NO831112L

NO831112L - Fremgangsmaate for fremstilling av blodtrykkssenkende midler

Info

Publication number: NO831112L
Application number: NO831112A
Authority: NO
Inventors: James Walter Ryan; Alfred Chung
Original assignee: Univ Miami
Priority date: 1980-03-10
Filing date: 1983-03-28
Publication date: 1981-09-11
Also published as: JPH0667902B2; ES519564A0; NO156695B; GR74795B; JPH01250344A; ES8403449A1; KR850001629B1; AU7363181A; ES8403450A1; JPH01246257A; NO831111L; PT72635A; FI810725L; PL230076A1; EP0038117A1; ES500254A0; ES8305698A1; ES519567A0; ES8403104A1; PT72635B

Description

Det angiotensin-omdannende enzym (peptidyldipeptidhydrolase, heretter betegnet som ACE) inntar en sentral rolle i fysio-logien omkring hypertensjon. Enzymet er i stand til å om-danne dekapeptidet angiotensin I, som har følgende amino-syresekvens:

AspArgValTyrlleHisProPheHisLeu

til et oktapeptid, angiotensin II, ved at det katalyserer hydrolysen av angiotensin I's nest siste peptidbinding, hvorved man frembringer en fjerning av karboksyl-sluttgruppen HisLeu.

Forskjellige kjemiske forbindelser som inngår i den etter-følgende forklaring, er angitt i den nedenstående tabell med sine forkortelser:

ACE = angiotensin-omdannende enzym

Ala = L-alanin

Arg = L-arginin

Asp = L-aspartinsyre

Boe = t-butyloksykarbonyl

Bpoc = 2-(4-bifenyl)-2-propyloksykarbonyl

Bz = benzoyl

Cbo = benzyloksykarbonyl

Ddz = N-a,a-dimetyl-3,5-dimetyloksykarbonyl

Gly = glycin

His = L-histidin

Ile = L-isoleucin

Leu = L-leucin

Phe = L-fenylalanin

Ppoc = 2-fenylisopropyloksykarbonyl

Pro = L-prolin

APro = L-3,4-dehydroprolin

Ser = L-serin

Trp = L-tryptofan

Tyr = L-tyrosin

Val - L-valin

Angiotensin II er et meget sterkt blodtrykkshevende middel.

I tillegg til sin direkte blodtrykkshevende virkning, så stimulerer også angiotensin II frigjøring av aldosteron som har en tendens til å heve blodtrykket ved at det holdes tilbake ekstracellulære salter og væsker. Angiotensin II finnes i målbare mengder i blodet hos normale mennesker. Det finnes imidlertid i forhøyede konsentrasjoner i blodet hos pasienter med nyrehypertensjon.

Nivået av ACE-aktivitet er vanligvis i overskudd, både i normale pasienter og i pasienter med hypertensjon, i forhold til den mengde som er nødvendig for å opprettholde det observerte nivå av angiotensin II. Man har imidlertid funnet at det skjer en betydelig blodtrykkssenkning i hyper-tensive pasienter når disse behandles med ACE-inhibitorer [Gavras, I., et al., New Engl. J. Med. 291, 817 (1974)].

Den rolle som ACE synes å ha i patogenesen for hypertensjon har gjort at man lenge har forsket for å finne inhibitorer for enzymet som kunne virke som blodtrykkssenkende midler.

Se f.eks. US-patentene 3.891.616, 3.947.575, 4.052.511 og 4.053.651. Reaktiviteten på ACE varierer markert avhengig av substratet. Mange peptider som kalles inhibitorer for den enzymatiske omdannelsen av angiotensin I til angiotensin II, er i virkeligheten substrater som har en lavere Michaelis-konstant (Km) enn angiotensin I. Slike peptider bør mer korrekt kalles konkurrerende substrater.

Tallrike syntetiske peptid-derivater har vist seg å være ACE-inhibitorer, se Ondetti et al, i US-patent 3.832.337 utstedt 27. august 1974. En meget effektiv inhibitor med høy biologisk aktivitet når den tilføres oralt, er D-3-merkapto-2-metylpropanoyl-L-prolin, betegnet SQ14225, beskrevet i US-patent 4-046.889 til Ondetti et al, utstedt 6. desember 1977, og beskrevet i forskjellige vitenskapelige artikler av Cushman, D.W. et al, Biochemistry ljj, 5484 (1977) og av Ondetti, M. et al, Science 196, 441 (1977). Inhibitoren SQ14225 har vært rapportert å ha en I^^-verdi på 2,3x10 -8M. Den I^0-verdi som er angitt av Cushman, et al, er den konsentrasjon av inhibitor som er nødvendig for å gi en 50% hemming av enzymet under et standardprøvesystem som inne-holder et substrat ved et nivå vesentlig ' over K m. Det er underforstått at I5Q-verdiene lar seg direkte sammenligne, når man holder alle de virksomme faktorer som påvirker reaksjonen konstante. Disse faktorer innbefatter opprinn^else av enzym, dets renhet, det anvendte substrat og dets konsentrasjon, samt sammensetningen på prøvebufferen.

Alle de 1,-Q-verdier som her er angitt, er utført i samme prøvesystem og med samme enzym (human urinær ACE), og med et omtrentlig \ K^-nivå av substrat, og resultatene lar seg derfor sammenligne.

Ved en analogi av det bedre kjente enzym karboksypeptidase A, har man utviklet en modell for den aktive posisjon i ACE og selve virkningsmåten for SQ14225. Det har vært postulert at den aktive posisjonen har en kationisk posisjon for binding av karboksylgruppen i substratet og en "lomme" eller "kløft" som er i stand til å binde sidekjeden på den C-terminale aminosyren, hvorved man får en spesiell sterk binding for den heterocykliske ringen på den terminale prolinrest. Det har vært postulert en lignende "lomme"

for den nest siste aminosyrerest, og publiserte data antyder et relativt strengt sterisk krav, ettersom D-formen av inhibitoren var vesentlig mer virksom enn sin stereoisomer eller 3-metyl eller andre usubstituerte analoger. Sulfhydrylgruppen på inhibitoren som har vært postulert å ha en aktiv posisjon nær det katalytiske sentrum, antas å spille en sentral rolle for inaktivering av enzymet ved en kombinasjon med den sinkgruppen som er vesentlig for den katalytiske aktiviteten. Substituenter på sulfhydrylgruppen slik som en metylgruppe, og S-acetylderivatet, reduserte i vesentlig grad inhibitorens virkning. Se Cushman, D.W., et al., Biochemistry, slik dette er angitt ovenfor.

