NO834468L

NO834468L - PROCEDURE FOR DETERMINING CEA AFTER SPECIAL TREATMENT

Info

Publication number: NO834468L
Application number: NO834468A
Authority: NO
Inventors: Nicholas A Giorgio; John Krupey; Leonard T Wilson
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1982-12-06
Filing date: 1983-12-05
Publication date: 1984-06-07
Also published as: EP0113072A3; ES527808A1; JPS59112264A; EP0113072A2; DK557483D0; DK557483A

Description

Bestemmelsen av carsinoembryonisk antigen (i det følgende kalt CEA) er velkjent for en fagmann på området. For en fagmann på området er det likeledes kjent at visse ikke-spesifike interfererende substanser som er til stede i prøven som skal undersøkes, i stor grad må fjernes eller nøytraliseres for at en nøyaktig ømfindtlig bestemmelse kan utføres. The determination of carcinoembryonic antigen (hereinafter referred to as CEA) is well known to a person skilled in the art. It is likewise known to a person skilled in the art that certain non-specific interfering substances which are present in the sample to be examined must be largely removed or neutralized in order for an accurate sensitive determination to be carried out.

Det er kjent en rekke fremgangsmåter ifølge hvilke mulige interfererende substanser som er til stede i prøven og den biologiske væske, f.eks. i serum- eller plasmaprøven, kan fjernes eller nøytraliseres før bestemmelsen av CEA. Det betyr åpenbart med hensyn til tid, omkostninger og enkel-het ved gjennomføring av undersøkelsen en fordel å for-enkle de nødvendige operasjoner for å fjerne slike interfererende substanser i en gitt undersøkelse. A number of methods are known according to which possible interfering substances are present in the sample and the biological fluid, e.g. in the serum or plasma sample, can be removed or neutralized before the determination of CEA. In terms of time, costs and simplicity when carrying out the examination, it is obviously an advantage to simplify the necessary operations to remove such interfering substances in a given examination.

Ved bestemmelsen av CEA ifølge Freedman et al., (US patent nr. 3.663.684) behandles blodprøven først med et glyko-proteinløsningsmiddel som CEA er løselig i, hvorpå den resulterende løsning klares. Eksempler på slike løsnings-midler omfatter perklorsyre, trikloreddiksyre, fosfor-wolframsyre og lignende. Behandlingen av blodprøven med glykoproteinløsningsmiddelet har til hensikt å fjerne de utfellbare normalproteiner og de interfererende antigen-materialer. Det utfelte, interfererende proteinmateriale fjernes derpå fra prøven ved sentrifugering. Fjerningen av syren skjer enten ved dialyse eller gelfiltrering. Begge disse metoder er tidkrevende, dyre og teknisk brysomme. •Antallet manipulasjonstrinn bidrar likeledes til unøyaktig-heten av undersøkelsen. In the determination of CEA according to Freedman et al., (US patent no. 3,663,684), the blood sample is first treated with a glycoprotein solvent in which CEA is soluble, after which the resulting solution is clarified. Examples of such solvents include perchloric acid, trichloroacetic acid, phosphorous-tungstic acid and the like. The treatment of the blood sample with the glycoprotein solvent is intended to remove the precipitable normal proteins and the interfering antigen materials. The precipitated, interfering protein material is then removed from the sample by centrifugation. The acid is removed either by dialysis or gel filtration. Both of these methods are time-consuming, expensive and technically difficult. •The number of manipulation steps also contributes to the inaccuracy of the survey.

Foreliggende oppfinnelse beskriver en fremgangsmåte ved forbehandling av en serum- eller plasmaprøve fra mennesker for etterfølgende behandling av CEA som er raskere, enklere og mindre komplisert enn de kjente preparative metoder. The present invention describes a method for pre-treatment of a serum or plasma sample from humans for subsequent treatment of CEA which is faster, simpler and less complicated than the known preparative methods.

i Som allerede nevnt beskriver foreliggende oppfinnelse en i As already mentioned, the present invention describes a

