NO750380L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av mikrobiell cellemasse av proteinkonsentrat med lavt innhold av nukleinsyre ved celleveggsnedbrytning og utvinning av derved frilagt protein.

Det har vist seg at menneskets evne til å tilgodegjøre seg proteininnholdet i mikrobiell cellemasse er sterkt begrenset hvis denne anvendes i kosten uten foregående behandling. Dette faktum antar man beror på at celleveggene avgrenser celleinnholdet fra god kontakt med fordøyelsessystemet. En første forholdsregel for å utnytte mikrobielt protein må derfor være en nedbrytning av celleveggene slik at proteinet blir lettere tilgjengelig. Nedbrytningen kan bl.ao bevirkes ad kjemisk vei, enzymatisk, ved varmebehandling eller ad mekanisk vei, f.eks. ved maling.

Selv om man utfører en slik nedbrytning av celleveggene for å øke utbyttet av protein, støter man på vanskeligheter. Således foreligger proteinet hovedsakelig sammen med nukleinsyrer eller deler av slike. Et høyt innhold av nukleinsyrer, særlig ribonukleinsyre (RNA), gjør cellemassen uegnet for konsumpsjon, da uheldige bivirkninger oppstår for konsumenten.

-For å kunne utnytte det mikrobielle protein til menneskeføde

er det derfor viktig av det mikrobielle utgangsmateriale, cellemassen, å fremstille proteinkonsentrater med redusert innhold av nukleinsyre.

En teknisk metode for fremstilling av proteinkonsentrat med lavt nukleinsyreinnhold er beskrevet i svensk patentskrift 355-823. Denne metode innebærer at protein og nukleinsyre i den desintegrerte cellemasse skilles ved at proteinet utfelles selektivt, dvs. nukleinsyren forblir i oppløsning, ved hjelp av varme ved optimal pH. Varmeutfeiningen bevirker imidlertid samtidig en denaturering av proteinstrukturen, hvilket begrenser antallet mulige næringstilbered-ninger.

Foreliggende oppfinnelse angår en ny teknisk fremgangsmåte

ved hjelp av hvilken ovennevnte ulempe med varmedenaturering av proteinstrukturen unngåes. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inne-L*£<*>jTi;.I a' C iiicui vviCi kOiSO-Liio tå jOii • e> v* liieKanj-iK ueilutcyitiJ. liiy Oy XiiKuUdte jon av den desintegrerte cellemasse i nærvær av et salt som kan tillates •ved raenneskekonsumpsjon, og ved måtelig temperatur fremstiller et 'proteinkonsentrat med meget lavt innhold av nukleinsyre. Nukleinsyrereduksjonen oppnåes ifølge oppfinnelsen på enzymatisk vis, dvs. ved at endogen ribonuklease RNase, aktiveres og nedbryter RNA, hvorefter nedbrytningsproduktene av nukleinsyre lett kan skilles fra proteinkonsent ratet .

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utgjør således et verdifullt alternativ til den i det svenske patentskrift 355.823 beskrevne varme-utfelningsfremgangsmåte ved at i begge tilfelle fåes proteinkonsentrater som har forskjellige funksjonelle egenskaper. Eksempelvis er nitrogenoppløseligheten høyere når konsentratet fremstilJ.es ved foreliggende fremgangsmåte. De to typer av konsentrater er derfor anvendbare for forskjellige næringsmiddelformål. Nitrogenutbyttet og nukleinsyrereduksjonen er av samme størrelsesorden i begge tilfelle. En teknisk fordel ved foreliggende fremgangsmåte er bedre separasjons-egenskaper hos suspensjonen efter utfelning av proteinet, hvilket innebærer lavere omkostninger for separasjonstrinnet. En annen om-stendighet som kan påvirke valget av fremgangsmåte, er det faktum at den tynnere fase ved varmeutfelningsfremgangsmåten inneholder høy-molekylær nukleinsyre, mens den tynnere fase ved foreliggende fremgangsmåte inneholder spaltningsprodukter av nukleinsyre.

Formålet med foreliggende oppfinnelse oppnåes ved at man danner en suspensjon av cellemassen, at man utsetter cellemassen i suspensjonen for mekanisk desintegrering, at man inkuberer suspensjonen i nærvær av et salt som kan tillates ved raenneskekonsumpsjon, og ved en temperatur på 30 - 70°C og en pH-verdi på 5 - 9, og at man fraskiller proteinkonsentratet .

