NO309427B1

NO309427B1 - Modifiserte oligodeoksyribonukleotider, preparat for behandling eller profylakse av virusinfeksjoner, anvendelse av forbindelsene til fremstilling av preparatene, samt mellomprodukter for fremstilling av forbindelsene

Info

Publication number: NO309427B1
Application number: NO940310A
Authority: NO
Inventors: Hidehiko Furukawa; Kenji Momota; Hitoshi Hotoda; Makoto Koizumi; Masakatsu Kaneko
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 2001-01-29
Also published as: CN1193013A; NZ250795A; FI940425A0; NO940310D0; KR940018394A; NZ280616A; HU222834B1; CA2114355A1; FI940425A; ES2098866T3; CZ19094A3; CN1098107A; CN1065238C; IL108467A0; IL108467A; US5807837A; AU5473194A; HUT66266A; AU670154B2; HK1016151A1

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører en serie nye, modifiserte oligodeoksyribonukleotider som har utmerket antivirus-aktivitet. Oppfinnelsen tilveiebringer også preparater hvor disse oligodeoksyribonukleotidene anvendes til behandling og profylakse av virusinfeksjoner og til inhibering av proliferasjonen av neoplasmaceller. Oppfinnelsen tilveiebringer videre anvendelse av forbindelsene til fremstilling av preparatene, samt mellomprodukter ved fremstillingen av forbindelsene. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er særlig effektive mot humant immunsviktvirus (HIV), nå generelt akseptert som årsaken til AIDS.

Det er kjent at oligodeoksyribonukleotider (anti-senseoligodeoksyribonukleotider) med en sekvens som er komple-mentær til et gen, inhiberer den funksjonelle ekspresjon av genet. Videre er det blitt rapportert at antisenseoligodeoksy-ribonukléotider som er komplementære til et virusgen eller onkogen, kan inhibere replikasjonen av viruset eller formeringen av cellen ved å inhibere funksjonen av de respektive gener [P. C. Zamecnik, M. L. Stephenson, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, (1) 280 (1978) og P. C. Zamecnik, J. Goodchild, Y.

Taguchi, Sarin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, (6) 4143

(1986)].

Det har tidligere vært antatt at oligodeoksyribonukleotidet, for at et antisenseoligodeoksyribonukleotid skulle utvise den ønskede aktivitet, burde være i stand til å danne et stabilt hybrid med mål-RNA eller -DNA in vivo, og at det følgelig burde ha en kjedelengde på 15 eller flere nukleotider. Generelt syntetiseres imidlertid oligodeoksyribonukleotider i utbytter og ved renheter som gjør det mulig å ta dem i praktisk bruk. Dessuten har antisenseoligodeoksyribonukleo-tidene ikke tilstrekkelig aktivitet til å inhibere replikasjonen av viruset eller inhibere formeringen av cellene for å muliggjøre anvendelsen av dem til behandling; dessuten er toksisiteten av disse forbindelsene mot de normale cellene til en vert forholdsvis høy.

Selv om oligodeoksyribonukleotider med en kort kjedelengde er kjent, har det tidligere vært antatt at de ville ha dårlig inhiberingsaktivitet. Som et resultat av dette, har de fleste forskerne konsentrert seg om undersøkelsen av oligodeoksyribonukleotider med lengre kjeder enn de ifølge foreliggende oppfinnelse. Selv om PCT-søknad nr. WO 88/07544 (som anses for å representere den nærmeste teknikkens stand i forhold til foreliggende oppfinnelse) således f.eks. omfatter innenfor sitt omfang oligodeoksyribonukleotider med så få som 4 baseenheter, er det i praksis klart at de eneste testede materialer er de som har betydelig større antall enheter, større enn de ifølge foreliggende oppfinnelse. Vi har nå funnet at visse modifiserte oligodeoksyribonukleotider bestående av forskjellige basesekvenser og fremstilt ved å innføre forskjellige substituenter i 5'- og/eller 3'-endene, utviser utmerket anti-AIDS-virusaktivitet, og at toksisiteten til nukleotidet mot de normale cellene til et vertsdyr er lav. Videre er det en viktig praktisk vurdering at de modifiserte oligodeoksyribonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse lett kan syntetiseres ved å bruke enkle, kjente teknikker.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en serie nye, modifiserte oligodeoksyribonukleotider.

Det er et ytterligere og mer spesifikt formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe slike modifiserte oligodeoksyribonukleotider som har evne til å inhibere replikasjonen av fremmede nukleinsyrer i normale celler, og som derfor kan brukes til behandling og profylakse av virusinfeksjoner, inkludert AIDS, og tumorer.

Et beslektet formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe preparater som inneholder forbindelsene, anvendelse av forbindelsene ved fremstilling av preparatene, og mellomprodukter for anvendelse ved fremstillingen av forbindelsene.

Oppsummering av oppfinnelsen

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er de modifiserte oligodeoksyribonukleotider med formel (1):

hvor:

R1#. R2og R3uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av hydrogenatomer, alkylgrupper med 1-4 karbonatomer, arylgrupper som definert nedenunder, og antrakinonylgrupper som er usubstituerte eller er substituert med minst én substituent som fortrinnsvis er valgt fra gruppen bestående av substituenter 1 definert nedenunder;

Z er et karbonatom eller et silisiumatom; eller

R2og R3og Z er til sammen en fluorenyl- eller xantenylgruppe;

R4er et hydrogenatom, en usubstituert alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, en substituert alkylgruppe med 1-4 karbonatomer og som er' substituert med minst én substituent fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av substituentene 2 definert nedenunder, en arylgruppe som definert nedenunder, eller en aralkylgruppe som definert nedenunder;

Ylr Y3og Y4er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av oksygenatomer, svovelatomer og grupper med formel >NH;

Y2er et oksygenatom, et svovelatom, en gruppe med formel >NH, en alkylengruppe med 1-4 karbonatomer eller en fenylengruppe;

X er en usubstituert alkylengruppe med 1-10 karbonatomer eller en alkylengruppe med 1-10 karbonatomer og som er substituert med minst én hydroksygruppe;

m og n er hver uavhengig av hverandre 0 eller et helt tall fra 1 til 10; og

B er et oligodeoksyribonukleotid med en kjedelengde på 3-9;

idet arylgruppen er en aromatisk, karbosyklisk gruppe med 6-20 ringkarbonatomer og som er usubstituert eller er substituert med minst én substituent valgt fra gruppen bestående av substituentene 1 definert nedenunder;

hvor aralkylgruppen er en alkylgruppe med 1-4 karbon-

atomer og som er substituert med minst én arylgruppe som definert ovenfor;

idet substituentene 1 er valgt fra gruppen bestående av alkylgrupper med 1-4 karbonatomer, halogenalkylgrupper med 1-4 karbonatomer, halogenatomer, nitrogrupper, cyangrupper, aminogrupper, alkoksygrupper med 1-4 karbonatomer, alkyltiogrupper med 1-4 karbonatomer, arylgrupper som definert ovenfor, aryloksygrupper hvor aryldelen er som definert ovenfor, og aralkyloksygrupper hvor aralkyldelen er som definert ovenfor, forutsatt at, når substituenten 1 er en arylgruppe eller en gruppe inneholdende en arylgruppe som er substituert med en ytterligere arylgruppe eller gruppe som inneholder en arylgruppe, at den ytterligere gruppen ikke i seg selv er substituert med en arylgruppe eller en gruppe som inneholder en arylgruppe; og

idet substituentene 2 er valgt fra gruppen bestående av aminogrupper, alkoksygrupper med 1-4 karbonatomer og halogenatomer,

eller et salt derav,

forutsatt at når Z er et karbonatom, m = 0, Yxer oksygen og Rx, R2og R3er en usubstituert eller substituert fenylgruppe, er B ikke valgt fra gruppen bestående av

CGTCACACAATA, ACGCTCAATT, AATTCACCGTG, GCTGTTGACT, ATTTTACCTCT, GGCGGTGATA, ATGAGCAC, AATTGTGC, TCATTATCA, CCGCCAGAG, GTAAAATAGTCA og ACACGCACGGTG.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et preparat for behandling eller profylakse av virusinfeksjoner, som omfatter en effektiv mengde av minst ett oligodeoksyribonukleotid, hvor oligodeoksyribonukleotidet er en forbindelse med formel (1) som definert ovenfor.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av en forbindelse med formel (1) som definert ovenfor, til fremstilling av et preparat for behandling eller profylakse av en virusinfeksjon hos et pattedyr som kan være et menneske.

Oppfinnelsen tilveiebringer også mellomprodukter for fremstilling av forbindelsene med formel (I) ifølge foreliggende oppfinnelse ved fremgangsmåter som er beskrevet nærmere nedenunder.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

De nye, modifiserte oligodeoksyribonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes normalt i en form som er fri for reaksjonsbiprodukter.

I forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hvor RlrR2eller R3er en alkylgruppe, kan disse være en alkylgruppe med rett eller forgrenet kjede som har 1-4 karbonatomer, og eksempler omfatter metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, isobutyl-, sek-butyl- og t-butylgruppene. Av disse foretrekker vi t-butylgruppen.

