NO744591L - - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte ved enzymatisk framstilling av hal vsyn tett ske penicilliner og cefalosporiner."-

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for enzymatisk syntese av halvsyntetiske penicillinet .dg cefålosporiher-ved. Æjélp av en uoppløselig acylase.

Viktigheten av de halvsyntetiske derivater av penicilliner og cefalosporiner er i de senere år blitt alminnelig kjent. Disse forbindelser anvendes i stor utstrekning i farmakologien i stedet for de antibiotika som ikke er penicillinaseslkre og de er derfor ikke særlig effektive. Disse produkter kan oppnås ved hjelp av en kjemisk eller enzymatisk syntese.

Den kjemiske syntese, med unntagelse av den som vedrorer fremstilling av ampicillin, gir ikke gode utbytter og krever anvendelse av dyre reaksjonskomponenter og et stort antall trinn.

Den e^2- ymati.ske syntese kan gjennomføres ved hjelp av celler eller av et mer eller mindre renset ekstrahert penicillin-acylaseenzyra. Den gjennomføres vanlig ved hjelp av celler da det rensede enzym

er så dyrt at det merkbart påvirker prosessens lønnsomhet. En vesentlig mangel ved den mikrobielle syntese skyldes det forhold at produktet i den endelige reaksjonsblanding befinner seg sammen med store mengder av forurensende proteinmaterial som nødvendig-gjor anvendelse av meget raffinerte og dyre metoder for rensingen. På den annen side er denne rensing absolutt nødvendig for å fjerne de minste spor av protelnforurensninger som hvis de er til stede i sluttproduktet kan bevirke kraftige allergiske reaksjoner.

Den foreliggende roppfinnelse vedrorer enzymatisk syntese hvor det anvendes pénicillin-acylase innesluttet i porøse fibere i henhold til en metodikk som er beskrevet i italiensk patentskrift 836.462

Viktige særegenheter ved den foreliggende oppfinnelse er:

a) anvendelse av fibere sont tilfører en stor mengde enzym for å gjennomføre en hurtig syntese av produktene. b) Muligheter for lett fraskilling av enzymet fra reaksjonsblandingen slik at uønskede spaltingsreaksjoner ilske opptrer. c) Produktet er ikke forurenset^da proteinet ikke kan passere ut fra de fiberhulrom hvori det inneholdes. *\ d) Kontinuerlig fornyet anvendelse av det innesluttede enzym som medfører opplagte fordeler for prosessens lønnsomhet.

Reaksjonen foregår mellom et utgangscaaterial som kan fremstilles ved hydrolyse av de naturlige antibiotika eller derivater" derav (e-aminopenicillar^syre 7-aminodaf aloapo/ aasyre) og -en -karboksyl-syre hvis karboksylgruppe kan aktiveres f .eks. ved hjelp av

ester eller amid, slik at reaksjonen påskyndes.

Temperaturen kan utgjøre fra 0 til 50°C>foretruktet omtrent

25°C, og pH er fra 4,0 til 9,0 og foretrukket omtrent 7.

Realts j onen gjennomføres ved å bringe fiber ene som inneholder

enzymet i kontakt med reaksjonsblandingen. Da denne er et heterogent system må en kraftig omrøring gjennomføres for å

unngå diffusjonsfenomener.ved grense-sjiktene.

Forskjellige reaktor typer kan anvendes og en meget enkel reaktor som ble anvendt utgjøres av en kolonne fylt med de enzymholdige fibere og hvorigjennom oppløsningen resifekuleres ved hjelp av en

pumpe i den tid som er nødvendig for å oppnå den høyeste;omdannelse.

De følgende eksempler illustrer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fenicillin-acyiase ble ekstrahert og renset fra Sscherichia Coli,. stammen av ATCC 9637, og innesluttet i cellulosetriacetatfibere i henhold til den metode som er beskrevet i italiensk patentskrift 836.462 slik at det ble oppnådd fibere inneholdende omtrent 25000 enzym-enheter pr. g polymer (1 enhet 1 mmol hydrolysert penicillin G pr. time ved 37°C)..

5D0 mg (2.33 mmol) 7-amino, 3-metyl,cef-3-em-4-karboksylsyre (7 \DCA) og 1 g (4.97 mmol) D(-) fenyl-glycinmetylesterlsloro-hycxat (PG24) ble opplost i 50 ral av en 0.1 M kaliumfosfat-buffer ved pH 7.00 ved 25°C. Denne oppløsning ble under omrøring holdt i kontakt med 2 g fiber tilsvarende 1 g cellulosetriacetat (CTA) inneholdt i et glas sr or forsynt med kappe.. Ved regelmessige tidsmellomrom ble 7 ø (2 '-araino-2 '-fenylacetamid-).,3-.metyl-3ef-3-emr4-karboksylsyre (cefalxin) bestemt ved hjelp av ett s pek tro-fotometrisk metode (AKALYST, 92, 247, 1967). Etter 1 time bi^reaksjonen stanset ved å fjerne réaksjonsblåndingen fra fiberene. I oppløsningen var det B, A mg/ml cefalxin tilsvarende en omdannelse av 7 M)C& på 51%.

Eksempel 2.

Det ble fremstilt en løsning aV 7-ADCA og .PGM som beskrevet i eksempel 1 men pH var 6.50.

BSter omtrent 2 timer ble reaksjonen avbrutt som nevnt ovenfor.. I løsningen var det 8.1 mg/ml cefalxin tilsvarende 495$ omdannelse.

Eksempel 3.

Det ble fremstilt en løsning av 7-ADCA og PGM i henhold til eksempel 1 men pH var lik 8.50.

