NO821569L

NO821569L - Diagnostiseringsmetode og proevesett

Info

Publication number: NO821569L
Application number: NO821569A
Authority: NO
Inventors: Henry Anthony Erlich; Michael Alan Lovett
Original assignee: Cetus Corp
Priority date: 1980-09-24
Filing date: 1982-05-12
Publication date: 1982-05-12
Also published as: DK232882A; ES8303072A1; ES505713A0; EP0050424A1; EP0050424B1; BR8108820A; JPS57501692A; IL63907A0; DE3172347D1; WO1982001011A1; CA1167376A

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt diagnose

av sykdom eller allergi i pasienter. Mer spesielt ved-rører oppfinnelsen en forbedret metode for slike diag-noser, såvel som et forbedret produkt for gjennomføring av sådan diagnose.

Mange kliniske diagnoseteknikker har antigen-antistoffreaksjonen som sin fundamentale basis. Denne reaksjon tjener som et forsvar mot mikroorganismer og andre fremmed-legemer som en del av kroppens normale immunologiske

reaksjon. Deteksjon av nærværet av antigen-antistoffreaksjoner i tester gjennomført med serum oppnådd fra en pasient kan indikere nærvær eller fravær av antistoffer i pasientens serum. En positiv test for reaksjon med antistoff med et spesifikt antigen kan indikere et nærvær av en tilsvarende sykdom eller i det minste foreslå denne diagnostiske konklusjon.

Kjente kliniske diagnostiske metoder som tester for antigen-antistof f reaksjonen i sera (serotester) kan ha en lang rekke forskjellige former. Noen anvender antigener forankret til overflaten av inerte partikler. I nærvær av spesifikt antistoff klumper disse partikkelformede antigener seg synlig sammen i en aglutineringsreaksjon. En slik metode er anvendt i stor utstrekning ved diagnose av syfilis og er kjent som Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)-testen. Andre tester kan involvere tilknytning av en

fluorescerende eller radioaktiv del på en slik måte at

dens nærvær indikerer at antigen-antistoffreaksjonen har foregått. På lignende måte har enzymer vært tilknyttet som en detekterbar del- den såkalte enzymtilknyttede immuno-sorbent-prøve (ELISA).

Kriteriet for konvensjonelle serotester er at de måler et enkelt positivt eller negativt signal. Signaler kan f.eks. være hemaglutinasjon, hemaglutinasjons-inhibering, komplement- fiksering, overflatefluorescens, partikkelagglutinasjon osv. Det enkle positive eller negative signal er vanligvis en kompleks og udifferensiert rekke av de strukturelle' komponenter av en organisme eller material som er antigenisk forbundet dermed. Denne kompleksitet av det antigeniske testmaterial øker sannsynligheten for at falske positive signaler kan genereres pga. antistoffer som er simulert av andre organismer som deler noen men ikke alle de anti-geniske egenskaper med testmaterialet.

Det er derfor et formål for den foreliggende oppfinnelse

å tilveiebringe en diagnostiseringsmetode og et middel hvormed antigen-antistoffreaksjonen kan sterkt forbedres som et diagnostisk verktøy.

Et ytterligere formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe et;middel'hvormed nærværet av en spesifikk sykdom, eller spesifikt trinn i en sykdom, eller en allergi i en pasient kan detekteres ved hjelp av en enkel metode.-

Et mer generelt formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe en forbedret klinisk diagnostiseringsteknikk for nærværet av en spesifikk sykdom, et spesifikt trinn i en sykdom, eller en allergi i en pasient.

Andre formål for oppfinnelsen vil fremgå for den fagkyndige fra den etterfølgende beskrivelse i forbindelse med de vedføyde tegninger hvori: Fig. 1 er et fotografi av en konvensjonell SDS hvori akryl-amidgel som viser den totale protein profil av T.pallidum etter farging. Fig. 2 er et fotografi av et autoradiogram av 12 diagnostiseringsstrimler av T.pallidum, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for sera trukket fra pasienter, hvorav 8 hadde forskjellige trinn av syfilis og hvorav 4 hadde fremvist falsk positiv (BFP) ved standard serologiske tester for syfilis. Fig. 3 er et fotografi av et autoradiogram av ni diagnostiseringsstrimler for T.pallidum, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for sera trukket fra pasienter som lider av sen syfilis og sekundær syfilis. Fig. 4 er et fotografi av et autoradiogram av de diagnostiseringsstrimler av T.pallidum, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for sera trukket fra pasienter som lider av tidlig latent og sen latent syfilis. Fig. 5 er et fotografi av konvensjonelle SDS geler som viser de totale proteinprofiler av 5 forskjellige immuno-typer av Clamydia. Fig. 6 er et fotografi av et autoradiogram av 5 diagnostiseringsstrimler av Chalmydia trachomatis, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for kanin-antiserum for Chlamydia trachomatis immunotype B. Fig. 7 er et fotografi av et autoradiogram av 7 diagnostiseringsstrimler av Toxoplasma gondii, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for sera trukket fra pasienter med kronisk og akutt toksoplasmose. Fig. 8 er et fotografi av et autoradiogram av diagnostiseringsstrimler av cytomegalovirus-infiserte celler og cellefritt preparat av delvis renset virus, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for pasientsera Fig. 9 er et fotografi av et autoradiogram av diagnostiserings-strimler av kanin-nyreceller infisert med Herpes simplex-virus I eller II, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for sera trukket ut fra pasienter som lider av Herpes-infeksjoner. Fig. 10 er 'et fotografi av et autoradiogram av diagnostiseringsstrimler for kapsulært polysakkarid typer 4 og 8 for Streptococcus pneumoniae, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for et immunserum. Fig. 11 er et fotografi av autoradiogram av en diagnostiseringsstrimmel av bi - gift, konstruert i samsvar med

oppfinnelsen, etter eksponering for serum trukket fra en pasient som er allergisk overfor bi-gift.

Figurene 12 og 13 er fotografier av et autoradiogram av diagnostiseringsstrimler av type C.trachomatis, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter reaksjon med sera

fra pasienter med type F-infeksjon, henholdsvis type D-infeksjon.

Fig. 14 er et fotografi av et autoradiogram av diagnostiseringsstrimler av T.pallidum, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for sera trukket fra pasienter som lider av syfilis og etter eksponering for sera trukket fra pasienter som lider av syfilis og etter eksponering

for IgG og IgM spesifikke antisera-prøvesett.

