NO841580L - Kompleksdannelse av biologisk aktive eller funksjonelle forbindelser og fremstilling og bruk derav - Google Patents

Description

Enzymer har en aktuell og stor potensiell anvendelse som diagnostiske kjemikalier eller verktøy. F.eks har det vært fore-slått å biotinylere et enzym slik som alkalisk fosfatase ved festing av en biotin gruppe dertil og å benytte det resulterende biotinylerte enzym som en sonde, slik som en diagnostisk sonde. Uheldigvis er det funnet at når alkaliske fosfataser biotinyleres er det-et resulterende tap på ca. 70% av den enzymatiske aktivitet for enzyme alkalisk fosfatase. I det vesentlige det samme vil være tilfelle i henblikk på den konvensjonelle derivatisering eller modifisering eller biotinylering av andre enzymer slik som sur fosfatase| og glykosidaser. Det ser ut som dt biotinyleringen av enzymene, f.eks alkalisk fosfatase, med aktivert biotin (N-hydroksysuccinimid-biotin), skjer gjennom epsilon amino gruppen i lysin resten ved eller nær sete for enzymets reaktive sete. Det synes videre sannsynlig at inn-arbeiding av biotin bryter opp enzymets tertiære struktur som er viktig for full enzym aktivitet. Som et resultat har den direkte modifisering eller derivatisering slik som biotinylering, av enzymer slik som alkalisk fosfatase, ikke helt et tilfredsstillende derivatisert enzym slik som en biotinylert alkalisk fosfatase, brukbar for diagnostiste formål eller andre formål.

En gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for modifisering eller derivatisering av funksjonelle eller biologisk aktive forbindelser, slik som biotinylering av enzymer, f.eks alkalisk fosfatase, sur fosfatase,

og andre enzymer eller biologisk funksjonelle eller aktive forbindelser i stand til biotinylering eller andre" tilsvarende modifiseringer eller derivatiseringer.

En annen gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe en modi-fisert eller derivatisert aktiv eller funksjonell forbindelse slik som en biotinylert alkalisk fosfatase eller sur fosfatase som er brukbar per se for diagnostiske formål, slik som i forbindelse med lokalisering eller identifisering eller påvisning av andre stoffer.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe material og teknikker som er brukbare ved fremstilling av forbindelser som lett fester seg selv til eller som lett bindes til biotin- eller avidin deler eller andre biologiske aktive eller funksjonelle forbindelser eller komplekser.

I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes

ået enzymbasierte eller bundne materialer og teknikker for fremstilling av slike materialer'og for anvendelse av slike materialer som diagnostiske sonder og lignende.

Hvordan disse og andre gjenstander for oppfinnelsen oppnås

vil fremgå i lyset av den følgende beskrivelsen. I minst en utførelsesform av oppfinnelsen vil minst en av de ovenfor angitte gjenstander oppnås.

I følge oppfinnelsen tilveiebringes det en forbedret fremgangsmåte eller teknikk for modifisering eller derivatisering av funksjonelle forbindelser eller biologiske aktive forbindelser slik som enzymer, hormoner inkl. neurohormoner, lektiner, antistoffer, antigener, proteiner slik som steroid bindene proteiner, hormonreseptorer og andre. Komplekser slik som komplekser som inneholder en biologisk aktiv eller funksjonell forbindelse eller forbindelser eller seter, fremstilles ved å feste eller fiksere en første forbindelse som kan være en biologisk aktiv eller funksjonell forbindelse, til et fast substrat under betingelser slik at det aktive sete av nevnte første forbindelse er beskyttet, deretter derivatisere eller kombinere nevnte første forbindelse med en derivatiserende eller modifiserende forbindelse mens den første forbindelse er festet til det faste substrat.

Det resulterende kompleks eller den kompleksdannede første forbindelse frigis så fra festingen til nevne faste substrat for å gi komplekset i det dette omfatter nevnte derivatiserende forbindelse festet til den første forbindelse, den første forbindelse som ved frigjøring fra det faste substrat har tilgjengelig funksjonelle eller biologiske aktive sete.

