NO332136B1

NO332136B1 - Immunomodulerende heterosyklisk forbindelse, anvendelse derav for fremstilling av et medikament, og farmasoytisk eller veterinaermedisinsk preparat omfattende forbindelsen

Info

Publication number: NO332136B1
Application number: NO20054710A
Authority: NO
Inventors: Ian Richard Mathews
Original assignee: Medigene Ag
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2005-10-13
Publication date: 2012-07-02
Also published as: NO20054710L; EA200702435A1; SI1603917T1; EA009680B1; CA2519063A1; NO20054710D0; JP4892338B2; IL170389A; US7598247B2; ATE489388T1; DE602004030225D1; EP1603917A1; BRPI0408365B8; AU2004220310A1; US20070021428A1; DK1603917T3; PT1603917E; US8309552B2; BRPI0408365B1; ECSP056104A

Abstract

Forbindelser med formel (I) er inhibitorer for CD80 og anvendbare i immunomodulasjonsterapi: hvor Ri og R3 uavhengig av hverandre er H, F, Cl, Br, -NO2, -CN, C1-C6 alkyl eventuelt substituert med F eller Cl, eller C1-C6 alkoksy eventuelt substituert med F; R4 er en karboksylsyregruppe (-COOH) eller en ester derav, eller -C(=O)NR6R7, -NR7C(=O)R6, -NR7C(=O)OR6, -NHC(=O)NR7R6 eller -NHC(=S)NR7R6 hvor Re er H, eller et radikal med formel -(Alk)m-Q hvor m is 0 or 1, Alk er et eventuelt substituert, toverdig, rettkjedet eller forgrenet C1-C12 alkylen-, C2-C12 alkenylen-, C2-C12 alkynylenradikal eller et toverdig C3-C12 karbosyklisk radikal, hvor alle radikalene kan inneholde en eller flere -O-, -S- eller -N(R8)-linkere hvor R8 er H eller d-C4 alkyl, C3-C4 alkenyl, C3-C4 alkynyl eller C3-C6 sykloalkyl, og Q er H, -NRgRiohvor R9 og Rio uavhengig av hverandre er H, C1-C4 alkyl, C3-C4 alkenyl, C3-C4 alkynyl, C3-C6 sykloalkyl, en estergruppe, en eventuelt substituert karbosyklisk eller heterosyklisk gruppe, eller R9 og Rio danner en ring sammen med nitrogenet som de er

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører nye heterosykliske forbindelser, fremgangsmåter for deres fremstilling, preparater som inneholder dem, og fremgangsmåter og anvendelser for klinisk behandling av medisinske tilstander som kan dra nytte av immunomodulering, f. eks. autoimmunsykdom, reumatoid artritt, multippel sklerose, sukkersyke, astma, transplantasjon, systemisk lupus erytematosis og psoriasis. Nærmere bestemt vedrører den foreliggende oppfinnelse nye heterosykliske forbindelser som er CD80-antagonister som er i stand til å inhibere interaksjonene mellom CD80 og CD28, som er anvendbare for immunoinhibering.

Oppfinnelsens bakgrunn

Immunsystemet har evnen til å kontrollere homeostase mellom aktiveringen og inaktiveringen av lymfocytter gjennom forskjellige regulatormekanismer under og etter en immunrespons. Blant disse er mekanismer som spesifikt inhiberer og/eller slår av en immunrespons. Når et antigen presenteres ved hjelp av MHC-molekyler for T-cellereseptoren, blir således T-cellene korrekt aktivert bare i nærvær av samstimulerende tilleggssignaler. I fravær av disse hjelpesignalene er det ingen lymfocytt-aktivering og enten induseres en tilstand av funksjonell inaktivering kalt anergi eller toleranse, eller T-cellene fjernes spesifikt ved hjelp av apoptose.

Ett slikt samstimulerende signal involverer interaksjon av CD80 på spesialiserte antigen-presenterende celler med CD28 på T-celler, og dette signalet er blitt vist å være av avgjørende betydning for full T-celleaktivering. (Lenschow et al.

(1996) Annu. Rev. Immunol, 14, 233-258). Det ville derfor være ønskelig å tilveie-bringe forbindelser som inhiberer denne CD80/CD28-interaksjon.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Med den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en forbindelse kjennetegnet ved formel (I), eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt salt, hydrat eller solvat derav:

hvor

Ri og R3uavhengig av hverandre er H, F, Cl, Br, -N02, -CN, Ci-C6alkyl eventuelt substituert med F eller Cl, eller Ci- Ce alkoksy eventuelt substituert med F;

R4er en karboksylsyregruppe (-COOH) eller en fysiologisk hydrolyserbar ester derav, eller

-C(=0)NR6R7, hvor

R<$ er H, eller et radikal med formel -(Alk)m-Q, hvor m er 0 eller 1;

Alk er et toverdig rettkjedet eller forgrenet C1-C12alkylen-, C2-Ci2alkenylen- eller C2-Ci2alkynylenradikal, eller et toverdig C3-Ci2karbosyklisk radikal, hvor alle radikalene kan inneholde én eller flere

-O-, -S- eller -N(R8)-linkere hvor Rg er H eller CrC4alkyl, C3-C4alkenyl, C3-C4alkynyl eller C3-C6sykloalkyl; og hvilke som helst av de to verdige radikalene er eventuelt substituert med fluor, fluor-Ci-C4alkyl, fenyl-CrC4 alkyl, C2-C5alkenyl, fluorsubstituert C2-C5alkenyl, CrC4alkylfenyl-Ci-C4alkyl, Ci-C4alkylsulfonylfenyl Ci-C4alkyl, benzyloksy, fenylkarbonylmetyl, Ci-C4alkyl, Ci-C4alkoksykarbonyl, Ci-C4alkoksy-Ci-C4alkyl, C3-C6sykloalkyl-Ci-C4alkyl, morfolinyl, hydroksy, amino, cyano, dimetylamino; fenyl eventuelt substituert med substituent(er)

valgt fra gruppen bestående av fluor, klor, brom, trifluor-C1-C4alkyl, Ci-C4alkyl, Ci-C4alkoksy, metylendioksy, nitro, sulfamoyl, hydroksy og dimetylamino; C3-Ci2sykloalkyl eventuelt substituert med substituent(er) valgt fra hydroksy, amino og Ci-C4alkyl; pyridyl, imidazolyl, furyl, tetrahydrofuryl, tienyl, piperidyl eventuelt substituert med substituent(er) valgt fra fluor, Ci-C4alkoksykarbonyl og benzyl;

kinolyl eventuelt substituert med trifluor- Ci-C4alkyl, indolyl eventuelt substituert med Ci-C4alkyl eller Ci-C4alkoksy, pyrrolidinyl eventuelt substituert med Ci-C4alkyl, og

Q er H; -NR9Ri0hvor R9og Ri0uavhengig av hverandre er H, Ci-C4alkyl, C3-C4alkenyl, C3-C4alkynyl, C3-Césykloalkyl, Ci-C4alkoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl, fenyl, bifenyl, naftyl eller monosyklisk N-inneholdende fenylgruppe substituert med nitro; eller R9og Rio danner sammen med nitrogenet som de er bundet til en pyrrolidinring, en imidazolidinon-ring, en imidazolring, en piperidinring, en piperazin-ring, en morfolinring, en tiomorfolinring eller en azepanring, hvor ringen er usubstituert eller substituert med én til fire Ci-C6-alkylgrupper, Ci-C6alkyl substituert med ett til tre halogenatomer, CrC6-alkoksykarbonyl, benzyl eller en oksogruppe, og

R7er H eller Ci-C6alkyl, eller R6og R7danner sammen med atomet eller atomene som de er bundet til, en morfolinring, en piperidinring, en azepanring, en diazepanring, en dekahydrokinolinring, en dekahydroisokinolinring, hvor ringen er usubstituert eller substituert med én til fire CrC6alkylgrupper; og X er en binding eller -NH-.

Oppfinnelsen angår også et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk preparat kjennetegnet ved at det omfatter en forbindelse ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel eksipiens eller bærer.

Oppfinnelsen angir videre anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen ved fremstillingen av et medikament for behandling av tilstander som har nytte av immunomodulasjon.

