NO311896B1

NO311896B1 - Fremgangsmate for aktivering av et normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen i genomet til en eukaryotisk cellelinje, fremgangsmate for modifisering av ekspresjonskarakteristikken, genom fra en eukaryotisk cellelinje, en ikke differensierende eukaryot cel

Info

Publication number: NO311896B1
Application number: NO19922436A
Authority: NO
Inventors: Scott Chappel
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1989-12-22
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 2002-02-11
Also published as: ES2151463T5; HU217212B; JP2004089200A; EP1375666A3; JP3740134B2; EP0505500A1; DE69034135T3; EP1484412A2; AU7183691A; ATE156189T1; BG60624B1; DE69034135D1; CA2071989A1; OA09594A; EP0779362B2; BG96515A; AR245776A1; ES2151463T1; LV10655A; JP2004000233A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et gen som er naturlig til stede i genomet til en stabil cellelinje eller klonet mikroorganisme. I den foretrukne utførelsen, angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for aktiviering og ekspresjon av et gen som er til stede i en stabil cellelinje og normalt transkriptsjonelt stille eller inert. Som et resultat blir proteinproduktet av genet uttrykt. Dette fenomenet opptrer uten transf ekter ing av cellen med DNA som koder for produktet. Det residente genet som koder for det ønskede produktet blir heller identifisert inne i en celle og aktivert ved innsetting av et passende regulerende segment ved en teknikk kalt homolog rekombinering. Positive og/eller negative selektive markører kan også bli innskutt for å hjelpe til i seleksjonen av celler i hvilke riktig homolog rekombinering har funnet sted. Som en ytterligere utførelse, kan et spesifikt gen bli forsterket for økede ekspresjonshastigheter, enten genet er normalt transkriptsjonelt stille og har vært aktivert ved hjelp av oppfinnelsen, eller endogent uttrykt produkt. Foreliggende oppfinnelse angår videre et genom fra en eukaryotisk cellelinje, en ikke differensierende eukaryot cellelinje, en DNA-konstruksjon samt anvendelse av denne.

Det er velkjent at hver celle i en organisme inneholder den genetiske informasjonen som koder alle proteinene funnet inne i organismen. Riktignok blir kun en meget liten prosentdel av genene i en celle av en gitt type faktisk transkribert. Den intracellulære mekanismen som regulerer innretningen av gener som skal bli transkribert er nå forstått. Cellespesifikke proteiner som er til stede i kjernen samvirker med DNA-regulerende segmenter som er bundet til spesielle gener. Denne samvirkingen av nukleære proteiner med DNA-regulerende sekvenser er nødvendige for gen transkripsjonen. Dette resulterer i mRNA biosyntese og til sist uttrykking av det kodede proteinet (Mitchell og Tjian, Science, 245:371, 1989 ).

Disse DNA-regulerende segmentene eller elementene for hvert gen ligger oppstrøms fra og kommer i noen tilfeller inn i eller til og med nedstrøms fra den kodende regionen. Gjennom en samvirking med cellespesifikke nukleære proteiner, påvirker DNA-regulerende segmenter evnen til RNA-polymerase, det hastighets-begrensende enzymet i protein ekspresjonen, å få tilgang til toppen av genet og syntetisere et mRNA-transkript. Således spiller disse DNA-segmentene og de residente nukleære proteinene en kritisk rolle i regulering av ekspresjonen av spesifikke gener (Johnson og McKnight, Ann. Rev. Biochem., 58:799, 1989).

De DNA-regulerende segmentene er bindingsseter for nukleære proteiner. Disse nukleære proteinene binder til DNA heliksen og endrer tilsynelatende dens struktur for å gjøre det ønskede genet tilgjengelig for RNA-polymerase gjenkjenning, noe som muliggjør gen-transkripsjon. Ekspresjonen av disse cellespesifikke regulerende proteinene avgjør hvilke gener som skal bli transkribert innen en celle og hastigheten med hvilken ekspresjonen skal skje. Som et eksempel på spesifi-siteten til dette systemet, er det hypofyseceller og ikke leverceller som uttrykker hypofyseproteiner, selv om disse genene for hypofyseproteiner er til stede i alle leverceller. Kjernen i levercellene inneholder ikke spesifikke DNA-bindende proteiner som samvirker med elementene av hypofyse-genene som er til stede i levercellene.

Med den viten at spesifikke DNA-regulerende sekvenser er nødvendige for å aktivere gen-transkripsjon innen spesielle celletyper, har vitenskapsmenn uttrykt fremmede gener innen en bestemt celletype gjennom genetisk engineering. Vanligvis blir DNA-regulerende segmenter som blir gjenkjent av cellens kjerneproteiner plassert oppstrøms fra den kodende regionen av et fremmed gen som skal bli uttrykt. På denne måten kan fremmed DNA etter innsettingen i cellen, bli uttrykt siden cellens nukleære regulerende proteiner nå gjenkjenner disse DNA-regulerende sekvenser. Denne teknikken har blitt anvendt for å fremstille proteiner som er vanskelige å oppnå eller rense fra naturlige kilder ved tradisjonelle rensestrategier.

I tillegg til den rekognoserbare DNA-sekvensen og det aktuelle genet, er en selekterbar markør festet til DNA-konstruksjonen. På denne måten kan kun celler som har tatt opp DNAet overleve etter at kulturen er plassert i et seleksjonsmedium. For eksempel kan genet for neomycin-resistanse bli inkludert i ekspresjonsvektoren. Etter transfeksjon, blir cellene dyrket i G418, et neomycin-antibiotika som er dødelig for mammalske celler. Hvis derimot cellene har oppnådd neomycin-resistanse genet, vil de være i stand til å motstå de toksiske effektene av medikamentet. På denne måten kan kun celler som har tatt opp det transfekterte DNA opprettholdes i kulturen. Det må forstås at en hvilken som helst selekterbar markør kan bli brukt så lenge den sørger for seleksjon av celler som har tatt opp det transfekterte DNA. Det må videre forstås at det ikke er kritisk hvilken spesifikk plassering det innsatte genetiske materialet har i cellen. Det er også viktig at det vil bli tatt opp et sted i kjernen der både det regulerende segmentet og det fremmede genet (så vel som den selekterbare markøren) er satt inn sammen.

Selv om teknikken over har vært grunnleggende for utnyttelse av kraften ved genteknologi, har det ikke alltid vært de mest effektive fremgangsmåtene for å yttrykke gener. Dette skyldes det faktum at innskyting av DNA i kjernen i en cellelinje vanligvis blir oppnådd ved en teknikk kjent som transfeksjon. DNA som har blitt bearbeidet for uttrykking i den aktuelle cellelinjen blir utfelt og cellemembranen blir oppløst for å tillate DNA å komme gjennom. Som indikert over, er det eksakte stedet i genomet hvor DNAet blir inkorporert ikke forutsigbart; faktisk kan DNAet forbli episomalt (ikke integrert i genomet). Dette resulterer i at både nivået av ekspresjon av det fremstilte proteinet og stabiliteten til cellelinjen ikke er forutsigbart.

En annen ulempe ved denne teknikken er det faktum at konstruksjonen av ekspresjonsvektoren er ekstremt vanskelig når det aktuelle genet er relativt stort (større en 5-10 kilobaser). Mange av proteinene uttrykt ved rekombinant DNA-teknologi har blitt kodet ved cDNA heller enn mye større genomiske kloner. Dette er gjort for å redusere total-størrelsen på innskuddet. Selv om anvendelse av cDNA gjør genetisk teknologi enklere, kan hastigheten av gentrans-kripsjon og proteinproduksjon bli skadelidende. Det har nylig blitt vist at ekspresjonsnivåene ofte blir kraftig forsterket gjennom anvendelsen av genomiske heller enn cDNA innskudd (Brinster et al., Proe. Nati. cad. Sei., 85:836-840, 1988, og Chung og Perry, Mol. Cell. Biol., 9:2075-2082, 1989 ) .

Selv om mekanismene som er ansvarlige for denne observasjonen ikke riktig er forstått, er det kjent at det i visse situasjoner er forsterkende elementer til stede i intron som kan forbedre transkripsjonseffektiviteten til genet. Det er også tydelig at intron, eller spleisingen som et resultat av eksistensen av intron, kan ha en effekt på RNA-prosesseringen som følger etter initieringen av transkripsjonen (Buchman og Berg, Mol. Cell. Biol., 8:4395-4405, 1988). Dette kan stabilisere transkriptet og derved øke hastigheten av mRNA-akkumulering. I den ovenfor siterte artikkelen fra Brinster et al., er det også postulert at posisjonen av intron i genet kan være viktig for fasing av nukleosomene relativt til promotoren. Innflytelsen av forskjellige regulerende elementer på transkripsjonen av eukaryote gener er diskutert i Khoury et al, Cell 33:313-14 (1983, Maniatis et al, Science, 236:1237-45 (1987) og Muller et al, Eur. J. Biochem, 176:485-95 (1988).

For det tredje må det transfekterte DNA inkludert hele den kodende regionen av fremmed gen, passere gjennom cytoplasma etter gjennomtrengingen av den permeabiliserte plasma-membranen til cellen for å nå kjernen. I løpet av denne tiden kan DNA komme i kontakt med lysosomale enzymer som kan forandre eller totalt ødelegge integriteten til DNA. Således kan den kodende regionen til DNA være forskjellig fra det som ble transfektert.

Den nye fremgangsmåten for genaktivering og/eller ekspresjon modifikasjon som blir beskrevet under kan ikke resultere i fremstilling av mutantformer av det ønskede proteinet, siden den kodende regionen av det ønskede genet ikke er utsatt for enzymatisk modifikasjon.

Ved oppsummering vil en stor mengde av DNAet som trans-fekteres inn i cellen ved hjelp av tradisjonelle teknikker, og spesielt den kodende regionen, ikke bli riktig transkribert. Det kan bli degradert før det kommer inn i kjernen, enzymatisk endret slik at det ikke vil kode for hele det ønskede proteinet eller trenger ikke å inneholde alle nødvendige regulerende segmenter for å tillate transkripsjon. Det kan også bli innsatt i en del av genomet som forhindrer transkripsjon. Det kan også bli innsatt i en del av genomet som forhindrer transkripsjon. Dersom cDNA blir transkribert, vil ofte det aktuelle proteinet ikke bli produsert effektivt på grunn av utelatelsen av introner som kan inneholde forsterkere eller tillate effektiv mRNA-prosessering. Til sist kan det forbli episomalt, fremme proteinproduksjon, men være ustabilt etter som cellepopulasjonen vokser gjennom celledeling.

Det vil således være ønskelig å utvikle en fremgangsmåte for indusering av genekspresjon som vil gi en cellelinje som hadde fått innarbeidet de positive sidene ved de eksisterende fremgangsmåtene, men som omgår de uheldige trekkene. Det ville videre være ønskelig å være i stand til å uttrykke eller modifisere endogen ekspresjon av bestemte gener i den aktuelle celletypen. Det ville videre være ønskelig å være i stand til å ta fordel av de potensielle fordelene som kan oppnås ved en fullstendig genomsekvens som kan omfatte kryptiske transkripsjonsforsterkere som kan være inne i introner, ved passende plassering av intron for riktig nukleosom fasing eller mer effektiv mRNA-prosessering.

Disse fordelene blir normalt ikke gitt i rekombinante DNA-ekspresjonsframgangsmåter grunnet størrelsen til genet. Hvis man kunne være i stand til å uttrykke et gen som allerede var til stede i genomet, det vil si et endogent gen, ville cellelinjens stabilitet og ekspresjonshastigheter være mer konsistente og forutsigbare.

Det er følgelig et mål ved oppfinnelsen å eliminere de ovenfor nevnte manglene ved kjent teknikk.

Det er et annet mål ved oppfinnelsen å gi en fremgangsmåte for regulering og/eller forsterking av genekspresjonen som omfatter de positive sidene ved rekombinant gen teknologi, en omgår de uheldige sidene.

Det er videre et mål for oppfinnelsen å gi en fremgangsmåte for uttrykking av spesifikke gener som er til stede, men normal transkripsjonelt stille i en aktuell cellelinje.

Det er enda et videre mål for oppfinnelsen å gi en fremgangsmåte for ekspresjon av proteiner som tar alle fordelene av fullstendig genomiske sekvenser som er ansvarlige for mRNA-akkumulering og/eller transkripsjon.

Det er videre et mål for oppfinnelsen å gi en fremgangsmåte for modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et aktuelt gen ved innsetting av DNA-regulerende segmenter og/eller forsterkende segmenter inn i genomet til en stabil cellelinje eller klonet mikroorganisme oppstrøms for, inni eller på annen måte i nærheten av det naturlige aktuelle genet.

Det er enda et mål for oppfinnelsen å gi en fremgangsmåte for modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et gen som er naturlig til stede i genomet til en stabil cellelinje eller klonet mikroorganisme og samtidig tilskuddets karakteristikker som vil hjelpe til i seleksjonen av celler som er blitt riktig modifisert.

Det er enda et mål for oppfinnelsen å gi et genom som inneholder, i nærheten av den kodende regionen eller ekson i det aktuelle genet, et regulerende eller forsterkende segment som ikke naturlig forefinnes der.

