NO832098L

NO832098L - Nonapeptid- og decapeptidanaloger av lhrh og fremgangsmaate for deres fremstilling

Info

Publication number: NO832098L
Application number: NO832098A
Authority: NO
Inventors: John J Nestor; Brian H Vickery
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1982-06-10
Filing date: 1983-06-09
Publication date: 1983-12-12
Also published as: EP0097031A2; EP0097031A3; DK171483B1; DE3378053D1; JPS5962556A; EP0097031B1; AU7941887A; IE55164B1; KR910002550B1; DK264683D0; FI832053A0; JPH0610184B2; ES523128A0; IL68938A0; ES8603194A1; NO834404L; AU569036B2; AU613878B2; FI832053L; AU1567483A

Description

Luteinjiseringshormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH) utskilles fra hypofyseforlappen under kontroll av sekresjonshormonet LHRH fremstilt i hypotalamusområdet.

LH og FSH virker på kjønnskjertlene ved å stimulere syntesen av stereoidhormoner og å stimulere kjønnscelleutvikling.

Den pulserende utskillelse av LHRH og derved utskillelsen

av LH og FSH, kontrollerer reproduksjonscyklusen hos husdyr og mennesker.

LHRH påvirker også morkaken, og kjønnskjertlene indirekte, for å forårsake utskillelsen av choriongonadotropin (hCG).

Antagonister til LHRH er nyttige til kontroll av fruktbarhet. Slike antagonister blokkerer eggløsningen hos hunnen og undertrykker dannelsen av sædceller hos hannen. Forbundet med disse virkningene er en undertrykkelse av normale nivåer for seksualsteroider av kjønnskjertelopprinnelse i blodomløpet, inkludert reduksjon i vekst av medvirkende organer hos hannen og hunnen. Hos husdyr fremmer denne virkningen vektøkning i forhold til formengde, stimulerer abort hos drektige dyr og virker vanligvis som et kjemisk steriliseringsmiddel.

Det naturlige hormonutskillende hormonet LHRH er et dekapeptid som omfatter naturlig forekommende aminosyrer

(som har L-konfigurasjonen med unntak av den achirale aminosyren glycin). Det har følgende aminosyresekvens:

Mange analoger til dette naturlige stoffet er blitt under-søkt og de aller fleste av disse har vist seg å ha util-strekkelig biologisk aktivitet til å være klinisk nyttige. Visse utvalgte modifikasjoner har vist seg å ha en agonist-virkning på biologisk aktivitet. Den aller mest betydnings-fulle forbedring fåes ved å endre resten i 6-stillingen fra

Viktig informasjon

Av arkivmessige grunner har Patentstyret for denne allment tilgjengelige patentsøknad kun tilgjengelig dokumenter som inneholder håndskrevne anmerkninger, kommentarer eller overstrykninger, eller som kan være stemplet "Utgår" eller lignende. Vi har derfor måtte benytte disse dokumentene til skanning for å lage en elektronisk utgave.

Håndskrevne anmerkninger eller kommentarer har vært en del av saksbehandlingen, og skal ikke benyttes til å tolke innholdet i dokumentet.

Overstrykninger og stemplinger med "Utgår" e.l. indikerer at det under saksbehandlingen er kommet inn nyere dokumenter til erstatning for det tidligere dokumentet. Slik overstrykning eller stempling må ikke forstås slik at den aktuelle delen av dokumentet ikke gjelder.

Vennligst se bort fra håndskrevne anmerkninger, kommentarer eller overstrykninger, samt eventuelle stemplinger med "Utgår" e.l. som har samme betydning.

Gly til en D-aminosyre.

I tillegg til agonister, er det blitt fremstilt analoger som er konkurrerende antagonister til LHRH, idet alle disse krever utelatelse eller erstatning av histidinresten i stilling 2, Vale, W., et al, Science, 176: 933 (1972).

Det synes vanligvis som om en D-aminosyre plasert i den stillingen i sekvensen gir den beste aktivitet, Rees, R.W.A., et al, J. Med. Chem. 17: 1016 (1974).

Det er også blitt vist at tilføyelse av en modifikasjon i 6-stillingen, som uten modifikasjonen i 2-stilling, resulterer i den ovenfor nevnte agonistaktivitet, øker antagonistaktiviteten til de 2-modifiserte analogene, Beattie, C.W.,

et al, J. Med. Chem., 18: 1247 (1975); Rivier, J., et al, Peptides 1976 p 427, Editions de l'Universite de Bruxelles, Belgium (1976) .

I tillegg til grunnlaget i disse to hovedforandringene, som resulterer i en virksom serie LHRH-antagonister, kan ytterligere økninger i antagonistaktivitet fåes ved å modifisere stillingene 1, 3 og/eller 10 i det allerede 2, 6 modifiserte peptidet. Coy, D.H., et al Peptides 1976, p. 462, Editions de l'Universite de Bruxelles, Belgium (1976); Rivier, J.E., et al, Life Sei. 23: 869 (1978); Dutta, A.S., et al, Biochem Biophys. Res. Commun. 81: 382 (1978), Humphries, J., et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 85: 709 (1978). Det er

også påvist at N-acylering av aminosyre i stilling 1 er nyttig, Channabasavaia, K., et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 81: 382 ( 1978) ; Coy, D. H., et al, Peptides. - Structure and Biological Function p. 775, Pierce Chemical Co. (1979). Dertil er (N-Ac-D-p-Cl-Phe<1>, D-p-Cl-Phe<2>, D-Trp<3>, D-Arg<6>, D-Ala<10>)LHRH blitt publisert av D.H.Coy, Endocrinology, 110, 1445 (1982). I et annet tilfelle er D-Ala 4 modifikasjon til LHRH blitt rapportert å opprettholde antagonistaktivitet. Se E. Pedroza, J.A. Martinez, D.H. Coy, A.Arimura and A.V. Schally; Int. J.Fert.; 23, 294 (1978).

Ettersom antagonister virker ved å konkurrere med LHRH om

de passende reseptorer, kreves det store mengder av disse forbindelsene for å stenge ute det naturlige peptidet. På grunn av dette er det særlig ønskelig å oppnå antagonister med en svært høy styrkegrad og forlenget aktivitet. Mulig-heten for å bli frigjort sakte fra depotpreparater vil også være riktig. Den for tiden kjente rekken av analoger krever forholdsvis høye nivåer av forbindelsen, med de medfølgende problemene med øket mulighet for toksisitet og andre bivirk-ninger.

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye, svært sterke nona-peptider og dekapeptidanaloger til LHRHhvor en utskifting i stilling 2, (og derved omdannelse av peptidet til anta-gonistseriene) gjøres mere effektiv ved utskifting av glycinresten i stilling 6 ved en ny guanido-substituert amidin eller tertiær eller kvaternær amin, vannoppløselig aminosyre-rest som ikke forekommer i naturen. Ytterligere forøkninger ved substitusjoner il, 2, 3, 4, 7 og/eller 10 stillingene åpenbares også. Oppfinnelsen er også rettet mot forskjellige fremgangsmåter for bruk av disse forbindelser og mot farma-søytiske preparater for dette. Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen omfatter fremgangsmåter for fremstillingen av de nye forbindelsene beskrevet ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye nonapeptid- og dekapeptidanaloger av LHRH som har formelen

og farmasøytisk akseptable salter derav, hvor:

A er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-pyroglutamyl, D-pyroglutamyl,

N-acyl-DL-tryptofanyl, N-acyl-glycyl,

N-Ac-D,L-^ 3 ' 4-prolyl, N-Ac-D,L-prolyl,

N-Ac-L-alkylprolyl, N-Ac-D,L-fenylalanyl,

N-Ac-D,L-p-klorfenylalanyl, N-Ac-D,L-seryl,

N-Ac-D,L-treonyl, N-Ac-D,L-alanyl,

3-(1-naftyl)-D,L-alanyl, 3-(2-naftyl)-D,L-alanyl, 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D,L-alanyl,

3-(4-trifluormetylfenyl)-D,L-alanyl,

3-(9-antryl)-D,L-alanyl,

3-(2-fluorenyl)-D,L-alanyl og

3-(Het)-D,L-alanyl hvor Het er en heterocyklisk arylgruppe som inneholder et radikal valgt fra

hvor A" og A' uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, lavere alkyl, klor og brom, og G

er valgt fra gruppen bestående av oksygen, nitrogen og svovel,

B er en aminoacylrest fra gruppen bestående av D-fenylalanyl, D-p-Cl-fenylalanyl, D-p-F-fenylalanyl, D-p-nitrofenylalanyl, 3-(3,4,5-trimetoksyfenyl)-D-alanyl, 2,2-difenylglycin, D-a-metyl-p-Cl-fenylalanin og 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl,

C er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-tryptofanyl, D-tryptofanyl, D-fenylalanyl, D-Me^fenylalanyl, 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-naftyl)-D-alanyl, 3-(2-naftyl)-D-alanyl, 3-(2-pyridyl)-D-alanyl og 3-(4-pyridyl)-D-alanyl.

D er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-seryl og D-alanyl,

E er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-fenylalanyl og L-tyrosyl,

F er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av radikalene med de følgende strukturformler:

a)

hvor

n er 1 til 5,

er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, -NRR^

hvor R er hydrogen eller alkyl med 1 til 4 karbonatomer, R^er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, cykloalkyl, fenyl, benzyl, -(CH_) -morfolino eller

Zn

- (CH.J N(R.)„ hvor n er 1 til 5 og R. er laverealkyl

Zn 4Z4

R2er hydrogen eller R^/eller R^ og omfatter en ring med de følgende strukturformler:

hvor n er 1 til 7, A er hydrogen, alkyl med 1 til 6 karbonatomer eller cykloalkyl, og X er halogen eller A eller b)

hvor Rj. er alkyl med 1 til 6 karbonatomer, benzyl, fenyletyl,

cykloheksyl, cyklopentyl, og

Rg, R^og Rg er hydrogen eller alkyl med 1 til 4 karbonatomer, og n er det hele tallet 2-5, eller

c) en substituent med formelen

hvor Rg er hydrogen, alkyl med 1 til 12 karbonatomer, fenyl

eller fenyllaverealkyl,

G er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-leucyl, L-norleucyl og L-norvalyl,

H er D-alaninamid, D-leucinamid, glycinamid eller -NHRj- hvor R5er laverealkyl, cykloalkyl, fluorlaverealkyl eller NHCONH-R^0hvor R^Qer hydrogen eller laverealkyl, og

de farmasøytisk akseptable saltene derav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter nye nonapeptid- og dekapeptidanaloger av LHRH som har formelen

og de farmasøytisk akseptable saltene derav, hvor:

A er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av N-Ac-D,L-/^ 3 ' 4-prolyl, N-ac-D,L-proiyl,

N-Ac-L-alkylprolyl, N-Ac-D,L-fenylalanyl,

N-Ac-D,L-p-klorfenylalanyl, N-Ac-D,L-seryl, N-Ac-D,L-treonyl, N-Ac-D,L-alanyl,

3-(1-nafty1)-D,L-alanyl, 3-(2-naftyl)-D,L-alanyl, 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D,L-alanyl og

3-(4-trifluormetylfenyl)-D,L-alanyl,

B er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av D-fenylalanyl, D-p-Cl-fenylalanyl, D-p-F-fenylalanyl, D-p-nitrofenylalanyl, 3-(3,4,5-trimetoksyfenyl)-D-alanyl, 2,2-difenylglycin, D-a-metyl-p-Cl-fenylalanin og 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl,

C er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av D-tryptofanyl, D-fenylalanyl, D-Me^fenylalanyl, 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-naftyl)-D-alanyl, og 3-(2-naftyl)-D-alanyl,

D er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-seryl og D-alanyl,

F er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av radikalene med de følgende strukturformlene:

a)

hvor

n er 1 til 5,

er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, -NHR^hvor

R^er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, cykloalkyl, fenyl, benzyl, morfolino eller -(CH2)nN (R^ )2 hvor n er 1 til 5 og R^er laverealkyl,

R2er hydrogen eller R^, eller og R2omfatter en ring med de følgende generelle formlene:

hvor n er 1 til 7, A er hydrogen, alkyl med 1 til 6 karbonatomer eller cykloalkyl, og X er halogen eller A, eller b)

hvor Rj- er alkyl med 1 til 6 karbonatomer, benzyl, fenyletyl,

cykloheksyl, cyklopentyl,

og Rg, R^og Rg er hydrogen eller metyl, og n er det hele tallet 2-5, eller

c) en substituent med formelen

hvor Rg er hydrogen, alkyl med 1 til 12 karbonatomer,

fenyl eller fenyllaverealkyl,

H er D-alaninamid, D-leucinamid, glycinamid eller -NHR,., hvor R,- er laverealkyl eller NHCONH2, og

de farmasøytisk akseptable saltene derav.

