NO314091B1 - Varmelabil uracil-DNA-glykosylase, DNA-sekvens som koder for enzymet, mikroorganisme som inneholder DNA-sekvensen, samt anvendelse av enzymet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et varmelabilt enzym med uracil-DNA-gyklosyklase (UDG) -aktivitet, DNA-sekvens som koder for enzymet, mikroorganisme som inneholder DNA-sekvensen, samt anvendelse av enzymet

Uracil i DNA kan resultere fra inkorporering av dUTP istedenfor dTTP under replikasjon eller fra deaminering av cytosin i DNA. Det siste resulterer i en mutasjon ved den neste runde av replikasjon. Enzymet uracil-DNA-glykosylase (UDG, EC 3.2.2.3) fungerer som et reparasjonsenzym for slik skade i DNA slik at uracilbasen klippes ut fra DNA-tråden (Lindahl 1994), og det skapes et apyrimidin-sete som gjenkjennes av andre DNA-reparasjonsenzymer. Dette enzymet er avgjørende for å opprettholde DNA-integritet, og har derfor blitt funnet i en rekke organismer; virus, prokaryoter og eukaryoter.

Uracil-DNA-glykosylase (UNG eller UDG) katalyserer hydrolysen av N-glykosylbindingen mellom deoksyribosesukkeret og basen i uracilinneholdende DNA, og ble først isolert og karakterisert fra Escherichia coli (1). Dette er det første trinnet i baseutklippingsreparasjons (BER) reaksjonsveien og fjerner uracil fra DNA (2), og apyrimidinsetet som dannes, repareres deretter av en AP-endonuklease, fosfodiesterase, DNA-polymerase og DNA-ligase (andre enzymer) i BER-reaksjonsveien (3-5).

En rekke klasser av uracil-DNA-glykosylaser (UNG eller UDG) har blitt beskrevet. Den cellulære hovedformen av UNG er UNG som kodes for av UNG-genet (6). Andre klasser omfatter cyklinlignende human UDG2 (7,8), enkeltkjedeselektiv monofunksjonell UDG SMUG1 fra human Xenopus (9), G/T:U-spesifikk mismatch-DNA-glykosylase (MUG) isolert fra E. coli (10,11) og Thermotoga maritima UDG (TMUDG) (12).

UNG er et monomert protein omtrent 25-35 kD i størrelse. Det er ikke avhengig av andre kofaktorer eller divalente kationer og er høyt konservert mellom de ulike artene [13]. UNG er imidlertid påvirket av ionestyrke. UNG-enzymet er blitt vist å virke i en prosessiv "glidende mekanisme", hvor det lokaliserer sekvensielle uracilresterfør dissosiasjon fra DNA [14,15], og en distributiv "tilfeldig treff-mekanisme [16]. UNG har tidligere blitt isolert og karakterisert fra rottelever [17-19], humane celler og vev [20-28], kalvethymus [29, 30], slimsopp

[31], gjær [32], planter [33, 34], saltvannsreker [35], prokaryoter [1, 36-45] og virus [46,47]. I menneske og rotte, har det blitt isolert både et mitokondrielt og nukleært UNG [18, 25]. I menneske (og mus) celler kodes disse to av det samme genet (UNG) [48, 49]. Ved to ulike transkripsjonsstartsteder og alternativ spleising, dannes det to former som skiller seg kun i N-terminalsignalsekvens som målretter enzymet til nukleus (UNG2) og mitokondria (UNG1), henholdsvis [49]. Nylig har flere studier blitt utført for ytterligere å studere den N-terminale signalsekvensen, og målgivingen av UNG til nukleus og mitokondria [50-52] har åpenbart at nukleær UNG2 er fosforylert [26]. Krystallstrukturene av UNG fra menneske, herpes simplexvirus og E. coli er blitt oppklart [53-55]. Restene i det aktive setet er konservert, og virkningsmåten i disse enzymene synes å være den samme med en nukleotidflippemekanisme for å fjerne uracil fra DNA [56, 57]. Enzymer fra kuldetilpassede organismer slik som atlantisk torsk ( Gadus morhua), må kompensere for reduksjonen av kjemiske reaksjonshastigheter ved lave temperaturer for å kunne opprettholde tilstrekkelig metabolsk aktivitet. Dette kan oppnås ved høyere transkripsjonelle/translasjonelle nivåer eller forbedret katalytisk effektivitet ( kcat/ KM). Høyere katalytiske effektiviteter kan oppnås ved en mer fleksibel struktur sammenlignet med deres mesofile motparter som tilveiebringer forsterket evne til å undergå konformasjonelle endringer under katalysen. Redusert stabilitet til pH, temperatur og denaturerende midler anses som en konsekvens av konformasjonell fleksibilitet [58]. Foreliggende oppfinnelse vedrører en varme-labil uracil-DNA-glykosylase fra en kuldetilpasset organisme, og som har anvendelse som et enzym effektivt i "carry-over-prevention" i DNA-kopieringsreaksjoner (PCR, LCR, etc). Det isolerte enzymet i henhold til foreliggende oppfinnelse har lignende karakteristikker som tidligere beskrevne UNG'er med hensyn til molekylvekt, isoelektrisk punkt, pH og NaCI-optima. Imidlertid har enzymet i henhold til foreliggende oppfinnelse, vist seg å være mer pH-labilt og varmelabilt og har en høyere relativ aktivitet ved lave temperaturer sammenlignet med et rekombinant mesofilt human UNG, noe som gjør det til en bedre kandidat i "carry-over-prevention"-tester som indikert over. UDG fra Escherichia coli har vært kommersielt tilgjengelig for anvendelse i "carryover prevention" når DNA-materiale skal amplifiseres. Forskjellige teknikker kan utnyttes for å amplifisere spesifikke DNA-sekvenser på basis av et DNA-templat. Vanlige teknikker er polymerasekjede-reaksjon (PCR) system (US patentnr. 4 683 195,4 683 202 og 4 965 188), ligase-amplifikasjonssystemet (PCT patentpublikasjon nr. 89/09835), det selvopprett-holdte sekvensreplikasjonssystemet (EP nr. 329 822 og PCT patentpublikasjon nr. 90/06995), det transkripsjonsbaserte amplifikasjonssystemet (PCT patentpublikasjon nr. 89/01050 og EP nr. 310 229) og Qp RNA-replikasesystemet (US patent nr. 4 957 858). Disse teknikkene er svært sensitive på den måten at de kan produsere påvisbare DNA-mengder fra svært få kopier av en mål-DNA-sekvens. Tilsvarende er teknikkene svært sensitive for kontaminering av DNA fra omgivelsene. Hovedkilden for kontaminasjon er produkter fra tidligere utførte oppskaleringsreaksjoner som for eksempel PCR-reaksjoner (59). For å overvinne dette problemet, er det blitt utviklet en metode for å skille mellom mål-DNA og kontaminerende DNA fra tidligere reaksjoner, for eksempel PCR-produkt-DNA (Longo et al., 1990, Hartley, 1990). I det vesentlige utføres alle amplifikasjonsreaksjoner ved bruk av dUTP for å erstatte dTTP for derved å inkorporere uracil i DNA i stedet for tymidin. Alle videre reaksjonsblandinger behandles så med UDG. Følgende varmebehandling degraderer kontaminerende DNA ved hydrolyse av fosfodiesterbindingen ved ikke-baseseter. Varmebehandlingen forutsetter også å inaktivere UDG-enzymet. Imidlertid inaktiveres ikke UDG-enzymet fra E. coli eller psykrofil marin bakterie, BMTU fullstendig ved varmebehandling, og inaktiveringen er ikke fullstendig irreversibel (45 og 60). Ifølge sammenlignende analyser av restaktivitet, er det konkludert med at UNG fra BMTU inaktiveres bedre enn UNG fra E. coli, men at restaktiviteten fremdeles er betydelig for den anvendelse som er tenkt. Dette påvirker oppskaleringsreaksjonen, for eksempel PCR-reaksjonen, produktintegritet, siden produktene degraderes med rest-UDG-enzymaktivitet. For å unngå dette, er det etterpå blitt tilsatt enzym inhibitor for UDG (US patent nr. 5 536 649). Imidlertid vil det foretrekkes å unngå å benytte ytterligere inhibitor fordi dette representerer et ekstra trinn i reaksjonsprosedyren, restkontaminasjon av inhibitoren kan være tilstede i senere reaksjoner, og kjøpet av inhibitor representerer en ekstra kostnad når PCR-reaksjoner utføres, som beskrevet over. Derfor vil det være en fordel å benytte et UDG-enzym som sikkert ødelegges/inaktiveres ved varmebehandlingen etter PCR-reaksjonen for derved å unngå tilsetning av spesifikke, kjemiske inhibitorer for UDG-enzymet. Figur 1 viser pl-bestemmelse av atlantisk torske-UNG (cUNG). Etter isoelektrisk fokusering ved bruk av Phast Gel I EF 3-9, ble gelen kuttet i stykker på 2 mm. Hvert stykke ble overført til et eppendorfrør og inkubert over natt ved 4°C. Aktiviteten ble så målt som beskrevet i materialer og metoder. Figur 2 viser produktinhibering av cUNG med fri uracil. Ulike konsentrasjoner av uracil ble tilsatt til testblandingen, og testen utført som beskrevet i materialer og metoder. Figur 3 viser inhibering av cUNG med Bacillus subtilis bakteriofag uracil-DNA-glykosylaseinhibitor (Ugi). 6,65 x 10"<4> U av cUNG ble inkubert med 1,25 x 10<3> U til 2,00 x 10<2> U av Ugi ved bruk av standard testbetingelser som beskrevet i materialer og metoder. Én enhet av Ugi inhiberer én enhet av UNG-aktivitet, hvor UNG-aktivitet er definert som frigjøring av 60 pmol av uracil pr. minutt ved 37°C. Figur 4 viser pH og NaCI-optimum av cUNG. Aktivitet av cUNG ble målt med variable natriumkloridkonsentrasjoner i forskjellige pH-serier som beskrevet i materialer og metode. Prosent UNG-aktivitet er satt relativt til den høyeste verdi målt, pH 7,5 med 50 mM NaCI. Figur 5 viser temperaturoptimum av cUNG. På grunn av forlenget inkubering av enzymprøven på is under eksperimentet, er aktiviteten korrigert med hensyn til stabilitet av enzymet som beskrevet i materialer og metoder. Figur 6 viser temperaturprofil av cUNG (A) og rhUNG (■). Enzymaktivitet ble målt som beskrevet i materialer og metoder. Prosent UNG-aktivitet er satt relativt til den høyeste verdi for cUNG (45°C) og rhUNG (50°C) henholdsvis. På grunn av forlenget inkubering av enzymprøvene på is under eksperimentet, er aktiviteten korrigert med hensyn til stabilitet av enzymene som beskrevet i materialer og metoder. Figur 7 viser pH-stabilitet av atlantisk torske-UNG (cUNG) og rekombinant human UNG (rhUNG). I de forskjellige pH-buffere, ble 1 U av cUNG (A) eller rhUNG (■) inkubert i 10 minutter ved 37°C. Så ble 5 \ x\ alikvoter overført til testblandingen, og restaktivitet målt ved bruk av standard testbetingelser som beskrevet i materialer og metoder. 100% aktivitet ble målt direkte fra en prøve fortynnet ved pH 8,0 uten noe inkuberingstrinn. Figur 8 viser temperaturstabilitet av atlantisk torske-UNG (cUNG) (A) og rekombinant human UNG (rhUNG) (■) Enzym (1 U) ble inkubert ved 50°C, 37°C, 25°C og 4°C, og 5 \ i\ alikvoter ble overført til testblandingen etter ulike tidsintervaller, og standardtester ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Halveringstider ble bestemt til 0,5 minutter (50°C), 20 minutter (37°C), 60 minutter (25°C) og 2 timer (4°C) for cUNG og 8 minutter (50°C), 30 minutter (37°C), 150 minutter (25°C) og 2,6 timer (4°C) for rhUNG. Figur 9 viser agarosegel som viser PCR-produkter fra "carry-over-prevention"-test ved bruk av rekombinant torske-UNG (rcUNG). Sporbeskrivelser: spor 1 og 8: DNA-stige; spor 2: T-inneholdende templat, ikke noe UNG; spor 3: T-inneholdende templat, 1,7 x 10"<3> U rcUNG; spor 4: U-inneholdende templat, 4 x 10"<4> U rcUNG; spor 5: U-inneholdende templat, 1,7 x 10"<3> U rcUNG; spor 6: U-inneholdende templat, 4 x 10"<*> U E. coli UNG; spor 7: U-inneholdende templat, ikke noe UNG. Oet er formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et nytt UDG-enzym som er funksjonelt i "carry-over-prevention"-teknikker for DNA-amplffikasjonsreaksjoner, for eksempel PCR, indikert over, og som fullstendig og irreversibelt inaktiveres av varmebehandlingen normalt utført i PCR-reaksjons-syklusene. Oppfinnelsen tilveiebringer således et enzym med uracil-DNA-glykosylase (UDG) -aktivitet og som er fullstendig deaktivert når det er oppvarmet til en temperatur over 60°C, og som ikke reaktiveres. Videre er det er formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en DNA-sekvens som koder for et slikt enzym eller en aktiv del derav, eventuelt som inneholdes i en vektor eller vektorsystem (foreksempel et virus, et plasmid, et kosmid, etc). Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er en mikroorganisme som inkluderer en slik DNA-sekvens. Det er også et formål for den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe anvendelse av et enzym i henhold til patentkravene i overvåkning og/eller kontrollering av reaksjonssystemer hvor DNA-sekvenser multipliseres, for eksempel PCR eller LCR. Spesielt foretrukket er anvendelse av enzymet ifølge foreliggende oppfinnelse i "carry-over-prevention"-prosedyrer. Enzymer fra kuldetilpassede organismer som lever i kalde habitater slik som atlantisk torsk ( Gadus morhua), må kompensere reduksjonen av kjemiske reaksjonshastigheter ved lave temperaturer for å opprettholde tilstrekkelige metabolske aktiviteter. Dette kan gjøres ved et høyere transkripsjons/- translasjonsnviå, eller forbedret katalytisk effektivitet (kcat/KM). Denne høyere effektiviteten oppnås ved en mer fleksibel struktur sammenlignet med deres mesofile motparter som tilveiebringer forsterket evne til å undergå konformasjonelle forandringer under katalyse. Den reduserte stabilitet for pH, temperatur og denaturerende midler anses som en konsekvens av den konformasjonelle fleksibilitet (58). I lys av ulempene med kontamineringer av UDG i henhold til teknikkens stilling i "carry-over-prevention"-prosedyrer når DNA-sekvenser amplifiseres (PCR, LCR), vil det være meget passende å tilveiebringe et UDG-enzym som blir 100% deradert ved enkel varmebehandling. Det har nå blitt funnet at et UDG-enzym isolert fra torsk har denne verdifulle egenskapen. Torske-UDG-enzymet isolert i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, har en lignende molekylvekt, isolelektrisk punkt, pH- og NaCI-optimum som tidligere beskrevne UNG'er, men den foreliggende torske-UNG er mer pH- og varmelabil og har en høyere relativ aktivitet ved lave temperaturer sammenlignet med den rekombinante mesofile humane UNG. Nedenfor er det beskrevet en isoleringsprosedyre for den relevante torske-UNG-proteinet i henhold til oppfinnelsen, så vel som isolering av DNA som koder for dette proteinet og dets anvendelse i mikroorganismer for rekombinant fremstilling av det relevante UNG-enzymet i henhold til oppfinnelsen.