Etter omtrent 30 minutter ble reaksjonen avbrutt og i løsningen var det 7.8 mg/ml cefalxin tilsvarende en 47% omdannelse.

Eksempel 4.

500 mg (2.33 mmol) 7 ADCA og 2 g (9.94 mmol) PGM ble oppløst i 50 ml K-PO^buffer 0,2 M ved pH 7. Denne oppløsning som ved h-^glp

av termostat ble boldt véd^25?G ble.under, ^omrdriisg^holdt--1* kontakt med 2 g fiber il time. atter denne tid var det i løsningen 12 mg/ml.cefalxin tilsvarende 73% omdannelse av 7 ADCA.

Eksempel 5.

En løsning ble fremstilt i henhold til eksempel 4 og under omrøring br agt i kontakt med 2 g fiber som ved hjelp av termostat ble holdt ved 37°C. Reaksjonen ble avbrutt etter 30 minutter.

I oppløsningen var det 11.4 mg/ml cefalxin tilsvarende en 70%

omdannelse.

Eksempel 6.

500 mg (2.31 mmol) 6-aminopenicillansyre (6-APA) og 2 g (10.2 mmol) etyleater av D(-) p-hydroksyifenyl-glycin (p-OH PGE) ble oppløst 1150 ml "~P04buffer 0.1 M ved pH 7.00 ved 25°C. Oppløsningen ble under omrøring holdt i kontakt med 2 g fiber

i 3 timer og deretter fjernet.

It/oppløsningen var Set 1.7 mg/ml e-araino-p-hydroksy-banzyl-penicillin (amoksycillin) tilsvarende en 6-APA omdannelse på 30?L

STcsempel 7.

4 g 6-APA (18.7 mmol) og 2 g (10.2 mmol) pOIi-PGE ble oppløst

i 150 ml K-P04buffer 0.1 11 ved pH 7.00 og 25°C og ble under omrøring holdt i kontakt med 4 g fiber.. Reaksjonen ble avbrutt etter 7 timer og da var konsentrasjonen av amoksycillin 7.2 mg/ml tilsvarende 15.7% omdannelse.

Eksempel 8.

500 mg (2.33 raapl) 7ADCA og 1 g (5.1 mmol) pOH PGE ble opplost i 150 ml K-PO^buffer 0.1 £4 ved pH 7.00 ved 25°C. Etter 4 timer ble reaksjonen avbrutt som tidligere nevnt.

I reaksjonsblandingen var det 2 mg/ml 7|3^2'arainc—2M~4vhydr.okBy~ fenyl) acetamid73 metyl, cef-3-era-4-karboksylsyre tii svarende en 35.4% omdaimelae.

Eksempel 9. •

535 mg (2.5 mmol) 7 ADCA og 873 mg (2.5 mmol) a-aminobenzyl penicillin (aapicillin) ble opplost i 50 ml IC-PO^, buffer 0.1 M

ved pH 7.00 ved 25°C*Oppløsningen ble holdt i kontakt med 1 g fiber under omrøring.

Stter Nitime ble det oppnådd maksimal konsentrasjon av cefalxin tilsvarende 3.5 mg/ral tilsvarende en 20% omdannelse av 7 ADCA.

Eksempel 10.

500 mg (2.33 mmol) 7ADCAog 1.35 g (9 mmol) fenylglycinaciid ble opplost i 50 nu/K-P04buffer 0.1 ti ved pH 7. Oppløsningen ble under omrøring holdt i kontakt med 2 g fiber i omtrent 1

time ved 25°C. Etter dette tidsrom var det i løsningen 11 mg/ral cefalxin tilsvarende 68% omdannelse av 7 ADCA.

Eksempel 11.

640 rag (2.35 mmol) 7-aminocefalosporansyre (7-ADCA) og 1.0 g (5.1 mmol) p-hydroksyfenylglicinetylester ble oppløst i 15© ml

fosfatbuffer 0.1 M ved pH 7 ved 25°C. /

Oppløsningen bie under omrøring holdt i kontakt med 2 g enzymholdig fiber i 4 timer. Btter dette tidsrom var det i reaksjonsblac&ingen 1.9 mg/mi. 73 (2,-amino-2,-(4-hydroksyfenyl) aceta^id) 3-hydroksy-metyl (acetat) cef-3-em-4-karboksylsyre tilsvarende efc. ut'?ytte på-29%. ved omdannelsen av 7 ADCA.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for enzymatisk syntese av halvsyntetlske penicilliner og cefalosporiner, karakterisert ved at© t hydrolyseprodukt av naturlige antibiotika eller derivater derav bringes i kontakt med en karboksyl syre, hvori karboksylcjruppén er aktivert, i nærvær av en penicillinacylase innesluttet i fibere.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at omsetningen gjennom-føres ved en temperatur fra 0 til 50°C.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at omsetningen gjennom-føres ved pH fra 4 til 9.

4. Fremgangsmåte som angjtatt i krav j B, karakterisert ved at penicillinacylase er innesluttet i fibere fremdilt fra cellulosetriacetat.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-4, karakterisert ved at penicillinacylase er ekstrahert og renset fra Escherichia Coli-stammen ATCC 9637.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-5, karakterisert ved at det som antibiotiske •': derivat anvendes 7 - aiaino- 3-me tyl - cef - 3-em- 4 - karboksyl syre og at det oppnådde produkt er cefalxin.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 - 5„ karakterisert ved at derivatet av naturlige antibiotika er 6-aminopenicillamsyre og at det oppnådde <1> produkt er amoksycillin.