NO316155B1 - Forbedret vevslim fremstilt ved anvendelse av kryopresipitat, fremgangsmåtefor fremstilling derav, samt anvendelse av en mengde avproteaseinhibitor - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører et vevshm som omfatter to komponenter A og B, en fremgangsmåte for fremstilling av vevshmet, anvendelse av en stor mengde aprotinin og anvendelse av et slangevenom proteolytisk enzym for fremstilling av et vevslim

Forbedring av lokal hemostase på et kirurgisk sårsted ved anvendelse av plasmaproteiner er et velkjent begrep Således er fibnnlapper for hemostase i hjernekirurg! blitt anvendt Blodplasma og trombin ble anvendt til å produsere en fibnnfilm over det kirurgiske sår I de siste 20 år er det mange publikasjoner som beskriver anvendelser av "fibrin-hm" eller "fibrin-klebemiddel" eller "fibnn-forseglingsmiddel" til de fleste kirurgiske disipliner I de siste 10 år er preparater av "hm" anvendt vidt i Europa "Limet" er sammensatt av to komponenter, mens en blanding av disse komponenter produserer en blodklump Den første komponent er et fibrmogenkonsentrat Dette konsentrat inneholder også fibronektin og Faktor XIII som er viktige til blodklumpstabilisering og styrke Den annen komponent er trombin, et aktivt enzym som omdanner fibrinogen, den siste komponent i det normale koagulasjonssystem til en fibnnklump Denne fremgangsmåte forbipasserer de fleste av trinnene i normal koagulenng og etterligner dens siste fase Noen fremstillere tilsetter plasminogen, som er et enzym som vil inkludere blodklumplysis etter noe tid, mens andre tilsetter aprotinin som er en inhibitor for proteaser for å forhindre blodklumplysis

Likevel gir disse produkter tilfredsstillende resultater i pasienter, dog med milde blødningshdelser, men pasienter som lider av alvorlige blødningslidelser slik som hemofili A eller B, har fortsatt en veldig høy risiko for postoperativ blødning Noen ganger forekommer en forsinket blødningskomplikasjon etter et gjennomsnitt på dager fra kirurgien Pasienter som behandles med antikoagulenngsfaktorer kan heller ikke behandles med vevshmet i henhold til den tidligere fagkunnskap En annen alvorlig ulempe med de kommersielle konsentrater er de høye produksjonsomkostninger

WO 86/01814 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av en kryopresipitert suspensjon som inneholder fibrinogen og Faktor VIII anvendbar som forløper i fremstillingen av et fibnn-hm som involverer (a) frysing av ferskt frossen plasma fra en enkelt donor f eks et menneske eller annet dyr som er blitt kartlagt for blodoverførte sykdommer ved ca -80°C i minst ca 6 timer, (b) heving av temperaturen i den frosne plasma, f eks til ca 0°C og romtemperatur, for å danne en supernatant og en kryopresipitert suspensjon som inneholder fibrinogen og Faktor VIII, og (c) utvinning av den kryopresipiterte suspensjon Det er også beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et fibnn-lim anvendbart i kirurgiske prosedyrer, som omfatter (a) fremstilling av en kryopresipitert suspensjon som beskrevet ovenfor, (b) anvendelse av et definert volum av suspensjonen til et ønsket sted, og (c) påfønng av en blanding som inneholder en tilstrekkelig mengde trombin til stedet for å forårsake at fibnnogenet i suspensjonen omdannes til fibnn-limet som så blir fast

EP-A-0 341 007 beskriver et kirurgisk klebemiddel, i en vandig sammen-setning, som omfatter autogent plasma fra pasienten, kollagen, trombin og eventuelt et antifibnnolytisk middel Det foreliggende klebemiddel dannes fra pasientens plasma uten anvendelse av noen tilsatte reagenser for konsentrasjon eller isolasjon av fibrinogenet Passende utformes klebemidlet som en to-dels blanding som blandes sammen rett før anvendelse