Det er enda et mål for oppfinnelsen å gi DNA-konstruksjoner som kan bli benyttet for å oppnå de homologe rekombinasjons-fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Det er videre et mål for oppfinnelsen å gi cellelinjer og mikroorganismer som omfatter genomene ifølge oppfinnelsen.

Disse og andre mål for oppfinnelsen blir oppnådd ved hjelp av teknikken homolog rekombinasjon, ved hvilken en med vanlige kunnskaper innen teknikken kan forårsake ekspresjonen og helst forsterkingen av residente, men transkripsjonene pausegener. Med denne teknikken kan man også modifisere ekspresjonskarakteristikkene til et gen som er naturlig til stede, men ikke nødvendigvis taust eller inert, ved genome fra en stabil cellelinje, som for eksempel for å gjøre ekspresjonen betinget, det vil si mulig å hemme eller induserbar, eller øke ekspresjonshastigheten.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for aktivering av et normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen i genomet til en eukaryotisk cellelinje og ekspresjon av genproduktet av nevnte gen, kjennetegnet ved at den omfatter:

a) Innsetting av en DNA-kon st ruk s j on i nevnte genom ved homolog rekombinasjon, hvor nevnte DNA-konstruksjon omfatter et DNA-regulerende segment som er istand til å stimulere ekspresjon av nevnte gen når det er operativt forbundet dertil og et DNA-målsøkingssegment homologt til en region av nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte regulerende segment er operativt forbundet med nevnte aktuelle gen; b) dyrking av cellelinjen under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte genprodukt; og c) oppsamling av nevnte genprodukt;

hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter et ekspresserbart, amplifiserbart gen, som er istand til å amplifisere nevnte aktuelle gen når det er satt inn i tilstrekkelig nærhet dertil, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte ampiifiserbare gen er tilstrekkelig nær nevnte aktuelle gen til å forårsake amplifikasjon derav, når nevnte amplifiserbare gen blir amplifisert,

hvor den nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart, selekterbart markørgen plassert slik at det blir satt inn sammen med nevnte ekspresjonsbare, ampiifiserbare gen,

hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter to DNA-mål-søkingssegmenter, som hvert er homologt til en region av nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor ett av nevnte målsøkingssegmenter er oppstrøms for nevnte regulerende segment, og det andre av nevnte målsøkingssegmentet er nedstrøms for nevnte regulerende segment,

hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart selekterbart markørgen, anbragt slik at det blir satt inn i nevnte regulerende segment, eller

hvor nevnte DNA-konstruksjon ytterligere eventuelt omfatter et negativt, selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvorved nevnte selekterbare markør ikke blir uttrykt i eeller i hvilke DNA-konstruksjonen er riktig satt inn, og hvor det eventuelt blir gjennomført en selektering av kloner fra nevnte cellelinje som uttrykker produktet av nevnte selekterbare markørgen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en fremgangsmåte for modifisering av ekspresjonskarakteristikken av et gen i et genom av en eukaryotisk cellelinje og ekspresjon av produktet av nevnte gen, kjennetegnet ved at den omfatter: a) Innsetting av en DNA-konstruksj on i nevnte genom ved homolog rekombinasjon, hvor nevnte DNA-konstruksjon omfatter et DNA-regulerende segment som er istand til å modifisere ekspresjonenskarakteristikken av nevnte gen når det er operativt forbundet dertil, sammenlignet med dets eksisterende DNA-regulerende segment, og et DNA-målsøk-ingssegment som er homologt med en region i nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte regulerende segment er operativt forbundet til nevnte gen; b) dyrking av cellelinjen under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte genprodukt; og c) oppsamling av nevnte genprodukt;

hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter et ekspresserbart, amplif iserbart gen, som er istand til å amplifisere nevnte aktuelle gen når det er satt inn i tilstrekkelig nærhet dertil, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte amplifiserbare gen er tilstrekkelig nær nevnte aktuelle gen til å forårsake amplifikasjon derav, når nevnte amplifiserbare gen blir amplifisert,

hvor den nevnte DNA-konstruksjonen eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart, selekterbart markørgen plassert slik at det blir satt inn sammen med nevnte ekspresjonsbare, amplifiserbare gen,

hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter et negativt, selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvorved nevnte selekterbare markør ikke blir uttrykt i celler i hvilke DNA-konstruksjonen er riktig satt inn, og hvor det eventuelt blir gjennomført en selektering av nevnte cellelinje som uttrykker produktet av nevnte selekterbare markørgen.

Konstruksjons- og innskuddsteknikkene er utformet for å forårsake at det nye DNA-regulerende segmentet blir operativt forbundet til det aktuelle genet. Således kan ekspresjonskarakteristikkene av et gen bli modifisert uten nødvendigvis å skyte inn noen nye kodende eksoner. I den foretrukne utførelsen er genet et som vanligvis er transkripsjonelt taust eller inert inni verts-cellelinjen eller mikroorganismen og, ved hjelp av den DNA-regulerende regionen, som blir målrettet direkte mot den viktige posisjonen i forhold til genet ved hjelp av homolog rekombinasjon, blir genet derved aktivert for ekspresjon av genproduktet.

Gen-konstruksjonen omfatter helst to målsegmenter som selv om de er adskilte i konstruksjonen ved de elementene som skal bli innskutt i genomet, helst er nærliggende i det naturlige genet.

Konstruksjonen omfatter videre helst minst et uttrykkbart valgbart markørgen, som genet som gir neomycin resistanse. Dette markørgenet, inkludert en promotor for dette, er også plassert mellom de to målregionene i konstruksjonen.

I en annen utførelse, omfatter konstruksjonen et uttrykkbart forsterkbart gen for å forsterke ekspresjonen av det aktuelle genet. Dette genet, inkludert en promotor for dette, er også plassert mellom konstruksjonens to målregioner. I noen tilfeller trenger ikke den valgbare markøren og den forsterkbare markøren å være den samme.

I en videre utførelse av oppfinnelsen, omfatter DNA-konstruksjonen et negativt valgbart markørgen som ikke blir uttrykt i celler hvor DNA-konstruksjonen blir riktig innskutt. Dette negative valgbare markørgenet er plassert på utsiden av de to målregionene slik at det blir fjernet når konstruksjonen blir riktig innsatt i genet ved homolog rekombinasjon. Et eksempel på et slikt negativt markørgen er Herpes Simplex Virus thymidin kinasegen.

I enda en utførelse, er det mulig å modifisere ekspresjonskarakteristikkene til et spesifikt gen som allerede uttrykker et produkt i cellelinjen eller mikroorganismen. Dette kan bli utført ved innsetting av en DNA-konstruksjon ved homolog rekombinasjon som omfatter (1) et uttrykkbart forsterkbart gen som øker antallet av det aktuelle genet når cellelinjen eller mikroorganismen blir utsatt for forsterkende betingelser og/eller (2) et promotor/forsterker element (eller andre regulerende elementer) som modifiserer ekspresjonen av det aktuelle genet som for eksempel ved øking av transkrip-sjonshastigheten, øking av translasjonseffektiviteten, øking av mRNA akkumuleringen, gjøre ekspresjonen induserbar etc.. Genekspresjonen som er modifisert på denne måten kan være naturlig ekspresjon eller ekspresjon som er forårsaket ved tidligere genetisk manipulasjon av cellelinjen eller mikroorganismen. Den tidligere genetiske manipulasjonen kan ha blitt gjort ved konvensjonelle teknikker eller ved hjelp av homolog rekombinasjon ifølge oppfinnelsen. Ved det siste tilfellet kan DNA-innskuddet som resulterte i modifikasjonen av ekspresjonskarakteristikkene bli utført som en del av samme genetiske manipulasjon som resulterte i ekspresjon av genet eller kan bli utført som et senere trinn.

Oppfinnelsen omfatter videre genom fra en eukaryotisk cellelinje, kjennetegnet ved at genomet har et DNA-regulerende segment operativt forbundet med et naturlig forekommende gen, hvor genet har sin naturlig forekommende lokalisering i genomet, og hvor det DNA-regulerende segmentet, når forbundet slik, ikke er ved dets naturlige plassering i genomet, ved hvilken naturlige plassering den fremmer ekspresjonen av et genprodukt som normalt blir uttrykt i nevnte cellelinje.

Omfattet av oppfinnelsen er videre en ikke differensierende eukaryot cellelinje som er istand til å uttrykke et genprodukt av et normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen innen genomet av nevnte cellelinje, kjennetegnet ved at genomet har innsatt deri en DNA-konstruksjon som er operativt forbundet med nevnte normalt transkripsjonelt ikke uttrykte gen, hvor det DNA-regulerende segment er istand til å fremme ekspresjonen av et genprodukt i nevnte cellelinje, hvor nevnte DNA-konstruksjon omfatter et DNA-regulerende segment som er istand til å stimulere ekspresjon av nevnte gen når det er operativt forbundet dertil og et DNA målsøkingssegment homologt til en region av nevnte genom;

hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter et ekspresserbart, amplif iserbart gen, som er istand til å amplifisere nevnte aktuelle gen når det er satt inn i tilstrekkelig nærhet dertil, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte amplifiserbare gen er tilstrekkelig

nær nevnte aktuelle gen til å forårsake amplifikasjon derav, når nevnte amplifiserbare gen blir amplifisert,

hvor den nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter to DNA-målsøkingssegmenter, som hvert er homologt til en region av nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor ett av nevnte målsøkingssegmenter er oppstrøms for nevnte regulerende segment, og det andre av nevnte målsøkingssegmentet er nedstrøms for nevnte regulerende segment, hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart selekterbart markørgen, anbragt slik at det blir satt inn i nevnte regulerende segment, eller

hvor nevnte DNA-konstruksjon ytterligere omfatter et negativt, selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvorved nevnte selekterbare markør ikke blir uttrykt i celler i hvilke DNA-konstruksj onen er riktig satt inn, og hvor det eventuelt blir gjennomført en selektering av nevnte cellelinje som uttrykker produktet av nevnte selekterbare markørgen.

Omfattet av oppfinnelsen er videre en ikke differensierende eukaryotisk cellelinje som er istand til å modifisere ekspresjon av et genprodukt sammenlignet med cellelinje fra hvilken den er avledet, kjennetegnet ved at nevnte genprodukt er ekspresj onsproduktet av et endogent gen fra genomet fra nevnte celle, hvor det i nevnte genom er satt inn på en operativ måte, ved eller nær nevnte endogene gen, en DNA-konstruksjon og eventuelt et amplifiserbart gen som er istand til å modifisere ekspresjonen av nevnte genprodukt ved nevnte cellelinje, hvor nevnte DNA-konstruksjon omfatter et DNA-regulerende segment som er istand til å stimulere ekspresjon av nevnte gen når det er operativt forbundet dertil og et DNA målsøkingssegment homologt til en region av nevnte genom; hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter et ekspresserbart, amplif iserbart gen, som er istand til å amplifisere nevnte aktuelle gen når det er satt inn i tilstrekkelig nærhet dertil, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte amplifiserbare gen er tilstrekkelig nær nevnte aktuelle gen til å forårsake amplifikasjon derav, når nevnte amplifiserbare gen blir amplifisert,

hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart selekterbart markørgen, anbragt slik at det blir satt inn i nevnte regulerende segment, eller hvor nevnte DNA-konstruksjon ytterligere omfatter et negativt, selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvorved nevnte selekterbare markør ikke blir uttrykt i celler i hvilke DNA-konstruksj onen er riktig satt inn, og hvor det eventuelt blir gjennomført en selektering av nevnte cellelinje som uttrykker produktet av nevnte selekterbare markørgen.

Oppfinnelsen omfatter videre en DNA-konstruksjon for anvendelse ved aktivering av ekspresjonen av et forhåndsvalgt normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen i en forhåndsvalgt eukaryotisk vertcellelinje og som passer for målsøking av nevnte forhåndsvalgte gen ved homolog rekombinasjon, kjennetegnet ved at konstruksjonen omfatter: et DNA-regulerende segment som er istand til å aktivere ekspresjonen av nevnte forhåndsvalgte normalt transkripsjonelt ikke uttrykte gen til cellelinjen inn i hvilken det er innsatt, når nevnte DNA-regulerende segmentet er operasjonelt forbundet til nevnte gen, og et DNA-målsøkingssegment homologt til et område til genomet inn i hvilket det er tiltenkt å bli innsatt eller proksimalt til nevnte forhåndsvalgte normalt transkripsjonelt ikke uttrykte gen, slik at når nevnte DNA-konstruksjon innsettes ved nevnte målsøkte posisjon, det DNA-regulerende segmentet vil være operativt forbundet til nevnte forhåndsvalgte normalt transkripsjonelt ikke uttrykte gen og vil være ved en posisjon i genomet som er en annen enn den naturlige posisjonen til nevnte DNA-regulerende segment.