MATERIALER OG METODER

Q-sepharose FF, S-sepharose FF, Heparin sepharose HP (Hi-trap 5 ml), Poly-U-sepharose 4B, Superdex 75 HR10/30, Phast system og Phast IEF-geler (3-9) og LMW-gelfiltreringskalibretingstestsett ble oppnådd fra Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige). Deoksy[5-<3>H]uridin 5'-trifosfat (19,3 Ci/mmol) ble forhandlet fra Amersham (U.K.). Uracil-DNA-glykosylaseinhibitor (Ugi) ble oppnådd fra New England Biolabs (Beverly, MA), enzymer ble forhandlet fra Promega (Madison, Wl). Proteaseinhibitorer, kalvethymus-DNA (D-1501), uracil, deoksyuridin og deoksyuridin-monofosfat ble forhandlet fra Sigma (St. Lois, MO). Alle andre reagenser og buffere ble forhandlet fra Sigma og Merck (Damstadt, Tyskland).

Rensing av cUNG

Fremstilling av råekstrakt og alle rensetrinn ble utført ved 4°C.

Fremstilling av råekstrakt

Til 600 ml ekstraktbuffer (25 mM Tris/HCI, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol, pH 8,0 (25°C) 200 g av frisk torskelever ble tilsatt og homogenisert i en Atomix homogenizer (MSE, England). Før homogenisering, ble den følgende proteaseinhibitorblandingen tilsatt til ekstraktbufferen: 1 mM PMSF 1 uM pepstatin, 1 \ M leupeptin, 10 \ xM TPCK og 10 TLCK (slutt-konsentrasjoner). Homogenatet ble sentrifugert ved 28.000 g i 15 minutter, og supernatanten ble filtrert gjennom glassull. Endelig ble glycerol tilsatt til 30%

(volum/volum), og torskelever-råekstraktet ble frosset ved -70°C.

Q- sepharose Fast Flow

1 liter råekstrakt ble fortynnet med 1 liter buffer A (25 mM Tris/HCI, 10 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1% glycerol, pH 8,0) (fraksjon 1). Prøven ble applisert i to porsjoner (1 liter hver) på en Q-sepharose FF-kolonne (5,0/15), ekvilibrert med

buffer A og så vasket med 250 ml buffer A, ved bruk av en strømningshastighet på 10 ml/minutt. Proteiner bundet til kolonnen ble eluert med 200 ml buffer A + 1,0 M NaCI, og kolonnen ble reekvilibrert med buffer A før neste del av prøven ble påsatt som nevnt over. UNG-inneholdende gjennomstrømnings- og vaskefraksjoner fra

begge kjøringene ble samlet (fraksjon 2, 2340 ml).

S- sepharose Fast Flow

Fraksjon 2 ble applisert på en S-sepharose FF-kolonne (1,6/10) ekvilibrert i buffer A, gjennomstrømningshastighet 10 ml/min. Kolonnen ble vasket med 300 ml buffer A + 60 mM NaCI, og eluert ved bruk av en 200 ml lineær gradient på 0,06-0,4 M NaCI i buffer A, strømningshastighet 5 ml/minutt. UNG-inneholdende fraksjoner ble oppsamlet (55 ml) og dialysert over natten i buffer A (fraksjon 3).

Heparin- sepharose ( HP)

Fraksjon 3 ble applisert på en heparin-sepharose HP Hi-Trap-kolonne (1,6/2,5) ekvilibrert i buffer A. Kolonnen ble vasket med 50 ml buffer A + 60 mM NaCI, og ble eluert i 50 ml lineær gradient på 0,06-0,4 M NaCI i buffer A, strømningshastighet 1 ml/minutt. UNG-inneholdende fraksjoner ble oppsamlet (fraksjon 4, 20 ml).

Polv- U- sepharose ( 4B)

Fraksjon 4 ble så fortynnet 5 ganger i buffer A, og tilsatt på en poly-U-sepharosekolonne (1,6/10) ekvilibrert i buffer A. Kolonnen ble vasket med 60 ml buffer A + 60 mM NaCI, og ble eluert i 200 ml lineær gradient på 0,06-0,4 M NaCI i buffer A, strømningshastighet 1 ml/minutt. UNG-inneholdende fraksjoner ble oppsamlet (fraksjon 5, 70 ml).

