NO751605L

NO751605L -

Info

Publication number: NO751605L
Application number: NO751605A
Authority: NO
Inventors: W Bauer; J Pless
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1974-05-13
Filing date: 1975-05-05
Publication date: 1975-11-14
Also published as: ES454283A1; IL47270A0; GB1509745A; US4120852A; FR2270889A1; ES437586A1; DE2519656A1; JPS50154241A; NZ177482A; AU8106875A; DK197575A; SE7505281L; FI751320A; FR2270889B1; NL7505458A

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av nye peptider.

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av nye peptider med formel I

hvori X står for H-ala, D-ala, |3-ala, propionyl eller Ac-ala (idet Ac betyr en acylgruppe), Y står for hydrogen eller betyr en direkte binding, mellom svovelatomene i 3-stilling og 14-stilling og Z står for restene -COOH, -COOR1(idet R1betyr en lavere alkylgruppe,

(idet R_ og R3uavhengig av hverandre

betyr hydrogen eller en lavere alkylgruppe) eller står for

-CH2OH, idet X ikke kan stå for H-ala, når Z betyr -COOH, samt syreaddisjonssalter og komplekser av disse peptider.

Står Ac for en acylgruppe, betyr denne foretrukket formyl-, acetyl-, benzoyl-, palmitoyl- eller trifluoracetylresten. Hvis R^, R^eller R^betyr en lavere alkylgruppe, så inneholder denne lavere alkylgruppe 1-5, foretrukket 1-3 karbonatomer og utgjor spesielt metyl.

Peptidene med den ovennevnte formel, hvori X, Y og Z har den ovennevnte betydning, deres syreaddisjonssalter og tungmetall-komplekser kan skje etter for syntese av forbindelser av denne type alminnelige kjente metoder. For dette kondenseres aminosyrene henhv. deres derivater i den i den ovenstående formel fastlagte rekkefolge enkeltvis eller etter dannelse av mindre peptidenheter, idet en aminosyre eller et peptid med beskyttet oc-aminogruppe og aktivert terminal karboksylgruppe omsettes med en aminosyre eller et peptid med beskyttet terminal karboksylgruppe og fri oc-aminogruppe eller en aminosyre eller et peptid med aktivert oc-aminogruppe og beskyttet terminal karboksylgruppe omsettes med en aminosyre eller et peptid med fri terminal karboksylgruppe og beskyttet oc-aminogruppe, idet i det enkelte tilfelle samtidig de fri funksjonelle grupper som ikke deltar i reaksjonen beskyttes, etter avsluttet kondensasjon avspaltes den ikke lengér:nodvendige beskyttelsesgruppe, idet man eventuelt på et onsket tidspunkt i syntesen etter i og for seg kjente metoder overforer karboksylgruppen i den endestående aminosyrerest i 14-stillingen i en -COOR,-

(idet R1betyr en lavere alkylgruppe)

(idet R2og R^

uavhengig av hverandre betyr hydrogen eller en lavere alkylgruppe) eller en -CH2OH-gruppe, eventuelt etter dannelse av delsvekvensen 3 til 14 oksyderer merkaptogruppen i 3-stillingen og 14-stillingen og de således erholdte peptider med den ovenstående formel overfores eventuelt i sine terapeutisk virksomme syreaddisjonssalter eller tungmétallkomplekser.

Karboksylgruppen kan f .eks. aktiveres ved overforing i ..ett syreazid/anhydrid, imidazolid, isoksazolid eller en aktivert ester eller ved reaksjon ved hjelp av et karbodiimid eller N,N<1->karbodiimidazol.

Som de greieste metoder nevnes karbodiimidmetoden, azidmetoden, metoden med aktivert ester og anhydridmetoden, videre den såkalte Merrifield-metode.

Fri funksjonelle grupper som ikke deltar i reksjonen kan ved oppbygningen av peptidene kan beskyttes ved hjelp av de beskyttelsesgrupper som er kjent fra syntesene av langkjedede peptider. For beskyttelsen av karboksylgruppen anvendes foretrukket benzylgruppen, men også andre beskyttelsesgrupper som metyl-, etyl-, tert.-;airiyl-amid- eller tert.-butylgruppen kan komme påtale. For beskyttelsen av en aminogruppe, spesielt UJ-aminogruppen i en lysinrest, kan det anvendes en karbobenzoksygruppe eller en karbo-tert.-butoksygruppe. Merkaptogruppen av cysteinresten kan f ..eks. beskyttes ved hjelp

av acylgrupper eller foretrukket ved hjelp av eventuelt substituerte arylmetylgrupper som benzyl, p-metoksybenzyl, p-nitrobenzyl, difenylmetyl eller'trietyl.

Omdannelsen av en beskyttet merkapto- eller amino-gruppe i en fri gruppe såvel som omdannelsen av en funksjonell omdannet karboksylgruppe i lopet av fremgangsmåten for fremstilling av peptidene ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse skjer etter i og for seg kjente metoder, ved behandling med hydrolyserende henhv. reduserende midler. Oksydasjonen av merkaptogruppene i 3-stillingen og 14-stillingen til S.S-broen skjer ved hjelp av oksygen eller kaliumferricyanid.