Forbindelser (I) kan foreligge i form av tautomerer, slik som (I<1>) og (I<2>):

Heretter kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen representeres og henvises til i hvilken som helst tautomer form (I), og det skal forstås at hvilken som helst og alle tautomere formene med formel (I), særlig (I<1>) og (I<2>), er inkludert i oppfinnelsen.

Forbindelser med generell formel (I) er CD80-antagonister. De inhiberer interaksjonen mellom CD80 og CD28, og således aktiveringen av T-celler, hvorved de modulerer immunresponsen.

Oppfinnelsen omfatter følgelig også:

(i) en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt salt derav for anvendelse ved behandlingen av tilstander som drar nytte av immunomodulering, og særlig for immunoinhibering. (ii) anvendelsen av en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt salt derav ved fremstillingen av et medikament for behandling av tilstander som drar nytte av immunomodulering, og særlig for immunoinhibering. (iii) en forbindelse til anvendelse ved immunomodulering, og særlig immunoinhibering hos pattedyr, inkludert mennesker, hvor anvendelsen omfatter administrering til et pattedyr som trenger slik behandling av en immunomodulerende effektiv dose av en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk salt derav. (iv) et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk preparat som omfatter en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt salt derav sammen med en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel eksipiens eller bærer.

Tilstander som drar nytte av immunomodulering omfatter:

akutt disseminert encefalomyelitt

adrenal insuffisiens

allergisk angiitt og granulomatose

amylodose

ankyloserende spondylitt

astma

autoimmun-Addison's sykdom

autoimmunalopesi

autoimmun-kronisk aktiv hepatitt

autoimmun-hemolytisk anemi

autoimmun-neutrogena

autoimmun-trombocytopenisk purpura

Behcets sykdom

cerebellar degenerasjon

kronisk aktiv hepatitt

kronisk inflammatorisk demyelinerende polyradikulonevropati

kronisk nevropati med monoklonal gammopati

klassisk polyarteritis nodosa

kongenital adrenal hyperplasi kryopatier

dermatitis herpetiformis sukkersyke

Eaton-Lambert myastenisk syndrom encefalomyelitt

epidermolysis bullosa acquisita erytema nodosa

gluten-sensitiv enteropati Goodpastures syndrom Guillain-Barre-syndrom

Hashimotos tyroiditt hypertyroidisme idiopatisk hemakromatose idiopatisk membranøs glomerulonefritt isolert vaskulitt i sentralnervesystemet Kawasakis sykdom

nyresykdom med minimal endring forskjellige vaskulitider blandet bindevevssykdom multifokal motornevropati med konduksjonsblokkering multippel sklerose myastenia gravis opsoclonus-myoclonus-syndrom pemfigoid

pemfigus

pernisiøs anemi

polymyositt/dermatomyositt post-infektive artritider primær gallesklerose psoriasis

reaktiv artritides Reiters sykdom

retinopati

reumatoid artritt skleroserende kolangitt Sjogrens syndrom " Stiff-man"-sy ndrom subakutt tyroiditt

systemisk lupus erytematosis

systemisk nekrotiserende vaskulitides

systemisk sklerose (skleroderma)

Takayasus arteritt

temporal arteritt

thromboangiitis obliterans

type I og type II autoimmun-polyglandulært syndrom

ulcerøs kolitt

uveitt

Wegeners granulomatose

Slik det her er brukt henviser uttrykket "ester" til en gruppe med formen -COOR, hvor R er et radikal som teoretisk er avledet fra alkoholen ROH. Eksempler på estergrupper omfatter de fysiologisk hydrolyserbare estere, slik som metyl, etyl, n-og iso-propyl, n-, sek.- og tert.-butyl, og benzylesterne.

Slik det her er brukt henviser uttrykket "alkylen" til en rettkjedet eller forgrenet alkylkjede som har to utilfredsstilte valenser, for eksempel -CH2-, -CH2CH2-,

-CH2CH2CH2-, -CH(CH3)CH2-, -CH(CH2CH3)CH2CH2CH2- og -C(CH3)3.

Slik det her er brukt henviser uttrykket "alkenylen" til en rettkjedet eller forgrenet alkenylkjede som har to utilfredsstilte valenser, for eksempel -CH=CH-,

-CH2CH=CH-, -C(CH3)=CH- og -CH(CH2CH3)CH=CHCH2-.

Slik det her brukt henviser uttrykket "alkynylen" til en rettkjedet eller forgrenet alkynylkjede som har to utilfredsstilte valenser, for eksempel -C=C-, -CH2C=C- og

-CH(CH2CH3)C=CCH2-.

Med mindre annet er angitt i den sammenheng som det opptrer i, betyr uttrykket "substituert" slik det er brukt på hvilken som helst rest her, substituert med minst en substituent, valgt fra for eksempel (Ci-C6)alkyl, (Ci-C6)alkenyl, (C2-C6)alkynyl, fluorsubstituert (Ci-C6)alkyl, fluorsubstituert (Ci-C6)alkenyl, fluorsubstituert (C2-C^alkynyl, (Ci-C6>alkoksy og fluorsubstituert (Ci-C6)alkoksy (inkludert det spesielle tilfellet hvor en ring er substituert på tilgrensende ring-C-atomer med alkylendioksy, slik som metylendioksy eller etylendioksy), (Ci-C6)alkyltio, fenyl, benzyl, fenoksy, benzyloksy, hydroksy, merkapto, amino, fluor, klor, brom, cyano, nitro, okso, -COOH, -S02OH, -CONH2, -S02NH2, -CORA, -COOR<A>, -S02OR<A>, -NHCOR<A>, -NHS02R<A>, -CONHR<A>, -S02NHR<A>, -NHR<A>, -NR<A>R, -CONRAReller -S02NR<A>R, hvor RA og Ruavhengig av hverandre er en (Ci-C6)alkyl- eller (C2-C6)alkoksygruppe eller en monosyklisk, karbosyklisk eller heterosyklisk gruppe med 5-7Tingmedlemmer, eller RA og Rdanner en ring når de regnes sammen med nitrogenet som de er bundet til. I det tilfellet hvor "substituert" betyr substituert med fenyl, benzyl, fenoksy eller benzyloksy, kan fenylringen derav selv være substituert med hvilken som helst av de ovenfor nevnte, bortsett fra fenyl, benzyl, fenoksy eller benzyloksy.

Slik det her er brukt henviser uttrykket "aryl" til et mono-, bi- eller trisyklisk karbosyklisk aromatisk radikal, og til to slike radikaler kovalent bundet til hverandre. Illustrerende for slike radikaler er fenyl, bifenyl og naftyl.

Slik det her er brukt omfatter det uforbeholdne uttrykk "karbosyklyl" eller "karbosyklisk" aryl, sykloalkyl og sykloalkenyl, og henviser til et ringsystem (monosyklisk, bisyklisk, trisyklisk eller brudannet) hvis ringatomer alle er karbon.

Slik det her er brukt henviser det uforbeholdne uttrykk "sykloalkyl" til et karbosyklisk ringsystem som inneholder bare enkeltbindinger mellom ringkarbon-atomer.

Slik det her er brukt henviser det uforbeholdne uttrykk "sykloalkenyl" til et karbosyklisk ringsystem som inneholder minst én dobbeltbinding mellom to ring-karbonatomer.

Slik det her er brukt henviser uttrykket "heteroaryl" til et mono-, bi- eller trisyklisk aromatisk radikal som inneholder ett eller flere heteroatomer valgt fra S, N og O. Illustrerende for slike radikaler er tienyl, benztienyl, furyl, benzfuryl, pyrrolyl, imidazolyl, benzimidazolyl, tiazolyl, benztiazolyl, isotiazolyl, benzisotiazolyl, pyrazolyl, oksazolyl, benzoksazolyl, isoksazolyl, benzisoksazolyl, isotiazolyl, triazolyl, benztriazolyl, tiadiazolyl, oksadiazolyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl, indolyl og indazolyl.