Superdex 75

Fraksjon 5 ble konsentrert til 200 ved bruk av Ultrafree15 og Ultrafree-MC ultrasentrifugeringsfiltere (Millipore), molekylvektsperre 5K, og applisert på en gelfiltreirngskolonne (HR 1,0/30) ekvilibrert i buffer A, med en strømningshastighet på 0,5 ml/minutt. Fraksjoner (350 \ x\) ble samlet, og dem inneholdende UNG-aktivitet ble oppsamlet (fraksjon 6,3 ml).

Fremstilling av substrat ved nick- translasion

<3>H-dUMP DNA ble fremstilt ved nick-translasjon og polymerasekjede-reaksjon (PCR). Det nick-translaterte substratet ble laget i et totalvolum på 1 ml og inneholdt 50 mM Tris/HCI, pH 7,2,10 mM MgS04,1 mM DTT, 250 ug kalvethymus-DNA (renset ved fenol/kloroformekstraksjon og etanolpresipitert før anvendelse), 0,1 mM dATP, dCTP, dGTP og dUTP, hvor 3 \ iM av dUTP var [<3>H]-dUTP (19,3 Ci/mmol). Så ble 0,1 ng (5,35 x 10 A U) Dnase I (bovin pankreas, Promega) tilsatt og 30 sekunder senere 25 U av E. coli DNA-polymerase. Nick-translasjonsblandingen ble inkubert ved 21°C i 24 timer. Det nick-translaterte DNA ble renset ved fenol/kloroformekstraksjon og etanolpresipitering. DNA ble resuspendert i 50 ul TE-buffer og renset med en NAP-5 kolonne (AP Biotech) ekvilibrert i TE-buffer (10 mM Tris/HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0) for å fjerne ikke-

inkorporerte nukleotider. Spesifikk aktivitet av nick-substratet var 1,8 x 105 dpm/ng (425 cpm/pmol).

Fremstilling av substrat ved PCR

PCR-produsert substrat ble anvendt i alle karakteriseringseksperimentene og besto av et 761 bp-fragment dannet fra kationisk trypsinogen (sstrplV) fra atlantisk laks { Salmo salar) [61]. PCR ble utført i et volum på 50 \ i\ i en Perkin Eimer Cetus termosykler. PCR-blandingen inneholdt 10 mM Tris/HCI, pH 8,3, 50 mM KCI, 6 mM MgCI2, 0,37 mM dATP, dCTP, dGTP og dUTP, hvor 10,4 uM av dUTP var [<3>H]-dUTP (17,0 Ci/mmol, Amersham), 700 pg templat-DNA (sstrplV i en pgem7zt-vektor), 2,5 ^M av oppstrøms- og nedstrømsprimere og 2 U Tag-polymerase (Roche, Sveits). PCR-reaksjonen ble utført med 30 sykluser av 94°C i 1 minutt, 45°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Så ble ytterligere 2 U av Taq-polymerase tilsatt, og PCR-reaksjonen fortsatt med 30 nye sykluser som beskrevet. PCR-substratet ble renset med QIAquick PCR-rensetestsett (Qiagen) som beskrevet av forhandler og eluert i 50x fortynnet TE-buffer, pH 8,0. Spesifikk aktivitet av PCR-substratet var 5,9 x 105 dpm/|j,g (451 cpm/pmol). Alle karakteriseringseksperimenter ble utført ved bruk av PCR-substratet.

Påvisning av uracil- DNA- glvkosylaseaktivitet ( standardtest)

Uracil-DNA-glykosylaseaktivitet ble målt i et sluttvolum på 20 inneholdende 70 mM Tris/HCI, 10 mM NaCI, 1 mM EDTA, 100 ug/ml BSA og 230 ng nick-substrat eller 71 ng PCR-substrat. Reaksjonsblandingen ble inkubert 10 minutter ved 37°C, og terminert ved tilsetning av 20 ni av iskald enkeltkjedet kalvethymus-DNA (1 mg/ml) og 500 \ i\ 10% (vekt/volum) TCA. Prøvene ble inkubert på is i 15 minutter og sentrifugert ved 16.000 g i 10 minutter. Supematantene med syreløselig <3>H-uracil ble analysert ved bruk av væskescintillasjonsteller.

Én enhet av aktivitet defineres som mengden av enzym som er nødvendig for å frigjøre 1 nmol av syreløselig uracil pr. minutt ved 37°C.

Analyse av testprodukter med tynnsjiktkromatografi

Reaksjonsprodukter etter testene ble blandet med 20 nmol uracil, deoksyuridin og deoksyuridin-monofosfat. Tynnsjiktkromatografi ble utført i henhold til metoden til Wang og Wang, ved bruk av polyamidlagplater (BDH), og tetraklorometan, eddiksyre og aceton (4:1:4, ved volum) som løsningsmiddel [62]. Flekker påvist under UV-lys, ble kuttet ut av platen og radioaktivitet målt i en væskescintillasjonsteller.

Molek<y>lvektbestemmelse

Molekylvekt ble bestemt ved gelfiltrering og ble utført med en Superdex 75 kolonne (1,0/30) ekvilibrert i en buffer inneholdende 25 mM Tris/HCI, 1,0 M NaCI, 1 mM EDTA, 1% glycerol, pH 8,0. Strømningshastigheten var 0,5 ml/minutt, og aktiviteten ble målt i fraksjoner oppsamlet (250 ul). Bovint serumalbumin (BSA, 67 kD), ovalbumin (43 kD), kymotrypsinogenA (25 kD) og ribonukleaseA (13,7 kD) ble anvendt som standarder. Blå dextran og natriumklorid ble anvendt for å bestemme void-(Vo) og indre volum (Vj), henholdsvis.

Proteinbestemmelse

Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med Coomassie® proteintestsett-reagens G-250 (Pierce, New York, NY) ved metoden til Bradford [63], med mikrotiterplateprotokollen som beskrevet av forhandler, ved bruk av bovint serumalbumin (BSA) som en standard.

lsoelektrisk punktbestemmelse

Isoelektrisk punktbestemmelse ble utført med Phast-systemet, isoelektrisk fokuseringsgel 3-9 og sølvfarging i henhold til metodene beskrevet av forhandler. Standarder benyttet var phycocyanin (4,45,4,65,4,75), p-laktoglobulin B (5,10), bovin karbonisk anhydrase (6,00), human karbonisk anhydrase (6,50), ekvin myoglobin (7,00), human hemoglobin A (7,10), human hemoglobin C (7,50), lentil lektin (7,8, 8,0, 8,2), cytokrom c (9,6), (IEF standarder pl-område 4,45-9,6, BIO-RAD). Etter fokusering, ble gelen kuttet i 2 mm stykker og hvert stykke inkubert i 250 ul ekstraksjonsbuffer (50 mM Tris/HCI. 0,2 M NaCI, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% (volum/volum) glycerol, pH 8,0 over natt. Alikvoter av 5 ul ble overført til testblandingene og aktiviteten målt ved bruk av standard testbetingelser.

Bestemmelse av pH/ NaCI- optimum

Testene ble utført i et volum på 20 ul som beskrevet i standardtesten som benytter PCR-dannet substrat og NaCI-konsentrering fra 0-200 mM med 25 mM intervaller og pH i området fra 9,5-6,5 med 0,5 pH enhetsintervaller. Alle buffere ble supplementert med 100 ug/ml BSA og 1 mM EDTA. Bufferne som ble anvendt var dietanolamin /HCI (9,5-8,5), Tris/HCI (8,5-7,5) og MOPS/NaOH (7,5-6,5). Alle bufferne ble pH-justert ved 37°C og anvendt i 25 mM konsentrasjon i testen.

Bestemmelse av temperaturoptimum

Testene ble utført i et volum på 20 ul som beskrevet i standardtesten som benytter PCR-dannet substrat. Testblandingene var som beskrevet i standardtest-betingelsene og ble justert til pH 8,0 for alle temperaturer. Temperaturområdet benyttet, var 5°C til 60°C. Aktiviteten ble målt på en sekvensiell måte med 15 minutters intervall mellom hver temperatur. Enzymene som ble anvendt, ble fortynnet i standardfortynningsbuffer (5 mM Tris/HCI, 10 mM NaCI, 1% (volum/- volum) glycerol, pH 8,0) og plassert på is. På grunn av ustabilitet av enzymprøven på is over en forlenget periode, ble resultater korrigert med hensyn til stabilitet av enzymene inkubert i fortynningsbuffer på is med formelen N(t> = cpm/e"<0693>'"<*>'<*>, hvor halveringstiden ( X) av cUNG og rhUNG er henholdsvis 2 timer og 2,6 timer.

Effekt av pH og temperatur på stabilitet

pH: UNG (0,01 U) ble preinkubert (i et totalvolum på 75 ul) i 10 minutter ved 37°C i buffere inneholdende 10 mM buffer, 10 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1% glycerol, med pH i området fra 9,5-6,5 med 0,5 pH-enhet-intervaller ved bruk av dietanolamin/- HCI (9,5-8,5), Tris/HCI (8,5-7,5), MOPS/NaOH (7,5-6,5) og MES/NaOH (6,5-5,5) som bufferkomponenter. Prøver på 5 ul ble overført til testblandingene, og restaktivitet ble målt ved bruk av standardtestbetingelser.

Temperatur: UNG (0,01 U) ble preinkubert (i et totalvolum på 75 ul) i 10 mM Tris/HCI, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1% glycerol, pH 8,0 (justert ved hver temperatur). Etter ulike tidsintervaller, som indikert i figurtekstene, ble 5ul alikvoter overført til testblandingene, og restaktivitet ble målt ved bruk av standardtestbetingelser.

