NO311362B1 - Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive polypeptider - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører analogifremgangsmåte for fremstilling av nye peptider som innvirker på veksten av cancerholdige tumorer i mennesker. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt bombesin antagonister som er [Y<8->^ pseudo] polypeptider inneholdende D- eller L tryptofan eller tryptofananalogen 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido[3,4-b]indol-3-karboksylsyre (Tpi) ved N eller/og C-terminalen som har antagonist egenskaper overfor bombesin eller bombesin-lignende peptider, salter derav og farmasøytiske sammensetninger og fremgangsmåter for anvendelse som vedrører disse peptidene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører analogifremgangsmåte for fremstilling av polypeptidforbindelser som har antagonist egenskaper overfor bombesin eller bombesin-lignende peptider så som gastrin frigjørende peptid (GRP), neuromedin C og lignende, nedenfor referert til som bombesin antagonist egenskaper og er av verdi for foreksempel behandling av malign sykdom i varmblodige dyr så som mennesket. Oppfinnelsen innbefatter analogifremgangsmåte for fremstilling av nye polypeptid forbindelser og nye farmasøytiske sammensetninger inneholdende nevnte polypeptid forbindelser. Fremgangsmåter for fremstilling av medikamenter som inneholder disse, kan anvendes ved fremstilling av en bombesin antagonist effekt i varmblodige dyr så som mennesket.

Bombesin er et tetradekapeptidamid som først ble isolert fra huden til frosken Bombina-bombina (Anastasi, Erspamer and Bucci, Experientia, 1971, 27, 166). Det er kjent at bombesin er et potent mitogen for Swiss 3T3 fibroblast celler fra mus (Rozengurt og Sinnett-Smith, Proe. NAtl. Acad. Sei. USA, 1983,80,2936) og at det stimulerer amylase sekresjon fra bukspyttkjertel acini fra marsvin (Jensen, Jones, Folkers and Gardner, Nature, 1984, 309, 61 ). Det er også kjent at bombesin-lignende peptider blir produsert og utskilt av human small-cellelungecancer (SCLC) celler(Moody, Pert, Gazdar, Carney og Minna, Science, 1981, 214, 1246), og at eksogent tilsatte bombesin-lignende peptider kan stimulere veksten av human SCLC-celler in vitro (Carney, Cuttia, Moody og Minna, Cancer Research, 1987, 47, 821) og at et monoklonalt antistoff spesifikt for C-terminus region til bombesin og GRP kan blokkere bindingen av GRP til dets reseptorer og forhindre veksten av humane SCLC-celler både in vitro og in vivo (Cuttia, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler og Minna, Nature, 1985, 316, 823).

GRP som har bombesin-lignende egenskaper er et sterkt distribuert peptidamid inneholdende 27 aminosyrer isolert fra tarmen til gris (McDonald, Jornvall, Nilsson, Vågne, Ghatei, Bloom og Mutt, biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 90, 227) hvor C-terminus aminosyresekvensen er nesten identisk med den til bombesin. Neuromedin C er et dekapeptidamid og strukturen er identisk med de siste 10 aminosyrene i C-terminusregionen til GRP som er blitt isolert fra tynntarmen til kanin (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke og Shively, J. Biol. Chem., 1983, 258, 5582). GRP stimulerer forkjellige biologiske responser, inkludert frigjøring av gastrin i den systemiske sirkulasjon. Den virker også som en vekstfaktor i 3T3 musefibroblaster og small cellelungecancer (SCLC) celle. GRP har derfor blitt foreslått å spille en direkte patofysiologisk rolle ved utvikling av SCLC via en autokrin vekstmekanisme.

Strukturene til bombesin, neuromedin C og det karbokyl-terminale nonapeptidet til GRP er vist nedenfor: bombesin pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

Neuromedin C H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 C-terminalt nonapeptid til GRP - Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHg

Søket etter andre amfibiske bombesin-lignende peptider førte til isolering av litorin som er et nonapeptid (pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2) i huden på frosk fra Papua, New Guinea som ser ut til å være det mest potente bombesinet

(Yasukara et al., Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Studier på bombesinanaloger viste at et minimumssegment på 9 aminosyreresidier fra 6-134 posisjonen av bombesin har hele spekteret av bombesin aktivitet.

Flere typer av bombesin antagonister er nå kjente. Forbindele P (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) som nar en viss aminosyresekvens homologi med bombesin inhiberer ikke bindingen av bombesin og bombesin-lignende peptider, men forbindelse P analoger modifisert ved erstatning av flere L-aminosyrer med D-aminosyrene så som (D-Arg<1>, D-Pro<2>, D-Trp<7>'<9>, Leu<11>) forbindelse P og (D-Arg<1>, D-Phe5, D-Trp7»9, Leu<11>) forbindelse P (Moody et al., Fed. Proceedings, 1987, 46, 2201) ble funnet å blokkere utskillelse av bombesin i bukspyttkjertelacinar celler og å antagonisere de vekst-fremmende virkningene av bombesin i Swiss 3T3 celler. To typer av bombesinantagonister avledet fra bombesin, blant annet (D-Phe^, D-Phe<12>) bombesin og [Leu<1>3-psi-Leu<14>] bombesin (Coy et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056 og peptider, 1989, 10, 587 har vist seg å være potente in vitro og in vivo inhibitorer av bombesinresponsen.

En annen type bombesinantagonist bestemt av Heimbrook et al., (J. Biol. Chem., 1989, 264, 11258) er N-acetyl-GRP(20-26) og analoger derav hvori det C-terminale metioninresidiet er deletert fra GRP(20-27)analogene. Nylig rapporterte Coy [J. Biol. Chem. 1989, 264, 14691] at noen kortkjedede bombesinantagonister basert på Litorin sekvensen så som [D-Phe^-Leu1<3->psi-Phe<14>] bombesin (6-14) og [D-Phe^, Leu13-psi-Leu<14>] bombesin-(6-14) utviste høyere potens enn deres tilsvarende opprinnelsespeptid [Leu<13->psi-Leu<14>] bombesin.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive polypeptider med formel I:

hvor

Q er NH2 eller OQ<1> hvor Q<1> er hydrogen, C^-iQ-alkyl, fenyl eller fenyl-C7_10-alkyl;

X er hydrogen eller en enkelt binding koblet til A<2>, acylresidiet til en organisk syre eller en gruppe med formel Rico-

hvor

(1) R<1> er hydrogen, C<->j^Q-alkyl, fenyl eller fenyl-C7_10~ alkyl;

hvor

R<2> er hydrogen, <C>1_<1>0-alkyl, fenyl eller C7_10<fe>nyl-C7_10<->alkyl, R3 er hydrogen eller C^_^ q alkyl;

(b) R<4->0-C0- hvor R<4> er C-^oalkyl, fenyl eller fenyl-C7_10-alkyl

A<1> er D-, L- eller DL- pGlu, Nal, Phe, Thi , Tyr, Tpi, Hea, Hpp,. Mpp, Trp eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere ledd valgt fra gruppen bestående av halogen, N02, NH2, OH, C-j^-alkyl og C1_3-alkoksy hvor halogen er fluor, klor og brom,

A<2> er Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(X) eller en gruppe med formel Dpa (X), Asp (Y), Glu[-} og Glu (Y)

hvor

X er som ovenfor

hvor

R<5> er hydrogen, C^_3 alkyl eller fenyl;

R<5> er hydrogen eller C1_3alkyl;

R<7> er hydrogen, C-^alkyl eller -NHCONH2

og [-] er en enkelt binding som kobler sidekarboksylgruppen med alfaaminogruppen til A<1> hvor X er en enkeltbinding,

A<3> er Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere ledd valgt fra gruppen bestående av halogen, N02 , NH2, OH, C1_3alkyl og C^_ 3-alkoksy hvor halogen er fluor, klor og brom;

A<4> er Ala, MeAla eller Gin;

A<5> er Val eller MeVal;

A<6> er Gly, Phe eller D-Ala;

A<7> er His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) eller Pal;

A» er en redusert isoster av Leu eller Phe;

A<9> er Leu, Phe, Tpi, Trp eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere ledd valgt fra gruppen bestående av halogen, N02, NH2, OH, <C>1_3alkyl og Ci_3alkoksy hvor halogen er fluor, klor og brom; forutsatt at når A<9> er Leu eller Phe er A<1> forskjellig fra D-Nal eller DL-Phe og hvor A<1> er D-Nal eller DL-Phe er A<9> forskjellig fra Leu eller Phe og saltene derav, kjennetegnet ved farmasøytisk akseptable syrer ved fragment kondensasjon av de tilsvarende peptidfragmentene som vanlig innen peptidkjemi eller ved trinnvis syntese som er vanlig i peptidkjemien og når nødvendig blir de på denne måten oppnådde peptidene acylert og/eller omdannet tiol farmasøytisk akseptable syresalter.