Fig. 15 er et fotografi av et autoradiogram av diagnostiseringsstrimler av Toxoplasma gondii, konstruert i samsvar med oppfinnelsen etter eksponering for serum trukket fra en pasient som lider av akutt toksoplasmose og-etter eksponering for IgG og IgM spesifikke prøvesett. Fig. 16 er et fotografi av et autoradiogram av diagnostiseringsstrimler av cytomegalovirus, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for en serum-pool trukket fra pasienter som lider av viral infeksjon og etter eksponering for IgG og IgMspesifikke prøvesett. Fig. 17 er et fotografi av et autoradiogram av diagnostiseringsstrimler av Toxoplasma gondii, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, når toksoplasma-antigenene ble separert på: en ikke-denaturerende isoelektrisk fokuserende gel. Fig. 18 er et fotografi av et autoradiogram av diagnostiseringsstrimler av Toxoplasma gondii, fremstilt i samsvar med oppfinnelsen, når toksoplasma-antigenene separeres på et ikke-denaturerende nativt gel-system, og Fig. 19 er et fotografi av et autoradiogram av en diagnostiseringsstrimmel av klonet T.pallidum - spesifikke antigener, konstruert i samsvar med oppfinnelsen, etter eksponering for sera fra pasienter som lider av syfilis.

Meget generelt omfatter fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen å tilveiebringe et substrat i fast tilstand hvorpå det i et forut bestemt forhold avsettes et sett av differensierte antigeniske komponenter i et større sett av proteiner eller polysakkarider. Det større sett ved-rører den sykdom eller allergi som er under diagnose. Settet av komponenter selekteres slik at i det minste et undersett av komponentene er kjent'å være reaktivt med antistoffer tilstede i serum oppnådd fra en pasient med den spesifikke sykdom eller allergi. Substratet bringes i kontakt med serum oppnådd fra pasienten under diagnose under betingelser som tillater reaksjon av antistoffer i serumet med antigeniske komponenter på substratet. Fore-komsten og mønstret for antigen-antistoffreaksjonene på substratet detekteres deretter for samsvar med mønstret for de komponenter på substratet som er kjent å være reaktive for den spesifikke sykdom, det spesifikke trinn av sykdommen eller allergien.

Fremgangsmåten detaljert heri for sykdomsdiagnose er markert forskjellig fra konvensjonelle serotester ved at hva som omfatter en "positiv" test ikke er nærvær av et eneste signal, men snarere tilsynekomsten av en rekke signaler som representerer antistoff-reaksjon for definerte antigener forbundet med et spesifikt patogen eller sykdom. Antallet og naturen av signalene som definerer en sykdomstilstand defineres empirisk for hver spesifikk sykdom. Alle mennesker med denne sykdom, fremviser de samme multiple signaler som er karakteristisk for denne sykdommen.

Mer spesielt trekker oppfinnelsen fordeler av en

erkjennelse av vesentlig betydning, selv om den-er basert på antigen-antistoff reaksjonsfenomener. Hvis protein eller polysakkarid-material som vedrører en spesifikk sykdom, eller trinn i en sykdom, eller en allergi differensieres på en slik måte at det etableres et rommelig forhold mellom differensierte antigeniske komponenter, kan et flertall antigen-antistoffreaksjoner detekteres ved eksponering for serum fra en syk pasient. Utstrekningen og mønstret for slike reaksjoner, med passende differensiering kan gjøres sterkt spesifikt for en gitt sykdom. Følgelig kan det etableres en slags molekylært antigenisk "fingeravtrykk" som vil identifisere en spesiell sykdom og ingen annen. Videre kan dette molekylære anti-geniske "fingeravtrykk" bygges opp slik at det kan skjelne mellom historiske antistoffer, dvs. residuelle IgG anti-stoffer som indikerer tidligere eksponering for et gitt antigel, og nåværende antistoff, dvs. senere IgM anti-stoffer som indikerer meget nylig eksponering for et gitt antigen. I tilfellet med allergi-diagnose er det detek-terte antistoff immunoglobulin i IgE.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvender et substrat i fast tilstand hvorpå det i et forut bestemt rommelig forhold avsettes et sett av differensierte anti-geniske komponenter av et større sett av proteiner eller polysakkarider. Denne større gruppe vedrører sykdommen, trinnet i sykdommen, eller allergien under diagnose. Det kan være selve patogenet (f.eks. Herpes virus I eller 110 eller den kan være en vevs-prøve (f.eks. av en sarcom tumor) eller den kan være et allergen som f.eks. de forskjellige typer av gress eller pollen. Ofte vil kilden for det større sett av proteiner eller polysakkarider selv være antigenisk for en spesiell sykdom men er utilfredsstillende for diagnostisk bruk pga. ikke-spesifisitet, kryssreaktivitet

eller andre, problemer.

Settet av differensierte antigeniske komponenter av det større sett av proteiner eller polysakkarider velges for sin spesielle evne til å identifisere sykdommen, sykdomstrinnet eller allergien av interesse. Disse komponenter selekteres slik at i det minste et subset av komponentene er kjent å være reaktive med antistoffer tilstede i serum oppnådd fra en pasient med den spesifikke sykdom eller allergi. Subsettene bestemmes empirisk i samsvar med teknikk beskrevet i det etterfølgende. Den fremgangsmåte hvormed komponentene differensieres avhenger av den spesielle sykdom, det større protein eller polysakkarid hvorfra komponentene avledes, og de spesielle antistoffer som skal detekteres (f.eks. IgG, IgM eller. IgE). Slike differensieringsprosesser kan inkludere men er ikke begrenset til elektroforese (SDS eller nativ-gel), iso-elektrisk fokusering, tynnsjiktkromatografering og sentrifugering. En annen differensieringsprosess, når naturen av subjektet av komponenter er fastslått, er å fremstille hver komponent av sub-settet separat ved hjelp av genetisk modifiserte mikroorganismer. Hver komponent kan da anbringes separat på substratet.

I alle fall anbringes de individuelle differensierte komponenter på et substrat i fast tilstand.som f.eks. en cellulosestrimmel. Den nøyaktige måte for å knytte komponentene til substratet til avhenge av arten av komponentene og substratet. Hvis f.eks. elektroforese anvendes som differensieringsprosess er en nyttig overføringsteknikk den såkalte filter-affinitets-overføring som beskrevet av Erlich, H.A., et al., i Journ. Biol.Chem. 254:12240-12247

(1979).