F.eks festes alkalisk fosfatase til et fast substrat slik som dekstran kuler, fortrinnsvis gjennom en ligand, slik som en kompetitiv inhibitor for alkalisk fosfatase, p-aminobenzyl fosfonsyre (p-ABPA). Dekstran kulene behandles først med p-ABPA og den alkaliske fosfatase bringes så i kontakt med de behandlede dekstran kuler. Den kompetitive inhibitor p-ABPA tjener som ligand for festing av alkalisk fosfatase til dekstran kulene og opptar og beskytter samtidig det aktive sete på den alkaliske fosfatase.' Deretter derivatiserea.eller modifiserers den således festede alkaliske fosfatase, f.eks ved biotinylering. - Etter biotinylering av den alkaliske fosfatase blir den resulterende biotinylerte alkaliske fosfatase eluert eller fjernet fra festingen til det p-ABPA behandlede faste substrat eller dekstran kulene hvortil den var fiksert og gir således en biotinylert alkalisk fosfatase med det aktive eller funksjonelle sete på den alkaliske fosfatase intakt. Komplekset kan mens det fremdeles er festet til dekstran kulene ytterligere behandles med en andre forbindelse eller komponent som også hvis ønskelig kan gi et aktivt eller funksjonellt sete, slik som ved kontakt med avidin, som vil binde til den modifiserende eller derivatiserende del, dvs. biotin, i den biotinylerte alkaliske fosfatase hvoretter det således femstilte avidin-biotinylerte alkaliske fosfatase kompleks kan elueres. Dette kompleks slik som et kompleks omfattende avidin-biotinylerte alkalisk fosfatase, kan benyttes som detektor i et det-ekterings system for identifisering og eller lokalisering av en annen forbindelse slik som en biotinylert forbindelse, f.eks et biotinylert nykleotid eller biotinylert DNA.

Mer spesielt . og med vekt på gjennomføring av oppfinnelsen slik den anvendes ved biotinylering av enzymer slik som alkalisk fosfatase, tilveiebringes dem en forbedret fremgangsmåte eller teknikk for biotinyliering av enzymer slik som alkalisk fosfatase ved fiksering av en kompetitiv inhibitor av enzymet til et fast substrat, fortrinnsvis et partikkelformig substrat. Deretter bringes enzymet i kontakt med den således fikserte kompetitive inhibitor slik at denne reagerer med eller effektivt okkuperer enzymets aktive sete. Denne okkupering av enzymets aktive sete av inhibitoren tjener til å beskytte enzymet, dvs. det enzymaktive sete, under den etterfølgende biotinylering av enzymet. Med det aktive sete av enzymet okkupert på denne måte kan enzymet som er festet til inhibitoren som er fiksert til en substrat, biotinyleres slik som ved kontakt eller omsetning med aktiviert biotin, N-hydroksy-succinimide-biotin. Ved denne operasjonen biotinyleres enzymet eller det utstyres med biotin eller biotin deler festet til enzymet.

Etter biotinylering av enzymet blir det resulterende biotinylerte enzym fridd fra inhibitoren som forblir fiksert til substratet, med resulterende produksjon og gjenvinning av et biotinylert enzym med det reaktive sete i det vesentlige intakt. Dette produkt, det biotinylerte enzym, slik som biotinylert-alkalisk fosfatase, er generellt brukbart ved kjemiske og eller diagnostiske prosedyrer.

Oppfinnelsens praksis kan generellt anvendes på enzymer, spesielt enzymer som er i stand til biotinylering, slik som enzymer som reagerer med aktivert biotin, N-hydroksy-succinimid-biotin. Egnede slike enzymer inkluderer ikke bare alkaliske fosfatase og sur fosfatase men også andre enzymer inkl. glykosidaser, f.eks 3 galaktosidase og glukose-oksydase.

Som antydet ovenfor kan biotinyleringen av enzymene gjennom-føres ved kontakt eller omsetning av enzymet med aktiviert biotin, N-hydroksy-succinimide-biotin. Andre teknikker er imidlertid også brukbare for gjennomføring av biotinyleringen av enzymene og alle slike teknikker som gir biotinylerte enzymer er brukbare ved gjennomføring av oppfinnelsen.

Ved gjennomføring av oppfinnelsen bringes enzymet som skal biotinyleres først i kontakt med en kompetitiv inhibitor for temporært og eller beskyttende og okkupere enzymets reaktive eller aktive sete under den etterfølgende biotinyleringsopera-sjon. Inhibitoren blir før den bringes i kontakt med enzymet

først helst fiksert, bundet eller festet til et substrat.

Som antydet kan substratet være et fiksert fast substrat eller et partikkelformig fast substrat. Det faste substrat kan hånd-fatte et fast materiale som oppviser eller tilveiebringer en glassoverflate eller et belegg, en polyakrylamid overflate eller et belegg eller derivatisert glassoverflate eller belegg, en dekstran gel (sefarose) overflate eller belegg eller en polystyren overflate eller et belegg. Spesiellt foretrukket ved gjennomføring av oppfinnelsen er et partikkelformig fast materiale slik som kuler, f.eks sefarose kuler, som oppviser eller presenterer slike overflater. Fiksering av inhibitorene til slike overflater skjer i det vesentlige ledd når inhibitoren bringes i kontakt med overfåtene.

