NO326398B1 - Nytt glykolipid og medisin for autoimmunsykdom inneholdende det samme som aktiv ingrediens. - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår et nytt glykolipid og en medisin for autoimmune sykdommer inneholdende det som aktiv ingrediens.

Bakgrunn

Levende legemer har som funksjon å forhindre og inhibere forekomsten av autoimmune sykdommer, og denne funksjonen refereres til som "immunmodulator-funksjonen". NKT-cellene tiltrakk seg nylig oppmerksomhet som en lymfocytt med "immunmodulator-funksjonen". (Saishin Igaku Vol. 55, nr. 4, s. 858-863). Oppfinnerne har ar-

beidet med utvikling av medisiner som virker på NKT-cellene (et farmasøytisk lege-middelmateriale som hensiktsmessig stimulerer NKT-cellene og som effektivt ekspres-

serer deres immunmodulator-funksjon).

Konvensjonelle behandlingsmetoder for autoimmune sykdommer fokuserer hovedsake-

lig på "ikke-spesifikk immunsupressiv behandling" og omfatter glukokortikoider og immundempende midler. "Ikke-spesifikk immunsupressiv behandling" refererer til fremgangsmåter for behandling som undertrykker mange av de biologiske funksjonene i immunceller uten spesiell selektivitet og adskilling. Disse fremgangsmåtene til behand-

ling undertrykker derfor biologiske reaksjoner som induserer og forverrer sykdommer,

men de undertrykker også biologiske reaksjoner som er nødvendige for levende legemer (bivirkninger). Derfor er utviklingen av spesifikke immundempende midler (farmasøy-

tiske legemidler som kun undertrykker de biologiske reaksjonene som induserer og forverrer sykdommer) sterkt ønsket. Autoantigene peptidbehandlinger ble nylig testet med dette formålet for øyet. Da peptidene imidlertid manifesteres i det store histokompatibi-

litets genkompleks ("major histocompatibility" MHC) molekylene som har individuelle forskjeller, varierte forskjellene i effektivitet svært blant individene, og allergiske reaksjoner skapte også et problem.

Alfa-galaktosylceramid er så langt blitt påvist av andre forskere som en substans som er istand til å stimulere NKT-celler. [Science, vol. 278, s. 1626-1629 (1997), Proe. Nati.

Acad. Sei. USA, vol. 95, s. 5690-5693 (1998), J. Med. Chem. 1995, 38, s. 2176-2187, japansk patentsøknad allment tilgjengelig beskrivelse (Kokai) Hei 5-9193, japansk pa-tentsøknad allment tilgjengelig beskrivelse (Kokai) Hei 5-59081, japansk patentnr.

3088461 og US patentnr. 5,936,076]. Oppfinnerne administrerte alfa-galaktosylceramidet som er beskrevet i publikasjonene, for å behandle autoimmune sykdommer slik som dyremodellen for multippel sklerose, eksperimentell autoimmun encefalomye-

litt (EAE) og kollagen-indusert artritt, dyremodellen for revmatisk artritt. Dette alfa-

galaktosylceramidet induserer imidlertid både IL-4, et cytokin som supresserer autoimmune sykdommer, så vel som IFN-y, et cytokin som forverrer autoimmune sykdommer. Derfor ble dette alfa-galaktosylceramidet klart funnet ikke å være effektivt i supresse-ring eller behandling av autoimmune sykdommer. (American Immunology Society Journal, the Journal of Immunology, 1. januar 2001, vol. 166, s. 662-669). Det vil si, konvensjonell alfa-galaktosylceramid er ikke en hensiktsmessig medisin for autoimmune sykdommer da det induserer en simultan manifestasjon av motstridende funksjoner (en funksjon som undertrykker sykdom og en funksjon som forverrer sykdommen) i NKT-celler.

Påtrufhe problemer

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe glykolipider som er effektive til behandling av autoimmune sykdommer. Selv om alfa-galaktosylceramid, som tidligere er undersøkt for et slikt formål, definitivt anerkjennes å ha kapasitet til å stimulere NKT-celler, er effekten ikke-spesifikk og det forverrer også autoimmune sykdommer. Følgelig var det ytterst utilfredsstillende som en slik medisin. Glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse induserer imidlertid spesifikke cytokiner som undertrykker autoimmune sykdommer og induserer ikke andre faktorer som forverrer autoimmune sykdommer. Derfor er de ytterst effektive til behandling av autoimmune sykdommer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnerne syntetiserte et stort antall glykolipider som er derivater av konvensjonell alfa-galaktosylceramid og testet deres biologiske aktiviteter. Som resultat oppdaget oppfinnerne at stoffene som ble fremstilt ved å modifisere disse glykolipidene for å korte lengden av karbonkjeden i sfingosinbasen, viste evnen til kun å indusere funksjonen (produserer IL-4) som er nyttig i undertrykking av autoimmun sykdom, som er den samme som NKT-cellene besitter. Derivatet ble administrert for å behandle EAE, dyremodellen for multippel sklerose og ble bekreftet å ha forebyggende og behandlende effekter på EAE.

Det vil si at foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et glykolipid som er representert ved formel (I) som er vist nedenfor.

I formelen er R<1> en aldopyranose-gruppe. Som dette aldopyranoseradikalet kan a-D-glykosyl, a-D-galaktosyl, a-D-mannosyl, P-D-glukosyl, P-D-galaktosyl, P-D-mannosyl, 2-deoksi-2-amino-a-D-galaktosyl, 2-deoksi-2-amino-P-D-galaktosyl, 2-deoksi-2-acetylamino-ct-D-galaktosyl, 2-deoksi-2-acetylamino-P-D-galaktosyl, P-D-allopyranosyl, P-D-altropyranosyl, P-D-idosyl og liknende nevnes, og a-isomeren er mer effektiv som glykolipidet i foreliggende oppfinnelse. Av disse er a-D-galaktopyranosyl, som er vist i formelen nedenfor, foretrukket som R<1>.

R<2> representerer et hydrogenatom eller en hydroksylgruppe, og fortrinnsvis hydrogenatom.

R3 representerer -CH2", -CH(OH)-CH2" eller -CH=CH", fortrinnsvis -CH2" eller - CH(OH)-CH2" og mest foretrukket -CH(OH)-CH2<->.

R<4> representerer et hydrogenatom eller CH3, fortrinnsvis hydrogenatom.

x er 0 til 35, fortrinnsvis 0 til 26, mer foretrukket 11 til 26, enda mer foretrukket 11 til 23 og mest foretrukket 18 til 23.

y og z representerer heltallene som oppfyller y + z = 0 til 3. Her betyr ikke -(CH2)y(CH)(CH3))z' at (CH2) og (CH(CH3)) er satt inn i denne formelen, men indikerer kun et kvantitativt forhold. For eksempel representerer -(CH2)y(CH)(CH3))z" en av - CH(CH3)CH2CH2\ -CH2CH(CH3) CH2<_> eller -CH2CH2CH(CH3)' når y = 2 og z = 1.1 tillegg er y og z fortrinnsvis z = 0 og y = 0-3, og mer foretrukket z = 0 og y = 1-3.

Foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en medisin som omfatter disse glykolipidene som aktive ingredienser, til behandling av en autoimmun sykdom. I tillegg er den å tilveiebringe en medisin som omfatter disse glykolipidene som aktive ingredienser for behandling av sykdommer hvor Thl/Th2 immunbalansen er forskjøvet mot Thl bias, eller sykdom hvori Thl-celler forverrer de patologiske tilstandene. Foreliggende oppfinnelse er dessuten å tilveiebringe et selektivt IL-4 produksjons-induserende middel som omfatter disse glykolipidene som aktive ingredienser.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 og 2 viser et eksempel på en produksjonsprosess for et glykolipid [formel (I)] ifølge foreliggende oppfinnelse. I figuren representerer R<1> en aldopyranose-gruppe, R<2 >representerer et hydrogenatom eller et hydroksylgruppe, R<3> representerer -CH2',

-CH(OH)-CH2_ eller -CH=CH\ R<4> representerer hydrogenatom eller metylgruppe, x representerer et heltall fra 0 til 35, y + z er et heltall på 0 til 3, R<5> representerer hydrogenatom, metylgruppe eller -(CH2)y-(CH)(CH3))z-"CH(R<4>)2 (hvor y' + z' er et heltall på 0 til 2), R<6> representerer hydrogenatom eller metylgruppe og R<7> representerer aldopyranose, hvori de funksjonelle gruppene slik som hydroksylgruppene og aminogruppene er hensiktsmessig beskyttet. Figur 3 er et diagram som viser resultatene av et supressjonsstudie av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE). Figur 4 er et diagram som viser resultatene av et supressjonsstudie av kollagen-indusert artritt (CIA).

Figur 5 viser resultatene av en supressjonstest av diabetes start i NOD-mus.