Utskiftingen av L-histidylresten som er stilling 2 i LHRH med en av de her spesiefiserte restene er en nødvendighet for å omdanne peptidet til LHRH antagonist. Utskiftingen av glycylresten i stilling 6 i LHRH med en av restene som er spesifisert som F, gir en dramatiskøkning av antagonistvirkningen. De her åpenbarte substitusjonene i stillingene 1, 2, 3, 4, 7 og 10 er ytterligere ganglige for å øke antagonistaktiviteten.

Forkortelser og definisjoner

Som angitt ovenfor og av bekvemmelighetshensyn ved beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse, brukes de vanlige for-kortelsene for de forskjellige vanlige aminosyrene slik som generelt akseptert innen peptidteknikken og anbefalt av the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 11,1726 (1972). Disse angir L-aminosyrer,

med unntak av den achirale aminosyren glycin, og videre med unntak av enhver unaturlig eller naturlig aminosyre som er achiral, eller på annen måte er betegnet som D-, og de aminosyrene som her er substituert inn i stillingene 1, 2,

3, 4, 6, 7 og 10 i stedet for de som vanligvis finnes i LHRH. Alle peptidsekvensene som her er nevnt er skrevet i henhold til den vanlig aksepterte konvensjon, hvorved N-ende aminosyren er til venstre og C-ende aminosyren er til høyre.

Visse andre forkortelser vil være nyttige ved beskrivelsen av oppfinnelsen. Foreliggende op<p>finnelse anvender utskifting med aminosyrer som ikke opptrer i naturen. De som særlig er vanlig brukt blant disse, er de følgende:

Som en ytterligere forenkling, ettersom aminosyrefrekvensen til LHRH er påvist å være

er nona- og dekape<p>tider hvor aminosyrerestene på bestemte steder i sekvensen er blitt byttet ut med andre aminosyre-rester eller andre rester, forkortet ved å vise typen av substitusjonen, med lokaliseringen skrevet under , etterfulgt av LHRH som opphavet.

Således er f.eks. sekvensen

hvor Gly i stilling 6 er blitt erstattet med D-Dih og His i stilling 2 er blitt erstattet med D-p-F-Phe, angitt

2 6

som [D-p-F-Phe , D-Dih ]LHRH, og sekvensen

er angitt som:

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "farmasøytisk akseptable salter" til salter som opprettholder denønskede biologiske aktivitet hos opphavsforbindelsen og ikke gir noen uønskede toksikologiske virkninger. Eksempler på

slike salter er (a) syreaddisjonssalter dannet med uorganiske syrer, f.eks. saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre og lignende, og salter dannet med organiske syrer slik som f.eks. eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, rav-syre, maleinsyre, fumarsyre, glukonsyre, sitronsyre, eplesyre, askorbinsyre, benzosyre, garvesyre, embonsyre, alginsyre, polyglutaminsyre, naftalensulfonsyrer, naftalen-disulfonsyrer, og polygalakturonsyre, (b) salter med poly-valente metallkationer slik som zink, kalsium, vismut,barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt, nikkel, kadmium og lignende, eller -med et organisk kation dannet fra N,N1 - dibenzyletylen-diamin eller etylendiamin, eller (c) kombinasjoner av (a) og (b), f.eks. et zink tannatsalt og lignende.

Uttrykket "laverealkyl" henviser til en rett eller forgrenet kjede av en mettet hydrokarbongruppe med fra 1 til 4 karbonatomer, slik som f.eks. metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek-butyl og tert-butyl. "Alkyl med 1 til 6 karbonatomer" omfatter de samme substituentene som "lavere - alkyl", men kan i tillegg ha 5 eller 6 karbonatomer, slik som f.eks. en n-pentyl-, n-heksyl- eller andre forgrenede rester med 5 eller 6 karbonatomer. "Alkyl med 1 til 12 karbonatomer" omfatter et radikal med 1 til 12 karbonatomer og hydrogen alene, slik som angitt ovenfor, med unntak av at radikalet kan ha opptil 12 karbonatomer. Uttrykket "cykloalkyl" henviser til en cyklisk, mettet hydrokarbongruppe med fra 3 til 6 karbonatomer, f.eks. cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl og cykloheksyl.

Når det gjelder foreliggende oppfinnelse henviser forkortelsen "alkylPro" til cis-5-alkyl-L-prolylrest hvor alkyl er det samme som "laverealkyl" definert ovenfor. Nærmere bestemt er "MePro" cis-5-metyl-L-prolyl, "EtPro" er cis-5-etyl-L-prolyl og "ButPro" er cis-5-n-butyl-L-Prolyl.

Forkortelsen "N-Ac" henviser spesifikt til N-acetylaminosyre-resten i overensstemmelse med vanlig akseptert nomenklatur.

Foretrukne utførelsesformer av forbindelsene

Forbindelser som er foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, er de hvor A er N-Ac-L-Pro,

N-Ac-D-Ser, N-Ac-D-p-Cl-Phe, N-Ac-D-Nal(2), B er

D-p-F-Phe eller D-p-Cl-Phe, C er D-Trp, D-Nal(2),

D-3Pal eller D-Phe, D er Ser, E er Tyr, F er forbindelsen

med formel II hvor n er 3 eller 4, R., er alkyl medxL til 8 karbonatomer eller cykloheksyl og R2er hydrogen, eller en forbindelse med formel II hvor R1er -NHR^, hvor R^er"metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-heksyl eller cykloheksyl og R2er R^eller hydrogen, eller F er en forbindelse med

formel II hvor R^og R2er dihydroimidazolinyl eller F er en forbindelse med formel (IV) eller (V) hvor Rg er hydrogen, metyl, pentyl eller benzyl, og H er D-AlaNH,,, GlyNH2eller NHEt.

Generelt sett er forbindelser hvor F er N,N" -guanido-disubsti- tuert-D-argininyl eller D-homoargininyl blant de foretrukne utførelses formene.

Særlig foretrukne utførelsesformer blant disse er:

A er N-Ac-L-Pro, N-Ac-D-Nal(2) eller N-Ac-D-p-Cl-Phe, B er D-p-F-Phe eller D-p<->Cl-Phe, C er D-Nal(2), D-Trp, D-3Pal eller D-Phe, D er Ser, E er Tyr, F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh eller D-Dhi og H er D-AlaNH2 GlyNH2 eller NHEt,

Ved alle de ovenfor nevnte utførelsesformene kan forbindelsen også fremstilles som det tilsvarende farmasøytisk akseptable saltet.

Analysefremgangsmåter.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen og særlig saltene derav, oppviser overraskende sterk og langvarig LHRH-antagonistaktivitet.

Viktigste mål for styrke er evnen til å inhibere eggløsning hoss rotter, slik det måles ved fremgangsmåten til Corbin,

A. og Beattie, C.W., Endocrine Res. Commun., 2:1 (1975),

og evnen til å inhibere LH-utskillelse og eggløsning hos kanin, slik som Phelps, C.P., et al, Endocrinology 100,

1526 (1977).

Andre biologiske analyser som brukes på LHRH-antagonister

og på forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, er:

(a) inhibering av LHRH indusert FSH og LH-utskillelse hos rotter, in vivo, Vilchez-Martinez, J.A., et al,

Endocrinology 96: 1130 (1975), og

(b) inhibering av LH og FSH utskillelse ved hjelp av dispergerte cellekulturer fra hypofyseforlappen målt ved hjelp av radioimmunomåling. (Vale, W., et al, Endocrinology 91: 562 (1972) .

Antagonistvirkninger og anvendelser

De følgende anvendelser følger av antagonistvirkningen til

de her beskrevne forbindelser:

- koncepsjonsforhindring hos kvinner,

- undertrykkelse eller forsinkelse av eggløsning,

- fødselsinduksjon,

- synkronisering av eggløsning,

- undertrykkelse av estrus,

- fremskyndelse av vekst hos hunndyr,

- luteolyse, induksjon av menstruasjon,

- tidlig abortfremkallelse, i de første 3 måneder,

- behandling for endometriose,

- behandling for brysttumorer og-cyster

- behandling for polycystisk eggstoffsyndrom (Stein-Leventhal),

- behandling for livmorkreft,

- behandling for godartet prostata hypertrofi og for prostatakreft,

- forhindring av konsepsjon hos hannen,

- behandling for sykdommer som skyldes overskudd av kjønnskjertelhormonproduksjon hos begge kjønn, - funksjonell kastrering av matproduserende dyr av hann-kjønn, - undertrykkelse av blødning hos hunder i proestrus-perioden,

- undertrykkelse av menopaussymptomer.

Aspektene ved den foreliggende oppfinnelse som vedrører bestemte anvendelser av de ovenfor beskrevne forbindelsene er knyttet til disse anvendelsene, særlig inhibering av egg-løsning og behandling av endometriose hos hunnen, og inhibering av sædcelledannelse og behandling av prostata-tumorer hos hannen.

Ved utøvelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen administreres en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk preparat som inneholder den samme forbindelsen, til individet som trenger eller ønsker slik behandling. Disse forbindelsene eller preparatene kan administreres på en hvilken som helst av en lang rekke måter, avhengig av den bestemte anvendelsen, inkludert oralt, parenteralt (inkludert subkutan, intramuskulær og intravenøs administrering), vaginalt (særlig ved forhindring av konceptsjon), rektalt, bukalt (inkludert sublingualt), transdermalt eller intranasalt.

Den mest egnede måten i et bestemt tilfelle vil avhenge av anvendelsen, den bestemte aktive bestanddel, individet som er involvert og legens bedømmelse. Forbindelsen eller preparatet kan også administreres ved hjelp av depot-eller inplantatpreparater for sakte frigivelse, slik som beskrevet i nærmere detalj nedenunder.

For de ovenfor beskrevne anvendelsene, er det vanligvis passende å administrere den aktive bestanddel i mengder mellom ca. 0,01 og 10 mg/kg kroppsvekt pr. dag, fortrinnsvis mellom ca. 0,1 og 5,0 mg/kg kroppsvekt pr. dag. Denne administrering kan utføres ved en enkel daglig administrering, ved fordeling over flere tilførsler eller ved sakte frigivelse for å oppnå de beste resultatene.

Den nøyaktige mengde og plan for administrering av disse forbindelser og preparater vil nødvendigvis være avhengig av behovene hos det enkelte individ som behandles, typen av behandling, graden av lidelse og behov og, selvfølgelig bedømmelsen til legen. Vanligvis krever parenteral administrering lavere dosering enn andre fremgangsmåter for admini-

strering som er mere avhengig av absorbsjon.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører farmasøytiske preparater•som inneholder som aktiv bestanddel en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, idet preparatene omfatter en slik forbindelse i blanding med en farmasøytisk akseptabel, ikke-toksisk bærer. Som nevnt ovenfor, kan slike preparater fremstilles for anvendelse ved parenteral (subkutan, intramuskulær eller intravenøs) administrering særlig i form av flytende oppløsninger eller suspensjoner, for bruk ved vaginal eller rektal administrering, særlig i halvfaste former, slik som kremer og suppositorier, for oral eller bukal administrering, særlig i form av tabletter eller kapsler, eller intranasal, særlig i form av pulver, nesedråper eller aerosoler.

Preparatene kan passende administreres i enhetsdoseringsform og kan være fremstilt ved en hvilken som helst av de velkjente fremgangsmåter innen den farmasøytiske teknikk, f.eks. slik som beskrevet i Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA., 1970. Preparater

for parenteral administrering kan som vanlige hjelpestoffer inneholde sterilt vann eller saltvannsoppløsning, polyalkylenglykoler, slik som polyetylenglykol, oljer av vegetabilsk opprinnelse, hydrogenerte naftalener og lignende. Preparater for vaginal eller rektal administrering, f.eks. suppositorier, kan som hjelpestoffer inneholde f.eks. polyalkylenglykoler, vaselin, kakaosmør og lignende. Preparater for inhalerings-administrering kan være faste og inneholde som hjelpestoffer, f.eks. laktose eller kan være vandige eller oljeoppløsninger for administrering i form av nesedråper. For bukal administrering omfatter typiske hjelpestoffer sukkere, kalsium-stearat, magnesiumstearat, forgelatinert stivelse og lignende.

Det er særlig ønskelig å overføre forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse til individet over en lengere tids-periode, f.eks. i perioder på en uke til ett år, med en enkel administrering. Forskjellige depot- eller implanterings-doseringsformer for sakte frigivelse kan brukes. F.eks.

kan en doseringsform inneholde et farmasøytisk akseptabelt, ikke-toksisk salt av forbindelsen, som har en lav oppløselig-hetsgrad i kroppsvæsker, f.eks. (a) et syreaddisjonssalt med en flerbasisk syre, slik som fosforsyre, svovelsyre, citron-syre, vinsyre, garvesyre, embonsyre, alginsyre, polyglutaminsyre, naftalen mono- eller disulfonsyrer, polygalakturonsyre, . og lignende, (b) et salt med et flervalent metallkation slik som zink, kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt, nikkel, kadmium og lignende, eller med et organisk kation dannet fra f.eks. N,N<1->dibenzyletylendiamin eller etylendiamin, eller (c) kombinasjoner av (a) og (b) f.eks. et zinktannatsalt. Videre kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, eller, fortrinnsvis et forholdsvis uoppløselig salt slik som de som nettop er beskrevet, formes i en gel, f.eks. en aluminiummonostearatgel med f.eks. sesam-olje, egnet for injeksjon. Særlig foretrukne salter er zinksalter, zinktannatsalter, pamoatsalter og lignende.

