NO831098L

NO831098L - Peptider med spesifiteten til munn- og klovsyke-virus-antigener

Info

Publication number: NO831098L
Application number: NO831098A
Authority: NO
Inventors: Heinz E Schaller; Eberhard P Pfaff
Original assignee: Biogen Nv
Priority date: 1982-03-26
Filing date: 1983-03-25
Publication date: 1983-09-27
Also published as: PT76451B; ES520997A0; AU1255383A; DK139083A; EP0090581A2; PT76451A; ES8500997A1; EP0090581A3; ZA831854B; JPS58213723A; US4605512A; IL68201A0; DK139083D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører små peptider med spes:.-fitet for munn og klovsyke ("'FMD") virus antigener. Næniere bestemt vedrører oppfinnelsen små peptider som omfatter antigendeterminantene til en eller flere serotyper av munn og klovsykevirus ("FMDV") og bruken av disse peptider i blandinger og fremgangsmåter for å gjøre dyrene resistente overfor FMDV gjennom i det minste et visst tidsrom.

FMD-virus er en picornavirus som angriper klovdyr. Den er

én av de mest infeksjonøse og lett overførbare sykdommer ljios bufe. Denne sykdom er genereltkarakterisert vedvesiku-lære lesjoner på føtter og munn hos det infiserte dyr. Ved én reduksjon i legemstilstanden senkes i allminnelighet produksjonen av dyreprodukter med 25 %. Epidemier av FMDV forårsaker store økonomiske tap ved fremstilling og saljj av kjøtt, meieriprodukter, ull, huder og andre produkter. Under f.eks. en epidemi i Storbritannia i 1967-68 ble nær 500 000 infiserte eller utsatte storfe, svin, sauer og geiter avlivet under tiltak for å stanse sykdommen. ii Det foreligger flere forskjellige serotyper av FMD-virus. Disse er de europeiske eller klassiske typer 0, A og C, de S.ør-Af rikanske teritorie-typer SAT1, SAT2 og SAT3 og den asiatiske type I. F.eks., K.J.H. Robson et al., "An Åssessment By Competition Hybridization Of The Sequence Homology Between The RNAs Of The Seven Serotypes Of FMDV",

37 J. Gen. Virol. 271-76 (1977). Typene 0, A og C er funnet

i Europa, Syd-Amerika, Asia og nordlige deler av Afrika^,

men området utvider seg. De tre Sør-Afrikanske teritorie-typer ble først påvist i Syd-Afrika, men sykdomstypen sprer seg igjen geografisk. Den asiatiske type opptrer i asiatiske liand fra østlige middelhavsland til Det Fjerne Østen. Hver av disse serotyper omfatter også flere serologiske under-zypez.

Vaksiner for beskyttelse av dyr mot FMDV forligger. De f lesete av disse vaksiner omfatter inaktivert eller svekket helt

■j/irus. De gis i kjente planer og opplegg på en årlig eljLer

wartalsbasis. Fordi de syv virustyper mangler kryss-immunitet (Robson et al., supra) og forskjellige områder i verden har et forskjellig spektrum av virustyper, utføres vaksinasjon noen ganger med et bivalent eller trivalent materiale. Dette er imidlertid ikke alltid nødvendig eller tilrådelig.

fremstilling av FMD hel-virusvaksiner er beheftet med flere store vanskeligheter. For det første må på grunn av virus-ens inf eks j onskarakter laboratoriedyrkningen av vaksine:: utføres i isolerte anlegg under streng kontroll. For det andre har de virusbaserte vaksiner ofte uakseptabel styrke-variasjon etter fremstilling og inaktivering. For det predje må vaksinene prøves under meget kontrollerte be-tingelser for å sikre riktig virkningsgrad av svekning eller inaktivering. Ellers kan vaksinen ved uhell forårsake .aktiv infeksjon eller subakutt progressiv sykdom hos de Leh andlede dyr. Alle disse produksjonsproblemer fører til -thiøiyl erde e oomvkenosfotnr ibnegeskr refvonr e dpen roednukdesljoinge sprvoabksleinmeer. , I føtrielr lebgrguk av hel-virusvaksiner til et lite, men et signifikant an<-

' I

! tall allergiske bi-reaksoner hos de behandlede dyr. Disse uønskede bi-virkninger forårsakes sannsynligvis av de mange irrelevante anti-gendeterminanter av virus og ikke-virusproteiner som normalt forurenser virusvaksiner.

Et forsøk på å unngå noen av problemene som følger produksjonen og bruken av hel-virusvaksiner er å anvende virus-i I underenhetvaksiner omfattende kapselp1 roteiner for FMD-viI rusI. F.eks., U.S. patent nr. 4. 140 .763 ; H.L. Bachrach et al.I, j i I "An Experimental Protein Vaccine For Foot-And-Mouth Disease", i I 10 Perspectives in Virology 147-59 (M. Pollard ed. 1978).

