflate.

19. Celleseparasjonsmateriale fremstilt ved en fremgangsmåte omfattende trinn for: (a) blanding av en kolloidal silicapartikkel covalent bundet til et organosilan som har en vannløselig, funksjonell gruppe, med et mercaptosilan som er i stand til å danne thiolgrupper på overflaten av angitte partikler, under dannelse av thiol-modifisert, kolloidalt silica; (b) omsetning av angitte thiol-modifiserte, kolloidale silica med et succinimid som er i stand til å reagere med angitte thiolgrupper under dannelse av succinimid-modifisert, kolloidalt silica; (c) omsetning av angitte succinimid-modifisert, kolloidalt silica med protein A under dannelse av protein A-modifisert, kolloidalt silica; og (d) omsetning av angitte protein A-modifisert, kolloidalt silica med et renset antistoff under dannelse av antistoff-modifisert, kolloidalt silica.

20. Celleseparasjonsmateriale fremstilt ved fremgangs-måten omfattende trinn for: (a) blanding av et flertall av kolloidale silica partikler covalent bundet til et organosilan som har en vannløselig, funksjonell gruppe, med et koplingsreagens som er i stand til å reagere med angitte, kolloidale silicapartikler under dannelse av aktiverte partikler; (b) omsetning av angitte, aktiverte partikler med protein A under dannelse av protein A-modifisert, kolloidalt silica; og (c) omsetning av angitte protein A-modifisert, kolloidalt silica med et antistoff under dannelse av anti-stof f-modif isert , kolloidalt silica.

21. Celleseparasjonsmateriale ifølge krav 20, karakterisert ved at angitte koplingsreagens er valgt fra 1,1-carbonyldiimidazol og succinimid.

22. Fremgangsmåte for separering av spesifikke celletyper fra en celleblanding omfattende trinn for: (a) blanding av et antistoff-modifisert, kolloidalt silica og en celleblanding under dannelse av en partikkel-celleblanding; (b) inkubering av angitte partikkel-celleblanding i tilstrekkelig tid til å tillate at komponentcelletyper får bindes til angitte antistoff-modifiserte partikler under dannelse av en inkubert partikkel-celleblanding og partikkel-bundne celler; (c) blanding av angitte, inkuberte partikkel-celleblanding og angitte partikkel-bundne celler med et celle-separas jonsmateriale omfattende et flertall av kolloidale silicapartikler covalent bundet til et organosilan under dannelse av reagens-modifiserte, kolloidale silicapartikler som har en ikke-ionisk, hydrofil overflate, idet angitte celleseparasjonsmateriale er suspendert i en buffer; og (d) sentrifugering av angitte partikkel-bundne celler og inkubert partikkel-celleblanding gjennom angitte celleseparasjonsmateriale under dannelse av minst ett komponentcellebånd som har en karakteristisk flytedensitet og minst ett bånd av partikkel-bundne celler.