En annen type depotpreparat for sakte frigivelse beregnet

på injeksjon, vil inneholde forbindelsen eller saltet disper-gert eller innkapslet i en sakte oppløselig, ikke-toksisk, ikke-antigen polymer slik som en polymelkesyre/polyglykolsyre-polymer f.eks. slik som beskrevet i U.S. 3.773.919. Forbindelsen eller fortrinnsvis forholdvis uoppløselige salter, slik som de som er beskrevet ovenfor, kan også formes i pellets med kolesterol som grunnmasse, særlig for bruk på dyr. Videre er depot- eller implanteringspreparater for sakte frigivelse, f.eks. liposomer, velkjente innen littera-turen, se f.eks. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. En detaljert henvisning med hensyn til forbindelser av LHRH-type kan f.eks. finnes i U.S. patentskrift nr. 4.010.125.

Syntese av peptidene

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan synteti- seres ved hjelp av en hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent for fagfolk innen peptidteknikken. En utmerket oppsummering av de mange fremgangsmåtene som således er tilgjengelige finnes i J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Reeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2,

p. 46., Academic Press (New York), 1973 for peptidsyntese i fast fase og E. Schroder og K. Lubke, The Pe<p>tides, Vol.l, Academic Press (New York), 1965 for alminnelig syntese i oppløsning.

I alminnelighet omfatter disse fremgangsmåtene den trinn-

vise tilføyelsen av en eller flere aminosyrer eller passende beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkjede. Vanligvis er enten amino eller karboksylgruppen i den første aminosyren beskyttet med en passende beskyttelsesgruppe.

Den beskyttede eller derivatiserte aminosyren kan så enten

bli knyttet til en inert fast bærer eller anvendes i opp-løsning ved å tilsette den neste aminosyren i sekvensen som har den komplementære (amino eller karboksyl) gruppen passende beskyttet, under betingelser som er egnet for å

danne amidbindingen. Den beskyttende gruppe fjernes så

fra denne nettopp tilsatte aminosyreresten og den neste aminosyren (passende beskyttet) tilsettes så, o.s.v.

Etterat alle de ønskede aminosyrene er blitt bundet i den korrekte rekkefølge, fjernes enhver gjenværende beskyttende gruppe (og enhver fast bærer) trinnvis eller samtidig, for å gi det endelige polypeptidet. Ved hjelp av enkle modifikasjoner av denne generelle fremgangsmåte er det mulig å tilsette mer enn en aminosyre av gangen til en voksende kjede, f.eks. ved å koble (under betingelser som ikke racemiserer chirale sentre) et beskyttet tripeptid med et passende beskyttet dipeptid for å danne, etter fjerning av beskyttelses-gruppen, et pentapeptid.

Foretrukne utførelsesformer av syntesen

En særlig foretrukket fremgangsmåte for å fremstille forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter peptidsynteser i fast fase.

Ved denne særlig foretrukne fremgangsmåte beskyttes a-amino-delen i aminosyrene med en syre- eller basefølsom gruppe. Slike beskyttende grupper bør ha de egenskapene at de er stabile overfor betingelsene ved dannelse av peptidbinding, mens de lett lar seg fjerne uten ødeleggelse av den voksende peptidkjeden eller racemerisering av noen av chirale sentrene som finnes der. Passende beskyttende grupper er t-butyloksykarbonyl(Boe), benzyloksykarbonyl (Cbz), bifenylisopropyl-oksykarbonyl, t-amyloksykarbonyl, isobornyloksykarbonyl, ],]-dimetyl-3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl, o-nitrofenyl-sulfenyl, 2-cyano-t-butyloksykarbonyl, 9-fluorenylmetyloksy-karbonyl og lignende, særlig t-butyloksykarbonyl (Boe).

Særlig foretrukne beskyttende grupper for sidekjeder er,

for arginin: nitro, p_-toluensulfonyl, 4-metoksybenzensulfonyl, Cbz, Boe og adamantyloksykarbonyl, for tyrosin: benzyl, o-brombenzyloksykarbonyl, 2,6-diklorbenzyl, isopropyl, cykloheksyl, cyklopentyl og acetyl, for serin: benzyl og tetra-hydropyranyl, for histidin: benzyl, p_-toluensulf onyl og 2,4-dinitrofenyl.

Aminosyren i C-enden er bundet til en passende fast bærer. Passende faste bærere som er nyttige ved syntesen ovenfor,

er de stoffende som er inerte overfor reagensene og reaksjons-betingelsene i de trinnvise reaksjonene med kondensasjon og fjerning av beskyttelsesgrupper, samt at de er uoppløselige i de mediene som brukes. Passende faste bærere er klormetyl-polystyren-divinylbenzenpolymer, hydroksymety1-polystyren-divinylbenzenpolymer og lignende, spesielt klormetyl-polystyren-1% divinylbenzenpolymer. I det spesielle tilfellet når C-enden i forbindelsen er glycinamid, er en særlig nyttig bærer benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzenpolymeren

Beskrevet av P. Rivaille, et al, Heiv. Chim. Acta., 54, 2772

(1971). Bindingen av klormetylpolystyren-divinylbenzen-harpikstypen gjøres ved hjelp av omsetningen av den Na-beskyttede aminosyren, spesielt Boc-aminosyren, i form av sitt cesium-, tetrametylammonium-, trietylammonium-, 1,5-diazabicyklo[5,4,0]undec-5-ene-salt eller lignende salt i etanol, acetonitril, N,N-dimetylformamid (DMF), og lignende, spesielt cesiumsaltet i DMF, med klormetylharpiksen ved en forhøyet temperatur, f.eks. mellom ca. 40 og 60°C, fortrinnsvis ca. 50°C, ifra ca. 12 til 48 timer, fortrinnsvis ca. 24 timer. Na<->Boc-aminosyren bindes til benzhydrylamin-harpiksen ved hjelp av en N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (DCC)/1-hydroksybenzotriazol (HBT)-formidlet sammenkobling i løpet av ca. 2 til ca. 24 timer, fortrinnsvis ca. 12 timer ved en temperatur på mellom ca. 10 og 50°C, fortrinnsvis 25°C i et oppløsningsmiddel slik som diklormetan eller DMF, fortrinnsvis diklormetan. Sammenkoblingen i rekkefølge av beskyttede aminosyrer kan utføres i et automatisk syntese-apparat for polypeptider som er godt kjent innen teknikkens stand. Fjerningen av de Na<->beskyttende gruppene kan utføres i nærvær av f.eks. en oppløsning av trifluoreddiksyre i metylenklorid, saltsyre i dioksan, saltsyre i eddiksyre, eller annen sterk syreoppløsning, fortrinnsvis 50% trifluoreddiksyre i diklormetan ved omtrent omgivelsestemperatur. Hver beskyttet aminosyre innføres fortrinnsvis i omtrent 2,5 molart overskudd og sammenkoblingen kan utføres i diklormetan, diklormetan/DMF-blandinger, DMF og lignende, særlig i metylenklorid ved omtrent omgivelsestemperatur. Sammenkoblingsmidlet er vanligvis DCC i diklormetan, men kan være N,N<1->di-iso-propylkarbodiimid (DIC) eller andre karbodiimider enten alene eller i nærvær av HBT, N-hydroksy-suksinimid, andre N-hydroksyimider eller'-oksimer. Alternativt kan det brukes beskyttede, aktive estere av aminosyren (f.eks. p-nitrofenyl, pentafluorfenyl og lignende) eller symmetriske anhydrider. Ved slutten av syntesen i fast fase fjernes det fullstendig beskyttede polypeptidet fra harpiksen. Når bindingen til harpiksbæreren er av benzylestertypen, skjer spaltingen ved hjelp av aminolyse med et alkylamin eller fluoralkylamin for peptider med prolin i C-enden, eller ved aminolyse med, f.eks., ammoniakk/metanol eller ammoniakk/etanol for peptider med glycin i C-enden ved en temperatur mellom ca. 10 og 50°C, fortrinnsvis ca. 25°C, i løpet av mellom ca. 12 og 24 timer, fortrinnsvis ca. 18 timer. Alternativt kan peptidet fjernes fra harpiksen ved hjelp av transforestring, f.eks. med metanol, etterfulgt av aminolyse. På dette punktet kan det beskyttede peptidet renses ved hjelp av kromatografi med silisiumdioksydgel. Fjerningen av de beskyttede gruppene for sidekjeden fra polypeptidet.ut-føres ved å behandle aminolyseproduktet med f.eks. vann-fritt, flytende hydrogenfluorid i nærvær av anisol eller annet fjerningsmiddel for karbonium, behandling med hydrogenfluorid/pyridinkompleks, behandling med tris(trifluoracetyl)-bor og trifluoreddiksyre, ved reduksjons med hydrogen og palladium-på-karbon eller polyvinylpyrrolidon, eller ved reduksjon med natrium i flytende ammoniakk, fortrinnsvis med flytende hydrogenfluorid, og anisol ved en temperatur mellom ca. -10 og +10°C, fortrinnsvis ca. 0°C, i mellom ca. 15 minutter og 1 time, fortrinnsvis ca. 30 minutter. For peptidene med glycin i enden som er bundet til benzhydrylamin-harpiksene, kan trinnene med harpiksavspalting og avspalting av beskyttelsesgrupper kombineres i ett enkelt trinn ved å anvende flytende hydrogenfluorid og anisol, slik som beskrevet ovenfor. Polypeptidet hvor alle beskyttelsesgruppene er fjernet renses så ved en sekvens av kromatografiske trinn under anvendelse av en hvilken som helst eller alle av de følgende typer: ionebytting på en svakt basisk harpiks i acetatform, hydrofob adsorbsjonskromatografi på ikke-derivatisert polystyren-divinylbenzen (f.eks. Amberlite XAD), adsorbsjonskromatografi på silisiumdioksydgel, ionebytter-kromatografi på karboksymetylcellulose, separasjonskromato-graf i, f.eks. på Sephadex-G-25, eller motstrømsfordeling, væskekromatografi med høy yteevne (HPLC), særlig HPLC i omvendt fase på kolonne med oktyl- eller oktadecylsilyl-silisiumdioksyd i bundet fase.

Hvis en racemisk aminosyre i 1, 2, 3 eller 6 stillingen, adskilles de diastereomere nonapeptid- eller dekapeptid-sluttproduktene og det ønskede peptid som inneholder en D-aminosyre i den passende stilling isoleres og renses, fortrinnsvis under den ovenfor beskrevne kromatografiske fremgangsmåte.

Fremstillingen av peptider med azaglycinamider i C-enden gjøres fortrinnsvis ved å bruke alminnelig peptidsyntese i oppløsning under anvendelse av kjente peptidmellomprodukter. Dette er beskrevet nærmere i Eksempel 3.

Således vedrører foreliggende oppfinnelse også en fremgangsmåte for å fremstille forbindelser ifølge oppfinnelsen og de farmasøytisk akseptable saltene derav, idet fremgangsmåten er kjennetegnet ved: å fjerne beskyttende grupper og eventuelt, kovalent bundet fast bærer fra et beskyttet polypeptid hvorved man får en forbindelse med formel (I) eller et salt derav, eller å koble sammen i den krevede sekvens to fragmenter av den ønskede forbindelse med formel (I), eller (a) omdanne en forbindelse med formel (I) til et farmasøytisk akseptabelt salt, eller

(b) omdanne et salt av en forbindelse med formel (I)

til et farmasøytisk akseptabelt salt, eller

(c) dekomponere et salt av en forbindelse med formel (I)

til et fritt polypeptid med formel (I).

Det vil forstås at de guanido-substituerte, amidin-, og tertiært og kvaternært amin, vannoppløselige aminosyrene som brukes ved foreliggende oppfinnelse for å erstatte glycinresten i stilling 6 i LHRH, er nyttige mellomprodukter og som sådanne danner en viktig del av foreliggende oppfinnelse.

Særlig nyttige mellomprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter de med formel (II) hvor n er 1 eller 2

og de andre foranderlige symbolene er som tidligere definert, de med formel (II) hvor n er 3, er alkyl med 2 til 12 karbonatomer eller slik som ellers definert tidligere, og de andre foranderlige symbolene er som tidligere definert,

og de med formel (II) hvor n er 4 eller 5, og de andre foranderlige symbolene er som tidligere definert.