Slik det her er brukt omfatter det uforbeholdne uttrykk "heterosyklyl" eller "heterosyklisk" "heteroaryl" som definert ovenfor, og særlig betyr det et mono-, bi-eller trisyklisk eller brudannet ikke-aromatisk radikal som inneholder ett eller flere heteroatomer valgt fra S, N og O, og grupper som består av et monosyklisk, ikke-aromatisk radikal som inneholder ett eller flere slike heteroatomer som er forbundet kovalent med et annet slikt radikal eller med et monosyklisk karbosyklisk radikal. Illustrerende for slike radikaler er pyrrolyl-, furanyl-, tetrahydrofuranyl-, tienyl-, piperidinyl-, imidazolyl-, oksazolyl-, isoksazolyl-, tiazolyl-, tiadiazolyl-, pyrazolyl-, pyridinyl-, pyrrolidinyl-, pyrimidinyl-, morfolinyl-, piperazinyl-, indolyl-, morfolinyl-, benzfuranyl-, pyranyl-, tetrahydropyranyl-, kinuklidinyl-, isoksazolyl-, benzimidazolyl-, metylendioksyfenyl-, etylendioksyfenyl-, maleimid- og suksinimidgrupper.

Noen forbindelser ifølge oppfinnelsen inneholder ett eller flere kirale senter på grunn av tilstedeværelsen av asymmetriske karbonatomer. Tilstedeværelsen av asymmetriske karbonatomer gir opphav til stereoisomerer eller diastereoisomerer med R- eller S-stereokjemi i hvert kiralt sentrum. Oppfinnelsen omfatter alle slike stereoisomerer og diastereoisomerer, og blandinger derav.

Salter av saltdannende forbindelser ifølge oppfinnelsen omfatter fysiologisk akseptable syreaddisjonssalter og basesalter. Egnede syreaddisjonssalter dannes fra syrer som danner ikke-toksiske salter. Eksempler omfatter acetat-, aspartat-, benzoat-, besylat-, bikarbonat-/karbonat-, bisulfat-/sulfat-, borat-, kamsylat-, sitrat-, edisylat-, esylat-, formiat-, fumarat-, glukeptat-, glukonat-, glukuronat-, heksafluorfosfat-, hibenzat-, hydroklorid-/klorid-, hydrobromid-/bromid-, hydrojodid-/jodid-, isetionat-, laktat-, malat-, maleat-, malonat-, mesylat-, metylsulfat-, naftylat-, 2-napsylat-, nikotinat-, nitrat-, orotat-, oksalat-, palmitat-, pamoat-, fosfat-/hydrogenfosfat-/dihydrogenfosfat-, sakkarat-, stearat-, suksinat-, tartrat-, tosylat- og trifluoracetat-salter. Egnede basesalter dannes fra baser som danner ikke-toksiske salter. Eksempler omfatter aluminium-, arginin-, benzatin-, kalsium-, kolin-, dietylamin-, diolamin-, glysin-, lysin-, magnesium-, meglumin-, olamin-, kalium-, natrium-, trometamin- og sinksaltene.

Fremgangsmåter

Forbindelser ifølge oppfinnelsen hvor R4 er en amidgruppe -C(=0)NR6R7 kan fremstilles ved omsetning av det passende amin HNRéRy med en forbindelse med formel (II) for å amidere karboksylsyregruppen:

hvor symbolene Ri, R3, X, Rg og R7er som definert i forhold til formel (I) ovenfor.

Forbindelser (II) (dvs. forbindelser (I) ifølge oppfinnelsen hvor R4er en karboksylsyregruppe) kan fremstilles ved omsetning av en forbindelse med formel (III) med et hydrazin med formel (IV):

Denne reaksjonen kan resultere i fremstillingen av en blanding av stillingsisomerene (IIA) og (IIB):

hvorfra den ønskede isomer (IIA) kan fraskilles.

Forbindelser (I) hvor R4er en ester- eller amidgruppe kan også fremstilles fra mellomprodukt (III) ved omsetning med det passende hydrazin (IVA)

hvor R4er en ester- eller amidgruppe. Igjen kan reaksjonen resultere i en blanding av ester- eller amidanalogene til karboksylsyrene (IIA) og (IIB), hvorfra den ønskede ester- eller amidisomer (I) kan fraskilles. Alternativt kan karboksylsyreforbindelsen (II) ganske enkelt forestres eller amideres. Forbindelser (I) hvor R4er en "reversamid"-gruppe -NRyC^CORg kan fremstilles ved hjelp av Curtius-omordning (se Ninomiya, K.; Shioiri, T.; Yamada, S. Tetrahedron (1974), 30(14), 2151-7) av karboksylsyren (II) til isocyanatet (V)

etterfulgt av hydrolyse av isocyanatgruppen til en aminogruppe og acylering av aminogruppen med for eksempel syrekloridet C1-C(=0)R6.1 tilfeller hvor R7ikke er

hydrogen kan R7-substituenten innføres etter isocyanatreduksjonstrinnet eller etter acyleringstrinnet.

Ved en alternativ reaksjonsvei til "reversamid"- forbindelsene (R4=

-NR7C(=0)R6) ifølge oppfinnelsen kan en forbindelse med formel (V) hvor isocyanatresten er erstattet med en nitrogruppe reduseres til det tilsvarende amin, som så kan acyleres slik at det ønskede reversamid dannes. Forbindelser (I) hvor R4 er en ureagruppe -NHC(=0)NHR6 eller tioureagruppe -NHC(=S)NHR6 kan også fremstilles fra isocyanatet (V) eller det tilsvarende isotiocyanat ved omsetning med det passende amin H2NR6.

Forbindelser (I) hvor R4 er en karbamatgruppe -NR7C(=0)OR6 kan fremstilles ved omsetning av isocyanatet med et passende alkohol ReOH.

Ytterligere detaljer vedrørende syntesemetodene for fremstillingen av forbindelser (I) ifølge oppfinnelsen og slike mellomprodukter som (III), kan finnes i eksemplene her.

I forbindelsene ifølge oppfinnelsen:

Radikalet R4X- er fortrinnsvis i 4-stillingen i fenylringen.

X kan for eksempel være en binding eller et -CH2- eller -CH2CH2-radikal. En binding er for tiden foretrukket.

R3 kan for eksempel være H, F, Cl, metyl, metoksy eller metylendioksy. For tiden er det foretrukket at R3 er H.

Ri kan for eksempel være H, F, Cl, metyl, metoksy eller metylendioksy. For tiden er det foretrukket at Rt er hydrogen eller fluor, særlig i 6-stillingen i 3-okso-l,3-dihydro-2H-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl-ringsystemet.

R4 er en karboksylsyregruppe (-COOH) eller en ester derav, eller -C(=0)NR6R7, -NR7C(=0)R6, -NR7C(=0)OR6 eller -NHC(=0)NHR6, alle som definert ovenfor.

Når R4 er en ester gruppe, omfatter eksempler de med formel -COOR hvor R er metyl, etyl, n- eller isopropyl, n-, sek.- eller tert.-butyl, eller benzylester.

R6 er, når den er til stede, H eller et radikal med formel -(Alk)m-Q hvor m, Alk og Q er som definert ovenfor. Når m er 1, kan Alk være for eksempel et rettkjedet eller forgrenet Ci-Céalkylenradikal, slik som -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- og -CH2CH(CH3)CH2-. Alk kan også være for eksempel et toverdig syklopropylen-, syklopentylen- eller sykloheksylenradikal. Radikalet Alk kan eventuelt være substituert med for eksempel OH, okso, CF3, metoksy eller etoksy. Radikalet Alk kan eventuelt inneholde et heteroatom, for eksempel i form av et eter-, tioeter- eller aminobindeledd.

Gruppen Q kan for eksempel være hydrogen; -NR9Ri0hvor R9og Ri0kan være like eller forskjellige og er valgt fra hydrogen, metyl, etyl, n- eller isopropyl eller tert.-butyl; en estergruppe, for eksempel en metyl-, etyl- eller benzylester;

eller en eventuelt substituert aryl-, aryloksy-, sykloalkyl-, sykloalkenyl- eller heterosyklisk gruppe, for eksempel

fenyl-, fenoksy-, syklopentyl-, sykloheksyl-, furyl-, tienyl-, kinuklidinyl-, piperidyl- eller piperazinylgruppe.

R7 er, når den er til stede, H eller Ci-C6 alkyl, for eksempel metyl, etyl, n- eller iso-propyl, n-, sek.- eller tert.-butyl; eller når de regnes sammen med atomet eller atomene som de er bundet til, danner R$ og R7 en monosyklisk heterosyklisk ring med 5, 6 eller 7 ringatomer.