Når RlfR2eller R3er en arylgruppe, kan denne være en aromatisk, karbosyklisk gruppe med 6-20 ringkarbonatomer, helst 6-16 ringkarbonatomer, enda mer foretrukket 6-10 ringkarbonatomer og mest foretrukket 6 eller 10 karbonatomer, og som er usubstituert eller er substituert med minst én substituent valgt fra gruppen bestående av substituentene 1 definert og eksemplifisert nedenunder. Eksempler på de usubstituerte grupper omfatter fenyl-, 1-naftyl-, 2-naftyl-, fenantren-4-yl-, antracen-9-yl-, antracen-2-yl- og pyrenylgruppene. Av disse er de mer foretrukne grupper naftyl- og fenylgruppene, idet fenylgruppen er mest foretrukket. De substituerte grupper kan være hvilke som helst av disse gruppene og kan være substituert med én eller flere av substituentene 1 definert ovenfor og eksemplifisert nedenunder. Det er ingen bestemt begrensning på antallet substituenter, bortsett fra slike som kan skyldes antallet substituerbare stillinger (f.eks. 5 i tilfellet med fenylgruppen eller 7 i tilfellet med naftyl-gruppen), og eventuelt steriske hindringer. Vanligvis foretrekker vi imidlertid 1-5 slike substituenter, helst 1-3 og aller helst 1 eller 2 substituenter. Bestemte eksempler på substituenter 1 omfatter: alkylgrupper med 1-4 karbonatomer, slik som metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, isobutyl-, sek-butyl- og t-butylgruppene, hvorav vi foretrekker metyl- og t-butylgruppene;

halogenalkylgrupper med 1-4 karbonatomer, slik som fluormetyl-, trifluormetyl-, triklormetyl-, 2,2,2-trifluor-etyl-, 2,2,2-trikloretyl-, 2-fluoretyl-, 2-kloretyl-, 2-jod-etyl-, 3-klorpropyl- og 4-fluorbutyl- og 6-jodheksylgruppene,

hvorav vi foretrekker 2,2,2-trikloretyl- og -trifluormetyl-gruppene;

halogenatomer, slik som fluor-, klor-, brom- og jod-atomene, hvorav klor- og fluoratomene er foretrukket;

nitrogrupper, cyangrupper, aminogrupper;

alkoksygrupper med 1-4 karbonatomer, slik som metoksy-, etoksy-, propoksy-, isopropoksy-, butoksy-, isobiit-oksy-, sek-butoksy- og t-butoksygruppene, hvorav vi foretrekker metoksy- og t-butoksygruppene;

alkyltiogrupper med 1-4 karbonatomer, slik som metyltio-, etyltio-, propyltio-, isopropyltio-, butyltio-, isobutyl tio-, sek-butyltio- og t-butyltiogruppene, hvorav vi foretrekker metyltio- og t-butyltiogruppene;

arylgrupper som definert og eksemplifisert ovenfor, og helst fenylgruppen;

aryloksygrupper hvor aryldelen er som definert og eksemplifisert ovenfor, og helst fenoksygruppen;

og aralkyloksygrupper hvor aralkyldelen er som definert ovenfor, slik som benzyloksy- og dibenzyloksybenzyloksy [særlig 3,5-dibenzyloksybenzyloksygruppen].

Det bør legges merke til at, mens en arylgruppe (eller en gruppe som inneholder en arylgruppe) i seg selv kan være substituert med en ytterligere slik gruppe, er det her pålagt en grense for slik ytterligere substitusjon ved at, når substituenten 1 er en arylgruppe eller en gruppe som inneholder en arylgruppe som er substituert med en ytterligere arylgruppe eller gruppe som inneholder en arylgruppe, er den ytterligere gruppe i seg selv ikke substituert med en arylgruppe eller en gruppe som inneholder en arylgruppe.

Bestemte eksempler på slike substituerte arylgrupper omfatter 4-metylfenyl-, 4-t-butylfenyl-, 2-fenylfenyl-, 4-fenylfenyl-, 4-fluorfenyl-, 2-klorfenyl-, 4-klorfenyl-, 4-bromfenyl-, 4-jodfenyl-, 2,4-difluorfenyl-, 4-nitrofenyl-, 4-t-butoksyfenyl-, 4-metoksyfenyl-, 4-etoksyfenyl-, 3-fenoksyfenyl-, 4-fenoksyfenyl-, 2-benzyloksyfenyl-, 4-benzyloksyfenyl-, 3,4-dibenzyloksyfenyl-, 3,5-dibenzyloksyfenyl- og 3,5-bis(3,5-dibenzyloksybenzyloksy)fenylgruppene. Av de substituerte og usubstituerte arylgrupper foretrekker vi fenyl-, 4-metoksyfenyl-, 3,4-dibenzyloksyfenyl-, 3,5-dibenzyloksyfenyl- gruppen og 3,5-bis(3,5-dibenzyloksybenzyloksy)fenylgruppene.

Når Rx, R2eller R3er en antrakinonylgruppe, kan denne være usubstituert eller den kan være substituert med én eller flere av substituentene 1, definert og eksemplifisert ovenfor. Når gruppen er substituert, kan den være substituert med minst én substituent valgt fra gruppen bestående av substituenter 1 definert og eksemplifisert ovenfor. Det er ingen bestemt begrensning på antallet substituenter, bortsett fra slike som kan skyldes antallet substituerbare stillinger og eventuelt steriske hindringer. Vi foretrekker 1-5 slike substituenter, helst 1-3 substituenter og aller helst 1 substituent. Eksempler på slike grupper omfatter 9,10-antrakinon-l-yl-, 9,10-antrakinon-2-yl-, 4-metyl-9,10-antrakinon-l-yl-, 5-metoksy-9,10-antrakinon-l-yl-, 7-klor-9,10-antrakinon-l-yl-, 8-fluor-9,10-antrakinon-2-yl-, 6-etyl-9,10-antrakinon-2-yl-, 8-etoksy-9,10-antrakinon-2-yl- og 6-hydroksy-9,10-antrakinon-1-ylgruppene. Av disse foretrekker vi de usubstituerte antrakinonylgrupper.

Alternativt kan R2, R3og Z til sammen være en fluorenyl- eller xantenylgruppe, i hvilket tilfelle denne fortrinnsvis er en fluoren-9-yl- eller xanten-9-ylgruppe.

Når R4er en alkylgruppe, kan denne være hvilken som helst av de som er eksemplifisert ovenfor i forhold til Rlfetc, men kan være usubstituert eller substituert. Dersom den er substituert, er den substituert med minst én av substituentene 2 definert ovenfor. Eksempler på slike substituenter 2 omfatter aminogrupper, alkoksygrupper med 1-4 karbonatomer og halogenatomer, som kan være som eksemplifisert ovenfor i forhold til substituentene 1 ovenfor. Bestemte eksempler på slike substituerte og usubstituerte alkylgrupper omfatter metyl-, etyl-, 2-aminoetyl-, 2-metoksyetyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, isobutyl-, sek-butyl- og t-butylgruppen. Av disse foretrekker vi metyl-, etyl-, 2-aminoetyl-, 2-metoksyetyl- og propylgruppene.

Når R4er en arylgruppe, kan denne være hvilken som helst av arylgruppene eksemplifisert ovenfor i forhold til Rlretc, og kan være en substituert eller usubstituert gruppe. Eksempler på slike grupper omfatter: fenylgruppen; alkylfenyl-grupper, slik som 2-metylfenyl- eller 3-etylfenylgruppen; halogenerte fenylgrupper, slik som 2-fluorfenyl-, 2-klorfenyl-, 4-klorfenyl-, 2-bromfenyl- og 2-jodfenylgruppen; nitrofenylgrupper, slik som 2-nitrofenyl- eller 4-nitrofenylgrup-pen; alkoksyfenylgrupper, slik som 4-metoksyfenyl- eller 4-etoksyfenylgruppen; alkyltiofenylgrupper, slik som 4-metyltio-fenyl- eller 4-etyltiofenylgruppen; og naftyl-, fenantrenyl-, antracenyl- og pyrenylgruppene. Av disse foretrekker vi da usubstituerte fenyl-, halogenerte fenyl- og nitrofenylgrupper.

Når R4er en aralkylgruppe, er denne en alkylgruppe med 1-4 karbonatomer og som er substituert med minst én (og fortrinnsvis 1, 2 eller 3, helst 1) arylgrupper som kan være som definert og eksemplifisert ovenfor. Eksempler på slike grupper omfatter benzyl-, metylbenzyl-, etylbenzyl-, metoksy-benzyl-, etoksybenzyl-, fluorbenzyl-, klorbenzyl-, brombenz-yl-, klornaftylmetyl-, indenylmetyl-, fenantrenylmetyl-, antracenylmetyl-, difenylmetyl-, trifenylmetyl-, 1-fenetyl-, 2-fenetyl-, 2,2-difenyletyl-, 2,2,2-trifenyletyl-, 3,3,3-tri-fenylpropyl-, 1-naftyletyl-, 2-naftyletyl-, 1-fenylpropyl-, 2-fenylpropyl-, 3-fenylpropyl-, 1-naftylpropyl-, 2-naftylpropyl-, 3-naftylpropyl-, 1-fenylbutyl-, 2-fenylbutyl-, 3-fenylbutyl-, 4-fenylbutyl-, 1-naftylbutyl-, 2-naftylbutyl-, 3-naftylbutyl-, 4-naftylbutyl-, 1-fenylpentyl-, 2-fenylpentyl-, 3-fenylpentyl-, 4-fenylpentyl-, 5-fenylpentyl-, 1-naftylpentyl-, 2-naftylpentyl-, 3-naftylpentyl-, 4-naftylpentyl-, 5-naftylpentyl-, 1-fenylheksyl-, 2-fenylheksyl-, 3-fenylheksyl-, 4-fenylheksyl-, 5-fenylheksyl-, 6-fenylheksyl-, 1-naftylheksyl-, 2-naftylheksyl-, 3-naftylheksyl-, 4-naftylheksyl-, 5-naftylheksyl- og 6-naftylheksylgruppene. Av disse foretrekker vi en usubstituert benzyl- eller 2-fenetylgruppe.

Når Y2er en alkylengruppe, kan denne være en metylen-, etylen-, propylen-, tetrametylen- eller pentametylen-gruppe. Av disse foretrekker vi en metylengruppe.

Y1#Y3og Y4er hver fortrinnsvis et oksygenatom.

Y2er fortrinnsvis et oksygen- eller svovelatom.

Z er fortrinnsvis et karbonatom.

