NO321705B1 - Vaksiner med modifiserte meningokokk/polysakkarid-konjugater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår kjemisk modifiserte gruppe B polysakkarider av Neisseria mengitidis som angitt i krav 1. Oppfinnelsen gir også vaksiner hvor de respektive modifiserte polysakkarider er konjugert til en proteinbærer som angitt i krav 24.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Meningitt forårsaket av gruppe B N. meninqitidis og E. coli Kl fortsetter å være hovedhelseproblemer i verden. Gruppe B meningitt opptrer i både endemiske og epidemiske situasjo-ner og utgjør omtrent halvdelen av alle nedtegnede tilfel-ler av meningokokkal meningitt, mens Kl-positive E. coli er hovedårsaken til meningitt i neonater. For tiden finnes det ingen vaksine kommersielt tilgjengelig mot sykdom forårsaket av gruppe B meningokokker og E. coli Kl. Dette er for en stor del bundet det faktum at gruppe B meningokokkal polysakkarid (GBMP) er kun dårlig immunogent i mennesker. Denne dårlige immunogenisitet av nativt GBMP og resulterende immuntoleranse har blitt postulert å være grunnet tilstedeværelsen av en vanlig epitop i humant og dyrevev. Det finnes enkelte nylig rapporterte kandidatvaksiner basert på komplekser av GBMP med ytremembranproteiner, men er enda intet klart bevis for deres effitivitet i mennesker.

Nylig har et nytt konsept av en vaksine basert på et synte-tisk kjemisk modifisert (N-propionylert) gruppe B polysakkarid-protein (N-Pr-GBMP-protein) konjugat blitt utviklet. Vaksinen induserer i mus høye titrer av IgG-antistoff, som ikke bare er beskyttende, men kryssreagerer også med umodi-fisert GBMP (dvs. N-acetyl-GBMP). Dette konsept er beskrevet og krevd i US patent Nr. 4,727,136, utstedt 23. februar 1988 til Harold J. Jennings, et al.

Det har blitt utledet at en vaksine som fremskaffer kryssreaktive antistoff, så som den beskrevet i US patent 4,727,136, bare kan være virksom på bekostning av brytende immuntoleranse. Denne hypotese blir godt gjort på identifi-kasjonen av en felles epitop, bestående av en kjede av a-(2-8)-bundede sialsyreresiduer (med et minimumskrav på ti residuer) i både den native N-Ac-GBMP og i humant og dyrevev (Jennings, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989, Vol. 10, 151-165). Disse polysialosylkjeder virker som utviklende antigener og har for det meste vært assosiert med den føtale tilstand i embryonisk neural celleadhe-sjon (Finne et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, 112, 482). I løpet av post-natal utvikling, blir dette an-tigenet nedregulert (Friedlander et al, J. Cell Biol., 1985, 101, 412), men blir uttrykt i voksne mennesker i lø-pet av regenerering av syke muskler (Cashman et al, Ann. Neuron., 1987, 21, 481) i tumorceller (Roth et al, Proe. Nati. Acad. Sei., 1988, 85, 299) og i naturlige dreper (NK) og CD3<+>T-celler (Husmann et al, Eur. J. Immunol., 1989, 19, 1761). Selv om konsekvensene med å bryte toleranse ovenfor disse føtale antigener enda ikke har blitt etablert, er det ønskelig å utvikle vaksiner som har redusert immunogenisitet for humane epitopér.

Følgelig er et mål for foreliggende oppfinnelse å utvikle modifiserte gruppe B meningokokkale polysakkarider, som er immunogene, men likevel induserer antistoff som har redusert kryssreaktivitet med native epitoper hos vertsorganis-men. Det er et annet mål å fremskaffe polysakkarid-proteinkonjugater som omfatter disse modifiserte polysakkarider. Et annet mål for foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe vaksiner med immunogene egenskaper som oppviser vesentlig redusert kryssreaktivitet med GBMP.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer generelt kjemisk modifiserte gruppe B polysakkarider av Neisseria meningitidis. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også vaksiner hvor de respektive modifiserte polysakkarider er konjugert til et proteinbæremateriale.

Spesielt fremskaffer foreliggende oppfinnelse umettede gruppe B N-acylderivat polysakkarider av N. meninqitidis, konjugater av det umettede N-acylderivat polysakkarid som angitt i krav 1, kovalent bundet til proteiner, farmasøy-tiske blandinger omfattende konjugatmolekyler av N. meningitidis av slike umettede N-acylderivat polysakkarider, samt bruk av disse sammensetninger til fremstilling av vaksiner.

I et aspekt av oppfinnelsen, er det fremskaffet et modifisert B-polysakkarid av N. meninqitidis med sialsyreresiduum N-acetyl (C2) -grupper erstattet med en umettet C3-4-acyl-gruppe.

I et annet aspekt er det fremskaffet et antigent konjugat omfattende umettede C2-4 N-acylderivatpolysakkarider konjugert til et immunogent egnet protein, som har øket immunogenisitet sammenlignet med native polysakkarider med redusert induksjon av kryssreaktive antistoff.

