NO338885B1 - Enantiomerisk rent (2R)-1,2-dioleoyloksy-3-trimetylammoniumpropanklorid ((2R) -DOTAP klorid), anvendelse derav som bestanddel ved fremstillingen av legemidler og farmasøytisk sammensetning derav. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører enantiomerisk rent (2R)-DOTAP-klorid så vel som anvendelsen derav til fremstillingen av farmasøytiske preparater.

DOTAP-klorid betegner ovenfor og nedenunder N,N,N-trimetyl-2,3-bis[[(9Z)-l-okso-9-oktadekenyl]oksy]-l-propanaminiumklorid, også kjent som (Z,Z)-N,N,N-trimetyl-2,3-bis[(l-okso-9-oktadekenyl)oksy]-l-propanaminiumklorid eller l,2-dioleoyloksy-3-trimetylammoniumpropanklorid, og hydratene derav.

C42HeoCIN04, Mw698.54

CAS-numre: 132172-61-3 og 477274-39-8 (racemat),

197974-73-58 (racemat, monohydrat)

428506-51-8 (2S-form), 328250-28-8 (2R-form)

Liposomer er syntetiske flerlagsvesikler (kuleformede, frittstående membraner) som omfatter ambifile stoffer, vanligvis naturlige lipider, hvor både hydrofile stoffer kan innkapsles i det vannholdige indre, og også lipofile stoffer kan inkorporeres i innsiden av lipidmembranen.

De anvendes særlig i kosmetikk og i medisin, spesielt i dermatologi. Her innkapsles særlig vitaminer, koenzymer, hud- og solkrem. Liposomer anvendes generelt topisk.

Liposomer får imidlertid stadig mer betydning innen farmasøytisk teknologi, ettersom parenteral applikasjon av liposomer muliggjør oppnåelse av mer spesifikk fordeling til organer enn dersom de aktive forbindelsene anvendes i fritt oppløst form.

Dersom DNA, RNA eller proteiner inkorporeres, oppnår man lipoplekser.

Ved tilsetning av oljer og bruk av høytrykkshomogeniseringsmidler så kan man fra liposomer frembringe de såkalte nanopartikler (nanodeler). Dette er partikler med omtrent samme størrelse som liposomer, men som ikke har en vannfase, men en oljefase i sitt indre. De egner seg særlig for innkapslingen av lipofile stoffer.

Mikroemulsjoner er kolloidalt dispergerte enkeltfasesystemer som omfatter vandige, lipidlignende og overflateaktive komponenter. De oppviseren partikkelstørrelse på 1-500 nm og oppfører seg på en lignende måte som væsker.

Spesielt i forbindelse med de normalt dårlige løselige peptidiske aktive forbindelser, nukleotider, vaksiner og andre biofarmasøytika, har den oppløseliggjørende effekt på de anvendelsene som er beskrevet ovenfor, svært stor betydning.

På denne måten kan dessuten nedbrytning av de aktive forbindelsene i kroppen bremses, og en vedvarende frigivelseseffekt oppnås.

DOTAP-klorid tilhører klassen av kationiske lipider. Disse har, i motsetning til naturlig forekommende fosfolipider, ikke en zwitterionisk karakter. Liposomer som omfatter kationiske lipider, alene eller kombinert med fosfolipider eller andre lipidlignende forbindelser, har en positivt ladet overflate. Dette gir opphav til høy affinitet for slike celler som har en negativt ladet overflate på utsiden, for eksempel endotelceller.

Særlig viktig er imidlertid evnen til DOTAP-baserte og andre kationiske liposomer og lipoplekser når det gjelder å kunne trenge inn i celler og derved transportere de innkapslede aktive forbindelsene, inn i det indre av cellen (transfeksjon).

Alle disse egenskapene gjør DOTAP-klorid også svært interessant for kreftterapi. Disse egenskapene gir opphav til muligheten for å anvende vanlige cytostatiske midler innkapslet i kationiske DOTAP-liposomer.

Transfeksjonsegenskapene til DOTAP-klorid og andre DOTAP-salter, slik som for eksempel acetatet, bromidet, dihydrogenfosfatet, hydrogensulfatet, jodidet, mesylatet, metylsulfatet, trifluoracetatet, sulfatet eller disulfatet og triflatet, er tilstrekkelig kjente fra litteraturen.

