NO782627L - Immobilisert enzympreparat. - Google Patents

Description

11 Immobilisert enzympreparat" .

Denne oppfinnelse vedrører et immobilisert enzympreparat, en fremgangsmåte for fremstilling av et slikt preparat og anvendelse av et slikt preparat ved en enzym-katalysert reaksjon.

Enzymer ér proteiner som kan katalysere kjemiske reak-sjoner. Deres nytte for forskjellige anvendelser har imidlertid vært begrenset siden det er vanskelig å fjerne enzymer fra reak-sjonsmedier, og dette begrenser produktets renhet. Dessuten kan løselige enzymer vanligvis bare anvendes én gang i en sats-reaksjon og, på grunn av de høye omkostninger som er forbundet med mange enzymer, har deres industrielle anvendelse vært beyrenset, selv om de kan være meget effektive katalysatorer. I de senere år er det blitt oppfunnet mange teknikker for å immobilisere enzymer ved å feste eller binde dem til vann-uløselige bærematerialer på en slik måte at enzymet blir gjort immobilt og likevel fremdeles katalytisk aktivt. Kjente immobiliserte enzympreparater har en rekke ulemper, f.eks. fremviser noen av dem, når de er sammenpakket i en kolonne, utilfredsstillende flyteegenskaper, noen fremviser lavt enzymutbytte og i noen er stabiliteten til enzymet nedsatt. Det foreligger således et behov for å utvikle forbedrede immobiliserte enzympreparater.

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringer vi et immobilisert enzympreparat som omfatter et bæremateriale som på overflaten har hydrofobe grupper, idet disse grupper inneholder substituerte eller usubstituerte alifatiske hydrokarbonkjeder med minst 6 karbonatomer og/eller inneholder kjeder av substituerte fenylgrupper, og har molekyler av minst ett enzym festet til de hydrofobe grupper.

Videre tilveiebringer vi i henhold til foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et immobilisert enzympreparat som omfatter det trinn å bringe et bæremateriale som på overflaten har hydrofobe grupper som inneholder substituerte eller usubstituerte alifatiske hydrokarbonkjeder med minst 6 karbonatomer og/eller inneholder kjeder av substituerte eller usubstituerte fenylgrupper, i kontakt med minst ett enzym, i en slik periode og under slike forhold at enzym-molekylene blir festet til de hydrofobe grupper.

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringer vi dessuten en fremgangsmåte for utførelse av en enzym-katalysert reaksjon hvorved det enzym som anvendes er i form av et immobilisert enzympreparat som omfatter et bæremateriale som har hydrofobe grupper på overflaten, idet disse grupper inneholder substituerte eller usubstituerte alifatiske hydrokarbonkjeder med minst 6 karbonatomer og/eller inneholder kjeder av substituerte eller usubstituerte fenylgrupper, og har molekyler av minst ett enzym festet til de hydrofobe grupper.

Enzympreparatet kan være i hvilken som helst egnet fysikalsk form, f.eks. partikkel-, fiber- eller matrise-form. Det er fortrinnsvis partikkelformet, og partikkelstørrelser innen om-rådet 50^til 1 mm er spesielt egnet. Den enzym-katalyserte, reaksjon blir fortrinnsvis utført i en kolonne pakket med partikler av preparatet, eller i et fluidisert sjikt. Det er imidlertid også mulig med andre måter å utføre reaksjonen på. Den kan f.eks. utføres i et kar som inneholder partikler av preparatet som blir separert fra produktene når reaksjonen er fullført, f.eks. ved filtrering eller sedimentering.

Overflaten av bærematerialet bærer hydrofobe grupper som kan avtegnes som "armer" som stikker utover fra overflaten og danner steder for festing av enzym-molekyler. De hydrofobe grupper kan være en integrert del av bærematerialet, således være grupper som utgjør en del av den forbindelse som materialet er sammensatt av, f.eks. sidekjeder på en polymer. Alternativt kan de hydrofobe grupper fremstilles ved å behandle bærematerialet med en hydrofob forbindelse som danner en kjemisk, f.eks. kovalent, binding med bærematerialet eller selv tilknyttes til bærematerialet på en eller annen måte.

Egnede bærematerialer er materialer som er inerte under den enzym-katalyserte reaksjon eller som blir gjort effektivt inerte når de behandles med den.hydrofobe forbindelse. En meget stor mengde materialer er egnet, f.eks. polyvinylalkoholer, dekstran-er, celluloser, polyakrylamider, agaroser og polyuretaner. For å feste den "hydrofobe arm" til disse forbindelser, kan de aktiveres med f.eks. cyanogenbromid eller cyanurklorid eller et mono-substituert derivat av cyanurklorid. De resulterende derivater kan så omsettes med f.eks. heksametylendiamin for å danne den "hydrofobe arm". Materialer så som glassperler og sand kan også anvendes dersom de blir passende behandlet for å muliggjøre at hydrofobe forbindelser kan festes til dem.