Det har således overraskende vist seg at man ved å utføre celle-veggsnedbrytningen på mekanisk vei og tilsette et salt til den desintegrerte cellemasse bevirker aktivering av endogent enzym, slik at nukleinsyren ved efterfølgende inkubasjon ved den angitte temperatur og angitte pH-verdi nedbrytes.

Mekanismen for enzymnedbrytningen er ikke helt klarlagt. For gjærceller gjelder imidlertid at RNA er lokalisert til kjernen, mito- kondrier, ribosomer og cytoplasma. RNase er påtruffet i vakuolene og assosiert med ribosomene. Den mekaniske desintegrering forårsaker antagelig en destruksjon av den subcellulære organisasjonhvilket fører tii nye muligheter ror RNase til å virke paRin<a>. Saixexs roiie ved den enzymatiske nedbrytning er ikke kjent.

Desintegreringen av cellemassen må således utføres mekanisk for at det ønskede resultat skal oppnåes. En fordel ved denne form for nedbrytning er at celleproteinet ikke påvirkes slik at dets verdi som næringsmiddel forringes. Videre gjelder at desintegreringen ut-føres slik at celleveggene på en så stor del av cellene som mulig, nedbrytes men under slike forhold at RNase ikke inaktiveres. Eksempelvis må temperaturen ikke overstige 70°C. Desintegreringen ut-føres fortrinnsvis i en med malelegemer forsynt homogenisator eller i en trykkhomogenisator, f.eks. av typen Manton-Gaulin. Malelegemene bør bestå av et i levnetsmiddelsammenheng godtagbart materiale,

f.eks. visse glass- eller stålkvaliteter. For gjær og bakterier kan kuleformige malelegemer med en diameter under 2 mm, passende 0,45 - 0,75 mm, med fordel anvendes. Ved kontinuerlig drift kan optimale desintegreringsbetingelser lett oppnåes. Malelegemene fraskilles derved kontinuerlig, f.eks. i en silanordning.

Et vesentlig kjennetegn ved foreliggende fremgangsmåte er således nærværet av et salt ved inkuberingen. Saltet tilsettes passende efter den mekaniske desintegrering, men salttilsetningen kan også skje før eller under denne i de tilfelle hvor desintegrerings-apparaturen er av et slikt materiale at korrosjon ikke blir forstyrr-ende. Uten nærvær av salt skjer der ingen enzymatisk nedbrytning av nukleinsyre. I denne sammenheng må bemerkes at en viss såkalt bunnreduksjon av nukleinsyreinnholdet alltid fåes ved utfeining av protein, men at denne reduksjon beror på (i dette tilfelle positive) tap ved felningsfremgangsmåten og at denne reduksjon ikke øket ved inkubering uten salt. Heller ikke gir tilsetning av salt til sus-pensjoner av ikke desintegrerte celler noen nukleinsyrereduksjon efter inkubering.

Som salt anvendes et hvilket som helst salt som kan tillates

ved menneskekonsumpsjon, f.eks. nat riumklorid, dinatriumhydrogenfosfat, natriumdihydrogenfosfat, kaliumklorid, dikaliumhydrogenfosfat, kaliumdihydrogenfosfat og calciumklorid. Det foretrukne salt er natriumklorid, ikke minst fra et omkostningssynspunkt. Foreliggende fremgangsmåte er naturligvis også tillempbar for forskjellige kombina-sjoner av hvilke som helst av de nevnte salter.

Allerede en meget liten tilsetning av salt, som 0,1 vekt% beregnet på suspensjonens vekt, gir en markant nukleinsyrereduksjon. Ved en tilsetning av 1 vekt% salt kan en RNA-reduksjon av størrelses-orden 7j ' vekt% erholdes, mens den maksimale RNA-reduks jon, som er av størrelsesorden 85 vekt%, oppnåes 'ved et saltinnhold på ca. 3 vekt%. RNA-reduksjonen i proteinkonsentratet beregnes på tørrstoffinnholdet og på RNA-innholdet i suspensjonen før inkubering. En økning av saltinnholdet over ca. 3 vekt% gir ikke noen ytterligere forbedring av RNA-reduksjonen. Innhold over 3 vekt% opptil i det minste ca. 5 vekt% gir imidlertid ikke noen nevneverdig nedsetning av RNA-reduksjonen. Saltinnholdet bør således fortrinnsvis være 0,1 - 5 vekt%, og aller helst 1-3 vekt%. Den øvre grense for saltinnholdet er ikke kritisk og bestemmes av økonomiske faktorer og av det saltinnhold som kan tolereres i proteinkonsentratet ved menneskekonsumpsjon. I denne sammenheng bør imidlertid bemerkes at salt som er tilstede i proteinfeiningen, kan vaskes bort med vann, hvilket omtales nærmere nedenfor. Saltinnholdet bør imidlertid ikke overstige 20 vekt%.