In vitro-studier av den mekaniske ved hjelp av hvilken SQ14225 og dets analoger virker for å hemme ACE, har vært noe hindret ved at disse molekyler under vanlige betingelser har høy grad av ustabilitet. Man har f.eks. kunnet obser-vere at en frisk vandig oppløsning med en konsentrasjon på 1 mg pr. ml av SQ14225 ved en pH på 8, blir vesentlig mindre aktiv ved henstand i så lite som 30 minutter, og at aktiviteten fortsetter å synke etter hvert som oppløsningen står. Man antar at dette tap av aktivitet i vesentlig grad skyldes en dimerisering av SQ14225, som skjer ved sulfhydrylende-gruppene, hvorved det dannes et disulfid som i vesentlig grad er inaktivt som en inhibitor. Etter som den frie sulfhydrylgruppen er meget reaktiv og lett kan oksyderes til polare syregrupper, slik som sulfon- og sulfoksydgrupper,

så kan det også være at det observerte in vitro-tap av aktivitet i vandige oppløsninger av SQ14255 ved henstand til dels skyldes en eller flere slike oksydasjonsreaksjoner med dannelse av et sulfon eller sulfoksyd som ikke virker effektivt som en inhibitor for ACE.

I rapporter som hittil er tilgjengelige for klinisk prøving av SQ14225, og i visse av disse refereres forbindelsen til under dets varemerke."Captopril", antyder at produktet er tilstrekkelig stabilt i normale magesekk og tarmmiljø man finner hos de fleste pasienter til at midlet er en effektiv inhibitor for ACE når det tilføres oralt. Det er imidlertid ikke klart hvorvidt det er større eller mindre grupper av pasienter hvor SQ14225 i alt vesentlig er ineffektivt. På grunn av den høye reaktiviteten på den frie sulfhydrylgruppen, så vil SQ14225 lett kunne danne blandet disulfider med serum, cellulære proteiner, peptider eller andre forbindelser med frie sulfhydrylgrupper i det miljø som hersker i magesekken eller i tarmen, foruten muligheten for en dimerdannelse eller oksydativ nedbrytning. Et blandet disulfid med protein kan være antigenisk, og enkelte allergiske reaksjoner er også blitt observert klinisk. Se Gavras, et al, New England J. Med. 298, 991 (1978). Hvis det dannes disulfider og . oksydative nedbrytningsprodukter av SQ14225, så kan det i beste fall forventes å være i alt vesentlig ineffektive som inhibitorer. Det kan følgelig postuleres at dosereaksjonen for SQ14225 vil være variabel med hensyn til tilførselsmåte og for den enkelte pasient. Videre kan man hos enkelte pasienter forvente uønskede sideeffekter, og det kan være vanskelig å regulere en effektiv konsentrasjon av inhibitoren i kroppen.

Det er vanligvis vært antatt at tioesterforbindelser er høy-reaktivé ved at tioesterbindingen lett lar seg hydrolysere til en sulfhydrylgruppe og en karboksylisk gruppe. Tio-estere har følgelig ofte vært brukt som aktivte estermellom-produkter for acylering under milde betingelser. Slike grupper, f.eks. acetyltio har vært brukt som blokkerende grupper bl.a. i ovennevnte Ondetti et al. patent. Tioester-mellomproduktet har også vært angitt å opptre i biosyntesen av cykliske peptider slik som tyrocidin eller gramicidin S.

Se Lipamnn, F. i Accounts Chem. Res. J5, 361 (1973).

Forbindelser som er beslektet med SQ14225 er beskrevet av Ondetti et al., i US-patentene 4.046.889, 4.052.511, 4.053.651, 4.113.715 og 4.154.840. Det er her blant annet beskrevet interessante analoger av SQ14225 ved at den fem-atomære heterocykliske ringen i prolin er erstattet med ringer inneholdende fire eller seks atomer. Den hemmende virkning for slike analoger i forhold til SQ14225 er imidlertid ikke beskrevet. Hvis man bruker D-prolin istedenfor L-prolin, så reduserer dette drastisk den hemmende virkningen for 3-mer-kaptopropanoylaminosyrer (Cushman, D.W. , et al.., se ovenfor).

Til dags dato har man ikke bestemt effekten av.aminosyren

til venstre for svovelatomet i tioesterforbindelsene. Det har vært antatt at denne aminosyren .virker, som en ytterligere "gjenkjennelsesposisjon" for enzymet. Hvis dette er tilfelle, så skulle man forvente at en forbindelse med en aminosyre her kunne være en bedre inhibitor. Foreliggende søkere har funnet at.forskjellige aminosyrer er effektive, og at hydroksy-proliner, prolin-L- og D,L-3,4-dehydroprolin, tiazolidin-4-karboksylsyre og L-5-oksoprolinderivater alle er effektive som blodtrykkssenkende midler og har høy hemmende virkning for ACE.

Foreliggende oppfinnelse angår en rekke fremgangsmåter for fremstilling av forbindelser med følgende formel:

hvor R er hydrogen, tert-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glutamy1-L-lysyl, L-lysyl, L-

arginyl eller pyro-L-glutamyl, eller R<1>, hvor R<1>er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl eller cyklopentankarbonyl; A er fenylalanyl, alanyl, trytofyl, tyrosyl, isoleucyl, leucyl, glycyl, histidyl eller valyl, og ct-amino-gruppen i disse forbindelser er i amidbinding med R; R^er hydrogen eller metyl; R£ er L-prolin, L-3,4-dehydroprolin, D,L-3,4-dehydroprolin, L-3-hydroksyprolin,

L-tiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-okso-prolin, og

hvor iminogruppen i disse forbidnelser er i imidbinding med

den tilstøtende

n er 0 eller 1, slik at når n er 0, så er R^metyl; og når n=l og R^er metyl, så står -CH^

gruppen i D-konfigurasjon. Disse forbindelser er inhibitorer for ACE og kan brukes som oralt effektive blodtrykkssenkende midler.

Av hensiktsmessighetsgrunner er alle de etterfølgende fremgangsmåter beskrevet på bakgrunn av de trinn som er nødven-dig for å fremstille den forbindelsen hvor R er benzoyl, A er fenylalanyl, R^er metyl, R«er L-prolin og n er 1, dvs. N et -[3-N ol-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin. For fagfolk vil det imidlertid være underforstått at man lett kan fremstille andre forbindelser ved at man kan innføre andre forønskede grupper når dette måtte være passende istedenfor de som er brukt for å illustrere de foreliggende fremgangsmåter. Således kan man i alle de etterfølgende fremgangsmåter bruke L-3,4-dehydroprolin, D,L-3,4-dehydro-prolin, L-3-hydroksyprolin, L-4-hydroksyprolin, L-tiazolidin- 4-karboksylsyre eller L-5-okso-prolin istedenfor L-prolin i alle de fremgangsmåter som er beskrevet i det etterfølg-ende. Videre kan alle de aminosyrer som er angitt for A brukes istedenfor fenylalanin i.disse fremgangsmåter. Videre kan andre forønskede forbindelser fremstilles ved å utføre passende substitusjoner hvis intet annet er angitt nedenfor.