I IN

fremgangsmåte ved fremstilling av serum- eller plasma-prøver fra mennesker for etterfølgende bestemmelse av CEA, som er rask, bekvem og mindre komplisert enn de tidligere kjente metoder. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fortynning av prøven med en puffer til en svakt sur pH, blanding av prøven med en hydrofil kiselgel ved romtemperatur, henstand av blandingen i en kort tid og adskillelse av kiselgelen fra prøven. Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er også en forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av CEA, ved hvilken den her beskrevne forbehandling er omfattet. method for the preparation of serum or plasma samples from humans for the subsequent determination of CEA, which is fast, convenient and less complicated than the previously known methods. The method according to the present invention comprises diluting the sample with a buffer to a slightly acidic pH, mixing the sample with a hydrophilic silica gel at room temperature, allowing the mixture to stand for a short time and separating the silica gel from the sample. The object of the present invention is also an improved method for determining CEA, in which the pretreatment described here is included.

Den hydrofile kiselgel som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse erkarakterisert veden stor spesifik overflate og en relativt liten gjennomsnittlig primær partikkelstørrelse. Den spesifike overflaten av kiselgelen som anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er på omtrent 100 til ca. 400 m 2 pr. gram og fortrinnsvis ca. 130-380 m 2 pr. gram. Overflaten av kiselgelen bestemmes etter metoden til Brunauer et al. i J.A.C.S. 6_0, 309 (1958). Den gjennomsnittlige primære partikkelstørrelse av kiselgelen som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse er omtrent 7-15 nanometer (milli-mikron). The hydrophilic silica gel used in the method according to the present invention is characterized by a large specific surface area and a relatively small average primary particle size. The specific surface area of the silica gel used in the method according to the present invention is approximately 100 to approx. 400 m 2 per grams and preferably approx. 130-380 m 2 per gram. The surface of the silica gel is determined according to the method of Brunauer et al. in J.A.C.S. 6_0, 309 (1958). The average primary particle size of the silica gel used according to the present invention is approximately 7-15 nanometers (milli-microns).

Mengden av kiselgel som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse svinger fra 10-100 mg og fortrinnsvis fra 35-80 mg. The amount of silica gel used according to the present invention ranges from 10-100 mg and preferably from 35-80 mg.

Prøveforbehandlingsmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fortynning av prøven fra ca. 0,2 til ca. 0,5 ml plasma eller serum. The sample pretreatment method according to the present invention comprises dilution of the sample from approx. 0.2 to approx. 0.5 ml of plasma or serum.

Fortynning av undersøkelsesprøven med en sur puffer er nødvendig for å optimalisere bestemmelsens sensitivitet. Den således fortynnede prøve har en svakt sur pH, dvs. en pH på ca. 6-6,5 og fortrinnsvis på 6,3. Eksempler på puffere som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter vanlige sure puffere såsom f.eks. ammoniumacetat-, natrium-acetat-, natriumcitratpuffer og lignende. Det anvendes en tilstrekkelig mengde puffer til å garantere at prøvens pH er svakt sur, dvs. har en pH fra ca. 6-6,5. Dilution of the test sample with an acidic buffer is necessary to optimize the sensitivity of the determination. The thus diluted sample has a slightly acidic pH, i.e. a pH of approx. 6-6.5 and preferably 6.3. Examples of buffers that can be used according to the present invention include common acidic buffers such as e.g. ammonium acetate, sodium acetate, sodium citrate buffers and the like. A sufficient amount of buffer is used to guarantee that the sample's pH is slightly acidic, i.e. has a pH from approx. 6-6.5.

Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse unngår perklor-syreekstraksjon og behovet for dialyse for å rense prøven for perklorsyre. De betydelige tids- og omkostningsinn-sparinger som oppnås ved forbehandlingsmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse, gjør bestemmelsen av CEA i stor skala tilgjengelig, f.eks. for en masseforprøving. En fullstendig fremgangsmåte for bestemmelse av CEA under anvendelse av forbehandlingsmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres på ca. 4 timer. Dette betyr en vesentlig forbedring i forhold til CEA-bestemmelser i handelen, ved hvilke en dialyse må utføres natten over. The method according to the present invention avoids perchloric acid extraction and the need for dialysis to purify the sample of perchloric acid. The significant time and cost savings achieved by the pretreatment method according to the present invention make the determination of CEA available on a large scale, e.g. for a mass trial. A complete method for determining CEA using the pretreatment method according to the present invention can be carried out in approx. 4 hours. This means a significant improvement compared to CEA regulations in the trade, whereby a dialysis must be carried out overnight.