DOTAP-dihydrogenfosfat og DOTAP-mesylat er bare nevnt som racemat i litteraturen. Alle andre salter nevnt ovenfor er hver nevnt som racemat og som 2S-enantiomer, og i tillegg er 2R-enantiomerene av kloridet og metylsulfatet nevnt.

I noen in vitro studier har andre salter slike som for eksempel DOTAP-metylsulfat, oppnådd bedre transfeksjonsverdier enn DOTAP-klorid.

Anvendt in vivo finner imidlertid en anionbytting på liposomoverflaten sted i den levende kroppen, slik at fordelene med andre salter ikke oppstår her. Spesielt ved medisinsk bruk hos mennesker er derfor, særlig for parenteral applikasjon, DOTAP-salter med fysiologisk akseptable anioner, slik som for eksempel det tilsvarende kloridet eller acetatet, foretrukket.

Medisinsk sett stilles, særlig ved parenterale anvendelser, de høyeste krav til kvalitet og renhet av de anvendte aktive forbindelsene og adjuvansene. Det er derfor svært strenge forskrifter fra myndighetene med hensyn til fremstillingen, reproduser-barheten ved fremstillingen så vel som biproduktprofilen til disse forbindelsene. Ved parenteralt anvendte stoffer må i tillegg mikrobiologisk forurensning med patogene mikroorganismer og endotoksiner nøye unngås og kontrolleres.

DOTAP-klorid og andre DOTAP-salter er ekstremt ustabile og er derfor vanskelige å fremstille til å være i en akseptabel renhet, slik at de er egnet for bruk til fremstillingen av en legemiddelformulering.

Som alle lipider som bærer oljesyreradikaler, slik som for eksempel de naturlige fosfolipidene DOPC og DOPE, er alle DOTAP-salter svært følsomme for oksidasjon. Oksidasjonsproduktene av umettede fettsyrederivater oppviser imidlertid som regel en høy toksisitet.

Her er egnede fremstillings- og rensemetoder nødvendige. DOTAP-acetat foreligger for eksempel som en høytkokende olje og er derfor teknisk meget vanskelig å få tak i tilstrekkelig kvalitet.

De vanlige metodene for å overvinne ustabiliteten, slik som f. eks. tilsetningen av antioksidanter i form av askorbinsyre eller redusert L-glutation, begrenser den generelle anvendbarheten av DOTAP-klorid mye ettersom interaksjoner med de senere innkapslede aktive forbindelsene, ikke kan utelukkes. En fullstendig utelukkelse av oksygen under fremstillingen, lagringen og anvendelse er praktisk talt umulig eller kan bare muliggjøres med svært stor innsats.

DOTAP-klorid er kommersielt tilgjengelig bare som en kloroformløsning eller som et amorft stoff.

Amorft DOTAP-klorid er i tillegg til sin oksidasjonsfølsomhet også ekstremt hygroskopisk og det løses ved normale atmosfæriske fuktighetsnivåer opp til en klebrig film innen svært kort tid. Dette vanskeliggjør håndtering av denne forbindelsen veldig.

Produsenten av amorft DOTAP-klorid anbefaler således som regel lagring under beskyttelsesgass ved -20 °C, og garanterer bare en holdbarhetstid på ca. 6 måneder.

Fra litteraturen er det utelukkende kjent forskjellige synteseveier for fremstillingen av amorft, racemisk DOTAP-klorid: Eibel og Unger, DE4013632A1, beskriver hovedtrekkene i syntesen av DOTAP-klorid fra DOTAP-bromid ved hjelp av ionebytting i kloroform/metanol/vandig HCI-løsemiddelsystemet og etterfølgende rensing ved hjelp av kromatografi. DOTAP-bromid oppnås på forhånd in situ fra l-brom-2,3-dioleoyloksypropan.

Leventis og Silvius, Biochim. Biophys. Acta, 1023 (1990) 124-132, beretter om syntesen av DOTAP-klorid fra DOTAP-jodid ved hjelp av ionebytting i to-fase system løsemiddel/NaCI-løsning. DOTAP-jodid fås på forhånd ved metylering av den tilsvarende dimetylaminoforbindelsen ved hjelp av metyljodid.