I den foretrukne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen blir 3-R^-tio-2-metylpropionsyre eller en ester av denne hvor

er Cbo, acetyl eller amino, oppløst for å danne 3-R^-tio-2- D-metylpropionsyre eller en ester av denne før man ut-fører en reaksjon med R-A.

3- benzoyltio-2-D-metylpropionsyre, som brukes som utgangs-forbindelse i de foreliggende fremgangsmåter for syntese av forbindelser med formel I, er kommersielt tilgjengelige fra Chemical Dynamics Corp., 3001 Hadley Road, South Plainfield, New Jersey.

I de følgende fremgangsmåter kan man bruke enhver hensikts-messig koplingsmetode;for de trinn hvor dette kreves i tillegg til de som er angitt. Eksempler på koplingsmetoder innbefatter: blandet anhydrid (MA), dicykloheksylkarbodiimid (DCC), azid, N-etyloksykarbonyl-2-etyloksy-l,2-dihydrokinolin (EEDQ), N-isobutyloksykarbonyl-2-isobutyloksy-l,2-dihydro-kinolin, symmetrisk anhydrid, Woodwards reagens K (N-etyl-5-fenylisooksazolium-3'-sulfonat) eller karbonyldiimidazol (CDI) metoder. For en oversikt over disse metoder og fremgangsmåter, se Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl) vol. XV, del II, s. 1 og etterfølgende (1974) .

På lignende måte kan man i de etterfølgende fremgangsmåter hvor man bruker en t-butyloksykarbonyl (Boe)-beskyttende gruppe, erstatte denne med enhver syrefølsom aminobeskyttende gruppe-, slik som 2-(4-bif enyl)-2-propyloksykarbonyl (Bpoc) . 2-fenylisopropyloksykarbonyl (Ppoc), benzyloksykarbonyl (Cbo) eller andre syrefølsomme N-aralkyloksykarbonyl-beskyttende grupper. Fjerning av de beskyttende grupper kan utføres på enhver kjent måte, f.eks. ved hjelp av trifluoreddiksyre (TFA) i anisol, HC1 i eddiksyre, kald trifluormetansulfon-syre eller metanolisk ammoniakk. Se Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), vol, XV, del I, s. 376 og de etter-følgende (1974) .

I.

Ifølge den foretrukne fremgangsmåte blir 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre omsatt med 2-metylpropen i nærvær av svovelsyre, hvorved man får 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester.

I det annet trinn blir så benzoylgruppen fjernet på vanlig måte, hvorved man får fremstilt 3-merkapto-2-D-metylpropionsyre-t-butylester. Eksempler på fremgangsmåter hvorved man fjerner de beskyttende grupper innbefatter bruk av ammonium-hydroksyd, ammoniakk i metanol og natriummetoksyd i metanol.

I det tredje trinn blir produktet fra trinn 2.koplet med N cx-benzoylfenylalanin (Bz-Phe) ved å bruke den aktive ester-koplingsmetoden, hvorved man får fremstilt. 3-Na-benzoyl-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester. Brukbare aktive estere innbefatter N-succinimidylester, p-nitro-fenylesteren og lignende av Bz-Phe.

Alternativt kan produktet fra trinn 2 koples med Bz-Phe ved

å bruke en lav racemiseringskoplingsmetode, slik som EEDQ-metoden, syreazidmetoden eller DCC-metoden med midler som holder tilbake racemiseringen, ..f .eks . 1-hydroksybenzotriazol, hvorved man får fremstilt 3-Na<->benzoylfenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester.

I trinn 4 blir t-butylestergruppen fjernet fra produktet fra trinn 3 ved å bruke vanlige fremgangsmåter, hvorved man får fremstilt 3-N cx-benzoylf enylalanyltio-2-D.-metylpropionsyre.

I trinn 5 blir produktet fra trinn 4 koplet med N-hydroksysuccinimid ved å bruke. DCC- eller MA-metodene, hvorved man får fremstilt N-succinimidylesteren. Dette produktet blir så omsatt med L-prolin, hvorved man får N -[3-(N -benzoyl-fenylalanyltio)-2-D-metylpropanoy1]-L-prolin. N-hydroksy-succinimidet kan erstattes med andre aktive esterforløpere, for derved å få fremstilt andre brukbare aktive estere. Alternativt kan produktet fra trinn 4 koples med L-prolin-t-butylester ved å bruke DCC- eller MA-metodene, hvorved man får fremstilt t-butylesteren av det samme produkt. t-butylestergruppen kan så fjernes ved å bruke valige kjente fremgangsmåter for fjerning av beskyttende grupper.

Ved å bruke Bz-L-Phe, Bz-D-Phe eller Bz-D,L-Phe som utgangs-materiale, kan man fremstille de følgende forbindelser: Na<->[3-(Na<->benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin, Na<->[3-(Na<->benzoyl-D-fenylalanyltio)-2-D-metyl-propanoyl]-L-prolin eller N ( X -[3-(N ( X-benzoyl-D,L-fenylalanyltio) -2-D-metylpropanoyl ] -L-prolin . De rene L-, D- eller D,L-formene av Bz-Phe kan oppnås ved å følge de fremgangsmåter som her er beskrevet.

Ved å bruke passende R-A-forbindelser fremstilt ved de fremgangsmåter som er beskrevet i de verserende US-patentsøknader nr. 064.897 til og med 064.903, innsendt 14. august 1979,

nr. 116.950 og 116.951 innsendt 30. januar 1980 og nr. 121.188, innsendt 3. mars 1980, istedenfor nevnte Bz-Phe.i trinn 3 og bruke de fremgangsmåter som her er beskrevet i trinnene 3-5, så kan man fremstille en forbindelse med de forønskede R-

og A-grupper.

II.

I denne fremgangsmåten blir 3-acetyltio-2-metylpropionsyre omsatt med 2-metylpropen i nærvær av sulfonsyre, noe som gir 3-acetyltio-2-metylpropionsyre-t-butylester. Acetylgruppen blir så fjernet ved å oppløse esteren i en alkalisk oppløs-ning, noe som gir 3-merkapto-2-metylpropionsyre-t-butylester.

I et annet trinn blir produktet koplet med Na<->benzoylfenylalanin (Bz-Phe) ved å bruke vanlige kjente koplingsmetoder bortsett fra halogenid, noe som gir 3-(Na-benzoylfenylalanyl-tio) -2-metylpropionsyre-t-butylester.

I et tredje trinn fjerner man de beskyttende grupper fra produktet fra trinn 2 ved hjelp av TFA i anisol, noe som gir 3-(Na<->benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre.

I et fjerde trinn blir syren fra trinn 3 oppløst på velkjent måte.