For å lette beskrivelsen av oppfinnelsen er de konvensjonelle forkortelsene for aminosyrer, peptider og derivater derav anvendt som generelt akseptert innen peptidområdet og som anbefalt av IUPAC-IUB (Commission og Biochemical Normen-clature [European J. Biocehm., 1984, 138 9-37].

Forkortelsene for de individuelle aminosyreresidier er basert på det trivielle navnet til aminosyren, for eksempel Trp er tryptofan, Gin er glutamin, His er histidin, Ala er alaniri, Val er val in, Gly er glycin, Leu er leucin, Phe er fenyl-alanin. Der hvor aminosyreresidiet har isomeriske former er det L-formen til aminosyren som er representert dersom ikke annet er angitt ved at D- eller DL- fremkommer foran aminosyresymbolet.

Forkortelser for de uvanlige aminosyrene anvendt i foreliggende oppfinnelse er som følger:

Dpa er 2,3-diaminopropionsyre

Nal er 3-(2-naftyl)-alanin

Thi er p<->2'-thienylalanin

Tpi er 2,3,4,9-tetrahydro-l H-pyrido-[3,4-b] indol-3-karboksylsyre

Peptidsekvensene er ført opp ifølge konvensjonen hvorved den N-terminale aminosyren er til venstre og den C-terminale aminosyren er til høyre.

Hea er hydrokanelsyre

Hna er 3-hydroksy-2-naftoinsyre

Hpp er 3-(4-hydroksyfenyl)propionsyre

Mpp er 3-(4-metoksyfenyl)propionsyre

Paa er fenyleddiksyre

Andre forkortelser som blir anvendt er:

AC acyl

Ac acetyl

AcOH eddiksyre

BOC tert-butoksykarbontl

(BOCjgO di-tert-butyldikarbonat

BHA benzhydrylamin

Bzl benzyl

BSA bovint serum albumin

DIC 1,3-diisopropylkarbodiimid

DMEM Dulbecco's modifiserte Eagles medium

Et etyl

EDTA etylendiamintetraeddiksyre

FCBS føtalt kalve bovint serum

FMOC 9-fluorenylmetyloksykarbonyl

For formyl

HITES RPMI 16 4D medium pluss IO"<8> M hydrokortison, 5 pl/ml bovint insulin, 10 ug/ml humant transferin, 10"<8> M p-estradiol og 3 x IO-<8> M Na2Se03

HOBt 1-hydroksybenzotriazol

HPLC høy-ytelses-væske-kromatograf i

Me metyl

MeCN acetonitril

MeOH metylalkohol

TEA trietylamin

PBS fosfat-buffret saltvann

PGlu pyroglutaminsyre

psi en pseudo peptid binding med struktur CH2-NH med unntagelse der følgende residie har en sekundær

N-terminal hvor betydningen er CHgN

TFA trifluoreddiksyre

Z benzyloksykarbonyl

De mest foretrukne polypeptidene i foreliggende oppfinnelse er

Spesielt foretrukne polypeptider i foreliggende oppfinnelse innbefatter peptid nummerene 5, 7, 12, 17, 18, 22, 26 og 38.

Syntese av polypeptider

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt ved hvilke som helst av de kjente teknikkene innenfor dette fagområdet. En oppsummering av teknikkene som er tilgjengelige kan finnes i M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.

Teknikkene for ekslusiv fast-fase syntese er angitt i boken til J.M. Stewart og J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2nd.ed.) oversikten til G. Barany, et al., Int. J. Peptide Protein Res. , 30, 705-739, 1987.

En spesielt foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider og deres forpeptider ifølge denne oppfinnelsen er fast-fase syntese. Bæreren anvendt i fast-fase syntesen av polypeptidene ifølge denne oppfinnelsen er benzhydrylamin (BHA) harpiks eller klormetylert polystyrenharpiks som er 1% kryss-bundet med divinylbenzen som er kommersielt til-gjengelig. Den beskyttende gruppen valgt for a-amino gruppen var tert-butoksykarbonyl (Boe-)gruppen som ble fjernet ved hvert trinn av syntesen. Utgangsmaterialet inneholdende den beskyttede aminosyren ble dannet fra en Boe aminosyre koblet til BHA harpiks eller koblet til klormetylert polystyrenharpiks med KF. Syntesen begynte ved C-terminalen av polypeptidet og ble utført ved anvendelse av en manuell apparatur, gjentatt med trinnvis avspaltning av a-amino gruppen og kobling til den neste aminosyren.

Rensing av polypeptider

Polypeptidene ble generelt renset ved høy ytelse væske kromatografi (HPLC) på en revers fase kolonne utført på et Rainin HPLC system (Rainin Inc., Co., Woburn, MA) bestående av tre Rainin kanin HP HPLC pumper kontrollert av en Apple Macintosh Plus datamaskin, en Rheodyne injektor og en Knauer modell 87 variabel bølgelengde UV monitor. Råpeptider (10-40 mg) blir applisert på en Dynamax makro kolonne (21,2 x 250 mm) pakket med sfærisk C^g silikagel (porestørrelse:300A; partikkelstørrelse: 12pm) (Rainin Inc. Co.) og eluert med lineær gradient ved anvendelse av et oppløsningsmiddelsystem bestående av (A) 0,1$ TFA og (B) 0, 1% TFA i 70% vandig acetonitril med en strømningshastighet på 2,0 ml/min. Alle fraksjonene ble vurdert for renhet og retensjonstiden ved en analytisk HPLC beskrevet nedenfor.

Kvaliteten og karaktertrekkene for elueringen av rå og renset peptid ble bestemt ved analytisk HPLC på en Hewlett-Packard Model 1090 væske kromatografi utstyrt med et diode stråle detektorsett ved 220 og 280 nm og en revers fase 4,6 x 250 nm W-porex C-Lg kolonne (porestørrelse: 300A, partikkelstørrelse: 5 pm). En strømningshastighet på 1,2 ml/min. av oppløsnings-middelsystem (A) og (B) beskrevet som ovenfor ble opprettholdt og separasjoner ble utført ved romtemperatur.

I de fleste tilfellene ble polypeptidene ytterligere renset ved rekromatografi på samme kolonne med en viss modifikasjon når det gjelder gradient betingelsene. Homogeniteten av de rensede peptidene viste seg å være rene over 97$ i analytisk

HPLC.

Aminosyre analyser

Aminosyre analyser av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse ble utført i Beckman 6300 aminosyre analysator på prøver som ble hydrolysert ved 110°C i 20 timer i forseglede, evakuerte rør med 4 M metansulfonsyre inneholdende 0,2$ 3-(2-aminoetyl)-indol. Forholdet til aminosyren var som ventet. Residiene til Leu-psi-Leu og Leu-psi-Phe viser absorbsjons-toppen med retensjonstider på henholdsvis 39.93, 44.56 min. Tpi ble ikke funnet etter 15 minutters fordøyning i analyse prosedyren.

Analyse prosedyrer

(A) Reseptorbindings analyse

Binding av <125>I-Grp(14-27) og erstatning av bombesinantagonister ble utført i 24-brønn vevskulturskåler (GIBCO) ved anvendelse av Swiss 3T3 celler. Murine Swiss 3T3 fibroblaster ble opprettholdt ved ukentlige føringer i DMEM inneholdende 10$ FCBS og antimykotika. Kulturene ble inkubert i 5% C02 i luft ved 37°C. Brønnene ble sådd med IO<5> celler/- brønn (levedyktighet >95#), dyrket til sammenløp og av-slutning. Bindingsprosedyren ble utført 7 dager etter utsåing. Cellene ble vasket to ganger med 0,5 ml bindingsbuffer (Dulbecco's modifiserte Eagels medium inneholdende 20 nM HEPES-NaOH (pH 7,4), 0, 2% BSA og 100 mcg/ml bacitracin). Cellene ble deretter inkubert med 0,2 nM <125>I-GRP (14-27) in nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner av antagonister (6xl0~1:1--6xl0_6M, totalvolum 0,4 ml).