Figur 6 er et diagram som viser resultatene av målinger av serumcytokin.

Figur 7 er et diagram som viser resultatene av proliferative responsanalyse for miltceller. Figur 8 er et diagram som viser resultatene av cytokinproduksjonsanalyse i miltceller. Den høyre stolpen av på stolpediagrammet representerer IL-4 og den venstre stolpen representerer IFN-y. Figur 9 viser resultatene av en proliferative responsanalyse for miltceller og cytokin-målinger. Figur 10 er et diagram som viser resultatene av serum anti-MOG antistoff-målinger. Den høyre stolpen på diagrammet representerer IgGl og den venstre stolpen representerer IgG2a.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Autoimmune sykdommer kan deles i generelle autoimmune sykdommer og organspesifikke autoimmune sykdommer. Av disse forårsaker organspesifikke autoimmune sykdommer kronisk inflammasjon i spesifikke organer eller vev (hjerne, lever, øyne og ledd) og årsaken tilskrives en immunrespons (en autoimmun respons) på autoantigener som er spesifikke for hvert organ. Multippel sklerose (rammer hjerne og ryggmarg) og revmatisk artritt (rammer leddene) er typiske eksempler på sykdommen. Disse sykdommene har mange felles kjennetegn selv om de rammer ulike organer, og behand-lingsmetodene inneholder også grunnleggende fellestrekk. I mange av dem spiller T-cellene som produserer IFN-y, en viktig rolle.

NKT-celler er lymfocytter som har egenskapene til både NK- og T-cellene og gjenkjen-ner glykolipidene som er bundet til CDld-molekylene gjennom T-celle antigenresepto-rer.

NKT-cellene ekspresserer fysiologiske funksjoner slik som (a) anti-tumoraktivitet (tu-morcelle eliminerende effekt), (b) IFN-y produksjon og (c) IL-4 produksjon så vel som (d) en funksjon for å forsterke NK-celleaktivitet og (e) å aktivere makrofagene. Både (d) og (e) induseres av IFN-y som produseres. Det vil si at (a), (b) og (c) er direkte virkninger av NKT-cellene og (d) og (e) er indirekte virkninger som induseres av (b).

Konvensjonell alfa-galaktosylceramid er en svært sterk immunstimulator som aktiverer NKT-cellene og induserer alle virkningene fra (a) til (e). Her refererer det konvensjonelle alfa-galaktosylceramidet til et stoff som har lenger karbonkjede i sfingosinbasen enn glykolipidet ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel refererer det til glykolipidene som anvendes til sammenligninger i eksempelene som beskrives senere, så vel som de som er beskrevet i Science, vol. 278, s. 1626-1629 (1997), Proe. National Academy Science USA vol. 95, s. 5690-5693 (1998), japansk patentsøknad allment tilgjengelig beskrivelse (Kokai) Hei 5-9193, japansk patentsøknad allment tilgjengelig beskrivelse

(Kokai) Hei 5-59081 og US patentnr. 5,936,076]. Av egenskapene som induseres er (c) IL-4 produksjon effektiv i undertrykking av en autoimmun sykdom, men (b) IFN-y produksjon forverrer den autoimmune sykdommen, og således opphever de hverandre hvilket gjør dem ineffektive i behandling av autoimmune sykdommer. I tillegg reduseres straks det korresponderende antall NKT-celler som stimuleres av det konvensjonelle alfa-galaktosylceramidet, ved apoptose. I motsetning har glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse en svakere immunaktiveringseffekt enn det konvensjonelle alfa-galaktosylceramidet og induserer selektivt (c) IL-4 produksjonen i >IKT-cellefunksjon-ene. Da IFN-y derivering unngås, kan glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse gi effekten å undertrykke og behandle organspesifikke autoimmune sykdommer. I tillegg er glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse bedre ved at de ikke induserer apoptose i NKT-cellene.

Forskningen på interaksjonene blant NKT-celleantigenreseptorene, glykolipidene og CD ld molekylene har hatt fremgang de siste årene. (Se Immunological Review Journal, 1999, vol. 172, s. 285-296). For tiden antas det at de to hydrofobe karbonkjede-segmentene som er avledet fra sfingosinbasen og en fettsyre i glykolipidet graver seg dypt ned i de to grøftene (lommene) i CDld molekylet for å lage en forbindelse mellom, og det hydrofile glykosylsegmentet antas å binde til en NKT-celle antigenreseptor. Karbonkjeden i sfingosinbasen i et glykolipid ifølge foreliggende oppfinnelse er kortere enn konvensjonell alfa-galaktosylceramid, og bindingen til et CD ld molekyl er svakere. Som et resultat avtar stabiliteten til glykosylsegmentet og egenskapen til signalet som overføres til antigenreseptorene modifiseres. Et annet resultat som induseres er selektiv IL-4 produksjon. Effekten av glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse korrespon-derer ikke til den til alfa-galaktosylceramid i noen dose, og det konkluderes med at de er vesentlig forskjellige ligander. [Referer til eksemplene som beskrives senere og en pub-lisert tese. (Nature, vol. 413, nr. 6855, s. 531-534 (2001)].

Glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse er representert ved formel (I) over. For eksempel kan (1) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-triakontanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (2) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-nonakosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (3) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-oktakosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (4) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heptakosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (5) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heksakosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (6) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-pentakosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (7) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-tetrakosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (8) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-trikosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (9) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-dokosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (10) (2S, 3S, 4R)-i-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heneikosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (11) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-eikosanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (12) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-nonadekanoylamino)-1,3,4-heptantriol, (13) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-triakontanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (14) (2S, 3S, 4R)-1 -0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-nonadekanoylamino)-l ,3,4-oktantriol, (15) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-oktakosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (16) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heptakosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (17) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heksakosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (18) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-pentakosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (19) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-tetrakosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (20) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-trikosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (21) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-dokosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (22) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heneikosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (23) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-eikosanoylamino)-1,3,4-oktantriol, (24) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-nonadekanoylamino)-l,3,4-oktantriol, (25) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-triakontanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (26) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-nonakosanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (27) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-oktakosanoylamino)-l,3,4-nonantriol, (28) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heptakosanoylamino)-l,3,4-nonantriol, (29) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heksakosanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (30) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-pentakosanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (31) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-tetrakosanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (32) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-trikosanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (33) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-dokosanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (34) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heneikosanoylamino)-l,3,4-nonantriol, (35) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-eikosanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (36) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-nonakosanoylamino)-1,3,4-nonantriol, (37) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-triakontanoylamino)-1,3,4-heksantriol, (38) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-nonakosanoylamino)-1,3,4-heksantriol, (39) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-oktakosanoylamino)-l,3,4-heksantriol, (40) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heptakosanoylamino)-1,3,4-heksantriol, (41) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-gaIaktosyl)-2-(N-heksakosanoylamino)-1,3,4-heksantriol, (42) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-pentakosanoylamino)-1,3,4-heksantriol, (43) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-tetrakosanoylamino)-1,3,4-heksantriol, (44) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-trikosanoylamino)-1,3,4-heksantriol, (45) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-dokosanoylamino)-1,3,4-heksantriol, (46) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heneikosanoylamino)-l,3,4-heksantriol, (47) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-eikosanoylamino)-l,3,4- hek-santriol, (48) (2S, 3S, 4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-nonadakanoylamino)-l,3,4- hek-santriol nevnes. Av disse er (3) til (9), (15) til (21), (27) til (33) og (39) til (45) foretrukket.

Glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved anvendelse av ulike metoder, men de kan for eksempel fremstilles i samsvar med fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor. Produksjonsprosessen er vist i figurene 1 og 2. Det vil si at forbindelsene (Ila), (Ilb) og (lic) fremstilles i samsvar med fremgangsmåten som er beskrevet i en publikasjon (M. Morita et al., J. Med. Chem., 1995, 38,2176 og liknende) og seg-mentene med dobbeltbinding i (Ila) og (Ilb) reduseres for å omdanne dem til forbindelsene (Illa) og (Illb). Etter mesylering eller tosylering av den sekundære hydroksylgruppen i forbindelsene (Illa), (Illb) og (Ila), fremstilles forbindelse (IV) ved å konvertere dem til azid-grupper og forbindelse (V) fremstilles ved en selektiv reduksjon av azid-gruppen til en aminogruppe og en påfølgende amid-dannelses reaksjon. Forbindelse (VI) fremstilles ved simultant å konvertere benzylgruppen som er tilstede i forbindelse

(V) som en beskyttelsesgruppe for det sekundære hydroksylgruppen, til en acylgruppe slik som en benzoylgruppe og en acetylgruppe, og fjerne beskyttelsesgruppen fra den primære hydroksylgruppen. Forbindelse (VI) glykosyleres for å fremstille forbindelse (VII), og den ønskede forbindelsen (I) kan fremstilles ved å fjerne de resterende be-skyttelsesgruppene.

Glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som medisiner for autoimmune sykdommer, medisiner for sykdommer hvori Thl/Th2 immunbalansen er forskjøvet mot Thl bias eller medisiner for sykdommer hvor Thl-cellene forverrer de patologiske tilstandene og også som selektive IL-4 produksjonsinduserende midler. Her betyr autoimmune sykdommer multippel sklerose, revmatisk artritt, psoriasis, Crohns sykdom, vitiligo vulgaris, Behcets sykdom, kollagensykdommer, type 1 diabetes, uveitt, Sjøgrens sykdom, autoimmuntype myokarditt, autoimmune leversykdommer, autoimmune gastritt, pemfigus, Guillain Barrés syndrom, HTLV-1 assosiert myelopati og liknende. I tillegg betyr sykdommer hvor Thl/Th2 immunbalanse forskyves mot Thl bias, autoimmune sykdommer slik som multippel sklerose, revmatisk artritt, psoriasis, type 1 diabetes, uveitt, Sjøgrens sykdom og liknende så vel som sykdommer som er forbundet med celleimmunologi slik som akutt hepatitt, transplantatavstøtning, infeksjoner som er forårsaket av intracellulære infeksiøse patogener og liknende.

Glykolipidene [formel (I)] ifølge foreliggende oppfinnelse har lav toksisitet. For eksempel overlevde samtlige 10 grupper av fem uker gamle mus når de fikk 300 ug/kg av forbindelse 25 administrert intraperitonealt to ganger pr. uke i 4 måneder i et forsøk. Glykolipidene (I) ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres alene, men dersom ønskelig kan de også anvendes sammen med velkjente bærere som vanligvis tolereres farmakologisk i formuleringer som er målrettet for å forbedre og behandle symptomene som er forårsaket av autoimmune sykdommer eller sykdommer som forskyver Thl/Th2 immunbalansen mot Thl bias eller sykdommer hvor den patologiske tilstanden forver-res av Thl-celler. For eksempel kan den aktive bestanddelen administreres oralt eller ikke-oralt alene eller sammen med et vanlig benyttet hjelpestoff ("vehicle") ved hensiktsmessig forming til kapsler, tabletter eller injeksjonsmidler. Kapslene fremstilles for eksempel ved å blande et stampulver med et hjelpestoff slik som laktose, stivelse eller derivater derav, cellulosederivater og liknende, og pakking i gelatinkapsler. I tillegg til det tidligere nevnte hjelpestoffet tilsettes et bindemiddel slik som karboksimetylcellulo-senatriumsalt, alginsyre, arabisk gummi og liknende samt vann til den aktive bestanddelen, blandingen knas og granuleres etter behov, før et smøremiddel slik som talkum og stearinsyre tilsettes og tabletter formes ved anvendelse av en vanlig trykkstempelma-skin. Til injeksjon, når en ikke-oral administrering anvendes til injeksjon, løses en aktiv bestanddel sammen med en oppløsningshjelper i sterilt destillert vann eller steril fysio-logisk saltløsning og forsegles i ampuller for å gi en injeksjonsformulering. En stabilisa-tor og en buffersubstans kan være tilstede dersom nødvendig.

Doseringen av den farmasøytiske forbedringen og medisinene ifølge foreliggende oppfinnelse for autoimmune sykdommer, sykdommer hvori Thl/Th2 immunbalanse forskyves mot Thl bias og IL-4 induserende midler, avhenger av ulike faktorer slik som for eksempel pasientens symptomer og alder, administreringsmåten, formuleringstypen og antallet administreringer. 0.001 mg til 5000 mg/dag/person er imidlertid vanligvis passende, hvor 0.01 mg til 500 mg/dag/person er foretrukket og 0.5 mg til 100 mg/dag/person er mer foretrukket.

Effekt av oppfinnelsen

Glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse er den første medisinen som behandler

autoimmune sykdommer ved effektivt å stimulere den immunjusterende evnen til NKT-cellene. I tillegg er glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse de første glykolipidene som er bevist å ha en undertrykkende effekt på autoimmune sykdommer. Dessuten er glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse svært revolusjonerende medisiner basert på det faktum at de selektivt kun induserer den autoimmune sykdomsbehandlende funksjonen til NKT-cellene.

Glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan umiddelbart anvendes som medisiner for autoimmune sykdommer som kan undertrykkes med IL-4 nivåer. I tillegg virker IL-4 ved å forsterke antistoff-produksjon og kan anvendes som hjelp i vaksine-behandling. Dessuten er glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse tenkt å være effektive når de administreres i kombinasjon med for eksempel hepatitt virus vaksine til pasienter som har vanskeligheter med å heve antistoffnivået sitt. Glykolipidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes på sykdommer hvori NKT-cellefunksj onene undertrykkes.

Foreliggende oppfinnelse illustreres ved eksemplene som er vist nedenfor, men eksemplene er ikke ment å begrense foreliggende oppfinnelse.

Referanse- eksempel 1: Syntese av ( 2R, 3S. 4R)- l, 3. 4- tri- 0- benzvl- 5- okten- 1. 2. 3. 4-tetraol ( forbindelse 1)

NaI04 (760 mg) ble satt til en løsning av 3,4,6-tri-O-benzyl-D-gålaktose (0.99 g) i eta-nol/vann (4/1,12.5 ml) ved 0°C. Den resulterende blandingen ble rørt i 6 timer ved romtemperatur. Blandingen ble fortynnet med metylenklorid, og vann ble tilsatt for å sepa-rere løsningen. Det vanndige laget ble ekstrahert to ganger med metylenklorid. Det organiske laget ble tørket med MgS04 og løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk. En løsning av råolje i THF (6 ml) ble tilsatt dråpevis ved -10°C til en separat fremstilt løsning av propyliden (trifenyl) fosforan (5 mmol) i THF-heksan (11.2 ml), og den resulterende blandingen ble rørt i 22 timer ved romtemperatur. Et blandet løsnings-middel av MeOH/H20 (4/1, 50 ml) ble tilsatt og ekstrahert 4 ganger med heksan, den organiske fasen ble tørket med Na2SC>4 og løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk. Den resulterende oljen ble renset på en silikagelkolonne og 270 mg av forbindelsen i overskriften var fremstilt.

'H-NMR (CDC13): 0.92 (t, J = 8 Hz, 3H), 1.85-2.05 (m, 2H), 2.97 (d, J = 5 Hz, 1H), 3.51 (d, J = 6 Hz, 2H), 3.55-3.60 (m, 1H), 4.05-4.10 (m, 1H), 4.35 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.40-4.50 (m, 1H), 4.50-4.55 (m, 3H), 4.60 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.69 (d, J = 12 Hz, 1H), 5.44 (t, J = 10 Hz, 1H), 5.70-5.80 (m, 1H), 7.2-7.4 (m, 15H).

Referanse- eksempel 2: Syntese av ( 2R. 3S. 4R)- 1. 3. 4- tir- Q- benzvl- 5- hepten-1. 2. 3. 4- tetraol ( forbindelse 2)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av 3,4,6-tri-O-benzyl-D-galaktose og etyliden (trifenyl) fosforan i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 1.

'H-NMR (CDCI3): 1.57 (dd, J = 7 Hz og 2 Hz, 3H), 2.95 (d, J = 5 Hz, 1H), 3.52 (d, J = 6 Hz, 2H), 3.55-3.60 (m, 1H), 4.05-4.10 (m, 1H), 4.35 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.40-4.55 (m, 3H), 4.60 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.69 (d, J = 12 Hz, 1H), 5.51 (t, J = 10 Hz, 1H), 5.80-5.90 (m, 1H), 7.2-7.4 (m, 15H).

Referanse- eksempel 3: Syntese av ( 2R. 3S. 4R)- 1. 3. 4- tri- 0- benzvl- 5- nonen-1. 2. 3. 4- tetraol ( forbindelse 3)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av 3,4,6-tri-O-benzyl-D-galaktose og butyliden (trifenyl) fosforan i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 1.

'H-NMR (CDCI3): 0.90 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.35-1.42 (m, 2H), 1.87-2.04 (m, 2H), 3.05 (d, J = 5 Hz, 1H), 3.55 (d, J = 6 Hz, 2H), 3.60-3.62 (m, 1H), 4.10-4.12 (m, 1H), 4.38 (d, J = 12, 1H), 4.45-4.56 (m, 4H), 4.64 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 12 Hz, 1H), 5.51 (t, J= 10 Hz), 7.26-7.36 (m, 15H).

Referanse- eksempel 4: Syntese av ( 2R. 3S. 4RV1. 3. 4- tri- 0- benzvl- 1. 2. 3. 4- oktan-

tetraol ( forbindelse 4)

Til en løsning av forbindelse 1 (270 mg) i THF (3 ml) ble 10% Pd-C (30 mg) tilsatt og

den resulterende blandingen ble rørt ved romtemperatur i 1 time ved en hydrogenatmo-

sfære. Forbindelsen i overskriften (262 mg) ble fremstilt ved å fjerne katalysatoren ved filtrering og fjerning av løsningsmiddelet.

