NO315276B1

NO315276B1 - Microbiological method, apparatus for its use as well as test kit and ADP reagent

Info

Publication number: NO315276B1
Application number: NO19952917A
Authority: NO
Inventors: David James Squirrell
Original assignee: Secr Defence Brit
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 2003-08-11
Also published as: NO952917L; NO952917D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden av mikroorganismer og/eller deres intracellulære material tilstede i en prøve. The present invention relates to a method for determining the presence and/or quantity of microorganisms and/or their intracellular material present in a sample.

Oppfinnelsen vedrører også et apparat for anvendelse ved The invention also relates to an apparatus for use in

denne fremgangsmåte samt testkit for påvisning og/eller kvantifisering av mikroorganismer ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte. this method as well as test kits for the detection and/or quantification of microorganisms using the above-mentioned method.

Endelig vedrører oppfinnelsen et ADP reagens for anvendelse i påvisning og/eller kvantifisering av mikroorganismer eller deres intracellulære innhold ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte . Finally, the invention relates to an ADP reagent for use in the detection and/or quantification of microorganisms or their intracellular content using the above-mentioned method.

Alle levende organismer anvender adenosintrifosfat (ATP) som en kilde for kjemisk energi og det er kjent å bestemme dette ved anvendelse av luciferase/luciferin-reaksjonen som er ATP-drevet. Lys dannet ved denne enzymatiske reaksjon kan måles ved anvendelse av et luminometer og relateres til mengden tilstedeværende ATP. Anvendbarheten av ATP som en indeks på mikrobetall har vært kjent siden midt i 1960-årene (se ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology (1989), utgiver Stanley et al, Blackwell Scientific Publications, London, sidene 1-10), idet dets viktigste fordel er hastighet og sensitivitet. Anvendelse av dette analyseformat gjør at enkle prøver kan analyseres i løpet av minutter mens komplekse prøver rutinemessig tar kun en halvtime med en påvisningsevne ned til IO"<12> mol/l ATP. Der er imidlertid et behov for metoder som tilveiebringer ytterligere sensitivitet i forbindelse med å påvise mikroorganismer eller deres innhold mens man opprettholder hurtighet og enkel utførelse. All living organisms use adenosine triphosphate (ATP) as a source of chemical energy and it is known to determine this using the luciferase/luciferin reaction which is ATP driven. Light produced by this enzymatic reaction can be measured using a luminometer and related to the amount of ATP present. The utility of ATP as an index of microbial counts has been known since the mid-1960s (see ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology (1989), published by Stanley et al, Blackwell Scientific Publications, London, pages 1-10), as its main advantage is speed and sensitivity. Application of this analysis format means that simple samples can be analyzed within minutes, while complex samples routinely take only half an hour with a detection capability down to IO"<12> mol/l ATP. However, there is a need for methods that provide additional sensitivity in connection with detecting microorganisms or their content while maintaining speed and ease of execution.

Man har nå funnet at hastighet og sensitivitet av denne ATP-baserte metode kan økes betydelig ved å skifte målet for analysen fra ATP til enzymet som danner det, adenylatkinase. Adenylatkinase er et enzym som anvendes av alle organismer It has now been found that the speed and sensitivity of this ATP-based method can be increased significantly by changing the target of the analysis from ATP to the enzyme that forms it, adenylate kinase. Adenylate kinase is an enzyme used by all organisms

for omdannelse av adenosindifosfat (ADP) til adenosintrifosfat (ATP). Targeting av dette enzym fremfor ATP, ved anvendelse av fremgangsmåten, apparatet og kitet i henhold til for the conversion of adenosine diphosphate (ADP) to adenosine triphosphate (ATP). Targeting this enzyme rather than ATP, using the method, apparatus and kit according to

oppfinnelsen, tillater påvisning av ned til minst IO"<20> mol intracellulær markør-adenylatkinase. invention, allows the detection of down to at least 10"<20> moles of intracellular marker adenylate kinase.

Det er kjent å bestemme adenylatkinase ved anvendelse av luciferase/luciferin-systemet (se Brolin et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1 (1979) 163-169) for det formål å bestemme aktiviteten derav i bestemte pattedyrvev og plantevev (Rodionova et al, Fiziologiya Rastenii (1978), 25, 4, P731-734 for planter). Anvendelse av et slikt analyse-system for å påvise mikroorganismer har imidlertid ikke blitt foreslått og fordelene med å gjøre dette, dvs. økt tilveiebragt sensitivitet, har ikke vært relevant for dem som stude-rer selve enzymet. It is known to determine adenylate kinase using the luciferase/luciferin system (see Brolin et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1 (1979) 163-169) for the purpose of determining its activity in specific mammalian and plant tissues (Rodionova et al , Fiziologiya Rastenii (1978), 25, 4, P731-734 for plants). However, the use of such an analysis system to detect microorganisms has not been proposed and the advantages of doing this, i.e. increased sensitivity provided, have not been relevant for those who study the enzyme itself.

Skjønt adenylatkinase er tilstede i mindre mengder enn ADP eller ATP, vil anvendelse derav som en biologisk markør for mikroorganismer tilveiebringe økt sensitivitet, med en typisk tilgjengelig amplifikasjon på 400.000, ved å måle tilstedeværelsen derav gjennom det ATP som den produserer, dvs. for hvert mol enzym tilstede omdannes 400.000 mol ADP til ATP i en 10 minutters inkubasjon. Således vil estimering av enzymet ved å måle substratet eller produktet i reaksjonen som det katalyserer, sørge for påvisning helt ned til io~<20 >mol. Although adenylate kinase is present in smaller amounts than ADP or ATP, its use as a biological marker for microorganisms will provide increased sensitivity, with a typical available amplification of 400,000, by measuring its presence through the ATP it produces, i.e. for each mole enzyme present, 400,000 mol of ADP are converted to ATP in a 10-minute incubation. Thus, estimating the enzyme by measuring the substrate or product in the reaction that it catalyzes will ensure detection right down to io~<20 >mol.

De foran beskrevne fordeler oppnås ved fremgangsmåten, apparatet, testkitet og ADP reagenset slik de er definert med de i kravene anførte trekk. The advantages described above are achieved by the method, the apparatus, the test kit and the ADP reagent as defined by the features stated in the requirements.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden mikroorganismer og/eller deres intracellulære material tilstede i en prøve som omfatter å estimere mengden adenylatkinase deri ved dens evne til å omdanne adenosindifosfat (ADP) til adenosintrifosfat (ATP) og relatere dette til tilstedeværelsen og/eller mengden av mikrorganismer og/eller deres intracellulære material. Denne omdannelse muliggjøres ved å tilsette ADP til prøver. The present invention thus provides a method for determining the presence and/or amount of microorganisms and/or their intracellular material present in a sample which comprises estimating the amount of adenylate kinase therein by its ability to convert adenosine diphosphate (ADP) to adenosine triphosphate (ATP) and relating this to the presence and/or amount of microorganisms and/or their intracellular material. This conversion is made possible by adding ADP to samples.