I det femte trinnet blir det oppløste produkt fra trinn 4 koplet til t-butylesteren av L-prolin, og den beskyttende gruppen blir så fjernet fra den resulterende ester med TFA

i anisol, hvorved man får fremstilt den forønskede forbindelse. \

3-acetyltiopropionsyre eller 2-acetyltiopropionsyre kan brukes istedenfor 3-acetyltio-2-metylpropionsyre i trinn 1

i denne fremgangsmåten, hvorved man henholdsvis får fremstilt 3-tiopropionsyre og 2-tiopropionsyrederivatene. Enhver ønskelig R-A-forbindelse kan fremstilles ved at man bruker de forønskede R- og A-gruppene istedenfor Bz-Phe i trinn 2.

III.

I en annen fremgangsmåte blir 3-acetyltio-2-metylpropionsyre omsatt med 2-metylpropen, hvorved man får fremstilt 3-acetyltio-2-metylpropionsyre-t-butylester hvoretter man fjerner acetylgruppen, noe som gir 3-merkapto-2-metylpropionsyre-t-butylester som beskrevet i fremgangsmåte II, trinn 1 ovenfor.

I et annet trinn blir esteren fra trinn 1 koplet til en be-skyttet fenylalaninforbindelse hvor den beskyttende gruppen er Bpoc, Ppoc eller Ddz, hvorved man. får fremstilt en be-skyttet 3-(Na<->fenylalanyltio)-2-metylpropionsyre-t-butylester.

I et tredje trinn fjerner man de beskyttende grupper fra

esteren fra trinn 2, f.eks. ved hjelp av svake syrer, og dette gir 3-fenylalanyltio-2-metylpropionsyre-t-butylester.

En Ddz-beskyttende gruppe kan fjernes ved hjelp av bestrål-ing .

I et fjerde trinn blir estere fra trinn 3 koplet til benzosyre, noe som gir 3-(Na<->benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre-t-butylester. Man kan istedenfor benzosyre bruke enhver benzoylkoplingsforbindelse, f.eks. et benzoylhalogenid slik som benzoylklorid eller benzoylbromid eller en aktiv benzosyreester, slik som N-succinimidyl-, p-nitrofenyl-, o-nitrofenyl-, benzotriazolyl-, 5-norbornen-2,3-di-karboksimidyl-, pentaklorfenyl- eller pentafluorfenylestere.

I et femte trinn fjerner man de beskyttende grupper fra

produktet fra trinn 4 med TFA i anisol, noe som gir 3-(N<0->benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre, slik dette er beskrevet i fremgangsmåte II, trinn 3 ovenfor.

I sjette trinn blir produktet fra trinn 5 resolvert ved hjelp av omkrystallisering, væskekromatografi, motstrømsfor-deling, ioneutveksling eller ved anvendelse av spaltnings-midler slik som 3-nitro-D-tyrosin-metylester eller-hydrazid, d-(+)-a-metylbenzylamin eller 1-(-)-a-metylbenzylamin, kinin,

(-)-efedrin eller N,N-dicykloheksylamin.

I det syvende trinn blir det oppløste produkt fra trinn 6 koplet til t-butylesteren av L-prolin ved bruk av DCC- eller MA-metoden, hvoretter de beskyttende grupper fjernes fra den resulterende ester med TFA i anisol hvilket gir den for-ønskede forbindelsen.

I de ovennevnte trinn kan man bruke benzylestrene istedenfor t-butylester og fjerning av beskyttende grupper kan ut-føres ved hjelp av HBr i eddiksyre.

3-acetyltiopropionsyre og 2-acetyltiopropionsyre kan brukes istedenfor 3-acetyltio-2-metylpropionsyre i trinn 1, hvorved man får fremstilt 3-tiopropionsyre og 2-tiopropionsyrederivatene. Man kan anvende enhver ønskelig A-gruppe istedenfor fenylalanin i trinn 2, hvorved man får fremstilt forbindelser med den forønskede A-gruppe. Enhver ønskelig R-gruppe kan koples til produktet fra trinn 3 ved å bruke R istedenfor benzoylgruppen i de angitte benzoylkoplingsfor-bindelser slik disse er brukt i trinn 4.

I alle de tilfeller hvor det er angitt at man har en D-konfigurasjon i metylsidekjeden på 3-merkapto-2-metylpro-pionsyregruppen, så er det underforstått at dette er ekvivalent til å angi at man har en S-konfigurasjon.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse danner basiske salter med forskjellige uorganiske og oragniske baser, og slike salter ligger også innenfor oppfinnelsen. Nevnte salter innbefatter f.eks. ammoniumsalter, alkalimetallsalter som natrium- og kalsiumsaltet (som er de foretrukne), alkali-jordmetallsalter som kalsium- og magnesiumsalter, videre salter med organiske baser, f.eks. dicykliheksylaminsalt, benzatin, N-metyl-D-glukamin, hydrabaminsalter, salter med aminosyrer som arginin, lysin og lignende. Det er foretruk-ket å bruke de ikke-toksiske, fysiologisk akseptable salter, skjønt, andre salter kan også brukes, f.eks. for å isolere eller å rense produktet, noe som er angitt i eksemplene i forbindelse med dicykloheksylaminsaltet.

Saltene fremstilles på vanlig kjent måte ved å omsette den frie syreformen av produktet med en eller flere ekvivalenter av en passende base, noe som gir det forønskede kation i et oppløsningsmiddel eller et medium hvor saltet er dårlig oppløselig eller uoppløselig, eller i vann og hvoretter man fjerner vannet ved frysetørking. Ved å omsette saltet med en uoppløselig syre slik som en kation-utbytningsharpiks i hydrogenformen (f.eks. polystyrensulfonsyreharpikser som Dowex 50), eller med en vandig syre og så ekstrahere denne med et organisk oppløsningsmiddel, f.eks. etylacetat, di-klormetan eller lignende, kan man oppnå den frie syreformen, hvis dette er ønskelig, og deretter danne et annet salt når dette måtte være passende.

Av hensiktsmessighetsgrunner har man i det etterfølgende beskrevet detaljer med hensyn til fremgangsmåter for fremstilling av N CX -[3-(N CX-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin. Hvis intet annet er angitt, har man anvendt molare ekvivalenter av reaktantene.

I.