Utgangsproduktene for fremstilling av peptidene kan i den utstrekning de ikke er tidligere kjent, erholdes etter de for peptidkjemien kjente metoder, idet aminosyrene enkeltvis eller etter foregående dannelse av mindre peptidenheter sammenknytes med hverandre.

Som syreaddisjonssalter kommer salter med organiske syrer, polymersyrer og salter med uorganiske syrer på tale.

Under komplekser forstås forbindelser som med hensyn til deres struktur ennå ikke er oppklart og som dannes ved tilsetning av uorganiske salter, som er avledet av metaller som kalsium, magnesium, mangan, aluminium, kobolt og sink (fremfor alt halogenider, fosfater, pyrofosfater og polyfosfater) og/eller ved tilsetning av polymerer organiske stoffer som polyoksygelatin, polyvinylpyrolidon og karboksymetylcellulose, videre sulfonsyre- eller fosforsyreestere av alginsyre, dekstran, polyfenoler og polyalkoholer, fremfor alt polyfloretinfosfat til peptidet med den ovenstående formel.

De nye peptider med formel I har terapeutisk betydning for alle indikasjonsområder hvori en hemming av GH-sekresjonen er onskelig.

I forgrunnen står anvendelse ved Diabetes Mellitus, behandling av acromegali, agiopati såvel som anvendelse av disse forbindelser for diagnostiske formål.

Hemming av GH-sekresjon kan vises på folgende måte:

Det anvendes hannrotter i nembutalnarkose. 15 minutter etter tilforsel av et nytt peptid i flere logaritmisk graderte doser til i hvert tilfelle minst 4- dyr fjernes blod etter at hodet er kuttet av. Bestemmelsen av GH-speilet i serum skjer ved hjelp av radio-imuno-provning under anvendelse av det material som er stilt til disposisjon av NIH. Aktivitetbestemmelsen skjer om mulig"ved hjelp av såkalt 4-6 Point-assay.

Doseringen ved pattedyr utgjor 0,5 til 500^'g/kg. Ved mennesker ligger doseringen ved 1,0 til 1000 yug/kg.

For terapeutiske formål anvendes 0,07 til 70 mg av et nytt peptid.

Anvendelsen skjer ved hjelp av injeksjon eller intravenos infusjon, idet hyppigheten av tilforselen retter seg etter indikasjonen henhv. den tilstrebede effekt.

Det ble videre funnet at virkningsvarigheten av de nye peptider

i form av injeksjonspreparater lot seg forlenge med flere timer,

når et nytt peptid med den tidligere angitte formel foreligger i form av ett av de anforte komplekser.

Hemmingen av vekst-hormonsekresjonen ved tilforsel av kompleksene kunne måles i rotter etter subcutan tilforsel. F.eks. kunne en tydelig retarderingsef f ekt oppnås etter s.c. tilforsel av 0,5 mg/kg av et peptid med den tidligere angitte formel og 0,1 til 100 mg/ml polyfloretinfosfat eller 0,1 til 10 mg/ml sinkklorid.

Disse protahert virksomme injeksjonspreparater kan fremstilles ved at et peptid med den tidligere angitte formel, eventuelt i sin saltform med et fysiologisk tålbart vannloslig metlallsalt, som avledes fra metaller som kalsium, magnesium, mangan, aluminium, kobol og sink ( fremfor alt halogenider, fosfater, pyrofosfater og polyfosfater) og/eller et polymert organisk stoff, som polyoksygelatin, polyvinylpyrolidon>karboksymetylcellulose, videre sulfonsyre- eller fosforsyreester av alginsyre, dekstran, polyfenoler og polyalkoholer,ffemfor alt polyfloretinfosfat loses henhv. suspenderes i vann og den således erholdte losning henhv. suspensjon bringes ved tilsetning av et alkalimetallhydroksyd eller en puffer til en pH-verdi fra 5 til 8.

På denne måte erholdes en losning henhv. suspensjon, som etter påfolgende sterilisering kan injiseres-direkte subkutant eller intramuskulært. Eventuelt kan pH i losningen henhv. suspensjonen stabiliseres ved tilsetning av en egnet puffer, f.eks. en fosfatpuffei

De ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremstilbare peptider kan finne anvendelse som legemiddel, f.eks. i form av farmasøytiske preparater. Disse inneholder de nevnte forbindelser i blanding med et for parenteral tilforsel egnet organisk eller uorganisk bærermaterial. Forbindelsene kan også anvendes i form av et depotpreparat.

Det anvendes folgende forkortelser:

Ala = L-ålanyl

D-Ala = D-ålanyl

(3-Al a =3|3-ålanyl

Gly = glycyl

Lys = L-lysyl

Asn = L-åsparaginyl

Phe = L-"f enylalanyl

Trp = L-iiryptophanyl

Thr = L-threonyl

Ser = L-seryl

Cys = L-cysteinyl =

D-cys = D-cysteinyl =

BOC = tert.-butyloksykarbonyl

Cbo = karbobenzoksy

MBzl = p-metoksybenzyl

OMe = metoksy

OCP = 2, 4, 5-triklorfenyloksy

ACOH = eddiksyre

AC = acetyl

I de folgende eksempler, hvori forbindelsene foreligger som acetat og som illustrerer fremgangsmåten, er alle temperaturangivelser i grader celsius.