Foretrukne mellomprodukter omfatter de med formel (II)

hvor n er 4, R er -NRR^hvor R er hydrogen og R^ er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, og R2er alkyl med 1 til 12 karbonatomer .

Slike mellomprodukter med formel (II) kan fremstilles på

en hvilken som helst vanlig måte, hvorav et eksempel er ved guanylering eller amidinering av det tilsvarende amin.

De følgende eksemplene gjengis for å gjøre fagfolk innen teknikken i stand til mer fullstendig å forstå og utøve foreliggende oppfinnelse. De må ikke betraktes som begrensende for omfanget av oppfinnelsen, men heller som å være illu-strerende og representative for den.

Fremstilling A

N- acetyl 3-( 2- naftyl)- D, L- Alaninat

Fremstillingen av 3-(2-naftyl)-D,L-alanin utføres i overensstemmelse med fremgangsmåten angitt i U.S. patentskrift 4.341.767.

Fremstilling av N-acetyl-3-(2-naftyl)-D,L-alinin, dets omdannelse til metyl N-acetyl-3-(2-naftyl)-D ,L-alinin og adskillelse av D-isomeren utføres ved fremgangsmåten beskrevet i U.S. patent skrift 4.341.767.

Fremstilling B

En blanding av 5,24 g benzyl-N^-benzyloksykarbonyl-D-lysinat-toluensulfonat (B.Bezus og L.Zervas, J.Am.Chem.Soc. 83, 719 (1961)) og 1,72 ml diisopropyletylamin i 60 ml dioksan behandles med 1,89 g N,N'-diisopropylkarbodiimid. Reaksjonsblandingen omrøres ved 100°C i 6 timer, avkjøles til værelsetemperatur og oppkonsentreres til et faststoff. Det faste stoffet suspenderes i 20 ml varm DMF, filtreres for å fjerne N,N'-diisopropylurinstoff og filtratet oppkonsentreres til et fast stoff. Benzyl-N^-benzyloksykarbonyl-N,N<1->guanido-diisopropyl-D-homoargininat-toluensulfonat erholdes som et hvitt, fast stoff ved utkrystalli-sering fra metanol/etylacetat [a]D-7,26° (C 0,3, MeOH).

På samme måte ble det ved å anvende fremgangsmåten ovenfor, men å bytte ut med: N,N'-dicykloheksylkarbodiimid,

N,N'-di-n-heksylkarbodiimid,

N,N'-dietylkarbodiimid,

N,N'-di-n-propylkarbodiimid,

N-i-propylkarbodiimid,

N-propylkarbodiimid,

N ,N'-di-n-butylkarbodiimid,

N,N'-dimetylkarbodiimid,

N,N<1->di-i-butylkarbodiimid,

N,N'-di-n-pentylkarbodiimid,

N,N<1->di-i-pentylkarbodiimid,

N,N<1->difenylkarbodiimid,

N,N'-ditolylkarbodiimid, eller

1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-HCl

og lignende, erholdes det: benzyl-Na<->benzyloksykarbonyl,N,N<1->guanido-dicykloheksyl-dicykloheksyl-D-homoargininat, [cc]D8,07° (C 0,9 MeOH),

benzyl N -benzyloksykarbonyl-N,N1-guanidodietyl-D-homoargininat,

benzyl Na<->benzyloksykarbonyl-N,N'-guanido-di-n-propy1-D-homoargininat [a]D8,07° (C 0,9 MeOH),

benzyl Na-benzyloksykarbonyl-N,N1-guanido-n-propyl-D-homoargininat,

benzyl Na-benzyloksykarbonyl-N,N1-guanido-di-n-butyl-D-homoargininat,

benzyl Na-benzyloksykarbonyl-N,N1-guanido-di-i-butyl-D-homoargininat,

benzyl Na-benzyloksykarbonyl-N,N1-guanido-di-n-pentyl-D-homoargininat,

benzyl Na-benzyloksykarbonyl-N,N1-guanido-di-fenyl-D-homoargininat,

benzyl Na<->benzyloksykarbonyl-N,N'-guanido-dimetyl-D-homoargininat,

benzyl Na<->benzyloksykarbonyl-N,N'-guanido-di-n-heksyl-D-homoargininat,

benzyl Na<->benzyloksykarbonyl-N,N<1->guanido-di-isopropyl-D-argininat, [a] -10,5° (C 0,5, MeOH),

benzyl Na<->benzyloksykarbonyl, N-guanido-(3-dimetylamino-propyl)-N'-guanido-etyl-D-homoargininat

i form av deres benzensulfonatsalter..På samme måte kan det ved å bytte ut D-lysinatet med benzyl Na<->benzyloksykarbonyl-D-ornitinat erholdes de tilsvarende argininanalogene i form av deres toluensulfonatsalter.

Fremstilling C

( I) benzyl N ct - benzyloksykarbonyl- N G , N G'- etano- D- homoargininat Til en blanding av 15 ml toluen og 15 ml t-BuOH ble det tilsatt 2,71 g benzyl Na<->benzyloksykarbonyl-D-lysinat og 1,46 g 2-metyltioimidazolin"HI ( tilgjengelig fra Aldrich). pH i blandingen ble bragt til ca. 8 ved tilsetning av diisoprpyletylamin og oppløsningen ble oppvarmet under tilbakeløp i 24 timer.

Oppløsningen ble oppkonsentrert under vakuum og resten ble plasert på en silisiumdioksydgelkolonne (250 g). Kolonnen ble eluert med en gradient fra CH2Cl2/MeOH (19:1) til CF^C^/MeoH (7:3). Fraksjonene som inneholdt produkt ble påvist ved hjelp av TLC, slått sammen og oppkonsentrert til tørrhet, hvilket ga 2,9 g hvitt skum.

En 2 g stor del av det ovenfor nevnte produktet ble oppløst

i 50 ml ETOH som inneholdt 0,8 g 10% Pd/C. Oppløsningen ble omrørt under H2i 8 timer. Blandingen ble filtrert på celite og filtratet ble oppkonsentrert til tørrhet, hvorved

G G1

man fikk N ,N -eteno-D-homoarginin som et hvitt skum, 1,2 g.

cx G G1

(II) N - Boc- N , N - etan- D- homoarginin

En oppløsning av 2,74 g D-lysin dihydroklorid og 4,03 g 2-metyltio-2-imidazolin'hydrojodid i 16,5 ml 2N NaOH ble omrørt ved værelsetemperatur i 6 dager. Analyse av reaksjonsblandingen på et analyseapparat for aminosyrer vist at ca. 70% av denønskede e-dialkylguanidoforbindelsen var blitt dannet. Ytterligere 0,25 g av 2-metyltio-2-imidazolin.hydrojodidet og 1 ml 2N NaOH ble tilsatt og omsetningen fikk fortsette ved værelsetemperatur i ytterligere 3 dager.

Reaksjonsblandingen ble behandlet med 0,8 g MgO og 4,36 g di- tert-butyldikarbonat i 20 ml dioksan. pH ble justert til 9,5 med IN NaOH. Etter omsetning over natten var noe utgangsmateriale tilstede så 1 g di- tert-butyldikarbonat ble tilsatt.

Blandingen ble filtrert og filtratet ble oppkonsentrert til tørrhet. Resten ble oppløst i J^O og vasket med Et20 og det vandige skiktet ble justert til pH 4 med HOAc. Den -sure oppløsningen ble vasket med EtOAc. Det vandige skiktet som inneholdt produktet ble behandlet med anionisk ione-bytterharpiks (AG-3 acetat, BioRad) og oppkonsentrert til tørrhet.

Det rå produktet ble sendt gjennom en hydrofob kromatografi-kolonne (Amberlite XAD-2, Rohm&Haas) ved eluering med en gradient fra H,,0 til 25% EtOH. Fraksjonene som inneholdt produktet ble slått sammen og man fikk 2,7 g N -Boc-, -etano-D-homoarginin, [et]<25>-19,7° (c 0,1, MeOH).

På en lignende måte ble det ved å bruke: S-metyl-dietyl-iso-tiourea-HI,

S-metyl-dipropyl-iso-tiourea-HI,

S-metyl-dibutyl-iso-tiourea-HI,

S-metyl-dipentyl-iso-tiourea-HI,

S-metyl-diheksyl-iso-tiourea-HI,

S-metyl-diheptyl-iso-tiourea-HI og

S-metyl-dionyl-iso-tiourea-HI

i stedet for 2-metyltio-2-imidazolin-HI, erholdt: Na<->Boc-N,N'-guanido-dietyl-D-homoarginin, Na<->Boc-N,N<1->guanido-dipropyl-D-homoarginin, Na<->Boc-N,N'-guanido-dibutyl-D-homoarginin, Na<->Boc-N,N<1->guanido-dipentyl-D-homoarginin, Na<->Boc-N,N<1->guanido-diheksyl-D-homoarginin, Na-Boc-N,N'-guanido-diheptyl-D-homoarginin og Na<->Boc-N,N'-guanido-dinonyl-D-homoarginin.

Fremstilling D

Denne fremstillingen illustrerer fremstillingen av Na-t-butyloksykarbonylderivater av N,N'-guanido-disubstituert-

D-homoargininer fra deres toluensulfonatforløpere.

En blanding av N,N'-guanido-diisopropyl-D-homoargininat-toluensulfonat (3,25 g) og 100 mg 10% Pd/C i 50 ml iseddik behandles med hydrogengass ved atmosfæretrykk i 4 timer. Katalysatoren frafiltreres på celitt og filtratet oppkonsentreres til et faststoff, N,N<1->guanido-diisopropyl-D-homoarginin-toluensulfonat. En oppløsning av denne forbindelse (2,13 g) i 60 ml 50% dioksan/vann behandles med 10 ml IN natriumhydroksyd og 0,4 g magnesiumoksyd. Denne blandingen behandles med 1,1 g di-t-butyldikarbonat og omrøres ved værelsetemperatur i 2 timer. Magnesiumsaltet frafiltreres og filtratet oppkonsentreres under vakuum.

Den basiske oppløsning vaskes med etanol, og bringes deretter til pH 2,5 med natriumsulfat. Den sure, vandige oppløsningen ekstraheres med etylacetat som tørkes over magnesiumsulfat. Tørkemidlet frafiltreres og filtratet oppkonsentreres. Utkrystallisasjon fra etylacetat/heksan gir Na-t-butyloksykarbonyl-N,N'-guanido-diisopropyl-D-homoarginin-toluensulfonat.

Ved å gå frem på en lignende måte, men ved å bytte ut med

de passende toluensulfonatforløperne, kan andre Na-t-butyloksykarbonyl-N,N'-guanido-disubstituert-D-homoarginin-eller D-arginin-forbindelser fremstilles.

Fremstilling E

Na-t-butyloksykarbonyl-3-(41 -(1'-propylpiperidyl))-D-alanin

■En 4,6 g stor del natriummetall ble tilsatt til 400 ml absolutt etanol og varmet opp. Til den resulterende oppløs-ning av natriumetoksyd ble det tilsatt 21,7 g dietylacetamid-malonat og 16,4 g 4-pikolylkloridhydroklorid (Aldrich Chem. co.). Reaksjonsblandingen ble varmet opp til 100°C i 4 timer, avkjølt, filtrert og oppkonsentrert under vakuum. Blandingen ble fylt på en silisiumdioksydgelkolonne i metylenklorid/ metanol (19:1) og eluert med den samme blandingen. Produktet

ble lokalisert som en hurtig forflyttende UV positiv flekk ved hjelp av TLC på silisiumdioksydgel i metylenklorid/ metanol (19:1). Sammenslåtte fraksjoner ble oppkonsentrert hvorved man fikk produktet.

Produktet fra det forrige avsnittet ble oppløst i 200 ml etanol og behandlet med en oppløsning av 2,72 g natriumhydroksyd i 40 ml vann ved 50°C i 6 timer. Oppløsningen ble surgjort med 12 ml 6N HC1, oppkonsentrert til tørrhet og tatt opp i 200 ml dioksan. Suspensjonen ble filtrert og filtratet oppvarmet ved tilbakeløp i 2 timer. Oppløs-ningen ble avkjølt og oppkonsentrert til tørrhet hvorved man fikk etyl-Na<->acetyl-3-(4-pyridyl)-D,L-alanin som et hvitt, fast stoff.

En del av denne N-acetylester ble på nytt oppløst ved å behandle med 200 ml av enzymet" subtilisin Carlsberg"

(Sigma Chem. Co., protease VIII) i en blanding av 300 ml dimetylsulfoksyd og 400 ml 0,01MKC1 (pH 7,2). pH ble holdt konstant ved tilsetning av IN NaOH på et pH-stat. Etter en periode på 6 timer var oppløsningen fullstendig. Oppløsningen ble fortynnet med 400 ml vann og ekstrahert med 4 x 750 ml etylacetat. De organiske skiktene ble slått sammen og tørket over magnesiumsulfat og oppkonsentrert, hvorved man fikk etyl-Na<->acetyl-3-(4-pyridyl)-D-alaninat som en olje.