Med henblikk på inhibitoren som benyttes for å beskytte enzymaktive- eller -reaktive seter under den etterfølgende biotinylering kan være en hvilken som helst av de kjente kompetitive inhibitorer for enzymer som vanligvis benyttes. Når det gjelder alkalisk fosfatase vil inhibitorene inkludere diazonium saltene av 1-amino-antrakinon, 4-benszolyamino-2:5-dimetoksy-anilin, p-nitroanilin, 4-kloro-2-nitroanilin, 2:5-dikloroanilin, o-dianisidin, 4-kloro-o-anisidin, 5-nitro-o-anisidin, 5-kloro-o-toluidin, 4-nitro-o-anisidin, 3-nitro-p-toluidin, 3-nitro-p-anisidin, 4-amino-3:1' -dimetyl azobenzen, 4-amino-2:5-dimetoksy-4-nitroazobenzen, 4-amino-4'-metoksy difenylamin, 3- nitro-o-toluidin, 4-amino-4'-nitro-3:6-dimetoksy-azobenzen, 4- amino-3':11-dimetyl-azobenzen, 2-metoksy-5-dietylamino-sulfanilin, 2-benzoylamino-4-metoksy-toluidin, 4-amino-difenylamin, p-p'-diaminodifenylamin. Med henblikk på inhibitorer for andre enzymer slik som sur fosfatase inkluderer slike inhibitorer fosfon- og arsonsyre slik som benzylfos-fonsyre, fenylfosfonsyre, 2-fenyletylfosfonsyre, etyl-fosfonsyre, p-nitrobenzylf osf onsyre;/ p-klorobenzylf osf onsyre, p-aminobenzylfosfonsyre, p-aminofenyl- fosfon-

syre., cyklohexylmetylf osf onsyre , f eny larsonsyre , p-amino-fenylarsonsyre ogfosforsyre. Andre inhibitorer som kan benyttes i forbindelse med andre enzymer slik som glykosidaser

glukoseoksydase inkluder inhibitorene p-aminofenyl-3-D-tio-galakto-pyranosid, p-aminofenyl-3~D-tioglukose-pyranosid, 3-aminosuccinyl-3'-aminodipropylamine-3-D-tiogalakto-pyranosid, p-aminopropylamin-3-D-tiogalaktopyranosid, p-aminobutyl-3-D-tiogalaktosid, / p-amin'obutyl-3-D-tioglukosepyranosid.

Andre brukbare inhibitorer og informasjon i forbindelse med

disse er beskrevet i " Biochemistry", 1978, V7, No. 5, pp.-915-

919; " Journal of Clinical PatholOgy", 1 978 , 3J_, pp. 454-460 ;

og " Biochimia et Biophysica Acta", 1979, 569, pp. 159-176.

Etter at enzymet er beskyttet ved at det aktive eller reaktive

sete er okkupert av inhibitoren som er fiksert til et egnet substrat og enzymet som således er beskyttet, er biotinylert,

slik som ved kontakt med aktiviert biotin, f.eks N-hydroksy-succinimid-biotin (NHS-biotin), blir biotinyleringsoperasjonen gjennomført ved en ph verdi innen området ca. 6-7, hvoretter det resulterende biotinylerte enzym frigis eller separeres fra inhibitoren. Denne frigivelse eller separering av det biotinylerte enzym fra festingen til den fikserte inhibitor gjennomføres slett slik som f.eks ved å øke ph verdien til ca. 9 i en buffer inneholdende mer konsentrerte fosfationer som kompenserer for affiniteten av benzylfosfonsyren for enzymet.