Det for inkubasjonen anvendbare temperaturområde er 30 - 70°C. Fortrinnsvis anvendes imidlertid en temperatur i området 40 - 65°C og aller helst en temperatur i området 48 - 62°C. I området 48 - 62°C er RNA-reduksjonen således praktisk talt konstant for siden å minske markant såvel under 48°C som over 62°C.

Det ønskede resultat oppnåes ved en pH-verdi under inkubasjonen i området 5- 9- Ifølge en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen opprettholdes imidlertid pH-verdien i området 5 - 7, og aller helst i området 5-6. Under pH ca. 5 skjer der en utfeining av protein, mens en pH over ca. 9 forstyrrer de aktive enzymer.

Den tid i løpet av hvilken inkubasjonen utføres, er ikke kritisk for foreliggende fremgangsmåte.. Under ellers optimale betingelser fåes maksimal RNA-reduks jon allerede efter 15 - 20 minutter. Den. i løpet av denne tid erholdte minskning av nitrogenutbyttet, dvs. nitrogeninnholdet i proteinkonsentratet i forhold til nitrogeninnholdet i suspensjonen før inkubering, beror praktisk talt utelukkende på RNA-reduksjonen. En ytterligere økning av inkubasjonstiden, dvs. utover den tid for hvilken maksimal RNA-reduksjon oppnåes, fører til en minskning av nitrogenutbyttet. Denne minskning av nitrogenutbyttet beror sannsynligvis- på en proteinnedbrytning, hvorfor inkubasjonen bør avbrytes så snart som det ønskede resultat hva angår nukleinsyre-reduks jon, er oppnådd.

Foreliggende fremgangsmåte er tillempbar på forskjellige typer av mikroorganismer, f.eks. gjær og bakterier egnet for menneske - konsumpsjon. Eksempel på anvendbare mikroorganismer er Saccharomyces cerevxsxae, Saccharomyces carisbergensxs, gjær av Candidatypen samt methan- og metbanoloxyderende mikroorganismer som Pseudomonas-bakterier.

RNA-reduksjonen påvirkes ikke nevneverdig av variasjoner i konsentrasjonen av tørr cellemasse i suspensjonen under inkuberingen. En passende konsentrasjon er 2-19 vekt%, men denne er ikke kritisk for foreliggende fremgangsmåte.

Inkuberingen avbrytes passende ved kjøling av suspensjonen til

> en temperatur under 30°C og/eller ved pH-justering av suspensjonen til en verdi under 5. Selv om en viss uoppløseliggjøring av protein finner sted under inkuberingen, forbedres utbyttet hvis pH-verdien senkes til under 5, f.eks. ved tilsetning av saltsyre, hvilket fører til en hurtig utfelning av protein. Proteinutfeiningen reguleres passende på for fagmannen kjent måte, f.eks. ved forsiktig omrøring og' passende konsentrasjon av den saltsyreoppløsndng som tilsettes, slik at en fnokket felning fåes, som er lettere å fraskille enn en kornet felning.

Efter avsluttet proteinutfeining skilles suspensjonen på i og for seg kjent vis , f.eks. ved filtrering, bunnfeining eller sentri-f ugalseparer ing. Nuk'leotidene og saltene finnes herved i såvel den tynnere som den tykkere fase, idet den sistnevnte utgjør proteinfeiningen. Separasjonen bør om mulig utføres slik at den tykkere fase, dvs. proteinfeiningen, får så lite volum som mulig„ Herved minskes i denne fase mengden av væske med oppløste nukleotider og oppløst salt. Da nukleotider er like skadelige som RNA for menneskekonsumpsjon, kan om nødvendig nukleotidmengden ytterligere minskes ved enkel vaskning med vann. Ved denne vaskning fjernes samtidig salt som fore-kommer i feiningen.