I prøven som forbehandles ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse utføres etterpå en egnet CEA-bestemmelse. Valget av den enkelte type immunologiske metode av CEA som skal anvendes, er ikke kritisk for prøveforbehand-lingen ifølge foreliggende oppfinnelse. I allminnelighet foretrekkes en radiologisk immunologisk fremgangsmåte eller en enzymatisk immunologisk fremgangsmåte, hvorunder imidlertid den radiologisk immunologiske fremgangsmåte er særlig foretrukket. In the sample which is pre-treated by the method according to the present invention, a suitable CEA determination is afterwards carried out. The choice of the individual type of immunological method of CEA to be used is not critical for the sample pretreatment according to the present invention. In general, a radiological immunological method or an enzymatic immunological method is preferred, under which, however, the radiological immunological method is particularly preferred.

I allminnelighet omfatter bestemmelsen av CEA ifølge foreliggende oppfinnelse de følgende trinn: a) Forbehandling av serum- eller plasmaprøve fra en pasient ifølge foreliggende oppfinnelse, for nøytralisering av In general, the determination of CEA according to the present invention comprises the following steps: a) Pretreatment of a serum or plasma sample from a patient according to the present invention, for neutralization of

mulige interfererende materialer,possible interfering materials,

b) Tilsetning av et overskudd av et CEA-antistoff til prøvene som skal undersøkes og inkubasjon i en forut b) Addition of an excess of a CEA antibody to the samples to be examined and incubation in a pre

bestemt tid,specific time,

c) Tilsetning av markert CEA til prøvene og inkubering i en forut bestemt tid, i c) Addition of labeled CEA to the samples and incubation for a predetermined time, i

d) Tilsetning av et insolubili.teringsmiddel til blandingen av b) og c) for å danne en fast fase som inneholder d) Addition of an insolubilizing agent to the mixture of b) and c) to form a solid phase containing

antistoff-bundet CEA og en flytende fase inneholdende ikke-bundet CEA,.antibody-bound CEA and a liquid phase containing unbound CEA.

e) Adskillelse av faste og flytende faser,e) Separation of solid and liquid phases,

f) Bestemmelse av mengde markeringsmiddel enten, i den faste eller i den flytende fase, og g) Bestemmelse av mengden CEA i prøven ved sammenligning med en standard. f) Determination of the amount of marker either in the solid or in the liquid phase, and g) Determination of the amount of CEA in the sample by comparison with a standard.

Ved den ovenfor nevnte bestemmelsesmetode anvendes begrepet "nøytralisering" av mulige interfererende substanser. Begrepet "nøytralisering" betyr både prøveforbehandlingen ifølge oppfinnelsen og de tidligere kjente metoder, ved hvilke disse interfererende materialer adskilles fysikalsk, da den ønskede effekt jo i begge tilfeller er den samme. In the above-mentioned determination method, the term "neutralization" of possible interfering substances is used. The term "neutralization" means both the sample pretreatment according to the invention and the previously known methods, by which these interfering materials are physically separated, as the desired effect is the same in both cases.

I prinsippet betyr altså begrepet "nøytralisering" at de interfererende materialer fjernes. In principle, therefore, the term "neutralization" means that the interfering materials are removed.

Som tidligere nevnt kan markeringsmiddelet som anvendesAs previously mentioned, the marker used can

for markering av CEA i den foran nevnte bestemmelse være ethvert immunologisk fordragelig markeringsmiddel som tillater en kvantitativ bestemmelse, såsom f.eks. en radioisotop, et enzym, en fluorescens eller en kemiluminescens eller lignende. Enzym- og radioisotopmarkeringsmiddelet foretrekkes, hvorunder de sistnevnte er spesielt foretrukket. Blant radioisotoper som kan anvendes ved vanlige radiologisk immunologiske metoder er -isotoper av jod foretrukket, spesielt jod-125 er særlig foretrukket. for marking CEA in the above-mentioned determination, any immunologically tolerable marker that allows a quantitative determination, such as e.g. a radioisotope, an enzyme, a fluorescence or a chemiluminescence or the like. The enzyme and radioisotope marker are preferred, with the latter being particularly preferred. Among radioisotopes that can be used in normal radiological immunological methods, -isotopes of iodine are preferred, especially iodine-125 is particularly preferred.

