NO310223B1

NO310223B1 - Anvendelse av kitosan og et polysakkarid i forbindelse med regenerering av hardt vev, samt implantat

Info

Publication number: NO310223B1
Application number: NO19970215A
Authority: NO
Inventors: Hans-Arne Hansson; Gunilla Johansson-Ruden; Olle Larm
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1994-07-19
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2001-06-11
Also published as: PL181764B1; JPH10502664A; KR970704459A; ES2178675T3; BR9508322A; AU3089595A; KR100395724B1; CZ14097A3; HU9700160D0; AU696183B2; EP0771206A1; SE9402528D0; CA2194462C; NO970215D0; RU2153877C2; US5894070A; DE69527203T2; FI970202A; MX9700443A; NZ290219A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av kitosan og et polysakkarid i forbindelse med stimulering eller akselerering av regenerering av hardt vev i tilknytning til såkalt osseointegrasjon, for eksempel den effekt som ønskes ved implantering av fremmede implantater i hardt vev, spesielt benvev. Ved foreliggende anvendelse kan det også oppnås utvikling av nytt ben i forbindelse med benvevdefekter eller ellers behov for benvev. Oppfinnelsen angår også implantat for integrasjon i hardt vev.

Implantater som er beregnet for forankring i hardt vev, spesielt benvev, har fått en stadig økende anvendelse i odontologi, ortopedi, neurokirurgi, håndkirurgi og plastisk og rekonstruktiv kirurgi. Langvarig forankring av implantater i ben har blitt oppnådd med titan og det antas at titanbaserte materialer også i fremtiden vil bli benyttet i stor utstrekning som det materiale som velges for implantater og proteser.

Et klinisk problem i forbindelse med såkalt osseointegrasjon er det faktum at implantatet ikke kan utsettes for en belastning før tilstrekkelig benforankring har blitt oppnådd, hvilket kan kreve så lang tid som 6-9 måneder. Klinisk er det derfor ytterst viktig å akselerere helingsprosessen ved tilveiebringelse av stimulert bendannelse i forbindelse med implantatene. Det er også et behov for å regenerere ben for å danne bro over defekter eller seksjoner der benresorpsjon har funnet sted i for eksempel tannløse deler i kjeven eller der benvev har gått tapt på grunn av for eksempel traumer, tumor eller kirurgi.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt anvendelse av kitosan og et polysakkarid imobilisert dertil valgt fra heparin, heparansulfat, kondroitinsulfater og dekstransulfat for fremstilling av et middel som kan gi stimulert regenerering av hardt vev.

Fordelaktige og foretrukne trekk ved denne anvendelse fremgår fra medfølgende krav 2-11.

Ved denne anvendelsen oppnås stimulering av vekst av celler i hardt vev, for eksempel benceller, slik at volumet av hardt vev vil øke. Anvendelsen vil også kunne gi dannelse av regenerert benvev av hovedsakelig lamellær, kompakt type, mens graden av dannelse av arrvev vil bli minimalisert.

Videre kan det benyttede middelet i forbindelse med implantater i hardt vev gi stimulert regenerering av hardt vev, for eksempel benvev.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således også tilveiebragt et implantat beregnet for integrasjon i hardt vev, kjennetegnet ved at i det minste den delen av implantatet som skal integreres er belagt med et middel som stimulerer regenerering av hardt vev og som omfatter kitosan og et polysakkarid immobilisert dertil valgt fra heparin, heparansulfat, kondroitinsulfater og dekstransulfat.

Det er foretrukket at implantatet innbefatter titan.

Polysakkaridet kan immobiliseres til kitosanmatrisen på flere måter, for eksempel ved ioniske bindinger, ved kovalent binding enten flerpunkt- eller endepunktbinding, eller ved mekanisk fiksering i kitosanmatrisen i forbindelse med utfelling av kitosanen oppløsning. Ioniske bindinger og kovalente bindinger er foretrukne immobiliseirngsformer.

Det benyttede hardvev-stimulerende middel kan være til stede i forskjellige fysikalske former, for eksempel som en membran, et pulver, et gel, kuler eller en oppløsning. I det tilfellet det dreier seg om et implantat kan den delen av implantatet som skal integreres i hardt vev dyppes for påføring av midlet på implantatet. Midlet kan naturligvis også tilføres til det harde vevet per se, for eksempel i en kavitet tilveiebragt i benvev.