Oppfinnelsen omfatter videre en DNA-konstruksjon for anvendelse ved modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et forhåndsvalgt gen i en forhåndsvalgt eukaryotisk vertscellelinje og som passer for målsøking av nevnte forhåndsvalgt gen ved homolog rekombinasjon, kjennetegnet ved at konstruksjonen omfatter: et DNA-regulerende segment som er istand til å modifisere ekspresjonskarakteristikkene av et forhåndsvalgte gen til cellelinjen inn i hvilken det skal innsettes, når nevnte DNA-regulerende segment er operasjonelt forbundet til nevnte gen, og et DNA-målsøkningssegment homolog til et område av genomet inn i hvilket det er tiltenkt å bli innsatt i eller proksimalt til nevnte forhåndsvalgte gen, slik at når nevnte DNA-konstruksjon innsettes ved nevnte målsøkte posisjon vil det DNA-regulerende segmentet være operativt forbundet til nevnte forhåndsvalgte gen og vil være ved en posisjon i genomet som er en annen enn den naturlige posisjonen til nevnte DNA-regulerende segment.

Oppfinnelsen omfatter videre anvendelse av en DNA-konstruksjon som omfalt ovenfor for aktivering av ekspresjonen av et forhåndsvalgt, normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen i en forhåndsvalgt eukaryotisk vertscellelinje, eller for modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et forhåndsvalgt gen i en forhåndsvalgt eukaryot vertscellelinje. Figur 1 viser den generelle skisse av en DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen. Figur 2A viser metoden for integrasjon av DNA-konstruksjonen inn i genomet ved en ikke-homolog eller tilfeldig re-kombinas jon . Figur 2 viser metoden for integrasjon av DNA-konstruksjonen i genomet ved homolog rekombinasjon. Figur 3 viser konstruksjonen av en foretrukket homolog rekombinasjonsvektor ifølge oppfinnelsen. Figur 4 viser fremgangsmåten ved integrasjon av en sirkulær del av DNA med homolog rekombinasjon når kun en målsøkende del av DNA blir benyttet. Figur 5 viser pRSVCAT plasmid, inkludert dets restrik-sj onsseter. Figur 6 viser konstruksjonen av pRSV plasmidet, omfattende dets restriksjonsseter. Figur 7 viser pSV2NE0 plasmidet, omfattende dets restrik-sj onsseter . Figur 8 viser konstruksjonen av pSVNEOBAM plasmidet, omfattende dets restriksjonsseter. Figur 9 viser konstruksjonen av pRSVNEO plasmidet, omfattende dets restriksjonsseter. Figur 10 viser konstruksjonen av pRSVCATNEO plasmidet, omfattende dets restriksjonsseter. Figur 11 viser et 15,3 kb fragment av rotte TSHe-genet og viser forskjellige av dets restriksjonssegmenter. Figur 12 viser konstruksjonen av pRSVCATNE0TSHB3 plasmidet, omfattende dets restriksjonsseter. Figur 13 viser konstruksjonen til pESVCATNE0TSHB3-5XbaI plasmidet, omfattende dets restriksjonsseter. Figur 14 viser en del av nukleotidsekvensen av TSHp sammen med regionene av dette hvor hver primer for PCR forsterking stemmer overens. Eksonene 2 og 3 er vist med store bok-staver. A 247 BP forsterket fragment er vist ved under-streking med stjerner. Figur 15 viser resultatene av polyakrylamidgel elektroforese av cDNA syntetisert fra RNA ekstrahert fra forskjellige cellepopulasjoner og hvor TSH cDNA, hvis til stede, er forsterket ved PCR. Naturen til cellene som representerer de forskjellige sporene er angitt i figur 15 under gelen.

Homolog rekombinasjon er en teknikk som er utviklet i løpet av de siste få år for målretting av gener for å indusere eller korrigere mutasjoner i transkripsjonelt aktive gener (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36:301 (1989)). Teknikken med homolog rekombinasjon ble utviklet som en fremgangsmåte for innføring av spesifikke mutasjoner i det mammalske genomet (Thomas, et al., Cell, 44:419-428, 1986; Thomas og Capecchi, Cell, 51:503-512, 1987; Doetschman et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 85:8583-8587, 1988) eller for å korrigere spesifikke mutasjoner i ødelagte gener (Doetschman et al., Nature, 330:576-578, 1987).

Gjennom denne teknikken kan en del av DNA som man ønsker å skyte inn i genomet bli rettet mot en spesifikk region med spesielle gener ved å feste det til "målsøkende DNA". "Målsøkende DNA" er DNA som er komplimentert (homologt) til en region i genomets DNA. Hvis to homologe deler av entrådet DNA (det vil si målsøkende DNA og genomets DNA) er nær hverandre, vil de hybridisere for å danne en dobbelt-trådet heliks. DNA-sekvensen som man ønsker å innsette i genomet er festet til det målsøkende DNA.

Det er flere fremgangsmåter ved hvilken homolog rekombinasjon kan foregå. Dette eksempel er under replikasjonsprosessen for DNA under mitosen i cellen.

Gjennom en mekanisme som ikke er fullstendig forstått, blir parentalt dobbeltrådet DNA åpnet rett før celledelingen på et lokalt område kalt replikasjonsboblen. De to adskilte strengene av DNA kan nå tjene som sjablonger på hvilke nye DNA-tråder blir syntetisert. En arm av replikasjonsgaffelen av DNA i 5' til 3' retning, som er den riktige orienteringen fra hvilken DNA-polymerase kan "lese". Dette enzymet testes til 5'-delen av det enkelttrådede DNA og anvender strengen som sjablong, begynner å syntetisere den kompiimentære DNA-streng. Den andre parentale strengen av DNA er kodet i 3' til 5' retning. Denne kan ikke bli lest i denne retningen av DNA-polymerase. For at denne DNA-strengen skal bli replikert, må en spesiell mekanisme opptre.

Et spesielt enzym, ENA primase, fester seg til 3' til 5' strengen av DNA og syntetiserer en kort RNA primer med mellomrom langs strengen. Ved hjelp av disse RNA-segmentene som primere, kan DNA-polymerasen nå feste seg til det forbehandlede DNA og syntetisere en komplimentær del av DNA i 5' til 3' retning. Disse delene av nylig syntetisert DNA er kalt Okazaki fragmenter. RNA primerne som er ansvarlige for startingen av hele reaksjonen blir fjernet ved eksonuklease-funksjon av DNA-polymerase og byttet ut med DNA. Dette fenomenet fortsetter inntil polymerasen når en ikke-for-behandlet del av DNA, hvor den lokale syntetiske prosessen stopper. Selv om den komplimentære parentale streng blir syntetisert hele veien i 3' til 5' retning, blir den faktisk fremstilt ved "tilbakesying" (backstitching) i 5' til 3' retningen. Alle kutt som kan opptre i DNA under "tilbake-syings" prosessen blir forseglet ved et enzym kalt DNA-ligase.

For å oppnå en absolutt nøyaktighet i DNA koden, er en korrekturlesingsfunksjon til stede i DNA polymerase. DNA polymerase krever en primet DNA ende på hvilken den kan syntetisere en ny DNA-streng. Som nevnt over, kan denne være en enkelt tråd av DNA primet med RNA, eller på en komplimentær DNA-streng. Når DNA-polymerase finner ikke-passende komplimentære deler av DNA, kan den fungere som en ekso-nuklease og fjerne DNA-baser i en 3' til 5'-retning inntil den når perfekt tilpasning igjen.

Med denne bakgrunnen er det nå mulig å forstå basisen til teknikken beskrevet her. Små deler av målsøkende DNA som er komplimentære med spesielle regioner i genomet ble satt i kontakt med den parentale streng under DNA-replikasjonsprosessen. Det er en generell egenskap ved DNA som har blitt innskutt i en celle for å hybridisere og derfor rekombinere med andre deler av DNA gjennom felles homologe regioner. Hvis denne komplimentære strengen er festet til et oligo-nukleotid som inneholder en mutasjon eller en forskjellig DNA-sekvens, blir den også inkorporert i den nylig synteti-serte strengen som et resultat av rekombinasjon. Som et resultat av korrekturlesingsfunksjonen, er det mulig for den nye DNA-sekvensen å tjene som sjablong. Således er det transfekterte DNA innarbeidet i genomet.

Dersom sekvensen til et spesielt gen er kjent, kan en del DNA som er kompi imentær til en valgt region av genet bli syntetisert eller oppnådd på annen måte, som ved passende restriksjon av naturlig DNA ved spesifikke gjenkjennings-steder som avgrenser den interessante regionen. Dette stykket vil tjene som målsøkende innretning ved innsetting i cellen og vil hybridisere til den homologe regionen i genomet. Hvis denne hybridiseringen skjer under DNA-replikasjonen, kan delen av DNA, og en hvilken som helst ti 1leggssekvens festet til denne, fungere som et Okazaki fragment og vil bli tilbakesydd I den nylig dannede dattertråden av DNA.

I teknikken ifølge oppfinnelsen, er det til disse delene av målsøkende DNA festet regioner av DNA som er kjent for å samvirke med de nukleære regulerende proteinene som er til stede i cellen og eventuelt forsterkende og selekterbare DNA-markører. Således kan uttrykkingen av spesifikke proteiner bli oppnådd ikke bare ved transfeksjon av DNA som koder for selve genet og markør DNA, som er mest vanlig, men heller ved anvendelse av målsøkende DNA (regioner med homolog! med det aktuelle endogene genet) koblet med DNA regulerende segmenter som gir genet gjenkjennbare signaler for transkripsjon. Med denne teknologien er det mulig å uttrykke og forsterke et hvilket som helst beslektet gen som er til stede i en celletype uten faktisk å transfektere genet. I tillegg er uttrykkingen av dette genet kontrollert av hele det genomiske DNA heller enn deler av genet eller cDNA, og forbedrer således hastigheten for transkripsjon og effektiviteten til mRNA prosessering. Dessuten kan ekspresjonskarakteristikkene til et hvilket som helst beslektet gen som er til stede i en celletype bli modifisert ved riktig innsetting av DNA regulerende segmenter og uten innsetting av hele den kodende delen av det aktuelle genet.

Ifølge disse sidene ved oppfinnelsen er det gitt nye metoder for uttrykking av normalt transkripsjonene pausegener eller for modifikasjon av ekspresjonen av endogene uttrykte gener, i en differensiert cellelinje. De beslektede genomiske sekvensene som ønskes uttrykket eller ekspresjonsmodifisert, vil bli utstyrt med de nødvendige cellespesifikke DNA-sekvenser (regulerende og/eller forsterkende segmenter) for å medføre eller modifisere uthalelsen av genet i cellen. Resulterende DNA vil inneholde DNA-sekvensen som koder for det ønskede proteinet direkte bundet på en operativ måte til heterologe (for den beslektede DNA-sekvensen) regulerende og/eller forsterkende segmenter. En positiv selekterbar markør blir eventuelt omfattet inne i konstruksjonen for å muliggjøre sorteringen av de resulterende celler. Anvendelsen av neomycin-resistansgenet er foretrukket, selv om en hvilken som helst markør kan bli benyttet. Negative selekterbare markører kan eventuelt også bli brukt. For eksempel kan Herpes Simplex Virus thymidin kinase (HSVtk) genet bli brukt som en markør for å selektere mot tilfeldig inegrert vektor DNA. De sammenkoblede DNA eller eksisterende uttrykte DNA kan bli forsterket hvis det målsøkende DNA er bundet til en forsterkende markør.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan derfor et hvilket som helst gen som normalt blir uttrykt nå være til stede i den spesifikke eukaryotiske cellelinje, spesielt en differensiert cellelinje, bli tvunget til uttrykking i en cellelinje som ikke er spesifikk for dette hvor genet er i et taust format. Dette opptrer uten innsetting av den fulle DNA-sekvensen til dette genet. I tillegg kan dette genet, eller et normalt uttrykkende gen, bli forsterket for økede ekspresjonshastigheter. Videre kan ekspresjonskarakteristikkene til gener som ikke er totalt transkripsjonelt tause, bli modifisert på samme måten som ekspresjons karakteristikkene til gener i mikroorganismer.

I en utførelse av oppfinnelsen, blir eukaryote celler som inneholder, men normalt ikke transkriberer et spesifikt gen, indusert til å gjøre dette ved teknikken som her er beskrevet. Den homologe rekombinasjonsvektoren beskrevet under blir innsatt i en klonal cellelinje og blir etter kjemisk seleksjon overvåket for produksjon av et spesifikt genprodukt på en passende måte, som for eksempel ved deteksjon av mRNA transkribert fra det nylig aktiverte genet, immunologisk deteksjon av det spesifikke genproduktet eller funksjonelle analyser for det spesifikke genproduktet.

Den generelle skissen av DNA-konstruksjonen som er brukt for transkripsjonen aktiviering av endogene gener ved homolog rekombinasjon er tegnet i figur 1.

Generelt består DNA-konstruksjonen av minst to og opp til seks eller flere separate DNA-segmenter. Segmentene består av minst en, helst to, DNA-målsøkende segmenter (A og B) som er homologe til en region i cellegenomet inne i eller i nærheten av genet som ønskes uttrykket, et positivt seleksjonsgen

(C), et forsterkbart gen (D) et selektivt seleksjonsgen (E) og et DNA regulerende segment (F) som er transkrips j onelt

aktivt i cellen som skal bli transf ektert. I den mest grunnleggende utførelsen av oppfinnelsen er kun et enkelt målsøkende segment (B) og det regulerende segment (F) til stede. Alle de andre regionene er valgfrie og gir foretrukne konstruksj oner.