I et ytterligere aspekt er det fremskaffet en vaksine omfattende det umettede N-acylderivat polysakkarid-proteinkonjugat i assosiasjon med et egnet bæremateriale eller fortynningsmiddel. Vaksinene ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en terapeutisk effektiv mengde av en adjuvant som er egnet for humant bruk, for eksempel aluminumfosfat, aluminumhydroksyd eller stearyltyrosin.

Den aktuelle vaksinen kan brukes til å immunisere pattedyr mot N. meninqitidis og E. coli Kl-infeksjoner. Vaksinen blir typisk tilført i en mengde på omkring 1 til 50 mikrogram per kilogram kroppsvekt, for eksempel 5 til 25 mikrogram per kilogram

kroppsvekt.

I enda et ytterligere aspekt fremskaffer oppfinnelsen serum og en gamma globulinfraksjon som er i stand til å beskytte mot meningitt forårsaket av gruppe B N. meninqitidis og E. coli Kl. Fraksjonen fremstilles ved å immunisere pattedyr med en vaksine ifølge oppfinnelsen og fortrinnsvis avskil-ler gamma globulinfraksjonen fra immunserumet. Fraksjonen blir så tilført et individ for å gi beskyttelse mot eller behandle pågående infeksjon forårsaket av de ovennevnte organismer. Fra dette vil det bli forstått at de immunogene vaksine-konjugater ifølge oppfinnelsen vil være en kilde for terapeutisk antiserum i lys av deres gunstige immunogenisitet med minimal induksjon av GBMP-kryssreaktive antistoff. Konjugatene ifølge oppfinnelsen vil også være anvendelige for å fremskaffe monoklonale antistoff, og eventuelt antidiotype antistoff.

Søker har funnet at det meste av de baktericide og beskyttende antistoff indusert av N-Pr-GBMP-proteinkonjugat beskrevet i de ovenfor angitte Jennings et al US patent 4,727,136 ikke er assosiert med i GBMP-kryssreaktive antistoff. Faktisk er mesteparten av den beskyttende aktivitet inneholdt i en N-Pr-GBMP-spesifikk antistoffpopulasjon som ikke kryssreagerer med GBMP. I lys av dette er det antatt at N-Pr-GBMP etterlater en enestående baktericidepiton på overflaten av gruppe B meningokokker.

Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen at det er mulig å syntesere kjemisk modifiserte GBMP, som etterlater den baktericideepitop, og som i sin konjugerte form ikke bare oppviser øket immunogenisitet, men også unngår i hovedsak induksjonen av antistoff som kryssreagerer med GBMP.

Ved å komme frem til foreliggende oppfinnelse har forskjellige kjemisk modifiserte GBMP blitt syntetisert og konjugert individuelt til protein, fulgt av injeksjon av konjugatene i mus og effektene er sammenlignet med dem dannet av N-Pr-GBMP-proteinkonjugatet. Overraskende har det nå blitt funnet at tilstedeværelsen av en umettet binding i N-acyl-enheten resulterer i spesielt immunogene konjugater.

Disse og andre trekk av oppfinnelsen vil bli bedre forstått gjennom en studie av den følgende detaljerte beskrivelse av en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer generelt nye gruppe B Neisseria meningitidis umettede N-acylderivat polysakkarider, nye konjugater av de gruppe B umetted N-acylderivater, farmasøytiske sammensetninger omfattende konjugat-molekyler av gruppe B Neisseria meninqitidis umettede N-acylderivat polysakkaridfragmenter kovalent bundet til proteiner, samt bruken av disse sammensetninger til fremstilling av vaksiner.

Foreliggende oppfinnelse angår gruppe B N. mengingitidis umettede N-acylderivat polysakkarider av formel (I):

hvor Ri er en C2-C4 umettet alkylgruppe omfattende minst en dobbeltbinding.

I en utførelsesform av oppfinnelsen har Ri av formel I tre, eller fire karbonatomer og to ikke-sidestilte dobbeltbindinger.

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen er Ri av formel I to, tre eller fire karbonatomer og karbonatomet som ligger fjernest fra acylkarbonet er bundet via en dobbeltbinding.

Spesielle, men ikke begrensende eksempler på modifisert gruppe B meningokokkale polysakkarid N-acylderivat polysakkarider av formel I som er anvendelige i foreliggende oppfinnelse, innbefatter de følgende: N-penteneoyl (CH2=CH-CH2-CH2-CONH-) ; og N-krotonoyl (3-buteneoyl) (CH2=CH-CH2-CONH-) .

Det gruppe B meningokokkale polysakkarid isoleres fra N. meningitidis ved metoder som er velkjent innen faget. I en slik metode blir gruppe B meningokokker (stamme 981B) dyrket ved 37 °C i en fermentor ved å bruke 30 g dehydrert Todd Hewitt Broth (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) per liter destillert vann. Før fermentorvekst ble den fry-setørkede stamme dyrket initialt i en lyskrukke ved 37 °C på 5 % (enkelte/enkelte) saueblodagar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) plater. Bakteriene ble så overført til 1,0 liter Todd Hewitt Broth (som ovenfor) i en Erlenmeyerkolbe som ble ristet ved 37 °C i 7 timer ved 190 r.p.m. Dette inokulum ble så overført til fermentoren. Etter fermentorvekst (16 timer) ble bakteriene avlivet ved tilsetning av formalin til en endelig konsentrasjon på 0,75 %. Bakteriene ble fjernet ved kontinuerlig sentrifugering og det gruppe B meningokokkale polysakkarid ble isolert fra supernatanten og renset i hovedsak som beskrevet av Bundle et al, J. Biol. Chem, 249, 4797-4801 (1974), bortsett fra at proteinet ble ekstrahert ved å omrøre en oppløsning av grov-polysakkaridet med kald (4 °C) 90 % fenol istedenfor varm (50-60°C) . Denne sistnevnte prosess sikrer at en høy-molekylvektform av GBMP blir dannet.