EP-A-0 253 189 beskriver et en-komponent-vevshm som har en vandig løsning av fibrinogen, Faktor VIII, en trombin-inhibitor, protrombinfaktorer, kalsium-loner og eventuelt en plasmin-inhibitor Vevshmet kan gjenutvinnes fra en lyofihsert prøve ved å tilsette vann Vevshmet kan inneholde alle aktive stoffer i pasteunsert form for å unngå hepatitt og HTLV lll-overfønng

WO-A-91/01762 beskriver en fremgangsmåte for pasteunsenng av en blanding av proteiner, i hovedsak inneholdende fibrinogen, ved oppvarming av blandingen under betingelser som sikrer pasteunsenng, hvor nevnte blanding pasteuriseres < nærvær av monosakkand og en sukkeralkohol Dette vevshmet kan fremstilles ved å starte med kryopresipitat Det beskrives et konsentrasjons-tnnn etter pasteunsenng

EP-A-0 305 243 beskriver et vevshm omfattende en komponent A inneholdende fibrinogen, fibnnektin, Faktor VIII og 10 000 KIU/m! av aprotinin og komponent B bestående av trombin

Et mål for foreliggende oppfinnelse er å gi et vevshm som også er egnet til pasienter med alvorlige blodkoagulenngshdelser, f eks hemofili A eller B Et videre mål for foreliggende oppfinnelse er å gi et vevshm som også kan anvendes til pasienter som allerede har utviklet antistoffer mot okse-trombin som er den aktive faktor i komponent B Ennå et annet mål for foreliggende oppfinnelse er å gi et vevshm til pasienter som behandles med antikoaguleringsfaktorer lik hepann På grunn av risikoen for overfønng av virussykdommer sammen med komponentene i vevslimet, må det sikres at fraksjoner av vevshmet er virus-inaktivert

To-komponent vevslimet med separate komponenter A og B i henhold til oppfinnelsen omfatter en komponent A hvor komponent A omfatter et kryopresipitat fra helblod og en mengde proteaseinhibitor som tilsvarer aprotinin i mengder på 3000 til 5000 KIU/ml enheter, nevnte komponent A kan oppnås ved opptining av kryopasta, oppløsning i en buffer ved pH 7,0 til 7,2, forvarming til 30 til 35°C, justering av pH til 7,0 til 7,2, tilsetning av aluminiumshydroksid under rønng, sentnfugenng og fjernelse av presipitat, tilsetning av CaCI2, vtrus-inaktivenng, konsentrenng ved uitrafiltrering til en proteinkonsentrasjon på 60 til 100 mg/ml, tilsetning av en mengde proteaseinhibitor tilsvarende 3000 til 5000 KIU/ml enheter av aprotinin, og en komponent B omfattende et proteolytisk enzym som er stand til å spalte fibnnogen spesifikt i nærvær av komponent A og å forårsake dannelsen av en fibrinpolymer

Kommersielt tilgjengelig kryopresipitat kan anvendes til fremstilling av vevshmet i henhold til oppfinnelsen Imidlertid kan det være fordelaktig å konsentrere kryopresipitatet mellom en faktor 2 og 5, fortrinnsvis faktor 3

Tilsetningen av en proteaseinhibitor i tilstrekkelig konsentrasjon som tilsvarer en mengde på 3 000 til 5 000 KIU/ml enheter aprotinin til kryopresipitatet gjør vevshmet i henhold til oppfinnelsen egnet til anvendelse i pasienter med alvorlige blødningslidelser Den foretrukne protease-inhibitor er aprotinin, som er kommersielt tilgjengelig under handelsnavnet Trasylol® eller Antagosan®