Nantz et al., Biochim. Biophys. Acta, 1299 (1996) 281-283, J. Med. Chem. 40

(1997) 4069-4078, beskriver syntesen av DOTAP-klorid ved hjelp av ikke-vandig ionebytterkromatografi. Den ønskede forbindelse oppnås ved inndamping av eluatet.

Felgner et al., US 5 264 618, utfører metyleringen av den tilsvarende dimetyl-aminoforbindelse direkte til DOTAP-klorid ved hjelp av metylklorid. De oppnår en gul voks angivelig ved krystallisering fra acetonitril ved -20 °C. DOTAP-klorid er imidlertid praktisk talt uoppløselig i acetonitril ved romtemperatur. Forsøk på å reprodusere denne såkalte krystallisering ga bare amorft materiale gjennom størkning av det oljeaktige stoffet ved avkjøling av den varme løsningen. Det faktum at dette ikke handler om en krystallisering viser seg også gjennom det faktum at forfatteren åpenbart ikke oppnår en renseeffekt, og må rense stoffet ved hjelp av kromatografi.

Følgelig er verken synteseveier for fremstillingen av de to enantiomeriske DOTAP-klorider eller deres karakteristiske egenskaper kjent hittil. Selv om Chemical

Abstracts har tildelt numre for de to enantiomerene, beskriver de tilsvarende publikasjoner utelukkende arbeidet med racemisk DOTAP-klorid.

Særlig dersom forbindelsene er ment for parenteral anvendelse, er en fremstilling som omfatter behandling med ionebytterharpiks svært problematisk med henblikk på mulig mikrobiologisk forurensning, ettersom tilsvarende harpikser er et ideelt næringsmedium for bakterier, og selv etter at de er blitt drept, foreligger fortsatt en risiko for forurensning med endotoksiner.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe DOTAP-kloridsalter og -hydrater med høyere renhet og med tilfredsstillende kjemisk og fysisk stabilitet. Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe disse saltene med lengre holdbarhetstider, noe som gjør det mulig å bruke dem til fremstillingen av farmasøytiske formuleringer. Videre er det et stort behov for en reproduserbar fremgangsmåte som kan utføres i industriell skala for fremstillingen av stabile former av DOTAP-klorid salte r og -hydrater.

Enantiomerisk rent DOTAP-klorid kan fås fra enantiomerisk rene utgangs-materialer analogt med fremgangsmåtene som er beskrevet for racematet, dvs.

via (R eller S)-l-klor-2,3-dioleoyloksypropan,

via (R eller S)-l-LG-2,3-dioleoyloksypropan og ionebytting (LG = uttredende gruppe), eller via (R eller S)-l-dimetylamino-2,3-dioleoyloksypropan.

En ytterligere fremstillingsfremgangsmåte som kan nevnes, er racemat-separasjonen av racemisk DOTAP-klorid.

Ved hjelp av forsøk er det nå overraskende blitt funnet at så vel racemisk som også enantiomerisk rent, krystallinsk DOTAP-klorid kan oppnås med høy kjemisk renhet og en utmerket stabilitet på en enkel måte. De krystallinske produktene som oppnås på denne måten, har praktisk talt ubegrenset stabilitet ved værelsestemperatur under beskyttelsesgass. De er derfor egnet som bestanddeler eller som utgangsmateriale for fremstillingen av legemiddelformer.

Gjenstand for den foreliggende oppfinnelse er følgelig enantiomerisk rent (2R)-DOTAP-klorid.

De stabile krystallmodifikasjonene kan foreligge i krystallinsk og delvis krystallinsk form. De oppviser en renhet som aldri hittil har vært oppnådd på > 98 %, sammen med en stabilitet som hittil aldri har vært oppnådd på > 98 %, i forhold til utgangsverdien etter lagring i 12 måneder med utelukkelse av luft ved 25 °C og 60 % relativ luftfuktighet. (Se i dette henseende tabell 1.) DOTAP-kloridkrystallmodifikasjonene håret innhold på mindre enn 1 ekvivalent krystallvann eller krystallløsemiddel pr. ekvivalent DOTAP-klorid.