Et typisk substrat i fast tilstand kan være en cellulosestrimmel hvortil et flertall differensierte kompoøenter av patogenet ansvarlig for en sykdom er blitt overført. Når

i

strimmelene-- eksponeres for en pasient-serum vil komponenter som er reaktive med antistoffer i serumet binde til denne og kan detekteres ved hjelp av en hvi-lken som helst passende prøve. Før sådan eksponering kan strimmelen se tom ut med de differensierte komponentene ikke synlige. Når de engang er eksponert for antistoffer bevirker antistoff-antigenreaksjonene av antistoffene.bindes til strimmelen i et mønster som indikerer nærvær eller fravær av en spesifikk sykdom. Ved foregående empirisk testing kan det lett fastslås hvilke differensierte proteiner eller grupper av proteiner på et gitt substrat som vil reagere med anti-stoffer i serum av en pasient med den spesifikke sykdom som er av interesse. Således kan separate strimler fremstilles som er spesifikke f.eks. for Chlamydia, syfilis og gonore', henholdsvis.

Når engang strimmelen eller substratet i fast tilstand er fremstilt med det empirisk bestemte eller selekterte mønster av differensierte antigeniske komponenter etablert på substratet, er dette i en form som kan brukes for klinisk diagnose. For en slik anvendelse eksponeres.eller bringes substratet i kontakt med serum oppnådd fra en pasient under diagnose. Betingélsene hvorunder kontakten foregår etableres slik at det tillates reaksjon mellom antistoffer i serumet og antigene komponenter på substratet.

Etter passende opplyssende trinn, f.eks. prøver merket med radioaktivitet og som er spesifikke for human-immunoglobu-linklasser og autoradiografi, undersøkes strimmelen for å fastslå eventuelt mønster av antistoff-antigen reaksjoner som har utviklet seg. Hvis mønstret tilsvarer det mønster som er kjent for den spesielle sykdom som tilsvarer strimmelen eller substratet, oppnås en positiv diagnose.

Ellers en diagnosen negativ. Aktuell deteksjon av antigen-antistof f reaksjonene kan anvende andre enn den autoradio-grafiske bedømmelse vist i fig. 2. F.eks. kan kolorimetrisk bedømmelse også anvendes.

Tradisjonelt har radio-aktlvt merket S. aureus protein A vært anvendt som en prøve for IgG antistoffer. For å skjelne mellom reaksjoner med historisk antistoff (IgG) og nytt antistoff (IgM), kan antiserum til human IgM merkes på en rekke forskjellige måter, f.eks.<125>j eller fluorescin, og anvendes som prøve for å detektere dannelsen av nytt human antistoff (IgM). Dette tilveiebringer muligheten av å skjelne mellom personer med en historie for en sykdom som ikke for tiden har en aktiv form av denne sykdom og personer med den aktive form av sykdommen. Historiske anti-stoffer vil i mange tilfeller være til-bake i en helbredet person i hele levetiden. Oppfinnelsen vil lettere forstås ved hjelp av de følgende eksempler. Disse eksempler er angitt for å illustrere oppfinnelsen og skal ikke på noen måte begrense denne.

EKSEMPEL I Anvendelse av oppfinnelsen for korrekt

diagnose av syfilis

Figur 1 er et fotografi som viser den totale proteinprofil av Treponema pallidum. Disse proteiner separeres og farges på en konvensjonell SDS polyakryiamid-gel. For å oppnå denne profil ble intakt T. pallidum suspendert i en elektroforese-prøvebuffer bestående av 62,5mM Tris (pH 6,8), 2% natriumdodecylsulf at og 5% merkaptoetanol. Prøven ble så påført et SDS-polyakrylamidgel-system som beskrevet i Laemmli, U.K. Nature (London) 227:680-685 (1970). Gelen ble behandlet inntil sporfargestoffet nådde bunnen av gelen.

I fig. 1 representerer den venstre kolonne profilen for T.pallidum, mens den høyre kolonne er et system av mole-kyl vektmarkører som er vel kjent ved bruken av polyakryl-amidgelsepareringer.

Fig. 1 gir en basis for sammenligning av den aktuelle protein-separasjon med den antigene aktivitet beskrevet i fig. 2.

t

n

I fig. 2 ble diagnosestrimler fremstilt i samsvar med oppfinnelsen under anvendelse av den totale protein-separasjon av T.pallidum illustrert i fig. 1. For fremstilling av strimlene dekkes gelen med nitro-cellulosepapir som beskrevet av Towbin, H, T. Staehlin og Gordon J., PNAS (USA) 76:4350-4354 (1979). Papiret dekkes så med mellomleggsputer og understøttes av gitter-verk med tallrike porer av lucit. Montasjen holdes sammen ved hjelp av gummibånd og anbringes så i et enkelt kammer for elektroforese slik at overflaten av gelen påført direkte på papiret vender mot anoden. Elektroforesen gjennomføres i en elektrodebuffer bestående av 25mM Tris, 192mM glycin og 20% volu/volum metanol ved pH 8,3. Elektroforesen gjennomføres i 90 minutter. Nitrocellulosen inneholder ved slutten av denne prosedyre proteinene anordnet i rekke-følge ettersom de er blitt separert i henhold til molekylvekten og omtales som "avtrykket".

Avtrykkene ble så lagt i bløt i en oppløsning av 1% bovin serumalbumin i en buffer bestående av 50mM Tris (pH 7,5), 0,9% natriumklorid, 0,25% gelatin, 0,2 natriumazid og 0,1% NP 40 (TSGAN) i 10 minutter ved romtemperatur. Dette var for å mette alle resterende reaktive steder på papiret.

Ved dette tidspunkt er avtrykkene ferdig for bruk og kan lagres ved frysing eller andre passende foranstaltninger.

Hver av strimlene i fig. 2 er et avtrykk av T.pallidum totalproteinprofil eller eksponering for pasientserum som representerer forskjellige trinn av syfilis (8 pasienter) og representerer ikke-syfilitiske patenter som viste falsk positiv (BFP) ved standard serologiske tester for syfilis(4 pasienter). Serumfortynninger ble anvendt ved 1:1000 ved 12 timer ved romtemperatur med forsiktig om-rysting. Etter denne inkubasjonsperiode med serum ble avtrykkene renset flere ganger med TSGAN og deretter vasket med TSGAN i 20 til 60 minutter ved romtemperatur, på nytt med forsiktig omrøring. Deretter ble 2 til 4 mikrocurier av protein A med spesifikk aktivitet på mer enn 10 tellinger pr. minutt/mikrogram tilsatt i et volum på

10 til 200 ml TSGAN og inkubasjon fortsatt med en for-

siktig omrøring i 60 minutter ved romtemperatur. Et lignende inkubasjons- buffersystem er beskrevet i Renard, J., Reiser, J., og Stark, G.R., PNAS (USA) 76:3116-3120 (1979).