Substratspesifisitet mot ss/ ds DNA

PCR- og nick-translatert substrat ble inkubert 3 minutter ved 100°C og deretter raskt avkjølt på is for å danne ssDNA. Etter denaturering ble ssDNA-substratene anvendt i standardtestbetingelser med 6,65 x 10"<4> U renset cUNG. Enzymaktivitet ble også målt ved bruk av dsDNA-substratene for både nick- og PCR-substratene, og anvendt som referanse.

Uqil- inhibitor- og uracilproduktinhibering

Aktivitetsmålingene ved bruk av PCR-substrat ble utført med 6,65 x 10*4 U av renset cUNG. Forskjellige konsentrasjoner av uracil (0,1,2 og 5 mM) eller Ugi-inhibitor (1,25 x 103 U til 2,00 x 102 U) ble tilsatt til testblandingene (på is). Aktivitet ble så målt som beskrevet under standardtestbetingelser.

RESULTATER

Rensing av cUNG

Atlantisk torske-UNG ble renset 17.000 ganger med en gjenvinning på 2% som vist i tabell 1. Til tross for den høye rensefaktoren, var enzymet bare delvis renset som bestemt på SDS-PAGE. Også utbyttet var lavt på grunn av mange rensetrinn og konsentreringen av fortynnet proteinprøve før gelfiltreringstrinnet.

Molekvlvekt oa pl- bestemmelse

Molekylvekt ble bestemt ved getfiltrering til å være 25 kD + 2, fra tre separate eksperimenter. Den isoelektriske punktbestemmelsen ble utført med en I EF Phast Gel med IEF-standarder i området fra 4,42-9,6. Etter i EF, ble cUNG-akivitet eluert fra gelfragmentene og aktivitet målt som beskrevet i materialer og metoder. cUNG-aktivitet koeluerte med cytokrom c, standard med et isoelektrisk punkt på 9,6, som vist i figur 1. Cytokrom c og cUNG-aktivitet ble funnet der hvor elektroden kontakter gelen, derfor kan vi kun konkludere at pl er større enn 9,0 som er den høyeste målbare verdi ved bruk av dette systemet.

Substratspesifisitet

cUNG-aktivitet ble målt ved bruk av både ssDNA og dsDNA. Det ble funnet en henholdsvis 1,8 og 1,9 ganger høyere aktivitet for ssDNA enn dsDNA ved bruk av nick- og PCR-substrater som vist i tabell 2. Testprodukter ble analysert med

tynnsjiktkromatografi, og hoveddelen av radioaktiviteten ble identifisert som uracil. Imidlertid var også noe radioaktivitet kolokalisert med deoksyuridinmarkøren, men dette kunne skyldes en partiell overlapping av de to markørene. I tillegg viste det rensede cUNG ikke noen vesentlig hydrolyse av <3>H-adeninmerket DNA, derfor var nukleaser ekskludert som ansvarlige for hydrolysering av DNA.

Inhibisionsstudier

Produktinhibering med fri uracil ble undersøkt og ga mer enn 50% inhibering med 1 mM uracil i testblandingen som vist i figur 2. Ved tilsetting av 5 mM fri uracil til testblandingen, ble det observert en 78% inhibering av aktivitet. Effekten av Ugi på cUNG ble målt ved tilsetting av Ugi til testblandingen. cUNG ble klart inhibert av Ugi, som vist i figur 3.

pH- og NaCI- optimum

pH- og natriumkloridoptimum ble undersøkt ved måling av enzymaktivitet ved ulike pH'er ved bruk av NaCI-konsentrasjoner fra 0-200 mM, som vist i figur 4. Enzymet viste et bredt pH-optimum med maksimal aktivitet mellom pH 7,0-9,0 og 25-50 mM NaCI. Et skifte i NaCI-optimum ble observert hvor den optimale NaCI-konsentrasjonen skiftet fra lave konsentrasjoner ved høy pH til høyere konsentrasjoner ved lav pH. Ved liten pH 9,5, ble cUNG inhibert ved NaCI.

Temperaturoptimum

Temperaturoptimum av cUNG ble bestemt til 41 °C (figur 5). For å sammen-ligne aktiviteten av cUNG med den mesofile rhUNG ved lave temperaturer, ble enzymaktiviteten målt fra 5-60°C, og aktiviteten ved lave temperaturer sammenlignet med deres respektive optimumtemperatur (figur 6). Aktivitetsprofilen av disse to enzymer viste liten forskjell ved 5-15°C. Imidlertid ble det observert en høyere relativ aktivitet med cUNG enn rhUNG ved temperaturer fra 20-40°C, mens det motsatte ble observert ved høyere temperaturer (50-60°C).

Stabilitet

Stabiliteten av de to UNG-enzymene ble sammenlignet ved preinkubering av enzymene ved ulike pH'er. Atlantisk torske-UNG ble vist å være mest stabil mellom pH 7,0-8,5. Ved pH 5,5 og pH 10,0, hadde den mindre enn 1% restaktivitet. rhUNG var mest stabil mellom pH 7,0-9,5. 3% restaktivitet var tilbake ved pH 5,5, mens det ved pH 10,0 var så mye som 66% av aktivitet tilbake, som vist i figur 7. Temperaturstabiliteten til de to UNG-enzymene ble sammenlignet ved 4°C, 25°C, 37°C og 50°C. Ved 50°C ble halveringstiden bestemt til å være 0,5 minutter og 8 minutter for henholdsvis cUNG og rhUNG. Ved alle temperaturer som ble undersøkt, var rhUNG mer stabilt enn cUNG. Halverings-tidene bestemt, var 20 minutter (37°C), 60 minutter (25°C) og 2 timer (4°C) for cUNG og 30 minutter (37°C), 150 minutter (25°C) og 2,6 timer (4°C) for rhUNG, det største forskjellen i halveringstid ble funnet ved den høyeste temperaturen, som vist i figur 8.

Rensing og molekvlvekt

Uracil-DNA-glykosylasen fra atlantisk torskelever ( Gadus morhua) ble renset 17.679 ganger ved bruk av ulike kromatografiteknikker. Enda var enzymet kun delvis renset, og flere andre bånd kunne ses på en SDS-PAGE-gel. Human nukleær og mitokondrien uracil-DNA-glykosyiaser ble vist å være dannet ved alternativ spleising og ha henholdsvis en ORF på 313 og 304 aminosyrer [49]. Molekylvekten til cUNG ble bestemt til 25 kD. Dette er omtrent den samme molekylvekten som bestemt for UNG fra human placenta (29 kD) og rhUNG (UNGA84) (27 kD), som manglet henholdsvis 77 og 84 av de første N-terminate aminosyrer, som forutsagt fra mitokondrien ORF [21, 64]. Dette foreslår at den N-terminale signalsekvensen i det rensede cUNG er prosessert eller kunstig spaltet under rensingen eller at atlantisk torske-UNG ikke har en N-terminal signal-sekvens. Under rensingen kunne vi ikke se noe tegn til ulike UNG'er som tidligere beskrevet under rensing av UNG fra rotte eller humane kilder [18, 23]. Men som en vertebrat, kunne man forvente atlantisk torsk innehar både en nukleær og en mitokondrien form av UNG, men hittil har ingen bestrebelser vært gjort for å fastslå dette forhold.

Uracil-DNA-glykosylasen fra atlantisk torsk var lik andre uracil-DNA-glykosylaser tidligere renset og karakterisert med hensyn til høy pl [19] og den to ganger preferansen til ssDNA sammenlignet med dsDNA [19].

Inhibering med Ugi og uracil

Bacillus sujbft//5-bakteriofagen PBS2 UDG-inhibitor (Ugi) inhiberer UNG ved å danne et stabilt kompleks med UNG ved fysiologiske betingelser [65, 66]. Ugi binder til human UNG ved innskudd av en beta-streng inn i det konserverte DNA-bindende sporet [67], og virker ved å etterligne DNA [68]. Dette indikerer at strukturen av substratets bindingssete av cUNG ligner andre UNG'er som inhiberes av Ugi-inhibitoren. Inhibering med fri uracil var i overensstemmelse med verdier tidligere rapportert [19].

Optimale betingelser

cUNG ble vist å ha et bredt pH-optimum fra 7,0-9,0, og aktiviteten var sterkt affisert av NaCI-konsentrasjonen. En bred optimumsaktivitet er tidligere rapportert for en rekke andre UNG'er som er karakterisert [23, 31, 40,47]. Det er interessant at NaCI-optimumet for cUNG øker når pH avtar. Det har tidligere vært demonstrert at UNG fungerer på en prosessiv måte ved lave ionestyrker, som når NaCI-konsentrasjonen øker, skifter enzymet til en distributiv mekanisme [14] [15]. Imidlertid rapporterte Purmal et al. det motsatte, at UNG virket ved en distributiv mekanisme ved lav ionestyrke. Den prosessive mekanismen er et vanlig trekk blant mange DNA-interaktive proteiner (polymeraser, repressorer, restriksjons/- modifikasjonsenzymer, DNA-reparasjonsenzymer), og interaksjonene er generelt elektrostatisk av natur [69-71]. I en UV-endonuklease fra Micrococcus luteus, har den prosessive mekanismen også vist seg å være pH-avhengig [72]. Derfor foreslår vi at skiftet i NaCI-optimum med økende pH, reflekterer den prosessive/- distributive naturen til cUNG. Det kan også være at det motstridende i de tidligere rapportene har vært forårsaket av ulike bufferkomponenter og pH i tillegg til forskjellene som allerede er beskrevet.

Temperaturoptimum (41 °C) ble funnet å være lavere enn den mesofile rhUNG (45°C) [64]. Den relative aktivitet ved temperaturer fra 5-45cC var høyere for cUNG enn for rhUNG. Ved temperaturer høyere enn 45°C, viste rhUNG en høyere relativ aktivitet enn cUNG, antagelig som en konsekvens av den lavere temperaturstabiliteten til cUNG.