Ifølge Zachary & Rozengurd, (Pres. Nati. Acad. Sei., USA, 1985, 85 3636-3670) og Layton et al. (Cancer Res., 1988, 43, 4783-4789) nådde binding av <125>I-GRP ved 37°C en maksimal-verdi ved 30 min. og ble deretter redusert slik at cellene ble inkubert ved 37° C i 30 min. Etter dette ble cellene vasket to ganger med iskald (4°C) bindingsbuffer og to ganger med is-kald fosfat-buffret saltvann (PBS.mM): NaCl 138, KC1 2,8, Na2HP048, KH2P04, 1,45, CaCl2 0,91, mgCl2 0,49. Vaskede kulturer ble ekstrahert i 0,5 ml 0.5 M NaOH og overført til rør for telling. Brønnene ble vasket en gang med 0,5 ml destillert vann (sterilt) og vaskevannet ble tilsatt til de hensiktsmessige rørene. Deretter ble radioaktiviteten til prøvene opptelt i en automatisk gammateller (Micromedic System, Inc., Huntsville, Ala.).

Ligand-PC data kurve tilpasningsprogrammet til Munson og Rodbard (Anal. Biochem., 1987, 107, 220-239) ble anvendt for å bestemme typer av reseptorbinding, dissosiasjonskonstant (Kd), assosiasjonskonstant (Ka), maksimal bindingskapasitet til reseptorene (Bmax) og halv-maksimal inhibisjon (ICgg). ICgo-verdiene representerer konsentrasjoner av antagonister som forårsaker halv-maksimal inhibisjon av 0,2 nM GRP(14-27) stimulert vekst. Dissosiasjonskonstanten og maksimal bindingskapasitet til <125>I-GRP (14-27) var i disse eksperimentene 1,32 nM og 0,769 pm/mg protein som var tilsvarende som de som ble rapportert for 12^-i-GRP Gg 125j_ Tyr<4->bombesin. Bindingskaraktertrekkene til GRP-reseptorene på 3T3 celler i disse eksperimentene er i samsvar med verdiene oppnådd for bombesinbinding til bukspyttkjertel acinar Jensen, et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1978, 75, 6139-6143) og hypofyse cellene ifølge Westendorf og Schon-brunn, (J. Biol. Chem. 1983, 258, 7527-7335).

GRP(14-27) inhiberer binding av <125>I-GRP(14-27) med IC50 2,32 nM som er i samsvar med dataene fra Layton, et al. (Cancer Res., 1988, 48, 4783-4789) som er angitt å være 2,2 nM. Bindingsdata til polypeptidene i foreliggende oppfinnelse er oppført i vedlagte tabell I nedenfor.

BINDINGSDATA PÅ 3T# SWISS

IC50 sr konsentrasjonen av umerket ligand som erstattet halvparten av den spesifikke radioligand bindingen. Det blir beregnet ifølge ligningen til Cheng og Prusoff (Biochem-Pharmacol. 1973, 22, 3099): IC50 = Kc (1 + L/Kc og Kh hvor Kc og Kh er dissosiasjonskonstantene til henholdsvis umerket (kald) og merket (varm) ligand og L er konsentrasjonen av anvendt radioligand.

(B) Amylasefrigjøring

Isolert bukspyttkjertel acini ble preparert ved collagenase

spaltning av bukspyttkjertelen oppnådd fra hann Wistar rotter (150-180 g) som fastet over natt. Dyrene ble drept ved cervical dislokasjon og bukspyttkjertelen ble fjernet og deretter spaltet med sterkt renset collagenase (CLSPA, 540 U/mg, Cooper Biomedical, Freehold, N.J., USA) ifølge fremgangsmåten til Amsterdam, Solomon og Jamieson (1978).

Dispergert acini ble suspendert i et inkubasjonsmedium inneholdende 24,5 mM HEPES, 98 mM NaCl, 4,0 mM KC1, 11,7 mM KH2P04, 1,0 mM MgCl2, 0,3 mM CaCl2, 5,0 mM glucose, 1%

(vekt/vekt) essensiell og uessensiell aminosyreblanding (Serva Feinbiochemica, Heidelberg, FRG), 2 mM glutamin, 0,2$ BSA og 0,01$ (vekt/vekt) trypsin inhibitor. Inkubasjons-oppløsningen ble mettet med oksygen og opprettholdt ved 37"C i et ristebad (60 svingninger/min.). Acinar suspensjon ble inkubert i nærvær av forskjellige konsentrasjoner GRP eller GRP antagonister.

Etter inkubasjon ble rørene sentrifugert ved 1000 g i 5 min. og supernatanten ble separert fra pelleten. Amylaseinnholdet i supernatanten og oppløst pellet ble bestemt separat som beskrevet av Bernfeld (1955). Sekresjon av amylase ble gitt som prosentandeler over basalverdien.

Inkubasjonene ble duplisert. Ustimulert amylasefrigjøring i løpet av hele denne eksperimentelle perioden ble bestemt som basalverdien.

Når tilsatt til inkubasjonsmediet i gradvis økende konsentrasjoner førte dette til en konsentrasjons-avhengig inhibisjon av amylasefrigjøringen stimulert ved submaksimal konsentrasjon av GRP (10~<9>M). (C) Inhibisjon av <3>H-thymidin inkorporeringen ved 3T3 cellene.

SCLC cellene ble anvendt 2 til 4 dager etter overføring. Enkeltcelle suspensjoner ble dannet ved vasking av cellene (2 ganger med PBS og deretter pipettering av disse i PBS inneholdende 0,2 g/liter glucose, 0,2 g/liter EDTA og 14 mM 1ignocainhydroklorid ved 37°C helt til suspensjonen så ut til å være jevn (2-4 min). Cellene ble vasket tre ganger og resuspendert i HITES uten FCSB. Kulturer ble satt opp i 1,34 x 10<5> celler sådd ut på dag 0 og alle peptidene ble tilsatt på samme tid i 1 ml RPMI-1640 medium pluss HITES og 0,125$ albumin. 48 timer senere ble 1 uc. tritiert thymidin tilsatt til hver brønn og inkubasjonen ble fortsatt i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter vasket og avsatt på glassfilter-papir og vasket med iskald 5% trikloreddiksyre. Filterpapiret ble plassert i beholdere inneholdende scintillasjonsvæske og telt i 1 minutt.

(D) Inhibisjon av veksten til forskjellige small cellelunge carcinomer (S.C.L.C.): Stamkultur av H-69 og H-345 S.C.L.C cellene oppnådd fra National Cancer Institue (NCI) blir opprettholdt i suspen-sjonskultur. Inhibisjon av GRP-indusert DNA-syntese ved bombesin antagonister blir utført ved måling av (<3>H)-thymidin inkorporasjon, inhibisjon av GRP-indusert DNA syntese av bombesinantagonister ble vist å være signifikant og konsen-trasjonsavhengig. (E) Virkning på bukspyttkjertelsekresjon in vivo Studier av sekresjon ble utført på seks katter ved bevissthet

(2-3 kg) preparert med kronisk mave og bukspyttkjertel fistulae som tidligere beskrevet (Konturek et al., J. Physiology, London, 1976, 257, 663-672). Kanylen anvendt i mave fistula var av samme type som beskrevet av Ernas, gastroenterology, 1960, 39, 886-782). Denne kanylen ble satt inn i pylorisk kjertelområde nære ved større curvatur. Bykspyttkjertel fistula ble dannet ved anvendelse av spesial T-formet metallkanyle med lateral og hovedlemmer som tilpasset ved bruk for katter. Felles galletrakt ble oppdelt like før kobling av bukspyttkjertelkanalen og transplantert til øvre tolvfingertarm for å separere gallestrømmen fra bukspyttkjertelsaften. En liten tolvfingerpute inneholdende innførsel av viktigste bukspyttkjertelkanal ble dannet og lateral lem til bukspyttkjertel kanylen ble satt inn i denne puten. Hovedlemmen til kanylen ble plassert i distaltov-fingertarmen omtrent 3 cm forbi duodeno-duodenostoien.