Kryopresipitatet kan oppnås fra pasienten selv ved å gi en autolog blodenhet før operasjonen Denne tilnærming forhindrer nsikoen for overføring av virusinfeksjoner ved blod-denvater Imidlertid, for å ha et passende kommersielt produkt, må kryopresipitatet bli virus-inaktivert En fremgangsmåte for virusinaktivenng er beskrevet i PCT/EP 91/00503 Det grunnleggende prinsipp er behandling av kryopresipitatet med spesielle vaskemidler og fjerning av vaskemidlet senere fra kryopresipitatet

Den annen komponent, komponent B, i vevslimet i henhold til foreliggende oppfinnelse fremstilles ved en løsning av et proteolytisk enzym som er i stand til spesifikt å spalte fibrinogen Vanligvis er det blitt anvendt trombin som ble isolert fra plasma fra mennesker eller pattedyr, f eks fra okse Dette trombin kan leveres i en lyofilisert form Gjenutvinningen av trombin forekommer med en 40 mmol løsning av kalsiumklorid Den foretrukne konsentrasjon av trombin er 50 til 200 u/ml

Til fremstilling av et raskt vevslim vil trombinløsningen av grovt 100 u/ml kalsiumklorid fremstilles Til fremstilling av et langsomt hm, f eks ved fylling av hulrom, dvs tannuttrekning eller tillukking av hulrommet etter transfenoidert hypofysektomi vil trombinet løses videre til en konsentrasjon på 25 u/ml med den passende kalsiumklondløsning

En annen utførelsesform av det forbedrede vevslim i henhold til oppfinnelsen omfatter som komponent B et proteolytisk enzym som isoleres fra slangevenom Denne utførelsesform er fordelaktig fordi også pasienter som har utviklet antistoffer mot trombin kan behandles Videre kan pasienter som er forbehandlet med hepann, behandles med vevslimet i henhold til oppfinnelsen, fordi hepann ikke har innflytelse på reaksjonen med slangevenom-enzymet I en spesielt foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er det anvendt slangevenom-enzymet batroxobin som kan isoleres fra den syd-amenkanske huleslange Bothrops moujeni Fortrinnsvis inneholder komponent B 0,5 til 10 u/ml av det henholdsvise proteolytiske enzym av slangevenom

Kjemisk er batroxobin et enkeltkjedet glykopeptid med molekylvekt på ca 36 000 Defibrase® forårsaker spalting av er 16 Arg/17 Gly bundet i fibrinogen som forårsaker avgivelse av fibnnopeptid A og dannelse av monomert fibnn I

Når aprotinin anvendes i mengdene i henhold til oppfinnelsen, kan også vevshmene som omfatter renset fibrinogen, fibronektin og Faktor XIII, anvendes som komponent A Risikoen for etter-blødning blir derved dramatisk redusert

Når proteolytiske proteaser fra slangevenom anvendes til fremstilling av komponent B, kan også "konvensjonelle" komponenter A som har fibrinogen, fibronektin og Faktor XIII, anvendes Anvendelsen av store mengder aprotinin i henhold til oppfinnelsen er foretrukket En spesielt foretrukket utførelsesform er kombinasjonen av komponent A i henhold til oppfinnelsen dannet fra kryopresipitat med eller uten store mengder aprotinin og komponent B i henhold til oppfinnelsen som har det proteolytiske enzym isolert fra slangevenom

Fremgangsmåten for fremstilling av fibnn-limet i henhold til oppfinnelsen omfatter tnnn med fremstilling av komponent A som omfatter trinn med fremstilling av en kryoløsning fra kryopresipitat,

vimsinaktivenng,

fjerning av virusidalt middel,

tilsetning av proteasemhibitoren og

fremstilling av en passende proteaseløsning av en protease som komponent B

En kryopasta blir for-tint over natten ved 4 til 10°C Kryopastaen løses i en buffer som inneholder natnumklorid-tnnatnumcitrat og glycin og har en pH på 7,0 til 7,2 og varmes så til 30-35°C Kryopastaen bør oppløses lett, ellers er den ikke egnet til fremstillingen Oppløsningen kan gjøres hurtigere ved å skjære opp kryopastaen i små stykker etter opptining Etter avkjøling av løsningen til nesten romtemperatur og justenng av pH til en verdi på 7,0 til 7,2 tilsettes aluminiumhydroksyd under rønng Presipitatet sentrifugeres og kastes Eventuelt blir et filtrenngstnnn utført Kalsiumklondet tilsettes opp til den ønskede sluttkonsentrasjon av kalsiumklorid