Materialet som foretrekkes for implanteringen er titan, men andre implantatmaterialer kan også anvendes.

Kitosan er et lineært 1,4-bundet polysakkarid oppbygget fra B-D-glukoseaminenheter. Kitosanen fremstilles ved N-deacetylering av kitin, en polymer som danner skallet på

blant annet insekter og skalldyr. Kommersielt blir kitin utvunnet fra krabbe- og rekeskall som utgjør avfallsprodukter fra fiskeindustrien. Ved regulering av alkalibehandlingen av kitiner kan det fremstilles kitosaner av varierende grad av N-acetylering. Ved behandling av kitin med konsentrert alkali, vanligvis natriumhydroksid, finner således N-deacetylering sted, dvs. acetamidogrupper omdannes til aminogrupper til dannelse av kitosan.

De fysikalske egenskapene til kitosan som påvirker dens brukbarhet avhenger av graden av N-acetylering, molekylvekten og homogeniteten. Kitosan er bionedbrytbar, både av kitinase i fordøyelsessystemet og av lysozym og andre enzymer i kroppen.

I forbindelse med anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er det foretrukket at kitosanen har en grad av N-acetylering på høyst ca. 90% og fortrinnsvis høyst ca. 50%. Det er særlig foretrukket at graden av N-acetylering er mindre enn ca. 25%.

Det foretrukne polysakkaridet for immobilisering til kitosanmatrisen er heparin eller heparansulfat. En spesiell teknikk for kovalent kobling av heparin til matriser inneholdende aminogrupper er beskrevet i US-patent 4.613.665.

For utførelse av stimulering og/eller akselerering av regenerering av hardt vev, for eksempel i forbindelse med såkalt osseointegrasjon blir implantatet og/eller det harde vevet før implantering påført en for stimulering egnet mengde av det ifølge oppfinnelsen benyttede middel. Osseointegrasjon er den optimale formen for langvarig forankring av et implantat av ikke-autologe og forskjellige fremmede materialer i hardt vev, spesielt benvev.

Midlet kan påføres i form av et pulver, en oppløsning, en gel, kulere, en film eller en membran. Midlet kan alternativt påføres ved dypping av den delen av implantatet som er beregnet for å bli integrert i hardt vev, i en oppløsning av de nødvendige bestanddelene kitosan og et polysakkarid immobilisert dertil.

Eksempler på foretrukne utførelser

Foreliggende oppfinnelse vil i det følgende bli illustrert ved hjelp av eksempler. I disse refererer prosent- og delangivelser til vekt dersom ikke annet er angitt.

Eksempel 1

Belegging av en titanskrue med kitosan

Titanskruer neddykkes i en 2% eddiksyreoppløsning av kitosan (1% vekt/vol) og får forbli i oppløsningen i 15 min. Kitosanen er Sea Cure 313, Pronova Biopolymer, 15% N-acetylering. De behandlede titanskruene blir deretter tørket i et oppvarrningskammer i 16 timer ved 70°C og deretter nøytralisert i 1 M NaOH og gjentatte ganger skyllet med destillert vann og på nytt tørket i et oppvarrningskammer. Skruene pakkes i en pakning av typen "riv åpen" og steriliseres med etylenoksid.

Eksempel 2

Titanskruer med ionisk bundet heparin

Skruer belagt med kitosan ifølge eksempel 1 overføres til en oppløsning bestående av 125 mg heparin (svineslimhinne, Kabivitrum) i 500 ml destillert vann hvor de får forbli i ca. 16 timer, hvoretter de skylles i destillert vann og tørkes ved romtemperatur. Skruene pakkes i en pakning av typen "riv åpen" og steriliseres med etylenoksid. Mengden av immobilisert heparin er ca. 2 ug/cm<2>.

Eksempel 3

Titanskruer med kovalent bundet heparin ( endepunktfesting)

Heparin oppløses i vann (300 ml). Oppløsningen avkjøles til 0°C i isvann og holdes i kald tilstand. Først tilsettes natriumnitritt (NaN03, 10 mg) og deretter eddiksyre (2 ml) til oppløsningen under omrøring. Reaksjonsblandingen holdes ved 0°C i 2 timer, dialyseres og frysetørkes. Utbyttet er 0,7 g.