Studier av utskillelsen begynte omtrent 3 måneder etter kirurgien, mat ble ikke tilført burene i minst 18 t. før hver test. I løpet av hver test (unntatt med foring) ble mavefistula latt stå åpen for å muliggjøre drenering av mavesaft til utsiden.

Sekresjon fra mavefistula ble samlet kontinuerlig og delt inn i 15 min. prøver. Volumet ble registrert og protein og bikarbonatkonsentrasjonene og utslagene ble bestemt som tidligere beskrevet (Konturek et al., 1976).

Flere serier av tester ble utført på hvert dyr for sammen-ligning av de sekretoriske potensene. GRP ble infusert i.v. i graderte doser (1250 pmol/kg-h GRP) i 1-dag testen uten eller med tilsetning av peptid 5. I tester med foring ble gastrisk fistula holdt lukket og hver katt mottok omtrent 50 g kokt homogenisert malt biff som vanligvis ble fullstendig konsumert. Intravenøs infusjon av saltvann (omtrent 10 ml/t) ble opprettholdt i løpet av den postpranidiale perioden og når responsen på bukspyttkjertelutskillelsen nådde et vedvarende platå ble peptid 5 administrert og sekresjonen ble undersøkt i en ytterligere periode på 2 t. I separate tester på fastende katter (uten peptid infusjon eller foring med kjøtt) ble den basale bukspyttkjertelsekresjonen (med åpen gastrisk fistula) målt i en 2 t. periode og deretter ble peptid 5 (10 nmol/kg-t) tilsatt til infusjonen ved en dose som fullstendig opphever bukspyttkjertelsekresjonen indusert av GRP. Resultatene er angitt nedenfor.

Bombesinanalogene peptidene (5), (10) og (2) ble testet in vivo på serumgastrin inhibisjon etter GRP-stimulering. Åtte

minutter etter stimulering med GRP (3>jg/100g BW) økte serumgastrin nivåene fra 16,7 pg/ml (kontroll) til 105 pg/ml.

Rotter injisert 10 min. før GRP-stimuleringen med en bolus av peptidene (5), (10) og (2) antagonistene (30 jjg/100 BW) viste en reduksjon i nivået av gastrinutskillelse (etter 8

min, 36,8 pg/ml for peptid (2); 24,2 pg/ml for peptid (10) pg 32,9 pg/ml for peptid (5).

Bombesin/GRP antagonistene er nyttige for behandling av tilstander av hypergastrinemi, for eksempel preniciøs anemi,

kronisk atrofisk gastritis, Zollinger-Ellison Syndrom og vittiligo, assosiert med diffus hyperplasi av gastriske enterokromafin-1ignende celler og med en øket risiko for utvikling av multifokale gastriske carcinoid tumorer.

Enterokromaffin-lignende celler hyperplasi blir lett produsert i dyr som blir gjort hypergastrinemiske.

En slik behandling er fordelaktig i forhold til kjente medikamenter på grunn av at Hg-antagonister som cimetidin som forårsaker hypergastrinemi og kan føre til carcinoid tumorer i mennesker. Stansing av terapi med Hg-antagonister forårsaker i tillegg en øyeblikkelig tilbakevending av sår på grunn av eksisterende hypergastrinemi.

På grunn av at disse forbindelsene kan antagonister av bombesin/GRP-reseptorer bli anvendt for behandling av lungecancer, tarmcancer og mavecancer.

På grunnlag av disse resultatene angitt ovenfor og data i rotter kan peptidene ifølge oppfinnelsen bli administrert i form av farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske salter, så som syreaddisjonssalter, og eksempler på slike syreaddisjonssalter er hydroklorid, hydrobromid, sulfat, fosfat, fumarat, gluconat, tannat, maleat, acetat, sitrat, benzoat, succinat, alginat, pamoat, malat, ascorbat, tartrat og lignende.

Mikrokapsler eller mikropartikler av disse peptidene formulert fra poly(DL-lactid-coglycolid) kan være det foretrukne vedvarende leveringssystemet. Intravenøs, intramuskulær eller subkutant administrering i isotonisk saltvann, fosfatbufferoppløsninger eller lignende kan bli anvendt. Aerosoler for levering til lunger kan også bli anvendt.

Disse farmasøytiske sammensetningene vil inneholde peptider sammen med en konvensjonell, farmasøytisk-akseptabel bærer. Doseringen vil være fra omtrent 1 til 1000 \ ig av peptidet pr. kg kroppsvekt av verten når gitt parenteralt. Behandling av individene med disse peptidene kan bli utført på samme måte som den kliniske behandlingen ved anvendelse av andre agonister og antagonister av LHRH, somatostatinanaloger eller andre peptider.

Disse peptidene kan bli administrert til pattedyr intrave-nøst, subkutant, intramuskulært, intranasalt eller ved lungeaerosol for å oppnå gastrisk inhibisjon eller antitumor effekt. Effektive doseringen vil variere med formen for administrering og de bestemte artene av pattedyr som blir behandlet. Et eksempel på en typisk doseringsform er en fysiologisk saltvannsoppløsning inneholdende peptidet der oppløsningen blir administrert for å tilveiebringe en dose i området på omtrent 0,01 til 0,20 mg/kg kroppsvekt. Vedvarende lever ingsformuler inger kan bli gitt en gang pr. måned og varigheten av behandlingen kan være på flere måneder.

Til tross for at oppfinnelsen er blitt beskrevet med hensyn på foretrukne utførelsesformer er det innlysende at for-andringer og modifikasjoner kan bli utført uten å fravike

rammen av oppfinnelsen. Substitusjoner kjent innenfor fagområdet som ikke vesentlig fraviker fra dets effektivitet kan bli anvendt i oppfinnelsen.

Genrelle prosedyrer for polypeptldsyntese begynnende

med en boc- aminosyre- harpiksenhet

Prosedyre 1:

(1) vaske med CHgClg (3x1 min); (2) avspalt med 50$ TFA i CHgClg to ganger i 5 min. og 25 min. For peptidharpikser inneholdende D- eller L-Trp eller Tpi, avspaltning med 50$ TFA i CH2C12 inne-3 holdende 5$ merkaptoetanol og 5$ anisol; (3) vask med CHgClg (6x1 min.); (4) nøytraliser med 10$ trietylamin i CHgClg (2x3 min.) (5) vask med CHgClg (6x1 min.); (6) kobling: i) tilsetning av boc-aminosyre (3 ekv. ) bg

5 HOBt (3,3 ekv.) i DMF (3 min.)

ii) tilsetning av 20$ diisopropylkarbodimid

(3 ekv.) i CH2C12 og risting i 60-90 minutter (7) vaske med CH2C12 (2x1 min), etanol (2x1 min) og CH2C1<2> (5x1 min).

Prosedyre II:

For innføring av den reduserte peptidbindingen: -CH2NH. , "ble trinn (6) ifølge prosedyre (I) modifisert som følger:

(1) vaske med DMF (2x1 min.)

(2) tilsett bocleucinaldehyd (3 ekv.) i DMF inneholdende 1$ AcOH; (3) tilsetning av NaBH3CN (3,5 ekv.) i DMF og risting i 60 min.;

(4) vask med 50$ MeOH (3x1 min)

100$ MeoH (3x1 min)

CH2C12 (3x1 min)

Prosedyre III:

For kobling av Boc-Asn, Boc-Gln og Boc-Gly, blir trinn (6) ifølge prosedyre I modifisert som følger: 20$ diisopropylkarbodiimid (3 rkv.) i CH2C12 ble tilsatt til en blanding av DMF oppløsning av Bocaminosyre (3,0 ekv.) og HOBt (3,3 ekv.) ved 0°C i 15 min. og ved romtemperatur, uoppløselig materiale blir fjernet ved filtrering, filtratet tilsatt til peptidharpiks og ristet med Boc-Gln eller Boc-Asn i 2-4 timer eller Boc-Gly i ltime.

Prosedyre IV:

Følgende prosedyrer ble utført for innføring av Fmoc aminosyren. (1) etter avspaltning og nøytralisering, vask med CH2C12 (3x1 min) og DMF (3x1 min) (2) kobling i) tilsetning av Fmoc aminosyre (3 ekv.) og HOBt (3,3 ekv.) i DMF (3 min)

ii) tilsetning av 20$ diisopropylkarbodi-

imid (3 ekv.) CH2C12 og risting i 60

min.