E. Coli (018:K1:H7) (NRCC 4283) ble dyrket ved 37°C i en fermentor i destillert vann inneholdende dehydrert hjerne-hjerte-infusjon (BHI; 37 g/liter) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Før fermentorvekst ble den frysetørkede stamme dyrket på 50 ml BHI-oppløsning (samme som ovenfor) i en Erlenmeyerkolbe som ble ristet ved 37 °C i 7 timer ved 200 r.p.m. Dette materiale ble så overført til 1,5 liter BHI (som ovenfor) og dyrket under samme betingelser som beskrevet ovenfor i 7 timer. Inokulumet ble så overført til fermentoren.

Fremgangsmåtene anvendt ved isolering og opprensning av det kapsulære polysakkarid fra E. coli Kl var identiske med dem beskrevet ovenfor for isoleringen av gruppen B meningokok-kalt polysakkarid.

Det vil bli forstått at isolerings- og opprensningsfrem-gangsmåtene beskrevet ovenfor ikke er den eneste som kan bli benyttet, og at andre publiserte fremgangsmåter er til-gjengelige, for eksempel dem beskrevet av Watson et al, J. Immunol., 81, 331 (1958) og i det ovenfor nevnte US patent 4,727,136.

Det native polysakkarid er N-deacetylert for å gi en reak-tiv amingruppe i sialsyreresiduumdelene av molekylet. N-deacetyleringen kan bli utført med enhver kjent metode, for eksempel i et basisk vandig medium ved høy temperatur, for eksempel omkring 90 °C til 110 °C, og ved en pH omkring 13 til 14. Det basiske vandige medium er passende en vandig alkalmetall hydroksidoppløsning, for eksempel natrium-»hydroksid med omkring 2M-konsentrasjon. Alternativt kan hydrasin i vandig oppløsning bli benyttet. Graden av N-deacetylering kan variere fra omkring 30 % til 100 % avhengig av betingelsene. Det er foretrukket å oppnå omkring 90 til 100 % N-deacetylering. N-deacetylert produkt kan bli gjen-vunnet for eksempel ved avkjøling, nøytralisering, opprensning om ønsket, og frysetørking.

Som et resultat av N-deacetylering blir fragmenter av polysakkaridet vanligvis dannet med en gjennomsnittlig molekylvekt i området fra omkring 3.000 til 50.000 dalton. For bruk i foreliggende oppfinnelse kan fragmenter eller polysakkarider av full lengde bli anvendt.

De N-deacetylerte polysakkaridfragmenter eller polysakkarider av full lengde blir så N-acylert for å gi det tilsvarende N-acylerte produkt. N-acyleringen kan bli utført ved å oppløse det N-deacetylerte polysakkarid i et vandig buf-ret medium med en pH på omkring 7,5 til 9,0, fulgt av tilsetning av det passende mettede acylanhydrid, eventuelt med en alkohol for å øke oppløseligheten, og avkjøling til under' 10 °C inntil reaksjonen er fullstendig. Om ønsket kan reaksjonsmedium bli renset. Ikke-begrensende eksempler på opprensningsmetoder som kan bli benyttet, innbefatter dialyse fulgt av gjenvinning av det N-acylerte produkt ved frysetørking. Reaksjonen er i hovedsak fullstendig i løpet av omkring i 10 til 20 timer. N-acyleringsgraden, som målt med analytiske teknikker, typisk ^-nmr, er minst 90 % og mer sannsynlig nær 100 %. N-acyleringsreaksjonen resulterer ikke i noen signifikant reduksjon i molekylvekt av fragmen-tene.

Konjugatmolekylene ifølge oppfinnelsen har formelen II hvor R2 er en umettet C<2>"<4->acylgruppe. Konjugatene kan føl-gelig omfatte de umettede polysakkarider ifølge foreliggende oppfinnelse og kan også innbefatte et akryloylderi-vat.

Det er foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse å velge ut for konjugeringsformål det C2-4 N-acylerte materiale med en gjennomsnittlig molekylvekt tilsvarende omkring 10 til 200 sialsyreresiduer. Således er et foretrukket konjugat N-acryloyl (2-propeneoyl) derivat. Dette blir generelt oppnådd ved hjelp av gelfiltrering av det N-acylerte GBMP ved å bruke en Ultragel varemerke AcA-44 (Kulediameter 60-140 pm) kolonne, ved å bruke PBS som e1ueringsmidde1. Alternativt kan en egnet størrelsesekskluderende membran bli benyttet.

Umettet N-acylert materiale med gjennomsnittlig molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, for eksempel 10.000 til 15.000 dalton, blir fortrinnsvis anvendt for oppfinnelsen. Dette blir oppnådd ved å samle opp fraksjonene av eluatet av kolonnen inneholdende N-acylert GBMP-materiale med dette gjennomsnittlige molekylvektsområde. N-acylert materiale med høyere gjennomsnittlig molekylvekt, for eksempel i området 30.000 til 40.000 dalton, har også vist seg å være anvendelig i henhold til oppfinnelsen.