Avtrykkene ble så renset flere ganger med TSGAN, vasket

med TSGAN med forsiktig omrøring ved romtemperatur i 20 minutter og deretter renset flere ganger med destillert vann, tørket med en hårtørrer og deretter underkastet autoradiografi. Autoradiografien foregikk med Kodak X-omatic R film og DuPond Cronex intensiveringsskjerm. Autoradiografien tar vanligvis fra 2 til 6 timer.

Av strimlene for 8 syfilitiske pasienter vist i fig. 2.

kan det sees at lignende reaksjonsmønstre eksisterer,

spesielt med hensyn til pasientene 1-5 og 7. Dette stemmer også for pasientene 6 og 8, selv om styrken av reaksjonene er mindre uttalt. På den annen side kan pasienter som var falskt positive i VDRL-testen, vist i fig. 2 som pasientene 9-12, klart skilt fra de ekte positiver ved hjelp av testene gjennomført i samsvar med oppfinnelsen.

Fig. 3 viser en diagnostiseringsstrimmel av IgG ånti-stoff-reaksjon overfor peptider av T.pallidum fra pasienter med sen syfilis og sekundær syfilis. Gelene, protein-

prøvene og strimlene ble fremstilt som skissert ovenfor.

I fig. 3 er den ytterste høyre strimmel et system med molekylvekt-markører. Strimlene 1-8 illustrerer antistoffreaksjonen fra pasienter som lider av sen syfilis, mens strimmelen 9 viser anti-stoffreaksjonen som tyder på

den sekundære form av sykdommen.

Fig. 4 viser diagnostiserings-strimler av IgG antistoff-reaksjon overfor peptider fra T.pallidum fra pasienter med tidlig latent og sen latent syfilis. På nytt ble prøvene fremstilt som skissert tidligere og på nytt er den ytterste høyre kolonne et system av standard molekylvekt- gelmarkører. Strimlene 1 og 2 viser reaksjonen fra pasientene i tidlig latent trinn av sykdommen. Strimlene 3 til 10, som viser et annet "fingeravtrykks"-mønster,

er fra pasienter i det siste latente trinn av sykdommen. Det kan således sees at den diagnostiske strimmel i. samsvar med oppfinnelsen tilveiebringer en mye mer på-litelig rest for påvisning av nærværet av de forskjellige trinn av syfilis men de standard serologiske tester for syfilis.

EKSEMPEL II Anvendelse av oppfinnelsen for detektering

av Chlamydia Antigen

Fig. 5, venstre kolonner 1-5, viser de fargede totale proteiner av 5 forskjellige immunotyper av Chlamydia. Kolonne 6 i fig. 5 er et molekylvekt-markørsystem. Ved standard-serologi er disse immunotyper ikke-kryssreaktive. Følgelig må et separat antiserum for klinisk bruk fremstilles for hver serotype. Fig. 6 viser strimler i samsvar med oppfinnelsen fremstilt i henhold til eksempel I etter eksponering for kanin-antiserum for Chlamydia trachomatis immuno type B og autoradiografi. Preparater og metoder var som i eksempel I. Alle C.thracomatis immunotyper har utstrakt kryss-reaksjon av de vesentlige anti-geniske proteiner. Det kan ses at de venstre fire strimler viser sterk reaksjon mens derimot strimmelen ytterst på høyre, spesifikk for C. psittaci, viser svak beslektethet for' bare to antigener. Dette illustrerer at en enkel C.thracomatis immunotype

er en tilstrekkelig kilde for antigener for testing av human infeksjon med hvilke som helst andre C. thracomatis immunotyper og likevel gir spesifisitet ved at andre typer

I

av Chlamydia lett kan skjelnes.

EKSEMPEL III Anvendelse av oppfinnelsen for detektering

av Toxoplasma qondii antigen

Fig. 7 er et fotografi som viser forskjellige antigeniske bånd av Toxoplasma gondii som reagerer med antistoffer i sera av pasienter med kronisk og akutt toksoplasmose.

For oppnåelse av de iakttatte mønstre ble toksoplasmal-antigener separert på en konvensjonell SDS polyakrylamid-

gel. Et sonikat av Toxoplasma ble suspendert i et like stort volum av elektroforese-prøvebuffer bestående av 0,125M trisma-base (pH 6,8), 2,5% natriumdodecyl-sulfat,

og 2, 5% 8-merkaptoetanol. Prøven ble så påført et SDS-polyakrylamid-gelsystem som beskrevet i Laemmli,

U.K. Nature (London) 227:680-685 (1970). Gelen ble behandlet 'inntil sporfargestoffet nådde bunnen av gelen.

Gelen ble så vasket i 15 minutter i vann og i 2 minutters vaskinger med 50mM natriumacetat, pH 7,0. Peptidkomponentene av toksoplasma, separert ved hjelp av molekylvekten i SDS polyakrylamidgelen, ble elektroforetisk overført på brom-cyan-aktivert papir på følgende måte. Gelen ble anbragt på en klar klebestrimmel dekket med filterpapir.

Et ark av brom-cyan behandlet filterpapir ble lagt på

gelen og et annet ark av filterpapir og en klar klebestrimmel ble anbragt på toppen. Montasjen ble anbragt i en E-C-elektroavtrykksenhet med brom-cyan papiret mot.anoden. Elektroforese ble gjennomført i 50mM natrium-acetat,

pH 7, ved 25 volt i 1 time.

Alle resterende reaktive steder på brom-cyanpapiret bindes og/eller inaktiveres ved bløtlegging av papiret i en oppløsning av lm glycin og 1% bivin-serumalbumin i 0,5 til 3 timer. Papiret ble vasket 3 ganger hver gang 5 til 15 minutter med omrøring i en vaskeløsning inneholdende' 0, 1% ovalbumin, 0,1% "tween 20", 0,02% natriumazid i fosfat-

bufret saltløsning. Papiret inkuberés så ved romtemperatur med forsiktig omrøring i 2 til 3 timer i et fortynnet humanserum.

De sera som anvendes i fig. 7 er fra pasienter med kronisk eller akutt toksoplasmose. Pasientens serum fortynnes 1:25 i vaskeløsning.

Etter inkubasjonen med serum vaskes papiret 3 ganger i

5 til 15 minutter med rysting i vaskeløsning. 125I-

protein A tilsettes til papiret under anvendelse av 1:200 fortynning av prøven (ca.5u/ml, 15yci/yg) i vaske-løsning. Protein A ioderes under anvendelse av kloramin T-metoden som beskrevet av Erlich, H., Cohen, S, og McDevitt, H i Cell 13:681-689 (1978). Papiret inkuberes med<1>25 I-protein A i 1 til 3 timer ved romtemperatur med omrøring. Papiret vaskes på nytt som ovenfor, tørkes og anbringes under Kodak XAR-5 røntgenfilm i 16 timer.