CONH2

0, 7g Cbo-D-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe^Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH2 tilsettes 3,3 ml anisol og 3,5g indol. Til denne blanding kondenseres under kjoling med torr is ca. 40 ml hydrogenfluorid, og deretter omrores i 1 time ved 0°C. Hydrog.enfluoridet fjernes i vakuum, resten omrores med 0,01 m 2-merkaptoebanol i etylacetat og filtreres. Resten loses i litt 5% eddiksyre og renses ved kromatografering på "Sephadex<*1>G 25 i systemet 0,01 m-2-merkaptoetanol i 5% eddiksyre. Fraksjoner som inneholderdet onskede produkt forenes og frysetorkes. ;Den i overskriften nevnte forbindelse erholdes med smeltepunkt 210°C ;-,20 ;(spalting);lal.' = -40 i 1% eddiksyre.;D. ;Det som utgangsmatøerial anvendes Cbo-D-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH2 fremstilles på folgende måte: ;a) Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe;85g Cbo-Phe-Phe-OMe loses i 850 ml hydrogenbromid/éddiksyre 4-n og inndampes etter en time til omtrent 2/3 volum. Det felles med 3 liter eter og avsuges på filter. Det erholdes H-Phe-Phe-OMe • HBr. ;orn20;Smeltepunkt 196 C;|_ ocj = + 8,1 i diemtylsulfoksyd.;D ;40 g H-Phe-Phe-OMe HBr loses i 400 ml dimetylformamid og tilsettes;44 g Cbo-Asn-OCP og 16 ml trietylamin. Etter 16 timers henstand ved romtemperatur inndampes losningen i vakuum og resten kokes opp i isopropanol. Etter avkjoling avsuges på filter og etteryåskes med i'éopropanol og metanol. Det erholdes Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe. ;20 ;Smeltepunkt 226 C ;[ al D = 18,7° i dimetylsulfoksyd.;b) BOC-LysjCbo)-Asn-Phe-Phe-OMe_;77 g Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe loses i 780 ml hydrogenbromid/éddiksyre 4-n;og settes bort i 1 time ved romtemperatur. Etter inndamping felles med 3 liter eter og avsuges på filter. Etter torking erholdes H-Asn-r- Phe-Phe-OMe • HBr. ;Smeltepunkt 195 o Cijpal 20 = •+ 4 6i dimetylsulf oksyd. ';51 g BOC-Lys(Cbo)-OH og 19 ml trietylamin loses i 500 ml tetrahydrofuran og tilsettes ved -10°C 13 ml klormaursyreetylester. Etter 5 minutter tildryppes en losning av 72g H-Asn-Phe-Phe-OMe •HBr og 23 ml trietylamin i 800 ml dimetylformamid. Etter 6 timers omroring ved romtemperatur inndampes og kloroform tilsettes. Bunnfallet avsuges på filter, ettervaskes med kloroform og etanol. Det erholdes BOC-Lys-(Cbo) -Asn^Asn-Phe-OMe. ;i- -i 20;Smeltepunkt 187 C ;[_ aj = -22,4 i dimetylsulf oksyd.;D ;c) BOC-Cys^MBzl^-LysjCbo^-Asn^;74 g BOC-Lys(Cbo)-ASN-Phe-Phe-OMe loses i 750 ml trifluoreddiksyre/ ;metylenklorid (9 : 1). Etter 1 time inndampes og felles med eter. Den ;utfeldte substans avsuges på filter og ettervaskes med eter.;Det erholdes H-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe som trifluoracetat.;r —. 20 Q;Smeltepunkt 216 C ;|_ a I D= -5,0 i dimetylsulf oksyd.;19 g H-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe trifluoracetat og 15 g ;BOC-Cys^MBzl)-OCP loses i 150 ml dimetylformamid og 6,5 ml trietylamin. Etter 16 timers henstand ved romtemperatur inndampes og felles med eter. Substansen ettervaskes med eter, etanol, aceton og torres. ;Det erholdes BOC-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe.;20 ;Smeltepunkt 212°C ;(~a~| = -20,7° i dimetylsulf oksyd.;_iD ;d) BOC-Gly-CysjMBzl^-LysjCbo;22 g BOC-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe loses i 220 ml trifluoreddiksyre/metylenklorid (9 : 1) og settes bort i intime ved romtemperatur. Etter inndamping felles med eter og avsuges på filter. Etter torr\ing erholdes H-Cys^MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe som trifluoracetat. ;Smeltepunkt.195°C ;T a~l<20>="-6,2° i dimetylsulfoksyd.;L_ _lD;4,5 g BOC-Gly-OH og 3,6 ml trietylamin loses i 50 ml tetrahydrofuran og tilsettes ved -10°C 2,5 må klormaursyreetylester. Etter 10 minutter tildryppes en losning av 24g H-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe-'trifluoracetat og 6,0 ml -trietylamin i -250 ml dimetylformamid. Etter 3 timers omroring ved romtemperatur inndampes i vakuum og resten ettervaskes flere ganger med eter, etanol og aceton. Det erholdes BOC-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe. ;Smeltepunkt 111°C ;[~a 120 = -17,0° i dimetylsulf oksyd.;D ;e) Cbo-p-Ala-Gly-CysjMBzl^-Ly^;4g BOC-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe losés i 40 ml ;trifluoreddiksyre/metylenklorid (9 : 1) og settes bort i en ^ time ved romtemperatur. Det felles med eter, avsuges på filter, vaskes med eter og det erholdes H-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe som trifluoracetat. ;Smeltepunkt 194°e ; r a ~l 20-14° o i dimetylsulfoksyd.;D ;900 mg H-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe trifluoracetat,;440 mg Gbo-B-Ala-OCP, 125 mg 1-hydroksybenzotriazol loses i 10 ml dimetylformamid, tilsettes 0,13 ml trietylamin og omrores i 20 timer ved romtemperatur. Det felles med eter, filtreres, vaskes i rekkefolge med isopropanol, vann, isopropanol, eter og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes. ;Smeltepunkt 220°; r cc- _. 