Det molare forhold mellom polysakkarid og protein i konjugatmolekylene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis mellom 1 mol protein til 20 mol polysakkarid. Mer foretrukket er forholdet mellom 1 mol protein og omkring 2-15 mol polysakkarid. Mest foretrukket er forholdet omkring 1 mol protein og 4 til 7 mol polysakkarid. Variasjoner i protein/polysakkarid forhold kan bli oppnådd ved å justere forholdet mellom utgangskomponenter i konjugeringsreaksjonen.

I tillegg til å gi konjugatmolekyler omfattende umettede N-acylderivat polysakkarider konjugert til protein, kontem-plerer foreliggende oppfinnelse også multivalente konjugater og deres vaksiner hvor forskjellige typer polysakkarider er konjugert til et enkelt protein.

Vaksinene ifølge oppfinnelsen blir dannet ved å konjugere det umettede N-acylerte polysakkarid med et immunologisk egnet bæreprotein. Fortrinnsvis er bæreproteinet i seg selv et immunogen. Ikke-begrensende eksempler på passende bære-proteiner er bakterielle proteiner, eller polypeptider innbefattende tetanustoksoid, difteritoksoid, kryssreagerende materialer (CRM) , fortrinnsvis CRM197 (fremskaffet fra Scla-vo Ltd., Siena, Italy), og bakterielle proteinbærere, så som meningokokkale ytremembranproteiner.

Enhver konjugeringsmetode kan bli benyttet for å konjugere de modifiserte polysakkaridfragmenter til bæreproteinet. En foretrukket metode er den beskrevet i US patent 4,356,170, dvs. ved å innføre terminale aldehydgrupper (via oksidering av cis-hosliggende hydroksylgruppe) i det N-acylerte polysakkarid og kobler aldehydgruppene til proteinaminogruppene ved reduktiv aminering. Polysakkaridet og proteinet blir derved bundet via en -CH2~NH-proteinbinding.

Det må imidlertid bli forstått at konjugatvaksiner ifølge oppfinnelsen ikke er begrenset til dem dannet via reduktivt aminering. Således kan vaksinene også blir dannet ved å konjugere det N-acylerte polysakkarid med bæreproteinet ved å bruke et adipin-dihydrasid avstandsgivende bindeledd, som beskrevet av Schneerson, R., et al, Preparation Characte-rization and Immnuogenicity of Haemophilus influenzae type b Polysaccharide-Protein Conjugates, J. Exp. Med., 1952, 361-476 (1980), og i US patent 4,644,059 til Lance K. Gor-don. Alternativt kan den binære avstandsholderteknologi utviklet av Merck bli brukt, som beskrevet av Marburg, S., et al, "Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meninqitidis Membrane Protein", J. Am. Chem. Soc, 108, 5282-5287

(1986) eller, muligens metoden med reduserende ender.

Konjugatmolekylene fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter typisk et protein til hvilket det er bundet minst et meningokokkal polysakkaridfragment ifølge foreliggende oppfinnelse via et enkeltbindingssete ved den terminale ende av stammen av polysakkaridfragmentet. Således fremskaffer foreliggende oppfinnelse muligheten, om

ønsket, å danne meningokokkal konjugatmolekylet hvor poly-sakkaridkomponenten, bortsett fra for en ende, ikke er dek-ket av protein. Andre metoder for konjugering av meningokokkale polysakkarider til protein via de terminale sialsyrer av grenene kan resultere i kryssbinding og fes-ting av polysakkarid til protein ved et antall seter. Foreliggende oppfinnelse angår også konjugatmolekyler som kan bli dannet ved å bruke en kombinasjonsmetode.

Det resulterende N-acylerte polysakkarid-proteinkonjugater som ikke har vesentlig kryssbinding, er oppløselige i vandige oppløsninger. Dette gjør disse konjugater ifølge oppfinnelsen, spesielt gode kandidater for vaksinebruk.

Et resulterende umettet N-acylert-polysakkarid-proteinkonjugat ifølge oppfinnelsen har blitt undersøkt i in vitro forsøk på mus, og har blitt vist å ha forbedrede immunogene egenskaper sammenlignet med det N-propionylerte polysakkarid. I tillegg blir vesentlig redusert dannelse av kryssreaktive antistoff observert. I tillegg viste det umettede konjugat uventet høye baktericide titrer sammenlignet med andre undersøkte konjugater. I lys av dette er det antatt at vaksinene ifølge oppfinnelsen vil være anvendelige mot meningitt forårsaket av gruppe B N. meninqitidis eller av E. coli Kl-organismer. Av spesiell interesse er vaksiner for å beskytte menneskebarn som er mest mottakelige for bakteriell meningitt.

Vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte standard bærematerialer, buffere eller preservativer kjent for fagmannen som er egnet for vaksiner. I tillegg kan adjuvanter så som alun eller stearyltyrosin bli inkludert i formu-leringen for å øke den immunogene respons.

Vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse blir typisk dannet ved å dispergere konjugatet i ethvert egnet farmasøy-tisk akseptabelt bæremateriale, så som fysiologisk saltvann eller andre injiserbare væsker. Tilførselen av vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli utført med enhver av de velkjente metoder, innbefattende, men ikke begrenset til, subkutant, intraperitonealt eller intramuskulært. Den foretrukne tilføringsmetode av vaksinen er parenteral til-førsel. Additiver som vanligvis finnes i vaksiner, kan også være tilstede, for eksempel stabilisatorer så som laktose eller sorbitol og adjuvanter så som aluminumfosfat, hydrok-sid eller sulfat.

Vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse tilføres i meng-der som er tilstrekkelig for å gi en immunogen respons. Typisk er en dose på mellom 1 og 50 ug polysakkarid effektivt for å danne en slik respons. Doser kan bli justert basert på størrelse, vekt eller alder av individet som mottar vaksinen. Antistoffresponsen i et individ kan bli overvåket ved å undersøke for antistofftiter eller baktericidaktivi-tet, og forsterket om nødvendig for å øke responsen.

En passende dose for vaksinen for menneskebarn ligger generelt innenfor området omkring 5 til 25 mikrogram, eller omkring 1 til 10 mikrogram per kilogram kroppsvekt.

EKSEMPLER

Eksemplene heri er ment å eksemplifisere de forskjellige aspekter ved utførelse av oppfinnelsen og er ikke ment å begrense omfanget av oppfinnelsen på noen måter.

EKSEMPEL 1

Syntese av H-acryloylert GBMP

Syntese av N-acryloylert GBMP er beskrevet i Roy R. et al., Glvcoconjuqate J. (1990) 7:3-12. N-deacteylert GBMP (150 mg) ble oppløst i 2,0 ml destillert vann. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og behandlet med 50 ul(l eq) porsjoner av acryloylklorid (Aldrich Chemical Co.) med et totale på 500 pl. pH av oppløsningen ble holdt ved pH 8,5 med 4M NaOH ved å bruke en autotitreringsenhet. Etter fullstendig tilsetning av syrekloridet (2 timer), ble pH øket til 12 og holdt ved dette nivå i 30 minutter. Materialet ble renset med ut-tømmende dialyse mot destillert vann ved 4°C, fulgt av fry-setørking til 163 mg. H-NMR av materialet viste 100 % N-acylering med det passende integreringsmønster for acryloylsubstituenten.

EKSEMPEL 2

Aktivering av N-acryloylert GBMP

N-acryloylert GBMP (150 mg) ble oppløst i destillert vann (1,25 ml), fulgt av tilsetning av 3,75 ml av en 0,2M opp-løsning (ca 50 eq) NalO^ i vann. Oppløsningen ble holdt i mørket ved romtemperatur i 1 time, fulgt av tilsetning av etylenglykol (400 ul, 10 eq). Etter 1 time ved romtemperatur ble oppløsningen påført direkte på en Sephadex G-10 (1,6 x 100) kolonne ekvilibrert i vann (Pharmacia Fine Che-micals) . Det aktiverte produkt ble eluert fra kolonnen i nullvolum toppen, som ble samlet opp og frysetørket. Det oksiderte produkt ble så fraksjonert på en BioGel A.5 kolonne (1,6 x 100) (BioRad) ekvilibrert i fosfatbufferet fysiologisk saltvann (pH 7,6). Molekylvektsammenslåinger ble foretatt basert på HPLC (høyeffekt væskekromatografi) analyse (Pharmacia-Superose 12-kolonne) av utvalgte fraksjoner fra det eluerte materialet. Sammenligningen av den relative Kav-verdi for hver fraksjon ved en tidligere konstruert ka-librerings kurve ga mulighet for utvelgelse av enkeltstående llKD-fraksjoner av oksidert acryloylert GBMP. Fraksjonene ble renset med dialyse som beskrevet ovenfor. H-NMR-spektroskopi av det fraksjonerte materiale var konsistent med oksidert N-acryloylert GBMP.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av et tetanustoksoidkonjugat av N-acryloylert

GBMP

Ferskt renset tetanustoksoidmonomer (TT-m; 3,5 mg) ble kom-binert i et Pierce reakti-beger med 10,5 mg av en 11 KD-fraksjon av oksidert acryloylert GBMP. Natriumcyanobor-hydrid (7,0 mg) ble tilsatt og blandingen ble oppløst i 233 ul av fosfatbuffer (0,1 M, pH 7,5). Oppløsningen ble inkubert ved 37°C over et totale på fem dager. Periodisk ble konjugeringen overvåket med størrelsesutskillende HPLC (Superose-12, Pharmacia) for å anskueliggjøre skiftet til høy-ere molekylvekt ettersom konjugeringen skred frem. Slutt-konjugatet ble renset fra utgangsmaterialene ved fraksjone-ring over en BioGel A.5 kolonne ekvilibrert i PBS, fulgt av dialyse, og frysetørking. Kolorimetrisk analyse for totalt sialsyreinnhold (Svennerholm-metode) og protein (BCA-metode, Pierce) indikerte konjugater som inneholdt mellom 12-30 % sialsyre.