Insolubiliseringsmiddelet som anvendes for å danne en første fase inneholdende antigen-bundet CEA og en flytende fase inneholdende ikke-bundet CEA kan være ethvert materiale som er kjent for dette formål. Således kan f.eks. visse alifatiske alkoholer, ionebytterharpikser og uorganiske salter samt også antistoffer som er rettet mot CEA-anti!- j stoffene bevirke dannelse av en proteinfelling som inneholder antigen-bundet CEA. Et foretrukket insolubiliseringsmiddel er et andre antistoff, dvs. et antistoff som The insolubilizing agent used to form a first phase containing antigen-bound CEA and a liquid phase containing unbound CEA can be any material known for this purpose. Thus, e.g. certain aliphatic alcohols, ion exchange resins and inorganic salts as well as antibodies directed against the CEA antibodies cause the formation of a protein precipitate containing antigen-bound CEA. A preferred insolubilizing agent is a second antibody, i.e. an antibody which

er rettet mot CEA-antistoffet i immobilisert form, dvs.is directed against the CEA antibody in immobilized form, i.e.

1 insolubilisert form.1 insolubilized form.

Med hensyn til den foran nevnte immobilisering av det andre antistoff kan enhver kjent teknikk anvendes for å immobilisere en immunologisk komponent såsom f.eks. partikler av forskjellig størrelse, småkuler, staver eller strimler av et bæremateriale. Såfremt en polymer anvendes som insolubiliseringsmiddel, f.eks. en styren-polymer eller kopolymer, kan - avhengig av polymerens individuelle egenskaper - mer enn en av de ovenfor an-vendte former anvendes. Et spesielt foretrukket materiale for immobilisering av det andre antistoffet er ikke-sintret With regard to the aforementioned immobilization of the second antibody, any known technique can be used to immobilize an immunological component such as e.g. particles of different sizes, small balls, rods or strips of a carrier material. If a polymer is used as insolubilizing agent, e.g. a styrene polymer or copolymer, depending on the polymer's individual properties, more than one of the forms used above can be used. A particularly preferred material for immobilizing the second antibody is non-sintered

poly(vinylidenfluorid), som f.eks. kan anvendes i form av fine partikler eller som film. Antistoffet kan være bundet til det immobiliserende materiale eller være kjemisk bundet til dette ved konvensjonelle metoder. poly(vinylidene fluoride), such as e.g. can be used in the form of fine particles or as a film. The antibody can be bound to the immobilizing material or be chemically bound to this by conventional methods.

De spesielle forhold, inkubasjonstider og temperaturer som man må ta hensyn til for en bestemt CEA-bestemmelse må anses som velkjente med tanke på de tallrike publikasjoner vedrørende CEA. Foretrukne inkubasjonstider for reaksjonen av antiserum og den etterfølgende reaksjonen med det markerte CEA er fra ca. 1 time til 2,5 timer, hvorunder 2 timer foretrekkes spesielt. Disse inkubasjoner utføres ved en temperatur på ca. 45°C. Hvis en enzym-markering anvendes, kan tilpasningen av inkubasjonstiden og spesielt temperaturen være nødvendig for å unngå en deaktivering med et enzym når enzymet er labilt ved de foran angitte temperaturer. Dersom et immobilisert andre antistoff anvendes som insolubiliseringsmiddel, inkuberes prøvene fortrinnsvis ved omgivelsestemperatur i ca. 10-30 minutter, fortrinnsvis i ca. 15 minutter. Bestemmelsen av CEA i prøven utføres ved en sammeligning méd en standardkurve på vanlig måte. Avlesningen av konsentrasjonen på markeringsmiddel utføres avhengig av typen markeringsmiddel likeledes etter vanlige metoder, f.eks. under anvendelse av et gamma-scintillasjons-spektrometer når det anvendes et radionuclid-markeringsmiddel. The special conditions, incubation times and temperatures that must be taken into account for a particular CEA determination must be considered well known in view of the numerous publications concerning CEA. Preferred incubation times for the reaction of antiserum and the subsequent reaction with the marked CEA are from approx. 1 hour to 2.5 hours, of which 2 hours is particularly preferred. These incubations are carried out at a temperature of approx. 45°C. If an enzyme label is used, the adaptation of the incubation time and especially the temperature may be necessary to avoid a deactivation with an enzyme when the enzyme is labile at the temperatures indicated above. If an immobilized second antibody is used as an insolubilizing agent, the samples are preferably incubated at ambient temperature for approx. 10-30 minutes, preferably for approx. 15 minutes. The determination of CEA in the sample is carried out by a comparison with a standard curve in the usual way. The reading of the concentration of marker is carried out depending on the type of marker and also according to usual methods, e.g. using a gamma scintillation spectrometer when a radionuclide tracer is used.