De racemiske DOTAP-kloridkrystallmodifikasjonene foreligger for eksempel i tre forskjellige krystallmodifikasjoner (type I, type II og type III) og oppviser middels skarpe bånd i pulverrøntgendifferaksjonsmålinger (se i dette henseende fig. 1 til fig. 3 og tabell 2).

Utvalgte 2-teta-verdier for de forskjellige krystallmodifikasjonene er 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 og 25,2 (type I), eller 3,3, 4,9, 19,3, 20,0 og 23,5 (type II), eller 2,8, 5,8, 20,0, 21,2 og 25,1 (type III).

Enantiomerisk rene DOTAP-klorider oppnås likeledes i krystallinsk form. Utvalgte 2-teta-verdier for den funnede krystallmodifikasjon, er 12,8, 19,4, 19,8, 20,2 og 21,5 (type IV, se i dette henseende fig. 4).

Enantiomerene er optisk aktive. (2S)-DOTAP-klorid har således en optisk rotasjon på -2,12°, (2R)-DOTAP-klorid har en optisk rotasjon på +2,12° ([<x]D ved 20 °C,

1 % oppløsning i diklormetan).

Beskrivelsen omtaler i det etterfølgende en fremgangsmåte for fremstillingen av DOTAP-kloridkrystallmodifikasjoner som er kjennetegnet ved at DOTAP-klorid utkrystalliseres fra et aprotisk medium. Det aprotiske medium som anvendes for dette formål, kan være aprotiske løsemidler eller blandinger derav.

Det aprotiske medium kan i små mengder også omfatte protiske løsemidler, slik som f. els. vann. I eksepsjonelle tilfeller kan under egnede betingelser, 25 vekt% av protiske løsemidler også være til stede. Krystalliseringen av DOTAP-kloridene kan her utføres direkte fra reaksjonsløsningen uten forutgående rensing. Krystallinsk DOTAP-klorid kan likeledes oppnås ved rekrystallisering av amorft, delvis krystallinsk eller krystallinsk materiale.

Egnede aprotiske løsemidler er særlig:

etere, slike som f.eks. tetrahydrofuran, metyltetrahydrofuran, dioksan,

dietyleter, dipropyleter, diisopropyleter og metyl-tert-butyleter,

ketoner, slike som f.eks. aceton og 2-butanon, metylisobutylketon,

metylisopropylketon,

nitriler, slike som f.eks. acetonitril, og

estere, slike som f.eks. etylformiat, metylacetat, etylacetat, propylacetat,

isopropylacetat, butylacetat, isobutylacetat, di metyl karbonat, dietylkarbonat og l,3-dioksolidin-2-on.

Disse løsemidlene kan i hvert tilfelle brukes i ren form eller i form av en blanding, det vil si det er mulig både å bruke de forskjellige aprotiske løsemidlene i en gruppe i form av en blanding, og også anvende aprotiske løsemiddeltyper i form av en blanding med hverandre. Som allerede angitt ovenfor, kan protiske løsemiddeltilsetninger være til stede i det aprotiske løsemiddelet eller løsemiddelblandingen som brukes.

Protiske løsemiddeltilsetninger av denne type kan vanligvis bestå av de følgende løsemidler: alkoholer, slik som f. eks. metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol,

isobutanol, 2-butanol, tert-butanol, 3-metyl-l-butanol

og etylenglykol, metoksyetanol, etoksyetanol, eller vann.

De protiske løsemiddeltilsetningene kan videre være tilsetninger av de rene løsemidlene eller av blandinger av disse protiske løsemidlene.

Krystalliseringen av DOTAP-kloridmodifikasjonen oppnås som regel særlig ved sakte avkjøling av den fremstilte løsning til temperaturer under 30 °C. Dannelsen av krystallene utføres enten spontant eller ved poding med den tilsvarende DOTAP-kloridkrystallmodifikasjonen.

De forskjellige DOTAP-kloridkrystallmodifikasjonene kan omdannes til hverandre. Omdannelsene kan oppnås ved hjelp av varmebehandlinger av de isolerte krystallmodifikasjonene ved forhøyet temperatur eller ved forlenget omrøring av deres suspensjoner under krystalliseringsbetingelser.