'H-NMR (CDC13): 0.88 (t, J = 3 Hz, 3H), 1.25-1.75 (m, 6H), 3.15 (d, J = 5 Hz, 1H),

3.5-3.7 (m, 4H), 4.05-4.10 (m, 1H), 4.50-4.75 (m, 6H), 7.25-7.40 (m, 15H).

Referanse- eksempel 5: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- 2- azid- l, 3, 4- tri- Q- benzyl- l, 3. 4-

oktantriol ( forbindelse 5)

Trietylamin (240 ul) og metansulfonylklorid (108 ul) ble tilsatt etter hverandre til en

løsning av forbindelse 4 (262 mg) i pyridin ved romtemperatur, hvoretter blandingen ble rørt i 1 time ved romtemperatur. Blandingen ble ekstrahert med eter og ble tørket med dehydrert natriumsulfat etter at det organiske laget var vasket med mettet kaliumbisul-

fat, vann, vanndig natriumbikarbonatløsning og saltoppløsning. Løsningsmiddelet ble dampet av under redusert trykk og det ble oppnådd 282 mg av residiet. Residiet ble løst i DMF (2 ml), og NaN3 (0.3 g) ble tilsatt. Blandingen ble rørt i 24 timer ved 100°C og ble fortynnet med etylacetat. Det organiske laget ble vasket med vann og tørket med dehydrert natriumsulfat. Løsningsmiddelet ble dampet av og residiet ble renset med flashkromatografi (heksan/etylacetat = 100/0 til 90/10) for å gi 200 mg av forbindelse i overskriften.

'H-NMR (CDCI3): 0.89 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.25-1.80 (m, 6H), 3.60-3.85 (m, 5H),

4.45-4.75 (m, 6H), 7.25-7.40 (m, 15H).

Referanse- eksempel 6: Syntese av ( 2S, 3S, 4RV2- azid- l, 3, 4- tri- 0- benzvl- 1. 3. 4-heptantriol ( forbindelse 6)

Etter at forbindelse 2 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindel-

se 4, ble forbindelse i overskriften deretter oppnådd ved samme fremgangsmåte som ved syntese av forbindelse 5.

'H-NMR (CDCI3): 0.90 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.30-1.75 (m, 4H), 3.60-3.85 (m, 5H), 4.50-4.75 (m, 6H), 7.25-7.40 (m, 15H).

li.

Referanse- eksempel 7: Syntese av ( 2S. 3S, 4R)- 2- azid- 1. 3, 4- tri- 0- benzyl- 1. 3. 4-nonantriol ( forbindelse 7)

Etter at forbindelse 3 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 4, ble forbindelse i overskriften deretter oppnådd ved samme fremgangsmåte som ved syntese av forbindelse 5.

'H-NMR (CDC13): 0.88 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.20-1.72 (m, 8H), 3.59-3.72 (m, 5H), 4.50-4.80 (m, 6H), 7.27-7.36 (m, 15H).

Referanse- eksempel 8: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- 2-( N- tetrakosanovlamino)- 1. 3. 4-tri- Q- benzvl- 1. 3. 4- oktantriol ( forbindelse 8)

Til en løsning av forbindelse 5 (200 mg) i THF (7 ml) ble 10% Pd-C (20 mg) tilsatt. Den resulterende blandingen ble rørt i 14 timer ved romtemperatur under en hydrogenatmosfære. Katalysatoren ble filtrert med et membranfilter og løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk. Residiet ble løst i metylenklorid (5 ml) og tetrakosanoinsyre, l-metyl-2-klorpyridiniumjodid (252 mg) og tributylamin (136 ul) ble tilsatt etter hverandre. Den resulterende blandingen ble rørt i 2.5 timer under oppvarming. Etter tilset-ting av etylacetat til reaksjonsblandingen, ble blandingen vasket med 5% vanndig na-triumtiosulfat og vanndig mettet kaliumhydrogensulfat-løsning. Det organiske laget ble tørket med natriumsulfat og ble deretter renset med flashkromatografi (aceton/heksan = 4/96 til Va) for å gi 213 mg av forbindelsen i overskriften.

'H-NMR (CDCI3): 0.80 (m, 6H), 1.20-1.75 (m, 48H), 2.0-2.1 (m, 2H), 3.45-3.55 (m, 2H), 3.75-3.85 (m, 2H), 4.20-4,30 (m, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.45-4.60 (m, 3H), 4.82 (d, J = 11 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 15H).

Referanse- eksempel 9: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- 2-( N- tetrakosanovlamino)- 1, 3, 4-tri- 0- benzvl- 1. 3, 4- heptantriol ( forbindelse 9)

Forbindelse 6 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 8, og forbindelse i overskriften ble fremstilt.

'H-NMR (CDCI3): 0.85-0.95 (m, 6H), 1.20-1.75 (m, 46H), 2.0-2.1 (m, 2H), 3.50-3.55 (m, 2H), 3.80-3.85 (m, 2H), 4.20-4.30 (m, 1H), 4.46 (s, 2H), 4.50-4.65 (m, 3H), 4.83 (d, J = 11 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 15H).

Referanse- eksempel 10: Syntese av ( 2S, 3S. 4RV2- fN- tetrakosanoylaminoV 1. 3. 4-tri- 0- benzvl- 1. 3. 4- heptantriol ( forbindelse 10)

Forbindelse 7 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 8, og forbindelse i overskriften ble fremstilt.

'H-NMR (CDC13): 0.85-0.95 (m, 6H), 1.26-1.70 (m, 50H), 2.00-2.05 (m, 2H), 3.49-3.54 (m, 2H), 3.79-3.83 (m, 2H), 4.22-4.28 (m, 2H), 4.45 (s, 1H), 4.49-4.54 (m, 2H), 4.59 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 12 Hz, 1H), 5.76 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.26-7.34 (m, 15H).

Referanse- eksempel 11: Syntese av ( 2S. 3S. 4RV2-( N- tetrakosanoylaminoV3. 4- di-0- benzovl- l- 0- trifenvlmetvl- 1. 3. 4- oktantriol ( forbindelse 11)

En blanding av forbindelse 8 (210 mg), Pd-C (10%, 60 mg) og PdCl2 (30 mg) i etylacetat (10 ml) ble rørt i 30 minutter ved romtemperatur under en hydrogenatmosfære. THF-EtOH (1/1,25 ml) ble tilsatt og løsningsmiddelet dampet av etter at katalysatoren var fjernet. Trifenylmetylklorid (587 mg) og dimetylaminopyridin (20 mg) ble tilsatt til residiet i pyridin (1.7 ml) og blandingen ble rørt i 9 timer ved 40°C. Pyridin ble fjernet under redusert trykk og residiet ble renset med flashkromatografi (metylenklorid/aceton = 100/0 til 50/1) for å gi en fraksjon som inneholder et diolderivat. Løsningsmiddelet ble fjernet og residiet ble tilsatt pyridin (2 ml), dimetylaminopyridin (25 mg) og ben-zoylklorid (200 ul). Blandingen ble rørt i 66 timer ved 40°C. Løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk og residiet ble renset med flashkromatografi (heksan/etylacetat = 98/2 til 80/20) for å gi 128 mg av forbindelse i overskriften.

'H-NMR (CDCI3): 0.80-0.95 (m, 6H), 1.20-1.45 (m, 44H), 1.5-2.0 (m, 4H), 2.1-2.3 (m, 2H), 3.25-3.35 (m, 2H), 4.5-4.65 (m, 1H), 5.30-5.35 (m, 1H), 5.79 (dd, J = 2 Hz og 9 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.05-7.35 (m, 15H), 7.35-7.60 (m, 6H), 7.88 (d, J = 7 Hz, 2H), 7.95-8.0 (m, 2H).

Referanse- eksempel 12: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- 2-( N- tetrakosanovlamino)- 3. 4- di-0- benzovl- l- 0- trifenylmetyl- 1. 3. 4- heptantriol ( forbindelse 12)

Forbindelse 9 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 11, og forbindelse i overskriften ble fremstilt.

'H-NMR (CDCI3): 0.85-0.95 (m, 6H), 1.20-1.50 (m, 42H), 1.55-1.75 (m, 2H), 1.80-1.95 (m, 2H), 2.1-2.3 (m, 2H), 3.30-3.40 (m, 2H), 4.55-4.65 (m, 1H), 5.35-5.40 (m,

1H), 5.82 (dd, J = 2 Hz og 9 Hz, 1H), 6.13 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.05-7.65 (m, 21H), 7.89 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 8 Hz, 2H).