EKSEMPEL 4

Immunisering av mus

Typisk ble 10 CFl-hunnmus (8-10 uker gamle) immunisert intraperitonealt (0,2 ml) med en mengde av konjugat som til-svarte 2 pg av sialsyre, med eller uten tilsetning av adjuvanter så som alun (alhydrogel, Superfos Blosektor) eller RIBIs fullstendige eller komponent adjuvantsystem (RIBI im-munochem). Den opprinnelige vaksinering ble fulgt av for-sterkningsvaksineringer på dag 21 og dag 35, fulgt av avlivning på dag 45. Blodet ble samlet opp-via hjertepunktur og serumet ble lagret i alikvoter ved -86°C.

EKSEMPEL 5

Bakterleidassay

Baktericidassay ble utført i vevskultur i 96 brønners mikrotiterplater (Corning). Alle antisera ble varme-inak-tivert ved 56 °C i 30 minutter før bruk. Gruppe B meningo-kokkus (stamme 80-165 B:2b:p.l) ble dyrket over natten på sjokoladeagarplater (QueLab) ved 37°C under en 5 % CO2- at-mosfære, fulgt av inokulering av en andre plate og inokulering av denne i fem timer. De passende fortynninger av antisera ble foretatt direkte i platen ved å bruke Hanks balansert saltoppløsning (HBSS) som fortynningsmiddel for å gi et endelig volum på 50 pl per brønn. En suspensjon av GBM i HBSS ble foretatt, noe som ga en O.D. (X58o) =0,1 ab-sorbans. Denne suspensjon ble fortynnet 40.000 ganger i HBSS for å gi den endelige arbeidsfortynning av bakterie for assayet. Ferskt tint babykanin-komplement (Pel-Freeze Biologicals) ble tilsatt (20 pl) til hver brønn, fulgt av 30 pl av arbeidsfortynningen av bakterie. Platen ble så ristet ved 37°C i en time. Innholdet av hver brønn ble blandet før dyrking (35 pl) på sjokoladeagarplater. Platene ble så inkubert over natten ved 37°C/5 % CO2 og antallet kolonidannede enheter (CFU) ble talt opp. Den prosentvise avlivning ble bestemt i forhold til gjennomsnittsverdiene av hver HBSS-kontrollbrønn eller et irrelevant antiserum på følgende måte: % avlivning <=> (CFU)c0ntroll-CFUantiseru»/CFUkontroll) x 100

EKSEMPEL 6

Passivt beskyttelsesassay

Musantisera fremskaffet fra N-acyl GBMT-TT-immuniseringene ble typisk fortynnet i sterilt fysiologisk saltvann eller PBS (fosfatbufferet fysiologisk saltvann). Grupper av fem CFl-hunnmus (8-10 uker gamle) ble injisert intravenøst med 200 ul av de fortynnede antisera. Etter en time ble hver gruppe av mus utsatt for en intraperitonealt injeksjon (500 ul; 800-1200 CFU/ml) av en suspensjon av gruppe B Neisseria meningitidis (GMB 80165 B:2b:P.l). Etter fem timer ble blodet samlet inn fra de enkelte mus med hjertepunktur og 10 ul av blodet ble sådd ut på sjokoladeagarplater. Platene ble inkubert ved 37 °C under 5 % CO2 og antallet kolonnidannede enheter (CFU) ble bestemt 15-20 timer senere.

Det passive beskyttelsesassay er basert på reduksjon eller fjerning av bakterier i nærvær av spesifikke antistoff og blir målt i forhold til en kontrollgruppe som mangler spesifikke antistoff. Graden av beskyttelse som blir gitt av et mus N-acyl-GBMP-konjugatserum, er gitt av den prosentvise reduksjon av CFU for hvert antiserum i forhold til et irrelevant kontrollantiserum eller PBS.

EKSEMPEL 7

Syntese og biologisk aktivitet av en vaksine mot Neisseria meningitidis serogruppe B

Den nye konjugatvaksine mot N. meningitidis serogruppe B ble syntetisert, hvor utforming er basert på en enestående modifikasjon av det native polysakkarid. Det native polysakkarid (N-Ac-GBMP) ble derivatisert ved aminoterminalen ved fullstendig substitusjonen av N-acetylgruppene med N-acryloylgrupper (NH-CO-CH=CH2) . Fysiske metoder, så som <X>H og 13C-NMR-spektroskopi karakteriserte med sikkerhet iden-titeten og homogeniteten av det nye materialer og størrel-seseksklusjon-HPLC viste at prosessen ikke endret mole-kylstørrelsen av polysakkaridet via depolymerisering. Konjugater til proteiner ble dannet på en måte som er lik de beskrevne fremgangsmåter. Kort angitt ved å starte fra fremstilling av N-acryloyl-GBM-polysakkaridet, ble to forskjellige porsjoner av N-acryloyl-GBMP-tetanustoksoid konjugater fremstilt. Kolorimetriske analyser av hvert konjugat viste henholdsvis et 13 % og 20 % totalt sialsyre-til-konjugatforhold. <1>H-NMR-spektroskopi av konjugatene viste uendret tilstedeværelse av det modifiserte polysakkarid på proteinet.

I separate dyreforsøk ble N-acroyl-GBMP-TT-konjugatene injisert i mus sammen med enten fysiologisk saltvann, aluminumhydroksyd eller RIBIs fullstendig adjuvant (MPL+TDM+CWS) i et tilfelle, og med RIBIs adjuvant alene i det andre tilfelle. Vaksinene ble tydelig godt tolerert hos mus.