(3) vask med etanol (3x1 min)

(4) avspaltning av Fmoc-gruppen med 50$ piperidin i DMF i

30 min.

(5) vask med DMF (6x1 min)

(6) en annen kobling som beskrevet i trinn (2)

Etter de ønskede forpeptidene med formel I er blitt dannet ble peptidharpiksen deretter behandlet med flytene HF i nærvær av anisol for å tilveiebringe polypeptidet i fri form hvor X med formel I var hydrogen og Y med formel I var NH2 eller OH; eller i beskyttet form hvor A<2> med formel I er Glu (OMe) eller His(Bz).

Omdanning av en funksjonell gruppe ved N, C-terminalen eller sidekjedegruppen til polypeptidet fra fri eller beskyttet form til en annen N eller C-terminal, eller sidegruppe funksjonell gruppe av polypeptidet ble utført med et egnet reagens i oppløsning. For eksempel ble et beskyttet polypeptid inneholdende Glu i posisjon A<2> omsatt med metylamin i nærvær av DIC for å oppnå et polypeptid inneholdende Glu(MeNH) i A<2->posisjonen. Et fritt N-terminalt polypeptid ble omsatt med KOCN for å gi et polypeptid inneholdende NH2C0- i X-posisjonen.

I følgende eksempler blir nummereringen anvendt for å identifisere mellomprodukter. Rekode a/b/Res er den opp-rinnelig harpiksen anvendt i eksempel "a" trinn "b". Kode a/b/c er en forløper for peptid "c" dannet i trinn "b" ifølge eksempel "a", a, b og c er alle tall.

Eksempel (1)

(1) A: Eksempel på L- og D- Tpi

2,04 g (10 mM) L-Trp ble løst opp i 25 ml kokende vann inneholdende 2,1 g sitronsyre. 0,5 ml 40$ formaldehyd ble tilsatt og de faste stoffene begynte øyeblikkelig å bli

dannet. Blandingen ble avkjølt i et isbad og de faste stoffene samlet og vasket med kaldt vann og fast stoffer lufttørket ved romtemperatur for å gi 2,14 g eller 99$ faste stoffer smp. med (dekomponering) ca. 310° . D-isomeren blir dannet på samme måte og har også smp. (dekomponering) ved ca. 310°C.

B: Eksempel på L- og D- Boc-Tpi

Til en omrørt suspensjon av 10,8 g (50 mM) D-Tpi i 250 ml 0,2 N NaOH og 7,5 ml trietylamin ble det tilsatt 10g Di-tert-butyldikarbonat og blandingen ble omrørt i 4 t. og deretter ble ytterligere 10g dikarbonat tilsatt og ytterligere 10g etter ytterligere 3 t. omrøring. Blandingen ble omrørt over natt og ekstrahert (2 x 100 ml) med eter som ble fjernet. Sitronsyre ble tilsatt til det vandige laget frem til surhet (pH 3-5). De faste stoffene ble samlet og vasket med vann og lufttørket over natt.

De faste stoffene ble suspendert i 100 ml tetrahydrofuran. Nesten alle faste stoffer ble oppløst. De uoppløselige stoffene ble fjernet ved filtrering og THF ble fjernet under vakuum. Resten ble triturert med eter for å tilveiebringe 9,20 58$. Dette materialet har samme smp. som utgangsmaterialet, men har forskjellig oppløselighet og TLC på silica ved anvendelse av 85:15:0,5 CHC13:MeOH.HOAc.

2,55 g L.Tpi gir 2,22 g eller 59$ Boc-Tpi ved anvendelse av samme metode.

(2) Eksempel på Boc-Leu-CHO

Boc-leucnmetylester (35 g, 134 mmol ) i tørr toluen (250 ml) under Ng ble avkjølt med tørr is/aceton og (150 ml) 25$ di-idobutyl-aluminiumhydrid i toluen ble tilsatt over 30 min. Blandingen ble omrørt i 20 min. i et bad av tørr is/aceton etter tilsetning av di-isobutylaluminiumhydrid og deretter ble metanol (15 ml) forsiktig tilsatt. Blandingen ble helt inn i 1000 ml iskaldt vann, ristet og filtrert. Toluen ble separert og den vandige fasen ble på ny ekstrahert med eter (3 x 300 ml). Toluen og eterekstraktene ble kombinert og tørket (NagSC^). Den resulterende oljen ble hurtig sendt gjennom en silica gel kolonne (3 x 50 cm) i 1500 ml 15$ EtOAc/petrol. Boc-Leualdehyd ble oppnådd som en olje (27,6g).

Eksempel 2

Peptid nr.

Polypeptidene i eksempelet inneholdt det samme fragmentet Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu NHg, men to forskjellige residier ved N-terminalen ble dannet trinn for trinn på benzhydryl (BHA) harpiksen i henhold til standard metodene for fast fase syntese.

0,50 g BHA harpiks (0,9 mmol NH2/g) ble behandlet med 10$ TEA i CHgClg (nøytralisering) to ganger hver i tre minutter og vasket med CHgClg seks ganger. Harpiksen ble blandet med 1,35 mmol Boc-Leu og 1,50 mmol 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) i DMF i tre minutter. 20$ 1,3-diisopropylkarbodiimid (DIC) med 1,3 mmol i CHgClg ble tilsatt. Blandingen ble ristet ved romtemperatur i 60 minutter. Den resulterende Boc-Leu-BHA harpiksen ble vasket med CHgClg metanol to ganger hver og CHgClg tre ganger og deretter utsatt for en Kaiser test (Anal. Biochem. 34, 595 (1979)). I de tilfellene hvor ufullstendig kobling oppstår blir koblingsprosedyren gjentatt.

Fjerning av Boc-gruppen (avspaltning) fra Boc-Leu-BHA-harpiksen ble utført i en oppløsning av 50$ TFA i DCM i 5 minutter, filtrert og på ny behandlet i 25 min. og deretter vasket med DCM seks ganger.

Nøytraliseringen blir utført som beskrevet ovenfor for BHA-harpiksen.

Kobling av Boc-Leu-CHO blir utført som følgende prosedyre

(II):

(1) vaske med DMF to ganger; (2) tillsetning av 1,5 mmol Boc-Leu-CHO i DMF inneholdende 1$ AcOH; (3) tilsetning av 2,9 mmol NaBH3 i DMF og risting i 60 min. ; (4) Vask med 50$ metanol i H20 to ganger og 100$ MeOH to ganger CHgClg tre ganger;

Etter fjerning av Boc-gruppen fra Boc-Leu-psi-Leu-BHA-harpiksen og nøytralisering ble koblingen av Boc-His(Z) utført som beskrevet i prosedyre I.

Kobling av Boc-Gly blir utført som i prosedyre (III).

20$ 1,3-diisopropylkarbodiimid (1,5 mmol) i CHgClg ble tilsatt til en DMF oppløsning av 1,5 mmol Boc-Gly og 1,65 mmol HOBt ved 0°C, omrørt under avkjøling i 15 min. og ved romtemperatur i 15 min. og presipitatet ble filtrert ut og tilsatt til harpiksen og ristet i 60 min.

De påfølgende aminosyreresidiene Boc-Val, Boc-Ala og Boc-Trp ble deretter sekvensielt introdusert ved kobling på samme måte som angitt i prosedyre (I) for å gi 0,90 g beskyttet peptidharpiks med en struktur Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks (2/1/res).

Etter inkorporering av Boc-Trp blir avspaltning av Boc-gruppen utført med 5 0$ TFA i DCM inneholdende 5$ merkaptoetanol og 5$ anisol for å tilveiebringe TFA-Trp-Ala-Val-Gly-Eis(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks (2/2/Res ).

0,91 g TFA-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks (2/2/res) blir delt inn i åtte porsjoner (omtrent 100 mg hver) som blir anvendt for å oppnå syntesen av konstruerte beskyttede polypeptidharpikser i henhold til prosedyrene beskrevet i prosedyre I for kobling av Boc-D-Trp, Boc-5F-D-Trp, Boc-D-Tpi og Boc-His(Z) og med prosedyre III for Boc-Gln.