Adenosintrifosfat (ATP) påvises foretrukket ved anvendelse av luciferin/luciferase-systemet til å gi et fotometrisk påvis-bart signal som indikerer mengden ATP i prøven. Luciferin/- luciferase-preparater og metoder for deres anvendelse for å bestemme ATP er kjent for den fagkyndige på området og er kommersielt tilgjengelige (se f.eks. Brolin et al). Et typisk preparat inneholder f.eks. 0,1 til 10 mg/l luciferase, 15 til 1000 /imol/1 D-luciferin og midler som MgCl2, EDTA, BSA og buffer med pH 7 (se f.eks. EP 054676). Adenosine triphosphate (ATP) is preferably detected using the luciferin/luciferase system to provide a photometrically detectable signal indicating the amount of ATP in the sample. Luciferin/-luciferase preparations and methods for their use to determine ATP are known to those skilled in the art and are commercially available (see, e.g., Brolin et al.). A typical preparation contains e.g. 0.1 to 10 mg/l luciferase, 15 to 1000 /imol/1 D-luciferin and agents such as MgCl 2 , EDTA, BSA and buffer with pH 7 (see e.g. EP 054676).

Som med enhver amplifisert analyse, er sensitiviteten av bestemmelsen av adenylatkinase i henhold til oppfinnelsen begrenset ved reagensenes renhet. I dette tilfellet er de signifikante kontaminanter ATP i ADP-substratet og adenylatkinase i luciferase-preparatet. For anvendelse som en sensi-tivitetsbestemmelse for mikroorganismer, særlig hvor disse eventuelt kan være skadelige og må påvises i lave antall, er det nødvendig at renheten av hvert av reagensene er så høy som mulig med hensyn til substansen hvormed det skal reagere i analysen. Fosfatbuffer har intet ATP-innhold. As with any amplified assay, the sensitivity of the determination of adenylate kinase according to the invention is limited by the purity of the reagents. In this case, the significant contaminants are ATP in the ADP substrate and adenylate kinase in the luciferase preparation. For use as a sensitivity determination for microorganisms, especially where these may possibly be harmful and must be detected in low numbers, it is necessary that the purity of each of the reagents is as high as possible with respect to the substance with which it is to react in the analysis. Phosphate buffer has no ATP content.

Med hensyn til det første problem er kommersiell ADP med høy renhet (>99,5 % renhet) foretrukket anvendt etter ytterligere rensing med kolonnekromatografi. Dette er ønskelig fordi selv små mengder kontaminerende ATP kan være tilstrekkelig til å gi én høy bakgrunnsavlesning. Anvendelse av en dietylaminoetyl-cellulosekolonne og 0,02 mM saltsyre som elueringsmiddel vil for eksempel føre til at ATP elueres saktere fra kolonnen enn ADP i en slik utstrekning at man kan oppnå reell separasjon. Andre kromatografimedier og elueringsmiddelkombinasjoner kan også anvendes og har en tilsvarende effekt. De initiale fraksjoner med høye ADP/ATP-forhold beholdes for bruk. Renhet måles ved luciferin/luciferasereagens-bioluminescens etter adenylatkinasevirkning for å måle ADP-nivåer og uten adenylatkinase for å måle ATP-kontaminantnivåer. En ytterligere metode for å fjerne ATP fra ADP-substratet anvender enzymer som spesifikt nedbryter ATP, som luciferase eller apyrase. Slike enzymer kan også. anvendes for ytterligere å rense kro-matograf isk renset ADP, eller enzymatisk renset ADP kan alternativt behandles ved kolonnekromatografi. Det skal bemerkes at apyrase også er en ADPase, men da den er mer aktiv på ATP og da ADP er tilstede i mye høyere nivåer, vil dette ikke være et signifikant problem. With regard to the first problem, commercial ADP of high purity (>99.5% purity) is preferably used after further purification by column chromatography. This is desirable because even small amounts of contaminating ATP can be sufficient to give one high background reading. Use of a diethylaminoethyl cellulose column and 0.02 mM hydrochloric acid as eluent will, for example, cause ATP to elute more slowly from the column than ADP to such an extent that real separation can be achieved. Other chromatography media and eluent combinations can also be used and have a similar effect. The initial fractions with high ADP/ATP ratios are retained for use. Purity is measured by luciferin/luciferase reagent bioluminescence after adenylate kinase action to measure ADP levels and without adenylate kinase to measure ATP contaminant levels. A further method of removing ATP from the ADP substrate uses enzymes that specifically degrade ATP, such as luciferase or apyrase. Such enzymes can also. is used to further purify chromatographically purified ADP, or enzymatically purified ADP can alternatively be treated by column chromatography. It should be noted that apyrase is also an ADPase, but as it is more active on ATP and as ADP is present in much higher levels, this will not be a significant problem.

Med hensyn til det andre problem nemlig adenylatkinase som et essensielt "housekeeping" enzym", så er dette enzym tilstede i alle organismer og er generelt tilstede i luciferase-preparater. Det vil kun være en mindre kontaminant, men siden målet er å måle svært lave adenylatkinasenivåer i prøver, kan tilstedeværelsen derav i luciferasen være en begrensende fak-tor . With regard to the second problem, namely adenylate kinase as an essential "housekeeping" enzyme, this enzyme is present in all organisms and is generally present in luciferase preparations. It will only be a minor contaminant, but since the aim is to measure very low adenylate kinase levels in samples, its presence in the luciferase may be a limiting factor.

Molekylvektene til luciferase og adenylatkinase er svært forskjellige, og er henholdsvis 61kD og 21kD. Videre er luciferase et membranbundet protein og er derfor relativt hydrofobt, mens adenylatkinase forefinnes som et oppløselig enzym. Det er således mulig å fjerne adenylatkinase fra luciferasepre-parater ved f.eks. kromatografi med utelukkelse på basis av størrelse, ved revers-fase kromatografi eller begge. Alternativt eller i tillegg til dette kan problemet med adenylat-kinasekontaminering av luciferase unngås ved tilsetning av bioluminescerende reagenser (luciferase og luciferin) like før eller på tidspunktet hvor målingene gjennomføres, slik at enhver kontaminerende adenylatkinase ikke har tid til å bevirke en signifikant effekt. The molecular weights of luciferase and adenylate kinase are very different, being 61kD and 21kD, respectively. Furthermore, luciferase is a membrane-bound protein and is therefore relatively hydrophobic, while adenylate kinase is found as a soluble enzyme. It is thus possible to remove adenylate kinase from luciferase preparations by e.g. size-exclusion chromatography, reverse-phase chromatography, or both. Alternatively or in addition to this, the problem of adenylate kinase contamination of luciferase can be avoided by adding bioluminescent reagents (luciferase and luciferin) just before or at the time the measurements are made, so that any contaminating adenylate kinase does not have time to produce a significant effect.