Når X er en rett eller forgrenet kjede som eventuelt er substituert med en hydroksygruppe, omfatter eksempler en metylen-, metylmetylen-, etylen-, propylen-, tetrametylen-, metyletylen-, 1-metyltrimetylen-, 2-metyltrimetylen-, 2-metyl- tetrametylen-, 3-metyltrimetylen-, pentametylen-, heksametylen-, heptametylen-, oktametylen-, nonametylen-, dekametyl-en-, 2-hydroksytrimetylen- eller 2-hydroksytetrametylengruppe. Av disse foretrekker vi en metylen-, metylmetylen-, etylen-eller metyletylengruppe.

De foretrukne verdier for hver av m og n er et helt tall fra 0 til 6. Vi foretrekker særlig at m er et helt tall fra 0 til 4.

Oligodeoksyribonukleotidet representert ved B, har fortrinnsvis en kjedelengde på 4-8; helst en kjedelengde på 5 eller 6. Dessuten er det foretrukket at det fjerde deoksyribo-nukleotidet fra 5'-enden er guanindeoksyribonukleotid.

De typiske, foretrukne, illustrerende oligodeoksyribonukleotider er de i den følgende "a-gruppe", og de mest foretrukne er de i den følgende "p-gruppe", hvor forkortelsene som er brukt i de følgende a- og p-grupper, har den følgende betydning:

A: adenindeoksyribonukleotid,

G: guanindeoksyribonukleotid,

C: cytosindeoksyribonukleotid,

T: tymindeoksyribonukleotid,

mC: 5-metylcytosindeoksyribonukleotid og

mG: 0<6->metylguanindeoksyribonukleotid. Uttrykket "venstre ende" betegner en 5'-ende, og uttrykket "høyre ende" betegner en 3'-ende, med det forbehold at det ikke er noen hydroksygruppe i både 5'- og 3'-endene til hvert oligodeoksyribonukleotid.

"a-gruppe": TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG,

CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, GGGCGGGGC, TAGGAGG, TGGGAGGT, TGGGCGCAG, CCG, TCGGAGG, TGmCGAGG, CTGGGAGG, TGG, TGGGAmGG, TGGGAGA, AATGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG, CGGGT, TGGGC, TGGGT.

"p-gruppe": TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG,

CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG.

En foretrukket gruppe med formel: R1R2R3Z-Y1, i 5<*->enden er eksemplifisert ved en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-bis[3, 5-(dibenzyloksy)benzyloksy]benzyloksy-, tert-butyldifenylsilyloksy-, fenylfluorenyloksy- eller fenylxantenyloksy gruppe; helst en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy- eller 3,5-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe.

En foretrukket gruppe med formel:

[P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)JBH

i 3'-enden er eksemplifisert ved et hydrogenatom, en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl-, -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforyl-, fenylfosforyl-, 4-klorfenylfosforyl-, 2-nitrofenylfosforyl-, 4-nitrofenylfosforyl-, etylfosforyl- eller -O-etyltiofosforylgruppe; helst et hydrogenatom, en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -0-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl- eller -0-(2-hydroksyetyl)-tiofosforylgruppe.

De foretrukne forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er de som har til felles at: (1) kjedelengden til B er 4-8; (2) kjedelengden til B er 5 eller 6; (3) kjedelengden til B er 4-8, og det fjerde deoksy-ribonukleotidet fra 5'-enden til B er guanindeoksyribonukleotid; (4) gruppen med formel: R1R2R3Z-Y1, i 5'-enden er en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-(dibenzyloksy ) benzyloksy-, 3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy]-benzyloksy-, tert-butyldifenylsilyloksy-, fenylfluorenyloksy-eller fenylxantenyloksygruppe; en gruppe med formel: [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)JBH, i 3'-enden er et hydrogenatom, en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl-, -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforyl-, fenylfosforyl-, 4-klorfenylfosforyl-, 2-nitrofenylfosforyl-, 4-nitrofenylfosforyl-, etylfosforyl- eller -O-etyltiofosforylgruppe; og B er TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, GGGCGGGGC, TAGGAGG, TGGGAGGT, TGGGCGCAG, CCG, TCGGAGG, TGmCGAGG, CTGGGAGG, TGG, TGGGAmGG, TGGGAGA, AATGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG, CGGGT, TGGGC eller TGGGT; (5) gruppen med formel: RjR^Z-Y^ i 5'-enden er en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-(di benzyloksy)benzyloksy-, 3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy] - benzyloksy-, tert-butyldifenylsilyloksy-, fenylfluorenyloksy-eller fenylxantenyloksygruppe; en gruppe med formel: [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]mH i 3'-enden er et hydrogenatom, en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, met-ylf osfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksy-etyl f os f oryl-, -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforyl-, fenylfosforyl-, 4-klorfenylfosforyl-, 2-nitrofenylfosforyl-, 4-nitrofenylfosforyl-, etylfosforyl- eller -O-etyltiofosforylgruppe; og B er TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG eller CGCGG; (6) gruppen med formel: R1R2R3Z-Y1, i 5'-enden er en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy] - benzyloksy-, tert-butyldifenylsilyloksy-, fenylfluorenyloksy-eller fenylxantenyloksygruppe; en gruppe med formel: [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]mH i 3' -enden er et hydrogenatom, en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl- eller -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforylgruppe; og B er TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG eller CGCGG; (7) gruppen med formel: R^RgZ-Yj^i 5'-enden er en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy- eller 3,5-(dibenzyloksyJbenzyloksygruppe; en gruppe med formel: [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]BH i 3'-enden er et hydrogenatom, en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl-, -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforyl-, fenylfosforyl-, 4-klorfenylfosforyl-, 2-nitrofenylfosforyl-, 4-nitrofenylfosforyl-, etylfosforyl- eller -O-etyltiofosforylgruppe; og B er TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG eller CGCGG; (8) gruppen med formel: R1R2R3Z-Y1, i 5'-enden er en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy- eller 3,5-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe; en gruppe med formel: [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]BH i 3' -enden er et hydrogenatom, en

metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl- eller -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforylgruppe; og B

er TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG,

TTGGGG, TGGGGG, CGGGG eller CGCGG.

Eksempler på forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i tabell 1.

I tabellen er de følgende forkortelser brukt for å betegne visse grupper:

2-Anq antrakinon-2-yl

2-Ant antracen-2-yl

9-Ant antracen-9-yl

Bdbbp 3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy] f enyl

Bu butyl

tBu t-butyl

Bz benzyl

3.4- Dbp 3,4-(dibenzyloksy)fenyl 3.5- Dbp 3,5-(dibenzyloksy)fenyl Decm dekame ty len [ - (CH2) 10 - ]

Et etyl

Ete etylen [-CH2CH2-]

Hepm heptametylen [-(CH2) 7 -]

Hexm heksametylen [-(CH2)6-]

Hpr 2-hydroksypropylen [-CH2C(OH)(CH3)-] Me metyl

Mee metylen [-CH2-]

Nonm nonametylen [ - (CH2)9- ]

Npe naftalenyl [f.eks. er 2-Npe naftalen-2-yl eller 1-Npe er naftalen-l-yl] Octm oktametylen [-(CH2) 8-]

Penm pentametylen [-(CH2) 5-]

Ph fenyl

Pha fenantrenyl [f.eks. 4-Pha er

fenantren-4-yl]

Phe 1,4-fenylen

Pr propyl

Pre propylen [-CH2CH(CH3)-] 1-Pyr pyren-1-yl

Tetm tetrametylen [-(CH2)4-] Trim trimetylen [-(CH2)3-]

I tillegg er sekvensen representert ved "B" i formel (1), identifisert ved de følgende kodetall:

Når en fluorenyl- eller xantenylgruppe er vist i tabellen, er denne videre representert ved R2, R3og Z til sammen.

Foretrukne forbindelser blant forbindelsene angitt ovenfor, er forbindelsene nr. 1-440, 454, 476, 586, 696, 806, 916, 1026, 1136, 1246, 1356, 1466, 1576, 1686, 1763, 1773, 1793, 1979, 1980, 1990-1994, 2250 og 2326-2906.

De mer foretrukne forbindelser er forbindelsene nr. 1-110, 113, 221-330, 333, 454, 1763, 1773, 1793, 1979, 1980, 1990-1994, 2250 og 2334-2906.

De mest foretrukne forbindelser er forbindelsene nr. 1, 2, 3, 4, 12, 13, 14, 15, 2555, 2556, 2557, 2558, 2566, 2567, 2568, 2569, 2665, 2666, 2667, 2668, 2676, 2677, 2678 og 2679.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være i form av salter, spesielt farmasøytisk akseptable salter med kationer. Eksempler på egnede salter omfatter uorganiske eller organiske salter, f.eks. de med alkalimetaller, slik som natrium eller kalium, jordalkalimetaller, slik som kalsium; ammoniakk; basiske aminosyrer, slik som lysin eller arginin; og slike alkylaminer som trietylamin. Foretrukne salter er alkalimetallsaltene, slik som natrium eller kalium.

Noen fremgangsmåter for fremstillingen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er illustrert ved hjelp av de følgende reaksjonsskjemaer.

Generelt kan forbindelsene med den generelle formel (1) fremstilles ved å kondensere et passende derivatisert nukleotid som er nukleotidet i 5'-enden til den ønskede forbindelse, med et beskyttet oligonukleotid som mangler et 5'-endenukleotid, hvor nukleotidene i det manglende oligonukleotid gir med 5'-endenukleotidet den korrekte nukleotidsekvens til den ønskede oligodeoksyribonukleotidforbindelse, idet det beskyttede, manglende nukleotid bindes til en polymer bærer. Vanligvis omfatter fremgangsmåten å omsette en forbindelse t^R^Z-Y'-[5'-endenukleotid] og en forbindelse [beskytter]-[manglende oligonukleotid]-linker-polymer.