For virus-inaktivenngen blir løsningen oppvarmet til 30°C Så blir vaskemidlene tilsatt Etter rønng i noe tid blir løsningen overført til en virus-fri beholder og etterlatt ved svakt forhøyede temperaturer i flere timer uten rønng

De virusidale midler fjernes ved å tilsette en mengde ncinusolje og svak rønng i flere minutter Når olje/vann-fasene er blitt separert, avkjøles løsningen til romtemperatur Det vandige lag blir så tatt opp i en virussikker beholder, og oljelaget kastes Det vandige lag klargjøres ved filtrenng pH må sjekkes til å være 7,0 til 7,2 Så pumpes proteinløsningen gjennom en reversfasekolonne ved romtemperatur Etter å ha målt proteininnholdet (i området 10 til 60 mg/ml konsentreres eluatet ved ultrafiltrering til et proteininnhold på 60 til 100 mg/ml og dialyseres mot en buffer som er identisk med bufferen nevnt ovenfor men som i tillegg har en relativt høy konsentrasjon av kalsiumklorid Så tilsettes proteasemhibitoren En stenl filtrering utføres, og prøven fylles og dypfryses i egnede containere

Komponent B er fortnnnsvis en frysetørket protease Spesielt foretrukket er lyofilisert trombin eller lyofilisert fraksjon av den syd-amenkanske huleslange Bothrops moujeni Det proteolytiske enzym er kjent under handelsnavnet Reptilase og er enzymet batroxobin

De proteolytiske enzymer løses i en kalsiumklondbuffer

Påføringen av de to komponenter A og B utføres ved å anvende en dobbelt-sprøyte-teknikk, f eks gjennom en plastisk kobling Ved blanding av de to komponenter vil det dannes en blodklump Påføringen kan forekomme via en kanyle eller kan sprayes til et tre-lumen-kateter Hver av de to komponenter injiseres i et separat lumen, og en lufttrykk-kilde i området på noen atmosfærer forbindes med det tredje lumen for å spraye blandingen

Vevslimet i henhold til oppfinnelsen er fordelaktig fordi det kan anvendes hos pasienter som har alvorlige blod-koagulenngshdelser og fortsatt er billigere enn de kjente vevshm Pasienter med alvorlig hemofili kan videre f eks få utført tannuttrekkinger uten preventive infusjoner av Faktor VIll-konsentrater med en vellykkethetsgrad på over 80% Dette betyr at bare ca 1/5 av pasientene trenger infusjoner på grunn av post-uttrekkingsblødning Videre kan slike pasienter som er forbehandlet med hepann, behandles med vevshmet i henhold tii oppfinnelsen En annen fordel er at mennesker som dannet antistoffer mot trombin, den andre komponent i vevshmet, kan behandles med et vevslim i henhold til oppfinnelsen, hvor trombin substitueres med en protease fra slangevenom, spesielt Defibrase®, som er senn protease batroxobin islolert fra venomet til den syd-amenkanske huleslange Bothrops moujeni

Oppfinnelsen er videre beskrevet i de følgende eksempler

Humant fibnnogen (merke L) var fra Kabl (Stockholm), okse-trombin fra Merz-Dade Kromogent substrat (N.-a-benzoyl-DL-arginin-p-nitroanihd (BAPNA) og analytiske merkevarereagenser var fra Sigma (St Louis, MO) Reagenser og salter ble fortynnet med 0,15M tris, 0,15M NaCI, med pH 7,4 Fibrinogen ble dialysert i tns-buffer med konsentrasjon bestemt fra Abs2go ved å anvende en omdannelsesfaktor på E<1%>280 = 15