Por å gjøre all adenylkinasen assosiert med en målmikroorga-nisme tilgjengelig for ADP og luciferase/luciferin-analysereagensene i henhold til oppfinnelsen, vil det være nødvendig å nedbryte dem slik at intracellulært material frigis eller på annen måte eksponeres for reagensene. Slik nedbrytning kan gjennomføres ved anvendelse av mekaniske midler som en ultra-lydgenerator, ved anvendelse av osmotisk sjokk eventuelt sammen med kuldesjokk eller slike midler som lysozym eller mer passende ved anvendelse av detergenter. Slike detergenter er kommersielt tilgjengelige og omtales vanligvis som "ekstraksjonsmidler". Typiske ekstraksjonsmidler inkluderer generiske kationiske detergenter som CTAB (cetyltrimetylammoniumbromid), og midler med handelsbetegnelsen Enzymatics ATP frigivelses-middel, Biotrace XM ekstraksjonsmiddel (tilgjengelig fra Biotrace, Bridgend UK) og Lumac NMR (nukleotidfrigivende middel tilgjengelig fra Lumac BV, Holland). Ved anvendelse av CTAB vil et passende preparat omfatte fra 0,01 til 1 % CTAB i vann, f.eks. 0,2%, men andre konsentrasjoner vil fremgå for den fagkyndige på området. In order to make all the adenyl kinase associated with a target microorganism available to ADP and the luciferase/luciferin assay reagents of the invention, it will be necessary to degrade them so that intracellular material is released or otherwise exposed to the reagents. Such degradation can be carried out by the use of mechanical means such as an ultrasound generator, by the use of osmotic shock possibly together with cold shock or such means as lysozyme or more appropriately by the use of detergents. Such detergents are commercially available and are commonly referred to as "extractants". Typical extractants include generic cationic detergents such as CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), and agents trade name Enzymatics ATP release agent, Biotrace XM extractant (available from Biotrace, Bridgend UK) and Lumac NMR (nucleotide release agent available from Lumac BV, Holland). When using CTAB, a suitable preparation will comprise from 0.01 to 1% CTAB in water, e.g. 0.2%, but other concentrations will be apparent to the person skilled in the field.

Før tilsetning av ADP og luciferase/luciferin-reagens(er) til en analyseprøve som man mistenker inneholder mikroorganismer, er det foretrukket at disse nedbrytes for å gjøre deres intracellulære innhold tilgjengelig for luminescerende reagenser ved anvendelse av nedbrytingsmidde1. Dersom det er ønskelig å skille mellom målceller og celler som soppsporer, er det mulig å kjøre to separate analyser hvor én behandles med ikke-ionisk detergent som er i stand til å kun nedbryte disse sporer og multicellulære "somatiske" animalske celler (f.eks. detergent med handelsbetegnelsen Triton TX-100) og hvor den andre behandles med kationiske detergent "ekstraksjonsmidler" som angitt mer detaljert i det foregående for å nedbryte alle typer celler. Det er mulig å gjennomføre disse analyser på den samme prøve dersom en ATPase som apyrase tilsettes mellom detergent/luciferase/målesyklusene, idet én syklus anvender ikke-ionisk og den andre kationisk detergent i et første trinn i syklusen. Before adding ADP and luciferase/luciferin reagent(s) to an assay sample suspected of containing microorganisms, it is preferred that these are degraded to make their intracellular contents available to luminescent reagents using degradation agent1. If it is desired to distinguish between target cells and cells such as fungal spores, it is possible to run two separate analyses, one of which is treated with a non-ionic detergent capable of only breaking down these spores and multicellular "somatic" animal cells (e.g. . detergent under the trade name Triton TX-100) and where the other is treated with cationic detergent "extractants" as set forth in more detail above to disrupt all types of cells. It is possible to carry out these analyzes on the same sample if an ATPase such as apyrase is added between the detergent/luciferase/measurement cycles, one cycle using non-ionic and the other cationic detergent in a first step of the cycle.

Apparatet ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at det omfatter midler for å motta en prøve som skal analyseres for tilstedeværelsen av mikroorganismer i en vandig suspensjon derav, midler for tilsetning av ADP, luciferase og luciferin til suspensjonen og midler for å påvise dannet lys. Apparatet omfatter foretrukket et middel for tilsetning av detergent til suspensjonen før midlet for tilsetning av luciferase og luciferin. ADP tilsettes foretrukket før luciferase og luciferin, f.eks. med detergenten, for å gi tid til dannel-sen av ATP, men alle reaksjonsmidler kan tilsettes sammen dersom det anvendes gløde-("glow") kinetikker. Foretrukket tilsettes luciferase/luciferin-reagenset (reagensene) separat fra The apparatus according to the present invention is characterized in that it comprises means for receiving a sample to be analyzed for the presence of microorganisms in an aqueous suspension thereof, means for adding ADP, luciferase and luciferin to the suspension and means for detecting light produced. The apparatus preferably comprises a means for adding detergent to the suspension before the means for adding luciferase and luciferin. ADP is preferably added before luciferase and luciferin, e.g. with the detergent, to give time for the formation of ATP, but all reactants can be added together if glow kinetics are used. Preferably, the luciferase/luciferin reagent(s) is added separately from

ADP. ADP.

Apparatet omfatter foretrukket et deteksjonsmiddel for å bestemme-mengden lys som sendes ut fra suspensjonen ved tilsetning av luciferase og luciferin og omfatter eventuelt en datamaskinprosessor og skjerm for å motta et signal fra detek-sjonsmidlet som viser mengden lys som sendes ut og for utfra dette å beregne den sannsynlige tilstedeværelse og mengde av mikroorganismer og fremvise resultater: Slik beregning vil kunne forenkles ved å programmere prosessoren til å ta hensyn til en på forhånd utarbeidet rekkefølge av innkommende sig-naler, hvorav noen vil være kontroller inkluderende blind-prøver og ikke-ionisk detergent, eller ta hensyn til pre-input standarder som f.eks. temperatur. The apparatus preferably comprises a detection means for determining the amount of light emitted from the suspension upon addition of luciferase and luciferin and optionally comprises a computer processor and screen for receiving a signal from the detection means that shows the amount of light emitted and from this to calculate the probable presence and quantity of microorganisms and display results: Such calculation can be simplified by programming the processor to take into account a previously prepared sequence of incoming signals, some of which will be controls including blank samples and non-ionic detergent, or take into account pre-input standards such as e.g. temperature.