Mer konkret kan det anvendes en fremgangsmåte som omfatter å kondensere en forbindelse med den følgende formel (2) og en forbindelse av typen [beskytter]-0-F-W, hvor F er det manglende oligonukleotid og W er linkeren og polymerbæreren. Under anvendelse av DMT som beskytter omfatter eksempler på forbindelser for omsetning med forbindelse (2) forbindelser med formlene: DMT-O-F-V^ (3), DMT-0-F-W2a(4a), DMT-0-F-W2b(4b), DMT-O-F-W3(5), DMT-0-F-W4a(6a), DMT-0-F-W4b(6b), DMT-O-F-W4c(6c), DMT-0-F-W4d(6d), DMT-0-F-W5a(7a) og DMT-0-F-W5b(7b), ifølge fremgangsmåte C-l, C-2 eller C-3. Reaktanten (2) som brukes i denne reaksjonen, kan passende fremstilles ved hjelp av fremgangsmåte A-I eller A-2, og reaktantene (3, 4a, 4b, 5, 6a-6d, 7a og 7b) kan passende fremstilles ved hjelp av fremgangsmåte B-l, B-2, B-3, B-4 eller B-5.

I de forskjellige forbindelsene med den generelle formel (2) er RlrR2, R3, Y1og Z som definert for den generelle formel (1); D' er en base valgt fra den følgende "5'-base-gruppe" eller den tilsvarende beskyttede base, idet basen er basen i 5'-enderesten til den effektive basesekvens (heretter betegnet som 5'-enderesten til den effektive basesekvens, eller ganske enkelt 5'-endebasen), hvor "5'-basegruppen" er adenin, guanin, cytosin, tymin eller 5-metylcytosin.

Fremgangsmåte B-l omfatter fremstillingen av en forbindelse (3) som mangler ett nukleotidfragment fra 5'-enden i den effektive sekvens, syntetisert ved å bruke regulert poreglass (heretter betegnet CPG) omfattende en linker bundet med et beskyttet nukleosid som kan anvendes for DNA-syntese av 3' - enderesten i den effektive basesekvens (heretter betegnet som et 3'-endenukleosid) og en nukleotidenhet som er tilgjengelig i handelen for et DNA-synteseapparat (heretter betegnet som en nukleotidenhet).

Fremgangsmåte B-2 omfatter fremstillingen av en forbindelse (4a) med ett nukleotidkortfragment fra 5'-enden til den effektive sekvens syntetisert ved å beskytte en ende-hydroksylgruppe i C2-C10-alkylendiol med hydroksylgrupper i endestillingene eller alkylendiolen med beskyttede hydroksyl-eller aminogrupper med en dimetoksytritylgruppe (DMT), omsette den andre hydroksylgruppen med ravsyreanhydrid for å fremstille en ravsyremonoester, binding av en karboksylgruppe i mono-esteren til CPG, fjerning av ende-DMT-gruppen og til sist omsetning av en nukleotidenhet med den CPG-bundne alkylenalkohol (4-6) i regulær sekvens på et DNA-synteseapparat; og fremstillingen av en forbindelse (4b) ved å omdanne den CPG-bundne alkylenalkohol (4-6) til 3'-endenukleosidfosfortioat båret på CPG (4-7) i henhold til konvensjonelle midler som brukes ved fremstilling av tioatnukleotid på et DNA-synteseapparat, og så omsetning med en nukleotidenhet på samme måte som ovenfor.

Fremgangsmåte B-3 omfatter fremstillingen av en forbindelse (5) med ett nukleotidkortfragment fra 5'-enden i den effektive sekvens syntetisert ved å kondensere 3'-endenukleo-sidf osf onat, som er fremstilt ved å omsette en hydroksylgruppe i 3'-stillingen i 3'-endenukleosidet med fosfonsyre, hvorved det fås en esterbinding, med en CPG-bundet etylenglykol (5-1) fremstilt ved bruk av ravsyreanhydrid i fremgangsmåte B-2, omsette med alkylamin, hvorved det fås 3'-endenukleosidfosfor-amiditt understøttet av CPG (5-4), og til sist omsetning med en nukleotidenhet i en regulær sekvens på et DNA-synteseapparat .

Fremgangsmåte B-4 omfatter fremstillingen av en kjent forbindelse (6-3) [M. Durand et al., Nucleic Acids Res., 18., 6353 (1990)3 ved å beskytte én hydroksylgruppe i heksaetylenglykol med en DMT-gruppe og omsette den andre hydroksylgruppen med et reagens for fremstilling av fosforamidittgruppe.

Deretter kan, analogt med fremgangsmåten beskrevet i fremgangsmåte B-3, CPG-bundet, DMT-beskyttet glykol (6-6) fremstilles ved å kondensere den nevnte heksaetylenglykol beskyttet med en DMT-gruppe (6-2) til CPG ved anvendelse av ravsyre.

Etter fjerning av en DMT-gruppe fra CPG-bundet, DMT-beskyttende glykol (6-6) på et DNA-synteseapparat omsettes glykolen med en nukleotidenhet, hvorved det fås den ønskede forbindelse (6a) som har ett nukleotidkortfragment fra 5'-enden til den effektive sekvens, syntetisert. Glykolen båret på CPG, som er erholdt ved fjerning av en DMT-gruppe fra CPG-bundet, DMT-beskyttet glykol (6-6) på et DNA-synteseapparat, omsettes én gang, to ganger eller tre ganger med fosforamid-ittet, etterfulgt av omsetning med en nukleotidenhet som omfatter ett nukleotidkortfragment fra 5-'enden til den nevnte, effektive basesekvens, hvorved det fås en forbindelse med hen-holdsvis formlene (6b), (6c) eller (6d).

Fremgangsmåte B-5 omfatter fremstillingen av en forbindelse (7-3) ved avbeskyttelse av en DMT-gruppe fra kommersielt tilgjengelig, beskyttet 2'-deoksynukleosid båret av CPG gjennom en linker (heretter betegnet som D"'-CPG) og omsetning med (2-cyanetoksy)-2-(2'-0-4,4'-dimetoksytrityloksyetylsul-fonyl)etoksy-N,N-diisopropylaminofosfin (7-1) rapportert av T. Horn et al., i Tetrahedron Letters, 27, 4705 (1986); fremstillingen av en forbindelse (7-5) ved avbeskyttelse av en DMT-gruppe fra forbindelsen (7-3) fremstilt ovenfor og konden-sering av den avbeskyttede forbindelse med en forbindelse (7-4) som har et aryl- eller alkylfosfat av en hydroksylgruppe i 3<1->stillingen i 3'-endenukleosidet, under anvendelse av et kondensasjonsmiddel; og fremstillingen av en forbindelse (7a) ved å omsette forbindelsen (7-5) fremstilt ovenfor med en nukleotidenhet som omfatter ett nukleotidkortfragment fra 5'-enden til den nevnte, syntetiserte, effektive sekvens.

På en lignende måte som ovenfor kan en forbindelse (7-7) fremstilles ved å omsette en forbindelse (7-3) befridd for en DMT-gruppe, med en forbindelse (7-6) som har en alkyl-eller arylfosforamidittgruppe i 3'-stillingen i 3'-endenukleosidet, og behandle analogt med syntesen av fosforsyretriester eller fosfortioattriester på et DNA-synteseapparat. Det således erholdte produkt omsettes med en nukleotidenhet i regulær sekvens, hvorved det fås en forbindelse (7a) som har ett nukleotidkortfragment fra 5'-enden til den nevnte effektive basesekvens.

Fremgangsmåte C-l omfatter fremstillingen av den ønskede forbindelse med generell formel (1) ved å omsette en forbindelse (2) med et fosfityleringsmiddel, hvorved det fås et 3'-fosfatderivat (8), omsette det således erholdte produkt med hver oligomer med formlene (3, 4a, 4b, 5, 6a-6d, 7a og 7b) båret på CPG, som er fremstilt i fremgangsmåtene B-l til B-5, etter avbeskyttelse av en DMT-gruppe, oksidasjon av det kondenserte produkt ved hjelp av et oksidasjonsmiddel, avspalting av nukleotidkjeden fra CPG og til sist fjerning av en beskyttelsesgruppe med unntak av substituentresten bundet til et karbonatom i 5-'stillingen i 5'-endenukleosidet.

Fremgangsmåte C-2 omfatter fremstillingen av den ønskede forbindelse (1) ved omsetning av en forbindelse (2) med et fosforyleringsmiddel, hvorved det fås et 3'-fosforsyre-derivat (9), kondensasjon av produktet med den nevnte forbindelse med hver av formlene: (3, 4a, 4b, 5, 6a-6d, 7a og 7b) etter avbeskyttelse av en DMT-gruppe alene, hvorved det fås en fosforsyretriesterbinding, avspalting av nukleotidkjeden fra CPG, fjerning av en beskyttelsesgruppe med unntak av substituentresten bundet til et karbonatom i 5'-stillingen i 5'-endenukleosidet; og endelig rensing ved hjelp av vanlige midler.

Fremgangsmåte C-3 omfatter fremstillingen av den ønskede forbindelse (1) ved å innføre en fosfonsyregruppe i 31 - stillingen i en forbindelse (2), hvorved det fås en forbind else (10), kondensasjon av produktet med den nevnte forbindelse med hver av formlene: (3, 4a, 4b, 5, 6a-6d, 7a og 7b) ved bruk av syrehalogenid i nærvær av en base, oksidasjon av det kondenserte produkt med et oksidasjonsmiddel, hvorved det fås en fosforsyrediesterbinding, avspalting av nukleotidet fra CPG, fjerning av en beskyttelsesgruppe bortsett fra substituentresten bundet til et karbonatom i 5'-stillingen i 5'-endenukleosidet, og endelig rensing ved hjelp av vanlige midler.

Fremgangsmåte A til fremgangsmåte C forklares nærmere på følgende måte.