20= -17 i dimetylsulf oksyd.;L_ _1 D;<f>) Cbo-D-Ala-Gly-CysjMBziy-L^;o,8 g Cbo-D-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe losésmi 10 ml,, ;dimetylformamid, tilsettes 1 ml hydrazinhydrat og hensettes i 20 timer ved romtemperatur., Det felles med vann, filtreres, resten vaskes med vann, deretter med metanol, det torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes. ;20 ;Smeltepunkt 235°C ocH D= -28 i dimetylsulf oksyd.;g) BOC-Lys(Cbo^-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe;17 g Cbo-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe loses i en blanding av metanol/dimetylformamid, tilsettes palladiumkull og hydrogenéres ved romtemperatur under normal trykk. Katalysatoren frafiltreres og det inndampes i vakumm. Den erholdte rest, 10,7g BOC-Lys(Cbo)-OH og 4,2g hydroksy-benzotriazol loses i 80 ml dimetylformamid, avkjoles til —5°C og tilsettes 3,2 ml N-metylmorfolin og en losning av 6,lg dicykloheksyl-karbodiimid i. 30 ml dimetylformamid. ;Det omrores over natten ved romtemperatur, utfelt dicykloheksyl-urinstoff frafiltreres og filtratet inndampes. Resten opplpses i etylacetat og. vaskes med 5% natriumbikarbonat og vann. Etylacetatfasen torres over natriumsulf at. og inndampes deretter. Det utfelte produkt frafiltreres og vaskes méd etylacetat/eter. Det erholdes BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe. ;20 ;Smeltepunkt 130 C aQD'= -7° i dimetylformamid.;h) BOC-LysiCbo^-Thr-Phe-Thr-Ser-mirø2 ;7g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe loses i en blanding av ;dimetylformamid og metanol, det tilsettes 8 ml hydrazinhydrat dg blandingen settes bort over. natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandinger tilsettes vann, omrores godt, utfelt produkt frafiltreres, resten vaskes med vann og torres. ;Det erholdes BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe^Thr-Ser-NHNH2.;Smeltepunkt 198 C; a = -5 i dimetylformamid.;D ;i) BOC-LysjCbo^-Thr-Phe|Thr-Se;4,15g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-NH-NH2loses i'40 ml dimetylformamid, avkjoles til 020°C, tilsettes 3rnml 5n saltsyre i eter, deretter 0,58 ml tert.-butylnitrit og omrores i 5 minutter ved -15°C. Etter tilsetning av 2,1 ml trimetylamin ved -20°C frafiltreres utfelt trietylamin-hydroklorid og filtratet forenes med en kald losning av 3,5g/.H-Cys (MBzl) - OMe • CH-.S0..H (smeltepunkt 150°C ;f ~[22 ,co . ,. ^ \c3 3 -f . »[^ aJD = -16 i dimetylformamid, ;fremstilt fra H-Cys(MBzl)-0H og metansulfonsyre i etanol) og 1,3 ml trietylamin i 20 ml dimetylformamid. Blandingen får stå over- natten ved 0°C, reaksjonsblandingen inndampes deretter i vakuum, felles med eter, filtreres og vaskes med eter, isopropanol,og vann. Det torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes. ;Smeltepunkt 186 C ; a = -15 i dimetylformamid.;Q r- -| 2 0 oi;j ) BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys^MBzlV-m2;2,5g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OMe loses i en blanding av 30 ml dimetylformamid og 70 ml metanol.- Losningen mettét ' ved 0°C med ammoniakk-gass og hensettes i 24 timer ved romtemperatur. Det omrores med eter, utfelt produkt frafiltreres , vaskes med eter, torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes. ;Smeltepunkt 205°C ;|~ oc~]D2^ = -15° i dimetylformamid.;<k>)<BO>C=<Trp-Lys>j<Cbo>)_-<Thr-Phe->;lg BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH2loses i 10 ml av en blanding av metylenklorid/trifluoreddiksyre (1 : 1) og settes bort i 25 minutter ved romtemperatur. Deretter felles H-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH2-trifluoracetat med eter, frafiltreres og vaskes ;ut med eter. Resten loses i 5 ml dimetylformamid, tilsettes 0,73g BOC-Trp-OCP og 0,15 ml trietylamin og settes bort over natten ved romtemperatur. Detvfelles med eter/e.tylacetat (1 : 1) , filtreres og vaskes med eter. Resten omkrystalliseres fra metanol. Etter torring erholdes den i overskriften nevnte forbindelse. ;20 ;Smeltepunkt 212°C ; ra n2. 