Oksetrombin var fra kommersielle kilder (Merz-Dade eller Parke Davis) med aktivitetsgradering av fabrikanten Reptilase®, et slangevenom som bare frigjører FPA, var fra Pentapharm (Basel) Den proteolytiske aktivitet til Reptilase® ble normalisert til aktiviteten til trombin ved å sammenligne hastighetene for proteolyse t et ikke-spesifikt kromogent substrat BAPNA (0,25 mM) ved 37°C i tns/saltvann, pH 8,0, målt ved 405 nm 115 min

På grunnlag av deres esterolytiske aktivitet, ble enhetsaktiviteten for reptilasen normalisert til enhetsaktiviteten for trombin

Fibnn-lim ble i det vesentlige dannet ved en dobbelt sprøytemetode med rent eller kryopresipitat-fibnnogen-substrat i en sprøyte, og reptilase (20 U/ml) eller trombin med CaCI2 (20 mM) i den andre

Koagulenngstid (CT) ble bestemt med en Research Model 300-R ACL Coagulation Analyzer (IL, Milan) Viskoelastisitet (TEG) ble bestemt på en 3-kanal Heihger Thromboelastograph ved 37°C Nedbrytmngsstyrke (BS) av limene (i gram) ble bestemt ved å blande limkomponentene mellom to stykker grovt vevet, syntetisk fiber (0,5 x 1 cm), hvilket tillater dannelsen av vev å bli totalt vevd mellom de to stykker med grov mesh og etter 2 timer ved 24°C ble samlingen av mesh-lim-mesh trukket fra hverandre ved å anvende et Accuforce Cadet Tensionometer

(AMATEK, Mansfteld & Greene, USA)

Sterilt kryopresipitat (kryo) ble fremstilt fra frossent (-30°C) humant plasma som ble tint ved 4°C, og supernatanplasma fjernet Fem slike enheter ble oppsamlet for å bestemme protein, og fibnnogenkonsentrasjoner ble bestemt ved "Buiref-metoden før og etter sammenklumping av kryopresipitatet (fortynnet 1 5)

med 2 U/ml trombin Faktor XIII ble bestemt ved å måle [^H]-putrescin-inkorporenng i dimetylert kasein etter aktivering av prøvene med 4 U/ml oksetrombin, 10 mm , 22°C

Et merkbart trekk ved CT-fibnnogenkurven er at den er bifasisk for et fiksert nivå av trombin eller reptilase (d v s 1 U/ml, fig 1 A) og når et minimum 11 - 8 mM fibrinogenområdet Dette er noe forskjellig fra den maksimale turbiditet (etter 10 mm ) som topper seg i området 20 til 40 mM fibrinogen Et motsatt ekspenment viser avhengigheten av CT på enten trombin eller reptilasenivåer Denne kurve viser en nær lineær invers avhengighet av geldannelses-hastighet ved lave enzymnivåer (mindre enn 2 U/ml), som danner et platå ovenfor ved høyere nivåer

Utviklingen av viskoelastisitet i rent fibnn er i noen grad langsommere enn dens turbiditet Ca(ll) er en hoved-kofaktor i gel-gjenforsterkning gjennom faktor Xllla-indusert kovalent blokkenng av proteinkjeder Slik geltverrbinding er en hovedkilde for mekanisk styrke av gelen, som danner et platå etter 20 mm

En anmerking om reptilases evne til å indusere Faktor XIIla-aktivitet synes passende

Protein-nivåer for oppsamlet kryopresipitat

Oppsamlet kryo fremstilt fra 5 enheter ga følgende gjennomsnittlige verdier

Koagulenngshastigheter

Blodklumpingstiden (CT) av kryo er lineært avhengig av trombin eller reptilasenivåer Imidertid, over 3 U/ml, utøver økende enzymnivåer liten virkning på CT For et fiksert nivå av enzym, gir seriefortynning av kryo en bifasisk CT-kurve ekvivalent med fibnnogen-avhengigheten sett i det rene fibnnsystem