I reaksjonsskjemaene oppsummert i fremgangsmåtene A til C, er RlfR2, R3, R4, Z, Ylf Y2, Y3, Y4, X, n, m og B som definert ovenfor; A1er en tritylgruppe (Tr), en monometoksy-tritylgruppe (MMT) eller en dimetoksytritylgruppe (DMT) som generelt anvendes for å beskytte en primær hydroksylgruppe i nukleosid spesifikt; og A2er en trisubstituert silylgruppe, slik som en tert-butyldimetylsilyl- (TBDMS) eller triisopro-pylsilylgruppe (TIPS); en slik trihalogenetoksykarbonylgruppe som trikloretoksykarbonylgruppe (Troe); eller en aralkyloksykarbonylgruppe, slik som en benzyloksykarbonylgruppe (Z).

D' er en base i 5'-endenukleotidet, hvor en aminogruppe er beskyttet med en acylgruppe for å syntetisere DNA for den effektive basesekvensen; D" er en nukleotidbaserest i 3'-enden; og D"' er en baserest i den eventuelle nukleotidenhet som skal anvendes i DNA-syntesen, dvs. en base valgt fra 5'-basegruppen eller den tilsvarende beskyttede base.

F er en oligonukleotiddel med ett nukleotidkortfragment fra 5'-enden til den effektive sekvens og er en basedel eller det tilsvarende oligonukleotid beskyttet med en beskyttelsesgruppe for en fosforsyredel, som generelt brukes for DNA-syntese, men som ikke inneholder noen hydroksylgruppe i 5'-stillingen i 5'-endenukleosidet, og i 3'-stillingene i 3'-endenukleosidet. V er en beskyttelsesgruppe for en fosforsyredel i tilfellet med DNA-syntese.

U er en aminogruppe i en amidittdel. Xx- W5er et fragment fra CPG til et oksygenatom i en hydroksylgruppe i 3'-stillingen i 3'-endenukleotidet i oligonukleotid (F) i den ønskede sluttforbindelse ifølge fremgangsmåten beskrevet i metode B-l til B-5. 1 er et helt tall fra 1 til 9; E er et hydrogenatom eller en eventuelt beskyttet hydroksyl- eller aminogruppe; og K er et oksygen- eller svovelatom.

R5er en metyl-, etyl-, propyl-, butyl-, fenyl-, metoksy-, etoksy-, propoksy-, butoksy-, cyanetyloksy- eller eventuelt substituert fenyloksygruppe.

Hvert av de følgende trinn er forklart nærmere nedenunder. Dersom trinnet kan utføres analogt med fremgangsmåten beskrevet i det forutgående, er den første forklart som en representant.

[Trinnene 1, 8 og 18]

I disse trinnene kan en forbindelse (2-2) hvor' en hydroksylgruppe alene i 5'-stillingen er selektivt beskyttet, fremstilles ved å omsette en forbindelse (2-1) med et hydrok-sylbeskyttende reagens i et inert oppløsningsmiddel. Når en basedel er A, G eller C, er aminogrupper omfattet i basen beskyttet ved acylering i det forutgående trinn, og beskyttel-sesreaksjonen kan utføres på en i og for seg kjent måte, f.eks. analogt med den rapporterte fremgangsmåte [J. Am. Chem. Soc, 104, 1316 (1982)]. Som aminobeskyttelsesgruppe kommer det generelt i betraktning en alifatisk lavere acyl- eller aromatisk acylgruppe. Eksempler på acylgrupper omfatter: alifatiske lavere acylgrupper, slik som en formyl-, acetyl-, pro-pionyl-, butyryl-, isobutyryl-, pentanoyl-, pivaloyl-, val-eryl- eller isovalerylgruppe; og aromatiske acylgrupper, slik som en benzoyl-, 4-acetoksybenzoyl-, 4-metoksybenzoyl-, 4-metylbenzoyl- eller 1-naftoylgruppe; fortrinnsvis i det tilfelle basedelen er A eller C, en benzoylgruppe, og i tilfellet en basedel er G, en isobutyrylgruppe.

Eksempler på foretrukne oppløsningsmidler som skal tas med: aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen eller xylen; halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen eller diklorbenzen; estere, slik som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat eller dietylkarbonat; etere, slik som dietyleter, diisopropyleter, tetrahydrofuran, dioksan, dimetoksyetan eller dietylenglykoldimetyleter; ketoner, slik som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon eller sykloheksanon; nitroforbindelser, slik som nitroetan eller nitrobenzen; nitriler, slik som acetonitril eller isobutyronitril; amider, slik som formamid, dimetylformamid (DMF), dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid eller sulfolan; alifatiske, tertiære aminer, slik som trimetylamin, trietylamin eller N-metylmorfolin; og aromatiske aminer, slik som pyridin eller pikolin; helst halogenerte hydrokarboner (særlig diklormetan) og amider (særlig DMF).

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til reagenset som brukes for beskyttelse, forutsatt at det kan brukes til spesifikk beskyttelse av en hydroksylgruppe alene i 5'-stillingen og kan fjernes under sure eller nøytrale betingelser. Eksempler på foretrukne beskyttelsesreagenser omfatter triarylmetylhalogenider, slik som tritylklorid, monometoksy-tritylklorid eller dimetoksytritylklorid.

Når beskyttelsesreagenset er et triarylmetylhalo-genid, utføres reaksjonen normalt i nærvær av en base.

Eksempler på egnede baser omfatter: heterosykliske aminer, slik som pyridin, dimetylaminopyridin eller pyrrolidinopyridin; og alifatiske, tertiære aminer, slik som trimetylamin eller trietylamin; fortrinnsvis organiske baser (særlig pyridin, dimetylaminopyridin og pyrrolidinopyridin).

Når det anvendes organiske aminer som oppløsnings-middel, er det unødvendig å bruke det andre avsuringsmiddel ettersom de organiske aminene i seg selv virker som et avsuringsmiddel .

Reaksjonstemperaturen varierer avhengig av egenskapene til utgangsmaterialet og oppløsningsmidlet som brukes, og de øvrige reaksjonsbetingelsene, men reaksjonen utføres normalt ved en temperatur fra 0°C til 150°C, fortrinnsvis 20°C til 100°C.

Den påkrevde tid for reaksjonen varierer avhengig av egenskapene til det anvendte utgangsmateriale og oppløsnings-middel, samt reaksjonstemperaturen, men reaksjonen fullføres normalt innenfor et tidsrom på 1-100 timer, fortrinnsvis 2-24 timer.

Etter fullførelse av reaksjonen kan den ønskede forbindelse isoleres fra reaksjonsblandingen, f.eks. ved å helle reaksjonsblandingen over i vann, ekstrahere med et vannublandbart oppløsningsmiddel, slik som benzen, eter eller etylacetat, og til sist destillere av oppløsningsmidlet fra ekstrakten. Det således erholdte produkt kan brukes i den påfølgende reaksjon uten ytterligere rensing, men kan, om ønsket, renses ved hjelp av vanlige midler, f.eks. forskjellig kromatografi eller rekrystallisasjon.

[Trinn 2]

I dette trinnet kan en forbindelse (2-3) fremstilles ved å omsette en forbindelse (2-2) med et hydroksylbeskyttel-sesreagens i nærvær av et inert oppløsningsmiddel.

Eksempler på foretrukne oppløsningsmidler omfatter: aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen eller xylen; halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen eller diklorbenzen; estere, slik som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat, dietylkarbonat; etere, slik som dietyleter, diisopropyleter, tetrahydrofuran, dioksan, dimetoksyetan eller dietylenglykoldimetyleter; ketoner, slik som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon eller sykloheksanon; nitroforbindelser, slik som nitroetan eller nitrobenzen; nitriler, slik som acetonitril eller isobutyronitril; amider, slik somformamid, dimetylformamid, dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid eller sulfolan; helst etere (særlig tetrahydrofuran), halogenerte hydrokarboner (særlig diklormetan), aromatiske hydrokarboner (særlig toluen) og amider (særlig DMF).

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til hydroksylbeskyttelsesreagenset som anvendes, forutsatt at beskyttelsesgruppen kan avbeskyttes i motsetning til en beskyttelsesgruppe i 5'-stillingen. Eksempler på slike beskyttelsesreagenser omfatter: silylhalogenider, slik som tert.-butyldi-metylsilylklorid eller triisopropylsilylklorid; halogenalk-oksykarbonylhalogenider, slik som trikloretoksykarbonylklorid; og aralkyloksykarbonylhalogenider, slik som benzyloksykarbon-ylklorid.

Når beskyttelsesreagenset er silylhalogenider, halo-genalkoksykarbonylhalogenider eller aralkyloksykarbonylhalo genider, utføres reaksjonen for beskyttelse normalt i nærvær av en base.

Eksempler på foretrukne baser omfatter organiske baser (særlig trietylamin, pyridin, N-metylmorfolin, DBU og imidazol).

Reaksjonstemperaturen varierer avhengig av egenskapene til reagenset, utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet, og andre reaksjonsbetingelser, men reaksjonen utføres normalt ved en temperatur fra -20°C til 150°C, fortrinnsvis -10°C til 50°C.

Den påkrevde tid for reaksjonen varierer avhengig av egenskapene til utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet som brukes, samt reaksjonstemperaturen, men reaksjonen fullføres normalt innen et tidsrom på 1-100 timer, fortrinnsvis 1-24 timer.

Etter fullførelse av reaksjonen kan den ønskede forbindelse isoleres fra reaksjonsblandingen. Et eksempel på én slik teknikk omfatter: helling av reaksjonsblandingen over i vann; ekstraksjon med et slikt vannublandbart oppløsnings-middel som benzen, eter eller etylacetat; og til sist avdestillering av oppløsningsmidlet fra ekstrakten. Det således erholdte produkt kan normalt brukes i den påfølgende reaksjon uten ytterligere rensing, men kan, om ønsket, renses ved hjelp av forskjellige kromatografi-, rekrystallisasjons- eller lignende midler.