Titanskruer belagt med kitosan ifølge eksempel 1 overføres til en oppløsning inneholdende 125 mg av den ovenfor nitrittnedbrutte heparin, 15 mg NaCNBH3, i 500 ml destillert vann og pH-verdien justeres til 3,9 med 0,1 M HC1. Reaksjonsblandingen holdes i 16 timer ved romtemperatur. Skruene blir deretter skyllet i destillert vann og tørket ved romtemperatur. De behandlede titanskruene pakkes i en pakning av typen "riv åpen" og steriliseres med etylenoksid. Mengden av immobilisert heparin er ca. 1,5 Hg/cm2.

Eksempel 4

Titanskruer med kovalent bundet heparin ( flerpunktsfesting^

En oppløsning av natriumperiodatoksidert natriumheparin fremstilles på følgende måte: 1 g natriumperiodat NaI04 oppløses i 200 ml destillert vann. 10 g natriumheparin tilsettes til oppløsningen og oppløsningen omrøres natten over i mørket. Den resulterende oppløsning blir etter tilsetning av 10 ml glycerol og omrøring i 2 timer dialysert mot vann. Vannet skiftes hver annen time. Dette resulterer i en oppløsning inneholdende periodatoksidert heparin i en konsentrasjon av ca. 19 mg/ml.

Titanskruer belagt med kitosan ifølge eksempel 1 overføres til en oppløsning inneholdende 125 mg av den ovenfor periodatoksiderte heparin, 15 mg NaCNBFf/j i 500 ml destillert vann. Reaksjonen utføres deretter på nøyaktig samme måte som beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 5

Fremstilling av kitosanfilm

5 g hydrokloridsalt av kitosan (50% acetyleirngsgrad, Pronova) oppløses i destillert vann (0,5 1, 1% vol/vekt). 10 ml av den oppnådde oppløsning overføres til en Petri-skål og en film av kitosan dannes ved fordampning og tørking i et oppvarrningskammer ved 70°C i 24 timer. Den oppnådde filmen blir deretter nøytralisert ved tilsetning av natriumfosfatbuffer, 0,2 M, pH 9,0. Filmen hensettes i Petri-skålen i denne bufferen ved romtemperatur i 2-4 timer, vaskes deretter 3-4 ganger med vann og får tørke.

Eksempel 6

Filmer med kovalent bundet heparin ( endepunktfesting')

Til en nøytralisert kitosanfilm fremstilt ifølge eksempel 1 tilsettes det 20 ml av en oppløsning inneholdende 125 mg nitrittnedbrutt heparin, fremstilt som i eksempel 3, oppløst i 0,5 1 vann og inneholdende 4,4 g NaCl. Til oppløsningen tilsettes 15 mg natriumcyanborhydrid. Oppløsningens pH-verdi justeres til 3,9 ved bruk av 0,5 M saltsyre eller en annen syre. Oppløsningen inneholdende kitosanfilmen hensettes ved romtemperatur i 14 timer, og den behandlede filmen vaskes deretter 3-4 ganger med vann og far tørke.

Eksempel 7

Filmer med ionisk bundet heparin

Til en nøytralisert kitosanfilm fremstilt ifølge eksempel 1 tilsettes det 20 ml av en oppløsning inneholdende 125 mg heparin oppløst i 0,5 1 vann inneholdende 4,4 g NaCl. Oppløsningen inneholdende kitosanfilmen hensettes ved romtemperatur i 14 timer og den behandlede filmen vaskes deretter 3-4 ganger med vann og får tørke. Den fremstilte filmen kan males til et pulver for bruk ved osseointegrasjon ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 8

Biologisk test

Som testdyr anvendes det voksne kaniner som bedøves og prepareres for operasjon under sterile betingelser, idet hår fjernes i kaninens kneområde.

Det foretas et distalt hudsnitt i kneleddet av en lengde på 35-40 mm mot den tibia-proksimale delen av epifysebruskområdet. Periost skjæres tvers over og under avkjøling ved hjelp av en kontinuerlig tilført steril, bufret saltoppløsning blir det ved en lav rotasjonshastighet boret et hull gjennom det kompakte benet opp til margkaviteten ved bruk av et 3,5 mm bor. Deretter blir det ved 4 mm distalt innskrudd en lang titanskrue med et sekskantet hode og ved 6 mm distalt en annen titanskrue, begge med en diameter på 3,5 mm. Facia og hudsår syes ved bruk av enkeltsuturer. I disse forsøkene anvendes det i tillegg til titanskruer behandlet ifølge eksemplene 1-3 også ubehandlede titanskruer.