Sekvensiell tilsetning av Boc-Gln og Boc-Trp til overnevnte heptapeptidharpiks (2/2/res) gir: Sekvensiell kobling av Boc-Gln og Boc-D-Trp til heptapeptidharpiks (2/2/res) gir;

Kobling av Boc-Gln og Boc-5F-D-Trp til heptapeptidharpiksen (2/2/res) fører til:

2/2/05 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks blir oppnådd ved sukssesiv kobling av Boc-Gln og Boc-D-Tpi.

2/2/6 Boc-D-Tpi-Glu(0Me )-Trp-Al a-Val-Gly-His( Z )-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks blir oppnådd ved suksseiv kobling av Boc-Glu(OMe) og Boc-D-Tpi.

2/ 21 Gl Boc-D-Tpi -Hi s(Z)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks blir oppnådd ved sukssesiv kobling av Boc-His(Z) og Boc-D-Tpi.

2/2/08 Boc-D-Tpi-His(Bz )Trp-Val-Gly-His(Z )-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks blir oppnådd ved suksseseiv kobling av Boc-His(Bz) og Boc-D-Tpi.

Etter fjerning av Boc-gruppen med 50$ TFA i DCM inneholdende 5$ merkaptoetanol og 5$ anisol blir den Boc-avbeskyttede polypeptidharpiksen vasket med DCM, metanol og DCM tre ganger hver og behandlet med frisk destillert HF (5 ml) og anisol (0,25 ml) ved 0°C i 1 t. Oppløsningsmiddelet blir avdampet i vakuum og vasket med eter eller etylacetat og deretter ekstrahert med 70-80$ eddiksyre og lyofilisert for å tilveiebringe rå:

Peptid nr.

En blanding av 40 mg Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-LeuNH2 (2/3/1) og 20 pl TEA i 0,5 ml DMF og 20 mg KOCN i 100 pl HgO ble omrørt ved 0°C og 100 pl AcOH ble deretter droppet inn i blandingen og omrørt ved 0°C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble utsatt for rensing for å tilveiebringe:

Peptid (3) ble preparert ved sukssesiv kobling av Fmoc-Glu(OBut) og Fmoc-D-Trp ved fremgangsmåten angitt i prosedyre IV til Trp-Ala-Val-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks (2/2/res) gir Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)Leu-psi-Leu-BHA-harpiks (2/4/3). Peptidharpiksen ble behandlet med 10$ TFA i DCM inneholdende 5$ 2-merkaptoetanol i 30 minutter for å fjerne But-gruppen fra karboksylgruppen til Glu. Til vasking seks ganger med DCM ble MeNH2 boblet gjennom et Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-harpiks sjikt (2/5/res) i 5 ml DMF ved 0 ° C i 5 min., og 0,25 ml 20$ DIC i DCM ble tilsatt og omsatt ved 0"C i 2 timer. Harpiksen ble deretter vasket med DCM og Fmoc gruppen fjernet med piperidin.

Peptid (3) D-Trp-Glu(MeNH)Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 (RC-3490) ble oppnådd etter behandling med HF.

Rensingen ble utført med HPLC med oppløsningssystemet bestående av (A) 0,1$ TFA og (B) 1$ TFA i 70$ acetonitril. Rensede peptider ble vist å være over 97$ rene i analytisk HPLC. Retensjonstidene til polypeptidene i dette eksempelet er beskrevet i følgende tabell.

ANALYTISK HPLC DATA

Resultatene av aminosyreanalysene for polypeptidene i dette eksempelet var som ventet. Aminosyreforholdene mellom peptid (2) og strukturen til D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 var 1.11:2.09:0.90:1.03:0.95:0.92 (Gin:Trp:Ala:Val:-Gly:His). Residiet Leu-psi-Leu viste en absorbsjonstopp med retensjonstid på 39,95 min. Tpi i peptidene (5), (6), (7) og (8) ble ikke detektert.

Eksempel 3

Polypeptidnr.

Polypeptidene i dette eksempelet inneholder det samme fragmentet Trp-Ala-Val-Gly-Eis-Leu-psi-PheNH2. Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z )Leu-psi-Phe-BHA (3/1/res) harpiks ble dannet trinn for trinn på 0,5 g BHA harpiks (0,9 mmol NH2/g) i henhold til fastfase syntesen som beskrevet i eksempel (2) med unntagelse av at Boc-Phe er istedenfor Boc-Leu ved første kobling.

Partielt paptidharpiks inneholdende omtrent 150mg Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z )-Leu-psi-Phe-BHA harpiks (3/1/res) blir hver koblet med de andre to residiene ifølge prosedyrene beskrevet i prosedyre I for kobling av Boc-Trp, Boc-D-Trp-Boc-D-Tpi og Boc-Glu(0Me) og prosedyre III for Boc-Gln for å gi den endelige polypeptidharpiksen.

Sekvensiell kobling av Boc-Gln og Boc-Trp til overnevnte heptapeptidharpiks (3/1/res) gir:

Sukssesiv tilsetning av Boc-Gln og Boc-D-Trp til heptapeptidharpiksen (3/1/res) gir:

Kobling av Boc-Gln og Boc-D-Tpi til heptapeptidharpiksen (3/1/res) gir:

3/2/13. Boc-D-Tpi-Glu(MeOH)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-harpiks blir dannet ved kobling av Boc-Glu(OMe) og Boc-D-Tpi til heptapeptidharpiks (3/1/res).

Etter fjerning av Boc-gruppen med 50$ TFA iDCM inneholdende 5$ merkaptoetanol og 5$ anisol ble polypeptidharpiksen vasket med DCM, metanol og DCM tre ganger hver og behandlet med frisk destillert HF (5 ml) og anisol (0,25 ml) ved 0°C i 1 time. Oppløsningsmiddelet blir avdampet i vakuum og vasket med etylacetat, ekstrahert med 70-80$ eddiksyre og lyofilisert. Følgende polypeptider blir oppnådd som følger:

Peptid nr.

Peptidet med NH2C0 ved N-terminalen ble preparert ved følgende prosedyre: En blanding av 40 mg råpolypeptid (3/3/9) Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 og 20 pl TEA i 0,5 ml DMF og 20 mg K0CN i 100 pl H20 ble omrørt ved 0"C og 100 pl AcOH ble derette droppet inn i overnvente blanding og reaksjonen ble omrørt ved 0°C i 1 t. Reaksjonsblandingen inneholdende det ønskede peptidet (9) NH2C0-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 ble utsatt for HPLC rensing.

Peptid (11) ble preparert ved sukssesiv kobling av to Fmoc-aminosyrer ved fremgangsmåten indikert i fast-fase syntese prosedyre IV.

150 mg TFATrp-Ala-Val-Gly-His(Z)Leu-psi- Phe-BHA harpiks (3/1/res) ble nøytralisert med 10$ TEA, vasket med CH2C12 og DMF og koblet med Fmoc-Glu(OBut) for å tilveiebringe Fmoc-Glu(0But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA harpiks (3/5/11). Fmoc-D-Trp-Glu(OBut )-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z )-Leu-psi-Phe-BHA harpiks ble oppnådd etter avspaltning med 50& piperidin og og kobling med Fmoc-D-Trp. But gruppen ble fjernet fra den Fmoc beskyttede pept idharpiksen ved behandling med 10$ TFA i DCM inneholdende 2$ merkaptoetanol i 30 min. MeNH2 ble boblet gjennom et sjikt av 200 mg Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)Leu-psi-Phe-BHA harpiks (3/6/11) i 5 ml DMF ved 0°C i 5 min., 0,2 ml 20$ DIC i DCM ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0"C i 2 t. Harpiksen ble deretter vasket med DCM og Fmoc-gruppen ble fjernet med piperidin. Etter behandling med HF og anisol ble peptidet (11) D-Trp-Glu(MeNH)Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-PheNH2 utsatt for rensing med HPLC.

Retensjonstidene til peptidene i dette eksempelet er angitt i følgende tabell.

Analytiske HPLC data

Forholdet mellom aminosyrene vist ved aminosyreanalyser var som ventet. For eksempel var forholdene av peptid (10) D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 1,15:0.96:0,95:1:01:-0,94:1,97 (Glu:Gly:Ala:Val:His:Trp) og hadde en topp med retensjonstid på 44,56 min. Forholdene til peptid (13) var 1,04:0,98:1,02:1,00:1,03:0,94 ( Glu:Gly:Ala:Val:His:Trp) og en absorpsjonstopp med retensjonstid 44,56 Leu-psi-Phe. Tpi i peptid (13) ble ikke detektert.