Et foretrukket apparat vil inkludere et transportmiddel som mottar et volum av flytende medium inneholdende prøven fra en eller flere reagensstasjoner og som beveger prøven til midlet for lysdeteksjon. En transportør bærer således for eksempel en serie prøverør, foretrukket luminometrirør, som på forhånd er tilført en fosfatbuffer inkluderende en vandig flytende suspensjon av material som skal testes for tilstedeværelsen av mikroorganismer eller som er ført gjennom en stasjon i apparatet hvor slik suspensjon plasseres deri. Rørene kan for eksempel være åpne og føres deretter på transportøren under en detergenttilsettende stasjon, under ADP og luciferase/luciferin-tilsettende stasjoner og deretter gjennom en lysdetek-torstasjon. Lysdetektoren kan være av standard luminometer-format, f.eks. Biotrace Hulti-lite eller Biotrace M3. A preferred apparatus will include a transport means which receives a volume of liquid medium containing the sample from one or more reagent stations and which moves the sample to the means for light detection. A conveyor thus carries, for example, a series of sample tubes, preferably luminometry tubes, which have previously been supplied with a phosphate buffer including an aqueous liquid suspension of material to be tested for the presence of microorganisms or which has been passed through a station in the apparatus where such suspension is placed therein. The tubes can for example be open and are then passed on the conveyor under a detergent adding station, under ADP and luciferase/luciferin adding stations and then through a light detector station. The light detector can be of standard luminometer format, e.g. Biotrace Hulti-lite or Biotrace M3.

Lys kan måles ved å opphoide prøvevolumet, f.eks. luminometer-røret, i lysdetektoren umiddelbart etter eller samtidig med tilsetningen av luciferase og luciferin. I et foretrukket apparat blir således luminometrireagensene tilsatt like før inntreden inn i eller inne i lysdetektorstasjonen. Et foretrukket apparat måler lys emittert umiddelbart etter reagens-tilsetning, deretter igjen etter en gitt tidsperiode. Alternativt påvises emittert lys over en passende lang periode slik at det kan fastsettes kumulativt, f.eks. hvor gløde-kinetikker anvendes. Light can be measured by increasing the sample volume, e.g. the luminometer tube, in the light detector immediately after or simultaneously with the addition of luciferase and luciferin. In a preferred apparatus, the luminometry reagents are thus added just before entry into or inside the light detector station. A preferred apparatus measures light emitted immediately after reagent addition, then again after a given period of time. Alternatively, emitted light is detected over a suitably long period so that it can be determined cumulatively, e.g. where annealing kinetics are used.

Testkitet i henhold til oppfinnelsen omfatter de essensielle reagenser som er nødvendige for fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, dvs. adenosindifosfat sammen med luciferase og luciferin. Kitet inkluderer foretrukket alle disse reagenser og med luciferase og luciferin i form av en enkel reagens-løsning, og med en ytterligere detergent i kitreagenset som er egnet for å nedbryte målcellene som analysen er tenkt for. Vanligvis, for å bestemme mikroorganismer, behøves kun kationisk detergent, men, dersom soppsporer og somatiske celler antas å være signifikante, da kan et ytterligere ikke-ionisk detergentreagens være inkludert for å bestemme deres antall. Kitet er i form av en enkel pakning som foretrukket omfatter instruksjoner vedrørende utførelsen av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, idet reagensene er tilveiebragt i beholdere og har en styrke som er egnet for direkte bruk eller etter fortynning. The test kit according to the invention comprises the essential reagents which are necessary for the method according to the invention, i.e. adenosine diphosphate together with luciferase and luciferin. The kit preferably includes all these reagents and with luciferase and luciferin in the form of a simple reagent solution, and with an additional detergent in the kit reagent which is suitable for breaking down the target cells for which the analysis is intended. Usually, to determine microorganisms, only cationic detergent is needed, but, if fungal spores and somatic cells are thought to be significant, then an additional nonionic detergent reagent may be included to determine their number. The kit is in the form of a simple package which preferably includes instructions regarding the execution of the method according to the invention, the reagents being provided in containers and having a strength which is suitable for direct use or after dilution.

Fosfatbuffer kan være inkludert. Phosphate buffer may be included.

Et foretrukket testkit i henhold til oppfinnelsen omfatter ADP-reagens med en renhet større enn 99,95%, og et luciferase-reagens som er i alt vesentlig uten adenylatkinaseaktivitet. Alternativt er det anvendte luciferase/luciferin-forhold, som avspeilet i kit-brukerinstruksjoner og/eller i deres relative konsentrasjoner, slik at luciferasen er i stand til å virke tilstrekkelig hurtig på luciferinsubstratet slik at den luciferase-assosierte adenylatkinase danner ATP etter at den initiale emisjon er ferdig, og således vil mikroorganisme-avledet adenylatkinase være indikert ved en "flash"- kinetikk-reaksjon og kontaminerende DNA ved en gløding("glow"). A preferred test kit according to the invention comprises ADP reagent with a purity greater than 99.95%, and a luciferase reagent which is substantially free of adenylate kinase activity. Alternatively, the luciferase/luciferin ratio used, as reflected in the kit user instructions and/or in their relative concentrations, is such that the luciferase is able to act sufficiently rapidly on the luciferin substrate so that the luciferase-associated adenylate kinase forms ATP after the initial emission is complete, and thus microorganism-derived adenylate kinase will be indicated by a "flash" kinetics reaction and contaminating DNA by a glow.

De foretrukne rensede reagenser kan tilveiebringes ved meto-dene som er beskrevet i det foregående. Det skal bemerkes at adenylatkinaseaktivitet i luciferase kan fjernes ved at luciferasen får stå i en periode på måneder eller år. The preferred purified reagents can be provided by the methods described above. It should be noted that adenylate kinase activity in luciferase can be removed by allowing the luciferase to stand for a period of months or years.

Fremgangsmåter, apparatur, reagenser og kit i henhold til oppfinnelsen skal nå illustreres nærmere under henvisning til de etterfølgende eksempler og figurer. Methods, apparatus, reagents and kits according to the invention will now be illustrated in more detail with reference to the following examples and figures.

Figurer Figures

Fig. l viser en kurve av økning i luminometertellinger pr. Fig. l shows a curve of increase in luminometer counts per

min. for forskjellige mengder E. coli, som bestemt i overensstemmelse med eksemplene 4 og 5. my. for different amounts of E. coli, as determined in accordance with Examples 4 and 5.

Fig. 2 viser en skjematisk fremstilling av apparatet i Fig. 2 shows a schematic representation of the apparatus i

eksempel 6. example 6.