Regionene A og B er DNA-sekvenser som er homologe til regioner i det aktuelle endogene genet som skal gjøres transskripsjonelt aktivt. De spesifikke regionene A og B av endogent gen er valgt slik at de er oppstrøms eller nedstrøms for den spesifikke posisjonen hvor det er ønsket at det regulerende segmentet skal bli innsatt. Selv om disse regionene er separert i konstruksjonen er de helst sammen-hengende i det endogene gen. Det kan være tilfeller når ikke-kontinuerlige deler av genomet blir benyttet som målsøkende segment, for eksempel hvis det er ønskelig å deletere en del av genomet, som et negativt regulerende element.

Mens to målsøkende regioner, A og B, er foretrukket for å øke de totale homologe regionene og således øke effektiviteten av rekombinasjonen, forstås også ved fremgangsmåten i oppfinnelsen anvendelsen av kun en målsøkende region. I denne enkleste formen (når kun det regulerende segmentet F og det valgfrie markørgenet C og promotoren C skal bli innsatt), blir en sirkulær del av DNA som inneholder disse elementene ved siden av det målsøkende DNA (se figur 4) benyttet. På denne måten hydrolyserer den homologe regionen (B) med sin genomiske motpart. Segmentene C, C og F blir innsatt innen posisjon B til det beslektede genet etter overkryssingen.

Når det er ønskelig at DNAets regulerende sekvens skal bli innsatt oppstrøms fra det aktuelle genet, som for eksempel når det er ønsket å aktivere og uttrykke et normalt transkripsjonelt taust gen, blir regionen med homologi helst homolog til en ikke-kodende del av genomet oppstrøms fra de kodende regionene til det aktuelle genet. Det er videre foretrukket at de homologe regionene blir valgt slik at den DNA-regulerende sekvensen vil bli innsatt nedstrøms fra den opprinnelige promotoren for det aktuelle genet, spesielt hvis den opprinnelige promotoren var en negativ promotor heller enn en avslått positiv promotor.

Størrelsen av de målsøkende regionene, det vil si homologe regioner, er ikke kritisk, selv om det ved kortere regioner er mindre sansynlig at de vil finne de riktige regionene med homologi og rekombinere på det ønskede sted. Således er kortere homologe regioner mindre effektive ved homolog rekombinasjon, det vil si gir mindre prosentdel av vellykket rekombinerte kloner. Det har blitt foreslått at minimumkravet for sekvenshomologi er 25 basepar (Ayares et al, PNAS, USA, 83:5199-5203, 1986). Hvis noen av de andre elementene i konstruksjonen også finnes i genomet til en vertcelle, er det dessuten en mulighet for rekombinasjon på feil sted. På grunn av den utmerkede positive og negative selektiviteten ifølge oppfinnelsen, kan den bli gjennomført vellykket selv når effektiviteten er lav. Optimum resultater ble nådd når den totale homologe regionen, omfattende begge målsøkende regionene, er stor, for eksempel 1 til 3 kg baser. Så lenge det regulerbare segmentet F kan være operativt bundet til genet er det ingen grense for størrelsen til den målsøkende regionen og spesielt en oppstrøms målsøkende region B.

Det kan enkelt bli empirisk bestemt om de målsøkende regionene er for store eller det regulerbare segmentet F har for stor avstand fra den kodende regionen av genet til hvilken den er operativt bundet. I så tilfelle kan regionene A og B bli gjort homologe til forskjellige seksjoner av det aktuelle genet og prosessen gjentatt inntil det regulerbare segmentet F riktig innsatt slik at det er operativt bundet til det aktuelle genet. For eksempel kan restriksjonssetet for kombinert region A-B til det endogene genet bli byttet og prosessen gjentatt. Straks konseptet ved oppfinnelsen er kjent, sammen med teknikkene beskrevet her, kan en med vanlige kunnskaper innen teknikken være i stand til å utføre og benytte oppfinnelsen på et hvilket som helst aktuelt gen i en hvilken som helst cellelinje eller mikroorganisme uten å gjøre unødvendige eksperimenter.

Region C er et positivt selekterbart markørgen som er i stand til å gjøre den transfekterte cellelinjen resistent til normalt toksisk miljø. Eksempler på slike gener er adenosin deaminase (ADA), aminoglycosid fosfotransfertase (neo), dihydrofolat reduktase (DHFR), hydromycin-B-fosfotransferase (HPH), thyimidin kinase (tk), xanthin-guanin fosforibosyl-transferase (gpt), multippel medikament resistansgen (MDR), ornithin dekarboksylase (ODC) og N-(fosfonacetyl)-L-aspertat resistans (CAD).

I tillegg til positive selekterbare markørgener, er et forsterkbart gen også eventuelt inkludert i konstruksjonen i region D. Forsterkende gener er gener som fører til økning i kopiantallet under selektivt press. Kopiantallet av et gen basert ved det forsterkende genet vil også øke. Forsterkbare gener som kan bli brukt omfatter DHFR, MDR, ODC, ADA og CAD. Medlemmene av den positive selekterbare markørgenegruppen og de av den forsterkbare genegruppen overlapper slik at en teoretisk i stedenfor å bruke to gener, et for positiv seleksjon og et for forsterkning, kan benytte ett gen for begge formål. Siden de fleste cellelinjer inneholder endogene kopier av disse forsterkende genene, vil cellene allerede bli noe resistente til seleksjonsbetingelsene og utskilling av cellene som har transfektert DNA fra de som ikke har mottatt transfektert DNA kan bli vanskelig. I tilfeller hvor et forsterkbart gen er foretrukket, bør derfor et positivt seleksjonsgen som er dominant, som HPH, gpt, neo og tk (i tk-celler) også være omfattet i konstruksjonen. For noen anvendelser er det mulig eller foretrukket å utelate den forsterkende markøren. For eksempel kan det aktuelle genet ikke behøve å bli forsterket som for eksempel når transkripsjonen aktivering ved heterolog DNA-regulerende sekvens er tilstrekkelig uten forsterkning. Dersom dessuten den homologe rekombinasjonseffektiviteten er meget lav, kan det være nødvendig å utelate forsterkende gener siden forholdet mellom ikke-homologt DNA til homologt DNA er direkte relatert til den homologe rekombinasjonseffektiviteten (Letsouu, Genetics, 177:759-770, 1987). Det er også mulig å eliminere det positive seleksjonsgenet og selektere celler kun ved å sortere etter produksjonen av det ønskede protein eller mRNA. Det er riktignok foretrukket i de fleste tilfeller å innbefatte i det minste det positive seleksjonsgenet.

Region E av konstruksjonen er et negativt selekterbart markørgen. Et slikt gen er ikke uttrykt i cellene hvor DNA-konstruksj onen er riktig innsatt ved homolog rekombinasjon, men blir uttrykt i celler hvor DNA-konstruksjonen blir innsatt uriktig, som ved tilfeldig integrasjon. Et slikt gen er Herpes Simplex Virus thymidin kinase gen (HSVtk). HSVtk har en lavere stringens for nukleotider og er i stand til å fosforylere nukleotidanaloger som normale mammalske celler ikke er i stand til å fosforylere. Dersom HSVtk er til stede i cellene, blir nukleotidanaloger som acyclovir og gancyclovir fosforylert og innsatt i DNA i vertcellen og dreper således cellen. Nærværet av den negative selekterbare markøren tillater at man benytter den positive-negative seleksjonen for homolog rekombinasjon som beskrevet av MAnsour et al (Nature, 336:348-352, 1988). Capecchi benytter en strategi som tar fordelen av de forskjellige metodene for integrasjon som opptrer når lineær vektor DNA blir innsatt via homolog rekombinasjon i forhold til når den blir innsatt ved tilfeldig integrasjon. Hvis vektor DNA blir innsatt tilfeldig, vil det meste av innskuddene bli innskutt via endene (Folger et al, Mol. Cell. Biol., 2:1372:1387, 1982; Roth et al, Mol. Cell. Biol., 5:2599-2607, 1985; og Thomas et al, Cell, 44:419-428, 1986). På den andre side, hvis vektoren er innsatt ved homolog rekombinasjon, vil den rekombinere i de homologe regionene hvilket forårsaker tap av sekvenser på utsiden av disse regionene.

Ved hjelp av konstruksjonen skissert i figur 1 som et eksempel, blir metoden for integrasjon av homologt rekombinant versus tilfeldig integrasjon illustrert i figurene 2A og 2B. Ved ikke-homolog rekombinasjon (figur 2A), blir vektorene innsatt via endene av konstruksjonen. Dette tillater et region E, i dette tilfellet HSVtk genet, blir innsatt i genomet. Dersom homolog rekombinasjon opptrer (figur 2B) blir derimot HSVtk genet tapt. Den første runden seleksjon benytter det passende medikamentet eller betingelser for positiv seleksjon som er til stede i konstruksjonen. Celler som har DNA integrert enten ved homolog rekombinasjon eller tilfeldig integrasjon vil overleve denne seleksjonsrunden. De overlevende cellene blir så eksponert fra et medikament som gansyklovir som vil drepe alle cellene som inneholder HSVtk-genet. I dette tilfellet vil de fleste av cellene i hvilke vektoren har blitt integrert via tilfeldig innsetting inneholde HSVtk-genet som blir drept av medikamentet mens de som er vektorintegrert ved homolog rekombinasjon har tapt HSVtk-genet og overlever. Dette tillater eliminering av de fleste cellene som inneholder tilfeldig integrert DNA, og etterlater det meste av de overlevende cellene inneholdende DNA som er integrert via en homolog rekombinasjon. Dette letter sterkt identifikasjonen av den korrekte rekombi-nas j onen .

Det negative seleksjonstrinnet kan også bli eliminert hvis nødvendig. Det vil kreve at roteringstrinnet blir mer arbeidsintensivt og omfatter behovet for teknikker som polymerase kjedereaksjon (PCR) eller immunologisk sortering.

Den sjette regionen (F) inneholder det DNA-regulerende segment som vil bli brukt for å gjøre genet transkripsjonelt aktivt. Det riktige DNA-regulerende segmentet er valgt avhengig av celletypen som skal anvendes. Det regulerende segmentet som er foretrukket brukt er et som er kjent for å fremme uttrykkingen av et gitt gen i en differensiert vertcellelinje. For eksempel hvis vertcellelinjen består av hypofyseceller som naturlig uttrykker proteiner som vekst-homon og prolactin, kan promotoren for et av disse genene bli brukt som DNA-regulerende element F. Når det er innsatt ifølge oppfinnelsen, vil det regulerende segmentet være operativt bundet til det normalt transkripsjonelt tause genet og vil stimulere transkripsjonen og/eller uttrykkingen av genet i vertscellelinjen. Forskjellige DNA-regulerende segmenter som fungerer på tvers av celletyper, som rous sacroma virus (RSV) promotoren er også anvendbare. Så lenge det regulerende segmentet stimulerer transkripsjonen og/eller uttrykkingen, eller kan bli indusert til å stimulere transkripsjonen og/eller uttrykkingen, av genet etter å ha blitt inskutt i vertscellelinjen slik at det er operativt bundet til det aktuelle genet ved hjelp av oppfinnelsen, kan det bli anvendt i oppfinnelsen. Det er viktig i sammenkobling av det regulerende segmentet F til det målsøkende segmentet A at det ikke ved en tilfeldighet blir innført et start kodon i sekvensen siden en slik tilstedeværelse ville forandre leserammen til genet som man ønsker å få uttrykt. Instruksjonen må naturligvis bli konstruert og innsatt slik at det regulerende segmentet F er operativt bundet til det aktuelle genet.

Det regulerende segmentet, region F, trenger ikke å være til stede i tilfeller hvor det er ønsket å øke eller forsterke transkripsjonen av et gen som allerede blir uttrykt i den aktuelle cellelinjen, enten fordi det er naturlig uttrykt i cellelinjen eller fordi cellelinjen tidligere har fått sitt DNA manipulert til å gi slik uttrykking. I slike tilfeller vil innsetting av et forsterkende gen, region D, fortrinnsvis med det positive selekterbare markørgenet, region C, og eventuelt med et negativt selekterbart markørgen, region E, være tilstrekkelig for å øke kopiantallet av det aktuelle genet og således øke totalmengden transkripsjon.

Alternativt kan et nytt regulerende segment, region F, som opprinnelig fremmer en øket (eller på annen måte modifisert) transkripsjonshastighet sammenlignet med eksisterende region for det aktuelle genet, bli inkludert for ytterligere å forsterke transkripsjonen av det eksisterende ekspresjons-genet. Slike nye regulerende segmenter kan omfatte promotorer eller forsterkere som øker transkripsjonseffektiviteten.

Regionene C, D' og E' er promotorregioner som blir brukt for å drive genene henholdsvis i regionene C, D og E. Disse promotorene er transkripsjonelt aktive i den valgte cellelinjen og kan være de samme eller forskjellige fra promotoren i region F som blir brukt for å drive det aktuelle endogene genet. Den spesifikke transkripsjonsretningen i figur 1 er ikke kritisk. De med vanlige kunnskaper innen teknikken kan avgjøre en hvilken som helst passende plassering av genene C, D og E og deres promotorer C, D' og E' slik at promotorene vil stimulere uttrykkingen av sine forbundne gener uten samtidig å ødelegge uttrykkingen av det aktuelle genet eller andre gener i konstruksjonen.