Som et spesifikk eksempel ved oppfinnelsens praksis blir en vandig alkalisk fosfataseoppløsning brakt i kontakt med deks-trangel kuler, sefarose, hvortil er festet eller fiksert en kompetitor inhibitor med alkalisk fosfatase inhibitoraktivitet, f.eks p-aminobenzylfosfonsyre, (p-ABPA). Ved kontakt mellom alkalisk fosfatase og fiksert p-ABPA fikseres benzylfosfon delen av p-ABPA til sefarose kulene, reagerer med eller okkuperer enzymets aktive sete og beskytter dette fra etterfølgende subs-tituering, f.eks den etterfølgende biotinylering. Med det reaktive sete på enzymet alkalisk fosfatase okkupert på denne måte eller bundet til den sefarosefikserte p-ABPA, bringes en vandig oppløsning av aktiviert biotin, en hydroksy-succinimid-biotin,

i kontakt med enzymet f.eks ved en ph verdi på 6-7. Under disse

betingelser vil biotinet binde eller feste seg til enzymet, alkalisk fosfatase, slik som til aminogruppene eller protein-

delen derav. Deretter fjernes det resulterende biotinylerte enzym fra festingen til den fikserte inhibitor p-ABPA ved vask-

ing eller eluering av det biotinylerte enzym ved å øke ph verdien til ca. 9 og ved å benytte en økende konsentrert oppløsning av fosfationer.

Det resulterende eluerte biotinylerte enzym slik som den biotinylerte alkaliske fosfatase kan etter separering og gjenvinn:---

ing fra eluate benyttes som en sonde fordi den derpå har tilgjengelig reaktive biotin seter.

En spesiell teknikk og anvendelse av det biotinylerte enzym i-følge oppfinnelsen vil være å benytte det biotinylerte enzym for gjenvinning;- av avidin og eller streptavidin fra blandinger eller relativt urene stoffer som inneholder avidin eller streptavidin. Avidin og streptavidin bindes sterkt til biotin. I

dette aspekt ved oppfinnelsen vil biotinylerte enzym slik som den biotinylerte alkalisk fosfatase ikke elueres eller fri-

gjøres fra den fikserte inhibitor eller vil det biotinylerte enzym som fremdeles er festet til den fikserte inhibitor, bringes i kontakt med en blanding inneholdene av avidin eller strepaviden. Pga. den sterke bindinqsaffinitet) mellom biotin og avidin eller strepavidin når et materiale inneholdendeavidin eller streptavidin bringes i kontakt med det effektivt fikserte biotinylerte enzym vil avidin eller streptavidin reagere med eller bindes til det effektivt fikserte biotin med det resultat at avidin eller streptavidin fjernes eller strippes fra de stoffer som inneholder dem.

Deretter vil det resulterende biotinylerte enzym, nå med avidin eller streptavidin festet til biotindelen derav, elueres eller fjernes fra festingen til den fikserte inhibitor og det vil gjenvinnes et enzymkompleks omfattende enzymet, f.eks alkalisk fosfatase, som er biotinylert og som nå i tillegg har avidin eller streptavidin festet eller bundet til biotindelene av det biotinylerte enzym. Denne teknikk tilveibringes som antydet en lett mulighet for rensing og gjenvinning av avidin eller streptavidin fra urene stoffer inneholdende disse. Videre tilveiebringer teknikken et middel for å oppnå et enzymkompleks som beskrevet ovenfor omfattende et enzym, biotin festet dertil og avidin og streptavidin festet til biotindelen som allerede er festet til enzymet.

Dette kompleks enzym-biotin-avidin eller streptavidin vil være spesielt brukbart som sonde for å søke ut, identifisere, best-

emme eller lokalisere biotinylert substrater slik som biotiny-

lert DNA, biotinylerte peptider eller proteiner, biotinylerte antigener og eller biotinylerte antistoffer. Ved denne anvendelse vil lokalisering eller nærvær av det biotinylerte substrat slik som biotinylert DNA, bestemmes ved å bringe det biotiny-

lerte substrat i kontakt med enzymkomplekset som omfatter enzymet, f.eks alkalisk fosfatase, som dertil har festet biotin som i sin tur har festet dertil biotindeler festet til enzymet, av avdin eller streptavidin. Fordi avidin eller streptavidin har sterk bindingsaffinitet til biotin blir enzymkomplekset ved eksponering til eller kontakt med det biotinylerte substrat let festet dertil noe som resulterer i enzymkomplekset enzym-biotin-avidin eller strepavidin fiksert til biotindelen av det biotinylerte substrat, f.eks biotinylert DNA. Lokalisering eller nærvær eller påvis-

ning av det biotinylerte DNA substrat vil så understøttes av eller belyses ved egnede kjemiske reaksjoner eller fysikalsk påvisning av det reaktive sete av enzymet som forblir tilgjengelig .