Eksempel 4

Peptid nr.

Leu-psi-Tpi-BHA harpiksen blir dannet ved omsetning av Boc-Leu-psi-Trp-BHA harpiksen med formaldehyd i henhold til prosedyrene som følger: Boc-Leu-psi-Trp-BHA harpiks blir oppnådd fra l,0g BHA harpiks (0,9 mmol NH2/g) med sukssesiv kobling av Boc-Trp og Boc-Leu-CHO ved fremgangsmåten angitt i prosedyre I og prosedyre II. 10 ml DMF inneholdende 1$ eddiksyre blir tilsatt til ovennevnte peptidharpiks og deretter omsatt med 1 ml 10$ formaldehyd ved romtemperatur i 60 min. og vasket med DMF, MeoH og DCM.

Alle polypeptidene i dette eksempelet inneholder et felles fragment Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2.Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z )-Leu-psi-Tpi-BHA harpiks (4/1/res) ble dannet trinn for trinn på Leu-Psi-Tpi.BHA harpiksen ved sukssesiv kobling av Boc-His(Z) (prosedyre I), Boc-Gly (prosedyre III), Boc-Val, Boc-Ala og Boc-Trp (prosedyre I).

En 150 mg del av overnevnte mellompeptidharpiks blir utsatt for to ytterligere koblinger med prosedyrene beskrevet i prosedyre I for kobling av Hea, D-pGlu, Boc-Glu(OMe), Boc-Glu(OBz), Boc-D-Phe, Boc-D-Trp, Boc-His(Bz), Boc-Tpi, Bod-D-Tpi, AC-Tpi og Hna-Tpi og ved prosedyre III for Boc-Gln for å tilveiebringe de endelige peptidharpiksene.

Kobling av Boc-Gln og Hea sekvensielt til overnevnte heptapeptidharpiks (4/1/res) gir:

Sekvensiell tilsetning av Boc-Gln og D-pGlu til heptapeptidharpiksen (4/1/res) gir:

Sukssesiv kobling av Boc-Glu(OBz) og Boc-Phe til ovennevnte forpeptidharpiks (4/1/res) gir: Kobling av Boc-Gln og Boc-D-Phe til heptapeptidharpiksen (4/1/res) gir

4/2/18. Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z )-Leu-psi-Tpi-BHA harpiks blir dannet ved kobling av Boc-Gln og Boc-D-Trp til heptapeptid harpiks

(4/1/res).

4/2/19. Boc-D-Trp-His(Bz )-Trp-Ala-Vall-Gly-His(Z )-Leu-psi-Tpi-BHA harpiks blir dannet ved kobling av

Boc-His(Bz) og Boc-D-Trp til heptapeptidharpiks (4/1/res).

4/2/21. Boc-D-Trp-Glu(OMe )-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA harpiks blir dannet ved kobling av Boc-Gln(MeO) og Boc-Tpi til heptapeptidharpiks (471/res).

4/2/22 . Boc-Tpi-Gln-rp-Ala-Val-Gly-His(Z )-Leu-psi-Tpi-BHA harpiks blir dannet ved kobling av Boc-Gln og Boc-Tpi til heptapeptidharpiks (471/res).

4/2/23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Z)-Leu-psi-Tpi-BHA harpiks blir dannet ved kobling av Boc-Gln og Ac-Tpi til heptapeptidharpiks (4/1/res).

4/2/25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA harpiks blir dannet ved kobling av Boc-Gln og Hna-Tpi til heptapeptidharpiks (4/1/res).

4/2/26 . Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z )-Leu-psi-Tpi-BHA harpiks blir dannet ved kobling av Boc-Glu og Boc-D-Tpi til heptapeptidharpiks (4/1/res).

Etter fjerning av Boc-gruppen og behandling av overnevnte med HF og anisol som beskrevet i eksempel (2) og (3) blir følgende peptider oppnådd:

Peptid nr.

Peptid nr.

20 mg Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 (4/3/16), 5 mg dlfenylfosforylazld og 10 mg KHCO3 i 0,5 ml DMF ble omrørt ved 0°C i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble utsatt for rensing med HPLC ved anvendelse av oppløsningsmiddelsystemet 40-70$ B i 60 min. for å tilveiebringe: Peptid (16). Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 omtrent 4,5 mg. Med renhet på (>95$) ved analytisk HPLC ved anvendelse av oppløsningsmiddelsystemet 25-65$ i 40 min.

En blanding av 40 mg råpolypeptid 22 Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2, 20 ul TEA i 0,5 ml DMF og 20 mg KOCN i 100 ul H20 ble omrørt ved 0°C. Få minutter senere ble 1++ ul AcOH droppet inn i overnevnte blanding og reaksjonen ble omrørt ved 0°C i 1 t. Reaksjonsblandingen inneholdende det ønskede oligo(peptidet): Peptid (24. NH2C0-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHg ble utsatt for rensing med HPLC.

Fmoc-D-Trp-Gln(0But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-harpiks (4/2/res) ble dannet ved sukssesiv kobling av Fmoc-Glu(OBut) og Fmoc-D-Trp to Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-harpiks (4/1 res) ifølge fremgangsmåten angitt i preosedyre IV. Etter fjerning av But gruppe med 10$ TFA i DCM inneholdende 2$ 2-merkaptoetanol i 30 min., blir petid-harpiksen omsatt med MeHH2 og DIC ved fremgangsmåtene beskrevet i eksempel (3) for peptidharpiks (3/6/11) for å oppnå Fmoc-D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)Leu-psi-Tpi-BHA harpiks (4/3/res). Etter fjerning av Fmoc-gruppen med piperidin ble peptidharpiksen behandlet med HF (5 ml) og anisol (0,25 ml) ved 0°C i 1 time for å tilveiebringe

peptid (20) D-Trp-Glu-(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2.

Retensjonstiden til peptidene i dette eksempelet er angitt ifølgende tabell.

Analytisk HPLC data

Aminosyreanalyse av peptidene i dette eksempelet ga de ventede sammensetningene. For eksempel hadde D-Phe-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 (1?) forholdene 1,04:0,99:0,96:-1,00:0,94:0,99:1,06 (Glu:Gly:Ala:Val:Phe:His:Trp) Tpi i peptid nr. 17, 24 og 26 kom ikke frem i aminosyreanalysen.

Eksempel 5

Peptid nr.

Peptidene i dette eksempelet inneholder et felles fragment Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2 eller Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Trp(For)-NH2• Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-BHA harpiks (5/1/res) blir dannet på 1,0 g BHA harpiks (0,9 mmol NH2/g) ved sukssesiv kobling med utførelse av fast fase syntese som beskrevet i eksempel (2) med unntagelse av at Boc-Trp(For) istedenfor Boc-Ley ved første kobling. 250 mg deler av overnevnte peptidharpikser blir anvendt for å oppnå syntesen av følgende fire beskyttede peptidharpikser ved den endelige koblingen med henholdsvis MPP, Boc-D-Phe, Boc-D-Trp eller Boc-D-Tpi, ifølge prosedyren beskrevet i prosedyre I.

Etter fjerning av Boc-gruppen med 50% TFA i DCM inneholdende 5% merkaptoetanol og 5% anisol ble halvparten av hver av de ovennevnte peptidharpiksene behandlet med HF (5 ml) og anisol (0,25 ml) ved 0°C i 1 time for å tilveiebringe peptider som følger:

Peptid nr.

Den gjenværende halvdelen av hver peptidharpiks ble behandlet med HF inneholdende 5% anisol og 5% dimerkaptoetanol ved 0°C ilt. for å tilveiebringen peptider som følger:

Peptid nr.

Peptidene ble renset med HPLC og retensjonstidene er angitt i følgende tabell:

Analytiske av HPLC data

Data fra aminosyreanalyse for peptidene i dette eksempelet var som ventet. For eksempel har (28) aminosyre forhold på 0,98:0,92.1,03:0,97:0,98:1,09 (Gly:Ala:Val:Phe:His:Trp ). Tpi i (30) og (34) ble ikke vist

Eksempel 6

Peptid nr.