Oppfinnelsen kan bli illustrert med referanse til aktiveringen av rotte thyrotropin beta subenhet (TSH) i GH^ (ATCC CCL 82), GH3 (ATCC CCL 82.1) eller GH4C1 cellelinjer (GH). GH cellelinjer er avledet fra strålingsindusert hypofysetumor i rotter kalt MtT/W5 (Takemoto, Cancer Res., 22:917, 1962) og tilpasset til vekst i kultur av Tashjian et al, Endocrinology, 82:342-352, 1968. Disse cellelinjene kan være subklonet eller sortert for sin evne til å produsere vekst hormon og TSH. Slike sorteringer kan fortrinnsvis bli utført ved hjelp av Northern blot analyse for å avgjøre om mRNA for disse rotte veksthormongenene er til stede og bekrefte at det ikke blir produsert noe mRNA for TSHp genet. Cellelinjene kan også bli sortert ved Southern analyse for å avgjøre at det minst er en kopi av TSH<g->genet til stede i genomet. Kun GH cellelinjer som produserer veksthormon og ikke TSHp, men inneholder en kopi av TSH<p->genet, blir brukt.

Den spesifikke homologe rekombinasjonsvektoren for anvendelse i GH-celler kan utformes på den følgende måte (figur 3). Region A kan bestå av den 5' oppstrøms ikke-transferterte regionen av TSHp-genet definert av HindiII fragmentet som strekker seg fra -74 til -2785 og region B kan inneholde DNA-fragmentet som strekker seg fra -2785 Hindlll setet til Ncol setet ca 2,1 kb videre oppstrøms som beskrevet av Carr et al (J. Biol. Chem., 262:981-987, 1987) og Croyle et al (DNA, 5:299-304, 1986). Det selektive seleksjonsgenet (region C) kan være 1067 bp Bglll-Smal fragment avledet fra plasmidet pSV2neo (ATCC No. 37,149) (Southern et al, J. Mol. Appl. Gen., 1:327-341, 1982). neo-genet kan bli drevet av Rous Sacroma Virus (RSV) promotor (region C) som er avledet fra Ndel-Hindlll fragmentet fra plasmidet pRSVcat (ATCC No. 37,152) (Gorman et al, PNAS, 79:6777-6781, 1982). I dette eksempelet er det ikke nødvendig å bruke forsterkende markør og det er således ikke nødvendig med noen region D for å optimalisere effektiviteten av den homologe rekombinasjon. Effektiviteten er invers med forholdet av ikke-homologe til homologe sekvenser som er til stede i konstruksjonen (Letsou et al, Genetics, 117:759-770, 1987). Region E, eller det negative seleksjonsgenet, kan bestå av HSVtk-genet som er et 2 kb Xho fragment oppnådd fra plasmidet pMCITK. HSVtk-genet i denne konstruksjonen kan bli drevet av polyoma virus promotoren og forsterker (region E') som konstruert av Thomas et al (Cell, 51:503-512, 1987). I en annen DNA-konstruksjon kan polyoma promotoren være byttet med RSV-promotoren beskrevet over. Den DNA-regulerende sekvensen som blir benyttet for å aktivere TSHP-genet kan enten være RSV-promotoren eller rotte veksthormon promotoren. Rotte veksthormon promotoren består av CacI-EcoRI fragmentet oppnådd fra plasmidet pRGH237CAT (Larson et al, PNAS, 83:8283-8287, 1986). RSV-promotoren har fordelen av å være ustabil i andre cellelinjer enn GH celler, mens GH promotoren er kjent å være aktiv i GH celler og kan bli spesifikt indusert (Brent et al, J. Biol Chem., 264:178-182, 1989). Rotte veksthormon promotoren og RSV-promotoren kan bli innsatt ved lokasjon F i separate konstruksjoner.

Etter transfeksjonen av den ovenfornevnte konstruksjonen i en GH cellelinje, kan cellene bli dyrket i media som inneholder G418. Dette vil tillate kun de cellene som har integrert plasmid DNA i genomet enten ved homolog rekombinasjon eller tilfeldig rekombinasjon og vokse. De overlevende cellene kan bli dyrket i et medium som inneholder gancyclovir. Majori-teten av de cellene som overlever denne seleksjonsrunden vil være de hvor vektor plasmidet DNAet er integrert via homolog rekombinasjon. Disse cellene kan bli sortert for å vise at de produserer mRNA som korresponderer tiol TSH genet og at de produserer TSH<p->protein. Det genomiske DNA kan også bli sekvensert rundt innsettingsområdet for den heterologe promotoren for å sikre at den riktige rekombinasjonen har skj edd.

Eksempel - Aktivering av TSHp-gen i rottehypofyse celler.

Ved hjelp av den følgende protokoll, ble thyrotropin beta subenheter (TSH) gen transkripsjon, som vanligvis ikke skjer i rotte GH3 hypofysecellelinje, aktivert i de cellene ved hjelp av fremgangsmåten ved homolog rekombinasjon for å sette inn et aktiverende element oppstrøms fra den TSHP-kodende regionen. Rous Sacroma Virus (RSV) promotor er kjent for å virke effektivt i GH3-celler (Christian Nelson et al, nature, 322:557-562 (1986); Zheng-Sheng Ye et al, The Journal of Biological Chemistry, 263:7821-7829 (1988)) og blir derfor valgt som det aktiverende element. En plasmidvektor som inneholdt det RSV-aktiverende element, deler av 5'regionen av TSHe-gen locus ble konstruert og en selekterbar fargemarkør, aminoglycosid fosfotransferasegen (NEO), for isolering av transfekterte cellepopulasjoner. Ribonukleinsyre (RNA) ble ekstrahert fra oppsamlede medikamentresistente GH3~celle populasjoner og omdannet til komplementære deoxyribonuklein-syre (cDNA). cDNA ble så sortert ved teknikken med polymerase kjedereaksjon (PCR) for nærværet av TSH cDNA. Konstruksjonen av de homologe rekombinasjonsvektorene og kontrollvektorene er skissert under sammen med de eksperimentelle prosedyrene og resultatene.

Plasmidkonstruksjon

Homolog rekombinasjon (HR) ryggrad vektor (pRSVCATNEO).

Rous Sacroma Virus (RSV) promotor ble avledet fra plasmidet pRSVCAT (Cornelia M. Gorman et al., Proceedings of the National Academy of Science, 79:677-6781 (1982)) (figur 5) ved isolering av 580 basepar (bp) Ndel - Hindlll fragmentet inneholdende den funksjonelle promotorenheten. Endene til dette fragmentet ble avstumpet ved hjelp av DNA-polymerase I Klenow fragment og Xbal linkere ligert til de avstumpede endene. Etter fordøyning med Xbal restriksjonsendonuklease og gelrensing, ble de resulterende fragmentene ligert inn i Xbal sete ril pUC18. En bakteriell koloni inneholdende et plasmid med RSV innskuddet i orienteringen som vist i figur 6 ble kalt pRSV. Aminoglycosid fosfortransferasegenet (NEO) ble klonet fra pSV2NE0 (P. J. Southern et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 1:327-341 (1982)) ved isolering av Bglll og BamHI fragmentet (figur 7) og ligering av dette fragmentet i BamHI setet av pRSV (figur 6). Et plasmid inneholdende NEO-genet i orienteringen vist i figur 8 hie valgt og kalt pRSVNEOBAM. pRSVNEOBAM ble fordøyet med Smal og ved 4328 bp fragmentet inneholdende RSV-promotor regionen, det meste av NEO-genet og pUC18 ble isolert ved gel elektroforese. Smal endene av dette fragmentet ble Xhol linket, kløvet med Xhol restriksjonsenzym og plasmidet gjort sirkulært ved ligasjon. Det resulterende plasmidet er vist i figur 9 og er kalt pRSVNEO. Dette siste klonetrinnet resulterte i delesjon av et 786 bp fragment fra 3' enden av NEO fragmentet som ikke er nødvendig for dets funksjonelle uttrykk. Denne konstruksjonen ga et plasmid hvor NEO genet er transkripsjonelt drevet av RSV-promotoren.

Deretter ble Ndel setet lokalisert 5' i forhold til RSV-promotoren i pRSVCAT (figur 5) omdannet til et Sali sete. Dette ble oppnådd ved fordøying av pRSVCAT med Ndel, fylle i endende ved hjelp av DNA-polymerase I Klenow fragmenter og ligere Sali linkere til resulterende avstumpede ender. Linkerne ble fordøyd til fullføring med Sali og plasmidet igjen gjort sirkulært ved ligasjon. Inn i det nylig konstru-erte Sali setet ble det klonet Sali - Xhol fragmentet fra pRSVNEO (figur 9) inneholdende RSV-promotoren og NEO genet. Et plasmid med RSV-promotoren og NEO fragmentet orientert som vist i figur 10 ble isolert og kalt pRSVCATNEO. Dette plasmidet var når det var transfektert inn i GH3 celler, i stand til å gi G418 resistans til disse cellene, og viste evnen til RSV-promotoren til å drive transkripsjonen av NEO genet og evnen til at dette RNA blir translatert til et funksjonelt protein (data ikke vist). Totalt RNA fra de stabile transfektantene over ble analysert ved polymerase kjedereaksjon (PCR) for å avgjøre om CAT genet ble transkribert. PCR resultater viste at CAT genet virkelig ble transkribert i alle G418 resistante koloniene som ble testet

(data ikke vist), noe som indikerte at RSV-promotoren 5' for CAT genet var i stand til å drive transkripsjonen til et gen lokalisert 3' i forhold til dette. Dette er viktig fordi RSV-promotoren vil være ansvarlig for å drive transkripsjonen til TSHp genet når TSHp HR vektoren beskrevet under blir integrert via homolog rekombinasjon i GH3 genomet.

TSHp HR vektor

En vektor som var i stand til å bli integrert i GH3 genomet ved homolog rekombinasjon, ble fremstilt ved innsetting av to stykker av 5' enderegioner fra thyrotropin beta subenhet (TSHp) gen inn i de unike Sali og Hindlll setene inneholdt i pRSVCATNEO (figur 10). Et rottemilt genomisk bibliotek inneholdende innsettingsstykker på 15 kilobaser (kb) eller større som var klonet inn i lambda DASH ble oppnådd fra Stratagen, San Diego, CA. Ved hjelp av standard protokoller (Current Protocols in Molekular Biology, pp. 1,9,1 - 1,13,6, 6,1,1 - 6,4,10) ble et 15,3 kb klon av det rotte genomiske TSHp genet omfattende 9kb sekvenser av 5' fra det første exon isolert. 15,3 kb fragmentet bestående av to Xbal fragmenter, et 10,6 kb fragment tilsvarende til 5' enden av 15,3 kb fragmentet og en 4,7 kb del tilsvarende 3' regionen av 15,3 kb fragment (figur 11). Begge disse Xbal fragmentene ble subklonet inn i pUC18 og plasmidene inneholdende innskuddene i begge orienteringer ble isolert. 2,3 kb Xbal - Hindlll fragmentet inneholdende 4,7 kb Xbal fragmenter (figur 11) ble renset og Xbal setet av dette fragmentet ble omdannet til et Hindlll sete ved å fylle opp endene med Klenow fragmenter og ligere på Hindlll linkerne. Dette fragmentet ble ligert inn i det unike Hindlll sete inneholdende pRSVCATNEO (figur 10). Et isolat tilsvarende et plasmid med 2,3 kb innsettingsstykkene i korrekt orientering som vist i figur 12 ble gitt navnet pRSVCATNE0TSHB3.

Det subklonede 10,6 kb Xbal fragmentet fra rotte TSHp klonet (figur 11) ble isolert og Xbal enden omdannet til Sali seter ved avstumping av endene av fragmentet med DNA-polymerase I Klenow fragment og testing av Sali linkere. Dette 10,6 kb Sali fragmentet ble så klonet i Sali setet av pRSVCAT-NE0TSHB3-5XbaI (figur 12). Et plasmid inneholdende innskuddet i den korrekte orienteringen ble identifisert og gitt navnet pRSVCATNE0TSHB3 (figur 13). Det siste plasmidet har blitt deponert i American Type Culture Collection, Rockville, MD, og ble gitt deponeringsnummer ATCC 40933. For bruk av dette deponiet ble plasmidet omdøpt til pHRTSH. Dette deponiet ble gjort ifølge alle kravene i Budapest traktaten.

Celle linje

CH3 cellene er en subklonet populasjon av mtT/V/5 som ble avledet av strålingsindusert hypofysetumor hos rotter (B. K. Takemoto, Cancer Research, 22:917 (1962)) og tilpasset vekst i kultur av Tashjian et al., Endocrinology, 82:342-352

(1968). GH3 cellene ble anskaffet fra American Type Culture Collections cellebank og ble holdt i kultur med vekst i Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) + 15% hesteserum (HS) og 2,5% fetalt bovin serum (FBS) + li L-glutamin (GH3 medium) ved 37 °C i 5% C02.

DNA TILBEREDELSE

Stor-skala tilberedelse av plasmid DNA

Alle plasmider anvendt for stabile transfeksjoner ble renset ved hjelp av alkalisk lysis metoden for stor-skala plasmid DNA isolert ved alkalisk lysis metoden ble videre renset ved dobbeltbinding i cesiumkloridgradient som også beskrevet i Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, pp. 1,7,1-1,7,2.