Etter 4 og 12 uker, respektivt, blir kaninene igjen bedøvet. Hår skjæres bort i kneområdet og hudinnsnitt utføres distalt i forhold til kneleddet mot tibia. Skruene dissekeres og identifiseres, og utskruingsmomentet for de proksimale skruene bestemmes. De distale skruene prepareres for lysmikroskopi med implantatet værende tilbake i benet in situ.

Eksempel 9

Titanpulver med eller uten heparinbelegg

Beleggingen av titanpulver med kitosan utføres i det vesentlige som beskrevet i eksempel 1 og immobiliseringen utføres som beskrevet i eksempel 3.

Fibula på hvert bakben eksponeres og dens muskelvev løsnes langs midten på benet i en lengde på ca. 10 mm. Et 6 mm langt segment av den eksponerte fibula fjernes, både ben og dets periostium, og defekten mellom benendene fylles med titanpulver. Et membranfilter fremstilt av PTFE vikles rundt for å danne bro over defekten og for å hindre granulasjonsvev i å invadere området. Titanpulver belagt med heparin anbringes på en side og på den andre siden ikke-belagt titanpulver. Sårene blir deretter lukket. Rottene får bevege seg uhindret i 3 uker før en annen undersøkelse og avlivning. Undersøkelse av defektene i fibula på hver side avslører at ben, kanselløst og lamellært, danner bro over begge defektene. Den mest omfattende bendannelsen befinner seg imidlertid ved og langs det hepariniserte titanpulveret. Videre blir det detektert mer lamellært, dvs. velorganisert ben, i det hepariniserte titanpulveret.

Titanpulver belagt med heparin som beskrevet ovenfor stimulerer således ny dannelse av ben selv i fravær av periosteum.

Eksempel 10

Osteogen aktivitet for ionisk heparinisert kitosanmembran bestemt ved fibulaspalte-brodannelsesteknikken

Fibula på hvert bakben eksponeres på bedøvede rotter og dens muskelvev løsnes langs benets midtre del i en lengde på ca. 10 mm. Et 6 mm langt segment av den eksponerte fibula fjernes, både benet og dets periostium, og defekten mellom benendene omvikles med en kitosanfilm.

På den venstre siden anbringes det en kitosanmembran fremstilt som i eksempel 5 (kitosan med 15% acetylering) og på den høyre fibuladefekten anbringes det en heparinisert kitosanmembran fremstilt som i eksempel 7 (kitosan med 15% acetylering).

For å unngå at røret, som skapes av membranene og broen over 6 mm spalten mellom benendene, kollapser, så anbringes det små benfragmenter langs spalten.

Ved undersøkelse etter 3 uker kunne det vises en mer fremtredende dannelse av benmatrise og av ben i begge dyr på den høyre siden, dvs. den med en heparinisert kitosanfilm.

Eksempel 11

Osteogen aktivitet for heparinisert kitosanmembran bestemt ved bendannelse i et hull i calvarium

Det er fastslått at dersom defekter som overskrider visse dimensjoner skapes i ben, så blir slike defekter helet ved dannelse av en fibrøs arrvevmembran som danner bro over defektene i benet. Den kritiske størrelsen for huller i calvarium i voksne rotter er 8 mm, dvs. hull på 8 mm eller av større diameter vil ikke bli lukket av benvev.

Et paramedialt hudinnsnitt foretas på rotter fra det nasofrontale området til den ytre nakkeknuten. Huden og de underliggende vev, inkludert mesteparten av den temporale muskelen på hver side, løsnes. En spesielt fremstilt trepan benyttes for å danne et 8 mm hull i skallen bilateralt. Det utvises omhyggelig forsiktighet for å unngå skade på meninges og hjernen.

På høyre side anbringes det en kitosanmembran med ionisk bundet heparin fremstilt som i eksempel 9 på dura, flere benfragmenter anbringes på membranen og en ytterligere identisk membran anbringes på skallen. Deretter blir det på venstre side anbragt en ikke-heparinisert kitosanmembran fremstilt som i eksempel 5 og på samme måte med benfragmenter i mellomrommet. Deretter blir galea og huden lukket.