Referanse- eksempel 13: Syntese av ( 2S. 3S, 4R)- 2-( N- tetrakosanovlaminoV3. 4- di-0- benzovl- l- 0- trifenylmetvl- 1. 3, 4- nonantriol ( forbindelse 13)

Forbindelse 10 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 11, og forbindelse i overskriften ble fremstilt.

'H-NMR (CDC13): 0.82-0.90 (m, 6H), 1.26-1.41 (m, 46H), 1.60-1.65 (m, 2H), 1.74-1.89 (m, 2H), 2.14-2.24 (m, 2H), 3.27-3.35 (m, 2H), 4.56-4.60 (m, 1H), 5.34-5.40 (m, 1H), 5.79 (dd, J = 3 Hz og 9 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.11-7.69 (m, 21H), 7.89 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 7 Hz, 2H).

Referanse- eksempel 14: Syntese av ( 2S. 3S, 4R)- 2-( N- tetrakosanoylamino)- 3. 4- di-0- benzovl- 1. 3, 4- oktantriol ( forbindelse 14)

p-Toluensulfonsyremonohydrat (14 mg) ble satt til en løsning av forbindelse 11 (128 mg) i metylenklorid/metanol (2/1) (1.8 ml) og den resulterende blandingen ble rørt i 2 timer ved 30°C. Løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk og residiet ble renset med flashkromatografi (heksan/etylacetat = 85/15 til 50/50) for å gi 54 mg av forbindelse i overskriften.

'H-NMR (CDCI3): 0.85-0.95 (m, 6H), 1.20-1.50 (m, 44H), 1.60-1.75 (m, 2H), 1.95-2.10 (m, 2H), 2.29 (t, J = 8 Hz, 2H), 2.70-2.75 (m, 1H), 3.6-3.7 (m, 2H), 4.35-4.45 (m, 1H), 5.35-5.45 (m, 2H), 6.33 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 8 Hz, 2H), 7.50-7.60 (m, 3H), 7.64 (t, J = 7 Hz, 1H), 7.95-8.00 (m, 2H), 8.05-8.10 (m, 2H).

Referanse- eksempel 15: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- 2-( N- tetrakosanoylamino)- 3. 4- di-Q- benzovl- 1. 3. 4- heptantriol ( forbindelse 15)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved at forbindelse 12 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 14.

'H-NMR (CDCI3): 0.88 (t, J = 7 Hz, 3H), 0.97 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.20-1.75 (m, 44H), 2.0-2.1 (m, 2H), 2.30 (t, J = 8 Hz, 2H), 3.6-3.7 (m, 2H), 4.35-4.45 (m, 1H), 5.35-5.45 (m, 2H), 6.38 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.38 (t, J 8 Hz, 2H), 7.45-7.70 (m, 3H), 7.95 (d, J = 7 Hz, 2H), 8.05-8.10 (m, 2H).

Referanse- eksempel 16: Syntese av ( 2S. 3S, 4R) :2-( N- tetrakosanovlamino)- 3, 4- di-0- benzovl- 1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 16)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved at forbindelse 13 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 14.

'H-NMR (CDC13): 0.85-0.95 (m, 6H), 1.26-1.48 (m, 46H), 1.65-1.72 (m, 2H), 1.89-2.10 (m, 2H), 2.29 (t, J = 8 Hz, 2H), 2.74-2.77 (m, 1H), 3.58-3.68 (m, 2H), 4.36-4.41 (m, 1H), 5.36-5.43 (m, 2H), 6.34 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7 Hz, 2H), 7.48-7.55 (m, 3H), 7.64 (t, J = 7 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 7 Hz, 2H).

Referanse- eksempel 17: Syntese av ( 2S. 3S. 4RV2-( N- tetrakosanovlamino)- 3, 4- di-O- benzovl- 1. 0-( 2. 3, 4, 6- tetra- 0- benzvl- a- D- galaktosyl)- 1. 3, 4- oktantriol ( forbindelse 17}

En blanding av forbindelse 14 (54 mg), tinnklorid (38 mg), sølvperklorat (46 mg) og molekylsikt (4A, 270 mg) i THF (2 ml) ble rørt i 1 time ved romtemperatur. Tetra-O-benzylgalaktosylfluorid (70 mg) ble satt til blandingen og den resulterende blandingen ble rørt i 2.5 timer. Etylacetat og saltløsning ble satt til reaksjonsblandingen og lagene i løsningen ble separert. Det organiske laget ble tørket med dehydrert natriumsulfat. Løs-ningsmiddelet ble dampet av under redusert trykk, og residiet ble renset med flashkromatografi (heksan/etylacetat = 95/5 til 75/25) for å gi 45 mg av forbindelse i overskriften.

'H-NMR (CDCI3): 0.75-0.90 (m, 6H), 1.15-1.45 (m, 44H), 1.55-1.70 (m, 2H), 1.80-1.85 (m, 2H), 2.16 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.30-3.35 (m, 1H), 3.50-3.55 (m, 1H), 3.6-3.65 (m, 1H), 3.8-4.1 (m, 5H), 4.40-4.90 (m, 10H), 5.35-5.45 (m, 1H), 5.70 (dd, J = 10 Hz og 3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.15-7.60 (m, 26H), 7.90-7.95 (m, 2H), 8.00-8.05 (m, 2H).

Referanse- eksempel 18: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- 2-( N- tetrakosanovlamino)- 3, 4- di-0- benzovl- l- 0-( 2, 3, 4. 6- tetra- 0- benzvl- a- D- galaktosyl)- 1. 3. 4- heptantriol ( forbindelse 18)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved at forbindelse 15 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 17.

'H-NMR (CDCI3): 0.85-0.95 (m, 6H), 1.15-1.50 (m, 42H), 1.55-1.70 (m, 2H), 1.80-1.90 (m, 2H), 2.15 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.30-3.55 (m, 1H), 3.6-3.65 (m, 1H), 3.8-3.9 (m, 2H), 3.95-4.05 (m, 2H), 4.05-4.15 (m, 1H), 4.40-4.90 (m, 10H), 5.40-5.45 (m, 1H), 5.69

(dd, J = 10 Hz og 3 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.15-7.65 (m, 26H), 7.92 (d, J = 7 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 7 Hz, 2H).

Referanse- eksempel 19: Syntese av (" 2S. 3S, 4R)- 2- rN- tetrakosanovlaminoV3. 4- di-0- benzovl- l- 0-( 2, 3. 4, 6- tetra- 0- benzvl- a- D- galaktosvlVl, 3. 4- nonantriol ( forbindelse 19}

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved at forbindelse 16 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 17.

'H-NMR (CDC13): 0.87-0.90 (m, 6H), 1.25-1.37 (m, 46H), 1.61-1.64 (m, 2H), 1.78-1.91 (m, 2H), 2.16 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.30-3.35 (m, 1H), 3.45-3.54 (m, 1H), 3.60-3.64

(m, 1H), 3.82-3.87 (m, 2H), 3.94-4.10 (m, 3H), 4.35-4.93 (m, 10H), 5.39-5.43 (m, 1H), 5.70 (dd, J = 9 Hz og 3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.16-7.38 (m, 22H), 7.45 (t, J = 7 Hz, 2H), 7.52 (t, J = 7 Hz, 1H), 7.60 (t, J = 7 Hz, 1H), 7.93 (d, j = 7 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 7 Hz, 2H).

Referanse- eksempel 20: Syntese av ( 2S. 3S. 4RV3. 4- di- Q- benzovl- 1 - Q-( a- D-galaktosyn- 2-( N- tetrakosanoylamino)- l, 3, 4- oktantriol ( forbindelse 20)

En blanding av forbindelse 17 (45 mg), Pd-C (10%, 12 mg) og PdCl2 (12 mg) i etylacetat (3 ml) ble rørt i 1.5 time ved romtemperatur under en hydrogenatmosfære. Katalysatoren ble filtrert og løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk. Residiet ble renset med flashkromatografi (aceton/heksan = 2/3) og 24 mg av forbindelse i overskriften ble fremstilt.

'H-NMR (CDCI3): 0.80-0.90 (m, 6H), 1.20-1.50 (m, 44H), 1.60-1.75 (m, 2H), 1.90-2.00 (m, 2H), 2.25-2.35 (m, 3H), 2.68 (s, 1H), 2.88 (s, 1H), 3.43 (brt, 1H), 3.65-4.05 (m, 8H), 4.60 (br t, 1H), 4.79 (d, J = 4 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 10 Hz og 3 Hz, 1H), 7.35-7.65 (m, 7H), 7.90-7.95 (m, 2H), 8.00-8.05 (m, 2H).

Referanse- eksempel 21: Syntese av ( 2S. 3S. 4RV3. 4- di- 0- benzovl- l- 0-( a- D-<g>alaktosvl)- 2-( N- tetrakosanovlamino)- 1. 3. 4- heptantriol ( forbindelse 21)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved at forbindelse 18 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 20.