Eksempel l: Fremstilling av renset adenosindifosfatreagens Væskekromatografi ble anvendt for å ytterligere rense kommersiell ADP med høy renhet (>99r95 %) (Sigma). Små kolonner ble dannet fra 10 ml engangs-plastsprøyter og små ringer av glass-fiberfilterpapir (Whatman GF/A) ble plassert inne i kolonnene for å dekke deres utløp. Kromatografimediet, dietylaminoetylcellulose (Whatman DE-52) ble forsiktig helt inn i hver kolonne og fikk stabilisere seg, noe som ga et sjiktvolum på omtrent 4 ml. En annen glåssfilterpapirring ble plassert på toppen av den pakkede kolonne. Example 1: Preparation of Purified Adenosine Diphosphate Reagent Liquid chromatography was used to further purify high purity commercial ADP (>99r95%) (Sigma). Small columns were formed from 10 ml disposable plastic syringes and small rings of glass fiber filter paper (Whatman GF/A) were placed inside the columns to cover their outlets. The chromatography medium, diethylaminoethylcellulose (Whatman DE-52) was carefully poured into each column and allowed to stabilize, giving a bed volume of approximately 4 mL. Another glass filter paper ring was placed on top of the packed column.

Etter vasking av kolonnen med omtrent 15 ml elueringsmiddel (0,02M HC1), ble 100 mM ADP med høy renhet i omtrent 0,5 ml 0,02M HCl påført og eluering ble gjennomført med 0,02M HC1 som strømmer med en hastighet på l ml pr. min. Fraksjoner på 3 til 4 ml ble samlet i engangs-plastkyvetter som tillot at optisk tetthet, og derved ADP, passende kunne måles (ved 265 nm). De initiale fraksjoner med høye ADP/ATP-forhold ble beholdt for bruk. After washing the column with about 15 ml of eluent (0.02M HCl), 100 mM high purity ADP in about 0.5 ml of 0.02M HCl was applied and elution was carried out with 0.02M HCl flowing at a rate of l ml per my. Fractions of 3 to 4 ml were collected in disposable plastic cuvettes which allowed optical density, and thus ADP, to be conveniently measured (at 265 nm). The initial fractions with high ADP/ATP ratios were retained for use.

For å bestemme resultatet av denne rensing, ble kommersielt tilgjengelige luciferin/luciferase-preparater (Enzymatrix, Cambridge, UK og HM fra Biotrace, Bridgend, UK) anvendt i henhold til produsentens instruksjoner for å påvise mengden av tilstedeværende ATP. Lignende tester ble gjennomført i nærvær av adenylatkinase for å bestemme ADP-nivåer. To determine the outcome of this purification, commercially available luciferin/luciferase preparations (Enzymatrix, Cambridge, UK and HM from Biotrace, Bridgend, UK) were used according to the manufacturer's instructions to detect the amount of ATP present. Similar tests were carried out in the presence of adenylate kinase to determine ADP levels.

50 fil av en 1/3000 fortynning av 100 mM kommersiell ADP med høy renhet (Sigma) ga et luminometertall på 8.919, og dette er et mål på ATP-forurensningsnivåer. Etter inkubasjon med 100 femtomol adenylatkinase ga den samme prøve et tall på 1.370.839, idet dette er et mål på mengden ADP. En kolonne-renset fraksjon avledet fra denne ADP-løsning ga et ATP-tall på 223 og et adenylatkinasetall på 1.442.054 under de samme betingelser. Forholdet mellom signal og bakgrunn i dette tilfelle var forbedret fra 153 til 6466. 50 μl of a 1/3000 dilution of 100 mM high purity commercial ADP (Sigma) gave a luminometer count of 8,919, and this is a measure of ATP contamination levels. After incubation with 100 femtomoles of adenylate kinase, the same sample gave a number of 1,370,839, this being a measure of the amount of ADP. A column-purified fraction derived from this ADP solution gave an ATP number of 223 and an adenylate kinase number of 1,442,054 under the same conditions. The ratio of signal to background in this case was improved from 153 to 6466.

Eksempel 2: Alternativ fremstillin<g> av adenosindi fosfatreaaens ADP med høy renhet ble ytterligere renset ved innvirkning av apyrase på kontaminerende ATP. 0,1 mM oppløsninger ble dannet med ADP avledet.fra to forskjellige kilder. Én (A) ble solgt som 98 % ren og den andre (B) som 99 % ren. Kommersielt tilgjengelige luciferin/luciferase-preparater ble anvendt for å bestemme ATP, idet luminometertallene fra prøver A og B er henholdsvis 54.768 og 305.500. 8 fil av en 100 enhet pr. ml apyraseoppløsning (potetapyrase: Sigma) ble deretter tilsatt til 10 ml 0,1 mM oppløsninger av A og B. Etter inkubasjon ved romtemperatur i omtrent 2 2 timer med etterfølgende koking for å ødelegge apyrasen ble luminometertall på 5100 for A og 6600 for B oppnådd, noe som viser et markert fall i mengden kontaminerende ATP. Example 2: Alternative preparation<g> of high purity adenosine phosphate reagent ADP was further purified by the action of apyrase on contaminating ATP. 0.1 mM solutions were made with ADP derived from two different sources. One (A) was sold as 98% pure and the other (B) as 99% pure. Commercially available luciferin/luciferase preparations were used to determine ATP, the luminometer numbers from samples A and B being 54,768 and 305,500 respectively. 8 file of a 100 unit per ml of apyrase solution (potatopyrase: Sigma) was then added to 10 ml of 0.1 mM solutions of A and B. After incubation at room temperature for about 2 2 h with subsequent boiling to destroy the apyrase, luminometer numbers of 5100 for A and 6600 for B were obtained , which shows a marked drop in the amount of contaminating ATP.

Eksempel 3: Vurdering av analyse av fri adenylatkinase Stamløsninger av adenylatkinasen for analyse ble dannet i fosfatbufret saltvann med pH 7,2 inneholdende 1% BSA og 0,25% Triton X-100 og analysen ble utført i 3 ml engangsplastrør egnet for luminometri. 200 /il Tris-buffer med pH 7,8 ble pippetert inn i analyserøret og til dette ble det tilsatt 100 fil av omtrent l mM ADP (renset som angitt detaljert i det foregående). 10 fil adenylatkinase, fortynnet i Tris-buffer med pH 7,8 ble deretter tilsatt for å starte reaksjonen. Example 3: Assessment of analysis of free adenylate kinase Stock solutions of the adenylate kinase for analysis were formed in phosphate-buffered saline with pH 7.2 containing 1% BSA and 0.25% Triton X-100 and the analysis was carried out in 3 ml disposable plastic tubes suitable for luminometry. 200 µl of Tris buffer with pH 7.8 was pipetted into the assay tube and to this was added 100 µl of approximately 1 mM ADP (purified as detailed above). 10 µl of adenylate kinase, diluted in Tris buffer of pH 7.8 was then added to start the reaction.