[Trinnene 3, 11, 22 og 25]

I disse trinnene kan forbindelsene (2-4), (4-6), (6-7) og (6-9) fremstilles ved å omsette forbindelse (2-3), (4-5), (6-6) og (6-8) med et avbeskyttelsesreagens i nærvær av et inert oppløsningsmiddel for å fjerne selektivt hydroksylbeskyttelsesgruppen i 5'-stillingen.

Eksempler på foretrukne oppløsningsmidler omfatter: aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen eller xylen; halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen eller diklorbenzen; estere, slik som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat eller dietylkarbonat; etere, slik som dietyleter, diisopropyleter, tetrahydrofuran, dioksan, dimetoksyetan eller dietylenglykoldimetyleter; alkoholer, slik som metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, tert-butanol, isoamylalkohol, dietylenglykol, glyserol, oktanol, sykloheksanol eller metylcellosolv; ketoner, slik som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon eller sykloheksanon; nitroforbindelser, slik som nitroetan eller nitrobenzen; nitriler, slik som acetonitril eller isobutyronitril; amider, slik som formamid, dimetylformamid, dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; og sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid eller sulfolan; mer foretrukket alkoholer (særlig metanol og etanol) og diklormetan, og i tilfelle eddiksyre er et avbeskyttelsesreagens, en blanding av eddiksyre og vann.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til avbeskyttelsesreagenset som anvendes, forutsatt at det normalt kan anvendes for vanlig avbeskyttelse. Når beskyttelsesgruppen er en triarylmetylgruppe, kan den fjernes ved å bruke syrer, slik som eddiksyre, dikloreddiksyre, trifluoreddiksyre, saltsyre eller Lewis-syrer, slik som sinkbromid, fortrinnsvis eddiksyre, dikloreddiksyre eller trifluoreddiksyre.

Reaksjonstemperaturen varierer avhengig av egenskapene til reagenset, utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet som anvendes, og andre reaksjonsbetingelser, men reaksjonen utføres normalt ved en temperatur på -10°C til 100°C, fortrinnsvis 0°C til 50°C. Den påkrevde tid for reaksjonen varierer avhengig av egenskapene til utgangsforbindelsen og opp-løsningsmidlet som anvendes, samt reaksjonstemperaturen, men reaksjonen fullføres normalt i løpet av et tidsrom på 1 minutt til 50 timer, fortrinnsvis 1 minutt til 24 timer.

Etter fullførelse av reaksjonen kan den ønskede forbindelse isoleres fra reaksjonsblandingen. I trinn 3 omfatter et eksempel på en slik teknikk: nøytralisering av reaksjonsblandingen, helling av den over i vann; ekstraksjon med et slikt vannublandbart oppløsningsmiddel som benzen, eter eller etylacetat; og avdestillering av oppløsningsmidlet fra ekstrakten. Det således erholdte produkt kan normalt anvendes i den etterfølgende reaksjon uten ytterligere rensing, men, om

ønsket, kan det renses ved hjelp av forskjellig slags kromatografi, rekrystallisering eller lignende middel. I trinnene 11, 22 og 25 omfatter et eksempel på en slik teknikk: fraskillelse

av den ønskede forbindelse ved filtrering og vasking av den med metylenklorid.

[Trinnene 4 og 6]

I disse trinnene kan en forbindelse (2-6) eller (2) fremstilles ved å omsette en forbindelse (2-4) eller (2-1) med en forbindelse (2-5) (i formelen betegner Hal et halogenatom) i nærvær av et inert oppløsningsmiddel og en base. Halogenid-resten i forbindelsen (2-5) som brukes, er eksemplifisert ved klor, brom eller jod, fortrinnsvis klor eller brom.

Eksempler på foretrukne oppløsningsmidler omfatter: aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen eller xylen; halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen eller diklorbenzen; estere, slik som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat eller dietylkarbonat; etere, slik som dietyleter, diisopropyleter, tetrahydrofuran, dioksan, dimetoksyetan eller dietylenglykoldimetyleter; ketoner, slik som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon eller sykloheksanon; nitroforbindelser, slik som nitroetan eller nitrobenzen; nitriler, slik som acetonitril eller isobutyronitril; amider, slik som formamid, dimetylformamid, dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; og sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid eller sulfolan; mer foretrukket etere (særlig tetrahydrofuran), ketoner (særlig aceton), halogenerte hydrokarboner (særlig diklormetan), amider (særlig DMF) og aromatiske aminer (særlig pyridin).

Eksempler på foretrukne baser omfatter: organiske baser (særlig trietylamin, pyridin, N-metylmorfolin, DBU og lignende baser), alkalimetallhydrider (særlig natriumhydrid) og alkalimetallkarbonater (særlig natriumkarbonat og litium-karbonat), og i tilfelle Z i forbindelsen (2-5) er et silisiumatom, er imidazol den mest foretrukne, organiske base.

Reaksjonstemperaturen er ikke særlig kritisk, men reaksjonen utføres normalt ved en temperatur på 0-100°C, fortrinnsvis 20-60°C.

Den nødvendige tid for reaksjonen ligger normalt i området fra 5 minutter til 30 timer. Når reaksjonen utføres ved 50°C, er den fullført i løpet av et tidsrom på 10 timer.

Etter fullførelse av omsetningen kan den ønskede forbindelse isoleres fra reaksjonsblandingen, f.eks. ved på passende måte å nøytralisere reaksjonsblandingen ved å frafiltrere uoppløselige materialer dersom slike finnes, tilsette vann og et slikt vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel som etylacetat, fraskille det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, vaske ekstrakten med vann, tørke ekstrakten over vannfritt magnesiumsulfat, etc, og til sist avdes-tillere oppløsningsmidlet. Om nødvendig, kan den derved erholdte, ønskede forbindelse renses ved hjelp av vanlige midler, f.eks. rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi eller lignende midler.

[Trinn 5]

I dette trinnet kan en forbindelse (2) fremstilles ved å omsette en forbindelse (2-6) med et avbeskyttelsesreagens i nærvær av et inert oppløsningsmiddel. (1) Når en hydroksylbeskyttelsesgruppe i Bestillin-gen er en silylgruppe, kan den normalt fjernes ved å behandle med en forbindelse som er i stand til å gi et fluoridion, slik som tetrabutylammoniumfluorid.

Det er ikke noen bestemt begrensning på egenskapene til det anvendte oppløsningsmiddel, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Foretrukne eksempler omfatter etere, slik som tetrahydrofuran eller dioksan.

Reaksjonstemperaturen er ikke særlig kritisk, men reaksjonen utføres normalt ved en temperatur fra -30 til 100°C, fortrinnsvis 0-30°C.

Den påkrevde tid for omsetningen varierer normalt fra 5 minutter til 30 timer. Når reaksjonen utføres ved 20°C, er den fullstendig i løpet av et tidsrom på 10 timer.

Etter fullførelse av reaksjonen kan den ønskede forbindelse isoleres fra reaksjonsblandingen, f.eks. ved å nøy-tralisere reaksjonsblandingen på riktig måte ved frafiltrering av uoppløselige materialer dersom slike finnes, tilsetning av vann og et slikt vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel som etylacetat, fraskillelse av det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, vasking av ekstrakten med vann, tørking av ekstrakten over vannfritt magnesiumsulfat, etc, og til sist fradestillering av oppløsningsmidlet. Det således erholdte, ønskede produkt kan, om nødvendig, renses ved hjelp av vanlige midler, f.eks. rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi eller lignende midler.

Om nødvendig, kan det således erholdte, ønskede produkt renses videre ved hjelp av vanlige midler, f.eks. rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi eller lignende midler. (2) Når en hydroksylbeskyttelsesgruppe i 3'-stillingen er en halogenalkoksykarbonylgruppe, kan den normalt fjernes ved å behandle med sinkstøv.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til det anvendte oppløsningsmiddel, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Eksempler på foretrukne oppløs-ningsmidler omfatter eddiksyre, alkoholer eller blandinger av vann og ett eller flere av disse oppløsningsmidlene.

Reaksjonstemperaturen er ikke særlig kritisk, men reaksjonen utføres normalt ved en temperatur fra 0 til 100°C, fortrinnsvis ved romtemperatur.

Den tid som kreves for reaksjonen, er normalt i området 5 minutter til 30 timer. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur, er den fullstendig i løpet av et tidsrom på 10 timer.

Etter fullførelse av omsetningen kan den ønskede forbindelse isoleres fra reaksjonsblandingen, for eksempel ved å nøytralisere reaksjonsblandingen fullstendig eller frafiltrere uoppløselige materialer dersom slike er til stede, tilsette vann og et vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel, slik som etylacetat, fraskille det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, vaske ekstrakten med vann, tørke over vannfritt magnesiumsulfat, etc, og til sist fradestillere oppløsningsmidlet. Det derved erholdte reaksjonsprodukt kan renses videre ved vanlige midler, for eksempel rekrystallisering, nyutfelling, kromatografi eller lignende midler. (3) Når en hydroksylbeskyttelsesgruppe i 3'-stillingen er en aralkyloksykarbonylgruppe, kan den normalt fjernes ved katalytisk reduksjon eller oksidasjon.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til katalysatoren som kan anvendes til reduksjon, forutsatt at den vanligvis kan anvendes i katalytisk reduksjon. Eksempler på foretrukne katalysatorer omfatter palladium-på-karbon, Raney-nikkel, platinaoksid, platinasort, rhodium-på-alumina, en kombinasjon av trifenylfosfin og rhodiumklorid, og palladium-på-bariumsulfat.

Hydrogentrykk som reaksjonen utføres under, er ikke særlig kritisk, men reaksjonen utføres normalt i et område fra 1 til 10 atmosfærers trykk.