'H-NMR (CDCI3): 0.88 (t, J = 7Hz, 3H), 0.93 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.20-1.40 (m, 41H), 1.4-1.55 (m, 1H), 1.60-1.75 (m, 2H), 1.85-2.00 (m, 2H), 2.11 (d, J =10 Hz, 1H), 2.32 (t, J = 8,2H), 2.52 (s, 1H), 2.64 (s, 1H), 3.44 (br t, 1H), 3.65-4.05 (m, 8H), 4.60 (br t, 1H),

4.80 (d, J = 4 Hz, 1H), 5.25-5.30 (m, 1H), 5.77 (dd, J = 10 Hz og 3 Hz, 1H), 7.35-7.65 (m, 7H), 7.90-7.95 (m, 2H), 8.00-8.05 (d, 2H).

Referanse- eksempel 22: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- 3. 4- di- 0- benzovl- l- Q-( a- D-galaktosvD- 2-( N- tetrakosanovlamino)- 1. 3. 4- nonantrioI ( forbindelse 22)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved at forbindelse 19 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 20.

'H-NMR (CDC13): 0.88-0.90 (m, 6H), 1.25-1.32 (m, 46H), 1.68-1.73 (m, 2H), 2.27-2.47 (m, 3H), 2.67 (s, 1H), 2.87 (s, 1H), 3.43 (t, J =7 Hz, 1H), 3.66-4.01 (m, 8H), 4.59 (t, J = 10 Hz, 1H), 4.79 (d, J = 4 Hz, 1H), 5.21-5.25 (m, 1H), 5.77 (dd, J = 3 Hz og 10 Hz, 1H), 7.37-7.65 (m, 7H), 7.91 (d, J = 7 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 7 Hz, 1H).

Eksempel 1: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- 0-( a- D- galaktosvD- 2-( tetrakosanovlamino)-1. 3. 4- oktantriol ( forbindelse 23)

En IM natriummetoksid i metanol-løsning (250 ul) ble satt til en løsning av forbindelse 20 (24 mg) i MeOH-THF (1/1,1.8 ml) ved romtemperatur, og den resulterende blandingen ble rørt i 30 minutter. AG 50Wx8 (H+type) (430 mg) ble satt til blandingen, og den resulterende blandingen ble rørt i 10 minutter før resinet ble filtrert. Løsningsmid-delet ble fjernet og residiet ble vasket med en liten mengde MeOH. En nitrogengass-strøm ble anvendt for å tørke produktet for å gi 15 mg av forbindelsen i overskriften.

'H-NMR (pyridin-ds): 0.80-0.90 (m, 6H), 1.15-1.45 (m, 42H), 1.55-1.70 (m, 1H), 1.75-1.90 (m, 4H), 2.20-2.30 (m, 1H), 2.42 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.20 (br t, 1H), 4.30 (br s, 1H), 4.35-4.50 (m, 4H), 4.50-4.60 (m, 2H), 4.60-4.70 (m, 2H), 5.20-5.30 (m, 1H), 5.57 (d, J = 4 Hz, 1H), 6.00-6.10 (m, 1H), 6.3 (br s, 1H), 6.4 (bf d, 1H), 6.55 (br s, 1H), 6.65 (br s, 1H), 6.95 (br s, 1H), 8.43 (d, J = 8 Hz, 1H). MS (ESI) m/z: 690.5 (M+H<+>).

Eksempel 2: Syntese av ( 2S. 3S, 4R)- l- 0-( a- D- galaktosvD- 2-( tetrakosanovlamino)-1. 3. 4- heptantriol ( forbindelse 24)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved at forbindelse 21 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 23.

'H-NMR (pyridin-ds): 0.87 (t, J = 7 Hz, 3H), 0.95 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.15-1.40 (m, 40H), 1.57-1.75 (m, 1H), 1.75-1.90 (m, 4H), 2.15-2.25 (m, 1H), 2.42 (t, J = 7 Hz, 2H), 4.30 (br s, 2H), 4.35-4.45 (m, 4H), 4.45-4.57 (m, 2H), 4.57-4.70 (m, 2H), 5.20-5.30 (m,

1H), 5.56 (d, J = 4 Hz, 1H), 6.00-6.05 (m, 1H), 6.25 (br s, 1H), 6.4 (bf d, 1H), 6.5 (br s, 1H), 6.6 (br s, 1H), 6.9 (br s, 1H), 8.38 (d, J = 8 Hz, 1H). MS (ESI) m/z: 676.4 (M+H<+>).

Eksempel 3: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- 0-( a- D- galaktosyi)- 2-( tetrakosanoylamino)-1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 25)

Forbindelsen i overskriften (presentert med strukturformelen nedenfor) ble fremstilt ved at forbindelse 22 ble anvendt i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelse 23.

TLC: Rf = 0.54 (CHCl3:MeOH=3:l). 'H-NMR (pyridin-d5): 0.80 (t, J = 7 Hz, 3H), 0.86 (t, J = 7 Hz, 3H), 1.22-1.31 (m, 44H), 1.58-1.69 (m, 1H), 1.79-1.84 (m, 4H), 2.20-2.30 (m, 1H), 2.43 (t, J = 7 Hz, 2H), 4.29 (br s, 2H), 4.36-4.45 (m, 4H), 4.50-4.55 (m, 2H), 4.62-4.69 (m, 2H), 5.26 (d, J = 5 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 4 Hz, 1H), 6.04 (br s, 1H), 6.29 (br s, 1H), 6.39 (d, J = 5 Hz, 1H), 6.51 (br s, 1H), 6.60 (br s, 1H), 6.93 (br s, 1H), 8.43 (d, J = 9 Hz, 1H). MS (ESI) m/z: 704.5 (M+H<+>).

Eksempel 4: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- 0-( q- D- galaktosvD- 2-( N- nonakosanovl-amino)- 1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 26)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og nonakosa-noinsyre i samme fremgangsmåte som for syntese av forbindelsene 8, 1.4, 17, 20 og 23.

TLC: Rf = 0.24 (CH2Cl2:MeOH=3:l). 'H-NMR (CDC13:CD30D=3:1): 7.34 (br s, 1H), 4.91 (d, 1H, J = 3.5 Hz), 4.17 (m, 1H), 3.95-3.88 (m, 2H), 3.80-3.68 (m, 6H), 3.67-3.55 (m, 2H), 2.21 (t, 2H, J = 7 Hz), 1.67-1.26 (m, 60H), 0.91-0.87 (m, 6H). MS (FAB) m/z: 774 (M+).

Eksempel 5: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- 1 - O-( a- D- galaktosvl)- 2-( N- oktakosanoylamino)-1. 3, 4- nonantriol ( forbindelse 27)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og oktakosa-noinsyre i samme fremgangsmåte som for syntesen av forbindelsene 8,14,17, 20 og 23.

TLC: Rf = 0.24 (CH2Cl2:MeOH=3:l). <!>H-NMR (CDC13:CD30D=3:1): 4.92 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 4.20-4.19 (m, 1H), 3.96-3.88 (m, 2H), 3.81-3.67 (m, 6H), 3.56-3.50 (m, 2H), 2.20 (t, 2H, J = 7 Hz), 1.67-1.26 (m, 58H), 0.91-0.86 (m, 6H). MS (FAB) m/z: 760

<M+).

Eksempel 6: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- Q-( a- D- galaktosvD- 2-( N- heptakosanovl-amino)- 1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 28)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og heptakosa-noinsyre i samme fremgangsmåte som for syntesen av forbindelsene 8,14,17, 20 og 23.

TLC: Rf = 0.25 (CH2Cl2:MeOH=10:l). 'H-NMR (pyridin-d5): 8.43 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 5.56 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 5.25 (m, 1H), 4.7-4.6 (m, 2H), 4.54 (d, 1H, J = 7.4Hz), 4.50 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 4.45-4.3 (m, 4H), 4.3-4.2 (m, 2H), 2.42 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 2.3-2.15 (m, 1H), 1.9-1.75 (m, 4H), 1.7-1.55 (m, 1H), 1.4-1.15 (m, 56H), 0.85 (t, 3H, J = 6.7 Hz), 0.78 (t, 3H, J = 7.1 Hz). MS (FAB) m/z: 747 (M+H+).

Eksempel 7: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- 0-( a- D- galaktosvl)- 2-( N- heksakosanovl-amino)- 1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 29)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og serotinsyre i samme fremgangsmåte som for syntesen av forbindelsene 8,14,17,20 og 23.

TLC: Rf = 0.20 (CH2Cl2:MeOH=6:l). 'H-NMR (pyridin-d5): 8.44 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 5.56 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 5.50-5.19 (m, 1H), 4.69-4.61 (m, 2H), 4.54 (d, 1H, J = 3.1 Hz), 4.52-4.47 (m, 1H), 4.45-4.34 (m, 4H), 4.31-4.23 (m, 2H), 2.43 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 2.28-2.17 (m, 1H), 1.92-1.73 (m, 4H), 1.70-1.53 (m, 1H), 1.38-1.15 (m, 54H), 0.85 (t, 3H, J = 6.7 Hz), 0.73 (t, 3H, J = 7.0 Hz). MS (FAB) m/z: 732 (M+).