Temperatur og pH- stabilitet

Enzymer karakterisert fra kuldetilpassede arter har blitt funnet å være mer temperatur og pH-labile, foreslått forårsaket av deres fleksible struktur for å opprettholde enzymatisk aktivitet ved lave temperaturer [73]. cUNG ble funnet å være både mer pH- og temperatur-labile enn rhUNG som er kjente trekk fra andre kuldetilpassede enzymer [73, 74].

En psykrofil UNG fra en marin bakterie, BMTU har tidligere blitt isolert og ble sammenlignet med E. co//-UNG med hensyn til temperaturstabilitet [45]. Den prokaryote UNG hadde en halveringstid på 2 minutter ved 40°C og 0,5 minutter ved 45°C, sammenlignet med 27 og 8 minutter for E. co//-UNG. cUNG ble sammenlignet med rhUNG med hensyn til både temperatur- og pH-stabilitet. Ved 50°C hadde rhUNG en halveringstid på 8 minutter, sammenlignet med 0,5 minutter for cUNG. Ved lavere temperatur, var forskjellen i halveringstid mindre, selv om rhUNG var mer stabil enn cUNG ved alle temperaturer som ble undersøkt. Begge enzymene ble vist å være labile ved lav pH, mens ved høyere pH var rhUNG mer stabil enn cUNG.

Som konklusjon, ble uracil-DNA-glykosytasen fra atlantisk torsk vist å være lik andre uracil-DNA-glykosylaser tidligere renset og karakterisert med hensyn til molekylvekt, høy pl, et bredt pH-optimum og en to gangers preferanse for ssDNA enn dsDNA. Imidlertid var cUNG vist å være mer temperatur- og pH-labil og ha en høyere relativ aktivitet ved lave temperaturer enn den mesofile rhUNG. Tatt i betraktning at UNG er et konservert enzym blant ulike arter, kan cUNG være et egnet enzym for videre studier av kuldetilpasning på molekylnivået.

Isolering av uracil- DNA- glvkosvlaseaenet fra Gadus morhua

Materialer

SuperScript™ II Rnase H" Reverse Transcriptase (Gibco BRL), Packagene® Lambda DNA-pakkesystem ble forhandlet fra Promega (Madison, Wl), deoksy[5-<3>H]uridin, 5'trifosfat (17,0 Ci/mmol) ble forhandlet fra Amersham (England), ekspresjonsvektor pTrc99A ble forhandlet fra Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sverige), restriksjonsenzymer ble forhandlet fra New England Biolabs (Beverly, MA), SMART™ PCR cDNA-bibliotekkonstruksjonssett og Marathon™ cDNA-amplifikasjonssett ble forhandlet fra Clontech (Palo Alto, CA). Escherichia coli NR8052 [A(pro-lac), thi-, ara, trpE9777, ungl] (75,76] og renset rekombinant human UNG (UNGA84) [64] ble tilveiebragt av Dr. Hans E. Krokan, Institutt for kreftforskning og molekylærbiologi, Norsk Universitet for Vitenskap og Teknologi.

Metoder

Isolering av mRNA

mRNA ble isolert fra 250 mg torskelever ved bruk av Oligotex direkte mRNA Midi-sett (Qiagen) ved å følge instruksjonene til forhandleren.

Fremstilling av cDNA

cDNA ble laget fra 250 ng av det isolerte poly A<+->RNA ved bruk av SMART™ PCR cDNA-bibliotekkonstruksjonssett (Clontech) i henhold til protokollen anbefalt av forhandleren. I korthet ble den første kjeden cDNA laget ved å kombinere 250 ng poly A<+->RNA med 10 pmol SMART-oligonuklelotid (5-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3') og 10 pmol CDS/3' PCR-primer (Oligo (dT) 30 N -1 N (N = A, G, C eller T; N -1 = A, G eller C)) i et sluttvolum på 5 ul, og inkubert ved 72°C i 2 minutter, og så plassert direkte på is i 2 minutter for å denaturere RNA. Så ble enzym og buffer tilsatt reaksjonsblandingen til et sluttvolum på 10 ul, bestående av 50 nM Tris/HCI, pH 8,3, 6 mM MgCI2, 75 mM KCI, 2 mM DTT, 1 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP henholdsvis og 200 U SuperScript™ II revers transkriptase (Gibco BRL), og så inkubert ved 42°C i 1 time. Syntese av den andre kjeden ble gjort med PCR i et sluttvolum på 100 ul, inneholdende 2 ul av den første kjedereaksjonen som templat, 40 mM Tricine/KOH pH 9,2 (25°C), 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)2, 3,75 ug/ml BSA, 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP henholdsvis, 1 U Advantage cDNA-polymeraseblanding (Clontech), 0,2 uM 5-PCR-primer (5-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA-3')og CDS/3'-PCR-primer henholdsvis.

PCR-amplifikasjon ble utført i en GeneAmp 9700 termocykler (Perkin Eimer) ved 95°C i 1 minutt, etterfulgt av 16 sykluser ved 95°C i 15 sekunder og 68°C i 5 minutter.

ds cDNA polishing T 50 ul av amplifisert ds cDNA, 40 ug proteinase K ble tilsatt og inkubert ved 45°C i 1 time. Proteinase K ble inaktivert ved inkubering av blandingen ved 90°C i 8 minutter. For å butte enden av ds cDNA, ble 15 U av T4 DNA-polymerase tilsatt og inkubert ved 16°C i 30 minutter og 72°C i 10 minutter. Endelig ble ds cDNA etanolpresipitert og resuspendert i 10 ul H20. Alle rør ble holdt på is dersom ikke annet er angitt.

Danning av 300 bp- fraament av cUNG- genet

Degenererte oligonukleotidprimere ble designet fra to konserverte regioner (GQDPYH og VFLLWG) fra kjente UNG -aminosyresekvenser. Vanlig kodon for atlantisk torsk ble også vurdert når primerne ble utformet. UNG-fragmentet ble dannet ved PCR med torskelever cDNA som templat i et sluttvolum på 50 ul, inneholdende 10 mM Tris/HCI, pH 9,0 (25°C), 50 mM KCI, 0,1% Triton X-100, 10 ng cDNA, 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP henholdsvis, 2,0 uM oppstrøms-primer (5'-GGH-CAR~GAY-CCC-TAY-CA-3')og nedstrømsprimer (5-DCC-CCA-SAG-SAG-RAA-VAC-3') henholdsvis og 2,5 U Taq-polymerase (Promega). Nuckleotidsymbolene som er anvendt er: A=adenin, C=cytosin, G=guanin, T=tymin, D=A+G+T, R=A+G, S=C+G, V=A+C+G, Y=C+T. PCR ble utført ved 94°C i 4 minutter, 30 sykluser av 94°C i 1 minutt, 60°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt, og et sluttekstensjonstrinn på 72°C i 5 minutter.

DNA- sekvensering

DNA-sekvensering ble utført med Amersham Pharmacia Biotech Thermo Sequenace Cy5 Dye Terminator Kit, ALFexpress™ DNA-sekvensator og ALFwin Sequence Analyzer versjon 2,10. Geler ble laget med Reprogel™ Long Read og Reproset UV-polymerisator. Alle gjenstander ble forhandlet fra Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sverige).

RACE- prosedvre

Ligering av adapterer til cDNA ble utført som beskrevet i protokollen fra forhandler, i korthet, ble RACE-adaptorene ligert til cDNA i et totalvolum på 10 ul inneholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,8), 10 mM MgCl2,10 mM DTT, 1 mM ATP, 0,75 ug cDNA, 2 uM Marathon cDNA-adaptor (Clontech), 400 U T4 DNA-ligase. Reaksjonen ble inkubert ved 16°C i 16 timer og 5 minutter ved 70°C for å inaktivere ligase. Før RACE ble det adaptorligerte cDNA fortynnet 50 ganger i TE-buffer og denaturert ved 100°C i 2 minutter og plassert direkte på is.

Sekvensen dedusert fra 300 bp-fragmentet av UNG-genet ble benyttet for å designere to primere for både 3'- og 5'- rask amplifikasjon av cDNA-ender (RACE), med en liten overlappsregion mellom de to fragmentene som dannes. Både 3'- og 5'-RACE-reaksjonene ble utført i et volum på 50 ul med 1 ul av fortynnet cDNA med RACE-adaptorer som templat, 0,2 uM intern 3'- (5" - TGTACCGACATTGATGGCTTCAAGCAT-3') eller 5" - (5'- CCCATCCGCTTA-GATCTCCATGTCCAG-3') RACE-primere, henholdsvis, 0.2 uM AP1-primer (tilveiebragt av forhandler) (5-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'), 40 mM Tricine/KOH pH 9.2 (25°C), 15 mM KOAc, 3.5 mM Mg(OAc)2, 3.75 ug/ml BSA, 0.2 mM av hver dATP, dCTP, dGTP and dTTP og 1U Advantage cDNA polymeraseblanding (Clontech). Amplifikasjon ble utført med en GeneAmp 9700 termocycler (Perkin Eimer), 94°C i 30 sekunder, fulgt av 5 sykluser av 94°C 5 sekunder og 72°C i 3 minutter, 5 sykluser av 94°C i 5 sekunder og 70°C i 3 minutter og 20 sykluser av 94°C i 5 sekunder 68°C 3 minutter.

Individuelle bånd ble renset fra en agarosegel og anvendt som templat I en ny PCR-reaksjon med de samme betingelser som over for å generere mer DNA.