Viskoelastisitet (TEG) og nedbrytningsstyrke (BS) av kryo-lim

Utviklingen av viskoelastisitet av kryo-lim ble undersøkt med enten trombin eller reptilase Denne parameter tar mye lenger tid å utvikle enn turbiditet Imidlertid oppnår kryo-lim fremstilt med overskudd av CaCl2 og enten trombin eller reptilase ekvivalente TEG-verdier i grovt sett den samme tidsramme Det synes som om etter den initielle påsetning av geldannelse, støtter Faktor Xllla-indusert tverrbinding opp under gelfiberstrukturen, slik at TEG-verdiene for begge lim konvergerer innen 1 time På samme måte ble de endelige BS i begge kryo-lim dannet med et overskudd av CaCI2 Begge kryo-lim brytes ved 50 til 60 g Disse forsøk indikerer at gelfibrene i limet blir gjenforsterket ved Faktor Xllla-indusert, kovalent tverrbinding

Fremstilling av en kryo-løsning

Kommersielt blir kryopasta for-tmt over natten ved 4-10°C 1 kg kryo løses i 2 hter buffer A (120 mM/l NaCI, 10 mM/l tnnatnumcitrat, 120 mM/l glycin og pH 7,0 til 7,2) og for-varmes til 30-35°C Kryopastaen bør oppløses lett ellers er den ikke egnet til fremstillingen For å gjøre oppløsningen hurtigere, skjær kropastaen i små stykker etter oppttning Så avkjøles løsningen til 20°C til 22°C, og pH sjekkes Eventuelt må den justeres til pH 7,0 til 7,2 ved tilsetning av fortynnet natnumhydroksyd eller eddiksyre 100 ml aluminiumhydroksyd tilsettes og røres i

30 min til Presipitatet sentrifugeres og kastes Supernatanten filtreres ved å anvende et 1 fjm filter 0,1 M/l CaCI2 tilsettes for å gi en sluttkonsentrasjon av Ca<2+> på 1 mM/l Igjen må pH sjekkes

Virusinaktivenng

Løsningen oppvarmes til 30°C 1 % w/v TNBP og 1 % w/v Tnton® X 100 tilsettes Blandingen røres forsiktig 11/2 time Løsningen blir så overført til en virus-fn beholder og etterlatt ved 30°C 13,5 timer uten rønng

Fjerning av virusidale midler

150 ml ncinusolje settes til blandingen fremstilt som beskrevet ovenfor og røres forsiktig i 30 min Mens man venter på olje/vann-separasjonen (30 til 45 min ) avkjøles løsningen til 20°C Det vandige lag blir trukket ut til en virus-fn beholder, mens oljelaget kastes Det vandige lag klargjøres ved filtrering på 1 pm/0,45 fjm filterkaskade Proteinløsningen blir så pumpet gjennom en reversfasekolonne (C-18-kolonne) ved en hastighet på 3 I/time ved romtemperatur Gjennomgangen måles ved UV og oppsamles inntil absorbansen har vent tilbake til 50% Fraksjonen inneholder grovt 40 mg/ml som målt i en proteinmåling

Eluatet konsentreres ved ultrafiltrenng til et proteininnhold på 70-80 mg/ml og dialyse mot tilstrekkelig mengde av en buffer B (samme bestanddeler som buffer A men i tillegg 1 mM/l kalsiumklorid) Så tilsettes 4 mio KIU aprotinin pr liter løsning Etterpå utføres en stenl filtrenng ved å anvende en 0,45 j/m + 0,2 fjm kaskade Løsningen blir så fylt og dypfrosset i plastbager, eventuelt lyofilisert