0 = -17° i dimetylformamid.;D ;Lys-(Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-CysjMBzl)_-;0,65g BOC-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH2loses i 6 ml metylenklorid og tilsettes - 0,54 ml anisol, 0,59g indol og til sist 6 ml trifluoreddiksyre. Blandingen får stå i 40 minutter ved romtemperatur og £elles deretter med eter. Etter filtrering, vasking med eter og torring erholdes H-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH2som trifluoracetat. ;0,59g Cbo-D-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-NHNH2loses i 15 ml dimetylformamid, avkjoles til -20oC og tilsettes 0,32 ml 5,01 saltsyre i eter, deretter 0,60 ml 10% tert.-butylnitrit i dimetylformamid og ;omrores i 5 minutter ved -15°C. Det tilsettes 0,35 ml trietylamin, ;utfelt trietylaminhydroklorid frafiltreres og filtratet forenes med en kald losning av det ovenfor erholdte H-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl)-NH2-trifluoracetat i 3 ml dimetylformamid. Blandingen for stå over natten ved 0°C, omrores ved 150 ml metanol, filtreres, resten vaskes med metanol og etylacetat, eter, torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes., ;Smeltepunkt 230°C (spalting) aj 20 = -16 o i dimetylformamid. ; Den i overskriften nevnte forbindelse fremstilles analogt med eksempel 1 ;Smeltepunkt 21- 5°■ C (spalting); ra i20= -38° i 1% eddiksyre.;D ;Det som utgangsmaterial anvendte Cbo-D-Ala-Gly-Cys-((MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH-CH2-CH3 fremstillesvpå folgende måte: ;a) BOC-Lys^Cbo)_-Thr-Phe-Thr-Ser-;En losning av 2g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OMe i en ;blanding av dimetylformamid/metanol mettes under avkjpling med etylamin-gass og hensettes i 60 timer ved romtemperatur. Utfelt produkt frafiltreres og vaskes med metanol. Det torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes. ;Smeltepunkt 215 C; a = -16 i dimetylformamid.;b) BOC-Trp-LysjCbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys^ ;Fremstilles analogt med eksempel lk) .;20 ;Smeltepunkt 224 C; a = -19 i dimetylformamid. ;- L J-D-19<0>i dimetylformamid.;c) Cbo-D-Ala-Gly-Cys (MBzl^-LysjCbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys_ ;jCbo) =Thr-Phe-Thr-Ser-Cys iMBzl^-NH-CH2-CH3 ;Fremstilles analogt med eksempel 11).;Smeltepunkt 240°C ; P a-l j<20>-17°i dimetylformamid.;D ; ; Den i overskriften nevnte forbindelse fremstilles analogt med eksempel 1 ;20 ;Smeltepunkt 205°C (spalting) ; | a | = -33 i 1% eddiksyre.;D ;Det som utgangsmaterial anvendte,. Cbo-D-Ala-Gly-Cys (MBzl)-Lys (Cbo)_Asn-&e-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-N(CH2CH3)2fremstilles på folgende måte: ;a) BOC-Lys_(Cbo) ^l!''1£_E?}®z!E^}£z55£zSY5i5??5ilz^?A^52-~3l.2;En losning av lg BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OMe'i en ;blanding av dimetylformamid/metanol tilsettes 1,0 ml dietylamin og hensettes i 16 timer ved romtemperatur. Det tilsettes eter, utfelt produkktf raf Utreres; vaskes med eter, torres og den i overskriften nevjite forbindelse erholdes. ;20 ;Smeltepunkt 188°C ; j^oj = -14° i dimetylformamid.;D ;b) BOC-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys jMBzl^-NjCH2CH3)_2 ;Fremstilles analogt med eksempel 1 k) .;- -r20 ;Smeltepunkt 210°C ;r aj = -18° i dimetylformamid.;D ;c) Cbo-p-Ala-Gly-Cys_(MBzl)_-Lys (Cbo^-Asn-Phe-Phe-Trp-_ ;^i2^2LzZ!}£zE^=^£i§®£z2Y^i^?5^z^i952--3l2 ;Fremstilles analogt med med eksempel 11).;20 ;Smeltepunkt 250 C ;l aj 20 = -16 Q i dimetylformamid.;D ;Eksempel 4.; ; Analogt med eksempel 1 e oppbygges Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl)-Lys (Cbo)-Asn-PhE Phe-OMe, idet Cbo-Ala-OCP anvendes. ;r -,20 ;Smeltepunkt 214C;|al = -19 i dimetylformamid.;D ;Analogt med eksempel .1 f oppbygges Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl) -rLys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-NHNH2. ;-.20 ;Sméltepunkt 245°C ; a = -22 i dimetylformamid.;D ;Analogt med eksempel 1 1 oppbygges Cbo-Ala-Gly-Cys(MBzl)rLYs(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-Nf^* Deretter behandles som angitt i eksempel 1 med flytende hydrogenfluorid. Den i overskriften nevnte forbindelse erholdes med smeltepunkt 218°C (spalting) n20