Om ønskes, kan det. efter adskillelsen og eventuell vaskning erholdte proteinkonsentrat tørres på konvensjonelt vis, f.eks. ved sprøytetørring. Om tørring skal anvendes eller ikke, beror naturligvis på i hvilken form proteinkonsentratet skal anvendes.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er beskrevet ovenfor uten noe trinn for fraskilling av cellevegger. I det minste hva angår gjærproteinkonsentrat har der hittil ikke vært fremført noen innvend-inger fra næringssynspunkt eller toksikologisk synspunkt. Celleveggene kan snarere i mange tilfelle være en fordel i nærings-middelt ilberedninger , da de gir produktet en viss fasthet. Hvis det imidlertid fins grunn til å mistenke at det foreligger stoffer bunufcsL Lii celleveggene som er uheldige i næringsmiddelsammenheng.

kan. de senere fraskilles enten før eller efter inkubasjonstrinnet. Fortrinnsvis skjer fraskillelsen før inkubasjonstrinnet, da dette gir et bedre utbytte av protein. Hvis nemlig f raskillelsen. skjer efter inkubasjonstrinnet, fraskilles samtidig en viss mengde protein som

uoppløseliggjøres under inkubasjonen. Uavhengig av på hvilket stadium fraskillelsen utføres, bør den gjøres ved en pH-verdi på 5 - 10, fortrinnsvis 7~9, hvor hoveddelen av proteinet foreligger i oppløsning. Fraskillelsen utføres på konvensjonelt vis, som omtalt ovenfor i for-bindelse med fraskillelsen av proteinkonsentrat.

Som omtalt ovenfor, kan den mekaniske desintegrering om ønskes utføres kontinuerlig. Dette gjelder imidlertid også samtlige av de øvrige trinn, som inkubering, separasjon og tørring, hvilket innebærer at hele fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres såvel sat svis som kontinuerlig.

Ifølge oppfinnelsen kan proteinkonsentrater erholdes som inneholder opptil ca. 70 vekt% av nitrogenet i utgangscellemassen og som har RNA-innhold under 1,5 vekt%.

Oppfinnelsen skal nu belyses ytterligere ved følgende eksempler.

Eksempel 1

5 kg cellemasse (tørrsubstans) av Saccharomyces cerevisiae med 7% RNA og 8% nitrogen, suspenderes i vann til 100 1 ved værelsetemperatur. Cellene desintegreres i en desintegrator fylt med glassperler med diameter 0,50 - 0,75 mm. pH måles til 5,8- Koksalt tilsettes til 5 vekt%. Suspensjonen oppvarmes til 50°C og holdes ved denne temperatur i 20 minutter. Suspensjonen avkjøles og pH senkes ved salt syretilsetning til pH k■ Suspensjonen separeres i en sentrifugalseparator. Den tykke masse vaskes en gang med 50 1 vann. I den vaskede tykke fase fåes 3,5 kg tørrsubstans som utgjør proteinkonsentratet, inneholdende 1,5% RNA og 8% nitrogen.

Eksempel 2

10 kg cellemasse (tørrsubstans) av Saccharomyces carlsbergensis med 6% RNA og 8% nitrogen suspenderes i vann til 100 1 ved værelsetemperatur. Cellene desintegreres i en trykkhomogenisator av type Manton-Gaulin. pH måles til 6,2. Kaliumklorid tilsettes til 2 vekt%.

Suspensjonen oppvarmes til 65°C og holdes ved denne temperatur i

15 minutter. Suspensjonen avkjøles og pl-l senkes ved saltsyret ilset ning til pH U. Suspensjonen spees til 200 1 med vann og separeres i sentrifugalseparator. Den tykke fase vaskes en gang med 50 1 vann.

I den vaskede tykke fase fåes 7,0 kg tørrsubstans som utgjør proteinkonsentratet , inneholdende 3,8% RNA og 7,8% nitrogen.

Eksempel 3

5 kg cellemasse (tørrsubstans) fra en methanoloxyderende Pseu-domonas-bakterie med 10% RNA og 9,5% nitrogen suspenderes i vann til 100 1 ved værelsetemperåtur. Cellene desintegreres i en desintegrator fylt med stålkuler med en diameter av 0,15~0,25 mm. pH måles til 6,0. Dinatriumhydrogenfosfat tilsettes til 1 vekt%. Suspensjonen oppvarmes til 38°C og holdes ved denne temperatur i 30 minutter. Suspensjonen avkjøles og separeres i sentrifugalseparator. Den tykke fase vaskes en gang med 50 1 vann. I den vaskede tykke fase fåes 3,5 kg tørrsubstans som utgjør proteinkonsentratet, inneholdende 6% RNA og 10% nitrogen.