Spesielt foretrukket er tilfellene hvor R4 er -C(=0)NR6R7 eller -NHC(=0)NR7R6, hvor R7 er hydrogen og R6 er et radikal med formel -(Alk)m-Q, hvor m er 1 og det toverdige radikal Alk inneholder 3 eller 4 karbonatomer og er usubstituert, og Q er -NR9Ri0hvor R9og Ri0uavhengig av hverandre er H; C1-C4 alkyl; C3-C4 alkenyl; C3-C4 alkynyl; C3-C6 sykloalkyl; en estergruppe; en eventuelt substituert karbosyklisk eller heterosyklisk gruppe; eller danner en ring når de regnes sammen med nitrogenet som de er bundet til, hvor ringen eventuelt er substituert.

Et bestemt foretrukket undersett av forbindelser ifølge oppfinnelsen har formel

(IC):

hvor X og R4er som angitt ovenfor. I dette undersettet kan radikalet R4X- være i 4-stillingen i fenylringen. Dette undersettet omfatter særlig forbindelser hvor X er en binding og R4er -C(=0)NR<$R7, hvor R<$og R7er som angitt ovenfor. I slike forbindelser kan R<$ for eksempel være kinuklidinyl og R7hydrogen.

Bestemte forbindelser ifølge oppfinnelsen omfatter de ifølge eksemplene her.

En foretrukket forbindelse ifølge oppfinnelsen er 4-(6-fluor-3-okso-l,3-dihydro-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)-N-(2,2-difluor-etyl)-benzamid, med formel (A)

eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt salt, hydrat eller solvat derav.

En annen foretrukket forbindelse ifølge oppfinnelsen erN-[3-(tert.-butyl-metyl-amino)-butyl]-4-(6-fluor-3-okso-l,3-dihydro-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)-benzamid, med formel ( BY.

Som nevnt ovenfor, omfatter oppfinnelsen farmasøytisk eller veterinærmedisinsk preparat som omfatter en forbindelse ifølge formel (I) eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt salt derav sammen med en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel eksipiens eller bærer. I slike preparater vil det forstås at det bestemte dosenivået for enhver bestemt pasient vil avhenge av mange forskjellige faktorer, inkludert aktiviteten til den bestemte forbindelse som anvendes, alderen, kroppsvekten, den generelle helsetilstand, kjønnet, kosten, administreringstiden, administreringsveien, uskillingshastigheten, legemiddelkombinasjonen og årsaken til og alvorligheten av den bestemte sykdom som gjennomgår behandling. Optimale dosenivåer og doseringshyppighet vil bli bestemt ved hjelp av kliniske forsøk.

Forbindelsene som oppfinnelsen vedrører, kan fremstilles for administrering ved hjelp av hvilken som helst vei som er i overensstemmelse med deres farmako-kinetiske egenskaper. De oralt administrerbare preparater kan være i form av tabletter, kapsler, pulvere, granuler, sugetabletter, væske- eller gelpreparater slik som orale, topiske eller sterile, parenterale oppløsninger eller suspensjoner. Tabletter og kapsler for oral administrering kan være i enhetsdosepresentasjonsform, og kan inneholde vanlige eksipienser, slik som bindemidler, for eksempel sirup, akasie, gelatin, sorbitol, tragant eller polyvinylpyrrolidon; fyllstoffer for eksempel laktose, sukker, mais-stivelse, kalsiumfosfat, sorbitol eller glysin; tabletteringssmøremiddel, for eksempel magnesiumstearat, talkum, polyetylenglykol eller silika; desintegrasjonsmidler, for eksempel potetstivelse; eller akseptable fuktemidler, slik som natriumlaurylsulfat. Tablettene kan være belagte i henhold til metoder som er godt kjent innen normal farmasøytisk praksis. Orale flytende preparater kan være i form av for eksempel vann-eller oljesuspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, siruper eller eliksirer, eller kan presenteres som et tørt produkt for rekondisjonering med vann eller annen egnet bærer før bruk. Slike flytende preparater kan inneholde vanlige additiver, slik som oppslemningsmidler, for eksempel sorbitol, sirup, metylcellulose, glukosesirup, gelatin, hydrogenerte spiselige fettstoffer; emulgeringsmidler, for eksempel lecitin, sorbitanmonooleat, eller akasie; ikke-vandige bærere (som kan inkludere spiselige oljer), for eksempel mandelolje, fraksjonert kokosnøttolje, slike oljeestere som glyserol, propylenglykol eller etylalkohol; konserveringsmidler, for eksempel metyl-or propyl-p-hydroksybenzoat eller sorbinsyre, og om ønsket vanlige smaks- eller fargemidler.

For topisk applikasjon til huden kan legemidlet utformes i en krem, lotion eller salve. Krem- eller salveformuleringer som kan anvendes til legemidlet, er vanlig formuleringer som er godt kjent på fagområdet, for eksempel som beskrevet i slike standardhåndbøker over farmasøytika som "The British Pharmacopoeia".

For topisk applikasjon til øyet kan legemidlet utformes i en oppløsning eller suspensjon i en egnet, steril vandig eller ikke-vandig bærer. Additiver, for eksempel slike bufferstoffer som natriummetabisulfitt eller dinatriumedeat; konserveringsmidler inkludert baktericide og fungicide midler, slik som fenylkvikksølvacetat eller -nitrat, benzalkoniumklorid eller klorheksidin, og slike fortykningsmidler som hypromellose, kan også være inkludert.

Den aktive bestanddel kan også administreres parenteralt i et sterilt medium. Avhengig av bæreren og konsentrasjonen som anvendes, kan legemidlet enten være oppslemmet eller oppløst i bæreren. På fordelaktig måte kan slike adjuvanser som et lokalanestetikum, konserveringsmiddel og buffermidler være oppløst i bæreren.

Utførelsesformer av oppfinnelsen er beskrevet i de følgende ikke-begrensende eksempler:

De følgende forkortelser anvendes i forsøksbeskrivelsene:

Eksempel 1

Trinn 1: Fremstilling av (fenylhydrazono)malonsyre:

Natriummesoksalatmonohydrat (5,00 g, 27,8 mmol) ble oppløst i 1 M saltsyre (50 ml), hvorved man fikk en fargeløs, uklar oppløsning. Fenylhydrazin (3,00 g, 2,72 ml, 27,8 mmol) ble tilsatt dråpevis ved romtemperatur til den omrørte blanding. En gul utfelling som ble dannet, ble samlet opp ved filtrering etter 90 minutter og vasket med vann (50 ml). Filterkaken ble triturert med etylacetat / heksan [1:1], filtrert og tørket under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et gult pulver (4,74 g, 22,7 mmol, 82 %). LCMS: m/z 207 [M-H]<+>.

Alternativt kan produktet ekstraheres fra vannfasen med etylacetat (2 x 250 ml), den organiske fasen tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og oppløsningsmidlet fjernes under vakuum.

Trinn 2: Fremstilling av (fenylhydrazono)malonoyldiklorid:

(Fenylhydrazonomalonsyre) (1,00 g, 4,80 mmol) ble blandet under inert atmosfære med tørr kloroform (15 ml), hvorved man fikk en gul suspensjon. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur og fosforpentaklorid (2,19 g, 10,5 mmol) ble tilsatt porsjonsvis. Reaksjonsblandingen ble varmet opp til refluks i 1,5 time, hvorved man fikk en grønn oppløsning. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og fortynnet med heksan (15 ml). En grønn utfelling som ble dannet, ble samlet opp ved filtrering og tørket under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et grønt pulver (645 mg, 2,63 mmol, 53 %).

Trinn 3: Fremstilling av metyl-4-hydroksycinnolin-3-karboksylat

(Fenylhydrazono)malonoyldiklorid (2,45 g, 0,01 mmol) ble blandet under inert atmosfære med 1,2-dikloretan (15 ml), hvorved man fikk en gul suspensjon. Titanium-tetraklorid (1,89 g, 1,09 ml) ble tilsatt dråpevis for å danne en brun oppløsning. Blandingen ble varmet opp til refluks over natten, avkjølt til romtemperatur og reaksjonen stanset ved dråpevis tilsetning av metanol (15 ml). Omrøring ble fortsatt i 30 minutter og flyktige stoffer ble fjernet under vakuum. Vann (100 ml) ble tilsatt og den erholdte suspensjon ble ekstrahert med «-butanol (2 x 50 ml). De kombinert organiske faser ble vasket med vann (2 x 20 ml) og konsentrert under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et grønt fast stoff (1,04 g, 5,10 mmol, 51 %). LCMS: m/z 205 [M+H]<+>.