Strimlene 1,2 og 7 i fig. 7 viser reaksjonen av sera fra pasienter' som lider av kronisk toksoplasmose. Strimlene 3 og 4 illustrerer den akutte form av sykdommen. Kon-troller fra uinfiserte pasienter er vist i strimlene 6

og 7. Kollektivt vises strimlene at bruk av oppfinnelsen tillater ikke bare deteksjon av toksoplasmose men også muligheten av å skjelne mellom kroniske og akutte former av sykdommen.

EKSEMPEL IV Bruk av oppfinnelsen for detektering av

'. cytomeqalovirus antigen o

Strimlene i fig. 8 illustrerer båndmønstrene oppnådd når cytomegalovirus infiserte celler og cellefri preparater av delvis renset virus reageres med pasient-sera. Elektroforese og overføring gjennomføres som skissert i eksempel III. Fremstillingen av de infiserte celler ble gjort som følger: To Corning 490 cm 2 rulleflasker inneholdende et sammen-flytende passeringslag av 8 humane embryo-lungeceller ble hver inokulert med 2,5 ml infiserte celler inneholdende mellom 10 7 • og 10 8 viral-partikler/ml. 14 ml Eagle minimal essensielt medium pluss 10% fetalt kalveserum ble tilsatt til hver flaske. Cellene ble inkubert ved 37°c i 1,5 timer før tilsetning av ytterligere 93

ml medium. 7 døgn senere ble cellene trypsinert av og sentrifugert ned til 2000 omdreininger pr. minutt i 5 minutter ved romtemperatur. De?resulterende 1,5 ml av pakkede celler ble suspendert på nytt i 3,5 ml medium, frosset i kullsyreis og lagret ved -20°c i 13 døgn.

Det fri virus inneholdes i supernatanten fra infiserte celler. En kontrollflaske av uinfiserte humane embryo-lungeceller ble også fremstilt.

EKSEMPEL V Bruk av oppfinnelsen for detektering av

Herpes Simplex virus- antiqen

Fig. 9 illustrerer dette eksempel. Kanin-nyreceller ble infisert med enten Herpes simplex virus type I eller Herpes simplex virus type II". Peptider fra disse infiserte celler ble separert på 9,5% denaturerende SDS polyakrylamidgeler som beskrevet i eksempel 1. Diagnostiseringsstrimler avledet fra gelene ble så kryssreagert med serum fra pasienter som led. av type I eller type II Herpes infeksjoner. Fig. 9 er et fotografi av et autoradiogram av disse diagnostiseringsstrimler etter eksponering for passende radioaktive prøver.

Strimmel 1, dvs, strimmelen lengst ut til høyre på fotografiet, viser et standard system av molekylvekt-markører. Strimlene 2 og 3 viser hvorledes serum fra pasient J.K reagerer med antigener fra de typer av Herpes. Strimmel 2 representerer proteiner avledet fra Herpes-virus type I mens strimmel 3 representerer proteiner avledet fra Herpes virus II. Sammenligning av strimlene viser at serum fra pasient J.K. inneholder IgG anti-stoffer som reagerer sterkt med peptidene avledet fra Herpes virus type I infiserte celler, og bare svakt med peptider avledet fra Herpes virus type II infiserte celler.

Strimler 8,.9 og 10 viser reaksjonen av serum fra pasient L.O. Strimlene 8 og 9 representerer proteiner avledet

fra Herpes virus type I, strimmel 8 protein-demonstrerer en igG-reaksjon mens strimmel 9 demonstrerer nærværet av IgM. Strimmel 10 representerer proteiner avledet fra Herpes virus type II. Sammenligning av strimlene viser

at serum fra pasient L.O. inneholder IgG antistoffer mot proteiner avledet fra Herpes virus type II infiserte celler. De viser også at L.O.'s serum reagerer bare svakt med. protein avledet fra Herpes virus type I infiserte celler. Strimlene 4 til 7 og strimlene 11 og 12 er ikke relevante for dette eksempel.

EKSEMPEL VI Bruk av oppfinnelsen for deteksjon av

polysakkarid- antigen

Fig. 10 illustrerer reaksjonen av immunserum med pneumococcalt kapsulært polysakkarid av typene 4 og 8. 3 mikrogram av renset polysakkarid ble påført i flekker på 2 nitrocellulosestrimler. Pre-immunserum reagerte ikke med disse antigener. Immunserum til type 8 reagerte sterkt med type 8 og mindre sterkt med type 4 pneumo-coccale polysakkarider.

EKSEMPEL VII Bruk av oppfinnelsen for diagnose for

diagnose av en allergi.

Fig. 11 illustrerer reaksjonen av sera fra en pasient som er allergisk overfor bi-gift. Strimmelen ble fremstilt under anvendelse av intakt bi-gift profilert på en SDS-polyakrylamidgel i samsvar med tidligere beskrevne metoder. Serumfortynningene var 1:20 med eksponering i 18 timer ved romtemperatur med forsiktig rysting. Prøve-125

settet anvendt for autoradiografi /var I-kaninanti-human IgE.

EKSEMPEL VIII Oppfinnelsen er ikke begrenset av immuno-

; type- spesifisitet

I

0 Fig. 12 illustrerer reaksjonen av serum fra en pasient med type F-infeksjon med proteiner av type L2 C trachomatis. Fig. 13 viser, på en identisk strimmel, reaksjon av serum.fra en pasient med type D-infeksjon med proteiner av type L2. Likhetene i mønstrene ses lett. Til forskjell fra mikro-immunofluorescens-testene for C.trachomatis, hvor human-infeksjon med disse immuno-typer resulterer i ikke-kryssreaktiv overflate antistoff, viser disse mønstre at reaksjonen er C. trachomatis arts-spesifikk og ikke immunotype-spesifikk. Begge strimler qle fremstilt og eksponert i samsvar med metodene indikert i forbindelse med eksempel I.

EKSEMPEL IX Bruk av oppfinnelsen for å skjelne mellom

IgG og IgM immunoglobuliner

Diagnose-strimlene i samsvar med oppfinnelsen kan anvendes for å skjelne mellom klasser av immuno-globuliner. Fig.

14 illustrerer hvorledes IgM og IgG fra syfilis-pasienter lett kan skjelnes og hvorledes nærværet av det ene eller det annet av disse antistoffer kan skjelnes fra sera fra normale pasienter. I fig. 14 separeres T.pallidum

og farges på SDS polyakrylamidgel som beskrevet i eksempel I. Kanin-antiserum til human IgM ble merket med -i p c I

125

og anvendt som prøve som IgM. I merket protein A,

av S.aureus ble anvendt som en prøve for IgG.