Oljen ble omsatt med 1,22 g n-propylbromid i 50 ml etanol, hvoretter oppløsningen ble oppkonsentrert til tørrhet og man fikk etyl-Na<->acetyl-3-(l-propyl-pyridinium-4-yl)-D-ali-ninat-bromid som et hvitt hygroskopisk faststoff.

Dette hvite faste stoffet ble oppløst i 200 ml etanol og ble redusert under en atmosfære av hydrogengass ved å bruke 100 mg 10% Pd/C som en katalysator. Etter en reduksjons-periode på 18 timer, ble katalysatoren frafiltrert og opp-løsningen oppkonsentrert, hvorved man fikk etyl-Na<->acetyl-3-

(41 -(1'-propylpiperidyl)-D-alininat som et lysebrunt faststoff. De frie syre ble fremstilt ved å tilbakeløpskoke etylesteren

i 100 ml 6N HC1 i 4 timer hvorved man fikk 3-(4'-(l'-propyl-piperidyl))-D-alanin som et hvitt faststoff.

De frie syre ble oppløst i 100 ml dioksan/vann (1:1) og behandlet med 2 g di-t-butyldikarbonat. pH ble holdt konstant på 9 ved tilsetning av IN NaOH på et pH stat.

Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen oppkonsentrert under vakuum, vasket med 100 ml etyleter og det vandige skiktet ble fylt på en Amberlite XAD-2 hydrofob harpiks. Kolonnen ble eluert med 250 ml vann, etterfulgt av 250 ml 50% etanol/vann. Etanoleluatet ble slått sammen og oppkonsentrert til tørrhet, hvorved man fikk Na<->t-butyloksy-karbonyl-3-(41 -(11-propylpiperidyl)-D-alanin som et hvitt faststoff.

Ved å gå frem på en lignende måte, men ved å bruke 3-picolylklorid hydroklorid i stedet for 4-picolylklorid-hydroklorid, fremstilles det Na<->t-butyloksy-karbonyl-3-(3'-(1'-propylpiper-idyl ))-D-alanin.

Fremstilling F

Cis-5-alkylprolin forbindelser kan fremstilles ved den følgende fremgangsmåte: Til en 200 ml rund-bunnet kolbe tilsettes det (S)-3-(benzyloksykarbonyl-5-okso-4-oksazolidinpropionsyre og 63 ml vannfri benzen. Til denne oppløsning tilsettes 13,9 g fosforpenta-klorid ved 0°C. Reaksjonsblandingen omrøres ved 0°C i 1 time, hvorunder alt fosforpentakloridet oppløses. Benzenoppløsnings-midlet fjernes under vakuum og samtidig fordamping med to 25 ml porsjoner med tørr benzen, og resten tørkes under vakuum hvorved man får et lyst faststoff. Det lyse faste stoffet suspenderes i 30 ml heksametylfosforamid og 9,4 ml tetrametyltin og 40 mg PhCH2Pd(PPh3)2C1 tilsettes. Reaksjonsblandingen oppvarmes ved 65°C i 4 timer. Ytterligere 2 ml tetrametyltin tilsettes ved slutten av denne perioden og reaksjonsblandingen omrøres over natten ved værelsetemperatur. Etter fortynning med vann og ekstraksjon med etylacetat, vaskes etylacetatskiktet med vann, 5% natriumbikarbonat, vann, 5% natriumbisulfat, vann og mettet natriumklorid og tørkes over vannfri magnesiumsulfat. Oppløsningen filtreres og oppkonsentreres til 16 g av en gul olje, som sendes gjennom en silisiumdioksydgelkolonne under anvendelse av etylacetat/heksan (4/6) som eluerings-middel. Oppkonsentrering av de passende fraksjonene gir 15 g av en lys gul olje som rekrystalliseres fra etylacetat-hekan hvorved man får 14,3 g (S)-3-(benzyloksykarbonyl)—4-(3-oksobutyl)-5-oksazolidinon som et hvitt fast stoff (74% utbytte), med et smeltepunkt på 64-65°C, [a}25= + 102° (c =1,1, CH2C12).

Analyse: Beregnet for C^gH^NO,-:

C; 61,85, H: 5,84, N: 4,81

Funnet: C: 61,54, H: 5,89, N: 4,84.

Ved å gjenta fremgangsmåten ovenfor på en lignende måte, og ved å erstatte tetrametyltinnet med en støkiometrisk ekvivalent mengde av det passende tetraalkyltinn, fremstilles de følgende forbindelsene: (a) Med tetraetyltinn: (S)-3-(benzyloksykarbonyl)-4-(3-oksopentyl)-5-oksazolidinon med et smeltepunkt på 45-46°C;

[a] 25 = 82,5° (c 0,7, CH30H).

Analyse: Beregnet for C16HigN05(305.336):

C: 62,94, H: 6,37, N: 4,59.

Funnet: C: 63,02, H: 6,15, N:4,48

(b) Med tetrabutyltinn

(S)-3-(benzyloksykarbonyl)-4-(3-oksoheptyl)-5-okazolidinon som en olje, [et]2<5>67 ,9° (c 0,12, CH30H) .

Analyse: Beregnet for C18H23NC>5 EtOAc (421.494):

C: 62,69, H: 7,41, N: 3,32.

Funnet: C: 62,50, H: 7,29, N: 3,39. 10 gram av (S)-3-(benzyloksykarbonyl)-4-(3-oksobutyl)-5-oksazolidinonet fra eksempel 4 oppløses i 480 ml destillert tetrahydrofuran, etterfulgt av 160 ml ammoniakk ved 0°C. Reaksjonsblandingen omrøres ved 0°C i 5 timer og deretter ved omgivelsestemperatur over natten. Etter stripping under vakuum til tørrhet, gir reaksjonsblandingen et hvitt fast stoff som rekrystalliseres fra varm etylacetat,

hvorved man får 8,8 g (S)-2-(benzyloksykarbonylamino)-5-okso-heksanamid som et hvitt fast stoff (82% utbytte), smeltepunkt 142-144°C,

[a]<25>= -4,0° (c 0,4, CH30H).

Analyse: Beregnet for C^HgNO,,:

C: 60,4, H; 6,4, N: 10,0

Funnet: C: 60,44, H: 6,53, N: 10,05.

Ved å gjenta fremgangsmåten ovenfor på -en lignende måte

og bytte ut med en støkiometrisk ekvivalent mengde av de tilsvarende mellomprodukter fra nest siste avsnitt ovenfor, fremstilles de følgende forbindelser: (S)-2-benzyloksykarbonylamino-5-okso-heptanamid med et smeltepunkt på 133-135°C, [a]<25>-4,17° (c 0,8, CH30H)

Analyse: Beregnet for c15H2oN2°4 (292'341>:

C: 61,63, H: 6,90, N: 9,58.

Funnet: C: 61,51, H: 6,75, N: 9,16 (S)-2-benzyloksykarbonylamino-5-okso-nonamid med et smeltepunkt på 162-163°C, [<x]2<5>-4,32° (c 0,6, CH30H) .

Analyse: Beregnet for C^H^N^ (320, 395) :

C: 63,73, H: 7,55, N: 8,74.

C: 63,62, H: 7,56, N: 8,82.

Til en oppløsning av 2,8 g (S)-2-benzyloksykarbonylamino)-5-oksoheksanamid fra det foregående avsnittet i en blanding av 60 ml metanol og 7,5 ml iseddik tilsettes under nitrogen, 1,5 g palladiumdiacetat. Denne reaksjonsblandingen hydro-generes under atmosfæretrykk i 4 timer, hvoretter en analyse med tynnskiktkromatografi viser at omsetningen er fullstendig. Reaksjonsblandingen filtreres så gjennom Celite og vaskes

med metanol. Reaksjonsblandingen og vaskevannene oppkonsentreres til tørrhet , hvorved man får 1,7 g av en gul olje, som behandles med 1 ml av en blanding av saltsyre og etylacetat for å fremstille hydrokloridsaltet. Denne olje tritureres med metanol/etyleter hvorved man får 1,3 g av et gult fast stoff, smeltepunkt 174-176°C,<=><->33°

(cO,96, CH30H). Det gule faste stoffet av (S)-cis-5-metyl-prolinamid (som hydrokloridsaltet) sendes gjennom en Bio-

Rex 70 kolonne (en svakt sur karboksylsyre ione-bytter harpiks) med eluering først med 300 ml vann, etterfulgt av 1% opp-løsning av ammoniumhydroksyd. Oppkonsentrering av de passende fraksjonene gir 0,9 g av et gult fast stoff som rekrystalliseres fra metylenklorid, hvorved man får 0,64 g (S)-cis-S-metylprolinamid som et gult fast stoff (50% utbytte), smeltepunkt 55-56°C.

Ved å gjenta fremgangsmåten ovenfor på en lignende måte,

og i stedet bruke en støkiometrisk ekvivalent mengde av det tilsvarende mellomproduktet, fremstilles de følgende forbindelsene etter reduksjon: (S)-cis-5-etylprolinamid, smp. 63-65°C og

(S)-cis-5-butyl-prolinamid, smp.74-75°C.

Fremstilling G

4,9 g Boc-glycin ble oppløst i en blanding av 50 ml etanol og 50 ml destillert vann. pH i oppløsningen ble bragt til 7 med vandig cesiumbikarbonat. Oppløsningsmidlet ble deretter fjernet under vakuum.

Etter 18 timer med tørking under høyvakuum, ble resten

oppløst i 150 ml tørr DMF. 25 g klormetylert polystyren -

1% divinylbenzen (Merrifield) harpiks (svarende til 25

mmol klorid) ble tilsatt. Blandingen ble rystet ved 50°C

i 24 timer, filtrert og harpiksen ble så vasket med hhv.

DMF, vann og etanol. Harpiksen ble tørket under vakuum i

3 dager hvorved man fikk 28,34 g Boc-Gly-O-harpiks.

Eksempel 1

I reaksjonsbeholderen til et Beckman 990 Peptid-syntetiserings-apparat ble det plasert 7,29 g (5,5 mmol.) Boc-Gly-0-

harpiks fremstilt ved omsetning av ekvimolare forhold av det tørre cesium-saltet av Boc-GlyOH med klormetylpoly-styren/1% divinylbenzen. Aminosyrer ble i rekkefølge tilsatt til denne harpiksen ved hjelp av et synteseprogram på følgende måte:

Trinnene 1-13 fullender en sammenkoblingscyklus for en aminosyre og fullstendigheten av omsetningen kontrolleres ved hjelp av ninhydrin-metoden til E. Kaiser, et al.,

Anal. Biochem., 34, 595 (1970).

Harpiksen ble i rekkefølge sammenkoblet med et 2,0 til 2,5 molart overskudd av hver beskyttet aminosyre og DCC. Harpiksen ble følgelig behandlet under suksessive sammenkoblings-sykluser med

3,01 g Boc-Pro-OH,

5,99 g Boc-Arg(Tosyl)-0H,

3,49 g Boc-Leu-0H-H20.

På dette punktet ble den resulterende tetrapeptidharpiksen delt opp i mindre porsjoner. En 1,00 g stor porsjon ble bragt videre ved ytterligere sammenkobling i suksessive cykluser med

0,456 g Boc-D-Dia-OH-toluensulfonat,

0,44 g Boc-Tyr(2,6-diklorbenzyl)-0H,

0,375 g Boc-Ser(benzyl)-0H,

0,315 g Boc-D-Nal(2)-0H,

0,35 g Boc-D-p-F-Phe-OH,

0,275 g Boc-L-Prolin og

2,5 ml eddiksyreanhydrid.

Harpiksen ble fjernet fra reaksjonsbeholderen, vasket med CH2Cl2og tørket under vakuum hvorved man fikk 1,66 g beskyttet polypeptidharpiks. Det beskyttede peptidet ble fjernet fra harpiksen ved behandling ved værelsetemperatur i 24 timer med 50 ml metanol mettet ved 0°C med ammoniakk. Harpikskulene ble frafiltrert og vasket i rekkefølge med metanol og DMF. Oppløsningsmidlet ble fjernet fra filtratet under vakuum hvorved man fikk det beskyttede peptidet som 0,9 g gul olje.

De beskyttende gruppene ble fjernet ved behandling med 10 ml vannfri, flytende HF i nærvær av 1 ml anisol (rensemiddel)

i en Kel-F-reaksjonsbeholder ved 0°C i 30 minutter. HF

ble avdampet under vakuum og resten N-Ac-L-Pro-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, i form av dens HF-salt, ble vasket med eter. Resten ble så ekstrahert med iseddik. Eddiksyreekstraktet ble lyofilisert, hvorved man fikk 0,5 g av råmaterialet.

Råmaterialet ble omdannet til acetatsaltet ved å sende det

i vann gjennom en kolonne av AG3X (en svakt basisk, tertiær aminharpiks) som var blitt omdannet til acetatformen. Lyofilisering av eluatet ga 0,5 g av det rå paptidacetat saltet som et hvitt fast stoff.