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen videre. Såfremt ikke annet er angitt, er alle temperaturer i °C. The following examples further illustrate the invention. Unless otherwise stated, all temperatures are in °C.

Eksempel 1 Example 1

Den kommersielle bestemmelse av CEA utføres som følger: Plasmaprøver (0,5 ml; in duplo) fra pasienter med mistanke om tykktarmscarsinom ekstraheres med 2,5 ml kald 1,2 molar perklorsyre ved blanding i en mikser av Vortex-typen i 30 sekunder og sentrifugeres så i 20 minutter ved 1000 x g. Supernantantene samles og bringes i en dialyseslange og dialyseres mot ionefritt vann, hvorunder vannet skiftes tre ganger og man venter minst 3 timer mellom hvert skifte. Det utføres en sluttdialyse under anvendelse av en ammoniumacetatpuffer med pH ca. 6,5. Etter dialysen bringes innholdet fra dialyseslangene i prøverør, hvorpå 25 ul CEA-antiserum handelsvare tilsettes under blanding med en Vortex-mikser. Rørene inkuberes i 30 minutter ved 45°C. Til hvert rør settes under blanding 25 ul "'"^J-CEA, hvorpå rørene igjen inkuberes 30 minutter ved 45°C. Det tilsettes 2,5 ml zirconylfosfatgel (pH 6,25) til hvert rør, .hvorpå man sentrifugerer i 5 minutter ved 1000 x g. Etter fjerning av supernantantene settes 5 ml ammonium-acetatpuf fer med pH 6,25 til hvert rør. Rørene sentrifugeres på nytt som ovenfor beskrevet og supernantantene The commercial determination of CEA is performed as follows: Plasma samples (0.5 ml; in duplicate) from patients with suspected colon carcinoma are extracted with 2.5 ml of cold 1.2 molar perchloric acid by mixing in a Vortex-type mixer for 30 seconds and then centrifuged for 20 minutes at 1000 x g. The supernatants are collected and brought into a dialysis tube and dialyzed against deionized water, during which the water is changed three times and you wait at least 3 hours between each change. A final dialysis is carried out using an ammonium acetate buffer with a pH of approx. 6.5. After the dialysis, the contents from the dialysis tubes are brought into test tubes, after which 25 ul CEA antiserum commercial product is added while mixing with a Vortex mixer. The tubes are incubated for 30 minutes at 45°C. 25 ul "'"^J-CEA is added to each tube while mixing, after which the tubes are again incubated for 30 minutes at 45°C. 2.5 ml of zirconyl phosphate gel (pH 6.25) is added to each tube, after which it is centrifuged for 5 minutes at 1000 x g. After removing the supernatants, 5 ml of ammonium acetate buffer with pH 6.25 is added to each tube. The tubes are centrifuged again as described above and the supernatants

125 125

fjernes. Andelen av bundet J-CEA i gjenværende gel bestemmes ved telling i et gamma-scintillasjons-spektrometer i 1 minutt. is removed. The proportion of bound J-CEA in the remaining gel is determined by counting in a gamma scintillation spectrometer for 1 minute.