Som ytterligere illustrasjon og forklaring på gjennomføringen

av oppfinnelsen og fremdeles med vekt på anvendeligheten av oppfinnelsen til derivatisering av enzymer, spesielt enzymer slik som alkalisk fosfatase, sur fosfatase og hormonreseptor-peroksydase, skal det nedenfor gis eksempler på gjennomføring av oppfinnelsen rettet mot syntese av biologisk aktive eller funksjonelle komplekser, spesielt komplekser omfattende alkalisk fosfatase-biotin-streptaviden.

Eksempel nr. 1

Fremstilling av alkalisk-fosfatase-

biotin- streptavidin kompleks.

Ved fremstilling av alkalisk fosfatase-biotin-streptavidin kompleks benyttes det hensiktsmessig som reagenser i forbindelse med dette alkalisk fosfatase, immobilisert p-aminobenzylfosfonsyre, (p-ABPA), på tverrbunnet 6% kuleformet agarose med en kap-asitet på 0,7 mg alkalisk fosfatase pr. ml gel matriks, biotin-forbindelsen NHS-C^-biotin, med molekylvekt ca. 471 i en 0,005 M

.vannfri dinetylsulfoksidoppløsning, streptavidin ved en konsen- ' trasjon på ca. 10,2 mg/ml protein, 0,01 M Tris- HC1 ved pH 8,0

og 0,01 M Na2HPC>4i 0,01 M Tris- HC1 ved pH 8,0.

Ved preparering av komplekset under anvendelse av disse reagenser blir 2 ml av en 50% oppslemming av en sefarose-p-aminobenzyl fosfonsyre (Seph-p-ABPA) ekvilibrert med 10 volumer 0,01 M Tris-HCl ved pH 8,0. En oppløsning med en konsentrasjon på 1 mg pr. liter alkalisk fosfatase og en oppløsning av streptavidin véd en konsentrasjon av 10 mg pr. ml ble dialysert mot 0,01 M Tris-HCl ved en pH verdi på 8,0 ved 4°C i 24 timer.

Ved denne operasjonen ble buffervolumet forandret 3 ganger.

En ml av en dialysert alkalisk fosfatase ble tilsatt til 4 ml av en 25% oppslemming av Seph-p-ABPA og blandet godt i en rotasjons-blander i ca. 30 minutter ved romtemeratur. Deretter ble gelen innført i en liten kolonne og gjennømstrømningen samlet som fritt enzym som kunne tilbakeføres. Gelen ble så vasket med 10 volumer kold 0,10 M Tris-HCl buffer ved en pH på 8,0. Gelen ble så suspangdert igjen i 1 ml 0,01 Tris-HCl buffer hvortil det var tilsatt 0,6 ml vannfritt dimetylsulfoksid, dråpevis,

under kontinuerlig røring ved langsom hastighet. Deretter ble på samme måte 178 yl 0,005 M NHS-C7-biotin tilsatt og den resulterende blanding inkludert ved romtemeratur i 1,5 timer i rotasjonsbalanderen.

I slutten av inkuberingsperioden ble det tilsatt 45 ml kold

0,01 M Tris-HCl ved pH 8,0 og den resulterende blanding blandet godt. Etter avsetning ca. 30 min. ved 4°C ble den overstående væske fjernet. Denne vasken ble gjentatt 2 ganger til. Den resulterende behandlede og vaskede gel ble fjernet og resu-spangdert i 1 ml buffer av 0,01 M Tris-HCl ved pH 8,0 til hvilken det ble tilsatt 1 ml dialysert streptavidin, etter-fulgt av blanding og inkubasjon av 37°C i 30 min.

I slutten av inkuberingsperioden ble gelen heilt på en liten kolonne og avløpet samlet som fritt streptavidin som hvis ønskelig kunne tilbakeføres.

Gelen i kolonnen ble så vasket med 10 volumer på 0,01 Tris-HCl ved pH 8,0 og det resulterende alkalisk fosfatase-biotin-streptavidin kompleks ble eluert fra kolonnen med 0,01 M Na^HPO^i 0,01 M Tris-HCL buffer ved en pH verdi på 8,0. Her ble 5 drå-pers fraksjoner samlet. Hver fraksjon ble prøvet på alkalisk fosfatase aktivitet ved å ta 10 yl av hver fraksjon, 40 yl buffer og 200 yl p-nitro-fenyl fosfat (1 mg/ml) i 10% dietanolamin buffer ved pH 9,0 og inkubert ved romtemeratur i ca. 10 min. der den resulterende oppløsning ble avlest ved OD405 nm. Fraksjonene som viser enzymatisk aktivitet ble samlet og brakt på nitrocellulosepapir og flekken prøvet med reduserende mengder biotinylerte cytokrom C. Det således fremstillte kompleks var i stand til å påvise 100 fmolbiotin ved bruk av NBT-BCIP substrat og et fmol ved bruk av flavon-3-difosfat, et fluorescensgivende substrat.