FMD-virus erkarakterisert vedfire kapselproteiner identi-fisert som VP1, VP2 , VP3 og VP4. Kapselproteinene til FiÆD-jvirus beskytter kollektivt virusribonukleinsyre ("RNA" )-kjernen til virusen mot forskjellige inaktiverende midler. Det nøytraliserende anti-gen for FMDV synes å ligge i VP1 polypeptidet (VP3 i US-terminologi) (H.L. Bachrach et ajl. , 'An Experimantal Subunit Vaccine For Foot-And-Mouth Diséasel' , International Symposium On Foot- And- Mouth Disease, Lyon 1976, 35 Develop. Biol. Standard 155-60 (1977)). Videre er det beskrevet at anti-gen delen til VP1 synes å sitte i den siste 1/3 av proteinet, det vil si nærmest dets COOH-ende j(R. Franz et al. , "Localization And Characterization Of Two Immunogenic Regions On The Coat Protein VPT^r0r Foot-And-Mouth Disease Virus (FMDV) Subtype O-^K Inducing Neutral--izing Antibodies", Munchen (desember 1980)). Det er ogsa beskrevet at to enzym-sensitive områder av VP1 synes å

i

eksistere — mellom sekvensposisjoner 138-139 og mellom i

posisjoner 200-213 [K. Strohmaier et al., "Localization And Characterization Of The Antigenic Portion Of The FMDV immunizing Protein", presentert på "Positive Strand Vi::us" samlingen ved møtet av The Society for General Microbioi.ogy, Cambridge (april 1981) ] . VP1 har blitt renset og anvend-: for å vaksinere svin mot virusangrep (H.L. Bachrach et al., supra). Imidlertid kreves minst 10 ganger mer protein enn virus-baserte vaksiner for å oppnå immunitet. Derfor kreves to eller flere vaksinasjoner med VP1 protein-basert undér-énhetvirus normalt for å beskytte et dyr mot FMD-virus.

I

Bruken av underenhetsvaksiner forhindrer i stor grad anti-stoff dannelse mot de mange irrelevante anti-gendetermif hanter av virus og ikke-virusproteiner som ofte forurenser virusvaksiner. Bruken av dem kan derfor redusere de mulige bi-virkninger av virusvaksiner. Videre mangler sub-enhe:-vaksiner virusnukleinsyre og antas derfor å ikke forårsake risiko for aktiv infeksjon eller sub-akutte progressive sykdommer i de behandlede dyr. Selv om disse sub-enhets-vaksiner imidlertid unngår noen av problemene som karak-teriserer hel-virusbaserte vaksiner, er det også ulemper ved bruk av dem. Først må virus kultiveres og dyrkes for å oppnå kapselproteinet. Derfor unngås ikke de isolerte anlegg og høye produksjonskrav som følger FMD-virusvirkftingj. For det andre må proteinene separeres fra virusen og renses sI terkt. Denne prosessen er både langsom og " dyr. Hvis prpi-teinet videre ikke renses tilstrekkelig, kan den resulterende vaksine fortsatt inneholde tilstrekkelig virus tilj å gi leilighetsvis infeksjon eller subakutt sykdom. I

Torå unngå problemene som er ulemper ved ovenfor beskrevne VPl-baserte vaksiner, har rekombinant DNA-teknologi også blitt anvendt for å fremstille rekombinante DNA-molekylerkarakterisert veden DNA-sekvens eller fragment derav som koder for et polypeptid med FMDV anti-genvirkning. Dette krbeide som ble utført sammen av Biogen N.V. og Max-Planck-Instituttet for Biokjemi er beskrevet i europeisk paten:-ansøkning 40.922. Ved bruk av rekombinant DNA-molekyler som er beskrevet i denne søknad fremstiltes FMD-virusspesif:^ke nukleotidsekvenser og FMDV-antigenpolypeptider uten nød-vendighet av å dyrke store mengder virus, rense proteiner f!ra virusen eller inaktivere eller svekke virusen. Anti-1-genpolypeptidene og DNA-sekvensen som er beskrevet i den søknad kan anvendes i blandinger og fremgangsmåter ved i -behandling av FMD-virusinfeksjon.

Vaksiner mot FMDV som er basert på bakterielt produsert VPl er følgelig meget fordelaktige fremfor vaksiner som ér basert på levende virus eller proteiner isolert fra levende virus. Imidlertid kan slike bakteriefremstilte VPl-baserte vaksiner forbedres ytterligere ved å erstatte den fullstendige VPl-aktive bestanddel i disse vaksiner med en aktiv bestanddel bestående hovedsakelig bare av kntigendelen til VPl. En slik modifikasjon av vaksinen mi edfører flere sammensetnings- og prosessuelle fordeleri.VI aksinen vil fortsatt inneholde bare en enkelt eller høyi-den meget få antigen-punkter. Den hovedsakelige mangel på ikke-FMDV-spesifike determinanter vil ytterligere redusere muligheten for allergiske bi-reaksjoner hos behandlede dyr. Bruken av mindre peptider vil også muliggjøre fabrikasjon

I i av en vaksine som vil inneholde en meget høyere andel aktiv kI omponent av vekten enn de tidligere hele VPl-baserte vaik-siner. Og hvis antigen-delen av VPl fremstilles ved kjemisk syntese, vil den være lettere å rense og den resulterende yaksine vil være et ikke-biologisk produkt. Til slutt kan

mfeitinrdukre tupr epentn idede r tiledtlitegere re mpoodilyfpiesperteids eri , ssamlmik enaset tnakintig voitgeten

jbil disse polypeptider og den derpå baserte vaksine kan fori-oedres ytterligere.