Trinn 1. Syntese av Na- t- butyl. oksykarbonyl- L- tiofenylalaninfenylester

En oppløsning av 3,98 g Boc-L-Phe i ca. 20 ml redestillert etanol ble avkjølt til -20°C i et metanolis-tørrisbad. Opp-løsningen ble tilsatt 2,04 ml N-etylmorfolin fulgt av 2,04 ml isobutylklorformat, og blandingen ble omrørt i 3 minutter ved -15°C. 1,8 ml tiofenol ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i 1$ time ved -15°C. Den ble så langsomt oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer. 20 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad. Den organiske fasen ble vasket tre ganger med kaldt vann, tre ganger med kald IN sitronsyre, tre ganger med kald mettet natriumklorid, tre ganger med kald IN NaHCO^ og til slutt tre ganger med en mettet kald natriumkloridoppløsning. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble så fjernet ved fordampning. Resten

ble utkrystallisert fra benzenpetroleter, noe som ga 3,68 g av hvite nåler med smeltepunkt på 113,5-114,5°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr og elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 2. Syntese av Na- benzoyl- L- tiofenylalaninfenylester

(i) 2 g av produktet fra trinn 1 ble tilsatt 2,0 ml anisol og avkjølt i et-isaceton-bad. Nevnte Na<->Boc-gruppe ble fjernet ved omrøring av blandingen med 4 ml vannfritt

TFA i romtemperatur i 30 minutter. TFA og anisol ble fjernet ved 3 0°C under høyvakuum inntil man fikk de første hvite krystaller. (ii) Deretter tilsatte man 10 ml av en 5,7 molar hydro-genkloridoppløsning i etanol, og blandingen ble omrørt i 10 minutter ved romtemperatur. 15 ml vannfri eter ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad i 30 minutter. Oppløsningen ble filtrert, og krystallene vasket flere ganger med eter. De ble så tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og<p>2°5'noe som9a 1*03 g hvite krystaller som dekomponerte ved 164,5-165 C. (iii) 1,12 g av dette produktet, dvs. hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalaninfenylesteren, ble suspendert i 15 ml etylacetat under kraftig omrøring. Man tilsatte så 0,45 ml benzoylklorid. Blandingen ble dråpevis tilsatt en oppløs-ning av 1,01 g Na^ CO^ i 10 ml vann, og blandingen ble omrørt kraftig i 30 minutter. Den ble så avkjølt i et isbad i 30 minutter og filtrert. Resten ble vasket syv ganger med kaldt vann, en gang med kald etylacetat og to ganger med vannfri eter. Resten ble så tørket i et vakuumkammer over NaOH-pellets og ^ 2^^ ^ flere timer, noe som ga 1,32 g hvite krystaller som dekomponerte ved 182-183°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen. ;Trinn 3. Syntese av Na- benzoyl- L- tiofenylalanin];En strøm av nitrogen ble boblet inn i en oppløsning av 1,01 g NaSH i 25 ml vannfri etanol under kraftig omrøring, mens temperaturen ble holdt mellom 35-40°C. 2,17 g av produktet fra trinn 2 ble tilsatt iløpet av 15 minutter. Temperaturen på reaksjonsblandingen falt til ca. 20°C etter at til-slutningen var ferdig. Blandingen ble så kraftig rørt ved 20°C i li time. Etanolen ble fjernet ved 32°C, 30 ml vann ble tilsatt, og oppløsningen avkjølt i et isbad. Den ble så surgjort til pH 2 med 50% r^SO^. Den ble så hensatt i et isbad i 30 minutter og filtrert, hvoretter resten ble vasket flere ganger med kaldt vann og tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P205*Resten ble omkrystallisert fra benzen og heksan, noe som ga 1,45 g hvite nåler som dekomponerte ved 108,5-109,5°C. Analyse av produktet ved IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 4. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

En suspensjon av 285 mg av produktet fra trinn 3 og 86/1 yl metakrylsyre i 2 ml toluen ble kokt under tilbakeløp i flere timer, inntil reaksjonen var fullstendig, noe som ble på-vist ved tynnsjiktskromatografi og papirelektroforese. Blandingen ble hensatt over natten ved romtemperatur, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning under høy-vakuum ved 35°C, noe som ga en oljeaktig rest. Dette ble utkrystallisert og omkrystallisert fra benzen-n-heksan til 195 mg hvite krystaller med et smeltepunkt på 120-122,5°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi vist at produktet var identisk med tittelforbindelsen.

Trinn 5. Oppløsning til 3-( Na- benzoy1- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropionsyre (A) Produktet fra trinn 4 ble flere ganger utkrystallisert fra benzen til tittelforbindelsen. Ved å bruke en ut-fellingskrystall, oppnådde man den ovennevnte forbindelse raskere og med høyere utbytte. (B) Produktet fra trinn 4 ble oppløst i benzen, hvoretter man tilsatte en ekvivalent dicykloheksylamin og omrørte

det hele i flere timer. Blandingen ble hensatt over natten ved 4°C og så filtrert, og krystallene ble vasket og tørket i et vakuumkammer. De ble så oppløst i en blanding av vann og etylacetat, og blandingen ble surgjort til pH 2 med konsentrert HC1 i et isbad. Blandingen ble så vasket med en

oppløsning av mettet natriumklorid og tørket ved hjelp av magnesiumsulfat. Oppløsningen ble filtrert, og oppløsnings-midlet ble fjernet i et roterende fordampningskammer. Produktet ble så utkrystallisert fra benzen.

Trinn 6. Syntese av N cx -[ 3 —( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin

(A) (i) 2,5 mmol av produktet fra trinn 5 ble oppløst i

3 ml dimetylformamid (DMF) og avkjølt til 0°C i et is-aceton-bad. 2,5 mmol DCC i 1,5 ml DMF ble tilsatt, og blandingen omrørt i 5 minutter ved 0°C. Oppløsningen ble tilsatt 2,5 mmol L-prolin-t-butylester i 1,5 ml DMF. Blandingen ble om-rørt over natten ved 4°C, og opparbeidet ved å tilsette 10 ml etylacetat og filtrert. Produktet ble vasket med 20 ml etylacetat, og de samlede etylacetatfraksjoner ble avkjølt i en dypfryser. Den organiske fasen ble vasket tre ganger med en mettet natriumkloridoppløsning, en gang med kald 0,1 N NaHCO^og tre ganger med mettet natriumklorid. Den organiske fasen ble så tørket med vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet under høyvakuum, noe som ga en hvit-"v rest. (ii) Nevnte rest ble suspendert i 4 ml anisol og omsatt med 8 ml TFA i li time ved romtemperatur under om-røring, TFA ble så fjernet ved fordampning i høyvakuum. Resten ble oppløst i 1 ml tetrahydrofuran (THF) og kromatografert. De forønskede fraksjoner ble fordampet.til tørrhet, oppløst i en mindre mengde isopropanol og kromatografert om igjen. De forønskede fraksjoner ga en olje som ble opp-løst i THF, hvoretter sistnevnte ble fordampet under en strøm av nitrogen. Sluttproduktet fikk man etter å ha fjernet det gjenværende oppløsningsmiddel ved hjelp av fordampning i høyvakuum. (B) En kald oppløsning av 2,5 mmol DCC i DMF ble tilsatt dråpevis til en blanding av 2,5 mmol av produktet fra trinn 5 og 2,5 mmol N-hydroksysuccinimid i DMF ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 minutter ved 0°C og så over natten ved 4°C. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering, og bunnfallet vasket med etylacetat. Oppløsningsmidlene fra de samlede filtrater ble fjernet under redusert trykk, og resten utkrystallisert fra benzen og heksan. Krystallene ble oppløst i kald THF, og oppløsningen ble tilsatt en kald oppløsning av 2,5 mmol L-Pro og 2,5 mmol NaHCO^i THF/vann. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. THF ble fjernet ved fordampning ved 35°C. Vann ble tilsatt blandingen og pH justert til 9 ved hjelp av fast NaHCO^. Den vandige fasen ble ekstrahert med etylacetat, ble så avkjølt i et isbad og surgjort til pH 2 ved hjelp av IN HC1 i nærvær av etylacetat. Den organiske fasen ble vasket to ganger med kaldt vann og så to ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsnings-midlet ble fjernet ved fordampning og resten utkrystallisert fra eter og heksan, noe som ga tittelproduktet. Alternative fremgangsmåter for syntese av N cx- benzoyl- L-tiofenylalanin (A) Boc-L-tiofenylalaninfenylesteren ble fremstilt som beskrevet i trinn 1. Deretter ble tiosyren, Boc-L-tiofenylalanin fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra trinn 3. Alternativt kan denne tiosyren fremstilles ved å omsette molare ekvivalenter av Boc-L-Phe og H2S ved hjelp av den blandede anhydridkoplingsmetoden som er beskrevet i J. Am. Chem.