Isolering av to ulike UNG- gener

Begge RACE-fragmenter dannet, ble sekvensert ved bruk av deres respektive interne RACE-primere. Undersøkelse av sekvensen av 5-RACE-fragmentet indikerer en dobbeltsekvens vanskelig å lese nær 5'-enden av fragmentet. Imidlertid kommer det tilsyne kun én sekvens ved enden av fragmentet på grunn av en lang stor UTR i én av UNG-sekvensene, men ikke i den andre. En ny primer komplementær til denne 5'-enden, ble utformet (5-ATGGAATTCGATTGAGATTGGCGCCTTTGG -3') og en ny PCR-reaksjon ble utført med denne, og 5'-RACE-internprimeren, med 5'-RACE-fragmentet som templat. PCR ble utført i et sluttvolum på 50 ul med 40 mM Tricine/KOH pH 9.2 (25°C), 15 mM KOAc, 3.5 mM Mg(OAc)2, 3.75 ug/ml BSA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP henholdsvis, 1U Advantage cDNA polymeraseblanding (Clontech), 10 ng cDNA som templat og 0.2 uM oppstrøms- og nedstrømsprimere henholdsvis. Amplifikasjon ble utført i en GeneAmp 9700 thermocycler (Perkin Eimer), 94°C i 1 minutt, fulgt av 30 sykluser av 94°C i 30 sekunder, 60°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt.

Fragmentet ble sekvensert ved bruk av intern RACE-primer, og sekvensen ble trukket fra dobbeltsekvensregionen beskrevet over. En primer komplementær til 5p-enden av den underliggende sekvensen ble utformet (bestående av begge nukleotidene fra SMART-sekvensen og den gjenværende UNG-sekvensen), og en PCR-reaksjon med denne og den interne 5'-RACE-primeren ble utført. Det nye fragment ble sekvensert som beskrevet over. Fra de to ulike UNG-sekvensene i 5-RACE-fragmentet, ble to sluttprimere (UNG1 og UNG2) laget for å isolere full-lengde UNG1 og UNG2 henholdsvis ved bruk av cDNA som templat og samme PCR-betingelsene som beskrevet over.

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer

Det katalytiske domene av UNG-genet ble klonet I en ekspresjonsvektor pTrc99A inneholdende en sterk trc-promotor oppstrøms av et multippelt klonings-sete [77]. Flere ulike konstruksjoner ble laget ved PCR-amplifisering av genet ved bruk av dDNA som templat med oppstrøms- og nedstrømsprimere inneholdende EcoRI og Sall-restriksjonsseter henholdsvis. DNA-fragmenter ble renset, spaltet med EcoRI og Sali og ligert inn i pTrc99A-ekspresjonsvektor. I korthet, ble PCR-fragmenter med restriksjonsseter dannet i en PCR-reaksjon (50 ul) inneholdende 40 mM Tricine/KOH pH 9.2 (25°C), 15 mM KOAc, 3.5 mM Mg(OAc)2, 3.75 ug/ml BSA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP henholdsvis, 1U Advantage cDNA polymeraseblanding (Clontech), 10 ng cDNA som templat og 0.2 uM oppstrøms-og nedstrømsprimere henholdsvis. Amplifikasjon ble utført i en GeneAmp 9700 thermocycler (Perkin Eimer), 94°C i 1 minutt, etterfulgt av 30 sykluser av 94°C i 30 sekunder, 60°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter, og et sluttekstensjonstrinn på 72°C i 5 minutter. Individuelle bånd ble renset fra agarosegel og anvendt som templat i en ny PCR-reaksjon med de samme betingelser som beskrevet overfor, for å generere mer DNA. DNA ble renset under anvendelse av Quiaquick PCR-rensesett (Millipore) som beskrevet av forhandler og eluert i TE-buffer, pH 8.0. Restriksjonsenzymspalting ble utført i et sluttvolum på 30 ul inneholdende 1 ug innskutt DNA eller 0.25 ug pTrc99A vektor, 6 mM Tris/HCI, pH 7.9, 6 mM MgCI2, 150 mM NaCI, 1 mM DTT (BufferD, Promega) og 3U av EcoRI og Sali. Blandingene ble inkubert ved 37°C i 3 timer, etterfulgt av to ganger fenol/- kloroformekstraksjon, etanolfelling og resuspendering i 5 ul H20. Ligeringer ble utført i et totalvolum på 10 ul inneholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7.8), 10 mM MgCI2,10 mM DTT, 1 mM ATP, 100 U T4 DNA-ligase, 250 ng vektor DNA og 1 ug innskutt DNA og inkubert ved 16°C i 16 timer.

Kompetent E. coli JM105 (200 (il) ble transformert med ligeringsblandinger og dyrket på LB+ plater inneholdende 100 ug/ml ampicillin ved 37°C. Plasmid-DNA ble reisolert fra positive kloner og transformert i E. coli NR8052 benyttet for ekspresjon av rekombinant UNG.

Fire ulike konstruksjoner ble laget rcUNGA74 og rcUNGA74o og rcUNGA81 og rcUNGA81o hvor henholdsvis 74 og 81 av de N-terminale aminosyrene var fjernet. Disse har henholdsvis de samme lengder som human A77 og A84 (64). A74o og A81o konstruksjonene har kodoner som koder for arginin 87 og 88 optimalisert for ekspresjon i E. coli, ved å forandre dem fra AGA til CGT. Alle konstruksjoner ble gjort ved PCR som beskrevet over ved bruk av de følgende primere og templater: rcUNGA74 : UDGL77 (5<*-> ACCATGGAATTCGCAAAAGCAACGCCTGCA- 3 ") og UDGEND2 (5'- GAGCTCGTCGACTTAGAGTGCCTCTCCAGTTTATAGG-3') og 10 ng cDNA som templat.

rcUNGA81: UDGL84 (5'- ACCATGGAATTCTTCGGAGAGACTTGGAGAAGA -

3') og UDGEND2 og 10 ng cDNA som templat.

rcUNGA74o: (5 - ATGGAATTCGCAAAAGCAACGCCTGCAGGTTTCGGA-GAGACTTGGCGTCGTGAG - 3') og UDGEND2 og 1 ng rcUNGA81o som templat.

rcUNGA81o : (5<*->ATGGAATTCTTCGGAGAGACTTGGCGTCGTGAGCTGGC-TGC - 3') og UDGEND2 og 10 ng cDNA som templat.

Småskalaekspresion av uracil- DNA- glykosylase

Optimalisering av ekspresjon ble utført i 1 liter "riflet" erlenmeyerflasker med 100 ml LB+ medium med 100 ug/ml ampicillin, inokulert med 5 ml av prekultur. Celler ble indusert med 1 mM av IPTG ved OD600 = 2.0, og indusert ved varierende lengde som indikert i figurtekstene. Ekspresjon ble undersøkt ved bruk av ulike temperaturer (20°C, 25°C, 30°C og 37°C).

Betingelsene over ble også anvendt for å indusere ekspresjon ved ulike IPTG-konsentrasjoner (1 mM, 0.5 mM, 0.1 mM og 0.01 mM).

Fermenteringsbetingelser

Fermentering ble utført i en 10 liters Chemap CF 3000 fermentor (Sveits). En 200 ml prekultur av E. coli NR8052 med pTrc99A oA84-konstruksjonen ble inokulert til 7 liter av LB-medium supplementert med 20 mM glukose og 100 (ag/ml ampicillin. Celler ble dyrket til en OD600 på 2.0 og indusert i 8 timer med 1 mM IPTG. Tilleggsglukose (3 x 50 ml av 20% glukose (vekt/volum)) ble supplert under fermenteringen for å unngå glukosesulting. Celler ble høstet og sentrifugert ved 10.000 g i 10 minutter. Cellepastaen ble frosset ved -70°C.

Rensing av rekombinant torske- UNG

Råekstrakt

Fra fermenteringen , ble 4 liter av E. coli NR8052-celler (68 g våt vekt) resuspendert I 400 ml av ekstraksjonsbuffer (25 mM Tris/HCI, 10 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 % glycerol, 1 mM DTT, 1 mM PMSF pH 8,0). Cellene ble ødelagt ved å utsette dem fem ganger før en forstøver ved bruk av 100 psi av nitrogen. Ekstraktet ble sentrifugert 25.000 g i 10 minutter og supernatanten fjernet. Pelleten ble resuspendert i 100 ml av buffer A, og resentrifugert som beskrevet over. Supematantene ble kombinert og filtrert gjennom glassull (460 ml).

Protaminsulfat

Tii råekstraktet (460 ml), ble det tilsatt 60 ml av 2% protaminsulfat i buffer A (25 mM Tris/HCI, 10 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 % glycerol, pH 8.0) og inkubert ved 4°C i 5 minutter med røring. Løsningen ble sentrifugert ved 25.000 i 10 minutter, og supernatanten ble fjernet, 510 ml (fraksjon 1).

Q/ S- sepharose

Protaminsulfatfraksjonen ble påsatt en Q-sepharose-kolonne (5.0/10) koblet med en S-sepharose-kolonne (2.6/10), begge ekvilibrert i buffer A ved bruk av en gjennomstrømningshastighet på 10 ml/minutt. Kolonnene ble vasket med 750 ml buffer A, og Q-sepharose-kolonnen ble så fjernet. S-sepharose-kolonnen ble vasket med ytterligere 550 ml buffer A + 60 mM NaCI, og en gradient på 60 til 400 mM NaCI i buffer A ble påsatt for å eluere kolonnen under anvendelse av en gjennomstrømningshastighet på 5 ml/minutt. Fraksjoner på 10 ml ble oppsamlet, og fraksjonene inneholdende UNG-aktivitet ble oppsamlet (fraksjon 2,115 ml).

Blue sepharose FF

Fraksjon 2 ble fortynnet to ganger I buffer A og direkte påsatt en blue sepharose-kolonne (1,6/5,0), med en gjennomstrømningshastighet på 4 ml/minutt. Kolonnen ble så vasket med 30 ml av buffer A og 60 ml av buffer A + 110 mM NaCI, og eluert med 60 ml buffer A + 0.7 M NaCI. UNG-inneholdende fraksjoner ble oppsamlet (fraksjon 3, 24 ml).