<;> Boc-Trp-OCHg-harpiksen blir anvendt som utgangsmateriale som blir dannet ved følgende prosedyre: en blanding av CICHg-harpiks (l,0g, 0,7 mmol Cl/g), Boc-Trp (2,0 Trp mmol) og KF

(4 mmol) i 20 ml DMF ble omrørt ved 70-80°C 1 4 timer. Boc-Trp-0CH2-harpiksen ble deretter vasket to ganger hver med MeOH, H20, MeOH, DMF og DCM. Boc-Leu-psi-Trp-OCH2-harpiks blir oppnådd ved kobling av Boc-Leu-CHO til Trp-OCH2-harpiks med prosedyre II. Boc-Leu-psi-Tpi-OCH2-harpiks blir oppnådd ved omsetning av Boc-Leu-psi-Trp-0CH2-harpiks med formaldehyd ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel (4). ved sukssesiv kobling av Boc-His(Z), Boc-Gly-Boc, Val-Boc-Åla-Boc-Trp og Boc-Gln med prosedyrer for fast fase syntese beskrevet som før, ble 1,60 g Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z )-Leu-psi-Tpi-OCH2-harpiks (6/1/res) oppnådd. En del av overnevnte forpeptidharpiks ble anvendt for å tilveiebringe Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-0CH2-harpiks (6/2/35) ved kobling av Boc-Tpi. En annen alikvot av poeptidharpiksen ble anvendt for å tilveiebringe Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)Leu-psi-Tpi-0CH2-harpiks 6/2/36 ved kobling av Boc-D-Tpi .

Etter fjerning av Boc-gruppen med 50$ TFA i DEM inneholdende 5$ merkaptoetanol og 5$ anisol ble transforestringsprosedyren utført som følger: 0,5g Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-0CH2-harpiks (6/3/35) metanol (15 ml) DMF (15 ml) og diisopropyletylamin (3 ml) ble tilsatt og blandingen omrørt ved romtemperatur i 3 dager. Harpiksen ble vasket med DMF (3 ganger) og metanol (3 ganger). Filtratet og vaskingene ble kombinert og avdampet ved roterende avdampning i vakuum for å fjerne oppløsningsmidlene. Etter behandling HF og anisol ble 123 mg rå

oppnådd.

ble oppnådd ved samme prosedyre, men begynnende med (6/2/36).

En blanding av Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-TpiOCH3 (35) (40 mg), 20 ul TEA i 0,5 ml DMF og 50 mg KOCN i 100 ul H20 ble omrørt ved 0°C og noen minutter senere ble 50 ul AcOH tilsatt til blandingen og omsatt ved 0°C i 1 t. Blandingen blir deretter utsatt for rensing for å gi En blanding av D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-TpiOCH3 (36) og en 1:2 v/v oppløsning av metylamin i metnaol (2 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 16 t. Etter avdampning ved roterende avdampning i vakuum ble residie materialet frysetørket og behandlet med HF og anisol. Produktet var

som ble utsatt for rensing ved HPLC.

En annen del av D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-OCHg-harpiksen (6/2/35) ble behandlet med HF og anisol for å gi :

En blanding av peptid 39 (40 mg), (Boc)20 (20 mg) og TEA (10 ul) i 0,5 DMF ble omrørt ved 0°C i 4 t og lyofilisert. Etter vasking med eter ble resten, HOBt (10 mg) og N2H3C0NH2 (20 mg) omsatt med DCI (100 ul 20$ DCI i DCM) ved 0°C over natt, DMF ble avdampet, vasket med eter og Boc-gruppen ble fjernet med 50$ TFA inneholdende 5$ merkaptoetanol og anisol for å gi rå

Claims (6)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive polypeptider med formel I: hvor Q er NHg eller OQ<1> hvor Q<1> er hydrogen, C^_^g-alkyl, fenyl eller fenyl-C7_iø-alkyl > X er hydrogen eller en enkelt binding koblet til A<2>, acylresidiet til en organisk syre eller en gruppe med formel R<1>CO- hvor

(1) R<1> er hydrogen, C^_^Q-alkyl, fenyl eller fenyl-Cy_^Q<-> alkyl; hvor R<2> er hydrogen, C^-^^o-3-1^1» fenyl eller £7- 10? enyl-Cy.^Q-alkyl, R<3> er hydrogen eller C^_io alkyl; (b) R<4->0-CO- hvor R4 er C-^Qalkyl, fenyl eller fenyl-C7_10-alkyl A<1> er D-, L- eller DL- pGlu, Nal, Phe, Thi , Tyr, Tpi, Hea, Hpp,. Mpp, Trp eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere ledd valgt fra gruppen bestående av halogen, NOgt NH2, OH, C^s-alkyl og C1_3-alkoksy hvor halogen er fluor, klor og brom, A<2> er Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(X) eller en gruppe med formel Dpa (X), Asp (Y), Glu[-> og Glu (Y) hvor X er som ovenfor R<5> er hydrogen, Ci_3 alkyl eller fenyl; R<5> er hydrogen eller C1_3alkyl; R<7> er hydrogen, C1_3alkyl eller -NHC0NH2 og [-] er en enkelt binding som kobler sidekarboksylgruppen med alfaaminogruppen til A<1> hvor X er en enkeltbinding, A<3> er Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere ledd valgt fra gruppen bestående av halogen, N02, NH2, OH, C1_3alkyl og 3-alkoksy hvor halogen er fluor, klor og brom; A<4> er Ala, MeAla eller Gin; A<5> er Val eller MeVal; A<6> er Gly, Phe eller D-Ala; A<7> er His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) eller Pal; A» er en redusert isoster av Leu eller Phe; A<9> er Leu, Phe, Tpi, Trp eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere ledd valgt fra gruppen bestående av halogen, N02, NH2, OH, C^_3alkyl og C^_3alkoksy hvor halogen er fluor, klor og brom; forutsatt at når A<9> er Leu eller Phe er A<1> forskjellig fra D-Nal eller DL-Phe og hvor A<1> er D-Nal eller DL-Phe er A<9> forskjellig fra Leu eller Phe og saltene derav, karakterisert ved farmasøytisk akseptable syrer ved fragment kondensasjon av de tilsvarende peptidfragmentene som vanlig innen peptidkjemi eller ved trinnvis syntese som er vanlig i peptidkjemien og når nødvendig blir de på denne måten oppnådde peptidene acylert og/eller omdannet tiol farmasøytisk akseptable syresalter.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid ifølge krav 1, hvor hvor Q er NHg eller OQ<1> hvor Q<1> er hydrogen, C^^g-alkyl, fenyl eller C7_ig-fenyl-alkyl; X er hydrogen, en enkeltbinding som kobler alfa-aminogruppen A<1> til sidekarboksylgruppen, hvor til stede, A<2>, eller en gruppe med formel R^-CO- hvor R<1> blir valgt fra gruppene bestående av: (a) hydrogen, C]__lg-alkyl, fenyl eller C^.<ig>-<f>enyl- alkyl; hvor R<2> er hydrogen, C^_<1>Q-alkyl, fenyl eller C7_^0-<fe>nyl-alkyl , R3 er hydrogen eller Ci- ±q alkyl; og (c) R4 -0- hvor R"1 er C^_^g-alkyl , fenyl eller c7-10"fenyl-alkyl. A<1> er L-, D- eller DL-Tpi, A<2> er Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) eller en gruppe med formel Asp (Y), Glu[-] og Glu (Y); hvori R<5> er hydrogen, C^_3 alkyl eller fenyl; R<5> er hydrogen eller Cj^alkyl; R<7> er hydrogen, C1_ 3 alkyl eller -NHC0NH2; og [-] er en enkeltbinding som kobler sidekarboksylgruppen, når til stede, av A<2> med alfa-aminogruppen til A<1> hvor X er en enkeltbinding; A<3> er Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere ledd valgt fra gruppen bestående av halogen, NOg, NHg, OH, C^_3 alkyl og C^_ 3-alkoksy hvor halogen er fluor, klor og brom; A<4> er Ala, MeAla eller Gin; A<5> er Val eller MeVal; A<6> er Gly, Phe eller D-Ala; A<7> er His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) eller Pal; A» er en redusert isoster av Leu eller Phe; A<9> er en D-, L- eller DL-aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av Leu, Phe, Trp eller Trp(For); og salter derav, karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid ifølge krav 1, hvor det har formelen D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NHg, karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

4 . Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid ifølge krav 1, hvor det har formelen D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH^karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

5 . Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid ifølge krav 1, hvor det har formelen Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHg, karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid ifølge krav 1, hvor det har formelen D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHg, karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.