De hydrofobe "armer" blir dannet av grupper med til-strekkelig lengde til å bindes til to av de hydrofobe steder som forekommer på enzym-molekyler. Disse grupper kan være grupper som inneholder substituerte eller usubstituerte alifatiske hydrokarbonkjeder med minst 6 karbonatomer (fortrinnsvis 6 til 12), grupper som inneholder kjeder av substituerte eller usubstituerte fenylgrupper, f.eks. inneholder 4 fenylgrupper, og grupper som inneholder alifatiske kjeder sammen med fenylgrupper. De hydrofobe "armer" har funksjonelle grupper, f.eks. -NH2, -CHO, -CNO eller -C00H-grupper, ved deres ytre ender. Hvilke som helst av disse funksjonelle grupper danner selv bindeledd med enzymet eller de kan omsettes med en annen forbindelse for å danne en kovalent binding og således ved enden av "armen" danne en gruppe som danner et bindeledd med enzymet. Egnede modifiserende forbindelser for omsetning med "armen" på denne måte er forbindelser som inneholder -CHO og -CNO-grupper, og fortrinnsvis inneholder en slik gruppe ved hver ende av forbindelsen, f.eks. glutaraldehyd eller

CHO (CH2)6CNO.

For et svært nyttig immobilisert enzympreparat har den hydrofobe "arm" strukturen -(CH2)gNH2 og omsettes med glutaraldehyd for å gi en glutaraldehydgruppe ved enden av "armen". Når enden av "armen" skal modifiseres på denne måte, kan bærematerialet med hydrofobe grupper omsettes med den modifiserende forbindelse på hvilken som helst egnet måte, f.eks. ved å føre en løsning av den modifiserende forbindelse over det.

Styrken av tilknytningen av enzymet til den hydrofobe gruppe eller "arm" kan forbedres ved behandling med et ikke-ionisk overflateaktivt middel, f.eks. "TRITON'X", "TWEENS" eller "SPAN". Denne behandling er mest verdifull når enden av "armen" ikke er modifisert som beskrevet ovenfor. Det ikke-ioniske overflateaktive middel bør være hydrofobt.Behandlingen med det ikke-ioniske overflateaktive middel kan utføres på hvilken som helst egnet måte.

'Det er mest fordelaktig at det ikke-ioniske overflateaktive middel inkluderes i reaksjonsmediet under den enzym-katalyserte reaksjon.

For å. danne det immobiliserte enzympreparat utføres fortrinnsvis de følgende trinn: (a) Dersom bærematerialet ikke allerede har hydrofobe grupper på dets overflate, blir det behandlet med en hydrofob forbindelse. Det er selvsagt unødvendig med en slik behandling dersom bærematerialet allerede har hydrofobe grupper på dets overflate. (b) Endene av de hydrofobe grupper blir omsatt med en kovalent

forbindelse for å aktivere dem.

(c) Det fremstilte bæremateriale blir bragt i kontakt med enzymet i vandig løsning.

Om ønskes kan trinnene (b) og (e) ovenfor utføres samtidig eller

i omvendt rekkefølge.

Enzymer som er nyttige ved anvendelse i det immobiliserte enzympreparat, innbefatter laktase, glukose-isomerase og glukoamylase.

Fremgangsmåten for utførelse av en enzym-katalysert reaksjon er nyttig ved omdannelse av glukose til fruktose ved anvendelse av glukose-isomerase (f.eks. ved anvendelse av metodene beskrevet i våre britiske patentskrifter nr. 1.451.273 og nr. 1.492.258),

ved omdannelse av laktose til glukose og galaktose ved anvendelse

av laktase (f.eks. ved anvendelse av metoden beskrevet i vår samtidig verserende britiske patentsøknad nr. 38002/76, ved omdannelse av stivelse til glukose ved anvendelse'av glukoamylase og ved mange andre enzym-omdannelser.

Oppfinnelsen blir belyst i de følgende eksempler:

Eksempel 1

/3-galaktosidase ekstrahert fra LT2 bacterium (NCIBnr. 11259) beskrevet i vår samtidig verserende britiske patentsøknad nr..38002/76, ble adsorbert på 1 g aminoheksyl-agarose ("SEPHAROSE" - registrert varemerke - kjøpt fra<p>harmecia). Agarosesuspensjonen ble så pakket i en kolonne. En 5%ig laktoseløsning i 50 mm fosfat-puffer pH'6,5 ble ført gjennom kolonnen ved 50°C og strømnings-hastigheten ble justert slik at det blé oppnådd 80% hydrolyse av laktose. Dette gav et mål på immobilisert/3-galaktosidase-.aktivitet. Etter 36 timer var 100 g laktose hydrolysert.

Eksempel 2

j3-galaktosidasen ble immobilisert som i eksempel 1, bortsett fra at "TRITON X-lOO", inntil en endelig konsentrasjon på o 10 —5%, ble satt til laktoseløsningen. Etter 150 timer var 400 g laktose hydrolysert.