Dette eksempel viser ikke bare preparering av en biologisk aktiv eller funksjonell forbindelse ifølge oppfinnelsen men er også indikerende på den så å si totale sensitivitet og den praktiske anvendelse for de således fremstillte komplekser.

-Eksempel nr. 2

Fremstilling av alkalisk fosfatase-biotin-streptavidin- biotinantistoff kompleks .

Det ble fremstillt et kompleks omfattende alkalisk fosfatase-biotin-streptavidin på den måte som angitt i eksempel 1. En kolonne inneholdende komplekset ble vasket med 10 M Tris-HCl ved pH 8,0 og deretter ble 0,05 ml biotinylert B7 gjete anti-

mus antistoff IgG i en konsentrasjon av 3 mg/ml i 10 mM Tris-

HCl ph 8,0 tilsatt til kolonneoppslemmingen og inkubert i en

time ved 37°C under mild risting. Deretter ble komplekset vasket godt med 10 mM Tris-HCl buffer pH 8,0 og brakt tilbake til kolonnen. Kolonneinnholdet ble så eluert med 10 M NaHPO^i 10 mM Tris-HCl ved ph 8,0. Fraksjonene av eluatet ble gjenvunnet og prøvet som følger: Muse IgG ble bragt på nitrocellulosepapir og lufttørket og blokkert med 0,5% Tween 20 overflataktivsk middel i PBS i 30 min i 37°C. Deretter ble det preparerte kompleks fortynnet i 1% BSA-0,1% Tween 20 overflataktivsk middel i PBS ble tilsatt og inkubert i

ca. 1 time ved 37°C under mild rysting fullt av vasking 3 ganger med 0,1% Tween 20 i 1% BSA i PBS i 5 min. hver gang, fullt av vasking med 10 mM Tris-HCl. Til det resulterende preparerte nitrocellulose prøvepapir ble det tilsatt substratet NBT-BCIP-veronal,og inkubert ved 37°C ble det påbragt muse IgG fremkalt og påvist ved det således dannede kompleks.

Som antydet ovenfor er gjennomføringen av oppfinnesen fremhevet med henblikk på fremstilling av komplekser ifølge oppfinnelsen der komplekset omfatter et enzymet slik som et biotinylert enzym, f.eks biotinylert alkalisk fosfatase. Som angitt ovenfor er imidlertid oppfinnelsen også anvendelig på andre enzymer slik som f.eks sur fosfatase, glykosidase, eller et hvilket som helst enzym hvor en kompetitiv enzyminhibitor kan immobiliseres på en fast matriks. Selv om det videre er foretrukket at den modifiserende eller derivatiserende forbindelse eller komponent er biotin kan denne også være en som gir en glykosylgruppe til for bindelsen som skal derivatiseres eller modifiseres. Ved gjenn-omføring av oppfinnelsen kan forbindelsene f.eks modifiseres ved festing dertil av en glykosylgruppe eller en annen sukkerdel. Den således modifiserte eller derivatiserte forbindelse vil så omsettes med et lektin, f.eks Konkanavalin A som fester seg selv til glykosylgruppen, på samme måte som avidin fester seg til biotingruppen eller biotindelen av en biotinylert forbindelse.

Som det fremgår av den ledsagende beskrivelse kan i tillegg til enzymer andre biologisk aktiver eller funksjonelle forbindelser slik som hormoner inkludert neurohormoner, hormonreseptorer, lektiner, antigener, antistoffer og proteiner modifiseres på den her beskrevne måte og så benyttes ved tildanning av biologisk aktive eller funksjonelle komplekser som har et vidt an-vendelsesspektrum. F.eks kan komplekser som på egnet måte er fremstillt ifølge oppfinnelsen inkludere:, komplekser som i en terminalposisjon har et antistoff eller antigen som søker ut og fester seg til sitt tilsvarende antigen eller antistoff, et hormon som søker ut og blir festet til den tilsvarende hormonreseptor, et lektin som søker ut og fester seg til en glykosi-lert forbindelse. Den andre terminalposisjon av komplekset kan inkludere en egnet signalgivende del slik som et enzym som blir effektivt i nærvær av et egnet substrat for å gi et farge-signal eller en annen kjemisk eller fysikalsk endring eller fluorescens, for derved å signalisere festing av den andre enden av komplekset til et mål. Når f.eks den andre ende av komplekset er et hormon vil komplekset benyttes for å søke ut den tilsvarende hormonreseptor slik som i vev inneholdende denne. Med hormonenden av komplekset festet til hormonreseptoren kan enzymet som befinner seg i den andre enden av komplekset benyttes som angitt ovenfor for å signalisere lokalisering og eller festing av hormonterminaldelen av komplekset til hormonreseptoren. På tilsvarende måte kan kompleksene benyttes for å søke ut andre mål av interesse slik som antistoffer, antigener, steroider, glykosilerte organiske molekyler, biotinylerte molekyler eller substrater osv., slik som beskrevet ovenfor.