Gjennom anvendelse av amorft eller delvis krystallinsk DOTAP-klorid som utgangsmateriale for rekrystalliseringen oppnår man ved den beskrevne fremgangsmåte hovedsakelig krystallinske DOTAP-klorider med en renhet som aldri tidligere har vært oppnådd, sammen med stabilitet som aldri tidligere har vært oppnådd.

Anvendelsen av krystallinske DOTAP-klorider til fremstillingen av legemiddel-formuleringer er også mulig ettersom de krystallinske DOTAP-klorider har utmerket stabilitet i fast form under de angitte betingelser, og har konstant og svært god kvalitet i et praktisk talt ubegrenset tidsrom.

I tillegg har enantiomerisk rene DOTAP-klorider andre fysikalske egenskaper enn racematet, særlig i kombinasjon med kirale forbindelser, slik som fosfolipidene eller kolesterolen.

De nye egenskapene som finnes forde enantiomerisk rene DOTAP-klorider, kan med fordel utnyttes, alene eller i kombinasjon med egnede fosfolipider, kolesterol og derivater derav, for å tilveiebringe nye liposomfinhetsgrader som, sammenlignet med vanlige former, på den ene side utgjør tettere pakninger av lipidene, og på den andre side har en mer jevn struktur. Liposomer fremstilt fra de rene enantiomerene oppviser således en 5 °C høyere hovedfaseovergangstemperatur sammenlignet med liposomene som omfatter racemisk DOTAP-klorid. Dette er et mål for pakningstettheten. Liposomer som omfatter DOTAP-kloridenantiomerer, har derfor redusert lekkasje av forbindelsen inkorporert i dem.

Dette har den følge at liposomer ladet med farmasøytisk aktive forbindelser vil frigi aktive forbindelser på en forsinket måte i vekselvirkning med metabolismen hos menneske- eller dyrekroppen. Sensitive, aktive forbindelser kan således med fordel særlig transporteres på en mer spesifikk måte til det ønskede sted eller organ hvor legemiddel-virkningen er ønsket.

DOTAP-kloridenantiomerene oppviser også, særlig i kombinasjon med kirale lipider, slik som fosfolipider, kolesterol og derivater derav, transfeksjonsegenskaper som er spesifikt forskjellig for cellelinjer.

For en fagperson er det mulig ved fremstillingen av disse nye liposomene spesifikt å velge en form eller et bestemt blandeforhold for DOTAP-kloridene som derved tilveiebringes, for å fremstille liposomer med visse nye egenskaper.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er følgelig også anvendelsen av de farmasøytiske preparatene som fås fra bruken av DOTAP-kloridformene som er krevet. Slike farmasøytiske preparater kan inneholde (2R)-DOTAP-klorid sammen med andre farmasøytiske, aktive forbindelser og kjente adjuvanser som vanligvis anvendes i legemiddelfremstillingen, samt ett eller flere løsemidler.

Disse farmasøytiske preparatene kan for eksempel foreligge i form av liposomer, lipoplekser, mikroemulsjoner og nanopartikler, og inneholder for eksempel en aktiv forbindelse fra gruppen av peptidene, nukleotidene, vaksinene eller de cytostatika.

Den foreliggende beskrivelse gjør det mulig for en fagperson å anvende oppfinnelsen på en allsidig måte. De følgende eksempler tjener i tillegg til bedre forståelse og til illustrasjon av mulige varianter av oppfinnelsen.

Alle temperaturer som er nevnt i de etterfølgende eksempler, er angitt i Celsius-grader. Hvis ikke annet er angitt, er innholdsdata angitt som vekt%.

Eksempler til illustrering av oppfinnelsen

Eksempel 1

Stabiliteter

For å bestemme stabiliteten til krystallinske DOTAP-klorider, lagres stoffene sammen med sammenlignbare prøver ved 25 °C og 60 % relativ fuktighet med utelukkelse av luft. Med jevne mellomrom måles restinnholdet av DOTAP-klorid og angis i sammenligning med utgangsverdien.

Renheten til og innholdet av DOTAP-klorid bestemmes ved hjelp av HPLC. For type I ble følgende verdier funnet:

Stabilitetsbestemmelsen kan gjentas på et hvilket som helst ønsket tidspunkt, verdiene angitt i tabell 1 er reproduserbare.