Trinn 4: Fremstilling av metyl-4-klorcinnolin-3-karboksylat:

Tionylklorid (8,15 g, 5 ml) ble tilsatt dråpevis under inert atmosfære til metyl-4-hydroksycinnolin-3-karboksylat (0,50 g, 2,45 mmol). Blandingen ble varmet opp til refluks i 1,5 timer, avkjølt til romtemperatur og overskudd av tionylklorid ble fjernet under vakuum. Toluen (5 ml) ble tilsatt til resten. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten. De faste stoffene ble samlet opp ved filtrering og tørket under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et brunt fast stoff (248 mg, 1,11 mmol, 45 %). LCMS: m/z 223 [M+H]<+>.

Trinn 5: Fremstilling av 4-(3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzosyre:

4-hydrazinobenzosyre (68,4 mg, 0,45 mmol) ble blandet ved romtemperatur med etanol (5 ml), hvorved man fikk en kremfarget suspensjon. Metyl-4-klorcinnolin-3-karboksylat (100 mg, 0,45 mmol) ble tilsatt og blandingen ble varmet opp til 45-50°C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og oppløsnings-midlet ble fjernet under vakuum. Etylacetat (10 ml) ble tilsatt til resten. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. De faste stoffene ble samlet opp ved filtrering og tørket under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et brunt pulver (120 mg, 0,39 mmol, 86 %). LCMS: m/z 307 [M+H]<+>. NMR [DMSO-dé]: 8 = 7,69-7,77 (m, 1 H^); 7,81-7,90 (m, 2 ); 8,05 (d, J = 8,85, 2 ); 8,20 (d, J = 7,92 Hz, 1 Haiyl); 8,33 (d, J = 8,85 Hz, 2 Hajyi); 14,64 (s, NH),

Alternativt kan reaksjonen utføres ved romtemperatur. I dette tilfellet kan det være nødvendig med en lengre reaksjonstid på 2-3 timer.

Eksempel 2

Fremstilling av A^-[(dimetylamino)propyl]-4-(3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzamid:

4-(3-okso-l,3-dihydro-2/f-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzosyre (25 mg, 0,08 mmol) ble blandet med DMF (1 ml). Diisopropyletylamin (21 mg, 28 ul, 0,16 mmol) og 3-dimetylaminopropylamin (8,2 mg, 10,0 ul, 0,09 mmol) ble tilsatt, etterfulgt av HBTU (30,3 mg, 0,08 mmol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Produktet ble renset ved hjelp av preparativ HPLC. Tittelforbindelsen ble isolert som et rødt fast stoff (12,6 mg, 0,032 mmol, 40 %). LCMS: m/z 391 [M+H]<+>.

Eksempel 3

Fremstilling av 7V-benzyl-4-(3-okso-l ,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzamid:

4-(3-okso-l,3-dihydro-2/f-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzosyre (52 mg, 0,17 mmol) ble blandet med DMF (2 ml). Diisopropyletylamin (22 mg, 29 ul, 0,17 mmol) og benzylamin (18,2 mg, 18,6 ul, 0,17 mmol) ble tilsatt, etterfulgt av HBTU (64,5 mg,

0,17 mmol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer. Produktet ble renset ved hjelp av preparativ HPLC. Tittelforbindelsen ble isolert som et rødt fast stoff (6,6 mg, 0,02 mmol, 10 %). LCMS: m/z 396 [M+H]<+>.

Eksempel 4

Trinn 1: Fremstilling av 4-(3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)-benzoylklorid:

Tionylklorid (90 ml) ble tilsatt til 4-(3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo-[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzosyre (2,36 g, 7,70 mmol). Blandingen ble varmet opp til refluks i 2 timer under nitrogenatmosfære. Det ble erholdt en mørkerød oppløsning som ble avkjølt til romtemperatur og overskudd av tionylklorid ble fjernet under vakuum. Toluen (30 ml) ble tilsatt til restene og blandingen ble omrørt ved romtemperatur under nitrogenatmosfære inntil utfelling var fullstendig. De faste stoffene ble samlet opp ved filtrering og vasket med toluen (2 x 30 ml). Tittelforbindelsen ble isolert som et rødt fast stoff (2,20 g, 6,77 mmol, 88 %) LCMS: m/z 321 [M+H]<+>(metylester som resulterte fra prøveopparbeidelse i metanol).

Trinn 2: Fremstilling av A^-[(sykloheksylamino)propyl]-4-(3-okso-l,3-dihydro-2//- pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzamid:

4-(3-okso-l,3-dihydro-2/f-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzoylklorid (97 mg, 0,30 mmol) ble oppløst i vannfritt DMA (2 ml). Diisopropyletylamin (39 mg, 53 ul, 0,60 mmol) ble tilsatt etterfulgt av /V-sykloheksyl-l,3-propandiamin (52 mg, 0,60 mmol). Blandingen ble omrørt i 30 minutter. Vann (5 ml) ble tilsatt, hvorved man fikk en mørkerød suspensjon. Blandingen ble ekstrahert med «-butanol (2 x 20 ml). De kombinerte organiske faser ble vasket med vann og konsentrert under vakuum inntil utfelling ble observert. Heksan (20 ml) og etylacetat (10 ml) ble tilsatt, de faste stoffer ble samlet opp ved filtrering og tørket under vakuum. Produktet ble isolert som et mørkerødt pulver (82 mg, 0,18 mmol, 62 %). LCMS: m/z 445 [M+H]<+>.

Eksempel 5:

Trinn 1: Fremstilling av [(2-fluorfenyl)hydrazono]malonsyre:

Natriummesoksalatmonohydrat (2,21 g, 12,3 mmol) ble oppløst i 1 M saltsyre (50 ml), hvorved man fikk en fargeløs uklar oppløsning. 2-fluorfenylhydrazinhydro-klorid (2,00 g, 12,3 mmol) ble tilsatt porsjonsvis ved romtemperatur til den omrørte blanding. Det ble dannet en gul utfelling, blandingen ble fortynnet med vann (50 ml) og omrøring fortsatte over natten. Etylacetat (150 ml) ble tilsatt, fasene ble blandet grundig inntil de faste stoffene hadde oppløstes. Fasene ble separert og vannfasen ble vasket med etylacetat (50 ml). De kombinerte organiske faser ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og oppløsningsmidlet fjernet under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et gult pulver (2,55 g, 11,7 mmol, 92 %). LCMS: m/z 227 [M-H]<+>.

Trinn 2: Fremstilling av [(2-fluorfenyl)hydrazono]malonoyldiklorid:

(2-fluorfenylhydrazono)malonsyre (1,33 g, 5,88 mmol) ble blandet under inert atmosfære med tørr kloroform (20 ml), hvorved man fikk en gul suspensjon. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur og fosforpentaklorid (2,69 g, 12,9 mmol) ble tilsatt porsjonsvis. Reaksjonsblandingen ble varmet opp til refluks i 2 timer,

hvorved man fikk en mørkegul oppløsning. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og konsentrert under vakuum inntil utfelling inntraff. De faste stoffene ble samlet opp ved filtrering, vasket med heksan (30 ml) og tørket under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et gult pulver (760 mg, 2,89 mmol, 49 %).

Trinn 3: Fremstilling av metyl-8-fluor-4-hydroksycinnolin-3-karboksylat:

(2-fluorfenylhydrazono)malonoyldiklorid (19,4 g, 74 mmol) ble blandet under inert atmosfære med 1,2-diklorethan (100 ml), hvorved man fikk en gul suspensjon. Titantetraklorid (13,9 g, 8,08 ml, 74 mmol) ble tilsatt dråpevis, hvorved det ble dannet en brun oppløsning. Blandingen ble varmet opp til refluks over natten. Ytterligere titantetraklorid (13,9 g, 8,08 ml, 74 mmol) ble tilsatt og oppvarming fortsatte i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0-5 °C og reaksjonen stanset med dråpevis tilsetning av metanol (50 ml). Omrøring ble fortsatt i 1 time ved romtemperatur og flyktige stoffer ble fjernet under vakuum. Vann (300 ml) ble tilsatt og den erholdte suspensjon ble ekstrahert med etylacetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske faser ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum. Det ble erholdt et gult fast stoff (12 g råprodukt). LCMS: m/z 223 [M+H]<+>.