Potensialet for identifisering og fremstilling av immunologiske aktive småpeptider er blitt påvist. F.eks., F.A, Ai nderer et al., "Properies Of Different Artificial AntigIens Immunologically Related To Tobacco Mosaic Virus", 97 Bio-

i~chim. Biophys. Acta 503-09 (1964); H. Langbeheim et al.. j'Antiviral Effect On MS-2 Goliphage Obtained With A Synthétic Antigen", 73 Proe. Nati. Acad. Sei. USA 4636-40 (1976);

i

F. Audibert et al., "Active Antitoxic Immunization By A Diphtheria Toxin Synthétic Oligopeptide", 289 Nature

593-94 (1981); E.H. Beachey et al., "Type-Specific Protec-tive Immunity Eviked By Synthétic Peptide Of Streptococcus pyogenes M Protein", 292 Nature 457-59 (1981); og G.M. Muller et al., "Anti-Influenza Response Achieved By Immunization With A Synthétic Conjugate", 79 Proe. Nati. Acad. Sei. USA 569-73 (1982).

Dertil har aminosyresekvensen til oppklarte antigenpolypeptider ved bruk av rekombinant DNA-teknologi blitt anvendt for å forutsi områder for mulig antigenitet. Peptidene som er definert gjennom disse områder er blitt syntitisert og deres immunologiske karakteristika analysert. For eksempel ble aminosyresekvensen til overflate-antigenet av hepatitt B-virus forutsagt av nukleotid-sekvensen til genet som koder for dette antigen analysert for å forutsi de innvendige og utvendige rester av antif genet og en serie peptider ble fremstilt basert på disse antagelser. R.A. Lerner et al., "Chemically SynthesizedJ Peptides Predicted From The Nucleotide Sequence og The ' Hepatitis B Virus Genome Elicit Antibodies Reactive WithThe Native Envelope Protein Of Dane Particles", 78 Proel Nati. Acad. Sei. USA 3403-07 (1981); T.P. Hopp, "A Synthétic Peptide With Hepatitis B Surface Antigen Reactivity", 18 Molec . Immun . 869-72 (1981); G.R. Dreesman et al., "AInti-body To Hepatitis B Surface Antigen After A Single Inocula-tion Of Uncoupled Synthétic HBsAg Peptides", 295 Nature 158-60 (1982); europeisk patentansøkning nr. 44.710. j

EIn lxgnende analyse og syntese er ogsa blitt beskrevet :. europeisk patentansøkning 44.710 for fremstilling av små peptider som antigener mot FMDV undertype 0,K. Som resultat av denne analysen ble fem peptider angitt som fremstilt — peptid 1: aminosyrer 1-18 av VPl; peptid 2: aminosyrer 9-2 4; peptid 3: aminosyrer 17-32; peptid 4: aminosyrer 25-41; og peptid 5: aminosyrer 21-41. Se f.eks. C. Kurz et al., 'Nucleotide Sequence And Corresponding Amino Acid Sequence Of The Gene For The Major Antigen Of Foot And Mouth Dis-

I I

éase Virus", 9 Nucleic Acids Research 1919-31 (1981). Disse peptider ble fastslått å bære spesifike antigendeterminanter for FMDV (europeisk patentansøkning 44.710).

Dertil har aminosyresekvensen til VPl bestemt ved rekombinant DNA-teknologi blitt brukt med et enzymspaltnings-mønster for naturlig VPl av FMDV undertype O-^K. Som et resultat ble en serie VPl-avledede fragmenter lokalisert i proteinene (Strohmaier et al., supra). De rapporterte fragmenter ble fastslått å omfatte de følgende aminosyresek-j-<y>enser av naturlig VPl fra FMDV undertype 0-^: 1-9, 10-36, 1-138, 1-145, 37-54, 55-180, 146-213, 155-200 og 181-213. Bare fragmentene 55-180, 146-213 og 181-213 ble angitt å i!ndusere nøytraliserende antistoffer. Følgelig ble sek-yi ensposisjonene mellom 138-154 og mellom 200 -213 forutsiagt å være antigendelene av VPl fra FMDV undertype 0-,L K, fordIidisse var de eneste områder i antistoffinduserende midleirsom ikke var overlappet av ikke-induserende områder (Strohmaier et al., supra).

Foreliggende oppfinnelse løser problemene som er beskrevet

ovenfor ved å tilveiebringe små peptider med spesifiteten til FMDV-virusantigenet. Videre produserer disse peptider åntisera som er i stand til å nøytralisere FMDV-virus i vanlige målinger og beskytte forsøksdyrene mot virusangrep.