Etter 3 uker blir rottene bedøvet og skallen undersøkt. Mer osteoid og nytt benvev viste seg å dekke defekten på den høyre siden sammenlignet med den venstre siden. Det er i tillegg mindre fremtredende inflammatorisk reaksjon ved de hepariniserte kitosanmembranene.

Eksempel 12

Fremstilling av kitosankuler dekket med dekstransulfat eller heparin eller kondroitin- 4-sulfat

Vandige oppløsninger av kitosan (2% vekt/vol, 18% acetylert) tilsettes dråpevis med en sprøyte til en oppløsning av dekstransulfat eller heparin eller kondroitin-4-sulfat (0,1% vekt/vol) i tripolyfosfatbuffer. De resulterende kulene utvinnes på et glassfilter og skylles med vann (11) og tørkes ved 30°C natten over.

Eksempel 13

Osteogen aktivitet for kitosankuler bestemt ved bendannelse etter subperiostal avsetning på skallen

Anbringelse av en forbindelse som skulle testes med henblikk på osteogen aktivitet under skallens periostium er en kjent og etablert metode.

Kuler fremstilt av kitosan og heparin, kitosan belagt med dekstransulfat og kitosan belagt med kondroitin-4-sulfat, paret som beskrevet i eksempel 12, anbringes subperiostalt på frontalbenet til voksne rotter. En slik kule anbringes på hver side. Bendannelse bestemmes etter 3 uker.

Kitosan-heparinkuler er osteogene hvilket vises ved dannelse av osteoid- og benvev på frontalbenet. De kondroitinsulfatbelagte kitosankulene og de dekstransulfatbelagte kulene viser også osteogen aktivitet. Inflammatoriske celler kunne også oppdages i variabel, vanligvis lav, grad.

Disse forsøkene viser at kitosan kombinert med visse polysakkarider utøver osteogen aktivitet.

Enda bedre stimulering av helingskvalitet kan sannsynligvis oppnås ved en kombinasjon av foreliggende oppfinnelse med vekstfaktorer. Forsøk in vitro med aFGF merket med jod 125 (sur fibroblastvekstfaktor, Bachem California) viser en betydelig høyere spesifikk binding av vekstfaktor til en heparinisert skrue sammenlignet med en ikke-heparinisert skrue. Selv om oppfinnelsen ikke er begrenset til noen spesiell teori, synes det sannsynlig at endogene vekstfaktorer blir anriket ved grenseflaten mellom implantat og omgivende ben når skruen er forsynt med et belegg av kitosan-heparin, hvilket således resulterer i stimulert benregenerering.

Oppfinnelsen er ikke begrenset til de beskrevne utførelsene, men kan anvendes på alle former av implantater som er beregnet for integrasjon i hardt vev, spesielt benvev. Oppfinnelsen kan således anvendes innenfor alle områder, for eksempel odontologi, ortopedi, neurokirurgi, håndkirurgi og plastikk- og rekonstruksjonskirurgi. Oppfinnelsen er også nyttig i forbindelse med dentalanvendelser.

Claims

1. Anvendelse av kitosan og et polysakkarid immobilisert dertil valgt fra heparin, heparansulfat, kondroitinsulfater og dekstransulfat for fremstilling av et middel som kan gi stimulert regenerering av hardt vev.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor stimulert regenerering av hardt vev oppnås i forbindelse med implantater i hardt vev, slik som benvev.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor polysakkaridet er immobilisert til kitosanen ved ioniske bindinger.

4. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor polysakkaridet er immobilisert ved hjelp av kovalente bindinger.

5. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor polysakkaridet er heparin eller heparansulfat.

6. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor midlet er i form av et pulver eller en oppløsning.

7. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, hvor midlet er i form av en gel.

8. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, hvor midlet er i form av kuler.

9. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor kitosanen har en grad av N-acetylering på høyst ca. 90% og fortrinnsvis høyst ca. 50%.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor kitosanen har en grad av N-acetylering på mindre enn ca.

25%.

11. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 2-10, hvor implantatet omfatter titan.

12. Implantat beregnet for integrasjon i hardt vev, karakterisert ved at i det minste den delen av implantatet som skal integreres er belagt med et middel som stimulerer regenerering av hardt vev og som omfatter kitosan og et polysakkarid immobilisert dertil valgt fra heparin, heparansulfat, kondroitinsulfater og dekstransulfat.

13. Implantat ifølge krav 12, karakterisert ved at det omfatter titan.