la = -36 i 1% eddiksyre.

D

Eksempel 5.

S S

CH2CH2H-Ala-Gly-L-NH-CH-CO-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-L-NH-GH

CONH2

Etter oksydasjon av den forbindelsersom er angitt i overskriften i eksempel 4 med kaliumferricyanid og kromatografering på "Sephadex" G-25 erholdes den i overskriften nevnte forbindelse med-smeltepunkt 251°C (spalting); 20

fal = -32 i 1% eddiksyre.

D

Analogt med eksempel 1 a til 1 oppbygger Cbo-D-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys (Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl, idet det i mellomtrinnet j anvendes "BOC-Trp-lLys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl)-OBzl og det behandles deretter som angitt i- eksejnpel 1 med flytende hydrogenfluorid. Den i overskriften nevnte forbindelse erholdes med smeltepunkt 225°C (spalting); 20

|a = -35 i 1% eddiksyre.

BOC-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys4MBzl)-OBzl fremstilles på

folgende måte.

a) 52C-LysjCbo^-Thr-Phe-Thr

2,3 g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH2 loses i 20 ml dimetylformamid,

avkjoles til -20°C, tilsettes 1,8 ml 5,5 N saltsyre i eter, deretter 0,33 ml ter.-butylnitrit og omrores i 5 minutter ved -15°C. Etter tilsetning av 1,45 ml trietylamin ved -20°C frafiltreres utfelt trietylamin-hydroklorid og filtratet forenes med en kald losning av 2,6 g H-Cys (MBzl) -OBzl • metansulfonat (smeltepunkt 120°C ;|-a~j 20_ _24°

D

i dimetylformamid, fremstilt fra H-Cys(MBzl)-0H med benzylalkohol og metansulfonsyre) og 1,0 ml trietylamin i 6 ml dimetylformamid.

Blandingen hensettes over natten ved 0°C, reaksjonsblandingen omrores

deretter med 500 ml eter. og utfelt material frafiltreres. Resten loses i en blanding av metanol/dimetylformamid og tilsettes deretter under omroring med vann. Utfelt produkt frafiltreres,vaskes med vann og torres. Det erholdes BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl.

20

Smeltepunkt 169 C a~^f D = -16° i dimetylformamid.

<b>) BOC-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl)_-0Bzl^

2,3.g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl loses i en blanding

av 10 ml metylenklorid og 6 ml trifluoreddiksyre og hensettes i 25 minutter ved romtemperatur. Deretter felles H-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl)-OBzl-trifluoracetat med eter, frafiltreres og utvaskes

godt med eter. Resten loses i 7 ml dimetylformamid, tilsettes l,5g BOCj-Trp-OCP og 0,3 ml trietylamin og blandingen settes bort over natten ved romtemperatur. Produktet utfelles med eter/etylacetat (1:1)

og filtreres. Det torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes.

20

Smeltepunkt 167 C '^"Q = -17,5 i dimetylformamid.

D

Etter oksydasjon av den forbindelsersom er angitt i overskriften i eksempel 6 ved hjelp av kaliumferricyanid, behandling med "Bio-Rad" AG 3X/4 og etterfølgende kromatografering med "Sephadex" G-25 (fortynnet eddiksyre) erholdes den i overskriften nevnte forbindelse.

20

Smeltepunkt 245 C (spalting) ;j~a~f = -31° i1% eddiksyre.

Analogt med eksempel 1 a til 1 oppbygges Cbo-|3-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl, idet det i mellomtrinnet j anvendes BOC-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl)-OBzl og det behandles deretter som angitt i eksempel 1 med flytende hydrogenfluorid. Den i overskriften nevnte forbindelse

erholdes med smeltepunkt 229 - 230° (spalting) ;n 20

230<0>J_aj<=>-38° i

D

1% eddiksyre.

Eksempel 9.

Etter oksydasjon av den forbindelse som er angitt i overskriften i eksemple 8 ved hjelp av kaliumferricyanid og etterfolgende opparbeidelse erholdes den i overskriften nevnte forbindelse med smeltepunkt 236°C (spalting) ; _[" aJ 20=-34° i 1% eddiksyre.

D

Eksempel 10.

Analogt med eksempel 1 a til 1 oppbygges Cbo-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr- idet iemellomcfijinnét j det fra BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH2og

20

(Tal =-21° i

D

dimetylformamid, fremstilt ved behandling av H-Cys(MBzl)-OMe

med NaBH^) erholdte

(smeltepunkt 120 C;[d ~~|20

l_ a_[D = -13 i dime<ty>lformamid) anvendes. Deretter gås det frem som angitt i eksempel 1 med flytende hydrogenfluorid. Det erholdes den i overskriften nevnte forbindelse.

Smeltepunkt (spalting) ; roe i20 eddiksyre.

D

Eksempel 11.

Etter oksydasjon av den forbindelse som er angitt i overskriften i eksempel 10 ved hjelp av kaliumferricyanid og etterfolgende opparbeidelse erholdes den i overskriften nevnte forbindelse.

Smeltepunkt 230°C (spalting) ; I al = -39 i 1% eddiksyre.

D

Eksempel 12.