Peptidene i foreliggende oppfinnelse omfatter bare et enkelt eller høyden noen få antigena ceder. Den hovedsakelige mangel på ikke-FMDV-spesifike determinanter i peptidene i foreliggende oppfinnelse reduserer muligheten for allerg- mviisuankle tie gbgdije-ørtr eeparkmå singjorannunetn er rha. ov Ps esbpien thidalneindle lle edi e stfdøoyrrer reliflosgre geånrosgde askå eopt fpreafmv insniteirrllé-sele-l

lingen av vaksiner og anvendelse av behandlingsmetoder hvori forholdet av den aktive vaksinebestanddel til vekten er meget høyere enn i tidligere tilgjengelige vaksiner og metoder. Videre er det lett å modifisere de små peptider i foreliggende oppfinnelse i sammensetning og konformasjoi for videre å forbedre den spesifike aktiviteten til disse pieptider mot FMDV. Selv om peptidene i foreliggende oppy fiinnelsekan fremstilles i bakterielle verter ved anvendelse av DNA-sekvenser som koder for disse peptider, gjennom kjemisk syntese eller ved en kombinasjon av de to, vil pep-t! ider i denne oppfinnelse som er fremstilt ved kjemisk sI<yn->tese være lettere å rense og fordelaktige fordi de har :.kke-biologisk oppfinnelse.

i

Beskrivelse av figurene

Figurene 1-2 viser aminosyresekvensen til de følgende FMDV-undertyper: C^K, C^, A,- , A1Q, A12, A2S. Sekvensen :il undertypene C^K, C^, A^ og A^2er basert på nukleotidsek-vensene til genet som koder for disse proteiner. Sekvensen

; I

til undertype A2S er basert på proteinsekvensing hvor den opptrer. Hvor det viser seg fordelaktig, ble sekvensene!i

Figur 1 og 2 forskjøvet i forhold til hverandre for å få dem mer på linje. Slike forskyvninger er betegnet med en brutt strek (--). Sekvensen i Figur 1 og 2 er nummerert slik at de ikke inneholder noen slike forskyvninger. Tallene behøver derfor ikke være i overensstemmelse med de virkelige aminosyresekvenstall for et spesifikt VPl

i protein.

i Idet det vises til Figur 1-2, ser man her at aminosyresekvensene til proteinet VPl av FMDV-undertyper 0 1 ,K, C^7

A,-, A^q , A^2og A2S. Se f.eks. C. Kurz et al., supra (undertype O1 .K); D.G. Kleind et al., "Cloned Viral Protelin Vaccine For Foot-And-Mouth Disease: Response In Cattle And Swine", 214 Science 1125-29 (1981) (undertype A12)r J Schaller et al., upubliserte data (undertyper A^ og C^) j Boothroid et al., Gene (i press) (undertype A^q) ; Strohiaaier ét al., privat meddelelse (A2S).

i

Fra en sammenligning av aminosyresekvensene til disse FMDV-

i undertyper har man funnet at det ikke foreligger en signifikant grad av sekvensvariasjon i spesielt veldefinerte områder i FMDV-polypeptidet. Dette området strekker seg :ra ca. aminosyre 130 til aminosyre 181. Det er også funnet at hvert VPl polypeptid av FMDV-undertyper O^K, og A,, nøytraliseres bare av antisera frembrakt mot det spesif:.ke polypeptid. Det nøytraliseres ikke av antisera frembrakt mot noen av de andre spesifike polypeptider. Følgelig har man postulert at områdene for maksimal aminosyresekvens--yariasjon mellom FMDV-undertypene er de deler av de kjente polypeptider som bærer de spesifike FMDV-antigendetermi--nanter, f.eks. fra ca. aminosyre 130 til 181 og spesiel-: fra ca. aminosyre 133 til 160 (Figur 1'og 2). Disse om-

i

irådef ble også analysert ved konvensjonelle a-helix, (3-folie og motsatte vridningskonformasjonspostulater [f.eks. G-E. Schulz og R.H. Schirmer, Principals Of Protein Struc-iure 118-120 (1979) og deri siterte referanser].

l

På basis av foreliggende sekvensanalyse og konformasjons-antagelser fremstiltes ifølge foreliggende oppfinnelse forskjellige peptider tilsvarende slike området for maksi-malt aminosyresekvens divergens og antatt konformasjon j som sannsynlig ville være egnet for en antigendeterminant.

Det ble også fremstilt et peptid utenfor områdene for maksi-l

mal divergens som var nær COOH-enden av VPl fra undertype O^K, fordi det området tidligere var blitt hevdet å inneholde antigendeterminantene [Strohmaier et al., supra].

i Deretter ble peptidenes evne til å danne antistoffer mo':

I I

VPl undersøkt og det ble vist at peptidene i foreliggende oj ppfinnelse viser antigenesisitet og spesifitet av FMDV-!<y>irusantigener. Det er også anvendelig i blandinger og i metoder for beskyttelse av angripelige dyr for en viss tid mot FMDV-vi rus infeksjoner. Det må være klart at selv om peptidene i foreliggende o]£p- I finnelse hovedsakelig kan karakteriseres ved én del av regionen for maksimal sekvensdivergens, kan også andre struktur og konformasjonstilpasninger være nødvendig for at peptidene skal vise den biologiske aktiviteten og spesifiteten til FMDV-virusantigener. For eksempel må peptidet ikke være for kort eller for lanat, slik at det ikke kan i

få en nødvendig konformasjon for slike aktiviteter. Derfor krever den faktiske bestemmelse av et riktig peptid som defineres ved foreliggende oppfinnelse de enkle målinger som her beskrives. Disse målinger slik det er her beskrevet kan utføres av en fagmann innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

!