Serologisk undersøkelse av hvert antiserum viste at begge konjugater ga en spesifikk respons som er sammenlignbar eller høyere enn dem observert med N-propionyl-GBMP-TT-konstruksjoner ved å bruke RIBIs adjuvantsystem (Se tabell 1). Foreløpig studier angående kryssreaktiviteten av N-acryloyl-GBMP-TT-antiserum viste resultater som lignet på graden av kryssreaktivitet observert med N-propionyl-GBMP-TT-antiserum (Se tabell 2). En av de to porsjonene av N-acryloyl-GBMP-TT-antiserum viste signifikant mindre kryss-reaksjon til den native GBMP i forhold til en N-propionyl-GBMP-TT-konstruksjon tilført i samme forsøk.

Begge porsjoner av N-acryloyl-GBMP-TT ble undersøkt for sin bakterielle aktivitet mot levende GBM og har vist signifikant aktivitet i forhold til N-propionyl-GBMP-TT-antiserum. Disse resultater er oppsummert i tabeller 1 og 3. Resulta-tene i tabell 1 er produktet av et baktericidassay utført i duplikat og er konsistente med fortynningsverdiene funnet med andre assays utført med samme materialet. Dataene i tabell 1 er konsistente med acryloyl som har spesielt effektivt baktericid aktivitet. Tabell 3 sammenligner den baktericide aktivitet av to porsjoner av N-acryloyl-GBMP-TT-antiserum sammen med N-propionyl-GBMP-TT-antiserum fremskaffet fra samme dyreforsøk. Assayet bruker et 15-ganger stør-re antall bakterier og således ble kun de antisera som viser sterk aktivitet påvist. Fra en sammenligning av N-acryloyl-GBMP-TT-antiserumet med N-propionyl-GBMP-TT-antiserum, kan det bli også observert at de baktericide aktivi-teter er så godt som like.

Passive beskyttelsesstudier ble utført med forskjellige fortynninger, hvorav alle viste signifikant fjerning, noe som således sier beskyttelse hos musene. (Se tabell 1). Sammenligning med N-propionyl-GBMP-TT-antiserumet med forskjellige fortynninger gå igjen nesten identiske resultater. Sammenligning av de to typer N-acryloyl-GBMP-TT- antisera i et passivt beskyttelsesforsøk viste at begge beskyt-tede muser identisk innenfor forsøks feilgrensen. (Se tabell 3) .

EKSEMPEL 8

Ytterligere studier ved å bruke N-acyl-modifiserte GBMP-TT-konjugater: En serie av N-acyl-modifiserte GBM-polysakkarider (N-propionyl-GBMP (NPr), N-butanoyl-GBMP (NBu), N-pentanoyl-GBMP (NPe), og N-acryloyl-GBMP (NAcryl) ble syntetisert i hovedsak som tidligere beskrevet med unntak av å bruke pH-kon-troll for å begrense depolymerisering av polysakkaridene. 1H- og 1<3>C-NMR-spektorskopi tillot fullstendig identifika-sjon av de modifiserte polysakkarider, og det ble bestemt at hvert polysakkarid var 100 % derivatisert. En serie av oksiderte polysakkaridfragmenter med samme molekylvekt (11 KD) var generelt basert på SEC-HPLC profilert utføring på en standard kolonne. Alle av konjugatene var syntetisert under nøyaktig samme betingelser. Kolorimetrisk analyse av konjugatene ga den følgende sialsyreinkorporering: NPr-28 %, NBu-30 %, NPe-18 %, NAcryl-19 %.

Mus ble immunisert med 2 ug sialsyre/konjugat enten i fysiologisk saltvann absorbert på aluminumhydroksyd, eller emulgert i RIBIs adjuvant. Alle av konjugatene ble godt tolerert hos musene uten noe synlige tegn av sykdom.

ELISA-titreringer av de forskjellige antiserum mot homologe polysakkaridantigener er oppsummert i tabell 1. Adjuvanten som ga den høyeste titrer ble funnet å være RIBIs-serien som øker fra N-propionyl til N-pentanoyl, noe som støtter tidligere funn som bruker andre hydrofobe adjuvantsystemer. I et adjuvantsystem så som alun, synes det ikke å være noen tilsvarende tendens i titer. Spesifisitet mot det immuni-serende polysakkarid øker også med økende lengde av acyl-kjeden fra N-propionyl til N-pentanoyl, mest markert i RIBI-serien. (Se tabell 2). Dette resultat er også i sam-svar med tidligere resultater som viste samme tendens. Til tross for økningen i titer og spesifisitet, finnes det ingen assosiert økning i aktivitet mot de native bakterier både i baktericid og passivt produksjonsassay. N-pr-antiserumet viser signifikant høyere baktericide titrer (14-25 ganger høyere) ved 50 og 90 % nivåene i forhold til N-bu og N-pe-antiserumet. Tilsvarende viser passive beskyttelsesstudier ved forskjellige fortynninger av antiserum signifikant fjerning av bakteriene med N-bu og N-pe ved kun den høyeste konsentrasjon, ulik N-pr-antiserumet som viser signifikant fjerning selv ved 1:6 fortynninger.