Fremstilling av en trombinløsning

Lyofilisert trombin løses i en løsning av 40 mM/l kalsiumklond Mengden av trombin er 100 U/ml i limet For et raskt arbeidende lim, f eks for spraying av limet på sårområdet, vil en trombinløsning på 100 U/ml i kalsiumklorid være tilstrekkelig For et langsomt lim, f eks fylling av hull under en tannuttrekning eller tillukking av hullet etter transfenoidai hypofysektomi vil trombin videre løses til en sluttkonsentrasjon på 25 U/ml ved å tilsette store mengder CaCU

Fremstillingen av reptilase er hk fremstillingen av trombin Imidlertid er mengden av reptilase grovt 2 U/ml

Rapport fra klinisk tilfelle

Pasienten (en 21 år gammel mann), led fra en alder på 21 år av alvorlig blødningsdiatese på grunn av ervervet inhibitor mot trombin Ingen bakgrunns-sykdom (dvs tumor eller autoimmun-sykdom) kunne forklare dette problem Laboratorietest, bekreftet ved to eksterne laboratoner, indikerte at MY hadde høye nivåer av anti-trombin IgG-antistoff I det siste året hadde han lidd av gjentatte angrep av nyrekohkk forårsaket av en stor sten i venstre nyrebekken Elektiv htotnpsi ved ultralyd ble planlagt Basert på den teknikk at IgG binder seg til protein-A-affinitetkolonner, ble pasienten plassert på immunosuppressiv terapi kombinert med ekstrakorporal immunoadsorpsjon Etter 8 behandlinger, hvor 6 liter av pasientens plasma ble kjørt gjennom passasje på protein-A-kolonnen, ble inhibitortiteren minsket med 98% Dette ble bestemt ved å måle trombintiden (TT) for normalt oppsamlet plasma, med pre- og post-affinitets-renset MJ-plasma Ikke desto mindre var TT såvel som PT og APTT-verdiene forlenget På dette tidspunkt flyttet nyrestenen seg til uret ra og forårsaket fullstendig blokkenng av nyren fulgt av hydronefrose Pasienten mottok 10 flere immunoadsorpsjons-behandhnger (ca 80 liter plasma) fulgt av intensiv plasmaferese (ca 50 liter) og høy dose av immunoglobuhn-infusjon (2 g/kg) På dette punkt minsket trombin-inhibitornivået til 0,5% PTT ble minsket til 47 sek (vs 85-90 sek forbehandling) og TT var 35 sek (vs 90 sek forbehandling og 27 sek normal kontroll) Det ble bestemt å fjerne stenen ved kirurgi, ved å anvende biologisk klebemiddel (kryo-lim) laget fra kryopresipitat og høye nivåer (200 U/ml) trombin Med denne blanding ble kryoen geldannet umiddelbart når den ble sprayet Imidlertid forekom geldannelse ikke i pasienten, og lokal hemostase ble oppnådd ved å suturere På slutten av kirurgien så såret "tørt" ut Ikke desto mindre, 6 timer senere, blødde pasienten fra kirurgiske dren Immuno-absorpsjon av 10 liter plasma ble utført, men uten virkning på blødningen som faktisk økte

Pasienten ble gjenoperert for å finne kilden for blødning Likevel ble ingen kirurgisk blødning funnet Diffus blødning ble observert fra hele såroverflate-området På dette tidspunkt ble en blanding av kryo og reptilase (2 U/ml, Defibrase) sprayet på såret Sprayen klumpet seg umiddelbart, såroverflaten viste seg turbid og blødning stoppet Pasienten fortsatte å motta daglig immuno-adsorpsjonsterapi i 5 dager til, uten blødning Dette viser fordelen ved å anvende slange-proteasen som komponent B i vevslimet i henhold til oppfinnelsen

Claims (13)