Råpeptidet ble renset ved hjelp av væskekromatografi ved høy ydeevne på en 2,5 x 100 cm kolonne av Licroprep Rp-18 (25-40 mikrometer) som var ekvilibrert til den anvendte buffer 35% CH3CN/65%H20 (0,03 M i NH^OAc, pH 4,5). Den størte UV-absorbsjonstoppen (280 nm) som eluerte ved omtrent 3 kolonnevolumer, ble samlet opp, konsentrert til tørrhet og lyofilisert 3 ganger fra destillert vann, hvorved man fikk 75 mg ren N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, [a]<25>= -15,4° (C0,5,HOAc).

Ved å gå frem på en lignende måte, men å bytte ut de angitte aminosyrer med de passende A-, B-, C-,D-, E-,G- eller F-aminosyrene, fremstilles de tilsvarende GlyNH2dekapeptidene som er eksemplifisert nedenfor. På lignende måte ble det ved å erstatte Boc-Gly-O-harpiksen med Boc-D-Ala-benzhydrylamino-polystyren-1%-divinylbenzen-harpiks fremstilt fra benzhydrylaminopolystyren-1% divinyl-benzenharpiks (Beckman Inst), Boc-D-Ala-OH, DIC og HBT erholdt de tilsvarende D-Ala^Qanalogene av LHRH:

Eksempel 2

For syntesen av analoge forbindelser med Pro-NHCH-^CH^i C-enden ble det brukt et synteseprogram som er identisk med det som er beskrevet i Eksempel 1. Reaksjonsbeholderen i Backman 990 Synteseapparatet ble fylt med 2,13 g Boc-Pro-0-harpiks, fremstilt ved omsetningen av ekvimolare forhold av det tørre cesiumsaltet av Boc-Pro-OH med klormetyl-polystyren/1% divinylbenzen (Lab Systems, Inc.). Den anvendte mengden Boc-Pro-O-harpiks inneholdt 1,4 mmol prolin.

Harpiksen ble i rekkefølge sammenkoblet med et 2,0 til 2,5 molart overskudd av hver beskyttet aminosyre og DCC. Således ble harpiksen omsatt under på hverandre følgende sammen-koblingssykluser med

1,61 g Boc-Arg(Tosyl)-OH,

0,93 g Boc-Leu-OH H20

0,94 g Boc-N,N'-guanido-diisopropylhomoarginin,

0,49 g 1-hydroksybenzotriazol,

1,75 g N-Boc-0-2-brombenzyloksykarbonyl-L-tyrosin,

og 1,11 g Boc-Ser-(Benzyl)-OH.

På dette punktet i syntesen ble mengden av beskyttet polypeptidharpiks delt i to og en halvpart ble ført videre til fullstendig omsetning ved i rekkefølge å omsette med 0,57 g Boc-D-Nal(2)-OH,

0,480 g Boc-D-p-F-Phe-OH

0,21 g N-Ac-L-prolin.

Harpiksen ble fjernet fra reaksjonsbeholderen, vasket

med CH2C12 og tørket under vakuum, hvorved man fikk 2,26 g beskyttet polypeptidharpiks.

Det beskyttede polypeptidet ble spaltet fra harpiksen ved aminolyse med 25 ml etylamin i 18 timer ved 2°C. Etylaminet fikk fordampe og harpiksen ble ekstrahert med metanol. Metanolen ble inndampet hvorved man fikk 1,3 9 g N-Ac-L-Pro-D-p-Cl-Phe-Trp-Ser(Benzyl)-Tyr(2,6-diklorbenzyl)-D-Dih-Leu-Arg(Tosyl)-Pro-NHCH2CH3. Dette beskyttede peptidet ble blandet med 3 ml anisol og 30 ml redéstillert (fra CoF^) vannfri flytende HF ved 0°C i 30 minutter i en Kel-F-reaksjonsbeholder. HF ble avdampet under vakuum og resten ble vasket med eter. Resten ble oppløst i 2 M eddiksyre og lyofilisert hvorved man fikk 0,82 g av rått N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-NHCH2CH3i form av dets eddiksyreaddisjonssalt. Sluttrensing ble oppnådd ved hjelp av preparativ væskekromatografi med høy ydeevne av en 20 mg stor prøve på en 2,5 x 100 mm kolonne med 40-50 mikrometer oktadecylsilylert silisiumdioksyd (Merck,Lichroprep C^g).

Ved å gå frem på en lignende måte, men å bytte ut med de passende, beskyttede aminosyrerestene der det passer, fremstilles de følgende forbindelser:

Ved å gjenta den ovenfor nevnte spalting og bytte ut

etylamin med en støkiometrisk mengde metylamin og propylamin, erholdes det tilsvarende metylamin eller propylamin av det ovenfor nevnte nonapeptid.

Eksempel 3

Forbindelser med formel I hvor H er -NH-CONH-R kan fremstilles ved vanlig oppløsningssyntese.

F. eks. kan den følgende fremgangsmåte brukes hvor "AzaGlyNHR^Q<1>' er -NH-NH-CONH2, for å fremstille peptidet som det frie peptidet eller saltet.

Sammenkoblingen av de enkelte fragmentene kan fortsettes

ved hjelp av acylazidmetoden (J.Honzel, et al, Coll. Czech. Chem. Comm. , ,26/2333 (1971) , ved DCC/HBT-sammenkobling

eller ved andre sammenkoblingsteknikker med racemerisering av fritt fragment. Forbindelse ( 2) er kjent: A.S.Dutta,

et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379, og forbindelse (1) kan fremstilles ved fremgangsmåter som er analoge med de i eksempel 1. Forbindelse ( 3) fremstilles fra (2) ved å fjerne Cbz og nitrogruppene ved hydrogenolsye, etterfulgt av sammenkobling med N-Boc-N,N<1->guanido-dietyl-D-homoarginin under anvendelse av DCC/HBT eller andre sammenkoblingsmidler som er kjent innen teknikken. Se Dutta, et al, nevnt ovenfor, vedrørende en lignende LHRH-analog syntese.

Fragmentene som sammenkobles på denne måten vil ofte være peptider eller aminosyrer. Alternativt kan nonapeptidsyren i N-enden fremstilles ved fastfase- eller oppløsningsfrem-gangsmåten og deretter sammenkobles med semikarbazid-HCl ved hjelp av dicykloheksylkarbodiimiddehydroksybenzotriazol-fremgangsmåten eller andre sammenkoblingsfremgangsmåter.

Eksempel 4

A. En oppløsning av 0,1 g av hydrogenfluoridsaltet av

N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2

(se eksempel 1) oppløses i 50 ml vann og sendes gjennom en kolonne med 50 g Dowex 3 anionbytterharpiks som tidligere var blitt filibrert med eddiksyre og vasket med deionisert vann. Kolonnen elueres med deionisert vann og effluenten lyofiliseres hvorved man får det tilsvarende eddiksyresaltet av N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, ['.a] 25 -15,4° (C 1, HOAc) .

Ved å gjenta det ovenfor beskrevne, men erstatte eddiksyre med andre syrer under ekvilibreringen av harpiksen, kan det f.eks. erholdes de tilsvarende saltene med saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre, benzosyre og lignende.

På lignende måte kan det fremstilles syreaddisjonssalter av de andre peptidanalogene til LHRH, slik det her er beskrevet.

B. I tilfellet med salter med lav vannoppløselighet,

kan disse fremstilles ved utfelling fra vann under anvendelse av den ønskede syre. F.eks.: Zinktannatsalt - en oppløsning av 10 mg N-Ac-L-Pro-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2eddiksyresalt i<:>0,l ml vann ble behandlet med en oppløsning av 8 mg garvesyre i 0,08 ml 0,25 M NaOH. En oppløsning av 5 mg ZnS04heptahydrat i 0,1 ml vann ble øyeblikkelig tilsatt

til oppløsningen av LHRH-analogen.

Den resulterende suspensjon ble fortynnet med 1 ml vann og utfellingen ble frasentrifugert. Supernatanten ble dekantert og resten ble vasket to ganger med 1 ml store porsjoner vann med sentrifugering av utfellingen og dekantering av supernatanten. Utfellingen ble tørket under vakuum hvorved man fikk 15 mg av det blandede zink-tannatsaltet av den ovenfor nevnte LHRH-analogen.

Pamoatsalt. Til en oppløsning av 50 mg av eddiksyresaltet

av N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2i en blanding med 1,6 ml etanol og 0,1 ml 0,25 M NaOH ble det tilsatt en oppløsning av 11 mg enbonsyre i 0,3 ml 0,25 M NaOH. Oppløsningsmidlene ble fjernet ved redusert trykk og resten ble suspendert i 2 ml vann, sentrifugert og supernatanten ble fradekantert. Utfellingen ble vasket med 1,5 ml H20, frasentrifugert og supernatanten ble dekantert. Utfellingen ble tørket under vakuum, hvorved man fikk 54 mg

av pamoatsaltet av den ovenfor nevnte LHRH-analogen.

På lignende måte kan andre salter med lav vannoppløselighet fremstilles.

C. Fremstilling av syreaddisjonssalt fra fritt peptid.

Til en oppløsning av 50 mg av N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2som den frie base tilsettes 30 ml IN eddiksyre. Den resulterende oppløsning lyofiliseres hvorved man får 50 mg av eddiksyresaltet av den ovenfor nevnte forbindelse [a]<25->15,4° (C 0,5, HOAc).

På lignende måte ble det ved å erstatte eddiksyre med

andre syrer ( i støkiometrisk ekvivalente mengder i forhold til peptid) erholdte andre syreaddisjonssalter av de her nevnte peptidene, f.eks. saltene med saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre. D. Fremstilling av salt med metallkation, f.eks. zinksalt.

Til en oppløsning av 50 mg av eddiksyresaltet av N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2i

en blanding av 0,4 ml 0,25 m NaOH, 0,3 ml vann og 1 ml etanol ble det tilsatt en oppløsning på 15 mg ZnSO^heptahydrat i 0,2 ml vann. Utfellingen ble sentrifugert og supernatanten ble dekantert fra. Utfellingen ble vasket med 1 ml vann ved sentrifugering og dekantering av supernatanten. Utfellingen

ble tørket under vakuum hvorved man fikk zinksaltet av den ovenfor nevnte LHRH-analogen.

På en lignende måte kan salter med andre flervalente

kationer, f.eks. kalsium, vismut, barium, magnesium,

aluminium, kobber, kobolt, nikkel, dadmium og lignende fremstilles.

Eksempel 5

En oppløsning av 50 mg av eddiksyresaltet av N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2i 25 ml vann sendes gjennom en 50 g kolonne med Dowex 1 (sterkt basisk, kvaternært ammoniumanionbytterharpiks). som var blitt ekvilibrert med NaOH-oppløsning for å tilberede den med det motsatte ionet hydroksyd. Kolonnen elueres med 150 ml vann og eluanten lyofiliseres hvorved man får 45 mg av det tilsvarende polypeptidet som den frie base.

På lignende måte kan andre syreaddisjonssalter av forbindelser av de her nevnte peptidene, f.eks. de som er nevnt i eksempel 6, omdannes til de tilsvarende frie baser.

Eksempel 6

Det følgende er typiske farmasøytiske preparater som inneholder som aktiv bestanddel en LHRH-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal (2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, som sådan eller som

et farmasøytisk akseptabelt salt, f.eks. eddiksyreaddisjons-saltet, zinksaltet, zinktannatsaltet, etc.

A. Gablettpreparater for bukal (f.eks. sublingual) administrering:

Fremstillingsfremgangsmåte.

a. LHRH-antagonist oppløses i vann, i en tilstrekkelig mengde til å danne et vått granulat når den blandes med sukkerdelen av bindemidlene. Etter fullført sammenblanding, tørkes granulatet på en brett- eller fluid-bed-tørker.

Det tørre granulatet siktes deretter for å bruke opp eventuelle store aggregater og så blandes det med de gjenværende bestanddelene. Granulatet presses deretter på en standard-tablettmaskin til den bestemte tablettvekt.

b. Ved denne fremstillingsfremgangsmåten omfatter alle preparatene 0,01% gelatin, USP. Gelatinet oppløses først i det vandige granuleringsoppløsningsmidlet etterfulgt av LHRH-analogen. De gjenværende trinnene er de samme som i (a) ovenfor.

Preparat 4 kan også brukes som en tablett for oral administrering .

B. Intramuskulære injiserbare preparater med langtids-virkning .

1. Langtidsvirkende intramuskulær injiserbar sesamolj egel

Aluminium-monostearatet blandes med sesamoljen og

varmes opp til 125°C med omrøring inntil en klar gul opp-løsning dannes. Denne blandingen autoklaveres så for sterilisering og foravkjøles. LHRH-analogen tilsettes så aseptisk ved triturering. Særlig foretrukne LHRH-analoger er salter med lav oppløselighet, f.eks. zinksalter, zinktannatsalter, pamoatsalter og lignende. Disse oppviser usedvanlig lang aktivitetsvarighet.