Trinn 4: Fremstilling av 4-(6-fluor-3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzosyre:

Urenset 8-fluor-4-hydroksycinnolin-3-karboksylat fra det forutgående trinn (1,00 g, 4,95 mmol) ble oppløst i tionylklorid (50 ml). Oppløsningen ble varmet opp til refluks i 2-3 timer inntil det ikke ble observert noen ytterligere gassutvikling. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og overskudd av tionylklorid ble fjernet under vakuum. Det urensede mellomprodukt ble azeotropdestillert med toluen (3x25 ml). Det ble erholdt et mørkebrunt fast stoff som ble tatt opp i etanol (25 ml). 4-hydrazinobenzosyre (640 mg, 4,21 mmol) ble tilsatt og blandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten. De faste stoffene ble samlet opp ved filtrering, oppslemmet i 1 M HC1 (100 ml), filtrert, vasket med heksan (50 ml) og tørket under vakuum. Det ble erholdt et brunt fast stoff (890 mg råprodukt). LCMS: m/z [M+H]<+>325.

Eksempel 6

Trinn 1: Fremstilling av 4-(6-fluor-3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-y l)benzosyreklorid:

Urenset 4-(6-fluor-3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)-benzosyre (1,45 g) fra det forutgående trinn ble oppløst i tionylklorid (50 ml). Blandingen ble varmet opp til 70 °C i 2-3 timer inntil det ikke ble observert noen ytterligere gassutvikling. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og overskudd av tionylklorid ble fjernet under vakuum. Restene ble azeotropdestillert med toluen (2 x 20 ml), hvorved man fikk et fast stoff. Det faste stoffet ble samlet opp ved filtrering, vasket med toluen og tørket under vakuum. Produktet ble isolert som et gult pulver (670 mg, 1,95 mmol). LCMS: m/z [M+H]+ 339 (metylester som resulterer fra prøveopparbeidelse i metanol).

Trinn 2: Fremstilling av 4-(6-fluor-3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-y i)-/V-(pyrrolidin-1 -yl-butyl)benzamid:

4-(6-fluor-3-okso-l,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzoylklorid (100 mg, 0,29 mmol) ble oppløst i vannfritt DMA (2 ml). Diisopropyletylamin (75 mg, 101 ul, 0,58 mmol) ble tilsatt, etterfulgt av l-(4-aminobutyl)pyrrolidin (41 mg). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten. Vann (5 ml) og n-butanol (5 ml) ble tilsatt. Fasene ble separert. Den organiske fasen ble vasket med vann (2x5 ml). De flyktige stoffene ble fjernet under vakuum. Produktet ble isolert som et brunt pulver (50 mg, 0,11 mmol, 37 %). LCMS: m/z [M+H]<+>463.

Eksempel 7

Fremstilling av 4-(6-fluor-3-okso-l ,3-dihydro-2//-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)-A^-(l,2,2,6,6-pentametylpiperidin-4-yl)benzamid:

4-(6-fluor-3-okso-l,3-dihydro-2/f-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzoylklorid (100 mg, 0,29 mmol) ble oppløst i vannfritt DMA (2 ml). Diisopropyletylamin (75 mg, 101 ul, 0,58 mmol) ble tilsatt etterfulgt av 4-amino-l,2,2,6,6-pentametylpiperidin (49 mg, 0,29 mmol). Blandingen ble omrørt over natten. Vann (5 ml) og n-butanol (5 ml) ble tilsatt. Fasene ble separert. Den organiske fasen ble vasket med vann (2x5 ml) og oppløsningen ble konsentrert under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et mørkerødt fast stoff (50 mg, 0,105 mmol, 36 %). LCMS: m/z [M+H]<+>477.

Eksempel 8

Trinn 1: Fremstilling av 2-(4-nitrofenyl)-l,2-dihydro-3//-pyrazolo [4,3- c] cinnolin-3-on

Tionylklorid (326 g, 200 ml) ble tilsatt dråpevis under inert atmosfære til metyl-4-hydroksycinnolin-3-karboksylat (10,0 g, 49 mmol). Blandingen ble varmet opp til refluks i 2,5 timer, avkjølt til romtemperatur og overskudd av tionylklorid ble fjernet under vakuum. Toluen (100 ml) ble tilsatt til resten og fjernet under vakuum. Denne fremgangsmåten ble gjentatt med ytterligere toluen (100 ml). Et brunt halvfast materiale ble erholdt og tatt opp i etanol (200 ml). 4-nitrofenylhydrazin (5,99 g, 39,2 mmol) ble tilsatt porsjonsvis. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten. Blandingen ble varmet opp til 40-45 ° C i 1 time og avkjølt til romtemperatur. De faste stoffene ble samlet opp ved filtrering, triturert med etanol (100 ml) og tørket under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et brunt fast stoff (8,42 g, 27,4 mmol,

70 %). LCMS: m/z 308 [M+H]<+>.

Trinn 2: Fremstilling av 2-(4-aminofenyl)-l,2-dihydro-3//-pyrazolo [4,3- c] cinnolin-3-on

2-(4-nitrofenyl)-l,2-dihydro-3//-pyrazolo [4,3- c] cinnolin-3-on (11,4 g, 37,2 mmol) ble oppslemmet i en blanding av etanol (100 ml) og vann (100 ml). Jernpulver (11,1 g, 200 mmol) og ammoniumklorid (5,34 g, 100 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble varmet opp til 80 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og gjort basisk med kaliumkarbonat til pH 9-10. De faste stoffene ble fjernet ved filtrering gjennom en pute av kiselgur. Filtratet ble ekstrahert med «-butanol (2 x 200 ml). De kombinerte organiske faser ble konsentrert under vakuum, hvorved man fikk et mørkerødt fast stoff. Det faste stoffet ble triturert med metanol (100 ml), filtrert og tørket under vakuum. Tittelforbindelsen ble isolert som et mørkerødt pulver (5,58 g, 20,1 mmol, 57 %). LCMS: m/z 278 [M+H]<+>. Trinn 3: Fremstilling av A^-[3-(dimetylamino)propyl]-A''-[4-(3-okso-l,3-dihydro-2//- pyrazolo- [4,3-c]cinnolin-2-yl) fenyl]urea

2-(4-aminofenyl)-l,2-dihydro-3//-pyrazolo [4,3- c] cinnolin-3-on (44 mg, 0,16 mmol) ble oppslemmet i toluen under nitrogenatmosfære (0,5 ml) ved 0-5 °C. DMA (0,5 ml) ble tilsatt etterfulgt av N,N'-karbonyldiimidazol (26 mg, 0,16 mmol). Blandingen ble omrørt i 1 time ved 0-5 °C før den ble blandet med en oppløsning av 3-dimetylaminopropylamin (18 mg, 0,18 mmol) i toluen (0,5 ml). Omrøring ble fortsatt i 1 time og produktet ble renset ved hjelp av preparativ HPLC. Tittelforbindelsen ble isolert som et mørkerødt pulver (2,6 mg, 6 umol, 4 %). LCMS: m/z 406 [M+H]<+>.

Eksempel 9: Fremstilling av 4-(3-okso-l,3-dihydro-2/f-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)benzosyreetylester.

Tittelforbindelsen ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge eksempel 1, trinn 5, idet den opprinnelige syre ble byttet ut med 4-hydrazinobenzosyreetylester. MS: MH+ = 335,2

Resultater

Anvendelsen av BIAcore biomolekylær interaksjonsanalyse

Biotinylert human-CD80 (hCD80-BT) er en rekombinant oppløselig form av et membranbundet reseptormolekyl (CD80) som binder seg til CD28 slik at T-celleaktivering initieres. Interaksjonen mellom CD80 og CD28 er blitt grundig undersøkt (Collins et al, 2002). Biotinylert human-HLA-A2-tax er den rekombinante oppløselige form av et membranbundet reseptormolekyl som er blitt brukt i dette eksempel som et kontrollprotein, og forventes ikke å reagere med forbindelsene.