Reaksjonstemperaturen og tiden som kreves for reaksjonen, varierer avhengig av egenskapene til utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet som anvendes, samt typen av katalysatoren og andre reaksjonsbetingelser, men reaksjonen utføres ved en temperatur fra 0 til 100°C, og den er fullført i løpet av et tidsrom på 5 minutter til 24 timer.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes ved avbeskyttelsen ved oksidasjon, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Foretrukket oppløsningsmiddel er eksemplifisert ved blandinger av vann og ett eller flere av de organiske oppløs-ningsmidlene.

Eksempler på foretrukne, organiske oppløsningsmidler omfatter: ketoner, slik som aceton; halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan, kloroform eller karbontetraklorid; nitriler, slik som acetonitril; etere, slik som dietyleter, tetrahydrofuran eller dioksan; amider, slik som dimetylformamid, dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; og sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oksidasjonsmidlet som brukes, forutsatt at det kan anvendes i vanlig oksidasjon. Foretrukne eksempler er eksemplifisert ved kaliumpersulfat, natriumpersulfat, ammoniumceriumnitrat (CAN) og 2,3-diklor-5,6-dicyan-p-benzokinon (DDQ).

Reaksjonstemperaturen og tiden som kreves for reaksjonen, varierer avhengig av egenskapene til utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet samt typen av katalysatoren som anvendes og andre betingelser, men omsetningen utføres normalt ved en temperatur fra 0 til 150°C og er fullstendig i løpet av et tidsrom på 10 minutter til 24 timer.

Hydroksylbeskyttelsesgruppen kan også fjernes ved å behandle med alkalimetaller, slik som litiummetall eller natriummetall, i flytende ammoniakk eller slike alkoholer som metanol eller etanol, ved en temperatur fra -78°C til -20°C.

Videre kan beskyttelsesgruppen fjernes ved å bruke en kombinasjon av aluminiumklorid og natriumjodid eller alkyl-silylhalogenider, slik som trimetylsilyljodid, i et oppløs-ningsmiddel .

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til

oppløsningsmidlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Foretrukne oppløsningsmidler er eksemplifisert ved nitriler, slik som acetonitril, halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan eller kloroform, og blandinger av to eller flere av disse oppløsningsmidlene.

Reaksjonstemperaturen og tiden som kreves for omsetningen, varierer avhengig av egenskapene til utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet, og andre reaksjonsbetingelser, men omsetningen utføres normalt ved en temperatur fra 0 til 50°C og er fullstendig i løpet av et tidsrom på 5 minutter til 3 dager.

Når substratet inneholder et svovelatom, kan avbeskyttelsen fortrinnsvis oppnås ved å bruke en kombinasjon av aluminiumklorid og natriumjodid.

Etter fullførelse av omsetningen isoleres den ønskede forbindelse fra reaksjonsblandingen, for eksempel ved å nøy-tralisere reaksjonsblandingen fullstendig eller frafiltrere uoppløselige materialer dersom slike er til stede, tilsette vann og et slikt vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel, slik som etylacetat, fraskille det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, vaske ekstrakten med vann, tørke over vannfritt magnesiumsulfat, etc, og til sist fradestillere oppløsningsmidlet. Den således erholdte, ønskede forbindelse kan, om nødvendig, renses ytterligere ved hjelp av vanlige midler, f.eks. rekrystallisering, nyutfelling, kromatografi eller lignende midler.

[Trinnene 7, 12, 14, 17, 23, 26, 28, 30, 33 og 35]

I disse trinnene kan CPG-bundne oligodeoksyribonukleotider (3), (4a), (4b), (5), (6a) til (6d), (7a) og (7b) fremstilles ved å bruke CPG-bundne nukleosider som omfatter 3'-endenukleosidene til den effektive basesekvens, idet for- lengelsestrinnet for DNA-kjede på et DNA-synteseapparat gjentas, og til slutt fremstilles et nukleotidkortfragment fra 5'-enden til den effektive sekvens.

Forlengelsen av DNA-kjede på et DNA-synteseapparat er forklart i henhold til "fosforamiditt"-fremgangsmåten, men det skal forstås at denne fremgangsmåten er for beskrivelsesformål og ikke begrensende.

I trinn 7 behandles kommersielt tilgjengelig, CPG-bundet D" (3-1) med et avbeskyttelsesreagens for en DMT-gruppe på et DNA-synteseapparat for å fjerne en 5'-ende-DMT-

gruppe, og så kondenseres det med en nukleotidenhet som er tilgjengelig i handelen for et DNA-synteseapparat, etterfulgt av dannelse av en fosforsyrlingtriesterbinding, som deretter oksideres til fosforsyretriester ved å bruke et passende oksi-das jonsmiddel . Etter syntetisering av ett nukleotidkortfragment fra 5'-enden til den effektive sekvens ved å gjen.ta disse trinnene, fremstilles det CPG-bundet ODN (3) med en 5'-ende-DMT-gruppe. Det CPG-bundne ODN i den ønskede nukleotid-basesekvens hvor 5'-enden er beskyttet med en DMT-gruppe, kan syntetiseres i henhold til fremgangsmåten rapportert av H.Koster et al. i Nucleic Acid Res., 12, 4539 (1984) eller dets modifiserte fremgangsmåte under anvendelse av et synteseapparat basert på en fosforamidittfremgangsmåte, for eksempel "Model 380B" (et produkt fra Applied Biosystems Inc.) eller "Cyclon Plus" (et produkt fra MilliGen/Biosearch).

En baserest i nukleotidenheten som skal anvendes for å syntetisere ODN, er de som er beskyttet med en acylgruppe. Foretrukne acylgrupper er eksemplifisert ved en benzoylgruppe i det tilfellet baseresten er A eller C, og en isobutyrylgruppe i tilfelle den er G.

Eksempler på de sure stoffene som skal brukes som katalysator i kondensasjonsreaksjonen i trinnet, omfatter sure stoffer, deriblant tetrazoler, fortrinnsvis tetrazol.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til det anvendte oppløsningsmiddel, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Foretrukne oppløsningsmidler er eksemplifisert ved acetonitril og tetrahydrofuran.

Reaksjonen utføres ved en temperatur fra -30 til 50°C, normalt ved romtemperatur.

Den tid som kreves for reaksjonen, varierer avhengig av reaksjonstemperaturen, men reaksjonen er fullstendig i løpet av et tidsrom på 1 minutt til 20 timer. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur, er den fullført i løpet av 10 minutter.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oksidasjonsmidlet som brukes i disse trinnene, forutsatt at det kan brukes i vanlig oksidasjon som et oksidasjonsmiddel. Eksempler på foretrukne oksidasjonsmidler omfatter: uorganiske metalloksidasjonsmidler, inkludert manganoksider, slik som kaliumpermanganat eller mangandioksid; ruteniumoksider, slik som ruteniumtetraoksid; selenforbindelser, slik som selendioksid; jernforbindelser, slik som ferriklorid; osmiumforbindelser, slik som osmiumtetraoksid; sølvforbindelser, slik som sølvoksid; kvikksølvforbindelser, slik som kvikksølvacetat; blyoksidforbindelser, slik som blyoksid eller blytetraoksid; kromsyreforbindelser, slik som kaliumkromat, et kompleks av kromsulfat og svovelsyre eller et kompleks av kromsyre og pyridin; ceriumforbindelser, slik som ceriumammoniumnitritt (CAN); uorganiske oksidasjonsmidler, inkludert halogenmolekyler, slik som klor-, brom- eller jodmolekyl; perjodater, slik som natriumperjodat; ozon; hydrogenperoksid; nitrøse forbindelser, slik som salpetersyrling; klorsyrlingforbindelser, slik som kaliumkloritt eller natriumkloritt; persvovelsyreforbindelser, slik som kaliumpersulfat eller natriumpersulfat; organiske oksidasjonsmidler inkludert reagenser som brukes ved DMSO-oksidasjon (et kompleks av dimetylsulfoksid og disykloheksylkarbodiimid, oksalylklorid, eddiksyreanhydrid eller fos-forpentaoksid, eller et kompleks av pyridin og svoveltri-oksid); peroksider, slik som tert-butylhydroperoksid; stabile kationer, slik som trifenylmetylkation; succinimider, slik som N-bromsuccinimid; hypoklorsyrlingforbindelser, slik som tert-butylhypokloritt; azodikarboksylsyreforbindelser, slik som azodikarboksylat; en kombinasjon av trifenylfosfin og disulfider, slik som dimetyldisulfid eller difenyldisulfid; salpetersyrlingestere, slik som metylnitritt; tetrahalogenkarbon-forbindelser, slik som tetrabrommetan; kinoner, slik som 2,3-diklor-5,6-dicyan-p-benzokinon (DDQ); fortrinnsvis jod.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til det anvendte oppløsningsmiddel, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Eksempler på foretrukne oppløs-ningsmidler omfatter: slike aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen eller xylen; halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan eller kloroform; slike etere som eter, tetrahydrofuran, dioksan eller dimetoksyetan; slike amider som dimetylformamid, dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; slike sulfoksider som dimetylsulfoksid; slike alkoholer som metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol eller isoamylalkohol; slike fortynnede syrer som vandig svovelsyre; slike fortynnede baser som en vandig oppløsning av natriumhydroksid; vann; slike ketoner som aceton eller metyletylketon; slike heterosykliske aminer som pyridin; og slike nitriler som acetonitril; fortrinnsvis heterosykliske aminer (særlig pyridin), nitriler (særlig acetonitril), etere (særlig tetrahydrofuran) og halogenerte hydrokarboner (særlig diklormetan ).

Reaksjonen utføres ved en temperatur fra -50 til 100°C. Den påkrevde tid for reaksjonen varierer hovedsakelig avhengig av reaksjonstemperaturen samt egenskapene til utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet, men reaksjonen utføres ved en temperatur på -50 til 100°C, og den er normalt fullført i løpet av et tidsrom på 30 minutter til 15 timer. Oksidasjonsreaksjonen beskrevet ovenfor, akselereres ved å tilsette en faseoverføringskatalysator, slik som trietylbenzylammonium-klorid eller tributylbenzylammoniumbromid.