En standard inhiberingskurve oppstilles som følger:A standard inhibition curve is drawn up as follows:

Til par av prøverør settes 5,0 ml av en 1:10 fortynningAdd 5.0 ml of a 1:10 dilution to pairs of test tubes

av EDTA-puffer (pH 6,5) med ionefritt vann. I hvert rør settes en CEA-standard-dose, dvs. 0, 10, 25, 50 og 100 ul tilsvarende 0, 2,5, 6,25, 12,5 og 25 mg/ml CEA-aktivitet, og rørinnholdene blandes med en mikser av Vortex-typen. Rørene behandles så som overfor angitt med antiserum for of EDTA buffer (pH 6.5) with deionized water. A CEA standard dose is placed in each tube, i.e. 0, 10, 25, 50 and 100 ul corresponding to 0, 2.5, 6.25, 12.5 and 25 mg/ml CEA activity, and the tube contents are mixed with a Vortex type mixer. The tubes are treated as indicated above with antiserum for

125 125

CEA og J-CEA. Man avleser og oppstiller en kurve som tjener til sammenligning med resultatene som fås fra pasientplasma. CEA and J-CEA. One reads and sets up a curve that serves for comparison with the results obtained from patient plasma.

I IN

Eksempel 2Example 2

En bestemmelse av CEA under anvendelse av den forbehandlede prøve ifølge foreliggende oppfinnelse utføres som følger: Plasmaprøver (0,5 ml) fortynnes med 2,9 ml av en 5,2 mM ammoniumacetatpuffer (pH 4) og blandes med en mikser av Vortex-typen. Etter tilsetning av 1,7 ml av en 5%-ig vandig suspensjon av kiselgel (med en overflate på ca. 380 m 2/g og en gjennomsnittlig primær partikkelstørrelse på ca. 7 nm) blandes grundig inntil prøven er homogen. Prøven inkuberes ved omgivelsestemperatur i ca. 10 minutter. A determination of CEA using the pretreated sample according to the present invention is performed as follows: Plasma samples (0.5 ml) are diluted with 2.9 ml of a 5.2 mM ammonium acetate buffer (pH 4) and mixed with a Vortex-type mixer . After adding 1.7 ml of a 5% aqueous suspension of silica gel (with a surface area of approx. 380 m 2 /g and an average primary particle size of approx. 7 nm) mix thoroughly until the sample is homogeneous. The sample is incubated at ambient temperature for approx. 10 minutes.

Prøven sentrifugeres i 10 minutter ved 1000 x g og supernantanten dekanteres i et annet rør. Til hver rør settes under blanding med en mikser av Vortex-typen 25 ul kommer-sielt CEA-antiserum. Rørene inkuberes i ca. 1 time ved 45°C. Under blanding tilsettes hvert rør 25 pl<12>5J-CEA, hvorpå man inkuberer ca. 1,5 timer ved 45°C. Til hvert rør settes 1 ml av en vandig suspensjon av et antistoff mot CEA-antiserum, hvilket ble insolubilisert ved adsorpsjon på partikler av poly(vinylidenfluorid). Rørene blandes på nytt og inkuberes i ca. 15 minutter ved romtemperatur. Prøvene sentrifugeres så i 10 minutter ved 1000 x g. Supernantanten dekanteres, hvorpå radioaktiviteten i The sample is centrifuged for 10 minutes at 1000 x g and the supernatant is decanted into another tube. 25 ul of commercial CEA antiserum is added to each tube while mixing with a Vortex-type mixer. The tubes are incubated for approx. 1 hour at 45°C. During mixing, 25 µl<12>5J-CEA is added to each tube, after which one incubates approx. 1.5 hours at 45°C. To each tube is added 1 ml of an aqueous suspension of an antibody against CEA antiserum, which was insolubilized by adsorption on particles of poly(vinylidene fluoride). The tubes are mixed again and incubated for approx. 15 minutes at room temperature. The samples are then centrifuged for 10 minutes at 1000 x g. The supernatant is decanted, after which the radioactivity in

resten i røret bestemmes i et gamma-scintillasjons-spektrometer. the remainder in the tube is determined in a gamma scintillation spectrometer.