Eksempel 8: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- 0-( a- D- galaktosvl)- 2-( N- pentakosanovl-amino)- 1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 30)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og pentakosa-noinsyre i samme fremgangsmåte som for syntesen av forbindelsene 8,14,17,20 og 23.

TLC: Rf = 0.53 (CH2Cl2:MeOH=6:l). 'H-NMR (CDC13:CD30D=3:1): 4.92 (d, 1H, J = 3.3 Hz), 4.20-4.15 (m, 1H), 3.96-3.93 (m, 1H), 3.92-3.85 (m, 1H), 3.82-3.65 (m, 6H), 3.60-3.52 (m, 2H), 2.21 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.62-1.26 (m, 52H), 0.90-0.85 (m, 6H). MS (FAB) m/z: 719 (M+H<+>).

Eksempel 9: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- 0-( a- D- galaktosvl)- 2-( N- trikosanovlamino)-1, 3, 4- nonantriol ( forbindelse 31)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og trikosanoin-syre i samme fremgangsmåte som for syntesen av forbindelsene 8,14,17, 20 og 23.

TLC: Rf = 0.51 (CHCl3:MeOH=4:l). 'H-NMR (CDC13:CD30D=3:1): 4.91 (d, 1H, J = 3.1 Hz), 4.23-4.15 (m, 1H), 3.95-3.85 (m, 2H), 3.81-3.63 (m, 6H), 3.59-3.51 (m, 2H), 2.21 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 1.61-1.25 (m, 48H), 0.90-0.85 (m, 6H). MS (FAB) m/z: 690

(M+).

Eksempel 10: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- 0-( a- D- galaktosvl)- 2-( N- dokosanovlamino)-1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 32)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og dokosa-noinsyre i samme fremgangsmåte som for syntesen av forbindelsene 8,14,17, 20 og 23.

TLC: Rf = 0.47 (CH2Cl2:MeOH=5:l). 'H-NMR (CDC13:CD30D=3:1): 4.90 (d, 1H, J = 3.0 Hz), 4.27-4.20 (m, 1H), 3.96-3.92 (m, 1H), 3.91 (dd, 1H, J = 10.5 Hz og 4.0 Hz), 3.82-3.65 (m, 6H), 3.58-3.51 (m, 2H), 2.22 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.70-1.21 (m, 46H), 0.90-0.85 (m, 6H). MS (FAB) m/z: 676 (M+).

Eksempel 11: Syntese av ( 2S. 3S. 4R)- l- 0-( a- D- galaktosvl)- 2-( N- heneikosanovlamino)-1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 33)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og heneikosa-noinsyre i samme fremgangsmåte som for syntesen av forbindelsene 8,14, 17, 20 og 23.

TLC: Rf = 0.33 (CH2Cl2:MeOH=6:l). 'H-NMR (CDC13:CD30D=3:1): 8.05 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 4.92 (d, 1H, J = 3.3 Hz), 4.22 (m, 1H), 3.96 (dd, 1H), 3.90 (dd, 1H, J = 10.5 Hz og 4.1 Hz), 3.81-3.69 (m, 6H), 3.55 (m, 2H), 2.22 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.68-1.62 (m, 4H), 1.31-1.27 (m, 40H), 0.90-0.87 (m, 6H). MS (FAB) m/z: 662 (M+H<+>).

Eksempel 12: Syntese av ( 2S, 3S, 4R)- l- 0-( a- D- galaktosvl)- 2-( N- eikosanoylamino)-1. 3. 4- nonantriol ( forbindelse 34)

Forbindelsen i overskriften ble fremstilt ved anvendelse av forbindelse 7 og arakidonsy-re i samme fremgangsmåte som for syntesen av forbindelsene 8,14,17, 20 og 23.

TLC: Rf = 0.33 (CH2Cl2:MeOH=6:l).1 H-NMR (CDC13:CD30D=3:1): 4.86 (d, 1H, J = 3.4 Hz), 4.16 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.85 (dd, 1H, J = 10.5 Hz og 4.6 Hz), 3.74-3.61 (m, 6H), 3.50 (m, 2H), 2.17 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 1.62-1.56 (m, 4H), 1.25-1.21 (m, 38H), 0.85-0.81 (m, 6H). MS (FAB) m/z: 648 (M+H<+>).

I tillegg ble alfa-galaktosylceramid (a-GC), NH og 3,4D syntetisert i overensstemmelse med syntesefremgangsmåtene som er beskrevet i eksemplene, og de ble anvendt som referansesubstanser til sammenligning ved evalueringen av biologisk aktivitet. Her refererer a-GC til (2S,3S,4R)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-heksakosanoylamino)-l,3,4-oktadekantriol, NH til (2S,3S,4R)-l-0-(2-amino-2-deoksi-a-D-galaktosyl)-2-(N-heksakosanoylamino)-l,3,4-oktadekantriol og 3,4D til (2S)-l-0-(a-D-galaktosyl)-2-(N-tetrakosanoylamino)-l-oktadekanol. Strukturformlene og spektraldata til disse forbindelsene er vist nedenfor.

Sammenlignin<g>seksempel 1: ( 2S, 3S. 4R)- l- 0-( 2- deoksi- 2- amino- 2- deoksi- q- D-galaktosylV2-( N- heksakosanovlamino)- l . 3. 4- oktadekantriol ( forbindelse 35:NH) TLC: Rf =0.67 (t-BuOH:CH3OH:H20=4:l:l). 'H-NMR (CDC13:CD30D:D20=3:1:0.1): 5.10 (d, 1H, J = 3.5 Hz), 3.47-3.94 (m, 11H), 2.24 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.26-1.54 (m, 72H), 0.88 (m, 6H). MS (ESI) m/z: 857.7 (M+H<+>).

Sammenlignineseksempel 2: ( 2S. 3S. 4RVl- 0-( a- D- galaktosvl)- 2-( N-heksakosanovlamino)- 1. 3. 4- oktadekantriol ( forbindelse 36:ot- GC)

TLC: Rf = 0.75 (CHCl3:MeOH=3:l). 'H-NMR (CDC13:CD30D =3:1): 4.90 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 3.56-3.90 (m, 11H), 2.21 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.27-1.61 (m, 72H), 0.89 (m, 6H). MS (ESI) m/z: 880.7 (M+H<+>).

Sammenlignin<g>seksempel 3: ( 2S)- 1 - 0-( a- D- galaktosvl)- 2-( N- tetrakosanovlamino)-1. 3. 4- oktadekanol ( forbindelse 37:3. 4D)

TLC: Rf = 0.48 (CHCl3:MeOH=7:l). 'H-NMR (CDC13:CD30D =3:1): 4.90 (d, 1H, J = 3.3 Hz), 3.42-3.95 (m, 9H), 2.19 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.27-1.62 (m, 72H), 0.89 (m, 6H). MS (MALDI) m/z: 820.74 (M+Na<+>).

Evaluering av biologisk aktivitet

Den biologiske aktiviteten til forbindelsene som er syntetisert slik som beskrevet over, ble evaluert ved anvendelse av fremgangsmåtene som er beskrevet nedenfor.

Først ble de syntetiserte glykolipidene [forbindelse 25 og a-GC (forbindelse 36)] anvendt og et inhiberingsstudie for eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) ble gjennomført.

6-8 uker gamle hunnmus C57BL6J(B6) ble immunisert nederst i halen ("at the base of the tail") ved anvendelse av en emulsjon av 100 ul peptid (sekvensen nr. 1) som korres-ponderer til aminosyreresidiene 35-55 i myelinoligodendrocyttglykoproteinet (MOG) i kombinasjon med død Mycobakterium tuberculosis (H37Ra). 200 ng kikhostetoksin ble administrert via en halevene samme dag og 200 ng kikhostetoksin ble administrert intraperitonealt 48 timer etter inokkuleringen for å indusere EAE. Kliniske observasjoner og patologisk studie ble gjennomført. Syntetiserte glykolipider ble administrert oralt (400 ng/kg). Kun DMSO (dimetylsulfoksid) ble administrert til kontrollgruppen.

Resultatene er vist i tabell 1. De kliniske og patologiske scorene som er beskrevet nedenfor ble anvendt i evalueringene.

Kliniske scores: 0: normal, 1: nedgang i haletonisitet, 2: kraftløs hale ("limp tail") og ustabil gange, 3: mild svakhet i baklem, 4: fullstendig svakhet i baklem, 5: lammelse i for- og baklemmer, 6: død.

Patologiske scores: 0: normal, 1: leptomeningitt og tilstøtende subpial celleinfiltrering, 2: mildt perivaskulært slag ("cuffing"), 3: omfattende perivaskulært slag, 4: cerebral parenkymal celleinfiltrering.