2. Langtidsvirkende intramuskulær injiserbar, biologisk nedbrytbare polymere mikrokapsler

Mikrokapsler (0-150 ) av det ovenfor nevnte preparatet suspendert i: 25 mg mikrokapsler suspenderes i 1,0 ml av hjelpeoppløsningen.

C. Vandig oppløsning for intramuskulær injeksjon

Oppløst gelatin og LHRH-antagonist i vann for injisering, steriliserer deretter filteroppløsning.

D. Preparat for rektal administrering

Suppositorium hjelpemiddel for rektal administrering

LKRH-antagonisten blandes med det smeltede "Witepsol H15", blandes godt og helles over i 2 g's former.

Eksempel 7

Biologisk aktivitet

Den nyttige aktiviteten til forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse illustreres ved hjelp av de følgende resultatene erholdt ved standard anti-eggløsningsprøven til A. Corbin and C.W. Beattie, Endoch. Res. Commun. Vol. 2, page 1, 1975.

Eksempel S

Kjennetegnende data for forbindelser fremstilt ifølge eksemplene ovenfor er vist nedenunder:

Fysikalske data

1. sp. 157-160°. Se anm. 2. Aminosyreanalyse (909):

Ser, 0,82 (1); Pro, 1,12 (1); Ala, 1,14 (1); Leu, 116(1);

Tyr, 0,83 (1); NH3, 2,58; Arg, 0,88 (1); D-pCl-Phe+Trp, 2,34 (3); D-Dih, 1,15(1). 2. Sp. 144-150°; [a]25-24,0° (c 0,3, HOAc). Beregnet for<C>73<H>104N17°17<F>(1510,75): c'58,04; H, 6,94; N, 15,76. Funnet (143316): C, H lav aminosyreanalyse (924): Ser, 0,87 (1); Pro, 2,08 (2); Gly, 1,01(1); mono-isopropyl Arg, 0,85 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,90 (1); NH^, 1,33 (1); Arg, 1,06 (1); D-pF-Phe, 0,91 (1); D-Nal(2), 1,09 (1). 3. Sp. 144-148°; [a]<25>-15,4° (c 0,32,HOAc). Beregnet for<C>76H110<N>17°17F (1552'83): c'58,78; H, 7,14; N, 15,33. Funnet (144251): C, H lav aminosyreanalyse (923): Ser, 0,94 (1); Pro, 2,05 (2); Gly, 1,00(1); D-Dia, 0,85 (1); Leu,

1,03 (1); Tyr, 0,96 (1); NH^, 1,27; Arg, 1,01 (1);

D-pF-Phe, 0,95 (1); D-Nal(2), 1,06 (1).

4. Sp. 145-150°; [et]<25>-18,1° (c 0,83, HOAc). Se anm.2. Aminosyreanalyse (925: Ser, 0,91 (1); Pro, 2,09 (2); Leu, 1,05 (1); Tyr, 0,84 (1); NH^, 0,41; Arg, 1,11 (1); D-pF-Phe, 0,91 (1); D-Nal(2), 0,95 (1); mono-isopropyl Arg, 0,74 (1). 5. Sp. 137-142°; [a]<25>-16,5° (c 0,2, HOAc). Beregnet for<C>76<H>111<N>16°16<F>(1523,83): c'59,90; H, 7,34; N, 14,71. Funnet (143315): C, H lav aminosyreanalyse(926) : Ser, 0,91 (1); Pro, 2,25 (2); Leu, 1,05 (1); Tyr, 0,93 (1);

NH3, 0,67; Arg, 1,01; D-pF-Phe, 1,00 (1); D-Nal(2), 1,05 (1); D-Dia, 0,86(1).

6. Sp. 152-155°; [a]<25>-15,2° (c 0,2, HOAc). Beregnet for C85<H>116<N>17°17<F>(1667>:C'61'24?H'7,01; N, 14,28. Funnet (143304) : C, H lav aminosyre-analyse (939) : Ser, 0,94 (1); Pro, 1,11 (1); Gly, 1,02 (1); Leu, 1,02 Cl); Tyr, 0,90 (1); NH3,1,45 (1); Arg, 1,06 (1); D-pF-Phe, 0,94 (1); D-Dph, 1,06 (1); D-Nal(2), 2,32 (2). 7. Sp. 135-142°; [ a]^ 5 -26,5° (c 0,23, HOAc). Beregnet for<C>77<H>112<N>17017F (1566,26): C, 59,02; H, 7,20; N, 15,20. Funnet (143303): C, H lav aminosyre-analyse (940):

Ser, 0,88 (1); Pro, 2,02 (2); Gly, 1,03 (1); Leu,

1,00 (1); Tyr, 0,88 (1); NH^, 1,61; Arg, 1,08 (1); D-pF-Phe, 0,92 (1); D-Dph, 1,08 (1); D-Nal(2), 0,91 (1). 8. Sp. 170-172°; [a]<25->17,5° (c 0,37, HOAc). Beregnet for C80H114N18°17°17C12 (1670'82) : -C, 57,51; H, 6,88;

N, 15,09. Funnet (143294): C, H lav aminosyreanalyse

(945): Ser, 0,88 (1); Pro, 1,09 (1); Ala, 0,88 (1);

Leu, 1,01 (1); Tyr, 0,92 (1); NH^, 1,76; Trp, 0,41 (1);

Arg, 1,19 (1); D-pCl-Phe, 1,84 (2); D-DpH, 0,97 (1). Anm: Trp adskilles ikke lett fra D-pCl-Phe.)

9. Sp. 165-170°; [a]<25>-25° (c 0,43, HOAc). Beregnet for<C>79<H>112N18°17C12(1656'2); c'57,27; H, 6,81; N, 15,22. Funnet (142675): C, H lav aminosyreanalyse (981): Ser, 0,83 (1); Pro, 0,93 (1); Ala, 1,01 (1); Leu, 1,02 (1); T(y1r); , 0D-,p9C4 l-(P1h)e; , NH1^,9, 4 1,(128 )1; (1D)-; DpThrp, , 10,1,96 7(1(l)).<1>; Arg, l,o3 o 25 10. Sp. 142-150 ; [ct]D Opak oppløsning i HOAc. Beregnet for<C>82<H>113<N>18°17<F>(1641'93)= c'59,98; H, 6,94; N, 15,35. Funnet (143302): C, H lav aminosyreanalyse (953B): Ser, 0,95 (1); Pro, 0,93 (1); Gly, 1,10 (1); Leu, 1,09 (1);

Tyr, 0,87 (1); D-pF-Phe, 0,223 (1); NH^, 2,87; Trp, 0,413 (1); Arg, 0,94 (1); D-Dph, 1,25 (1); D-Nal(2), 1,06 (1). (Anm.: D-pF-Phe-verdier er lave) 11. Sp. 142-152°. Se anm. 2.

Aminosyreanalyse (952): Ser, 0,83 (1); Pro, 0,95 (1);

Gly, 0,97 (1); Leu, 1,06 (1); Tyr, 0,96 (1); NH^, 3,17;

Trp, 0,66 (1); Arg, 1,01 (1); D-pF-Phe, 0,78 (1);

D-Dph, 1,22 (1); D-Nal(2), 1,27 (1). 12. Sp. 140-142°; [ct]<25>-14,3° (c 0,14, HOAc). Beregnet for<C>82<H>118N18°13C12*4 CH3C00H' 3 H2° d929-14): C, 56,03; H, 7,31; N, 13,07. Funnet (141592): C, 55,75;

H, 6,93; N, 12,76. Aminosyreanalyse (987): Ser, 0,87 (1);

Pro, 1,09 (1); Ala, 1,08 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,94 (1);

NHV 1,43; Trp, 0,88 (l)<1>; Arg, 0,97 (1); D-pCl-Phe, 1,76 (2) 1; D-Dhh kommer ikke ut av kolonnen selv etter 340 min. 13. Sp. 145-148°; [a]<25>-4,17° (c 0,11, HOAc). Beregnet for<C>79<H>121<N>18°18<F>(]-629, 96): C, 58,21; H, 7,48; N, 15,46. Funnet (142506): C, H lav aminosyreanalyse (963B): Ser, I, 77 (2); Pro, 1,15 (1); Gly, 1,07 (1); Leu, 1,01 (1);

Tyr, 0,96 (1); NH^, 1,26; Trp, 0,73 (1); Arg, 1,01;

D-pF-Phe, 0,81 (1).

14. Sp. 147-151°; [a]25 -27,3° (c 0,51,HOAc). Beregnet for<C>89<H>127<N>18°17F d740,12): C, 61,43; H, 7,36; N, 14,49. Funnet (142505): C, H lav aminosyreanalyse (964B): Ser, 1,00 (1); Pro, 1,11(1); Gly, 1,03 (1); Leu, 1,03 (1);

Tyr, 0,95 (1); NH^, 1,24 (1); Trp, 0,80 (1); Arg, 0,99 (1); D-pF-Phe, 0,87 (1); D-Nal(2), 0,85 (1). 15. Sp. 155-158°; [ a]^ 5"26° (c 0,44, HOAc). Beregnet for C77<H>108N18°17C12(1528,74): C, 56,78; H, 6,68; N, 15,48. Funnet (142479): C, H lav aminosyreanalyse (975): Ser, 0,88 (1); Pro, 0,97 (1); Gly, 1,01 (1); Leu, 0,99 (1);

Tyr, 0,97 (1); NH^, 1,19; Trp, 0,926 (l)<1>; Arg, 1,03 (1);

D-pCl-Phe, 1,85 (2)<1>; D-Deh, 1,28 (1).

16. Sp. 152-155°; [cx]<25>-32,6° (c 0,26, HOAc). Beregnet for C81<H>111<N>18°17<F>(1628): C, 59,76; H 6,87; N, 15,49. Funnet (142431): C, H lav aminosyreanalyse (966): Ser, 0,93 (1); Pro, 0,99 (1); Gly, 1,10 (1); Leu, 0,94 (1); Tyr, 0,94 (1); NH^, 1,19; Trp, 0,76 (1); Arg, 1,02 (1); D-pF-Phe, 0,92 (1); D-Deh, 1,23 (1); D-Nal(2), 0,95 (1). 17. Sp. 155-157°; [a]25 -18,4° (c 0,27, HOAc). Beregnet for<C>78<H>110N13°17°17C12d642,76): C, 57,03; H, 6,75; N, 15,35. Funnet (143293): C, H lav aminosyreanalyse (997): Ser, 0,89 (1); Pro, 0,97 (1); Ala, 0,98 (1); Leu, 1,03 (1); TDy-prC, l0-P,h9e9 , (11),8; 6 NH(^2), 11; ,D3-4D; eThr, p1, ,O17 ^(11); . Arg, 1,00 (1); 18. Sp. 158-160°; [et] 25 -29, 3° (c 0,41, HOAc). Beregnet for<C>81<H>111<W>18°17<C>1 d-644 ,36): C, 59,16; H 6,80; N, 15,33. Funnet (143809: C, H lav aminosyreanalyse (1014): Ser, 0,92 (1); Pro, 1,02 (1); Gly, 1,02 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,99 (1);NH3, 1,26; Trp, 0,83 (1); Arg, 0,98 (1); D-pCl-Phe, 0,98 (1); D-Deh, 1,16 (1); D-Nal(2), 0,96 (1). 19. Sp. 154-157°; [ct]^<5>-21,6° (c 0,25, HOAc). Beregnet for<C>82H113N18°17C1 deSS,38): C, 58, 39; H, 6,87; N, 15,20. Funnet (144272): C, H lav aminosyreanalyse (1022): Ser, 0,95 (1); Pro, 1,08 (1); Ala, 0,99 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 1,01 (1); NH^, 1,34; Trp, 0,85 (1); Arg, 0,97 (1); D-pCl-Phe, 1,18 (1); D-Deh, 1,17 (1); D-Nal(2), 1,00 (1). 20. Sp. 150-155°; [et]<25>-17,9° (c 0,25, HOAc). Beregnet f°r C80H115N19°17C12 (1685,84): C, 56,99; H, 6,87;

N, 15,79. Funnet (143292): C, H lav aminosyreanalyse

(995): Ser, 0,86 (1); Pro, 1,08 (1); Gly, 1,04 (1);

Leu, 0,97 (1); Tyr, 0,91 (1); NH^, 1,32; Trp, 0,31 (1);

Arg, 0,99 (1); D-pCl-Phe, 1,34 (2); D-Wsh kommer ikke ut av kolonnen selv etter 340 min. 21. Sp. 150-154°; [a]2<5>-23,3° (c 0,55, HOAc). Beregnet for C34<H>118<N>19°17<F>(1685) :C'59,88; H, 7,06; N, 15,79. Funnet (143295): C, H lav aminosyreanalyse (996): Ser, 0,87 (1); Pro, 0,94 (1); Gly, 1,05 (1); Leu, 0,99 (1);

Tyr, 0,95 (1); D-pF-Phe, 0,90 (1); NH^, 1,34; Trp,

0,68 (1); Arg, 1,00 (1); D-Nal (2), 0,346 (1); D-Wsh kommer ikke ut av kolonnen selv etter 340 minutter.