BIAcore S51-systemet ble brukt til screening av forbindelsene ifølge eksemplene 1-4 ovenfor. En sensorbrikke CM5 fra serie S ble koblet sammen med BIAcore S51. Streptavidin ble koblet til karboksymetyloverflaten ved å anvende standard aminsammenkobling. Brikkeoverflaten ble aktivert med 0,2 M EDC / 0,05 M NHS, etterfulgt av binding av streptavidin (0,25 mg/ml i 10 mM natriumacetat pH 5,0) og metning av ukopierte seter med 1 M etylendiamin.

BIAcore S51-sensorbrikken har to separate sensorflekker for immobilisering av proteiner. hCD80-BT ble immobilisert på den streptavidin-belagte overflate til ett sensorpunkt inntil det ble observert en respons på omtrent 3000 RU. Et protein for å kontrollere med hensyn på ikke-spesifikk binding av forbindelsen ble immobilisert på et andre sensorpunkt. Kontrollproteinet som ble bukt til disse forsøkene var en biotinylert, oppløselig form av human-HLA-proteinet.

Fortynningsserier av forbindelser (1000 nM - 0,05 nM) ble fremstilt i kjørebuffer (10 mM, pH 7,4,150 mM NaCl, 0,005 % P20; 5 % DMSO).

BIAcore S51 ble kjørt ved en strømningshastighet på 30 ul/min under anvendelse av kjørebuffer. Forbindelser og DMSO-standardoppløsninger for korreksjon av data for oppløsningsmiddeleffekter ble injisert. Data ble målt automatisk og ble analysert ved å anvende S51-evalueringsprogramvare.

Interaksjonen mellom CD80 og den endogene proteinligand (CD28) er svært spesifikk, men forholdsvis svak med en KD-verdi på 4750 nM, og en "off-rate" på mer enn 0,2 s"<1>. Forbindelsene ifølge eksemplene 2,3,4,6 og 7 har større affinitet og lengre oppholdstider på CD80 enn CD28, idet de har KD-er som er lavere enn 100 nM og "off-rates" på 2xl0"<2>, noe som indikerer at cinnolinene vil være i stand til å konkurrere effektivt med den endogene ligand. Cinnolinene oppviste ikke noen påvisbar interaksjon med kontrollproteinet.

Litteraturhenvisninger

Collins AV et al (2002) Immunity 17,201-210 "The interaction properties of costimulatory molecules revisited"

Inhibering av produksjon av interleukin-2 (IL-2) ved hjelp av humane Jurkat T-celler.

Metode

Humane Raji-celler ble dispensert ved en konsentrasjon på 2xl0<5>celler pr. brønn i RPMI-1640-medium supplert med 10 % føtalt kalveserum, 1 % penicillin/- streptomycin, 1 % glutamin (RPMI-medium) i en 96-brønners, rundbunnet mikro-titerplate. Forbindelser under undersøkelse (oppløst i 100 % DMSO) ble fortynnet til åtte ganger den ønskede sluttkonsentrasjon i RPMI-medium og tilsatt til den nød-vendige sluttkonsentrasjon for et totalvolum på 200 ul pr. brønn. Etter 20 minutters inkubasjon ved 37 °C, ble Jurkat T-celler tilsatt ved en konsentrasjon på 2x10<5>celler pr. brønn. Monoklonalt antistoff mot CD3 (UCHT1, R&D Systems) ble tilsatt til kulturene ved en sluttkonsentrasjon på lug pr ml og, der hvor det er angitt, ble monoklonalt antistoff mot CD28 (CD28,2, BD-Pharmingen) også tilsatt ved en konsentrasjon på 2,5 (ig pr. ml. Celler ble dyrket ved 37 °C i 5 timer, hvoretter platene ble sentrifugert og supernatantene ble innhøstet for IL-2-ELISA-analyse under anvendelse av IL-2-Eli-par-sett (DIACLONE Research, Besancon, Frankrike) i henhold til produsentenes instruksjoner.

Som eksempel ga forbindelsen ifølge eksempel 2 (AVI 142005) 65 % inhibering ved 3,0 uM.

Homogen, tidsoppløst fluorescensanalyse

Eksemplene beskrevet ovenfor ble testet i en cellefri, homogen tidsoppløst fluorescensanalyse, (HTRF)-analyse, for å bestemme deres aktivitet som inhibitorer for CD80-CD28-interaksjonen.

I analysen forbindes europium og allofykocyanin (APC) indirekte med CD28 og CD80 (gjennom antistofflinkere), slik at det dannes et kompleks som bringer europiumet og APC-et i nær kontakt for å generere et signal. Komplekset omfatter de følgende seks proteiner: fluorescerende markør 1, linkerantistoff 1, CD28-fusjonsprotein, CD80-fusjonsprotein, linkerantistoff 2 og fluorescerende markør 2. Tabellen nedenunder beskriver disse reagensene nærmere.

Etter dannelse av komplekset bringes europium og APC nært sammen og det genereres et signal.

Ikke-spesifikk interaksjon ble målt ved å bytte ut CD80-muse-Fab-fragment-fusjonsproteinet (1,9 ug/ml) med et muse-Fab-fragment (C215). Analysen ble utført i sorte 384-brønnplater ved et sluttvolum på 30 fil. Analysebuffer: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,8, inneholdende 0,1 % BSA (vekt/volum) tilsatt like før bruk.

Forbindelser ble tilsatt til reagensene ovenfor i en konsentrasjonsserie som strakk seg fra 100 uM til 1,7 nM. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 4 timer ved romtemperatur. Dobbeltmålinger ble gjort ved å bruke en Wallac Victor 1420 Multilabel-teller. Første måling: eksitasjon 340 nm, emisjon 665 nm, opphold 50 jas, måletid 200 us. Andre måling: eksitasjon 340 nm, emisjon 615 nm, opphold 50 us, måletid 200 us. Tellinger ble automatisk korrigert for fluorescensoverkrysning, slukking og bakgrunn. EC5o-aktivitetene til forbindelser som ble testet, er målt som:

Forbindelsene ifølge eksemplene 1-8 hadde de følgende aktiviteter i HTRF-analysen som er beskrevet ovenfor:

Eksempel 1<*>

Eksempel 2***

Eksempel 3<***>

Eksempel 4<***>

Eksempel 5<*>

Eksempel 6<***>

Eksempel 7<***>

Eksempel 8<***>

Eksempel 9

Ytterligere eksempler

Ytterligere eksempler på forbindelser ifølge oppfinnelsen ble syntetisert ved hjelp av fremgangsmåter som er analoge til de ifølge eksemplene 1-8 ovenfor. Strukturene til de syntetiserte forbindelser er vist i den følgende tabell sammen med deres aktiviteter i HTRF-analysen som er beskrevet ovenfor.

Eksempler på resultatet av testing av forbindelsene ovenfor i analysen for inhibering av produksjon av interleukin-2 (IL-2) ved hjelp av humane Jurkat T-celler, beskrevet ovenfor, er som følger:

Claims

1. Forbindelse, karakterisert vedat den har formel (I) eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt salt, hydrat eller solvat derav:

hvor Ri og R3uavhengig av hverandre er H, F, Cl, Br, -NO2, -CN, Ci-C<$alkyl eventuelt substituert med F eller Cl, eller Ci-C6alkoksy eventuelt substituert med F; R4er en karboksylsyregruppe (-COOH) eller en fysiologisk hydrolyserbar ester derav, eller -C(=0)NR6R7, hvor Réer H, eller et radikal med formel -(Alk)m-Q, hvor m er 0 eller 1; Alk er et toverdig rettkjedet eller forgrenet C1-C12alkylen-, C2-Ci2alkenylen- eller C2-Ci2alkynylenradikal, eller et toverdig C3-Ci2karbosyklisk radikal, hvor alle radikalene kan inneholde én eller flere -O-, -S- eller -N(R8)-linkere hvor Rg er H eller CrC4alkyl, C3-C4alkenyl, C3-C4alkynyl eller C3-C6sykloalkyl; og hvilke som helst av de to verdige radikalene er eventuelt substituert med fluor, fluor-Ci-C4alkyl, fenyl-Ci-C4alkyl, C2-C5alkenyl, fluorsubstituert C2-C5alkenyl, C1-C4alkylfenyl-Ci-C4alkyl, Ci-C4alkylsulfonylfenyl C1-C4alkyl, benzyloksy, fenylkarbonylmetyl, CrC4alkyl, CrC4alkoksykarbonyl, CrC4alkoksy-C1-C4alkyl, C3-C6sykloalkyl-Ci-C4alkyl, morfolinyl, hydroksy, amino, cyano, dimetylamino; fenyl eventuelt substituert med substituent(er) valgt fra gruppen bestående av fluor, klor, brom, trifluor-Ci-C4alkyl, Ci-C4alkyl, C1-C4alkoksy, metylendioksy, nitro, sulfamoyl, hydroksy og dimetylamino; C3-Ci2sykloalkyl eventuelt substituert med substituent(er) valgt fra hydroksy, amino og C1-C4alkyl; pyridyl, imidazolyl, furyl, tetrahydrofuryl, tienyl, piperidyl eventuelt substituert med substituent(er) valgt fra fluor, C1-C4alkoksykarbonyl og benzyl; kinolyl eventuelt substituert med trifluor- C1-C4alkyl, indolyl eventuelt substituert med Ci-C4alkyl eller C1-C4 alkoksy, pyrrolidinyl eventuelt substituert med Ci-C4alkyl, og Q er H; -NR9Ri0hvor R9og Ri0uavhengig av hverandre er H, C1-C4 alkyl, C3-C4 alkenyl, C3-C4 alkynyl, C3-C6 sykloalkyl, CrC4 alkoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl, fenyl, bifenyl, naftyl eller monosyklisk N-inneholdende fenylgruppe substituert med nitro; eller R9og Rio danner sammen med nitrogenet som de er bundet til en pyrrolidinring, en imidazolidinon-ring, en imidazolring, en piperidinring, en piperazin-ring, en morfolinring, en tiomorfolinring eller en azepanring, hvor ringen er usubstituert eller substituert med én til fire Ci-C6 alkylgrupper, Ci-C6 alkyl substituert med ett til tre halogenatomer, Ci-C6-alkoksykarbonyl, benzyl eller en oksogruppe, og R7 er H eller Ci-C6 alkyl, eller R$ og R7 danner sammen med atomet eller atomene som de er bundet til, en morfolinring, en piperidinring, en azepanring, en diazepanring, en dekahydrokinolinring, en dekahydroisokinolinring, hvor ringen er usubstituert eller substituert med én til fire Ci-C6 alkylgrupper; og X er en binding eller -NH-.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat radikalet R4X- er i 4-stillingen til fenylringen.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert vedat X er en binding.

4. Forbindelse ifølge hvilke som helst av de forutgående krav,karakterisert vedatR3erhydrogen.

5. Forbindelse ifølge hvilke som helst av de forutgående krav,karakterisert vedat Rt er hydrogen eller fluor.

6. Forbindelse ifølge hvilke som helst av de forutgående krav,karakterisert vedat R4 er -C(=0)NR<$R7 hvor R<$ og R7er som definert i krav 1.

7. Forbindelse ifølge hvilke som helst av de forutgående krav,karakterisert vedat R<$ er et radikal med formel -(Alk)m-Q hvor m er 1 og det toverdige radikal Alk inneholder 3 eller 4 karbonatomer og er usubstituert, og Q er -NR9Ri0hvor R9og Ri0uavhengig av hverandre er H, Ci- C4 alkyl, C3-C4 alkenyl, C3-C4 alkynyl, C3-C6 sykloalkyl, C1-C4 alkoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl, fenyl, bifenyl, naftyl eller monosyklisk N-inneholdende fenylgruppe substituert med nitro; eller R9og Ri0danner sammen med nitrogenet som de er bundet til en pyrrolidinring, en imidazolidinonring, en imidazolring, en piperidinring, en piperazinring, en morfolinring, en tiomorfolinring eller en azepanring, hvor ringen er usubstituert eller substituert med én til fire Ci-C6 alkylgrupper, Ci-C6 alkyl substituert med ett til tre halogenatomer, Ci-C6 alkoksykarbonyl, benzyl eller en oksogruppe.

8. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert vedatR7erhydrogen.

9. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedatQerH, eller -NRgRg hvor hver R8uavhengig av hverandre er H, C1-C4 alkyl, C3-C4 alkenyl, C3-C4 alkynyl, C3-C6 sykloalkyl, C1-C4 alkoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl, fenyl, bifenyl, naftyl eller monosyklisk N-inneholdende fenylgruppe substituert med nitro; eller R9og Ri0danner sammen med nitrogenet som de er bundet til en pyrrolidin-ring, en imidazolidinon-ring, en imidazolring, en piperidinring, en piperazinring, en morfolinring, en tiomorfolinring eller en azepanring; og R7 er H eller CrC6 alkyl, eller Rg og R7 danner sammen med atomet eller atomene som de er bundet til en morfolinring, en piperidinring, en azepanring eller en diazepanring.

10. Forbindelse ifølge krav 9, karakterisert vedat R4 er en karboksylsyregruppe (-COOH) eller en estergruppe med formel -COOR hvor R er metyl, etyl, n- eller iso-propyl, n-, sek.- eller tert.-butyl, eller benzyl.

11. Forbindelse ifølge krav 9 eller krav 10, karakterisert vedat Rg er et radikal med formel -(Alk)m-Q hvor m is 1, Alk er -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- eller -CH2CH(CH3)CH2-, eller et toverdig syklopropylen-, syklopentylen- eller sykloheksylenradikal, eventuelt substituert med OH, okso, CF3, metoksy eller etoksy, og Q er hydrogen, -NRgRg hvor hver R8kan være den samme eller forskjellige og er valgt fra hydrogen, metyl, etyl, n- eller isopropyl, eller tert.-butyl, en metyl-, etyl- eller benzylester, eller fenyl-, fenoksy-, syklopentyl-, sykloheksyl-, furyl-, tienyl-, piperidyl- eller piperazinylgruppe.

12. Forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 9-11,karakterisert vedatR7er metyl, etyl, n- eller iso-propyl, n-, sek.-eller tert.-butyl, eller Rg og R7danner sammen med atomet eller atomene som de er bundet til, en morfolinring, en piperidinring, en azepanring eller en diazepanring.

13. Forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 9-12,karakterisert vedat Ri er H, F, Cl, metyl eller metoksy.

14. Forbindelse ifølge hvilke som helst av krav 9-13, karakterisert vedatRierFi 6-stillingen til 3-okso-l ,3-dihydro-2H-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl-ringsystemet.

15. Forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 9-14,karakterisert vedat R3 er H, F, Cl, metyl eller metoksy.

16. Forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 9-15,karakterisert vedat X er en binding eller et -CH2- eller -CH2CH2-radikal.

17. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den har formel (IC) eller et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt salt, hydrat eller solvat derav:

hvor X og R4 er som angitt i hvilke som helst av kravene 3, 7, 8 eller 9-16.

18. Forbindelse ifølge krav 17, karakterisert vedat radikalet R4X- er i 4-stillingen i fenylringen.

19. Forbindelse ifølge krav 17 eller krav 18, karakterisert vedat X er en binding og R4er -C(=0)NR<$R7 hvor R<$og R7er som angitt i krav 9, eller henholdsvis krav 11 eller 12.

20. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den har formelen 4-(6-fluor-3-okso-l ,3-dihydro-pyrazolo[4,3-c]cinnolin-2-yl)-N-(2,2-difluor-etylyl)-benzamid, ifølge formel (A)

21. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den har formelen N-[3-(tert.-butyl-metyl-amino)-butyl]-4-(6-fluor-3 -okso-1,3 -dihydro-pyrazolo[4,3 -c]cinnolin-2-yl)-benzamid, ifølge formel (B):

22. Farmasøytisk eller veterinærmedisinsk preparat, karakterisert vedat det omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-21 sammen med en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel eksipiens eller bærer.

23. Forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-21 for anvendelse ved behandling av tilstander som har nytte av immunomodulasjon.

24. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-21 ved fremstillingen av et medikament for behandling av tilstander som har nytte av immunomodulasjon,

25. Forbindelse for anvendelse ifølge krav 23 eller anvendelse ifølge krav 24, hvor immunomodulasjonen er immunoinhibering.

26. Forbindelse for anvendelse ifølge krav 23 eller anvendelse ifølge krav 24, hvor tilstanden er autoimmunsykdom, reumatoid artritt, multippel sklerose, sukkersyke, astma, transplantasjon, systemisk lupus erytematosis og psoriasis.