Superdex 75

Fraksjon 3 ble konsentrert til 3 ml ved bruk av en Ultrafree 15 enhet (Millipore) og tilsatt på en superdex 75 kolonne (2.6/60) ekvilibrert i buffer A + 0.15 M NaCI. En gjennomstrømningshastighet på 2 ml/minutt ble benyttet, og fraksjoner på 5 ml ble oppsamlet. Fraksjoner inneholdende UNG-aktivitet ble oppsamlet (fraksjon 4, 30 ml).

Source 15Q

Superdex 75-fraksjonen ble diafiltrert i en Ultrafree 15 enhet (Millipore) og omtrent 2/3 av Superdex 75-fraksjonen ble påsatt Source 15Q-kolonnen (2.6/3.0) ekvilibrert i buffer A ved romtemperatur. Kolonnen ble vasket med 60 ml buffer A + 60 mM NaCI, og så bie en gradient fra 60 til 210 mM NaCI i buffer A påsatt for å eluere kolonnen. Fraksjoner ble oppsamlet på is, og UNG-inneholdende fraksjoner ble oppsamlet (UNG-aktivitet eluerte mellom 105 til 145 mM NaCI).

Resultatene er gitt i sekvenslisten SEQ:ID:NO. 5 og 6 i form av sekvensene for cUNG1 og cUNG2, henholdsvis DNA-sekvenser og tilhørende translaterte proteinsekvenser.

Ekspresjon

Ekspresjon av rcUNG med pTrc99A-A81o i 7 liter skalafermenteringen ga et totalt utbytte på 413.480 enheter av rcUNG inneholdt i råekstraktet.

Rensing

Rensing av rekombinant cUNG (A81o) (rcUNG) er oppsummert i tabell 1. Fra 4 liter av fermenteringsbatchen, ble 4,8 mg av rekombinant UNG renset til tilsynelatende homogenitet, og molekylvekten ble bestemt til 28 kD med SDS-PAGE. Den spesifikke aktiviteten av enzymet ble bestemt til 30.092 U/mg ved bruk av nick-generert substrat med standard testbetingelser.

Eksempel: " Carrv- over- prevention"

Metode

Som en kontaminant, ble 0,5 ng av uracil-inneholdende templat DNA (761 bp-fragment dannet fra kationisk trypsinogen fra atlantisk laks ( Salmo salar) [61], tilsatt til PCR-blandingen i et sluttvolum på 50 fal inneholdende 10 mM Tris/HCI pH 9,0 (25°C), 50 mM KCI, 0,1% Triton X-100, 10 ng cDNA, 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP henholdsvis, 2,0 uM oppstrøms- (OP5) og nedstrøms-primer (NP2) henholdsvis, og 1,0 U Taq-polymerase (Promega). UNG (4 x 10"<3> eller 1,7 x 10'<2> U) ble tilsatt til PCR-blandingen og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter.

Som negative kontroller, inneholdt én PCR-reaksjonsmikstur templat med tymidin erstattende uracil, og i én blanding erstattet vann UNG. Som en positiv kontroll, ble 1.7 x 10"3 U UNG fra E. coli benyttet.

Så ble PCR utført ved 94°C i 4 minutter, 30 sykluser av 94°C 1 minutt, 60°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Etter PCR'en, ble produktene analysert med agarosegelelektroforese.

PCR primersekvenser:

OP5:

5'-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCCCATTGACGATGAGGATGA-3'

NP2:

5'-GTAGAATTCGGATCCATGTCTCCTCCAGTCTAGAT-3'

Resultat

Resutatet av eksperimentet i henhold til eksempelet er vist i fig. 9. Uracil-inneholdende templater ble degradert ved UNG i alle PCR-reaksjoner, mens reaksjonene enten uten UNG eller med tymin-inneholdende templater ga de forventede PCR-produktene. Resultatene i fig. 9 er vist som en figur av en agarosegel.

a) Enzymaktivitet ble målt som beskrevet under standardtest i materialer og metoder ved bruk av nick-substrat. b) Proteinkonsentrasjon ble bestemt som beskrevet i materialer og metoder.

c) Proteinkonsentrasjon var for lav til å måle.

REFERANSER

1. Lindahl, T., An N- glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proe Nati Acad Sei, USA, 1974. 71(9): p. 3649-53. 2. Lindahl, T., DNA glycosylases, endonucleases for apurinic/ apyri- midinic sites, and base excision- repair. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1979. 22: p. 135-92. 3. Kubota, Y., et al., Reconstitution of DNA base excision- repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein. Embo J., 1996. 15(23): p. 6662-70. 4. Nicholl, I.D., K. Nealon, and M.K. Kenny, Reconstitution of human base excision repair with purified proteins. Biochemistry, 1997. 36(24): p. 7557-66. 5. Parikh, S.S., CD. Mol, and J.A. Tainer, Base excision repair enzyme family portrait: integrating the structure and chemistry of an entire DNA repair pathway. Structure, 1997. 5(12): p. 1543-50. 6. Slupphaug, G., ef al., Cell cycle regulation and in vitro hybrid arrest analysis of the major human uracil- DNA glycosylase. Nucleic Acids Res., 1991.19(19): p. 5131-7. 7. Muller, S.J. and S. Caradonna, Isolation and characterization of a human cDNA encoding uracil- DNA glycosylase. Biochim. Biophys. Acta, 1991.1088(2): p. 197-207. 8. Muller Weeks, S.J. and S. Caradonna, Specific association of cyclin- like uracil- DNA glycosylase with the proliferating cell nuclear antigen. Exp. Cell Res., 1996. 226(2): p. 346-55. 9. Haushalter, K.A., et al., Identification of a new uracil- DNA glycosylase family by expression doning using synthetic inhibitors. Curr. Biol., 1999.9(4): p. 174-85. 10. Gallinari, P. and J. Jiricny, A new class of uracil- DNA glycosylases related to human thymine- DNA glycosylase. Nature, 1996. 383(6602): p. 735-8. 11. Barrett, T.E., et al., Crystal structure of a G:T/ U mismatch- specific DNA glycosylase: mismatch recognition by complementary- strand interactions. Cell, 1998.92(1): p. 117-29. 12. Sandigursky, M. and W.A. Franklin, Thermostable uracil- DNA glycosylase from Thermotoga maritima a memberofa novel class of DNA repair enzymes. Curr. Biol., 1999. 9(10): p. 531-4. 13. Krokan, H.E., R. Standal, and G. Slupphaug, DNA glycosylases in the base excision repair of DNA. Biochem. J., 1997. 325(Pt 1): p. 1-16. 14. Higley, M. and R.S. Lloyd, Processivity of uracil DNA glycosylase. Mutat. Res., 1993. 294(2): p. 109-16. 15. Bennett, S.E., R.J. Sanderson, and D.W. Mosbaugh, Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil- DNA glycosylase is affected by NaCI concentration. Biochemistry, 1995. 34(18): p. 6109-19. 16. Purmal, A.A., et al., Uracil DNA N- glycosylase distributively interacts with dupiex polynucleotides containing repeating units ofeither TGGCCAAGCU or TGGCCAAGCTTGGCCAAGCU. J. Biol. Chem., 1994. 269(35): p. 22046-53. 17. Colson, P. and W.G. Verly, Intracellular localization of rat- iiver uracil- DNA glycosylase. Purification and properties of the chromatin enzyme. Eu r. J. Biochem., 1983.134(3): p. 415-20. 18. Domena, J.D. and D.W. Mosbaugh, Purification ofnuclearand mitochondrial uracil- DNA glycosylase from rat liver. Identification oftwo distinct subcellular forms. Biochemistry, 1985. 24(25): p. 7320-8. 19. Domena, J.D., et al., Purification and properties of mitochondrial uracil- DNA glycosylase from rat liver. Biochemistry, 1988. 27(18): p. 6742-51. 20. Seal, G., P. Arenaz, and M.A. Sirover, Purification and properties of the human placental uracil DNA glycosylase. Biochim. Biophys. Acta., 1987.925(2): p. 226-33. 21. Wittwer, C.U., G. Bauw, and H.E. Krokan, Purification and determination of the NH2' terminal amino acid sequence of uracil- DNA glycosylase from human pfacenta. Biochemistry, 1989.28(2): p. 780-4. 22. Krokan, H. and CU. Wittwer, Uracil DNa- glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Res., 1981.9(11): p. 2599-613. 23. Wittwer, CU. and H. Krokan, Uracil- DNA glycosylase in HeLa S3 cells: interconvertibility of 50 and 20 kDa forms and similarity of the nuclear and mitochondrial form of the enzyme, Biochim. Biophys. Acta., 1985. 832(3): p. 308-18. 24. Myrnes, B. and CU. Wittwer, Purification of the human 06- methylguanine-DNA methyltransferase and uracil- DNA glycosylase, the latter to apparent homogeneity,. Eur. J. Biochem., 1988.173(2): p. 383-7. 25. Caradonna, S., et al., Affinity purification and comparative analysis of two distinct human uracil- DNA glycosylases. Exp. Cell Res., 1996. 222(2): p. 345-59. 26. Muller-Weeks, S., B. Mastran, and S. Caradonna, The nuclear isoform of the highly conserved human uracil- DNA glycosylase is an Mr 36, 000 phosphoprotein. J. Biol. Chem., 1998. 273(34): p. 21909-17. 27. Seal, G., R.J. Tallarida, and M.A. Sirover, Purification and properties of the uracil DNA glycosylase from Bloom' s syndroma. Biochim. Biophys. Acta., 1991. 1097(4): p. 299-308. 28. Caradonna, S.J. and Y.C Cheng, Uracil DNA- glycosylase. Purification and properties ofthis enzyme isolated from blast cells ofacute myelocytic leukemia patients. J. Biol. Chem., 1980. 255(6): p. 2293-300. 29. Talpaert-Borle, M., L. Clerici, and F. Campagnari, Isolation and characterization of a uracil- DNA glycosylase from calfthymus. J. Biol. Chem., 1979. 254(14): p. 6387-91. 30. Talpaert-Borle, M., F. Campagnari, and D.M. Creissen, Properties of purified uracil- DNA glycosylase from calfthymus. An in vitro study using synthetic DNA- iike substrates. J. Biol. Chem., 1982. 257(3): p. 1208-14. 31. Guyer, R.B., J.M. Nonnemaker, and R.A. Deering, Uracil- DNA glycosylase activityfrom Dictyostelium discoideum. Biochim. Biophys. Acta., 1986. 868(4): p. 262-4. 32. Crosby, B., et a/., Purification and characterization of a uracil- DNA glycosylase from the yeast. Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res., 1981. 9(21): p. 5797-809. 33. Blaisdell, P. and H. Warner, Partial purification and characterization of a uracil- DNA glycosylase from wheatgerm. J. Biol. Chem., 1983.258(3): p. 1603-9. 34. Talpaert-Borle, M. and M. Liuzzi, Base- excision repair in carrot cells. Partial purification and characterization of uracil- DNA glycosylase and apurinic/ apyrimidinicendodeoxyribonuclease. Eur. J. Biochem., 1982.124(3): p. 435-40. 35. Birch, D.J. and A.G. McLennan, Uracil- DNA glycosylase in developing embryos of the brine shrimp ( Artemia salina). Biochem. Soc. Trans., 1980. 8(6): p. 730-1. 36. Lindahl, T., et al., DNA N- glycosidases: properties of uracil- DNA glycosidase from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1977. 252(10): p. 3286-94. 37. Cone, R., er al., Partial purification and characterization of a uracil DNA N-glycosidase from Bacillus subtilis. Biochemistry, 1977.16(14): p. 3194-201. 38. Williams, M.V. and J.D. Pollack, A mollicute ( mycoplasma) DNA repair enzyme: purification and characterization of uracil- DNA glycosylase. J. Bacteriol., 1990.172(6): p. 2979-85. 39. Kaboev, O.K., et al., Uracil- DNA glycosylase from Bacillus stearothermophilus. FEBS Lett., 1981.132(2): p. 337-40. 40. Pumapatre, K. and U. Varshney, Uracil DNA glycosylase from Mycobacterium smegmatis and its distinct biochemical properties. Eur J Biochem., 1998. 256(3): p. 580-8. 41. Kaboev, O.K., L.A. Luchkina, and T.l. Kuziakina, Uracil- DNA glycosylase of thermophilic Thermothrix thiopara. J Bacteriol, 1985.164(1): p. 421-4. 42. Masters, CL, B.E. Moseley, and K.W. Minton, AP endonuclease and uracil DNA glycosylase activities in Deinococcus radiodurans. Mutat. Res., 1991. 254(3): p. 263-72. 43. Koulis, A., et al., Uracil- DNA glycosylase activities in hyperthermophilic micro- organisms. FEMS Microbiol. Lett., 1996.143(2-3): p. 267-71. 44. Leblanc, J.P., et al., Uracil- DNA glycosylase. Purification and properties of uracil- DNA glycosylase from Micrococcus luteus. J Biol Chem, 1982. 257(7): p. 3477-83. 45. Sobek, H., et al., Heat- labile uracil- DNA glycosylase: purification and characteirzation. FEBS Lett., 1996. 388(1): p. 1-4. 46. Focher, F., et al.. Herpes simplex virus type 1 uracil- DNA glycosylase: isolation and selective inhibition by novel uracil derivatives. Biochem J., 1993. 292(Pt 3): p. 883-9. 47. Winters, T.A. and M.V. Williams, Purification and characterization of the herpes simplex virus type 2- encoded uracil- DNA glycosylase. Virology, 1993. 195(2): p. 315-26. 48. Slupphaug, G., et al., Nuclearand mitochondrial forms of human uracil- DNA glycosylase are encoded by the same gene. Nucleic Acids Res., 1993. 21(11): p. 2579-84. 49. Nilsen, H., et al., Nuclear and mitochondrial uracil- DNA glycosylases are generated by alternative splicing and transcription from different positions in the UNG gene. Nucleic Acids Res., 1997. 25(4): p. 750-5. 50. Bharati, S., et al., Human mitochondrial uracil- DNA glycosylase preform ( UNG1) is processed to two forms one ofwhich is resistant to inhibition by AP sites. Nucleic Acids Res., 1998. 26(21): p. 4953-9. 51. Haug, T., et al., Regulation ofexpression of nuclearand mitochondrial forms of human uracil- DNA glycosylase. Nucleic Acids Res., 1998. 26(6): p. 1449-57. 52. Otterlei, M., et al., Nuclear and mitochondrial splice forms of human uracil-DNA glycosylase contain a complex nuclear localisation signal and a strong classical mitochondrial localisation signal, respectively. Nucleic Acids Res., 1998. 26(20): p. 4611-7. 53. Mol, C.D., et al., Crystal structure and mutational analysis of human uracil-DNA glycosylase: structural basis for specificity and catalysis [ see comments]. Cell, 1995. 80(6): p. 869-78. 54. Sawa, R., et al., The structural basis ofspecific base- excision repair by uracil- DNA glycosylase. Nature, 1995. 373(6514): p. 487-93. 55. Ravishankar, R., et al., X- ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase ( EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG. Nucleic Acids Res., 1998. 26(21): p. 4880-7. 56. Slupphaug, G., et al., A nucleotide- flipping mechanism from the structure of human uracil- DNA glycosylase bound to DNA [ see comments]. Nature, 1996. 384(6604): p. 87-92. 57. Parikh, S.S., et al., Base excision repair initiation revealed by crystal structures and binding kinetics of human uracil- DNA glycosylase with DNA. Embo J., 1998.17(17): p. 5214-26. 58. Feller, G. and C. Gerday, Psychrophilic enzymes: molecular basis ofcold adaptation. Cell Mol. Life Sei., 1997. 53(10): p. 830^1.