Røret ble spinn-blandet og fikk stå for inkubasjon ved romtemperatur. Etter inkubasjon i 10 min., ble 100 til 150 fil luciferin/luciferase reagens tilsatt og lyset produsert fra ATP dannet ved aktiviteten av adenylatkinasen ble målt umiddelbart i et luminometer (se tabell 1). The tube was spin-mixed and allowed to stand for incubation at room temperature. After incubation for 10 min., 100 to 150 µl of luciferin/luciferase reagent was added and the light produced from ATP formed by the activity of the adenylate kinase was measured immediately in a luminometer (see Table 1).

Det skal bemerkes at analysens følsomhet kan økes ved anvendelse av høyere konsentrasjoner av ADP i reaksjonsmediet, da K,,, for adenylatkinase er i millimolar-området. Kommersielt ■ tilgjengelig ADP inneholdende betydelige mengder ATP gjør bruk av slike millimolar-mengder ADP uønsket, men bruk av renset ADP i henhold til oppfinnelsen tillater en slik økning med tilhørende fordeler, økende' inkubasjonstid vil likeledes øke sensitiviteten. It should be noted that the sensitivity of the assay can be increased by using higher concentrations of ADP in the reaction medium, as K,,, for adenylate kinase is in the millimolar range. Commercially available ADP containing significant amounts of ATP makes the use of such millimolar amounts of ADP undesirable, but the use of purified ADP according to the invention allows such an increase with associated advantages, increasing' incubation time will likewise increase sensitivity.

Ukjente adenylatkinasenivåer ble estimert under henvisning til en kalibreringskurve som relaterer kjente konsentrasjoner av adenylatkinase til ATP dannet ved 10 minutters inkuberingen. På grunn av analysens følsomhet er det ønskelig å ta forholds-regler mot tilfeldige kontaminering med ATP eller adenylatkinase. Analysene bør gjennomføres i en laminær strømnings-kappe ved anvendelse av ATP-frie oppløsninger, engangsgummi-hansker og plast-bruksgjenstander med lav ATP, der det er mulig. Unknown adenylate kinase levels were estimated by reference to a calibration curve relating known concentrations of adenylate kinase to ATP formed during the 10 minute incubation. Due to the sensitivity of the analysis, it is desirable to take precautions against accidental contamination with ATP or adenylate kinase. The analyzes should be carried out in a laminar flow hood using ATP-free solutions, disposable rubber gloves and plastic consumables with low ATP, where possible.

Det fremgår at når adenylatkinase anvendes for å bestemme den sannsynlige tilstedeværelse av spesielle organismer kan nøy-aktig kvantifisering økes dersom mengden adenylatkinase som de forventes å inneholde estimeres. Følgelig vil kalibrerings-kurver dannet ved anvendelse av de spesifikke målorganismer være best å anvende. It appears that when adenylate kinase is used to determine the likely presence of particular organisms, accurate quantification can be increased if the amount of adenylate kinase that they are expected to contain is estimated. Consequently, calibration curves formed using the specific target organisms would be best to use.

Eksempel 4 : Analyse av E. coli Example 4: Analysis of E. coli

En uke gammel E. coli kultur inneholdende omtrent 2,2 x IO<7 >mikroorganismer pr. 2 00 fil fosfatbufret saltvann med pH 7,4 ble anvendt som en stamløsning og fortynnet i 10 påfølgende fortynninger med denne buffer til å gi prøver med fra IO<7> til 0,1 organismer pr. 200 ^1 prøve. Bufferen sørger for fosfat-reaktant for ATP syntese. A week-old E. coli culture containing approximately 2.2 x 10<7 >microorganisms per 200 µl phosphate buffered saline pH 7.4 was used as a stock solution and diluted in 10 successive dilutions with this buffer to give samples with from 10<7> to 0.1 organisms per 200 ^1 sample. The buffer provides the phosphate reactant for ATP synthesis.

Hver 200 fil prøve ble tilsatt til et 3 ml luminometerrør, Each 200 μl sample was added to a 3 ml luminometer tube,

10 fil l mM ADP og 100 ^1 0,1 % vandig cetyltrimetylammoniumbromid ble tilsatt og den oppnådde blanding ble inkubert ved romtemperatur i l min. Etter denne inkubasjon ble 100 fil aldret Biotrace HM (2 år gammel uten påvisbar adenylatkinaseaktivitet) tilsatt og emittert lys ble bestemt i løpet av et første 10 sekunders intervall og deretter i løpet av 10 sekunders intervaller opp til ett minutt for å bestemme økningen i lys på kumulativ måte ved anvendelse av et Biotrace M3 luminometer. Den initiale signalverdi ble subtrahert fra den siste avlesning for å oppnå et mål på signalet i tellinger pr. min. 10 µl of 1 mM ADP and 100 µl of 0.1% aqueous cetyltrimethylammonium bromide were added and the resulting mixture was incubated at room temperature for 1 min. After this incubation, 100 µl aged Biotrace HM (2 years old with no detectable adenylate kinase activity) was added and emitted light was determined during an initial 10 second interval and then during 10 second intervals up to one minute to determine the increase in light on cumulative manner using a Biotrace M3 luminometer. The initial signal value was subtracted from the last reading to obtain a measure of the signal in counts per my.

Tellinger høyere enn kontroll oppnådd i løpet av minutt-inku-basjonen varierte med antall E. coli som følger: 10<6> - 392 97 cpm, IO<5> - 3199 cpm, IO<4> - 189 cpm, IO<3> - 67 cpm, 10<2> - 26 cpm. Ytterligere resultater er vist i fig. 1. Counts higher than control obtained during the minute incubation varied with the number of E. coli as follows: 10<6> - 392 97 cpm, IO<5> - 3199 cpm, IO<4> - 189 cpm, IO<3 > - 67 cpm, 10<2> - 26 cpm. Further results are shown in fig. 1.

Effekten av ekstraksjonsmiddel på luciferase/luciferin-systemet er kjent for å være viktig (se f.eks. Simpson ét al (1991) J. Biolumin Chemilumin 6(2) s. 97-106), idet kationiske detergenter er kjent til å forsterke reaksjonen men til å gi grad-vis inaktivering av luciferase, hvor anionisk detergent inhi-berer' reaksjonen og hvor ikke-ioniske og zwitterioniske detergenter er kjent til å forsterke innen et stort.område. For å bestemme effektene av detergent på adenylatkinaseanalysen av E. coli celler ble den protokoll som er anvendt i det foregående endret i den grad at forskjellige "ekstraksjonsmidler" ble anvendt for analyse av IO7 E. coli i 200 ftl fosfatbufret saltvann. The effect of extractant on the luciferase/luciferin system is known to be important (see eg Simpson et al (1991) J. Biolumin Chemilumin 6(2) pp. 97-106), cationic detergents being known to enhance the reaction but to give gradual inactivation of luciferase, where anionic detergent inhibits the reaction and where non-ionic and zwitterionic detergents are known to enhance within a large range. To determine the effects of detergent on the adenylate kinase assay of E. coli cells, the protocol used above was modified to the extent that different "extractants" were used for the assay of 107 E. coli in 200 ftl of phosphate buffered saline.