De spesielle peptider i foreliggende oppfinnelse er der::or definert som peptider hvorav en vesentlig del omfatter én I . 0 I sekvens av aminosyrer valgt fra omradet for maksimum sekvensdivergens mellom proteiner VPl av de forskjellige FMDV-undertyper og som erkarakterisert vedat antisera dannes i i kaniner mot ca. 0,4 mg av peptidet (etter riktig kopling) binder til VPl av FMDV-undertypen fra hvilken denne amino-si yresekvens er ved en fortynning på minst ca. 1:100 og hvilke antisera er nøytraliserende for FMDV av den undertype i en musunge i en fortynning på ca. 1/10 av den fortynning ved hvilken den binder til VPl.

Det må selvfølgelig være klart at selv om Figur 1-2 bare viser FMDV-undertyper C^, A,. , A^q, A^2, og A2S, kan iden-tiske analyser anvendes for å bestemme lokaliseringen ay antigendeterminanten til andre FMDV-undertyper. Det må også være klart at peptidene i foreliggende oppfinnelse ikke jer begrenset bare til disse områder for maksimal aminosyrey sekvensdivergens mellom undertypene av FMDV. I stedet kan peptidene i foreliggende oppfinnelse gå utenfor det spesifike området eller kan inneholde helt ubeslektede aminoy syresekvenser eller kjemiske koplinger så lenge en hovedsakelig del av disse peptider inneholder sekvenser fra det : i spesielle område og disse peptider tilfredsstiller de andre definerte krav til peptidene i foreliggende oppfinnelsej.

Det spesifike utvalg av det bestemte peptid innenfor ovén-nevnte definisjon av peptidene i foreliggende oppfinnelse ér ikke kritisk. Et slikt utvalg kan foretas ved å ta et antall peptider og undersøke disse peptider som beskrevet i foreliggende oppfinnelse med hensyn til deres immunologiske og biologiske aktivitet mot FMDV.

I

i

l

Peptidene eller gruppen av peptider i foreliggende oppfinnelse kan deretter fremstilles ved vanlige synteser

som benytter hvilke som helst kjente peptidsyntesemetoder inkludert syntese på en fast bærer. Peptidene i foreliggende oppfinnelse kan også fremstilles i passende verter som er transformert med DNA-sekvenser som koder for det ønskede peptid. En kombinasjon av slike metoder kan selvfølgelig også anvendes. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen anvendes kjemisk syntese alene. Ved å bruke denne metode er peptidene i foreliggende oppfinnelse dertil fordelaktige for bruk i blandingene og frémgangsmåtene i fore-l; iggende oppfinnelse fordi de er lette å rense og ikke hiar biologisk opprinnelse. I en sterkere foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen er DNA-sekvensene som koder for pep-

I " i tidene i foreliggende oppfinnelse knyttet sammen og disse sekvenser brukes for å transformere passende verter for å muliggjøre ekspresjon av de ønskede peptider.

i

i Peptidene i foreliggende oppfinnelse er anvendelige i blandinger og metoder for å beskytte dyr mot FMDV for i detj minste et visst tidsrom. Peptidene kan anvendes i disse blandinger og metoder enten alene eller sammen med andre peptider fra klassen som er definert i denne oppfinnelse på en måte som er i samsvar med konvensjonell anvendelse av antigener i dyrevaksiner og behandlingsmetoder. Selvj om blandingene og fremgangsmåtene i foreliggende oppfinnelse kan karakteriseres ved et eller flere peptider fra en FMDV-undertype, er de sterkest foretrukne blandinger og fremgangsmåter i foreliggende oppfinnelsekarakterisertved peptider fra flere FMDV-undertyper og serotyper. I denne foretrukne utførelsesform er blandingene og metodene multivalente.

Selv om peptidene i foreliggende oppfinnelse kan anvendes alene i blandingen og metoden som her er beskrevet, kobles de fortrinnsvis til en eller flere bæreproteiner før bruk. Blant bæreproteinet som er anvendelig i foreliggende opp-finnelseer.storfeserum-albumin (BSA), tyroglobulin (Tyr; og nøkkelhull-limpet-hemocyianin (KLH) . Peptidene i forelag-gende oppfinnelse kobles til bæreproteinet på forskjellige vanlige måter. For eksempel glutaraldehyd [M. Reichlin, |'Use Of Glutaraldehyd As A Coupling Agent For Proteins And P' eptides", 70 Methods In Enzymology 159-165 (1980)], N-éIt<y>l-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid [T.L. Goodfriend et ai l., "Antibodies To Bradykinin and Angiotensin: A Use OfI Carbodiimides In Immunology", 144 Science 1344-46 (19641 ]g en blanding av N-etyl-N<1->(3-dimetylaminopropyl)-karbo-

i diimid og det succinylerte bæreprotein [M.H. Klapper et al., "Acylation With Dicarboxylic Acid Anhydrides", 25 Methods Of Enzymology 531-36 (1972); Goodfriend et al., supra] kan anvendes. Dertil kan peptidene i foreliggende oppfin-nI eise polymeriseres med et vanlig polymerisasjonsmiddeliI<,>f.eks. toluylendiisocyanat før bruk. F.eks. F. Wold, "Bifunctional Reagents", 25 Methods Of Enzymology 623-651 (19 72). i

I

Etter fremstilling av peptidet og kopling av det til bæreproteinet, anvendes om ønsket antigenet i fremgangsmåten o: g blandingene i foreliggende oppfinnelse på vanlig måtei. For eksempel blandes peptidet eller det koblede peptidet normalt med et eller en kombinasjon av velkjente hjelpej-I stoffer og additiver, fortrinnsvis ved først for eksempeilå oppløse peptidet i PBS med 0,1 % SDS. En annen utførelses-form av oppfinnelsen kan peptidene knyttes hydrofobe gruppe-for å bygge hjelpestoffet inn i blandingen. Selvfølgelig må! det være klart at de andre velkjente metoder for fremstilling av en blanding for behandling av dyr kan anvendes yed bruk av antigen-peptidene i foreliggende oppfinnelse.