Den ytterste høyre kolonne i fotografiet i fig. 14 er

et standard system av molekylvekt-markører vel kjent for den fagkyndige. De resterende seksten kolonner representerer diagnosestrimler etter eksponering for serum fra 8 forskjellige pasienter. Den høyre strimmel .tA) i hvert 125

par ble prøvd med I kanin antihumanIgM og venstre strimmel (B) med<1>25 I protein A som er spesifikt for IgG. De første 5 pasienter (dvs. de første 10 strimler) illustrerer sera fra pasienter med primær syfilis. De neste 3 pasienter (dvs. de resterende 6 strimler) illustrerer

I

sera fra normale pasienter ikke smittet med syfilis. Strimler fra disse siste 3 pasienter viser at ikke-smittede mennesker har lite eller ingen IgG eller IgM antistoffer for antigen-proteiner avledet fra den organisme som bevirker syfilis. I motsetning hertil, har alle pasienter med primær syfilis IgG og IgM antistoffer til proteinene fra T.pallidum. IgG eller historiske anti-stoffer er klart skjelnbare fra de vanlige IgM antistoffer i alle pasientene med primær syfilis.

Fig. 15 viser at diagnosestrimlene i samsvar med oppfinnelsen kan anvendes for å skjelne mellom IgG og IgM antistoffer i sera av pasienter som lider av toksoplasmose. Toksoplasma gondii ble separert og behandlet på SDS-polyakrylamidgel som beskrevet i eksempel III. Overføring av gel proteinmønstret til diagnosestrimlene er også beskrevet i det nevnte eksempel. Strimlene 1 og 2 ble inkubert med serum fra en pasient med et akutt tilfelle

125

av toksoplasmose. I merket protein A av s.aureus

125

ble anvendt som en prøve for IgG i strimmel I. I merkede affinitetsrensede geite-antistoffer for human IgG ble anvendt som en prøve for IgM. Strimmel III representerer velkjente molekylære markører.

Fig. 16 illustrerer at diagnosestrimlene kan anvendes for å skjelne mellom IgG og IgM antistoffer i sera av pasienter smittet med cyto-megalovirus. Prøvene og trinnene ble fremstilt som skissert i eksemplene III og IV. På nytt

125

ble I merket protein A anvendt som en prøve for IgG

125

og I merket affinitetsrenset geite-antistoffer for human IgG ble anvendt som en prøve for IgM. Strimmel 1 i fig.16 viser nærværet av IgG, strimmel 2 nærvær av IgM. Strimmel 3 er et system av standard molekylære markører.

EKSEMPEL X Antigene proteiner for diagnosestrimlene kan

separeres på ikke- denaturerende geler.

A. '] Bruk av ikke- denaturerende iso- elektrisk- fokuserende

gel

Fig. 17 illustrerer toksoplasma antigen-bånd iakttatt når antigenet separeres på ikke-denaturerende iso-elektrisk fokuserende gel og sekvensmessig inkuberes med

125 pasientsera og i protein A. Et sonikat av Toxoplasma gondii fremstilles med 1% i ikke-jod P40. Ikke-solubiliserte membraner peletiseres ved sentrifugering ved 15000 omdreininger pr. minutt i 2 minutter. Super-natatet pipetteres direkte ut på den forbehandlede gel.

Gelen fremstilles med 5% i akrylamid, 0,0013% i bis-akrylamid (T=5,l%, C=2,6%), 13% sukrose, 2% ikke-jod P40 og 5% i amfolytter pH 3,5-10,0. Gelen polymeriseres med ammoniumpersulfat og TEMED i l.time. Gelen for-behandles i 1-2 timer med 30 rna konstant strøm med et spenningsmaksimum på 1000. Anodeoppløsningen er IM fos-forsyre, katoden IM natriumhydroksyd. Prøvene tilsettes til gelen'og elektroforesebehandles i 2,5 timer ved 1000 volt. De separerte antigener overføres til brom-cyan-behandlet papir som skissert i eksempel III, med unn-tagelse av at gelen ikke vaskes med vann og natriumacetat før overføringen.

I fig. 17 viser strimlene 1-4 de isoelektriske bånd fra pasienter som lider av toksoplasmose. Strimler 5 og 6 er fra ikke-smittede mennesker og viser derfor ikke noen bånd. Strimmel 7 er et positiv med 1 kanin-antiserum.

B. Bruk av ikke- denaturerende nativ- gel

Fig. 18 viser Toxoplasma gondii båndmønster oppnådd når antigener separeres på et ikke-denaturerende nativt gel-system og sekvensmessig inkuberes med pasientsera og 125

I protein A. Metoden beskrevet i- eksempel III for elektroforese og overføring av toksoplasma anvendes med følgende modifikasjoner. Gelen fremstilles med 7,5% akrylamid, 0,2% bis-akrylamid, 2% ikke-jod P40 og 75mM

i

Trizma-base. plus 32mM borsyre pH 8,9., Gelen polymeriseres med ammoniumpersulfat og TEMED i 20 minutter. Gelen overdekkes med en overlagsgel fremstilt med 4% akrylamid, 0,1% bis-akrylamid, 2% ikke-jod P40 og 37,5

mM Trizmabase plus 16mM borsyre pH 9,8. Denne overlagsgel polymeriseres med ammoniumpersulfat og TEMED

i 10 minutter. Elektrodebuffer for systemet er 0,1% ikke-jod P40, 75mM Trizmabase, 32mM borsyre pH 8,9. Toksoplasma sonikerte organismer fremstilles med 1% i ikke-jod P40 og tilføres gelen som i eksempel III.

Strimmel 1 fremstilles fra en ikke-smittet pasient og viser derfor ikke noen bånd karakteristisk for toksoplasma antigener. Strimlene 2-6 er fra pasienter som lider av forskjellige former av toksoplasmose. Alle viser bånd karakteristisk for sykdommen. Strimmel 7 er en positiv kontroll med et kanin-antiserum.

EKSEMPEL XI. Antigene proteiner i samsvar med oppfinnelsen kan fremstilles av genetisk behandlede mikroorganismer

De antigene proteiner anvendt ved oppfinnelsen kan være produkter av gener avledet fra antigene organismer som er blitt separat klonet inn i passende genetisk behandlede vert-mikroorganismer. Ekspresjon av klonet T.pallidum DNA i E.coli illustrerer slik antigent proteinfremstilling.