Eksempel 2

[Pulverrøntgendiagrammer]

For karakterisering av strukturegenskapene (krystallmodifikasjoner) til krystallinske DOTAP-klorider, måles pulverrøntgendiagrammer (diffraksjonsspektra) for disse stoffene.

Krystallinske DOTAP-klorider gir spektra med middels skarpe bånd som har forholdsvis god oppløsning for lipider. Spektraene indikerer høye krystallinnhold. Ingen amorfe fraksjoner er synlige under polariseringsmikroskopet.

Eksempler på spektra er vist i fig. 1 (type I), fig. 2 (type II), fig. 3 (type III) og fig. 4 (type IV).

For sammenligning er det vist et spektrum for den kommersielt tilgjengelige, amorfe prøve i fig. 5 (amorft).

Tabell 2 angir utvalgte 2-teta-verdier for de forskjellige krystallmodifikasjonene av racemiske og enantiomerisk rene DOTAP-klorider.

Eksempel 3

Hovedfaseovergangstemperaturer

Målinger av differensialscanningkaliometri (DSC) utføres på multi-lamellære-liposomer i vann. Liposomer fremstilles ved hjelp av tynnfilmmetoden fra de beregnede mengder av racemisk eller enantiomerisk rent DOTAP-klorid. Lipidkonsentrasjonen er her i hvert tilfelle 0,1 g/ml. Egnede mengder av disse dispersjonene innføres så i lukkbare smeltedigler av aluminium og måles ved å anvende et 204 Phoenix kalorimeter (Netzsch, Selb, Tyskland). I hvert tilfelle utføres det tre på hverandre følgende runder med oppvarming/avkjøling fra -50 °C til +20 °C ved 1<0>C/minutt.

For alle tre DOTAP-kloridvariantene finnes det faseovergangstemperaturer under 0 °C. For kjølesyklusene er denne i hvert tilfelle ved -23 °C til -24 °C. Forskjeller mellom racemisk og enantiomerisk rent DOTAP-klorid er i hvert tilfelle tydelig i varmesyklusene.

(2R)-DOTAP-klorid og (2S)-DOTAP oppviser begge en endoterm faseovergang rundt -12,5 °C, mens faseovergangen for racematet er ved -17,5 °C (se fig. 6).

Eksempel 4

Transfeksjonsegenskaper på COS-7-celler

Racemisk og enantiomerisk rent DOTAP-klorid samt racemisk DOTAP-metylsulfat dispergeres begge med den samme mengde kolesterol i transfeksjonsmediet og det behandles med ultralyd. Liposomene og GFP-plasmidoppløsningen blandes, og det inkuberes i 15 minutter, mengder pr. brønn: 2 ug plasmid/8 ug lipid.

Etter inkubasjon i 5 timer ved 37 °C/5 % C02fjernes supernatanten fra cellene ved hjelp av sug, 2 ml nytt medium tilsettes og blandingen inkuberes i ytterligere 20 timer. Etter opparbeidelse viser FACS-analyse effektiv transfeksjon av alle lipoplekser. Det fremgår tydelig en signifikant forskjell mellom transfeksjonsprosentene for de enkelte lipidblandinger:

Claims (5)

1. Enantiomerisk rent (2R)-l,2-dioleoyloksy-3-trimetylammoniumpropanklorid ((2R) -DOTAP klorid).

2. Anvendelse av enantiomerisk rent (2R)-DOTAP-klorid som bestanddel ved fremstillingen av legemidler.

3. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert vedat det inneholder enantiomerisk rent (2R)-DOTAP-klorid sammen med farmasøytisk aktive forbindelser, adjuvanser eller et løsemiddel.

4. Farmasøytisk sammensetning som inneholder enantiomerisk rent (2R)-DOTAP-klorid ifølge krav 3, hvor det som den farmasøytisk aktive forbindelsen er anvendt en aktiv forbindelse valgt fra gruppen av peptider, nukleotider, vaksiner og cytostatika.

5. Farmasøytisk sammensetning som inneholder enantiomerisk rent (2R)-DOTAP-klorid ifølge krav 3, hvor den omfatter liposomer, lipoplekser, nanopartikler eller mikroemulsjoner.