Di en ovenfor fremstilte blanding " anvendes så på en konveni-sjonell måte for å behandle dyr som kan få FMDV-infeksjoner. Slike behandlingsmetoder og deres doseringsnivåer og krav er velkjente på området og kan velges av en fagmann blant tilgjengelige metoder og teknikker.

For at den her beskrevne oppfinnelse skal oppfattes klarere er de følgende eksempler gitt. Det må være klart at disse eksempler bare har illustrerende hensikt og ikke må anses som begrensende for oppfinnelsen på noen måte til de spesifike utførelsesformer som her er gitt.

i

Eksempel 1

Peptider tilsvarende aminosyresekvensene i polypeptid v:?l av FMDV- st amme 0-. K.

A. Seleksjon av peptidene i foreliggende oppfinnelse.

Som beskrevet ovenfor ble aminosyresekvensene som er vist

i Figur 1-2 analysert og området fra aminosyre 130 til L81 for VPl av FMDV-undertype O^K valgt som det området med maksimal divergens blant undertypene. Derfor fant man ifølge foreliggende oppfinnelse at dette polypeptidområde bar FMDV-antigendeterminanter. Dette området ble analysert ved bruk av a-helix, (3-folie og "reverse turns" konformasjo:is-forutsigelser [Schultz and Shirmer, supra].

i Siom følge av disse analyser ble fem peptider valgt for syntese: Peptid FA Ile-Val-Ala-Pro-Val-Lys-Gln-Thr-Leu ,(AA205-213 av VPl) Peptid FB Ala-Gln-Lys-Val-Ala-Arg-Thr-Leu i(AAl52-159 av VPl) Peptid FC Leu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu j ;(AA144-151 av VPl) Peptid FD Leu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala-|(AA144-159 av VPl) Gln-Lys-Val-Ala-Arg-Thr-Leu | Peptid FE Ala-Ile-Lys-Ala-Thr-Arg-Val-Thr-Glu-;(AA167-181 av VPl) Leu-Leu-Tyr-Arg-Leu-Lys

Disse peptider ble syntetisert via oppløsningsmetodenj (BACHEM). I foreliggende syntese ble det funnet mer henp siktsmessig å syntetisere hexadecapeptidet FD ved å komrbinere octapeptidet FB og FC fremfor å syntetisere pep-j tidet FD direkte. Også fire andre peptider ble fremstilt fra VPl av FMDV-stamme O-^K: Struktur og renhet av disse peptider ble bekreftet ved vanlig strukturanalyse.

kv disse fem peptider FA til FE ligger fire av dem, peptidene FB, FC, FD, og FE innenfor området for maksimal sekvensdivergens, f.eks. aminosyrene 130-181 (Figur 1 og 2). Peptid FE inneholder en aminosyre som er forskjellig fra d!entilsvarende aminosyre av VPl, undertype OjK. I peptidet FE er aminosyre 180 leusin, mens i VPl er den metionin ( Figur 1 og 2). Denne utskifting antas ikke edå i i er vtæatne re goimkt rriå atdheisa , kmF. MeEn DVt -deaanv t tepier gpentinidnedeetnnee rfmoir (npeeanpt ttoeimd r . rFao[AdSe t) roslhoim mggaetier ir dulteiegt ^ nearfljoelr.,

supra] . Alle peptidene 1 til 4 ligger innenfor området jior maksimal sekvensdivergens.

B. Immunologisk aktivitet av peptidene i foreliggende opp-finneIse. _ .— i j. Kobling av peptider til bæreproteiner■

i ! De ovenfor beskrevne proteiner ble koblet til bæreproteinene BSA, Tyr, KLH eller deres succinylerte motstykker ved forskjellige kjente metoder ved bruk av glutaraldehyd (Glu) eller N-etyl-N<1->(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (CDI). I Peptid og bærerprotein ble koblet på forskjellige måterl

i<!>

i i 1 I(a) Med Glu i '

i

' i i i i i 2 1 mg peptid ble oppløst i 10 pl H^O og tilsatt 15 mg bær■ e-protein i 2 ml natriumfosfatpuffer (0,1 M,pH = 7,0). 1 ml vannløsning av Glu (21 mM) ble så tilsatt dråpevis i løpet av en time ved lav temperatur. Blandingen fikk stå natten over og ble så dialysert mot PBS. __ j

j( b) MedCDI

I tilfelle ikke-succinylert bærerprotein ble 2 mg av pep-jbidet oppløst i 10 ul H20 og 15 mg bærerprotein i 1 ml natriumfosfatpuffer (0,1 M,pH = 6,0). Så ble en løsning av 120 mg CDI i et 150 ul H20 tilsatt dråpevis i løpet av

<pn time ved lav temperatur. Etter risting i en time ■ ved jromtemperåtur fikk reaksjonsblandingen stå natten over og ble dialysert mot PBS.