Slik det vil være klart for fagmannen kan mange modifikasjoner, endringer og erstatninger foretas i forbindelse med oppfinnelsen uten å gå utenfor dens ramme.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et kompleks av en første forbindelse, karakterisert ved at den omfatter å feste eller fiksere den første forbindelse til et fast substrat under betingelser slik at det aktive sete av den første forbindelse er beskyttet, derivatisering eller kombinering av den første forbindelse med-en derivatiserende forbindelse mens det aktive sete av den første forbindelse er festet til og eller beskyttet ved fiksering til det faste substrat, frigjøring av den resulterende kompleksdannede første forbindelse fra festingen til det faste substrat for å oppnå komplekset idet dette omfatter den derivatiserende forbindelse bundet til den første forbindelse hvorved den første forbindelse ved frigjøring fra det faste substrat har sitt aktive sete tilgjengelig.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter festing av den andre forbindelse til den resulterende derivatiserte eller kombinerte første forbindelse idet den andre forbindelsen har bindingsaktivitet som er spesifikk for den derivatiserende forbindelse som benyttes for å derivatisere den første forbindelse, og frigjøre den resulterende kompleksdannede første forbindelse fra festing til det faste substrat for å oppnå komplekset idet komplekset omfatter nevnte andre forbindelse festet til den derivatiserende forbindelse og denne festet til den første forbindelse hvorved den første forbindelse ved frigjøring fra det faste substrat" har tilgjengelig sitt aktive sete.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den første forbindelse er et enzym.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det faste substrat er et sefarosesubstrat, den første forbindelse en glykosidase og den derivatiserende forbindelse et biotin og det resulterende kompleks en biotinylert glykosidase.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den første forbindelsen er glykosidase, den derivatiserende forbindelse er biotin og den andre forbindelse er streptavidin mens det resulterende kompleks er streptavidin-biotinylertgly-kosidase.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 , karakterisert ved at substratet forbehandles med en kompetitiv inhibitor før den første forbindelse før festing av denne til substatet via den kompetitive inhibitor.

7. Kompleks, karakterisert ved at de omfatter en første forbindelse som tilveiebringer et aktivt eller funksjonellt sete der den første forbindelse er derivatisert eller kom-binert med en derivatiserende forbindelse, og en andre forbindelse med bindingsaktivitid som er spesifikk for nevnte derivatiserende forbindelse <>> festet til den første forbindelse.

8 . Fremgangsmåte for detektering av et kjemisk merket nukleotid, karakterisert ved at den omfatter og bringer det kjemisk merkede nukleotid i kontakt med et kompleks omfattende en første forbindelse som oppviser et aktivt eller funksjonellt sete, en derivatiserende forbindelse festet til den første forbindelse i komplekset og en andre forbindelse med en bindingsaktivitet spesifikk for den derivatiserende forbindelse og festet dertil, idet den andre forbindelse også har bindingsakivitet for den kjemiske del som benyttes for kjemisk og merke det kjemisk merkede nukleotid hvorved komplekset blir festet til en kjemisk merkelapp festet til nukleotidet og således til kjenne i nærværet av den nevnte kjemiske merkede nukleotid, nå festet til den nevnte andre forbindelsen i kom plekset, ved å bringe den resulterende kombinasjon av kompleks festet til det kjemiske nukleotid i kontakt med et substrat under betingelser slik at det aktive eller funksjonelle sete av den første forbindelse som utgjør komplekset, bevirker og tilveiebringer en observerbar endring i substratet.

9 . F remgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nukleotidet er deoksyribonukleotid.