59. Kwok S, Higuchi R., Nature 1989, 339:237-8.

60. Longo MC, Berningr MS, Hartley JL, Gene 1990, 93:125-8.

61. Male, R., et al., Molecular doning and characterization of anionic and cationic variants oftrypsin from Atlantic salmon. Eur. J. Biochem., 1995. 232(2): p. 677-85. 62. Wang, K.T. and I.S. Wang, Polyamide- layer chromatography of nucleic acid bases and nucleosides. Biochim. Biophys. Acta., 1967.142(1): p. 280-1. 63. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding. Anal. Biochem., 1976. 72: p. 248-54. 64. Slupphaug, G., et al., Properties of a recombinant human uracil- DNA glycosylase from the UNG gene and evidence that UNG encodes the major uracil-DNA glycosylase. Biochemistry, 1995. 34(1): p. 128-38. 65. Bennett, S.E., M.l. Schimerlik, and D.W. Mosbaugh, Kinetics of the uracil-DNA glycosylasefmhibitor protein association. Ung interaction with Ugi, nucleic acids, and uracil compounds. J Biol Chem, 1993. 268(36): p. 26879-85. 66. Karran, P., R. Cone, and E.C. Friedberg, Specificity of the bacteriophage PBS2 induced inhibitor of uracil- DNA glycosylase. Biochemistry, 1981. 20(21): p. 6092-6. 67. Mol, C.D., et al., Crystal structure of human uracil- DNA glycosylase in complex with a protein inhibitor protein mimicry of DNA. Cell, 1995. 82(5): p. 701-8. 68. Sawa, R. and L.H. Pearl, Nucleotide mimicry in the crystal structure of the uracil- DNA glycosylase- uracil glycosylase inhibitor protein complex. Nat Struct Biol, 1995. 2(9): p. 752-7. 69. Lohman, T.M., Kinetics of protein- nucleic acid interactions: use of salt effects to probe mechanisms of interaction. CRC Crit. Rev. Biochem., 1986.19(3): p. 191-245. 70. von Hippel, P.H. and O.G. Berg, Facilitated target location in biological systems. J. Biol. Chem., 1989. 264(2): p. 675-8. 71. Dodson, M.L., M.L. Michaels, and R.S. Lloyd, Unified catalytic mechanism for DNA glycosylases. J. Biol. Chem., 1994. 269(52): p. 32709-12. 72. Hamilton, R.W. and R.S. Lloyd, Modulation of the DNA scanning activity of the Micrococcus luteus UV endonuclease. J. Biol. Chem., 1989. 264(29): p. 17422-7. 73. Outzen, H., ef al., Temperature and pH sensitlvity of trypsins from Atlantic salmon ( Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin. Comp Biochem Physiol B Biochem. Mol. Biol., 1996.115(1): p. 33-45. 74. Berglund, G.I., et al., Purification and characterization ofpancreatic elastase from North Atlantic salmon ( Salmo salar). Mol. Mar. Biol. Biotechnol, 1998. 7(2): p. 105-14.

75. Kunkel TA, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 1985, 82:488-92.

76. Varshney U, van de Sande JH, Nucleic Acids Res., 1989,17:813.

77. Amann E., Ochs B., Abel KJ, Gene 1988, 69:301-15.

r " ■ . _ '

SEKVENSLISTE

SEQ:ID:NR. 1:

DNA- sekvens av clINGI hvor A=adenin. T=tvmidin. G=auanin. C=cvtosin. Enkelt-kiedevarietet.

SEQ:ID:NR. 2:

DNA- sekvens av cUNG2 hvor A=adenin. T=tvmidin. G=quanin. C=cvtosin. Enkelt-kiedevarietet.

SEQ:ID:NR. 3:

Aminosvresekvens til cUNG1. Konvensjonell én- bokstavbetepning av aminosyrer.

SEQ. ID. NR. 4:

Aminosvresekvens til cUNG2. Konvensjonen én- bokstavbeteanina av aminosyrer.

SEQ:ID:NR. 5

DNA- sekvens og aminosvresekvens tilhørende translasionsprotein av cUNG1

SEQ:ID:NR. 6

DNA- sekvens og aminosvresekvens tilhørende translatert protein cUNG2