Soc. 74.' 4726 (1952). Tiosyren blir omsatt med hydrogen-klorid i etanol og hvoretter man reagerer produktet med benzoylklorid eller en aktiv ester av benzosyre slik det er beskrevet i trinn 2, noe som gir tittelproduktet.

(B) Na<->benzoyl-L-Phe ble syntetisert ved å reagere ekvivalente mengder av benzoylklorid og L-Phe i natrium-hydroksydoppløsning som beskrevet i J. Bio. Chem., 138, 627

(1941). Produktet kan syntetiseres ved å reagere molare ekvivalente mengder av NQ-benzoyl-L-Phe og H2S ved å bruke den blandede anhydridkoplingsmetoden slik det er beskrevet i J. Am. Chem. Soc, 74.'4726 (1952).

Alternativ fremgangsmåte for syntese av 3-( Nq- benzoyl- L-fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre

Boc-L-tiofenylalanin ble fremstilt som beskrevet i fremgangsmåte IX, trinn 1 og 2. Hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalanin ble fremstilt ved å reagere Boc-L-tiofenylalanin. med HC1 i eddiksyre under omrøring ved romtemperatur. Vannfri eter ble tilsatt og blandingen avkjølt i et isbad, hvoretter den ble filtrert og vasket flere ganger med eter. Resten ble tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og<p>2°5'Det resulterende produkt ble omsatt med metakrylsyre som beskrevet i trinn 4, hvorved man fikk hydrogenkloridsaltet av 3-L-fenylalanyltio-2-metylpropionsyre. Dette produkt kan enten oppløses ved å bruke fremgangsmåten fra trinn 5 og deretter reagere det med benzoylklorid som beskrevet i trinn 2 (iii), noe som gir tittelforbindelsen, eller dette produkt kan omsettes med benzoylklorid som beskrevet i trinn 2 (iii) og så oppløses.

II.

Trinn 1. Syntese av 3- merkapto- 2- metylpropionsyre- t- butylester 0,62 g 3-acetyltio-2-metylpropionsyre ble tilsatt en oppløs-ning av 0,56 g 2-metylpropen i IN svovelsyre ved -10°C. Blandingen ble omrørt i 30 minutter og så oppvarmet til romtemperatur, hvorved man fikk 3-acetyltio-2-metylpropionsyre-t-butylester. Dette produkt ble oppløst i en blanding av ammoniakk og vann. Etter en time ble blandingen for-tynnet med vann og filtrert, hvorpå filtratet ble ekstrahert med etylacetat og så surgjort med konsentrert salt-syre, mettet med natriumklorid og ekstrahert to ganger med etylacetat. Etylacetatekstraktet ble vasket med mettet natriumklorid og konsentrert til tørrhet, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 2. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre- t- butylester

Benzoylklorid omsettes med fenylalanin i natriumhydroksyd-oppløsning for dannelse av Na<->benzoylfenylalanin (Bz-Phe)

som beskrevet i J. Biol. Chem., 138, 627-629 (1941). Den

således oppnådde Bz-Phe omsettes deretter med overskudd N-hydroksysuccinimid ved anvendelse av MA-metoden. Ved omsetning av det resulterende produkt med produktet fra trinn 1, oppnås det ønskede produkt.

Trinn 3. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-metylpropionsyre Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å fjerne t-butylester-gruppen fra produktet i trinn 2, suspenderer nevnte produkt i 4 ml anisol og omsetter med 8 ml trifluoreddiksyre (TFA)

i lj time ved romtemperatur under omrøring. TFA ble fjernet med en roterende evaporator under høyt vakuum. Resten ble oppløst i 1 ml tetrahydrofuran (THF) og kromatografert.

De ønskede fraksjoner ble inndampet til tørrhet, oppløst i

en liten mengde isopropanol og kromatografert på nytt. De ønskede fraksjoner som ga en olje, ble oppløst i THF og deretter ble THF inndampet under en strøm av N^. Sluttproduktet ble oppnådd etter fjerning av det resterende opp-løsningsmiddel med en roterende evaporator under høyt vakuum.

Trinn 4. Oppløsning til 3-( Nq- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 5.

Trinn 5. Syntese av Na-[ 3-( benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble syntetisert på følgende måte: 2,5 mmol av produktet fra trinn 4 ble oppløst i 3 ml dimetylformamid (DMF) og avkjølt til 0°C i et is-aceton-bad. 2,5 mmol DCC i 1,5 ml DMF ble tilsatt og blandingen omrørt i 5 minutter ved 0°C. Til denne oppløsning ble det tilsatt 2,5 mmol L-prolin-t-butylester i 1,5 ml DMF. Reaksjonsblandingen

ble omrørt natten over ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble deretter opparbeidet ved tilsetning av 10 ml etylacetat og filtrering. Bunnfallet ble vasket med 20 ml etylacetat.

De kombinerte etylacetatfraksjoner ble avkjølt i en fryser.

Den organiske fasen ble vasket tre ganger med mettet NaCl,

en gang med kald 0,1 N NaHCO^og tre ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen ble tørket med vannfritt MgSO^ og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet med en roterende evaporator under høyt vakuum hvilket ga en hvit rest. Fjerning av beskyttelsen fra denne rest ved fjerning av t-butylester-gruppen som beskrevet i trinn 3 ga det ønskede produkt.

III.

Trinn 1. Syntese av 3- merkapto- 2- metylpropionsyre- t- butylester Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å bruke fremgangsmåten fra metode II, trinn 1.