100 til 2.000 mg H-BiJSlla-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-GH loses i 50 ml vann, tilsettes 630 mg sink (2) klorid,

300 mg fenol og 230 mg natriumklorid, pH-verdien innstilles på 5 til 8 med fortynnet natriumhydroksydlosning og etterfylles med destilert vann til 100 ml.

Eksempel 13.

Det gås frem som i eksempel 12,men i stedet for 630 mg sink(2)klorid tilsettes 460 ml kalsiumklorid eller 580 mg manganklorid eller 440 mg magnesiumklorid.

Eksempel 14:

Det gås frem som i eksempel 12, men tilsettes ytterligere 200 mg N.aH2P04• H2Q.

Eksempel 15:

Det gås.frem som i eksempel 12, men tilsettes ytterligere 200 mg NaH2P04<<>■ H20 og 230 mg karboksymetylcellulose.

Eksempel 16:

Det gås frem som eksempel 12, men tilsettes ytterligere 200 til 5.000 mg polyfloretinfosfat.

Eksempel 17:

Det gås frem som i eksempel 12, men tilsettes i stedet for sinkklorid 100 til 5.000 mg polyfloretinfosfat.

Eksempel 18.

Den i overskriften nevnte forbindelse fremstilles analogt med eksempel 1. Smeltepunkt 230°C (spalting) 20

• L cc J = -36° i 1%

D

eddiksyre.

Det som utgangsmaterial anvendte Cbo-D-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys(MBzl)-NH2fremstilles på folgende måte:

a) H-D-Cys (MBzl^-OH_

15g D-cystin loses i 1,5 1 torr ammoniak og tilsettes under omroring

og koking Na-metall til blåfarging. Det avfarges med litt ammonium-klorid og tildryppes under omroring og koking 30g p-metoksybenzyl-klorid. Det inndampes til torrhet, resten loses i vann og det ekstraheres méd etylacetat. Den vandige fase innstilles med saltsyre til det isoelektriske punkt (pH 5 - 6). Det filtreres, vaskes med vann, torres og det erholdes H-D-Cys(MBzl)-0H.

Smeltepunkt 204 C (spalting) r I a "iI 20 = -24 o i 1 nnatriumhydroksyd.

D

b) BQ<C->p<->C<y>s_(MBzl)_-gH_

24g H-D-Cys(MBzl)-OH i 200 ml dioksan/vann (1 : 1) tilsettes

25g BOC-azid og omrores i 2 dogn ved pH 10 (tilsetning av natriumhydroksyd). Det ekstraheres med eter, den vandige fase syres med sitronsyre og ppoduktet ekstraheres med etylacetat. Etylacetatfasen vaskes med vann, torres over natriumsulfat og inndampes. Det krystalliseres fra eter/petroleter.

22

Smeltepunkt 75°C ;Q aJ = +36° i dimetylformamid.

D i

c) BOC-D-Cys(MBzl) -NH_ '

5g BOC-D-Cys(MBzl)-OH loses i 60yml torr tetrahydrofuran, avkjoles til -15°C, tilsettes 1,85 ml N-etyl-morfolin, deretter 1,92 ml klormaur-syre-isobutylester og det omrores i 10 minutter. Deretter innfores ved -15°C under omroring torr ammoniakgass, deretter rores det videre i 2 timer, idet temperaturen stiger til romtemperatur. Det fortynnes med ca. 800 ml etylacetat, vaskes med vann og den organiske fase torres over natriumsulfat. Det inndampes, filtreres, vaskes med etylacetat/eter, torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes.

20

Smeltepunkt 140°C ccJ = +26° i dimetylformamid.

D

d) H-D-CysjMBzl)-NH2_Trif luoracetat_

2,5g BOC-D-Cys(MBzl) -Nf^ susbenderes i 5 ml metylenklorid, tilsettes

6 ml trifluoreddiksyre og hensettes i 45 minutter ved romtemperatur. Det omrores med eter, filtreres, vaskes med eter, torres og

erholdes H-D-Cys(MBzl)-NH2 . trifluoracetat.

20

Smeltepunkt 130 C cc = -10 i dimetylfo rmamid.

D

e) BOC-Lyjs jCbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-D-CysjMBzl^-NI^

l,7g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH2loses i 25 ml dimetylformamid,

avkjoles til -20°C, tilsettes 1,6 ml 5n saltsyre i eter, deretter o,24 ml tert,-butylnitrit og omrores i 5 minutter ved -15°C. Etter tilsetning av 1,2 ml trietylamin ved -20°C frafiltreres utfelt trietylamin-hydroklorid og filtratet forenes (-20°C) med en kald losning av 0,8g-H-D-Cys(MBzl)-NH2• Trifluoracetat i 3 ml dimetylformamid. Det tilsettes 0,3 ml trietylamin og hensettes over nattten til 0°C> Det inndampes i vakuum, felles med eter, og vaskes med metanol pg vann. Det torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes.

20

Smeltepunkt 190°C ;| a | = +6° i dimetylformamid.

D

f) BOC-Trp-LysjCbo^-Thr-Phe-Thr-S

Den i overskriften nevnte forbindelse fremstilles analogt med

eksempel 1 k.

.20

Smeltepunkt 205 C ;[~" a~| = +0,5 i dimetylformamid.