Claims (30)

1. Modifisert gruppe B meningokokkal polysakkarid hvor N-acetylgruppene er substituert med et N-acylderivat som i formel (I): hvor Ri er en C3-4 umettet alkylgruppe omfattende minst en dobbeltbinding.

2. Polysakkarid ifølge krav 1, hvor Ri er fire karbonato- • mer og har to ikke-sidestilte dobbeltbindinger.

3. Polysakkarid ifølge krav 1, hvor Ri er fire karbonatomer og har en dobbeltbinding.

4. Polysakkarid ifølge krav 1, hvor Ri er tre karbonatomer.

5. Polysakkarid ifølge krav 2, hvor Ri er CH2=CH-CH2-CH2.

6. Polysakkarid ifølge krav 3, hvor Ri er CH2=CH-CH2.

7. Polysakkarid ifølge krav 1, hvor karbonatomet som er fjernest fra acylkarbonatomet er bundet via en dobbeltbinding.

8. Polysakkarid ifølge krav 7, hvor Ri er fire karbonatomer.

9. Polysakkarid ifølge krav 7, hvor Ri er tre karbonatomer.

10. Konjugatmolekyl omfattende minst et polysakkarid som har en struktur av et modifisert gruppe B meningokokkisk polysakkarid hvor modifikasjonen omfatter utskiftning av N-acetylgrupper av gruppe B Neisseria meningokokkisk polysakkarid av formel (Ila), hvor R2 er en umettet C2-C4 alkylgruppe omfattende minst en dobbeltbinding og hvor polysakkaridet er kovalent bundet til et protein.

11. Konjugatmolekyl ifølge krav 10, hvor proteinet er avledet fra et bakterium.

12. Konjugatmolekyl ifølge krav 11, hvor bakterien er Neisseria meningitidis.

13. Konjugatmolekyl ifølge krav 10, hvor proteinet er avledet fra et bakterium valgt fra gruppen omfattende tetanustoksoid, difteritoksoid, CRM197 og meningokokkal yter-membranproteiner (OMP).

14. Konjugatmolekyl ifølge krav 10, hvor polysakkaridfragmentet er et N-acylderivert polysakkarid, proteinet er tetanustoksoid og OMP og molekylvekten av polysakkaridet er mellom omkring 3 kDa og 50 kDa.

15. Konjugatmolekyl ifølge krav 10, hvor polysakkaridet er et N-acylderivert polysakkarid, proteinet er tetanustoksoid og molekylvekten av polysakkaridet er mellom omkring 10.000 og 15.000 Dalton.

16. Konjugatmolekyl ifølge ethvert av kravene 10 til 15, hvor det molare forhold mellom polysakkarid og protein er omkring 20 mol av polysakkarid til 1 mol protein.

17. Konjugatmolekyl ifølge krav 16, hvor det molare forhold mellom polysakkarid og protein er omkring 4 til 7 mol polysakkarid til omkring 1 mol protein.

18. Konjugatmolekyl ifølge krav 10 hvor det modifiserte gruppe B Neisseria meningokokksike polysakkarid er et N-akryloylderivat.

19. Konjugatmolekyl ifølge krav 18, hvor proteinet er et meningokokkisk yttermembranprotein.

20. Konjugatmolekyl ifølge krav 10, hvor det molare forhold av polysakkarid til protein er mellom omkring 2 til 15 mol polysakkarid til 1 mol protein.

21. Konjugatmolekyl ifølge krav 10, hvor mellom omkring 30 til 100 % av N-acetylgruppene av gruppe N Neisseria meningokokkisk polysakkaridet er de-N-acetylert.

22. Konjugatmolekyl ifølge krav 10, hvor polysakkaridet og proteinet er kovalent bundet ved å bruke reduktiv aminering.

23. Konjugatmolekyl ifølge krav 10, hvor molekylvekten av det modifiserte Neisseria meningokokkiske polysakkaridfragment er mellom omkring 10.000 og 15.000 Dalton.

24. Vaksinesammensetning av konjugatmolekyler omfattende et gruppe B meningokokkal umettet C3_5-N-acylderivert poly-sakkaridf ragment kovalent bundet til et protein.

25. Vaksinesammensetning ifølge krav 19, hvor proteinkom-ponenten er avledet fra et bakterium valgt fra gruppen omfattende tetanustoksoid, difteritoksoid, CRMi97 og meningokokkale ytremembranproteiner.

26. Vaksinesammensetning ifølge krav 19, hvor fragmentet er et N-acylderivert polysakkarid og molekylvekten av polysakkaridfragmentet er mellom omkring 3 og 50 kDa.

27. Vaksinesammensetning ifølge krav 19, hvor proteinkom-ponenten er avledet fra Neisseria meningitidis.

28. Immunserum omfattende antistoff fremskaffet i et pattedyr immunisert med konjugatet ifølge ethvert av kravene 10 til 23.

29. Immunserum ifølge krav 28, hvor polysakkaridene av konjugatet er fragmenter av umettede C3-5 N-acylderiverte polysakkarider.

30. Anvendelse av konjugatmolekylet ifølge ethvert av kravene 10 til 23 ved fremstilling av en vaksine for immunisering av et pattedyr mot Neisseria meningitidis- og E. coli Kl-infeksjoner.