Trinn 2. Syntese av 3-( NqPpoc- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre- t- butylester

Na<->Ppoc-L-Phe (som ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten som er beskrevet i Int. J. Peptide Protein Res. 6, 111 (1974) for N-Ddz-L-Phe. ble koblet til produktet fra trinn 1 ved bruk av CDI-metoden i nærvær av trietanolamin (TEA) for dannelse av det ønskede produkt.

Trinn 3. Syntese av 3- L- fenylalanyltio- 2- metylpropionsyre- t-butylester

Produktet fra trinn 2 ble oppløst i metylenklorid inneholdende 0,5 TFA og omrørt i 10 minutter. TFA og metylenklorid ble fjernet ved fordampning, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 4. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre- t- butylester

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å reagere molare ekvivalenter av benzoylklorid og produktet fra trinn 3 i en blanding av etylacetat og vann inneholdende NaHCO^.

Trinn 5. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å fjerne t-butylester-gruppen fra produktet i trinn 4 ved å bruke fremgangsmåten fra metoden i eksempel II, trinn 3.

Trinn 6. Oppløsning til 3-( Na- benzoy1- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved først ved å oppløse produktet fra trinn 5 i benzen. En ekvivalent dicykloheksylamin ble tilsatt til denne oppløsning og omrørt i flere timer. Blandingen ble hensatt natten over ved 4°C og deretter filtrert. Krystallene ble vasket og deretter tørket i en vakuumeksikator. Krystallene ble deretter oppløst i en blanding av vann og etylacetat, blandingen ble surgjort til pH 2 med konsentrert HC1 i et isbad. Blandingen ble deretter vasket med en oppløsning av mettet NaCl og tørket med MgSO^. Oppløsningen ble filtrert og oppløsningsmidlet fjernet med en roterende evaporator. Tittelproduktet ble deretter krystallisert fra benzen.

Trinn 7. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel II, trinn 5, ved å utelate beskyttelsesfjerningstrinnet.

IV.

Trinn 1. Syntese av Na- Ddz- L- tiofenylalanin

5 mmol Na<->Ddz-L-Phe ble oppløst i DMF og avkjølt til 0°C i et is-aceton-bad. 5 mmol DCC i DMF ble tilsatt, og blandingen omrørt i flere minutter ved 0°C. Oppløsningen ble tilsatt 5 mmol p-nitrofenol i DMF. Den ble så omrørt over natten ved 4°C og oppløsningsmidlet fjernet ved fordampning. Etylacetat ble tilsatt og blandingen filtrert. Resten ble vasket med etylacetat og de samlede etylacetatfraksjoner ble av-kjølt i en dypfryser. Den organiske fase ble vasket tre ganger med kald IN NaHCO^ og til slutt tre ganger med mettet NaCl, hvoretter den ble tørket over magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning under høyvakuum. 2,17 ml av dette produkt ble tilsatt iløpet av 15 minutter til en oppløsning av 1,01 g NaSH i 25 ml vannfri etanol som tidligere var bragt i kontakt med ^ ved bobling av en N^-strøm inn i nevnte oppløsning under kraftig omrøring og med temperaturen holdt ved 35-40°C. Temperaturen på reaksjonsblandingen falt til omtrent 20°C ved slutten av denne tilsetning. Blandingen ble omrørt kraftig ved 20°C

i li time. Etanolen ble fjernet med en roterende evaporator ved 32°C, 30 ml vann ble tilsatt og oppløsningen avkjølt i et isbad. Oppløsningen ble deretter surgjort til pH 2 ved anvendelse av 50% E^ O^" Blandingen ble hensatt i isbadet i 30 minutter og deretter filtrert. Resten ble vasket flere ganger med kaldt vann og tørket natten over i en vakuumeksikator over NaOH-pellets og P2O1-. Resten ble omkrystallisert fra benzen-heksan for dannelse av tittelproduktet.

Trinn 2. Syntese av 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

En suspensjon av 285 mg av produktet fra trinn 1 og 86,1 yl metakrylsyre i 2 ml toluen ble tilbakeløpskokt i flere timer inntil reaksjonen var praktisk talt fullstendig som indikert ved tynnsjiktskromatografi og papirelektroforese. Blandingen ble deretter hensatt natten over ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet med en roterende evaporator under høyt vakuum ved 35°C hvilket ga en oljeaktig rest. Resten ble krystallisert og omkrystallisert fra benzen-n-heksan for dannelse av tittelforbindelsen.

Trinn 3. Oppløsning til 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre (A) Produktet fra trinn 2 krystalliseres gjentatte ganger fra benzen for oppnåelse av tittelforbindelsen. Ved å be-nytte et kimkrystall i den gjentatte krystallisasjonsmetode, oppnås tittelforbindelsen hurtigere og i høyere utbytte. (B) Produktet fra trinn 2 ble oppløst i benzen. En ekvivalent av dicykloheksylamin ble tilsatt til denne oppløs-ning og omrørt i flere timer. Blandingen ble hensatt natten over ved 4°C og deretter filtrert. Krystallene ble vasket og deretter tørket i en vakuumeksikator. Krystallene ble opp-løst i en blanding av vann og etylacetat. Blandingen ble surgjort til pH 2 med konsentrert HC1 i et isbas. Blandingen ble deretter vasket med en mettet NaCl-oppløsning og tørket med MgSO^. Oppløsningen ble filtrert og oppløsningsmidlet fjernet med en roterende evaporator. Tittelproduktet ble deretter krystallisert fra benzen.

Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å utsette produktet fra trinn 3 for metoden beskrevet i eksempel IV, trinn 5, ved utelatelse av beskyttelsesfjerningstrinnet.

Trinn 5. Syntese av Na-[ 3-( L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropa-noyl ]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte forbindelse ble syntetisert ved behandling, for beskyttelsesfjerning av produktet fra trinn 4 ved bestrålning ved en bølgelengde på 350 nm i 5 timer ved 20°C i THF.

Trinn 6. Syntese av NQ-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å omsette molare ekvivalenter av benzoylklorid og produktet fra trinn 5 i en blanding av etylacetat og vann inneholdende NaHCO^.

Trinn 7. Syntese av N CX -[ 3-( N ot- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å fjerne t-butylester-gruppen fra produktet fra trinn 6 ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel II, trinn 3.

v.

Trinn 1. Syntese av 3-( Na- Bpoc- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre- t- butylester

N<Q->Bpoc-L-Phe ble syntetisert ved hjelp av fremgangsmåten

som er beskrevet av Sieber et al., Heiv. Chem. Acta 5_1, 614

(1968). 3-merkapto-2-D-metylpropionsyre-t-butylester ble fremstilt som beskrevet i metode I, trinnene 1 og 2. Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke N cx-Bpoc-L-Phe for ■

a • N -Bz-L-P i metode I, alternativt trinn 3 og vesentlig bruke den der angitte fremgangsmåte.