Før transfeksjonen ble HR-vektorene fordøyet med enten Aatll eller Apal. Apal ble anvendt for å gjøre kontrollplasmidet pRSVCATNEO lineært og Aatll for å gjøre HR plasmid pRSVCATNE0TSHB3-5XbaI lineært. Lokaliseringen av spaltnings-setene til Apal og Aatll kan ses i henholdsvis figur 10 og 13. Etter fordøying med det passende restriksjonsenzymet, ble reaksjonen ekstrahert med fenol/kloroform, ekstrahert med kloroform, utfelt med etanol og vasket en gang med 70% etanol. Plasmidet ble så resuspendert i sterilt deionisert vann (dHgO) til en konsentrasjon på 1 mikrogram/mikroliter (jjg/pl) etter bestemmelse ved absorbans ved 0D26Q' * et forsøk på å øke transfeksjonseffektiviteten og/eller andelen av homolog rekombinasjon positive til det som skyldtes tilfeldig integrasjon, ble pRSVCATNE0TSHB3-5XbaI fordøyd med Apal. Fordøyelsen med Apal kutter ved tre adskilte seter i pRSVCATNE0TSHB3-5XbaI og fjerner alle regionene av vektoren bortsett fra de som er nødvendige for homolog rekombinasjon (figur 13). Etter fordøyelse med Apal, ble reaksjonsblandingen elektroforert på en 0,8% agarosegel og topp båndet tilsvarende 10,992 bp fragmentet inneholdende de to 5' enderegionene av TSH genet, RSV promotoren - NEO regionen og TSH genaktiverende RSV promotor ble isolert fra gelen ved elektroeluering inn i dialyserør. Det elektroeluerte DNA ble videre renset ved hjelp av en elutip minikolonne (Schleicher og Schuell) med fabrikantens anbefalte standard protokoll. DNA ble eluert fra kolonnen, felt med etanol, vasket med 70% etanol og resuspendert til en konsentrasjon på ljjg/pl.

STABILE TRANSFEKSJONER

Kalsiumfosfat transfeksjon

48 timer før transfeksjon ble 3 x IO<6> GH3 celler utsatt på 10 centimeter (cm) skåler. I hver skål ble lOpg vektor DNA sammen med 30 jig sonikert laksesperma DNA tilsatt til 0,5 milliliter (ml) transf eks jonsbuf f er . Transf eks jonsbuf feren ble fremstilt ved blanding av 4 gram NaCl, 0,185 g KC1 , 0,05g Na2HP04, 0,5g dextrose, 2,5g HEPES og dH20 til et endelig volum på 500 ml og en pH på 7,5. 31 jjI av 2 molar (M) CaClg ble tilsatt i 0,5 ml av DNA + transf eks jonsbuf f er og blandet. Den oppløsningen ble tillatt å stå ved romtemperatur i 45 minutter. Når DNA - CaCl2 - transfeksjonsbufferen var ferdig, ble GH3 mediet fjernet fra GH3 cellene og DNA - CaClg-transfeksjonsbufferen ble lagt over cellene. Cellene ble tillatt å stå ved romtemperatur i 20 minutter. Etter 20 minutter, ble 5 ml GH3 medium tilsatt og platene ble inkubert ved 37°C i 6 timer. Cellene ble så gitt et sjokk ved å suge av mediet og tilsette 5 ml ny transfusjonsbuffer inneholdende 15% glycerol i 3,5 minutter. Cellene ble renset 2 ganger med PBS og foret med 10 ml GH3 medium. 48 timer etter transfeksjonen, ble mediet fjernet og 10 ml GH3 medium inneholdende 400 ug/ml G418 ble tilsatt.

Elektroporasjon

Elektroporas j on ble utført ved hjelp av en gen BTX 300 transfektor med 3,5 millimeter (mm) mellomrom mellom elektrodene. 1 x IO<7> GH3 celler som vokser i logaritmisk fase, ble fjernet fra sine plater ved trypsinering, bunnfelt ved sentr i fuger ing og vasket en gang med PBS. Cellene ble resuspendert i 1,0 ml PBS og overført i 2,9 ml ultra-UV engangs kuvetter (American Scientific Products) på is. lOjjg av DNA ble tilsatt cellene, blandet og igjen plassert på is i 5 minutter. Etter 5 minutter ble elektrodene plassert i kammeret og cellene ble elektroforert ved en innstilling på 750 mikrofarad med en 200 volt puls. Kuvettene ble så satt tilbake i is i 10 minutter. Cellene ble overført fra kuvetten til 9 mm GH3 medium inneholdende 1% penicillin og 1% streptomycin ved romtemperatur i et 15 ml konisk rør og tillatt å stå i 10 minutter. Den totale elektroporasjonen av 1 x IO<7> celler ble overført til 3 10 cm plater, noe som ga omtrent 3 x IO<6> celler pr. plate. Etter 48 timer, ble GH3 medium inneholdende 400 pg/ml G418 tilsatt,

Transfeksjon av GH3 celler med pRSVCATNE0TSHB3-5Xbal (Aatll kuttet), pRSVCATNE0TSHB3-5XbaI (Apal kuttet) og pRSVCATNEO

(Apal kuttet)

pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (Aatll kuttet),

pRSVCATNE0TSHB3-5XbaI (Apal kuttet) og pRSVCATNEO (Apal kuttet) plasmider ble transfektert inn i GH3 celler sammen med en ikke-DNA kontroll ved hjelp av kalsiumfosfat protokollen og elektroporasjons protokollen. 48 timer etter transfeksjonen ble cellene utsatt for G418 seleksjon. Omtrent 14 til 21 dager senere ble koloniene synlige for øyet på 10 cm skålene og ble talt. For alle ikke-DNA kontrollene var det ingen synlige kolonier, noe som viser at G418 seleksjonen virket og at nærværet av et plasmid inneholdende RSV- NEO regionen var nødvendig for å gi G418 resistans. På dette tidspunkt ble koloniene utvalgt og oppsamlet ved isolering av regioner på 10 cm skålen med 17 ml kloningsringer. Disse store kloningsringene inneholdt mellom 10 og 70 kolonier avhengig av tettheten av kolonier pr. plate og tillot at GH3 cellene i den isolerte regionen ble fjernet og oppsamlet samtidig med trypsinering. De trypsinerte koloniene i hver ring ble overført til plater med 6 brønner og tillatt å vokse i GH3 medium inneholdende G418. Etter oppnåelse av 70 til 80% sammenstrømning ble 80000 celler overført til en plate med 24 brønner og de gjenværende cellene tatt vare på ved frysing for videre testing senere. Cellene i platene med 24 brønner ble dyrket inntil de nådde 50% til 80% sammenflyting. Totalt RNA ble så høstet fra GH3 cellene ved hjelp av den følgende fremgangsmåten.

RNA ISOLERING FRA TRANSFEKTERTE GH3 CELLER DYRKET I PLATER

MED 24 BRØNNER

Det følgende er en modifikasjon av protokollen beskrevet av Chomczynski og Sacchi, Anal. Biochem., 162:156-159 (1987). Mediet som dekket GH3 cellene i 24 brønns platene ble fjernet og cellene ble vasket med 1 ml PBS. 1 ml GTC oppløsning ble tilsatt og cellene ble inkubert ved romtemperatur i 5 minutter. GTC oppløsningen ble fremstilt ved oppløsning ved 250 g guanidium thiocyanat (Fluka) i 293 ml dHgO, og så å tilsette 17,6 ml 0,75 M natriumsitrat pH 7,0 og 26,4 ml 10% sarcosyl (L-Lauryl sacrosin). Rett før bruken ble 360 jjI p-mercaptoetanol pr. 50 ml GTC oppløsning tilsatt. Etter 5 minutter ved romtemperatur ble 1 ml av GTC cellelysatet overført til et Sarstedt 55.518 trykk-propprør inneholdende 2 ml GTC oppløsning. Til hvert rør ble det tilsatt 300 pl 2 M natriumacetat pH 4,0 og røret ble virvlet. Deretter ble 3 ml dH20 mettet fenol tilsatt og rørene ble virvlet igjen. Til hvert rør ble det tilsatt 600 pl kloroform: isoamylalkohol (49:1) og rørene ble ristet for hånd i 10 sekunder og plassert på is i 15 minutter. Rørene ble så sentrifugert i en Sorval RC-5B ved en SM24 rotor ved 8000 omdreininger pr. minutt (RPM) i 20 minutter ved 4°C. Den vandige fasen ble overført til et nytt Sarstedt rør inneholdende 3 ml isopropanol og plassert ved -20°C i 1 time. Etter 1 time ble rørene sentrifugert i en Sorval RC-5B med en SM24 rotor ved 8000 rpm i 20 minutter ved 4"C. Supernatantene ble fjernet og pelletene resuspendert i 500pl GTC oppløsning. Det resuspenderte RNA ble overført i et 1,5 ml eppendorf rør og tilsatt 500 pl isopropanol. Rørene ble igjen plassert ved-20°C i 1 time. Eppendorf rørene ble sentrifugert i 5 minutter i en mikrosentrifuge og supernatanten kastet. Pelleten ble vasket med 70% etanol 2 ganger og tillatt og tørke inntil etanolen var fullstendig fordampet. Pelleten ble resuspendert i 20 pl dietylpyrokarbonat (depc) behandlet med vann og oppvarmet til 65° C i 5 minutter. Dette RNA ble så benyttet for å fremstille cDNA ved en av fremgangsmåtene beskrevet under.

cDNA REAKSJONER

Fremgangsmåte 1

Første cDNA tråd ble syntetisert fra 2,5 til 6,0 pl av total RNA (ca 0,5 til 6 pg) i et reaksjonsvolum på 10-20 pl. Det totale RNA ble oppnådd ved ekstraksjonsmetoden beskrevet over og ble denaturert i 5 til 10 minutter ved 70° C og hurtig avkjølt på is før tilsetting av reaksjonskomponentene. Reaksjonsbetingelsene var 50 millimolar (mM) Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM av henholdsvis dCTP, dATP, dGTP, og dTTP (Pharmacia), 40 mM KC1, 500 enheter/ml RNasin (Promega Biotin), 85 pg/ml oligo (dT)^2-18 (Colla-horative Research, Inc.). og 15000 til 20000 enheter/ml Moloney urin leukemi virus revers transkriptase (Bethesda Research laboratorles) inkubert ved 37° C i 60 minutter. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetting av EDTA til 40 mM og nukelinsyrene ble utfelt ved tilsetting av natriumacetat til en konsentrasjon på 0,3 M og to volumer etanol. Presipitåtet ble tillatt og dannes ved 0°C i 30 minutter og ble pelletert ved sentr i fuger ing i en mikrosentrifuge ved 14000 rpm i 30 minutter. Pelleten ble vasket med 70% etanol, tørket og resuspendert i depc behandlet med vann til et volum på 15 til 25 mikroliter.

Fremgangsmåte 2

Betingelsene for syntesen av den første tråden cDNA fra RNA ble tilpasset fra Carol A. Brenner et al, BioTechniques, Vol. 7, No. 10, pp. 1096-1103 (1989). 1 pl av totalt RNA fra RNA tilberedningsprosedyren beskrevet over ble tilsatt 9 pl reaksjonsbuffer i 0,5 ml eppendorf rør. Reaksjonsbufferen besto av 200 enheter Moloney murine leukemia virus revers transkriptase (MMLVRT Bethesda Research Labs), og en endelig konsentrasjon av de følgende stoffene: 70 mM tris.HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton X-100, 1 mM av hver dnTP, 4 mM MgCl2 og 0,45 OD260 enheter av tilfeldige heksamerer (Pharmacia). Etter blanding ble rørene inkubert ved romtemperatur i 10 minutter og plassert ved 42°C i 1 time. Etter 1 time ble rørene oppvarmet til 90°C i 1 minutt for deaktivere MMLVRT og avkjølt til romtemperatur.

POLYMERASE KJEDEREAKSJON (PCR) FORSTERKING AV RNA FRA GH3 CELLER

De følgende primere ble brukt for å forsterke, ved PCR, TSHø cDNA syntetisert fra RNA transkripter fremstilt ved GH3 celler som et resultat av HR plasmidene som aktiverer det endogene TSHp gen ved homolog rekombinasjon.

Figur 14 viser regionene til TSHp genet som tilsvarer hver primer.

PCR REAKSJONSBETINGELSER

Alle PCR-reaksjonene ble utført i Ericomp Twinblock thermo-cycler. Dersom PCR forsterkingen kunne bli kjørt på cDNA fremstilt med fremgangsmåte 2, ble 40pl av den ytterligere reaksjonsblandingen direkte tilsatt i 10 ul av cDNA reaksjonsblanding for å bringe det total volum opptil 50 ul. Den endelige konsentrasjonen av reagenser i 50 pl var 40 mM Tris.HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton X-100, 2,25 enheter Taq polymerase (Pharmacia), 0,2 mikromolar (pM) av hver primer, 200pM av hver dNTP, og 0,8 mM MgClg.

Dersom PCR skulle bli utført på cDNA fremstilt ved fremgangsmåte 1 over, ble 5 til 10 pl av det resuspenderte cDNA tilsatt 40 til 45pl inneholdende endelig konsentrasjoner av de følgende: 70 mM Tris.HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton X-100, 2,25 enheter Taq polymerase, 0,2 pM av hver primer, 200 pM av hver dNTP og 0,8 mM MgCl2-

Reaksjonene ble så utsatt for de følgende PCR sykluser.