D

g) Cbp^K^Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys^Cbo^-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-_

Phe-The-Ser-DJCys^MBzl)_-NH2

Den i overskriften nevnte forbindelse oppbygges analogt med eksempel

1 I fra BOC-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr^Ser^D-Cys(MBzl)-NH2

og

Cbo-D-Ala-GlyéCysXMBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-NHNH2

Smeltepunkt o (spalting) r a "<i20>= - o dimetylformamid. Smeltepunkt 223 C (spalting) ; oe = - 4,3 i dimetylformamid.

D

Eksempel 19.

Analogt med eksempel 2a;.-:.til c oppbygges Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl)-Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl) -NHCH2CH3 .

r —20

Smeltepunkt 230 C ;[_oc_j = -15,5° i dimetylformamid.

D

Deretter behandles som angitt i eksempel 1 med flytende hydrogenfluorid. Den i overskriften nevnte forbindelse erholdes med smeltepunkt 220°C (spalting) ; jr —j 20

lal = -42. i l%veddiksyre .

D

Eksempel220.

Analogt eksempel 3 a til c oppbygges Cbo-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe§Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-N(CH2CH3) 2»

<20>Smeltepunkt 248°C (spalting) ; a~| = -17° i dimetylformamid.

D

Deretter behaftdles som angitt i eksempel 1 med flytenede hydrogenfluorid. Den i overskriften nevnte forbindelse erholdes med smeltepunkt 205°C (spalting) jtL _ 20

T aol = -35° i1% eddiksyre.

D

Eksempel 21.

Den i overskriften nevnte forbindelse fremstilles analogt med eksempel 1.

Smeltepunkt 212 C (spalting) a J = -25 i 1% eddiksyre.

D

Det som utgangsmaterial anvendte Ac£Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl fremstilles

på folgende måte:

<a>) BOC-Ala-Gly-CysjMBzl^-LysjCbo

4g BOC-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe loses i 40 ml

trifluoreddiksyre/metylenklorid (9 : 1) og settes bort i en time ved romtemperatur. Det felles med eter, avsuges på filter, vaskes med eter og H-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe erholdes som trifluoracetat.

Smeltepunkt 194 o C sr l cc "I I 20 = -14 o i dimetylsulf oksyd.

D

4,3g H-Gly-Cys(MBzl)-Cys(CBo)-Asn-Phe-Phe-OMe -trifluoracetat,

l,7g BOC-Ala-OCP, 0,5g 1-hydroksy-benzotriazol loses i 60 ml dimetylformamid, tilsettes 0,7 ml trietylamin og omrores i 20 timer ved romtemperatur. Det felles med eter, filtreres, vaskes i rekkefolge med isopropanol, vann, isopropanol, eter og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes.

20

Smeltepunkt 210 o C a "II. 20 = -26 i dimetylsulfoksyd.

D

b) Ac-Al5-Gly-Cys^MBzl^-Lys_(Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe_

4,2g BOC-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe loses i 40 ml

trifluoreddiksyre/metylenklorid (9 : 1) og settes bort i en ^ time ved romtemperatur. Det felles med eter, filtreres, vaskes med eter, torres og H-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe erholdes som trifluoracetat.

Smeltepunkt 213 o C (spalting) ;l r a ~l I = -16° i dimetylformamid.

D

0,5g H-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe-trifluoracetat loses i 10 ml dimetylformamid og tilsettes 0,06 ml acetylklorid og 0,16 ml trietylamin. Blandingen settes bort over natten ved romtemperatur, inndampes og felles .med eter. Det filtfceres, vaskes med isopropanol og eter, torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes. Smeltepunkt 207°C ;r t20 _

[ «1 • - -27° i

D

dimetylformamid.

c) Ac-Ala-Gly-CysjMBzl)_-LysjCbo

360 mg Ac-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe loses i

10 ml dimetylformamid, tilsettes 0,4 ml hydrazin-hydrat og hensettes over natten ved romtemperatur. Det felles med vann, filtreres og vaskes med vann, metanol, eter. Det torres og den i overskriften nevnte forbindelse erholdes.

Smeltepunkt 250 C (spalting) ; a = -36 i dimetylformamid. o (spalting) r<l20>o dimetylformamid.

D

d) Ac-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys_(Gbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys^Cbo^-T^ Thr-Ser-CysjMBzl)_-OBzl_

Forbindelsen fremstilles analogt med eksempel 1 1 fra BOC-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl og Ac-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo) -Asn-Phe-Phe-NHNH„.

o rn20 o

Smeltepunkt 228 C (spalting) ;| aj<20>= -21 i dimetylformamid.

D

Eksempel 22.

Etter oksydasjon av den i overskriften i eksempel 1 angitte forbindelse med kaliumferricyanid erholdes den i overskriften nevnte forbindelse med smeltepunkt 228°C (spalting) ;r 20 Å

a = -32°',

D

c = 1,0 i eddiksyre 0,1 n.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av nye peptider med formel I

hvori X, Y og Z har den ovennevnte betydning, såvel som syreaddisjonssalter og komplekser av disse forbindelser, karakterisert ved at paptidene med den angitte formel "fremstilles etter dl?, peptidkjemien kjente metoder og eventuelt deretter på i og for seg kjent måte overfores i sine syreaddisjonssalter og komplekser.