1 To-komponent vevslim med to separate komponenter A og B, karakterisert ved at det omfatter komponent A hvor komponent A omfatter et kryopresipitat fra helblod og en mengde proteaseinhibitor som tilsvarer aprotinin i mengder på 3000 til 5000 KIU/ml enheter, nevnte komponent A kan oppnås ved opptining av kryopasta, oppløsning i en buffer ved pH 7,0 til 7,2, forvarming til 30 til 35°C, justering av pH til 7,0 til 7,2, tilsetning av aluminiumshydroksid under rønng, sentnfugering og fjernelse av presipitat, tilsetning av CaCb, virusinaktivenng, konsentrering ved ultrafiltrenng til en proteinkonsentrasjon på 60 til 100 mg/ml, tilsetning av en mengde proteaseinhibitor tilsvarende 3000 til 5000 KIU/ml enheter av aprotinin, og en komponent B omfattende et proteolytisk enzym som er stand til å spalte fibrinogen spesifikt i nærvær av komponent A og å forårsake dannelsen av en fibrinpolymer

2 Vevslim ifølge krav 1, karakterisert ved at proteasemhibitoren er aprotinin i mengder på 3000 til 5000 KIU/ml enheter

3 Vevslim ifølge ethvert av kravene 1og2, karakterisert ved at det proteolytiske enzymet er trombin avledet fra pattedyr eller mennesker

4 Vevslim ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en komponent A som omfatter et konsentrert kryopresipitat av helblod, og en komponent B som omfatter et proteolytisk enzym som kan oppnås fra slangevenom, hvilket enzym er i stand til å spalte fibnnogen tilstede i komponent A, spesifikt og forårsake dannelsen av en fibrinpolymer

5 Vevslim ifølge krav 4, karakterisert ved at slangevenomenzymet er batroxobin isolert fra venomet til syd-amenkansk huleslange Bothrops moujeni

6 Vevslim ifølge kravene 4 eller 5, karakterisert ved at det har en høy mengde proteaseinhibitor, fortrinnsvis aprotinin, tilsvarende 3000 til 5000 KIU/ml enheter aprotinin

7 Vevslim ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at kryopresipitatet er virusinaktivert

8 Fremgangsmåte for fremstilling av fibrinhm i henhold til kravene 1 til 7, kara ktensert ved opptinmg av kryopasta, oppløsning i en buffer ved pH 7,0 til 7,2, forvarming til 30 til 35°C, justering av pH til 7,0 til 7,2, tilsetning av aluminiumshydroksid under rønng, sentnfugering og fjernelse av presipitat, tilsetning av CaCb, vimsinaktivenng, konsentrering ved ultrafiltrenng til en proteinkonsentrasjon på 60 til 100 mg/ml, tilsetning av en mengde proteaseinhibitor tilsvarende 3000 til 5000 KIU/ml enheter av aprotinin, og fremstille løsning av en passende protease for komponent B som definert i kravene 1 til 7

9 Vevslim ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter som komponent A fibnnogen, fibronektin og faktor XIII og en proteaseinhibitor tilsvarende til en aprotininmengde på fra 3000 til 5000 KIU/ml

10 Vevshm ifølge krav 9, karakterisert ved at komponent B er et proteolytisk enzym i henhold til kravene 4 og/eller 5 eller trombin

11 Anvendelse av en mengde av proteaseinhibitor tilsvarende 3000 til 5000 KIU/ml enheter av aprotinin i kombinasjon med konsentrert kryopresipitat som kan oppnås ved opptining av kryopasta, oppløsning i en buffer ved pH 7,0 til 7,2, forvarming til 30 til 35°C, justering av pH til 7,0 til 7,2, tilsetning av aluminiumshydroksid under rønng, sentnfugenng og fjernelse av presipitat, tilsetning av CaCI2, virusinaktivenng, konsentrenng ved ultrafiltrenng til en proteinkonsentrasjon på 60 til 100 mg/ml, for fremstilling av et vevslim i henhold til ett av kravene 1 til 7

12 Anvendelse ifølge krav 11, hvori proteaseinhibitoren er aprotinin

13 Anvendelse av konsentrert kryoprsipitat for fremstilling av vevslim ifølge ethvert av kravene 1 til 6