1 minutt ved 940C

30 sekunder ved 55°C.

2 minutter ved 72°C.

Syklusen over ble repetert 30 til 40 ganger. 10 pl av hver reaksjonsblanding ble kjørt på en 6% polyakrylamidgel og undersøkt for nærværet av et 247 bp PCR fragment som kunne indikere nærværet av det riktige spleise mRNA for TSH.

PCR RESULTATER FOR FORSTERKING AV TSHP RNA FRA GH3 CELLER OG ROTTEHYPOFYSE TOTAL RNA

For å fastslå om GH3 celler normalt syntetiserer TSHp RNA, ble cDNA fra ikke-transfekterte GH3 celler så vel som cDNA fra rottehypofyse utsatt for PCR-betingelsene over. Det korrekte 247 bp båndet som indikerte nærværet av PSHp mRNA var synlig i den positive kontrollen av rottehypofyseprøve, men intet bånd var synlig fra GH3 celle total RNA prøven selv etter 60 sykluser (data ikke vist).

TRANSFEKSJONSRESULTATER

Antallet G418 resistente kolonier tilstede på 10 cm skålene ble satt i tabell mellom 14 og 21 dager etter tilsetting av G418 til mediet.

Totalt RNA ble høstet fra kolonioppsaml ingene som var inneholdt i plater med 24 brønner som beskrevet over. cDNA ble fremstilt fra disse RNA preparatene og utsatt for PCR forsterkning. Antallet positive kolonier som fremstiller TSHP mRNA ble bestemt ved nærværet av et 247 bp fragment vist på en polyaktrylamidgel. Det er i de undersøkte forekomstene inneholdt mellom 10 og 70 kolonier. Det anslåtte antallet kolonier pr. oppsamling pr. transfeksjon ble anvendt for å anslå antallet G418 resistente GH3 cellekloner hvor TSHP gen trasnskripsjonen var aktivert. Hvis en oppsamling var positiv i testen, ble det antatt at enden representerte en positiv koloni til stede i den bestemte forekomsten.

Disse resultatene viser den vellykkede aktiveringen av det normalt transkripsjonene tause TSH<g> genet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Mens antallet kolonier som er positive for TSH transkripsjon er lite sammenlignet med antallet kolonier som er G418 resistente (omtrent en av hver IO<3> G418 resistente kolonier), er dette resultatet hoved-sakelig konsistent med forholdene rapportert for andre homologe rekombinasjonseksperimenter (Michael Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY (1990), pp. 56 - 60). Det er vanligvis observert at den homologe rekombinasjonsandelen synes å være propor-sjonal med transkripsjonsraten til det målsøkende gen (M. Frohman og G. Martin, Cell, 56:145 (1989); S. L. Mansour et al, Nature, 336:348 (1988)). Det må noteres at rottene som har blitt vist er 3 størrelsesordener større enn hva som ville være ventet for tilfeldig mutasjon for å slå på TSHgenet.

For å sikre at resultatene for hver kolonif orekomst var reproduserbare og at aktiveringen av mRNA transkripsjon var stabil, ble koloniforekomstene som tidligere var frosne tilsvarende forekomstene som var blitt testet positive i den første analysen tint og dyrket i kultur. De nylig tinte GH3 positive forekomstene ble satt ut i T25 vevskulturflasker og dyrket inntil cellene nådde 70% til 80% sammenflytning. 80000 celler på hver flaske ble så tatt ut på plater med 24 brønner og dyrket inntil de var 50% til 70% sammenf lytende. RNA ble ekstrahert fra cellene, omdannet til cDNA og igjen testet for nærværet av TSHP RNA ved å kjøre IOjjI av hver PCR reaksjon på en b% polyakrylamidgel. Figur 15 viser resultatene fra representative PCR reaksjoner fra den andre analysen vist på en polyakrylamidgel ved ethidiumbromid farging og fluori-sering. Sporene 1, 2 og 3 inneholdt PCR-reaksjonene kjørt på en cDNA fra GH3 celler som hadde blitt transfektert med pRSVCATNEO. pRSVCATNEO inneholdt ingen homologe regioner med THS og er således ikke i stand til å aktivere TSHP genet ved homolog rekombinasjon. Som det kan sees fra gelen i figur 15 er det ingen bånd tilsvarende 247 bp i disse sporene, noe som viser at THSp genet ikke er aktivert. Spor 6 inneholder også en negativ kontroll. I sporet hvor 3 forekomster ble satt sammen fra prøver av GH3 celler som hadde blitt transfektert med pRSVCATNE0TSHB3-5XbaI (Apal kuttet), men som var negative for transkripsjon av TSHP genet i den første analysen. Fraværet av 247 bp fragmentet i spor 6 demonstrerer at nærværet av transfektert pRSVCATNE0TSHB3-5XbaI (Apal kuttet) plasmid integrert tilfeldig i genomet ikke er i stand til å fremstille 247 bp TSHP PCR fragmentet. Sporene 7,8, 9 og 10 omfatter PCR reaksjoner kjørt på en cDNA fremstilt fra totalt RNA høstet fra rottehypofyse i mengder per reaksjon på 25 nanogram, 100 nanogram, 200 nanogram og 400 nanogram. Nærværet i disse sporene av det forventede 247 bp båndet, fremstilt fra cDNA fremstilt fra rottevev som normalt uttrykker TSHP, viste at PCR-reaksjonsbetingelsene var korrekt optimalisert og at PCR-båndet oppnådd i sporene 4 og 5 inneholdende de homologe rekombinasjons TSHp positive er av korrekt størrelse. To forekomster transfektert med pRSVCAT-NE0TSHB3-5XbaI (Apal kuttet) som var positive i den første testen, ApaI-107 i spor 4 og ApaI-136 i spor 5, ble igjen testet positive for TSHP genaktivering som vist i nærværet av det korrekte TSHp PCR bånd forsterket fra cDNA fremstilt fra total RNA ekstrakter fra disse forekomstene beviste at transkripsjon av TSHP genet hadde blitt stabilt aktivert. Nærværet av båndene ved 247 bp i spor 4 og 5 inneholdt RNA fra tidligere positive ApaI-107 og ApaI-136 og fraværet av bånd i de negative kontrollene pRSVCATNEO transfektert GH3 celler i sporene 1 til 3 og det pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (Apal kuttet) negative i spor 6 viste at produksjonen av TSH RNA i en cellelinje som vanligvis ikke fremstiller dette RNA hadde blitt slått på stabilt ved homolog rekombinasjon.

Oppfinnelsen er ikke begrenset til cellelinjen beskrevet her. Alle cellelinjer har genetisk informasjon som normalt er taus eller inert. De fleste er kun i stand til å uttrykke bestemte gener. Dessuten kan et normalt transkripsjonelt taust eller inert gen fra en slik cellelinje bli aktivert for å uttrykke genproduktet ifølge oppfinnelsen og et hvilket som helst gen fra genomet kan få sine ekspresjons-karakteristikker endret ifølge oppfinnelsen. Til og med tidligere transformerte cellelinjer kan bli anvendt så lenge den tidligere transformasjonen ikke ødelegger det aktuelle genet. Kilden for cellelinjen er ikke viktig. Cellelinjen kan være dyr eller plante, primær, kontinuerlig eller udødelig. Det er naturligvis ønskelig at en slik cellelinje er stabil og udødelig slik at den etter behandlingen med teknikken ifølge oppfinnelsen kan få ekspresjonen kommersialisert. Klonede mikroorganismer, enten prokaryote eller eukaryote, kan også bli behandlet med teknikken ifølge oppfinnelsen.

Mens oppfinnelsen fortrinnsvis er beskrevet med henvisning til uttrykkingen av et normalt transkripsjonelt taust eller inert gen, kan teknikken ifølge oppfinnelsen også benyttes til modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et gen som naturlig blir uttrykket i vertscellelinjen. For eksempel hvis det er ønskelig å gjøre ekspresjonen av et gen avhengig av kulturbetingelser eller lignende slik at uttrykkingen kan bli slått av og på etter ønske, kan et passende DNA-regulerende segment, som forårsaker slike karakteristikker som repressbarhet eller induserbarhet, bli innsatt. For eksempel hvis det er kjent at celledybden inneholder den nukleære stereoidreseptor, som estrogen, testosteron eller gluco-corticoid eller thyroxin reseptorer, kan man benytte steroid eller thyroxin responselementene som region F. Et slikt responselement er et hvilket som helst DNA som hinder slike reseptorer for å gi en positiv respons i forhold til transkripsjonen. Selv hvis en celle ikke naturlig gir respons på glucocortocoider, kan for eksempel en del av DNA som koder for glucocortocoid reseptoren bli tilsatt konstruksjonen, for å sørge for at cellen reagerer på glucocortocoider. Anvendelsen av en regulerbar promotor kan være ønskelig om det aktuelle genet er normalt transkripsjonelt taust eller ikke. Andre typer regulering kan også bli oppnådd ved tilpasning av det passende DNA regulerende segmet til den eksakte aktuelle posisjon ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Selv om stimulering av uttrykkingen av normalt transkripsjonelt tause gener er den foretrukne anvendelsen for oppfinnelsen, er dets videste betydning dets anvendelse for modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et hvilket som helst endogent gen i vertscellelinjen.

Den spesifikke teknikken med homolog rekombinasjon er ikke, per se, en ny del av oppfinnelsen. Slike teknikker er kjent og de som har normale kunnskaper innen teknikken vil forstå at slike teknikker kan anvendes i oppfinnelsen så lenge det tillater målsøking av DNA-regulerende sekvenser til de ønskede lokaliseringene i forhold til det aktuelle genet. Selv om en foretrukket teknikk er beskrevet, anvendelsen av en linearisert konstruksjon med to homologe regioner på hver ende av sekvensene som skal bli innsatt, blir en hvilken som helst annen teknikk som videre oppnår denne funksjonen som for eksempel anvendelsen av sirkulære konstruksjoner, også ansett å være omfattet av oppfinnelsen. Den kritiske egenskap ved oppfinnelsen er anvendelsen av homologe rekombinasjons-teknikker for innsetting av en DNA regulerende sekvens som forårsaker modifisering av ekspresjonskarakteristikkene i den anvendte cellelinjen eller mikroorganismen, som er operativt bundet til et gen i genomet til cellelinjen, helst et som er normalt transkripsjonelt taust eller å innsette forsterkbar sekvens, uten en regulerende sekvens, tilstrekkelig nær et gen i genomet i cellelinjen som allerede blir transkribert for å forårsake forsterking av slike gener ved forsterking av den forsterkbare sekvensen. Det er ikke absolutt nødvendig at en valgbar markør også er omfattet. Seleksjon kan være basert kun på deteksjonen av det aktuelle genproduktet eller mRNA i mediet eller celler etter innsettingen av DNA-konstruksjonen. Dessuten, i utførelsen hvor en regulerende sekvens blir innsatt, er forsterking ønskelig, men ikke kritisk for funksjonen. Det samme gjelder også negativ seleksjonsgenet som gjør roteringsprosessen enklere, men er ikke kritisk for oppfinnelsens suksess. Den grunnleggende utførelsen krever således kun innsetting av det DNA-regulerende segment eller forsterkbare segment i den ønskede spesifikke posisjonen. Tilsettingen av positive og/eller negative selekterbare markørgener for anvendelsen ved seleksjonsteknikkene er imidlertid foretrukket, noe som også gjelder tilsettingen av et forsterkbart gen i utførelsen hvor et regulerbart segment blir tilsatt.

Uttrykket "modifikasjon av uttrykkingen" som brukt gjennom beskrivelsen og kravene, defineres her for å ekskludere terminering av uttrykkingen ved innsetting med homolog rekombinasjon en mutasjon, delesjon, stopp koderen eller andre nukleotid sekvenser, omfattende et helt gen, inn i det aktuelle genet, for å hindre at det aktuelle produktet blir uttrykt. Tidligere teknikk lærer anvendelsen av homolog rekombinasjon for innsetting av spesifikke mutasjoner og uttrykkingen av et celleprodukt kan derved bli terminert ved hjelp av dette (se for eksempel Schwartzberg et al, PNAS (USA), 87:3210-3214 (1990)). Oppfinnelsen er ikke ment å omfatte en slik fremgangsmåte. Ved oppfinnelsen blir "modifikasjon av uttrykkingen" oppnådd ved hjelp av innsetting av regulerende og/eller forsterkende regioner ved spesielt ønskede lokaliseringer ved hjelp av homolog rekombinasjon. De foretrukne modifikasjonene er de som aktiverer og/eller forsterker uttrykkingen av det aktuelle produkt.

Når det i beskrivelsen benyttes frasen at et DNA-regulerende segment er "operativt bundet til" et gen, er en slik terminologi ment å bety at det DNA-regulerende segmentet er slik plassert i forhold til det aktuelle genet at transkripsjonen av dette genet er regulert ved dette DNA-regulerende segment. Det regulerende segment er fortrinnsvis oppstrøms for genet, men kan være nedstrøms eller inne i genet, forutsatt at det opererer for å regulere uttrykkingen av genet på en eller annen måte. Det DNA-regulerende segmentet kan være en promotor, terminator, operator, forsterker, stilner, demper eller lignende eller en hvilken som helst kombinasjon av disse.