De høyeste tall ble oppnådd ved anvendelse av Lumac NMR mens CETAB ga 226.924 cpm og de to andre ekstraksjonsmidler ga hhv. 79.280 og 29.280 cpm. Dette er ikke overraskende sett på bakgrunn av funnene til Simpson et al med hensyn til skadelige effekter av kationiske og anioniske detergenter på luciferase, og det betraktes som sannsynlig at disse reagenser, som er utformet for bruk med luciferase/luciferin bare for ATP analyse, har inhiberende effekt på adenylatkinase. The highest numbers were obtained using Lumac NMR while CETAB gave 226,924 cpm and the other two extractants gave respectively. 79,280 and 29,280 cpm. This is not surprising given the findings of Simpson et al regarding deleterious effects of cationic and anionic detergents on luciferase, and it is considered likely that these reagents, which are designed for use with luciferase/luciferin only for ATP analysis, have inhibitory effect on adenylate kinase.

Eksempel 5: Lokalisering av adenylatkinase påvist i E. coli Example 5: Localization of adenylate kinase detected in E. coli

analyse analysis

For å bestemme lokaliseringen av adenylatkinasen som er påvist i forsøket i eksempel 4 ble antall tellinger pr. minutt oppnådd ved anvendelse av nye uvaskede E. coli celler, nye vas-kede celler, celler lagret i -3 døgn ved 37°C og som var uvaskede, og mediet fra nye celler som prøven. Resultatene fra disse analyser viste at det meste av adenylatkinasen er intracellulær, idet mindre enn 10% frigies inn i mediet, og at adenylatkinasenivået ikke varierer betydelig med cellenes alder (se fig. l). In order to determine the location of the adenylate kinase that has been detected in the experiment in example 4, the number of counts per minute obtained by using new unwashed E. coli cells, new washed cells, cells stored for -3 days at 37°C and which were unwashed, and the medium from new cells as the sample. The results from these analyzes showed that most of the adenylate kinase is intracellular, with less than 10% being released into the medium, and that the adenylate kinase level does not vary significantly with the age of the cells (see fig. l).

Eksempel 6: Apparat i henhold til oppfinnelsen Example 6: Apparatus according to the invention

Et apparat i henhold til oppfinnelsen utgjøres av en karusell-transportør l som er utstyrt med stativer som er egnet for å holde åpne luminometerrør 2 med et antall reagenstilsetnings-stasjoner som er plassert på forskjellige punkter langs beve-gelsesretningen derav. Luminometerrør 2 inneholdende prøver som skal analyseres settes på karusellen i begynnelsen av kjøringen og føres til den første stasjon hvor datamaskin-styrte peristaltiske pumper 3 gir en tilførsel av kationisk detergent 4 og ADP reagens 5 i de påkrevde mengder på hhv. 100 lii og 10 fil. Karusellen fører deretter røret til et lumino-meterområde 6 hvor samtidig 10 0 /zl lucif erase/lucif erin-reagens (f.eks. Biotrace HM) tilsettes ved anvendelse av en datamaskinstyrt peristaltisk pumpe 7 for å kontrollere av-levering fra forsyning 8. Røret bruker minst 1 min. til å bevege seg fra detergent/ADP-stasjonen til luminometer/luciferase/luciferin-stasjonen for å tillate mikroorganismened-brytelse og ATP syntese. An apparatus according to the invention consists of a carousel conveyor 1 which is equipped with racks which are suitable for holding open luminometer tubes 2 with a number of reagent addition stations which are placed at different points along the direction of movement thereof. Luminometer tubes 2 containing samples to be analyzed are placed on the carousel at the beginning of the run and taken to the first station where computer-controlled peristaltic pumps 3 provide a supply of cationic detergent 4 and ADP reagent 5 in the required amounts of, respectively. 100 lii and 10 fil. The carousel then guides the tube to a luminometer area 6 where simultaneously 10 0 /zl lucif erase/lucif erin reagent (e.g. Biotrace HM) is added using a computer controlled peristaltic pump 7 to control delivery from supply 8. The pipe takes at least 1 min. to move from the detergent/ADP station to the luminometer/luciferase/luciferin station to allow microorganism degradation and ATP synthesis.

Etter tilsetning av luciferase/luciferin-reagenset forblir røret i luminometerområdet i 70 sek. mens 7 avlesninger som-tellinger pr. 10 sekunders periode utføres, og hvor den kumu-lative verdi etter 10 sek. subtraheres fra verdien etter 70 sek. til å gi tellinger pr. minutt. Denne beregning gjennom-føres i en tilknyttet datamaskin 9 matet med et cpm-signal ved hjelp av luminometeret og resultater for hvert rør påsatt karusellen vises på en skjermenhet 10. På denne måte kan datamaskinen styre tilførselstiden for reagenser til et kjent rør for å variere inkubasjonsperioden om nødvendig. After adding the luciferase/luciferin reagent, the tube remains in the luminometer area for 70 sec. while 7 readings as counts per 10 second period is performed, and where the cumulative value after 10 sec. is subtracted from the value after 70 sec. to give counts per minute. This calculation is carried out in an associated computer 9 fed with a cpm signal by means of the luminometer and results for each tube attached to the carousel are displayed on a display unit 10. In this way the computer can control the supply time of reagents to a known tube to vary the incubation period if necessary.

Eksempel 7: Testkit i henhold til oppfinnelsen Example 7: Test kit according to the invention

Et testkit i henhold til oppfinnelsen utgjøres av en beholder med renset ADP oppløsning (>99,95 % ren) fremstilt som beskrevet i eksempel 1 eller 2 på 10 mM (økt konsentrasjon i forhold til den metoden som beskrevet i eksempel 4 for å øke sensitiviteten), en beholder med aldret luciferase/luciferin-løsning (Biotrace HM) og en beholder med cetyltrimetylammoniumbromid (0,1 % i vann), som alt er pakket sammen med instruksjoner for anvendelse i forbindelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Por anvendelse i mobile laboratorier kan pakningen være i form av en plastboks med elastiske innfat-ninger for hver beholder, dvs. skumfyllmateriale med fordyp-ninger med form av beholderens utvendige form. A test kit according to the invention consists of a container with purified ADP solution (>99.95% pure) prepared as described in example 1 or 2 at 10 mM (increased concentration compared to the method described in example 4 to increase sensitivity ), a container of aged luciferase/luciferin solution (Biotrace HM) and a container of cetyltrimethylammonium bromide (0.1% in water), all of which are packaged together with instructions for use in connection with the method according to the invention. For use in mobile laboratories, the packaging can be in the form of a plastic box with elastic frames for each container, i.e. foam filling material with recesses shaped like the outer shape of the container.