22. Sp. 164-166°; [a]25 -12,7° (c 0,3 HOAc). Beregnet for C76H106N18°17C12 (1614,72): C, 56,53; H, 6,62; N, 15,61. Funnet (143660): C, H lav aminosyreanalyse

(1011) : Ser, 0,93 (1); Pro, 1,07 (1); Ala, 1,03 (1);

ALergu, , 11,,010 1 ((11)); ; TDy-prC, l0-P,h9e7 , (11),9 ; N(H2^)1, ; 1D,-2D7m; hT, rp1, ,101 ,9(15 ).(l)1; 23. Sp. 160-164°; [a]25 -26,5° (c 0,29, HOAc). Beregnet for<C>79<H>107N18°17<F>(1600):C, 59,31; H, 6,74; H, 6,74;

N, 15,76. Funnet (143658): C, H lav aminosyreanalyse

(1012) : Ser, 0,87 (1); Pro, 1,06 (1); Gly, 1,00 (1);

Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,98 (1); NH^, 1,31; Trp, 0,87 (1);

Arg, 1,08 (l)<1>; D-pF-Phe, 1,25 (1);-D-Dmh 1,0a1; D-Nal (2), 0,89 (1). 24. Sp. 160-165°; [a]<25>-12,2° (c 0,29, HOAc). Beregnet for<C>76<H>104<N>18°17C12(1612,7): C, 56,60; H, 6,50; N, 15,60. Funnet (143659): C, H lav aminosyreanalyse (1010): Ser, 0,94 (1); Pro, 1,14 (1); Ala, 1,01 (1); Leu, 0,97 (1); TDy-prC, l0-P,h9e6 , (12),0; 0 NH(^2), 11; ,D2-3D; hTir, p0, ,199 ,0c()11); Arg, 1,06 (1); 25. Sp. 172-174°; [a]<25>-29,8° (c 0,62, HOAc). Beregnet for C79<H>105<N>18°17<F>d598):c'59,38; H 6,62; N, 15,78. Funnet (143657) : C, H lav aminosyreanalyse (1013) : Ser, 0,89 (1); Pro, 1,07 (1); Gly, 1,00 (1); Leu, 0,99 (1); Tyr, 0,97 (1); NH^, 1,24 (1); Trp, 0,85 (1); Arg, 1,04 (1); D-pF-Phe, 0,98 (2); D-Nal(2), 0,92 (1); D-Dhi, 0,98 (1). 26. Sp. 162-164°; [(a] -18,7° (c 0,54,HOAc). 2<5>Beregnet for C75<H>104<N>l<g0>17Cl2(1600,69): C, 56,28;

H, 6,55; N, 15,75. Funnet (143808): C, H lav aminosyre-analyse (1015): Ser, 0,86 (1); Pro, 1,14 (1); Ala, 1,01 (1); Leu, 1,01 (1); Tyr, 0,99 (1); NH.,, 1,54; Trp, I, 02 (1) 1 ; Arg, 0,99 (1); D-pCl-Phe, 2,04 (2) 1; D-Dma, 1,02 (l)<1>.

Anmerkninger

Topper lar seg ikke lett skille fra hverandre og

angitte verdier er gjennomsnittet for de to toppene.<2>Optisk rotasjon og elementæranalyse ble ikke utført på grunn av mangel på tilstrekkelig materiale.

Følgende forbindelser ble også fremstilt: N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Trp-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2;

N-Ac-D-Trp-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2-

Claims

1. Fremgangsmåte for å fremstille en forbindelse med formel

og de farmasøytisk akseptable saltene derav, hvor: A er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-pyroglutamyl, D-pyroglutamyl, N-acyl-D,L-tryptofanyl, N-acyl-glycyl, N-Ac-D,L-/\3 ' 4-prolyl, N-Ac-D, L-prolyl, N-Ac-L-alkylprolyl, N-Ac-D,L-fenylalanyl, N-Ac-D,L-p-klorfenylalanyl N-Ac-D,L-seryl, N-Ac-D,L-treonyl, N-Ac-D,L-alanyl, 3-(1-naftyl)-D,L-alanyl, 3- (2-naftyl)-D,L-alanyl, 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D,L-alanyl, 3-(4-trifluormetylfenyl)-D,L-alanyl, 3-(9-antryl)-D,L-alanyl, 3-(2-fluorenyl)-D,L-alanyl og 3-(Het)-D,L-alanyl hvor Het er en heterocyklisk aryl- gruppe som inneholder et radikal valgt fra

hvor A" og A' uavhengig av hverandre er valgt ut fra gruppen bestående av hydrogen, laverealkyl, klor og brom, og G er valgt fra gruppen bestående av oksygen, nitrogen og svovel; B er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av D-fenylalanyl, D-p-Cl-fenylalanyl, D-p-F-fenylalanyl, D-p-nitrofenylalanyl, 3-(3,4,5-trimetoksyfenyl)-D-alanyl, 2, 2-difenylglycin, D-cx-metyl-p-Cl-f enylalanin og 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl; C er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-tryptofanyl, D-tryptofanyl, D-fenylalanyl, D-Me^ fenylalanyl, 3,(2-pyridyl)-D-alanyl, 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, 3-(4-pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-naftyl)-D-alanyl og 3- (2-naftyl)-D-alanyl; D er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-seryl og D-alanyl; E er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-fenylalanyl og L-tyrosyl; F er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av radikalene med de følgende strukturformler:a)

hvor n er 1 til 5, er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, -NRR^ hvor R er hydrogen eller alkyl med 1 til 4 karbonatomer, R^ er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, cykloalkyl, fenyl, benzyl, -(CH2 )n _morfolino eller -(CH2 )n N(R^ )2 hvor n er 1 til 5 og R^ er laverealkyl; R2 er hydrogen eller R^ ; eller R^ og R2 utgjør en ring med de følgende strukturformler:

hvor n er 1 til 7; A er hydrogen, alkyl med 1 til 6 karbonatomer eller cykloalkyl; og X er halogen eller A ellerb)

hvor er alkyl med 1 til 6 karbonatomer, benzyl, fenyletyl, cykloheksyl, cyklopentyl; og Rg, R^ og Rg er hydrogen eller alkyl med 1 til 4 karbonatomer; og n er et helt tall fra 2-5; ellerc) en substituent med formelen

hvor Rg er hydrogen, alkyl med 1 til 12 karbonatomer, fenyl eller fenyllaverealkyl; G er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-leucyl, L-norleucyl og L-norvalyl; H er D-alaninamid, D-leucinamid, glycinamid eller -NHR^ hvor R,- er laverealkyl, cykloalkyl, fluorlaverealkyl eller -NHCONH-R-^q hvor R^ er hydrogen eller laverealkyl; og de farmasøytisk akseptable saltene derav, karakterisert ved å. fjerne beskyttende grupper og eventuelt kovalent bundet fast bærer fra et beskyttet polypeptid for å tilveiebringe en forbindelse m<i ed formel (I) elle■r et salt derav, eller koble sammen i den krevede rekkefølge to fragmenter av den ønskede forbindelse med formel (I) , e^I^n^"rø£ im tfVf &ta^" ^J ^V^mdann^en—f xb±nåe~ l' se~ laéd fb rmel (I) et farmasøytisk akseptabelt salt, eller "H b^ <7> omdanne}~et salt "av en forbindelse ^med formel (I) til et farmasøytisk akseptabelt •■ salt, eller tofp dekomponerejjet salt av en forbindelse med formel (I) til et fritt polypeptid med formel (I).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å fremstille en forbindelse med formel

og de farmasøytisk akseptable saltene derav, hvor: A er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av N-Ac-D,L-£ 3 ' 4-prolyl, N-Ac-D,L-proly1,N-Ac-L-alkylprolyl, N-Ac-D,L-fenylalanyl, N-Ac-D,L-p-klorfenylalanyl, N-Ac-D,L-seryl, N-Ac-D,L-treonyl, N-Ac-D,L-alanyl, 3-(l-naftyl)-D,L-alanyl, 3-(2-naftyl)-D,L-alanyl, 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D,L-alanyl og 3-(4-trifluormetyl-fenyl)-D,L-alanyl, B er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av D-f f enylalanyl, D-p-Cl-f enylalanyl, D-p-F-f enylalanyl, D-p-nitrofenylalanyl, 3-(3,4,5-trimetoksyfenyl)-D-alanyl, 2,2-difenylglycyl, D-a-mety1-p-Cl-fenylalanyl og 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl; C er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av D-tryptofanyl, D-fenylalanyl, D-Me^ fenylalanyl, 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-naftyl)-D-alanyl, og 3-(2-naftyl)-D-alanyl: D er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-seryl og D-alanyl; E er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-fenylalanyl og L-tyrosyl; F er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av radikalene med de følgende generelle formler:a)

hvor n er 1 til 5; er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, -NHR^ hvor R^ er alkyl med 1 til 12 karbonatomer, cykloalkyl, fenyl, benzyl, morfolino eller -(CH„) N(R. )„ hvor n er 1 til 5 og R. er lavere 2 n 4 2 4 alkyl; 1*2 er hydrogen eller R^ , eller R^ og R2 utgjør til- sammen en ring med de følgende generelle formler:

hvor n er 1 til 7, A er hydrogen, alkyl med 1 til 6 karbonatomer eller cykloalkyl, og X er halogen eller A, ellerb)

hvor Rj- er alkyl med 1 til 6 karbonatomer, benzyl, fenyletyl, cykloheksyl, cyklopentyl, og Rg, R^ og Rg er hydrogen eller metyl, og n er et helt tall fra 2-5, ellerc) en substituent med formelen

hvor Rn er hydrogen, alkyl med 1 til 12 karbonatomer, fenyl eller fenyllaverealkyl, G er en aminoacylrest valgt fra gruppen bestående av L-leucyl, L-norleucyl og L-norvalyl, H er D-alaninamid, D-leucinamid, glycinamid eller -NHR5 hvor R^ er laverealkyl eller -NHCONH2 .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse hvor F er N,N'-guanido-disubstituert-D-argininyl eller D-homoargininyl.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse hvor A er N-Ac-L-Pro, N-Ac-D-Ser, N-Ac-D-p-Cl-Phe, N-Ac-D-Nal(2), B er D-p-F-Phe eller D-p-Cl-Phe, C er D-Trp, D-Nal(2), D-3Pal eller D-Phe, D er Ser, E er Tyr, F er forbindelsen med formel II, hvor n er 3 eller 4, R^ er alkyl med 1 til 8 karbonatomer eller cykloheksyl og R2 er hydrogen, eller en forbindelse, med formel II hvor R^ er -NHR^ , hvor R^ er metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-heksyl eller cykloheksyl og R2 er R^ eller hydrogen eller F er en forbindelse med formel II hvor R^ og R2 er dihydroimidazolinyl, eller F er en forbindelse med formel (I V) eller (V) hvor Rg er hydrogen, metyl, pentyl eller benzyl, og H er D-AlaNH2 , GlyNH2 eller NHEt.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse hvor A er N-Ac-L-Pro, N-Ac-D-Nal(2) eller N-Ac-D-p-Cl-Phe, B er D-p-F-Phe eller D-p-Cl-Phe, C er D-Nal(2), D-Trp, D-3Pal eller D-Phe, D er Ser, E er Tyr, F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh eller D-Dhi og H er D-AlaNH2 GlyNH2 eller NHEt.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 , hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh, D-Dhi, D-Prh eller D-Hha.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakter <:> isert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-L-Pro-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-NHEt, hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh, D-Dhi, D-Prh eller D-Hha.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 , hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhi, D-Dhh, D-Prh eller D-Hha.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 .

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 .

11. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 , hvor F er D-Dmh,D-Deh, D-Dph, D-Dhh, D-Dhi, D-Prh, D-Hha eller propylamidin.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 .

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 .

14. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2 , hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhi, D-Dhh, D-Prh eller D-Hha.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2 .

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2 .

17. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved å fremstille N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2 , hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh eller D-Dhi.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved å fremstille forbindelsen N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2 .

19. Fremgangsmåte for å fremstille en forbindelse med formel (II):

hvor n er 1 eller 2 og de andre variable symbolene er som definert i krav 1, n er 3, er alkyl med 2 til 12 karbonatomer eller slik som ellers definert i krav 1, og de andre variable symbolene er som definert i krav 1, eller n er 4 eller 5 og de andre variable symbolene er som definert i krav 1, karakterisert ved å guanylere det tilsvarende amin.