I tilfellet succinylert bærerprotein fremstiltes først en løsning av 20 mg bærerprotein i 200 ul H20 og ble tilsatt 100 mg ravsyreanhydrid litt av gangen mens reaksjons-blandingens pH ble holdt mellom ca. 7,0 og 7,2 med NaOH, Tilsetningen tok ca. en time. Blandingen ble så fryse-tørket og 1,5 mg av den ble brukt som ovenfor for CDI-kopling til. peptidet. 2. Polymerisasjon av peptider med toluylendiisosyanat.

De ovenfor beskrevne peptider ble polymerisert med toluylendiisosyanat (TDI) ved bruk av vanlige metoder.

3. Inokulering av forsøksdyr.

a. Kaniner

i Man oppløste de fri peptid- eller modifiserte peptidanti-j-gener i PBS med 0,1 % SDS og blandet de resulterende løs-ninger med fullstendig "Freund adjuvant" i et 1:1 forholid.Det anvendtes doser på 400 pg peptid og 1 mg bærerprotein eller 1 mg fritt protein i et totalvolum på 1,0 ml for sub-kutaninjeksjon i kaniner. Fire uker senere (28. dag) tok man blodprøver fra kaninene og målte sera ved bruk av forskjellige nedenfor beskrevne målinger. Resultatene av målingene er vist i tabell I, II og IV.

Etter å ha tatt de ovenfor beskrevne blodprøver gjentok man injeksjonen (adjuvanten for dette var ufullstendig "Frelind- akjuvant") og ti dager senere (38. dag) gjentok blodprø<y>er f: ra kaninene og målte sera som forut. Resultatene er visit i tabell I, II og IV. Til slutt gjentok man med kaninene 6, 17, 21, 24 og 26 etter å ha tatt de sist beskrevne blod-prøver, injeksjonen (hjelestoffet for denne dosen var

T

ufullstendig "Freund asjuvant") og ti dager senere (48. dag)

I

tok man igjen blodprøver fra kaninene og målte sera som forut. Resultatene er vist i tabell V.

i

b'. Storfe

i

Man oppløste igjen de fri peptid- eller modifiserte pep-j-tidantigener i PBS med 0,1 % SDS og blandet de resulterende løsninger med ufullstendig "Freund adjuvant" i et 1:1 forhold. Man anvendte doser på 1,2 mg peptid og 3 mg bærerprotein i totalvolum på 3 ml for intramuskulær injeksjon i i storfe. 7 uker senere tok man prøver fra feet og målte sera ved bruk av Elisa-bestemmelsen. Resultatene av målingene

er vist i tabell III.

Etter å ha tatt de ovenfor beskrevne blodprøver, gjentok

i man injeksjonen og 14 dager senere tok man igjen en blod-prøve og målte sera. Resultatene av målingene er vist i tabell III.

i

ci. Målinger

i_1_Elisa

Rebelagte mikrotiterplater (Nunc) ble belagt med peptid

(5 ug/brønn) eller autentisk VPl (0,25 ug/brønn)og inkubert natten over ved 37°C. Etter vasking av brønnene to ganger med PBS, ble brønnene mettet med 1 % BSA i PBS (30 min. ved 37°C) og brønnene ble tilsatt 50 pl sera (fortynninger 1:10 opp til 1:1 000). Etter inkubering i to timer ved 37°C ble

brønnene vasket fem ganger med PBS/triton X100 og man in-kuberte brønnene i ytterligere to timer med peroxidase-markert geite-anti-kanin IgG i et forhold på 1:500 i 1 BSA/PBS. Etter gjentatte vaskinger med PBS/triton X100 J;il-

satte man hver brønn 50 ul av en løsning av 0,4 % o-fenyl-

e3i n0 dmiaimnm utteor g s0to,p1p2 e% t Hma2n 02 eni zy0m,r1 eM aksfojsonfeante -soitg rbaets-pteumftfee rs. tEyI rt-ter, ken med et Titertek Multiscan fotometer ved 492 nm.

Man bestemte derfor ved den ovenfor beskrevne måling om antisera fremkalt av et peptid i et dyr bindes til peptidet

I

og til autentisk VPl. Ved dertil å bruke fortynninger av sera oppnår man en indikasjon på mengden av antisera.

i

I

iii_Musunge-måling

Musunge-målingen er en vanlig målemetode. F.eks. H.H. Skin-ner, 1 Proe. 15th Int. Det, Congr. Part 1, 195 (1952) . :: denne målingen ble antisera fremkalt i kaniner som foru-: blandet i forskjellige fortynninger med FMDV av den rik--.tige undertype og blandingen ble inkubert. Musunger inji-sIeres deretter med antisera-virus-blandingen. Da FMDV-infeksjonen dreper musunger hvis aktiv virus er tilstede i i den injiserte blanding (f.eks. virusen er ikke blitt nøytralisert med de antisera som er frembrakt av peptidene i foreliggende oppfinnelse) vil musen dø. Følgelig gir bestemmelsen et mål for den virusnøytraliserende aktiviteten til de antisera som dannes av peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Resultatene av musungemålingene er vist i

tabell IV og V. i

cIi l. Resultater av målinger

Elisa-målingene viste at peptidene FA, FB og FC i kombina-

ssjjoon n. dVanindeet re anetr idstiossfe fer anmtoist eVrPa l hoi veen dsmakeegelit g liakv kkeo-nnøsyentrtralai--serende i musunge-målingen. Dertil viser målingene at peptidet FE også danner antistoffer mot VPl i en meget lav konsentrasjon.