I pakningen er det eventuelt inkludert en beholder med ikke-ionisk detergentløsning (Triton X-10 0 0,2 % eller en ekvi-valent) og/eller en beholder med en ATPase som apyrase for nedbrytning av ATP frigitt ved virkningen av den ikke-ioniske detergent på en prøve, noe som gjør den egnet for reanalyse ved tilsetning av den kationiske detergent. In the package, there is optionally included a container with non-ionic detergent solution (Triton X-10 0.2% or an equivalent) and/or a container with an ATPase such as apyrase for breaking down ATP released by the action of the non- ionic detergent on a sample, which makes it suitable for reanalysis by adding the cationic detergent.

Fosfatbuffer kan være inkludert i kitet som en separat buffer eller kan være inkludert i detergenten elier ADP-reagensbehol-derne, særlig dersom disse er i sluttkonsentrasjon. Alternativt kan bufferen være inkludert med detergenten og/eller ADP i en konsentrert form for fortynning. Phosphate buffer can be included in the kit as a separate buffer or can be included in the detergent or the ADP reagent containers, especially if these are in final concentration. Alternatively, the buffer may be included with the detergent and/or ADP in a concentrated form of dilution.

Claims

1. Procedure for determining the presence and/or amount of microorganisms and/or their intracellular material present in a sample, characterized in that it comprises estimating the amount of adenylate kinase therein by its ability to convert adenosine diphosphate (ADP) to adenosine triphosphate (ATP) and relating this to the presence and/or amount of microorganisms and/or intracellular material.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that the sample is an aqueous suspension or solution and that the estimation of adenylate kinase therein is carried out by adding ADP under conditions whereby any adenylate kinase present will convert this to ATP, adding luciferase and luciferin agents, determining the amount light emitted from the sample and to relate this to the presence and amount of adenylate kinase.

3. Method as stated in claim 2, characterized in that ADP has an ADP/ATP ratio of 2000/1 or greater.

4. ■ Method as stated in claim 2, characterized in that ADP is that which is obtained by separating commercial ADP with a high purity of over 98% into ADP and ATP fractions by passing it through a column of diethylaminoethyl cellulose by elution with 0.02M hydrochloric acid at a rate of 1 ml per my.

5. Method as stated in claim 2, characterized in that ADP has a purity with respect to ATP such that 50 µl of a 1/3000 dilution of a 100 mM solution of ADP gives less than 10,000 counts per my. as determined with 10 0 /l Biotrace Enzyme HM luciferase and luciferin reagent.

6. Procedure as specified in claim 5, characterized in that ADP issues less than 300 counts per my. as determined with 100 fil Biotrace Enzyme HM luciferase and luciferin reagent.

7. Method as stated in claim 2, characterized in that ADP has a purity with respect to ATP whereby the molar ratio between ADP and ATP is more than 6000.

8. A method as set forth in claim 2, characterized in that ADP is obtained by treating ADP of 98% or higher purity with an ADPase for a time sufficient to reduce its ATP to 0.1 mol% or less.

9. Method as stated in claim 2, characterized in that the luciferase agent has been treated to eliminate its adenylate kinase activity.

10. Method as stated in claim 9, characterized in that the adenylate kinase in the luciferase has been removed by size exclusion chromatography, by reverse-phase chromatography or both.

11. Method as stated in claim 2, characterized in that luciferase and/or luciferin is added - just before or while measurements are being carried out so that any contaminating adenylate kinase does not have time to produce a significant effect.

12. Procedure as stated in one or more of the preceding claims, characterized in that the sample is pre-treated to break down any microorganisms present so that the intracellular material is released or otherwise exposed to the analysis reagents.

13. Method as stated in claim 12, characterized in that the treatment regarding decomposition is carried out using detergents.

14. Method as stated in claim 13, characterized in that the detergent comprises a cationic detergent.

15. Method as stated in claim 13, characterized in that the analysis is also carried out on a sample that has been pre-treated with non-ionic detergent and that the amount of ATP that is formed is subtracted from that formed when the analysis is used with a cationic detergent.

16. Apparatus suitable for use in a method as stated in one or more of claims 1-15, characterized in that it comprises means (2), to receive a sample to be analyzed for the presence of microorganisms or their intracellular content in an aqueous suspension or solution, means (3,5,7,8) for adding ADP, luciferase and luciferin to the suspension and means (6) for detecting generated light where a carrier (1) is provided to move the sample and the means (6 ) relative to each other for the purpose of sequential operation.

17. Apparatus as stated in claim 16, characterized in that it further comprises a means for adding detergent to the suspension before the means for adding luciferase and luciferin.

18. Apparatus as stated in claim 17, characterized in that the ADP reagent is added with the detergent.

19. Apparatus as stated in one or more of claims 16 - 18, characterized in that it further comprises a station for detecting light where luciferase and luciferin are added to the sample before light emitted therefrom is measured with the means for detecting light.

20. Apparatus as stated in claim 16, characterized in that it comprises a transporter which receives a volume of liquid medium containing the sample and which carries this through one or more reagent stations to the means for detecting light.

21. Apparatus as stated in claim 20, characterized in that it comprises a transporter which is adapted to receive a series of luminometry tubes which are previously filled with an aqueous liquid suspension of material to be tested for the presence of microorganisms or which is passed through a station in the apparatus where such a suspension is placed therein.

22. Test kit for the detection and/or quantification of microorganisms using the method as stated in one or more of claims 1-15, characterized in that it comprises adenosine diff osf at, luciferase and luciferin.

23. Test kit as stated in claim 22, characterized in that it further comprises a detergent reagent which is suitable for breaking down the target microorganism cells for which detection and/or quantification is intended.

24. Test kit as stated in claim 22 or 23, characterized in that it comprises cationic and non-ionic detergent reagents.

25. ADP reagent for use in the detection and/or quantification of microorganisms or their intracellular content by means of a method as stated in one or more of claims 1 to 15, characterized in that it comprises ADP with purity, with respect to ATP, so that the molar ratio between ADP and ATP is 2,000/1 or greater.

26. ADP reagent comprising ADP as stated in claim 25, characterized in that the molar ratio between ADP and ATP is 99.99/0.1 or greater.

27. Test kit as stated in one or more of claims 22 - 24, characterized in that the ADP reagent is as stated in claim 25 or 26.

28. Test kit as specified in one or more of claims 22 - 24 or 27, characterized in that the luciferase is largely free of adenylate kinase activity.

29. Test kit as specified in one or more of claims 22 - 24 or 27, characterized in that the luciferase/luciferin ratio used, or the instructions therein which refer to the dilution of one or more such reagents, is such that the luciferase is able to act sufficiently quickly on the luciferin substrate so that luciferase-associated adenylate kinase forms ATP after the initial issue is closed.