En standardinhiberingskurve fremstilles som følger:A standard inhibition curve is prepared as follows:

Til par av prøverør settes 0,5 ml menneskelig plasma inneholdende 1 ng/ml CEA. Til hvert rør settes en CEA-standard-dose, dvs. 0, 10, 25, 50 og 100 ul tilsvarende 0, 2,5, Add 0.5 ml of human plasma containing 1 ng/ml CEA to pairs of test tubes. A CEA standard dose is added to each tube, i.e. 0, 10, 25, 50 and 100 ul corresponding to 0, 2.5,

6,25, 12,5 og 25 ng/ml CEA-aktivitet, hvorpå man blander med en mikser av Vortextypen. Rørene behandles som ovenfor angitt med ammoniumacetatpuffer, kiselgel, antiserum mot 6.25, 12.5 and 25 ng/ml CEA activity, after which mixing is done with a Vortex-type mixer. The tubes are treated as indicated above with ammonium acetate buffer, silica gel, antiserum against

125 125

CEA, J-CEA og insolubilisert andre antistoff. Etter avlesning oppstilles en kurve som tjener til sammenligning av resultatene som erholdtes med plasmaprøver fra pasientene. CEA, J-CEA and insolubilized second antibody. After reading, a curve is drawn up which serves to compare the results obtained with plasma samples from the patients.

i in

I tabell I sammenlignes resultatene for delprøver som erholdtes ifølge den vanlige dialysemetode ifølge eksempel 1 med de resultater som erholdtes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ifølge eksempel 2. In table I, the results for partial samples obtained according to the usual dialysis method according to example 1 are compared with the results obtained by the method according to the invention according to example 2.

Eksempel 3 Example 3

En bestemmelse av CEA utføres ifølge foreliggende oppfinnelse som følger: En plasmaprøve (0,2 ml) bringes i et 13 x 100 ml glassrør. Til denne prøve settes 2,3 ml av en 1,85%-ig (g/V) suspen sjon av kiselgel (overflate ca. 380 m 2 /g og gjennomsnittlig primær partikkeldiameter ca. 7 nm) i 3,3 mM ammonium-acetatpuf fer med pH 4. Prøven blandes grundig til den er homogen. Prøven inkuberes ved omgivelsestemperatur i ca. A determination of CEA is carried out according to the present invention as follows: A plasma sample (0.2 ml) is placed in a 13 x 100 ml glass tube. To this sample, add 2.3 ml of a 1.85% (w/V) suspension of silica gel (surface area approx. 380 m 2 /g and average primary particle diameter approx. 7 nm) in 3.3 mM ammonium acetate buffer with pH 4. The sample is thoroughly mixed until it is homogeneous. The sample is incubated at ambient temperature for approx.

15 minutter. Prøven sentrifugeres- i 5 minutter ved 1000 x g og supernantanten dekanteres i et annet rør. Til hver prøve settes under blanding med en mikser av Vortex-typen 25 ul geite-anti-CEA-antiserum. Rørene inkuberes i 1 time ved 45°C. Til hvert rør settes under blanding 25 pl 125 15 minutes. The sample is centrifuged for 5 minutes at 1000 x g and the supernatant is decanted into another tube. Add 25 ul of goat anti-CEA antiserum to each sample while mixing with a Vortex-type mixer. The tubes are incubated for 1 hour at 45°C. Add 25 ml 125 to each tube while mixing

J-CEA hvorpå rørene på nytt inkuberes i ca. 1,5 timer ved 45°C. Til hvert rør settes 0,6 ml av en vandig suspensjon av et antistoff mot CEA-antiserum, som ble insolubilisert ved adsorpsjon på partikler av poly(vinyliden-fluorid). Rørene blandes på nytt og inkuberes 15 minutter ved romtemperatur. Prøvene sentrifugeres på nytt. i 10 minutter ved 1000 x g. Supernantantene dekanteres og resten i røret måles i et gamma-scintillasjons-spektrometer. J-CEA, after which the tubes are again incubated for approx. 1.5 hours at 45°C. To each tube is added 0.6 ml of an aqueous suspension of an antibody against CEA antiserum, which was insolubilized by adsorption on particles of poly(vinylidene fluoride). The tubes are mixed again and incubated for 15 minutes at room temperature. The samples are centrifuged again. for 10 minutes at 1000 x g. The supernatants are decanted and the residue in the tube is measured in a gamma scintillation spectrometer.