Trinn 2. Syntese av trifluoracetatsaltet av 3- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre- t- butylester

Produktet fra trinn 1 ble oppløst i metylenklorid innehold-

ende 0,5% TFA og omrørt i 10 minutter. Metylenkloridet og overskuddet av TFA ble fjernet ved fordampning, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 3. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre- t- butylester

15 mmol av produktet fra trinn 2 ble suspendert i etylacetat under kraftig omrøring. Deretter tilsatte man 15 mmol benzoylklorid ved romtemperatur. Blandingen ble dråpevis tilsatt en oppløsning av 32 mmol NaHCO^i vann, og blandingen omrørt i li time. Den ble så avkjølt i et isbad i ytter-

ligere en i time, og etylacetat ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt i et isbad og vasket med vann, IN sitronsyre og så flere ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsnings-midlet ble fjernet ved fordampning etter tørkning over vannfritt magnesiumsulfat, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 4. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

t-butylgruppen ble fjernet fra produktet fra trinn 3 ved hjelp av fremgangsmåten i metode I, trinn 4, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 5. Syntese av Nq-[ 3-( Na- benzoy1- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

VI.

Trinn 1. Syntese av 3- merkapto- 2- D- metylpropionsyre Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 2 og bruke 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre istedenfor dets t-butylester.

Trinn 2. Syntese av 3-( Na- Boc- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre

Ved å o bruke N Oi -Boc-L-Phe istedenfor N ( X-Bz-L-Phe og produktet fra trinn 1 istedenfor 3-merkapto-2-D-metylpropionsyre-t-butylesteren i metode I, alternativt trinn 3 og bruke den der angitte fremgangsmåte, fikk man fremstilt det ovennevnte produkt.

Trinn 3. Syntese av trifluoracetatsaltet av 3- L- fenylalanyltio- 2- D- metylpropionsyre

Produktet fra trinn 2 ble suspendert i 4 ml anisol og omsatt med 8 ml TFA i 1£ time ved romtemperatur under omrøring. Anisol og overskudd av TFA ble fjernet ved fordampning, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 4. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Ved å bruke produktet fra trinn 3 istedenfor TFA-saltet av 3-L-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester, fikk man\ fremstilt tittelproduktet.

Trinn 5. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ] r- L- prolin

VII.

Trinn 1. Syntese av 3-( Nq- Bpoc- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved kobling av Na<->Bpoc-Phe med 3-merkapto-2-D-metylpropionsyre ved anvendelse av DCC-metoden i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol i MA-metoden.

Trinn 2. Syntese av Nq-[ 3-( Na- Bpoc- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

En kald oppløsning av 10 mmol DMF og inneholdende 10 mmol

1- hydroksybenzotriazol ble dråpevis tilsatt en blanding av 10 mmol av produktet fra trinn 1 og 10 mmol L-prolin-t-butylester i DMF. Blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 0°C

og så over natten ved 4°C. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering, og bunnfallet vasket med etylacetat. Oppløsningsmidlene fra de samlede filtrater ble fjernet under redusert trykk, og resten utkrystallisert fra eter og heksan, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 3. Syntese av trifluoracetatsaltet av Nq-[ 3- L- feny1-alanyltio- 2- D- metylpropanoyl]- L- prolin- t- butylester Ovennevnte produkt ble fremstilt ved beskyttelsesfjernings-behandling av produktet fra trinn 2 for fjerning av Bpoc-gruppen, deretter oppløsning av den resulterende forbindelse i metylenklorid inneholdende 0,5% TFA og omsetning som beskrevet i eksempel V, trinn 2.

Trinn 4. Syntese av N CX -[3-(N CX- benzoyl- L- fenylalanyltio- 2- D-metylpropanoy1]- L- prolin- t- butylester

Produktet fra trinn 3 ble koblet med benzoylhalogenid eller benzosyreester som beskrevet i eksempel VIII, trinn 3, for dannelse av tittelproduktet.

Trinn 5. Syntese av Nq-[ 3- Na- benzoyl- L- fenylalanyl)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel I, trinn 6(B).

VIII.

Trinn 1. Syntese av Na-[ 3-( Na- Boc- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ] - L- prolin

3-(N°-Boc-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre ble fremstilt ved først å fjerne benzoylgruppen fra 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre ved anvendelse av konvensjonelle be-skyttelsesf jerningsmetoder og deretter kobling av det resulterende produkt til Na-Boc-Phe ved benyttelse av den aktive esterkoblingsmetoden, trinn 2. Dette produkt ble brukt istedenfor 3-(Na-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i metode I, trinn 5 (A)., og man brukte den der angitte fremgangsmåten for å fremstille ovennevnte produkt.

Trinn 2. Syntese av trifluoracetatsaltet av Na-[ 3- L- feny1-alanyltio- 2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved beskyttelsesfjerningsbe-handling av produktet fra trinn 1 ved å bruke trifluoreddiksyre (TFA) i anisol.

Trinn 3. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Produktet fra trinn 2 ble koblet med et benzoylhalogenid, slik som benzoylklorid eller -bromid, eller en benzotriazolyl-, p-nitrofenyl-, o-nitrofenyl-, 5-norbornen-2,3-dikarboksimidyl-, pentaklorfenyl- eller pentafluorfenylester av benzosyre for dannelse av tittelproduktet.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvor R er hydrogen, t-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-lysyl, L-arginyl, pyro-L-glutamyl eller R', hvor R' er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl eller cyklopentankarbonyl; A er fenylalanyl, alanyl, tryptofyl, tyrosyl, glycyl, isoleucyl, leucyl, histidyl eller valyl,' idet cx-aminogruppen deri er i amidbinding med R; R1 er hydrogen eller metyl; n er 0 eller 1, slik at når n er 0, er R^ metyl, og når n er 1 og R^ er metyl, er gruppen

i D-konfigurasjonen, og R2 er L-prolyl, L-3,4-dehydroprolyl, D,L-3,4-dehydroprolyl, L-3-hydroksyprolyl, L-4-hydrokzyprolyl, L-tiazolidin-4-karboksylsyre, eller L-5-oksoprolyl, idet iminogruppen deri er i imidbinding med den tilstøtende

karakterisert ved følgende trinn:(A) omsetning av en forbindelse med formelen:

hvor R1 og n har den ovenfor angitte betydning, med en forbindelse med formelen:

hvor R og A har den ovenfor angitte betydning, for dannelse av en forbindelse med formelen:

hvor R, A, R-l og n har den ovenfor angitte betydning, (B) fjerning av t-butylestergruppen fra forbindelsen med formel IV, (C) kobling av produktet fra trinn (B) med en forbindelse med formelen:

hvor R^ enten er lik R2 som angitt ovenfor eller R2 er som angitt ovenfor inneholdende en karbonylbeskyttende gruppe, og, om nødvendig, fjerning av den karbonylbeskyttende gruppe.