I dette eksempel ble Treponema pallidum først høstet fra testiklene av 10 kaniner. Testiklene ble grundig knust i fosfatbufret saltløsning før den resulterend ekstrakt ble underkastet flere sykluser med differensial-sentrifugering for å fjerne cellulært avfall. Den endelige super-natant, som inneholdt motilt og virulent T.pallidum, ble ytterligere renset på en densitetsgradient under anvendelse' av en homogen oppløsning av Percoll, fremstilt av Pharmacia Corporation, Piscataway, New Jersey, 08854. Sentrifugering ved 20.000 omdreininger pr. minutt i 29 minutter fremstilte i

et bånd med forholdsvist rent, motilt og virulent T. pallidum. Båndet ble trukket ut fra Percoll gradient-materialet, underkastet en fortynning i fosfatbufrets saltløsning og deretter peletisert ved hjelp av ultra-sentrifugering ved 10.000 x G i 2 timer. Peleten av T.pallidum /ble suspendert på nytt i buffer inneholdende Tris EDTA, pH 7,5, før behandling med detergenten "Sarcosyl" (N-lauroyl-sarkosin) fremstilt av Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri 63178, for å frigi treponemalt DNA. Den resulterende DNA-detergentekstrakt ble sentrifugert til likevekt på en cesium-klorid densitetsgradient. Det treponemale DNA-bånd ble så trukket ut fra gradienten og dialysert mot Sau3A I restriksjonsbuffer minus magnesium. Det dialyserte DNA ble delvis oppsluttet med Sau3A I restriksjons-endonuklease under anvendelse av teknikk vel kjent for den fagkyndige og deretter ligert til renset BamH I-kuttede stykker av colifage Charon 30.

Rimm, D.L., et al, Gene 12:310-309 (1980). Ligasjons-metoder var på nytt dem som er vel kjent for den fagkyndige innenfor rekombinant.DNA-teknikk. T.pallidum DNA-colifage Charon 30, produktet ble sammenpakket in vitro, Blattner, F.R. et al, Science 202:1979-1284 (1978) og deretter anvendt for å infisere E.coli stammen K 802. De resulterende belegg ble selektert for T.pallidum antigener ved hjelp av en in situ radiu immuno-prøve. Seleksjon ble gjort ved en modifikasjon av den såkalte "Western" avtrykks-metode til Towbin, H., et al, PNAS USA 76:4350-4354 (1979). Nitrocellulose fiver ble lagt over fagebeleggene og skivene fikk absorbere protein i 10 til 30 minutter. Lite protein ble absorbert fra ikke-lysert E.coli i laget. Nitro-cellulosefilterne ble så dekket méd oval.bumin ved bløt-legging i 10 minutter i 5% ovalbumin i 50mM Tris HCl (pH 7,5), 150mM NaCl, 0,15% natriumazid (TSA-5%OA). Belegg-avtrykkene ble inkubert natten i enten human-sekundære syfilitiske sera i normale humansera. Begge sera ble fortynnet 1:300 i TSÅ-1%0A. Autoradiogrammer ble fremstilt

i

av Tdwbin, .supra, etter at avtrykkene var eksponert for 125

I-merket S.aureus protein A.

Et belegg, betegnet Tp3A, ga en spesiell sterk reaksjon med et sekundært syfilitisk serum, og ble anvendt for ytterligere transformasjoner. Fage fra belegg Tp3A ble fortynnet og på nytt lagt på E.coli CSH 18. Ved for-

nyet seleksjon med 3 forskjellige sekundære syfilitiske sera, frembragte alle Tp3A-belegg autoradiogrammer som viste positive radioaktive reaksjoner. Autoradigrammer fra kontrollbelegg av kloningsvektor Charon 30 fremviste liten eller ingen radioaktivitet. Dette viste at gen- •• produkter fra Tp3A-transformerte verter var antigeniske for antistoffer i sera fra syfilitiske individer.

For ytterligere å studere gen-produktene fra Tp3A transformerte verter ble et totalt proteinlysat fra de transformerte verter underkastet SDS-polyakrylamidgel-elektroforese som beskrevet i eksempel III. De differensierte polypeptider ble så elektroforetisk overført til nitrocellulosestrimler som beskrevet i eksempel I. Strimlene ble belagt med ovalbumin og inkubert med syfilitiske sera. På nytt ble autoradiogrammer fremstilt som beskrevet i eksempel I etter av avtrykkene var eksponert

125

ti I-merket S.aureus protein A.

Fig. 19 er et fotografi av et autoradiogram av en diagnose-strimmel av klonede treponemale antigene peptider fra Tp3A transformerte verter. Strimmel I er de differensierte peptidmønstre fra de transformerte verter etter eksponering for syfilitiske sera. Strimmel 2 er en Charon 30 kontroll. Strimmel 3 viser den totale T.pallidum proteinprofil etter eksponering for syfilitiske sera. Strimmel 4 er standard system for molekylvektmarkører.

En sammenligning av strimmel 1 med strimmel 4 viser at Tp3A gener koder for i det minste 5 peptider med molekylvekt

l

41.000, 38.000, 23.000, 19.700 og 17.600 som reagerer spesifikt med syfilitiske sera. Molekylvektene av disse klonede antigene proteiner tilsvarer molekylvektene av de antigene proteiner av T.pallidum illustrert i strimmel 3. Kontrollstrimmel 2 viser at lysat-proteiner oppnådd fra Charon 30 transformerte verter ikke reagerer med syfilitiske sera. Dette viser at de treponemale antigene proteiner er kodet for av det klonede T.pallidum DNA.

Det kan derfor ses, at oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for diagnose med hensyn til.nærvær av en spesifikk sykdom, et spesifikt sykdomstrinn, eller allergi i en pasient og hvormed en mye større nøyaktighet kan oppnås i løpet av en meget kort tid. Oppfinnelsen åpner for muligheten av å gi leger, i deres praksis eller i små laboratorier, evne til å tilveiebringe hurtig diagnose på basis av en prøve av pasients serum. Lange vente-tider og mulige unøyaktigheter som er typiske for mange utstrakt anvendte kliniske diagnoseteknikker elimineres. Teknikken i samsvar med oppfinnelsen kan anvendes for en lang rekke sykdommer eller allergier bg krever bare en initialt serie av sammenligningstester for å fastslå og utvikle den empiriske informasjon som er nødvendig for å selektere den optimale gruppe av antigene komponenter og den optimale differensieringsprosess.

Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til den som er kjent og beskrevet heri, vil være klar for den fagkyndige ut fra den foregående beskrivelse. Slike modifikasjoner er ment å falle innenfor rammen av de ved-føyde patentkrav.