Når termene "oppstrøms" eller "nedstrøms" blir anvendt i beskrivelsen og kravene, er det med dette ment henholdsvis i 5' retning eller 3'retning, relativt til den kodende strengen i det aktuelle genet.

Claims

1. Fremgangsmåte for aktivering av et normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen i genomet til en eukaryotisk cellelinje og ekspresjon av genproduktet av nevnte gen, karakterisert ved at den omfatter: a) Innsetting av en DNA-konstruksjon i nevnte genom ved homolog rekombinasjon, hvor nevnte DNA-konstruksjon omfatter et DNA-regulerende segment som er istand til å stimulere ekspresjon av nevnte gen når det er operativt forbundet dertil og et DNA-målsøkingssegment homologt til en region av nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte regulerende segment er operativt forbundet med nevnte aktuelle gen; b) dyrking av cellelinjen under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte genprodukt; og c) oppsamling av nevnte genprodukt; hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter et ekspresserbart, amplif iserbart gen, som er istand til å amplifisere nevnte aktuelle gen når det er satt inn i tilstrekkelig nærhet dertil, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte amplif iserbare gen er tilstrekkelig nær nevnte aktuelle gen til å forårsake amplifikasjon derav, når nevnte ampiifiserbare gen blir amplifisert, hvor den nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart, selekterbart markørgen plassert slik at det blir satt inn sammen med nevnte ekspresjonsbare, amplifiserbare gen, hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter to DNA-mål-søkingssegmenter, som hvert er homologt til en region av nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor ett av nevnte målsøkingssegmenter er oppstrøms for nevnte regulerende segment, og det andre av nevnte målsøkingssegmentet er nedstrøms for nevnte regulerende segment, hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart selekterbart markørgen, anbragt slik at det blir satt inn i nevnte regulerende segment, eller hvor nevnte DNA-konstruksjon ytterligere eventuelt omfatter et negativt, selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvorved nevnte selekterbare markør ikke blir uttrykt i celler i hvilke DNA-konstruksjonen er riktig satt inn, og hvor det eventuelt blir gjennomført en selektering av kloner fra nevnte cellelinje som uttrykker produktet av nevnte selekterbare markørgen.

2 . Fremgangsmåte for modifisering av ekspresjonskarakteristikkene av et gen i et genom av en eukaryotisk cellelinje og ekspresjon av produktet av nevnte gen, karakterisert ved at den omfatter: a) Innsetting av en DNA-konstruksjon i nevnte genom ved homolog rekombinasjon, hvor nevnte DNA-konstruksjon omfatter et DNA-regulerende segment som er istand til å modifisere ekspresjonenskarakteristikken av nevnte gen når det er operativt forbundet dertil, sammenlignet med dets eksisterende DNA-regulerende segment, og et DNA-målsøk-ingssegment som er homologt med en region i nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte regulerende segment er operativt forbundet til nevnte gen; b) dyrking av cellelinjen under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte genprodukt; og c) oppsamling av nevnte genprodukt; hvor nevnte DNA-konstruksj on eventuelt omfatter et ekspresserbart, ampi if iserbart gen, som er istand til å amplifisere nevnte aktuelle gen når det er satt inn i tilstrekkelig nærhet dertil, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte amplif iserbare gen er tilstrekkelig nær nevnte aktuelle gen til å forårsake amplifikasjon derav, når nevnte amplifiserbare gen blir amplifisert, hvor den nevnte DNA-konstruksjonen eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart, selekterbart markørgen plassert slik at det blir satt inn sammen med nevnte ekspresjonsbare, ampiifiserbare gen, hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter to DNA-mål-søkingssegmenter, som hvert er homologt til en region av nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor ett av nevnte målsøkingssegmenter er oppstrøms for nevnte regulerende segment, og det andre av nevnte målsøkingssegmentet er nedstrøms for nevnte regulerende segment, hvor nevnte DNA-konstruksj on eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart selekterbart markørgen, anbragt slik at det blir satt inn i nevnte regulerende segment, eller hvor nevnte DNA-konstruksj on eventuelt ytterligere omfatter et negativt, selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvorved nevnte selekterbare markør ikke blir uttrykt i celler i hvilke DNA-konstruksjonen er riktig satt inn, og hvor det eventuelt blir gjennomført en selektering av nevnte cellelinje som uttrykker produktet av nevnte selekterbare markørgen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at cellelinjen er en animalsk cellelinje.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte cellelinje er en mammalsk cellelinje.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte cellelinje er en plantecelle-linje.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte selekterbare markørgen er neomycinresistensgenet og nevnte utvelgingstrinn omfatter utvelgelse av de kloner som har neomycinresistans.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 6, karakterisert ved at nevnte DNA-konstruksjon ytterligere omfatter et negativt selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment, slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvor nevnte negative selekterbare markørgen ikke blir uttrykt i celler hvor nevnte DNA-konstruksjon blir riktig satt inn, og hvor nevnte utvelgingstrinn ytterligere omfatter selektering av de klonene som ikke uttrykker nevnte negative, selekterbare markørgen.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte negative, selekterbare markørgen er Herpes Simplex Virus tymidinkinasegenet og nevnte utvelgingstrinn omfatter utvelgelse av de kloner som overlever eksponering for et medium som avliver celler som uttrykker nevnte gen.

9. Genom fra en eukaryotisk cellelinje, karakterisert ved at genomet har et DNA-regulerende segment operativt forbundet med et naturlig forekommende gen, hvor genet har sin naturlig forekommende lokalisering i genomet, og hvor det DNA-regulerende segmentet, når forbundet slik, ikke er ved dets naturlige plassering i genomet, ved hvilken naturlige plassering den fremmer ekspresjonen av et genprodukt som normalt blir uttrykt i nevnte cellelinje.

10. En ikke differensierende eukaryot cellelinje som er istand til å uttrykke et genprodukt av et normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen innen genomet av nevnte cellelinje, karakterisert ved at genomet har innsatt deri en DNA-konstruksjon som er operativt forbundet med nevnte normalt transkripsjonelt ikke uttrykte gen, hvor det DNA-regulerende segment er istand til å fremme ekspresjonen av et genprodukt i nevnte cellelinje, hvor nevnte DNA-konstruksj on omfatter et DNA-regulerende segment som er istand til å stimulere ekspresjon av nevnte gen når det er operativt forbundet dertil og et DNA målsøkingssegment homologt til en region av nevnte genom; hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter et ekspresserbart, amplif iserbart gen, som er istand til å amplifisere nevnte aktuelle gen når det er satt inn i tilstrekkelig nærhet dertil, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte amplifiserbare gen er tilstrekkelig nær nevnte aktuelle gen til å forårsake amplifikasjon derav, når nevnte amplifiserbare gen blir amplifisert, hvor den nevnte DNA-konstruksjonen eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart, selekterbart markørgen plassert slik at det blir satt inn sammen med nevnte ekspresjonsbare, ampiifiserbare gen, hvor den nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter to DNA-målsøkingssegmenter, som hvert er homologt til en region av nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor ett av nevnte målsøkingssegmenter er oppstrøms for nevnte regulerende segment, og det andre av nevnte målsøkingssegmentet er nedstrøms for nevnte regulerende segment, hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart selekterbart markørgen, anbragt slik at det blir satt inn i nevnte regulerende segment, eller hvor nevnte DNA-konstruksjon ytterligere omfatter et negativt, selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvorved nevnte selekterbare markør ikke blir uttrykt i celler i hvilke DNA-konstruksj onen er riktig satt inn, og hvor det eventuelt blir gjennomført en selektering av nevnte cellelinje som uttrykker produktet av nevnte selekterbare markørgen.

11. En ikke differensierende eukaryotisk cellelinje som er istand til å modifisere ekspresjon av et genprodukt sammenlignet med cellelinje fra hvilken den er avledet, karakterisert ved at nevnte genprodukt er ekspresjonsproduktet av et endogent gen fra genomet fra nevnte celle, hvor det i nevnte genom er satt inn på en operativ måte, ved eller nær nevnte endogene gen, en DNA-konstruksjon og eventuelt et amplifiserbart gen som er istand til å modifisere ekspresjonen av nevnte genprodukt ved nevnte cellelinje, hvor nevnte DNA-konstruksjon omfatter et DNA-regulerende segment som er istand til å stimulere ekspresjon av nevnte gen når det er operativt forbundet dertil og et DNA målsøkingssegment homologt til en region av nevnte genom; hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter et ekspresserbart, amplif iserbart gen, som er istand til å amplifisere nevnte aktuelle gen når det er satt inn i tilstrekkelig nærhet dertil, hvor nevnte konstruksjon blir satt inn slik at nevnte amplif iserbare gen er tilstrekkelig nær nevnte aktuelle gen til å forårsake amplifikasjon derav, når nevnte amplifiserbare gen blir amplifisert, hvor den nevnte DNA-konstruksjonen eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart, selekterbart markørgen plassert slik at det blir satt inn sammen med nevnte ekspresjonsbare, amplifiserbare gen, hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt omfatter to DNA-mål-søkingssegmenter, som hvert er homologt til en region av nevnte genom i eller nær nevnte gen, hvor ett av nevnte målsøkingssegmenter er oppstrøms for nevnte regulerende segment, og det andre av nevnte målsøkingssegmentet er nedstrøms for nevnte regulerende segment, hvor nevnte DNA-konstruksjon eventuelt ytterligere omfatter minst ett ekspresserbart selekterbart markørgen, anbragt slik at det blir satt inn i nevnte regulerende segment, eller hvor nevnte DNA-konstruksjon ytterligere omfatter et negativt, selekterbart markørgen anbragt med hensyn på nevnte målsøkingssegment slik at det ikke blir satt inn når nevnte konstruksjon blir riktig satt inn ved homolog rekombinasjon, hvorved nevnte selekterbare markør ikke blir uttrykt i celler i hvilke DNA-konstruksj onen er riktig satt inn, og hvor det eventuelt blir gjennomført en selektering av nevnte cellelinje som uttrykker produktet av nevnte selekterbare markørgen.

12. DNA-konstruksjon for anvendelse ved aktivering av ekspresjonen av et forhåndsvalgt normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen i en forhåndsvalgt eukaryotisk vertcellelinje og som passer for målsøking av nevnte forhåndsvalgte gen ved homolog rekombinasjon, karakterisert ved at konstruksjonen omfatter: et DNA-regulerende segment som er istand til å aktivere ekspresjonen av nevnte forhåndsvalgte normalt transkripsjonelt ikke uttrykte gen til cellelinjen inn i hvilken det er innsatt, når nevnte DNA-regulerende segmentet er operasjonelt forbundet til nevnte gen, og et DNA-målsøkingssegment homologt til et område til genomet inn i hvilket det er tiltenkt å bli innsatt eller proksimalt til nevnte forhåndsvalgte normalt transkripsjonelt ikke uttrykte gen, slik at når nevnte DNA-konstruksjon innsettes ved nevnte målsøkte posisjon, det DNA-regulerende segmentet vil være operativt forbundet til nevnte forhåndsvalgte normalt transkripsjonelt ikke uttrykte gen og vil være ved en posisjon i genomet som er en annen enn den naturlige posisjonen til nevnte DNA-regulerende segment.

13. DNA-konstruksjon for anvendelse ved modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et forhåndsvalgt gen i en forhåndsvalgt eukaryotisk vertscellelinje og som passer for målsøking av nevnte forhåndsvalgt gen ved homolog rekombinasjon, karakterisert ved at konstruksjonen omfatter: et DNA-regulerende segment som er istand til å modifisere ekspresjonskarakteristikkene av et forhåndsvalgte gen til cellelinjen inn i hvilken det skal innsettes, når nevnte DNA-regulerende segment er operasjonelt forbundet til nevnte gen, og et DNA-målsøkningssegment homolog til et område av genomet inn i hvilket det er tiltenkt å bli innsatt i eller proksimalt til nevnte forhåndsvalgte gen, slik at når nevnte DNA-konstruksjon innsettes ved nevnte målsøkte posisjon vil det DNA-regulerende segmentet være operativt forbundet til nevnte forhåndsvalgte gen og vil være ved en posisjon i genomet som er en annen enn den naturlige posisjonen til nevnte DNA-regulerende segment.

14 . DNA-konstruksjon ifølge krav 12 eller 13, karakterisert ved at det omfatter to DNA-målsøkende segmenter, hvor i det minste segementet plassert oppstrøms er homologt til en ikke-kodende region av genomet.

15. DNA-konstruksjon ifølge krav 14, karakterisert ved at det nedstrøms DNA-målsøkende segmentet omfatter en del av det forhåndsvalgte genet.

16. Anvendelse av et DNA-konstruksjon ifølge krav 12, eller krav 14 eller 15, når avhengig av krav 12, for aktivering av ekspresjonen av et forhåndsvalgt, normalt transkripsjonelt ikke uttrykt gen i en forhåndsvalgt eukaryotisk vertscellelinje.

17. Anvendelse av et DNA-konstruksjon ifølge krav 13, eller krav 14 eller krav 15, når avhengig av krav 13, for modifisering av ekspresjonskarakteristikkene til et forhåndsvalgt gen i en forhåndsvalgt eukaryot vertscellelinje.