En standardinhiberingskurve erholdes som følger:A standard inhibition curve is obtained as follows:

Til par av prøverør settes 0,2 ml plasma fra mennesker inneholdende mindre enn 1 ng/ml CEA. Til hvert par rør settes en CEA-standard-dose, dvs. 0, 10, 25, 50 og 100 pl tilsvarende 0, 2,5, 6,25, 12,5 og 25 ng/ml CEA-aktivitet, hvorpå rørinnholdene blandes med en mikser av Vortex-typen. Rørene behandles som ovenfor beskrevet med anti-12 5 Add 0.2 ml of human plasma containing less than 1 ng/ml CEA to pairs of test tubes. A CEA standard dose is added to each pair of tubes, i.e. 0, 10, 25, 50 and 100 µl corresponding to 0, 2.5, 6.25, 12.5 and 25 ng/ml CEA activity, after which the tube contents are mixed with a Vortex-type mixer. The tubes are treated as described above with anti-12 5

serum mot CEA, J-CEA og insolubilisert andre antistoff. Etter avlesning av resultatene oppstilles en kurve som tjener til sammenligning av resultatene som erholdtes med plasmaprøver fra pasienter. serum against CEA, J-CEA and insolubilized other antibody. After reading the results, a curve is drawn up which serves to compare the results obtained with plasma samples from patients.

I tabell II sammenlignes resultatene for prøvene ifølge vanlig dialysemetode ifølge eksempel 1 og de som oppnås ifølge fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse ifølge eksempel 3. Table II compares the results for the samples according to the usual dialysis method according to example 1 and those obtained according to the method in the present invention according to example 3.

Claims

1. Procedure for determining concentrations of carcinoembryonic antigen in a serum or plasma sample from humans, characterized in that it comprises the following steps: a) Addition of sufficient buffer to buffer the sample to a pH of approx. 6 to 6.5, b) Incubation of the sample in the presence of a hydrophilic silica gel to neutralize the materials in this sample that could interfere with the determination, e) Separation of the silica gel from the sample, d) Addition of an excess antibody against CEA to the sample and incubation for a predetermined time, e) Adding an amount of carcinoembryonic antigen, which is equipped with a label that can be determined quantitatively, which is sufficient to react with the amount of antibody that was added in step d) and incubation for a predetermined time, f) Addition of insolubilizing agent to the sample to form a solid phase containing antibody-bound CEA and a liquid phase containing unbound CEA, g) Separation of the solid and liquid phases, h) Determination of the amount of marking substance either in the solid or in the liquid phase, and i) Determination of the amount of carcinoembryonic antigen in the sample by comparison with a standard. in

2. Method according to claim 1, characterized in that the hydrophilic silica gel has a surface of approx.

130-380 m 2/g and an average primary particle size of approx. 7-16 nm.

3. Method according to claim 2, characterized in that the hydrophilic silica gel has a surface of approx.

380 m 2/g and an average primary particle size of approx. 7 nm.

4. Method according to claim 1, characterized in that an ammonium acetate buffer is used as acidic buffer.

5. Method according to claim 1, characterized in that the sample is buffered to approx. pH 6.3.

6. Method according to claim 1, characterized in that in step d) an antibody is used as insolubilizing agent, whereby this antibody is present in insolubilized form.

7. Method according to claim 1, characterized in that the marking substance is a radioisotope.

8. Method according to claim 7, characterized in that the radioisotope is a radioisotope of iodine.

9. Method according to claim 8, characterized in that the radioisotope of iodine is iodine-125.

10. Method according to claim 1, characterized in that an enzyme is used as a marking substance.

11. Method according to claim 1, characterized in that a fluorinating agent is used as marking substance.

12. Method according to claim 1, characterized in that a chemiluminescent agent is used as marking substance.