10. Fremgangsmåte for detektering av et kjemisk merket nukleotid, karakterisert ved at den omfatter å bringe det kjemisk merkede nukleotid i kontakt med et kompleks som oppviser en første forbindelse, med en derivatiserende forbindelse festet til den første forbindelse i komplekset og den andre forbindelse med bindingsaktivitet spesifikk for den derivatiserende forbindelse og festet dertil, idet den andre forbindelse også har bindingsaktivitet for den kjemiske del som benyttes for kjemisk og merking der kjemisk merkede nukleotid, hvorved komplekset blir festet til den kjemiske merkelapp i nukleotidet, idet den første forbindelse er i stand til fluorescens og eks-ponerer den resulterende kombinasjon av det kjemisk merkede nukleotid festet til komplekset for bestråling for å indusere fluorescens fra nevnte første forbindelse omfattende nevnte kompleks for således å indikere eller belyse nærværet av det kjemisk merkede nukleotid, festet til nevnte kompleks.

11. Fremgangsmåte for detektering av et kjemisk merket nukleotid, karakterisert ved at den omfatter å bringe det kjemisk merkede nukleotid i kontakt med et kompleks som oppviser den første forbindelse, en andre forbindelse med bindingsaktivitet spesifikk for den første forbindelse idet den andre forbindelse er fluorescinert, hvorved den første forbindelse også har spesifikk bindingsaktivitet med henblikk på den kjemiske del som benyttes for kjemisk å merke det kjemisk merkede nukleotid, hvor i komplekset blir festet til den kjemiske merkelapp i nukleotidet via den første forbindelse, og eksponering av den resulterende kombinasjon av nevnte kjemisk merkede nukleotid festet til nevnte første forbindelse i komplekset til bestråling hvorved nevnte andre forbindelse festet til den første i komplekset induserer til fluorescens for å indikere eller belyse nærværet av nevnte kjemisk merkede nukleotid festet til komplekset.

12. Fremgangsmåte for detektering av et hormon, karakterisert ved at den omfatter å bringe et materiale inneholdende det nevnte hormon i kontakt med et kompleks under betingelser som bringer komplekset i kontakt med hormonet, idet komplekset omfatter en hormonreseptor som oppviser et aktivt eller funksjonelt sete for festing til hormonet når det er i kontakt, derivatiserende forbindelse festet til nevnte hormon reseptor i komplekset og en andre forbindelse festet til den derivatiserende forbindelse, idet den andre forbindelse oppviser et aktivt eller funksjonelt sete slik at når komplekset bundet til hormonet bringes i kontakt med et substrat er komplekset i stand til å gi en observerbar endring av substratet, og bringer komplekset i kontakt med nevnte hormon for å feste komplekset .til hormonet via nevnte hormonreseptor og å bringe det resulterende kombinerte hormonkompleks i kontakt med substratet for å bevirke en oppserverbar endring i substratet for derved å belyse nærværet av hormonene i nevnte materiale.

13. Fremgangsmåte for detektering av et antistoff, karakterisert ved at den omfatter å bringe materiale inneholdende antistoffer i kontakt med et kompleks under betingelse som bringer komplekset i kontakt med antistoffer, idet komplekset omfatter et antigen for nevnte antistoff for festing til nevnte antistoff når de er i kontakt, en derivatiserende forbindelse festet til atigenet i komplekset og en andre forbindelse festet til den derivatiserende forbindelse idet den andre forbindelse oppviser et aktivt eller funksjonelt sete slik at når komplekset bundet til antistoffet bringes i kontakt med et substrat er komplekset i stand til å gi en oppserverbar endring i substratet, og bringe komplekset i kontakt med antistoffet for å feste komplekset til antistoffer via nevnte antigen og å bringe det resulterende kombinerte antistoffkompleks i kontakt med substratet for å bevirke en oppserverbar endring i subsratet for derved å belyse nærværet av antistoffet i materialet.

14 . Fremgangsmåte for detektering av et antigen, karakterisert ved at den omfatter og bringer et materialet inneholdende antigener i kontakt med et kompleks under betingelser som bringer komplekset omfattende antstoffer for antigenet for festing til antigenet når det er i kontakt, en derivatiserende forbindelse festet til antistoffet i komplekset og en andre forbindelse festet til den derivatiserende forbindelse idet den andre forbindelse tilveiebringer et aktivt eller funksjonelt sete slik at når komplekset,bundet til antigenet bringes i kontakt med substratet er komplekset i stand til å gi en oppserverbar endring i substratet, og bringe komplekset i kontakt med antigenet for å feste komplekset til antigenet via antistoffet og å bringe det resulterende kombinerte antigenkompleks i kontakt med substratet for å bevirke en oppserverbar endring i substratet for derved å belyse nærværet av antistoffet i materialet.