Eksempel 3

Aminoheksyl-agarose ble inkubert med 0,5% glutaraldehyd

i 1 1/2 timer ved pH 7,0./3-galaktosidase-ekstrakt, fremstilt som i eksempel 1, ble omsatt i 1 1/2 timer med det resulterende alde-hydderivat av aminoheksyl-agarosen. Det kovalent tilknyttede enzym ble undersøkt som i eksempel 2. Etter 150 timer var 400g laktose hydrolysert.

Eksempel 4

/3-galaktosidase ekstrahert fra B. coagulans NRRL B-8100 (fått fraReynoldsTobaccoCo.) ble immobilisert og undersøkt som i eksempel 3. Etter 1000timer var 300 g laktose hydrolysert.

Claims (18)

1.I mmobilisert enzympreparat som omfatter et bæremateriale som har hydrofobe grupper på overflaten, karakterisert ved at disse grupper inneholder substituerte eller usubstituerte alifatiske hydrokarbonkjeder med minst 6 karbonatomer og/eller inneholder kjeder av substituerte eller, usubstituerte f enylgrupper-, og har molekyler av minst ett enzym festet til de hydrofobe grupper.

2. Preparat i henhold til krav 1, karakterisert ved at bærematerialet er et materiale som er behandlet med en hydrofob forbindelse som festes selv til materialet for å danne hydrofobe grupper på dets overflate.

3. Preparat i henhold til krav 2, karakterisert ved at bærematerialet er en polyvinylalkohol, en cellulose, et poly-akrylamin, en agarose eller en polyuretan som er behandlet for å danne hydrofobe grupper på dets overflate.

4. preparat i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at enzymet er glukose-isomerase, laktase eller glukoamylase.

5.F remgangsmåte for fremstilling av et immobilisert enzym preparat, karakterisert ved det trinn å bringe et bæremateriale som på overflaten har hydrofobe grupper som inneholder substituerte eller usubstituerte alifatiske hydrokarbonkjeder med minst 6 karbonatomer og/eller inneholder kjeder av substituerte eller usubstituerte fenylgrupper, i kontakt med minst ett enzym, i en slik periode og under slike forhold at enzym-molekylene blir festet til de hydrofobe grupper.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 5, karakterisert ved at bærematerialet blir dannet ved å behandle et materiale med en hydrofob forbindelse som selv festes til materialet for å danne hydrofobe grupper på dets overflate.

7.F remgangsmåte i henhold til krav 5 eller 6, karakterisert ved at de hydrofobe grupper har -NH2/ -CHO, -CNO eller -COOH-grupper som funksjonelle grupper ved deres ytre ender og hvor det inkluderes et trinn hvor disse funksjonelle grupper omsettes med en modifiserende forbindelse for å danne en ende-gruppe hvortil det blir festet enzym.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 7, karakterisert ved at de hydrofobe armer har strukturen -(CH2 )gNH og blir omsatt med glutaraldehyd som en modifiserende forbindelse før de blir bragt i kontakt med enzymet.

9.F remgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 5 til 8, karakterisert ved at.den omfatter de følgende trinn: (a) å behandle et materiale med en hydrofob forbindelse for å danne hydrofobe grupper på dets overflate, (b) å omsette det behandlede materiale med en kovalent forbindelse som modifiserer endene av de hydrofobe grupper, og (c) å bringe det -behandlede bæremateriale i kontakt med et enzym i vandig løsning.

10 .F remgangsmåte for å utføre en enzym-katalysert reaksjon hvor enzymet som anvendes er i form av et immobilisert enzympreparat som omfatter et bæremateriale som har hydrofobe grupper på overflaten, - karakterisert ved at disse grupper inneholder substituerte eller usubstituerte alifatiske hydrokarbonkjeder med minst 6 karbonatomer og/eller inneholder kjeder av substituerte eller usubstituerte fenylgrupper, og har molekyler av minst ett enzym festet til de hydrofobe grupper.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 10, karakterisert ved at under omsetningen blir enzympreparatet behandlet med et hydrofobt, ikke-ionisk overflateaktivt middel.

12. Fremgangsmåte i henhold til krav 11, karakterisert ved at det ikke-ioniske over flateaktive middel er "TRITON X".

13. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 10 til 12, karakterisert ved at glukose blir omdannet til fruktose, stivelse blir omdannet til glukose eller laktose blir omdannet til glukose og galaktose.

14. Sirup som inneholder fruktose, glukose eller glukose og galaktose, karakterisert ved at den er fremstilt ved en fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 10 til 13..

15. Enzympreparat, karakterisert ved at det er fremstilt ved en fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 5 til 9.

16. Immobilisert enzympreparat vesentlig som her beskrevet og som vist i hvilket som helst av eksemplene.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av et immobilisert enzympreparat vesentlig som beskrevet her og vist i hvilket som helst av eksemplene.

18.F remgangsmåte for utførelse av en enzym-katalysert reaksjon vesentlig som her beskrevet og som vist i hvilket som helst av eksemplene.