En EAE supressjonseffekt ble observert i gruppen som var behandlet med forbindelse 25, men det ble ikke observert noen supressjonseffekt i gruppen som var behandlet med a-GC. Supressjonseffekten ble observert i gruppen som var behandlet med forbindelse 25, til og med i den patologiske testen. Da EAE-supressjonseffekten som skyldes forbindelse 25 ble ikke observert i NKT knockout-mus (TCR J alfa 281 knockout-mus), NKT-celler ble antatt å være involvert i virkningen.

Deretter ble EAE indusert ved anvendelse av fremgangsmåten som er beskrevet i den tidligere nevnte autoimmune encefalomyelitt (EAE) supressjonstesten, og EAE supressjonseffekten til intraperitoneal administrering av forbindelse 25 (100 ug/kg) ble stu-dert. Resultatene er vist i figur 3. Resultatene viser at intraperitoneal administrering har liknende EAE supressjonseffekt som oral behandling.

Deretter ble de syntetiserte glykolipidene (forbindelse 25 og a-GC) og DMSO anvendt for å studere mekanismen til supressjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

(EAE).

EAE ble indusert ved anvendelse av fremgangsmåten som er beskrevet over, og rollen til IL-4 i EAE-supressjonseffekten som er assosiert med administrering av forbindelse 25 ble undersøkt. Anti-IL-4 antistoff (1 mg/ml) ble administrert intraperitonealt simultant. Resultatene er vist i tabell 2.

EAE-supressjonseffekten som oppnås ved administrering av forbindelse 25 forsvant når anti-IL-4 antistoff ble administrert, hvilket indikerer at IL-4 er viktig i EAE-supressjon.

Deretter ble en kollagen-artritt (CIA) supressjonstest gjennomført. Resultatene er vist i figur 4.

A) 6-8 uker gamle C57BL6 hannmus ble immunisert nederst i halen ved anvendelse av en emulsjon av 100 ul av et tri Typell kollagen i kombinasjon med død Mycobakterium tuberculosis (H37Ra). På dag 21 ble musene ytterligere immunisert ved anvendelse av samme emulsjon, og kliniske tegn ble observert. De syntetiserte glykolipidene (500 ug/kg) ble administrert intraperitonealt to ganger pr. uke fra tiden for den ekstra immuniseringen. Kontrollgruppen fikk kun DMSO.

Klinisk score: 0: ingen tegn, 1: opphovning og rødhet observert i et lite ledd slik som fingerledd, 2: opphovning og rødhet observert i minst 2 små ledd eller relativt stort ledd slik som håndledd og ankler, 3: opphovning og rødhet observert i en hel hånd eller fot, 4: maksimal opphovning i en hel hånd eller fot. Scoret representerer en total for begge hender og føtter. En supressjonseffekt ble observert ved administrering av forbindelse 25 til B6-mus med kollagen-indusert artritt. B) 6-8 uker gamle S JL-hannmus ble immunisert nederst i halen ved anvendelse av en emulsjon av 200 ul av en bovin Typell kollagen i kombinasjon med død Mycobakterium tuberculosis (H37Ra). På dag 21 ble musene ytterligere immunisert ved anvendelse av samme emulsjon, og kliniske tegn ble observert. De syntetiserte glykolipidene (500 ug/kg) ble administrert intraperitonealt to ganger pr. uke fra tiden til den ekstra immuniseringen. Kontrollgruppen fikk kun DMSO. Kollagen-indusert artritt i SJL-mus ble effektivt supressert ved administrering av forbindelse 25. C) 6-8 uker gamle SJL-hannmus ble immunisert nederst i halen ved anvendelse av en emulsjon av 200 fil av et bovint Typell kollagen i kombinasjon med død Mycobakterium tuberculosis (H37Ra). På dag 21 ble musene ytterligere immunisert ved anvendelse av samme emulsjon, og kliniske tegn ble observert. De syntetiserte glykolipidene (500 ug/kg) ble administrert intraperitonealt to ganger pr. uke fra tiden til den ekstra immuniseringen eller 28 dager fra symptomene dukket opp. Kontrollgruppen fikk kun DMSO. Kollagen-indusert artritt ble effektivt undertrykt ved administrering av forbindelse 25 når symptomer viste seg.

Deretter ble en supressjonstest for diabetes-forekomst gjennomført ved anvendelse av NOD-mus. Resultatene er vist i figur 5. Diabetes- forekomsten ble observert å være signifikant supressert ved intraperitoneal administrering av forbindelse 25 (100 ug/kg) to ganger til 4 uker gamle NOD-mus.

Deretter ble cytokinene i blodet målt og resultatene er vist i figur 6. Det er kjent at en stor mengde cytokin frigis til blodet i en kort tidsperiode når NKT-celler stimuleres. Derfor ble serum IFN-y og IL-4 nivåene med forløpt tid målt ved anvendelse av ELISA-fremgangsmåtene når de syntetiserte glykolipidene ble administrert til mus. Som tidligere rapportert, ble IFN-y hovedsakelig dannet ved administrering av a-GC, mens IL-4 hovedsakelig ble dannet ved administrering av forbindelse 25.

Deretter ble miltcelle-prolifereringsreaksjoner målt, og resultatene er vist i figur 7. Murine miltceller ble isolert, og prolifereringsreaksjonen for de syntetiserte glykolipidene ble målt ved anvendelse av tymidin-inkorporering i cellene som indikator. Miltcellene viste signifikant prolifereringsreaksjon mot forbindelse 25.

Deretter ble miltcelle-cytokinmålinger gjennomført, og resultatene er vist i figur 8. Murine miltceller ble isolert og nivåene av INF-y og IL-4 dannelse som skyldes syntetiserte glykolipider ble målt ved anvendelse av ELISA-metoden. IFN-y ble hovedsakelig dannet ved administrering av a-GC men IL-4 ble hovedsakelig dannet ved administrering av forbindelse 25, slik som observert ved behandling av mus.

Deretter ble miltcelle-prolifereringsreaksjoner og cytokin-målinger gjennomført, og resultatene er vist i figur 9. Murine miltceller ble isolert, og prolifereringsreaksjonene for syntetiserte glykolipider ble målt ved anvendelse av tymidin-inkorporering i cellene som indikator. Signifikant miltcelle-prolifereringsreaksjon ble vist med forbindelsene 23,24 og 25. Murine miltceller ble isolert og nivåene av INF-y og IL-4-dannelse som skyldes de syntetiserte glykolipidene, ble målt ved anvendelse av ELISA-metoden. IFN-y ble hovedsakelig dannet ved administrering av a-GC, men IL-4 ble hovedsakelig dannet ved administrering av forbindelsene 23,24 og 25.

Deretter ble serum anti-MOG antistoff-målinger gjennomført, og resultatene er vist i figur 10. ELISA-metoden ble anvendt for å måle nivåene til anti-MOG antistoff og dets isotype i gruppen som er behandlet, ved anvendelse av syntetiserte glykolipider. Anti-MOG antistoffnivået steg i gruppen som ble behandlet med forbindelse 25. Hva isoty-pen angår, steg IgGl nivåene signifikant og indikerer at reaksjonen på MOG ble for-skjøvet ("biased") mot Th2.

Claims (8)

1. Glykolipid karakterisert ved at det er representert ved formel (I) nedenfor i hvori R<1> er en aldopyranose-gruppe, R<2> er et hydrogenatom eller en hydroksylgruppe, R<3> er -CH2", -CH(OH)-CH2' eller -CH=CH", R<4> er et hydrogenatom eller CH3, x er 0-35, y og z representerer heltall som oppfyller y + z = 0-3.

2. Glykolipidet ifølge krav 1 karakterisert ved at R<1> er a-D-galaktopyranosyl.

3. Glykolipidet ifølge krav 2 karakterisert ved at R<3> er -CH2<-> eller -CH(OH)-CH2" og x er 10-32.

4. Glykolipidet ifølge krav 3 karakterisert ved at R<3> er -CH(OH)-CH2<-.>

5. Glykolipidet ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 karakterisert ved at R<2> og R<4> er hydrogenatomer, x er 11-23 og z er 0.

6. Medisin for autoimmun sykdom karakterisert ved at den omfatter glykolipidet ifølge hvilket som helst av kravene 1-5 som aktiv bestanddel.

7. Medisin for sykdommene hvor Thl/Th2 immunbalansen er forskjøvet mot Thl bias eller sykdommer hvori Thl-celler forverrer de patologiske tilstandene karakterisert ved at den omfatter glykolipidet ifølge hvilket som helst av kravene 1-5 som aktiv bestanddel.

8. Induserer av selektiv IL-4 produksjon karakterisert v e d at den omfatter glykolipidet ifølge hvilket som helst av kravene 1-5 som aktiv bestanddel.