Eksempel 4

5 kg cellemasse (tørrsubstans) av Saccharomyces cerevisiae med 7% RNA og 8% nitrogen suspenderes i vann til 100 1 ved værelsetemperatur. Koksalt tilsettes til 1 vekt%. Cellene desintegreres i en desintegrator fylt med glassperler med en diameter på 0,50 - 0,75 ram.

pH måles til 5,8. Suspensjonen oppvarmes til 6o°C og holdes ved denne temperatur i 15 minutter. Suspensjonen avkjøles og pH senkes ved saltsyretilsetning til pH 4. Suspensjonen separeres i sentrifugalseparator. Den tykke fase vaskes en gang med 50 1 vann. I den vaskede tykke fase fåes 3,3 kg tørrsubstans, som utgjør proteinkonsentratet, inneholdende 2,0% RNA og 8% nitrogen.

Eksempel 5

5 kg cellemasse (tørrsubstans) av en mikroorganisme isolert fra jord, trolig Candida-gjær med 7,5% RNA og 7,5% nitrogen suspenderes i vann til 100 1 ved værelsetemperatur. Cellene desintegreres i en desintegrator fylt med glassperler med en diameter på 0,50 - 0,75 mm. Koksalt tilsettes til 3 vekt%. pH innstilles med natronlut til pH 7. Suspensjonen oppvarmes til 50°C og holdes ved denne temperatur i 20 minutter. Suspensjonen avkjøles og pH senkes ved saltsyret ils et-ning til pH 4- Suspensjonen separeres i sentrifugalseparator. Den tykke fase vaskes en gang med 50 1 vann. I den vaskede tykke fase fåes 3,3 kg tørrsubstans som utgjør proteinkonsentratet, inneholdende 3,5% RNA og 8,5% nitrogen.<f3>>

Claims (15)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av mikrobiell cellemasse av pro temKonsenr rat mea lavt innhold- av nukieinsy re , ved ceiieveyysueu-brytning og utvinning av derved frilagt protein, karakterisert ved at man fremstiller en suspensjon av cellemassen, at man utsetter cellemassen i suspensjonen for mekanisk desintegrering, at man eventuelt fraskiller, fortrinnsvis ved en pH--verdi på 7 - 9, cellevegger nedbrutt ved den mekaniske desintegrering, at man inkuberer suspensjonen i nærvær av et salt som kan tillates ved menneskekonsumpsjon, og ved en temperatur på 30 - 70°C og en pH-verdi på 5 - 9, at man fraseparerer proteinkonsentratet, - fortrinnsvis efter først å ha senket pH-verdien til under 5, og at man eventuelt vasker proteinkonsentratet med vann.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man utfører den mekaniske desintegrering i en med malelegemer forsynt h <p> mogenisator.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, •karakter 'i sert. ved at man utfører den mekaniske desintegrering i en trykkhomogenisator.

4- Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at man inkuberer suspensjonen i nærvær av natriumklorid som salt.

5- . Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at man anvender saltet i en mengde på 0,1 - 20 vekt%, beregnet på suspensjonens vekt.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man anvender saltet i en mengde på 0,1 - 5 vekt.%.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man anvender saltet i en mengde på 1 - 3 vekt%.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1-7, karakterisert ved at man inkuberer suspensjonen ved en temperatur på 40 - 65°C.

9.F remgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at man inkuber.er suspensjonen, ved en temperatur på Lyg - 62°C.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1-9, karakterisert ved at man inkuberer suspensjonen ved en pM-vcrdi på 5-7*

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at man inkuberer suspensjonen ved en pH-verdi på 5 - 6.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1 - 11, karakterisert ved at man utfører separasjonen og/eller fraskillelsen ved hjelp av filtrering, bunnfeining eller sent rifugalseparering, fortrinnsvis sentrifugalseparering.

13- Fr emgangsmåte ifølge krav 1 -12, karakterisert ved at man som mikrobiell cellemasse anvender gjær eller bakterier.

14- Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at man som mikrobiell cellemasse anvender cellemasse av Saccharomyces- eller Candida-gjær eller methan- eller methanol-oxyderende bakterier.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14 , karakterisert ved at man som mikrobiell cellemasse anvender cellemasse av Saccharomyces cerevisiae.