Peptidet FA ligger selvfølgelig utenfor det området som er j/algt på basis av maksimal sekvensdivergens ( ovenfor) . Peptidene FB, FC og FE ligger innenfor disse områder for maksimal sekvensdivergens. Mangelen på antigenaktivitet for disse peptidene skyldes derfor sannsynligvis deres manglende ei vne til å innta en korrekt konformasjon. '' Selvfølgelig mi<å>det være klart at hvis peptidene FB, FC eller FE blir modi-fisert ved forlengelse eller avkortning eller få den til å i! nnta korrekt konformasjon ved andre midler, kan de fallie innefor peptid-definisjonen i foreliggende oppfinnelse. Denne mulighet underbygges av den høye antigen- og nøy-tralisasjonsaktiviteten til peptidet FD som er en kombinasjon av peptidene FB og FC.

Elisa-målingene viste også at peptidet FD etter kopling, alene eller med peptidet FE, har sterkt antigenkarakter I F.eks. kaninene 23, 24, 17 og 21. Videre viste musungemålingene at de antisera som ble dannet av FD peptidet alene eller en kombinasjon av peptidene FD og FE er i stand til å nøytralisere FMDV. Positive resultater ble også ob-servert med peptidene 1 til 4.

Målingene viste også at antisera dannet av peptidene i foreliggende oppfinnelse er spesifike. De bindes ikke til VPl

i

av FMDV-undertype A^og bindes ved en grad på ca. 1 % til ViPl av FMDV-undertype C,.

E; ksempel II

peptider tilsvarende aminosyresekvenser i polypeptid VPL av FMDV- s tamme C-^.

Ved bruk av fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel I fremstilte man også målte peptider fra de områder, av VPl av FMDV-undertype C-^ som lignet dem man anvendte fra VPiL av FMDV-undertype 0-.K. Disse peptider viste antigenisitét i j- "I av FMDV-antigener i meget lik grad O^K peptidene, bortsett fra av graden av nøytralisering av antistoffer fremkalt av C, peptidene var lavere.

i Skjønt det her nå er fremlagt flere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, må det være klart at grunntanken kan endres og gi andre utføreIses former som anvender fremgangsmåter og blandinger fra foreliggende oppfinnelse.

Omfanget av oppfinnelsen er derfor angitt ved de medføl-

i gende krav og ikke ved de spesifike utførelsesformer som her forut er angitt i form av eksempler.

Claims

I

1. Peptid med antigenvirkning til et FMD-virus-antigen, karakterisert ved at en vesentlig del av peptidet omfatter en aminosyresekvens valgt fra et område med maksimal sekvensdivergens mellom protein VPl fra de forskjellige FMDV-undertyper, hvilket peptide videre er karakterisert ved at antisera dannet kaniner mot en enkelt injeksjon av 0,4 mg av peptidet etter ken riktige kopling bindes til VPl fra FMDV-under ty pen ::ra hvilket aminosyresekvensen stammer i en fortynning på minst ca. 1:100 og hvilket antisera er nøytraliserende overfor FMDV av denne undertype i en musungebestemmelse i en fortynning på ca. 1/10 av den fortynning ved hvilken den bin-dIes til dette VPl.

i 2. Peptid ifølge krav 1, karakterisert j/ ed

at området for maksimal sekvensdivergens strekker seg mellom ca. aminosyre 130 og aminosyre 181 fra VPl av de forskjellige FMDV-undertyper som er oppstilt ifølge de prin-sipper som er anvendt i Figur 1 og 2.

i3. Peptid ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at området for maksimal sekvensdivergens strekker seg mellom ca. aminosyre 133 og aminosyre 160 av VPl fra de forskjellige FMDV-undertyper som oppstilt ifølge prinsippene anvendt i Figur 1 og 2.

4. Peptid ifølge krav 1-3, karakterisert ved at FMDV-undertyper velges fra undertyper av FMD-serotyper valgt fra gruppen bestående av O, C, A, SAT1,| SA T

2, SAT3 og asiatisk type I.

5. Peptid ifølge krav 1, karakterisert v; e c.

at det som vesentlig del omfatter aminosyresekvensen Leu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala-Gln-Lys-Val-Ala-Thr-LeuL

6. Blanding for behandling av dyr for å beskytte dem en| viss tid mot FMDV-infeksjon, karakterisert ved at den omfatter minst et peptid ifølge kravene 1I-5.

7. Blanding ifølge krav 6, karakterisert ved at peptidet omfatter aminosyresekvenser valgt fra protein VPl fra to eller flere FMDV-undertyper.

8. Fremgangsmåte ved behandling av dyr for å beskytte dem i noen tid mot FMDV-infeksjon, karakterisert y e d at man behandler dyrene på en farmasøytisk aksep-titabel måte med blandingen ifølge krav 6 eller 7.

9. Fremgangsmåte ved fremstilling av peptidet ifølge krav 1i-5 , karakterisert ved at man dyrker én passende vert transformert med en DNA-sekvens som koder for disse peptider og isolerer disse peptider fra verts-

- kulturen.

I