Claims

1. Fremgangsmåte for diagnosering av nærvær av en spesifikk sykdom, et spesifikt trinn i en sykdom, eller allergi i en pasient, karakterisert ved/ ' at det tilveiebringes et substrat i fast tilstand hvorpå det i et forut bestemt rommelig forhold avsettes et sett av differensierte anti-geniske komponenter av et større sett av proteiner eller polysakkarider, idet det større sett er relatert til sykdommen, sykdomstrinnet eller allergien under diagnose, idet settet av differensierte anti-geniske komponenter velges slik at i det minste et;, undersett av de nevnte antigeniske komponenter er kjent å være reaktive med antistoffer tilstede i serum oppnådd fra en pasient med den spesifikke sykdom, sykdomstrinn eller allergi, substratet bringes i kontakt med serum oppnådd fra pasienten under diagnose under betingelse som tillater reaksjon av antistoffer i det nevnte serum med antigeniske komponenter på substratet, og eksistensen og mønstret for antigen-antistoffreaksjoner på substratet detekteres for samsvar med de komponenter på substratet som er kjent å være reaktive for den spesifikke sykdom eller allergi.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er komponenter av et patogen.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er komponenter av et allergen.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 , karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er komponenter av et tumor-vev.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at de differensierte antigeniske-komponenter er av et virus.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved ., at de differensierte antigeniske komponenter er proteiner differensiert ved hjelp av gel-elektroforese.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er proteiner differensiert ved -hjelp av et ikke-denaturerende gel-system.

8. Et ikke-denaturerende gel-system i henhold til krav 7, karakterisert ved at det ikke-denaturerende gel-system er et iso-elektrisk fokuserende gelsystem.

9. Et ikke-denaturerende gel-system som angitt i krav 7, karakterisert ved at det ikke-denaturerende gel-system er et nativt gelsystem.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 6 eller 7, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter overføres fra gelen til substratet i fast tilstand ved hjelp av filter-affinitetsoverføring.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er proteiner, idet proteinene fremstilles som produkter av gener avledet fra en antigenisk organisme, idet genene er blitt klonet separat inn i passende genetisk-behandlede vert-mikroorganismer.

12. Proteinprodukter av gener avledet fra en antigenisk organisme i henhold til krav 11, karakterisert ved at den antigeniske organisme er Treponema pallidum.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en diagnostisk antistoffprøve, karakterisert ved at det på et substrat i fast tilstand anordnes et sett av differensierte anti-geniske komponenter av et større sett av proteiner eller polysakkarider i et forut bestemt rommelig forhold, idet det større sett er relatert til en sykdom, et sykdomstrinn eller allergi under diagnose, idet settet av differensierte antigeniske komponenter selekteres slik at i det minste et undersett av de differensierte, antigeniske komponenter er kjent å være reaktive med antistoffer tilstede i serum oppnådd fra en pasient med den spesifikke sykdom, sykdomstrinn eller allergi.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er fra et patogen.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er fra et allergen.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er fra et tumor-vev.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved - at de differensierte antigeniske komponenter er fra et virus.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at de differensierte i antigeniske komponenter er proteiner differensiert ved hjelp av gel-elektroforese.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er proteiner differensiert ved hjelp av et ikke-denaturerende gel-system.

20. Et ikke-denaturerende gel-system i henhold til krav 19, karakterisert ved at det ikke-denaturerende gel-system er et iso-elektrisk fokuserende gel-system.

21. Et ikke-denaturerende gel-system i henhold til krav 19, karakterisert ved at det ikke-denarurerende gel-system er et nativt gel-system.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 18 eller 19, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter overføres fra gelen til substratet i fast tilstand ved hjelp av filter-affinitets-overføring.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at de differensierte anti-geniske komponenter er proteiner, idet proteinene fremstilles som produkter av gener avledet fra en antigeniske organisme, idet genene er blitt klonet separat inn i passende genetisk fremstilte verts-mikroorganismer.

24. Proteinprodukter av gener avledet fra en aritigenisk organisme i henhold til krav 23, karakterisert ved at den antigeniske organisme er Treponema pallidum.

25..En diagnostisk antistoff-prøve fremstilt i samsvar med fremgangsmåten angitt i kra.v 13. I

26. En diagnostisk anti-stoffprøve, karakterisert ved at den omfatter et substrat i fast tilstand hvorpå det i et forut bestemt rommelig forhold er anordnet et sett av differensierte antigeniske komponenter av et større sett av proteiner eller polysakkarider, idet det større sett har sammen-heng med en sykdom, et sykdomstrinn eller allergi under diagnose, idet settes av differensierte antigeniske komponenter selekteres slik at i det minste et undersett av de nevnte differensierte antigeniske komponenter er kjent å være reaktive med antistoffer tilstede i serum oppnådd fra en pasient med den spesifikke sykdom, sykdomstrinn eller allergi.

27. Diagnostisk antistoffprøve i henhold til krav 26, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er fra et patogen.

28. Diagnostisk antistoffprøve i henhold til krav 26, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er fra et allergen.

29. Diagnostisk antistoff-prøve i henhold til krav 26, karakterisert v e~ d' ~ at de differensierte antigeniske komponenter er fra et tumor-vev.

30. Diagnostisk antistoff-prøve i henhold til krav 26, karakterisert ved !.at de differensierte antigeniske komponenter er fra et virus.

31. Diagnostisk antistoff-prøve i henhold til krav 26, karakterisert ved at komponentene er proteiner differensiert ved hjelp av gel-elektroforese.

32. Diagnostisk antistoff-prøve i henhold til krav 26, karakterisert ved at komponentene er proteiner differensiert ved hjelp av et ikke-denaturerende gel-system.

33. Et ikke-denaturerende gel-system i henhold til krav 32, karakterisert ved at det ikke-denaturerende gel-system er et iso-elektrisk fokuserende gel-system.

34. Et ikke-denaturerende gel-system i henhold til krav 32, karakterisert ved at det ikke-denaturerende gel-system er et nativt gelsystem.

35. Diagnostisk antistoff-prøve i henhold til krav 26, karakterisert ved at de differensierte anti-geniske komponenter overføres fra gelen til substratet i fast tilstand ved hjelp av filter-affinitets-overføring.

36. Diagnostisk anti-stoff-prøve i henhold til krav 26, karakterisert ved at de differensierte antigeniske komponenter er proteiner, idet disse er fremstilt,som produkter av gener avledet fra en antigenisk' organisme, idet genene er blitt klonet separat inn i passened genetisk fremstilte vert-mikroorganismer.

37. Proteinprodukter av gener avledet fra en antigeniske organisme i henhold til krav 36, karakterisert ved at den antigeniske organisme er Treponema pallidum.