Trinnene 12, 14, 17, 23, 26, 28, 30, 33 og 35 er like.

[Trinnene 9 og 20]

I disse trinnene kan en halvester av dikarboksylsyre fremstilles ved å omsette en fri hydroksylgruppe av en forbindelse (4-2) eller (6-2) med et anhydrid av dikarboksylsyre, slik som ravsyreanhydrid, i nærvær av en basekatalysator.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til den anvendte dikarboksylsyre. Foretrukne dikarboksylsyrer er de som inneholder 2-10 karbonatomer, og den mest foretrukne dikarboksylsyre er ravsyre eller glutarsyre. Eksempler på egnede basekatalysatorer omfatter: aminopyridiner, slik som di metylaminopyridin eller pyrrolidinopyridin; tertiære aminer, slik som trimetylamin eller trietylamin; natriumhydrogenkarbonat; og alkalimetallkarbonater, slik som kaliumkarbonat; idet dimetylaminopyridin eller pyrrolidinopyridin er mest foretrukket.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til det anvendte oppløsningsmiddel, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen og er i stand til å oppløse utgangsmaterialet i en viss utstrekning. Eksempler på foretrukne oppløsningsmidler omfatter: aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen eller xylen; halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan eller kloroform; etere, slik som eter, tetrahydrofuran, dioksan eller dimetoksyetan; amider, slik som dimetylformamid, dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid; alkoholer, slik som metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol eller isoamylalkohol; fortynnede syrer, slik som vandig svovelsyre; fortynnede baser, slik som en vandig oppløs-ning av natriumhydroksid; vann? ketoner, slik som aceton eller metyletylketon; heterosykliske aminer, slik som pyridin; og nitriler, slik som acetonitril; mest foretrukket nitriler (særlig acetonitril), etere (særlig tetrahydrofuran) og halogenerte hydrokarboner (særlig diklormetan).

Omsetningen utføres ved en temperatur på -50 til 100°C. Den tid som kreves for reaksjonen, varierer hovedsakelig avhengig av reaksjonstemperaturen samt egenskapene til utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet som anvendes, men reaksjonen er normalt fullført i løpet av et tidsrom på 30 minutter til 15 timer.

[Trinnene 10 og 21]

I disse trinnene kan de ønskede forbindelser (4-5) og (6-6) fremstilles ved å omsette halvestere av ravsyre (4-3) og (6-4) fremstilt i trinnene 9 og 20 med slike fenoler som pentaklorfenol i nærvær av et kondensasjonsmiddel, hvorved det fås en aktivert ester, og deretter omsetning av produktet med CPG-aminer (4-4) og (6-5) i nærvær av en base.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til fenoler som brukes i denne reaksjonen. Foretrukne fenoler er

eksemplifisert ved pentaklorfenol og 4-nitrofenol.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til det anvendte oppløsningsmiddel, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen og er i stand til å oppløse utgangsmaterialet i en viss utstrekning. Eksempler på egnede oppløsningsmidler omfatter: amider, slik som dimetylformamid, dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid; ketoner, slik som aceton eller metyletylketon; heterosykliske aminer, slik som pyridin; og nitriler, slik som acetonitril; fortrinnsvis amider, slik som dimetylformamid.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til den anvendte base, forutsatt at den kan brukes som en base i vanlig reaksjon. Eksempler på foretrukne baser omfatter: organiske baser, slik som trietylamin, tributylamin, diisopropyletylamin, N-metylmorfolin, pyridin, 4-(N,N-dimetylamino)-pyridin, N,N-dimetylanilin, N,N-dietylanilin, 1,5-diazabi-syklo[4,3,0]non-5-en, l,4-diazabisyklo[2,2,2]oktan (DABCO) eller 1,8-diazabisyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU); mer foretrukne organiske baser er særlig trietylamin, pyridin, N-metylmorfolin og DBU.

Omsetningen utføres ved en temperatur fra -50 til 100°C. Den tid som kreves for reaksjonen, varierer"hovedsakelig avhengig av reaksjonstemperaturen samt egenskapene til utgangsforbindelsen eller oppløsningsmidlet som anvendes, men når reaksjonen utføres ved romtemperatur, fullføres den normalt i løpet av et tidsrom på 30-50 timer.

[Trinnene 13 og 32]

I trinn 13 kan CPG-bundet nukleosid (4-7) som inneholder en tiolatgruppe, fremstilles ved å omsette en forbindelse (4-6) fremstilt i trinn 11, med et kommersielt tilgjengelig 5' -O-DMT-nukleosid-3'-fosforamidittreagens på et DNA-synteseapparat, og deretter omsette med et tioeringsreagens.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til tioeringsreagenset som anvendes, forutsatt at det er i stand til å danne en tioatgruppe ved å reagere med treverdig fosfor. Eksempler på foretrukne tioeringsreagenser omfatter: i tillegg til svovel, tetraetyltiuramdisulfid (TETD) (et produkt fra Applied Biosystems Inc.) og Beaucage-reagens (et produkt fra MilliGen/Biosearch). Den ønskede forbindelse (4-7) hvor 3'-endenukleosidet i den effektive basesekvens er båret på CPG gjennom en tioatgruppe, kan fremstilles ved å behandle med tetraetyltiuramdisulfid (TETD) ifølge fremgangsmåten rapportert i Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991) eller med Beaucage-reagens ifølge fremgangsmåten rapportert i J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990) eller dens modifiserte fremgangsmåte.

I trinn 32 kan CPG-bundet nukleosid (7-7) med en fosforsyretriester eller tioatgruppe fremstilles ved å omsette en forbindelse (7-3) med et fosforamidittreagens, etterfulgt av behandling med konvensjonelle midler eller med et tioerings-middel.

[Trinn 15]

I trinnet kan CPG-bundet forbindelse (5-3) med en fosfonsyrediestergruppe fremstilles ved å omsette en CPG-bundet forbindelse (5-1) som er befridd for en DMT-gruppe, og som er erholdt analogt med fremstillingen av en CPG-bundet forbindelse (4-6), med en kommersielt tilgjengelig fosfonsyremono-esterforbindelse (5-2) i nærvær av et kondensasjonsmiddel og et avsuringsmiddel. Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til kondensasjonsmidlet som benyttes, forutsatt at det kan dannes et syreanhydrid med fosfonsyremonoester. Eksempler på foretrukne kondensasjonsmidler omfatter adamantan-l-karbon-ylklorid og pivaloylklorid. Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til avsuringsmidlet som brukes, forutsatt at det kan brukes som et avsuringsmiddel i tilfelle acylering utføres ved å bruke et syreklorid. Eksempler på foretrukne avsuringsmidler omfatter generelt aromatiske aminer, slik som pyridin. Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Eksempler på foretrukne oppløs-ningsmidler omfatter nitriler, slik som vannfritt acetonitril. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur, er den fullstendig i løpet av et tidsrom på 5-60 minutter.

[Trinn 16]

I trinnet omdannes en fosfonsyrediestergruppe i en CPG-bundet forbindelse (5-3) til en fosforamidatgruppe ved å omsette med alkylamin og karbontetraklorid. Som alkylamin skal det forstås de ønskede alkylaminer. Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Eksempler på foretrukne oppløsningsmidler omfatter normalt ikke-polare oppløsningsmidler, slik som karbontetraklorid. Reaksjonstemperaturen er ikke av spesielt avgjørende betydning, og reaksjonen utføres normalt ved en temperatur fra -50 til 100°C. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur, er den fullstendig i løpet av et tidsrom på 1-10 timer.

[Trinnene 19 og 36]

I disse trinnene kan 3'-fosforsyrlingderivater (6-3) og (8) fremstilles ved å omsette forbindelse (6-2) og (2) medklorfosforamiditt (6-3') som brukes som et fosfityleringsmiddel, i nærvær av et inert oppløsningsmiddel og et avsuringsmiddel. U brukt i definisjonen av en forbindelse (6-3'), betegner en dialkylaminogruppe, slik som en dimetylamino-eller diisopropylaminogruppe, eller en heterosyklisk gruppe med 1 eller 2 oksygen- og/eller nitrogenatomer i ringen. V brukt i definisjonen av en forbindelse (6-3'), kan være hvilken som helst gruppe, forutsatt at den kan fjernes etter dannelse av en fosfatbinding. Eksempler på slike grupper omfatter fortrinnsvis lavere alkyloksygrupper, slik som en metoksy-gruppe, og cyanalkyloksygrupper, slik som cyanetyloksygruppe. Som forbindelsen (6-3') skal det forstås spesielt fosfiner, slik som klormorfolinometoksyfosfin, klormorfolinocyanetoksyfosfin, klordimetylaminometoksyfosfin, klordimetylaminocyan-etoksyfosfin, klordiisopropylaminometoksyfosfin og klordiisopropylaminocyanetoksyfosfin; fortrinnsvis klormorfolinometoksyfosfin, klormorfolinocyanetoksyfosfin, klordiisopropylaminometoksyfosfin og klordiisopropylaminocyanetoksyfosfin.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Foretrukne oppløsningsmidler er etere, slik som tetrahydrofuran, dietyleter eller dioksan. Eksempler på avsuringsmidler omfatter: heterosykliske aminer, slik som pyridin eller dimetylaminopyridin, og alifatiske aminer, slik som trimetylamin, trietylamin eller diisopropyletylamin, fortrinnsvis alifatiske aminer (særlig diisopropyletylamin).

Reaksjonstemperaturen er ikke av spesielt avgjørende betydning, men reaksjonen utføres normalt ved en temperatur fra -50 til 50°C, fortrinnsvis ved romtemperatur.

Den tid som kreves for reaksjonen, varierer avhengig av egenskapene til utgangsforbindelsen og reagenset samt reaksjonstemperaturen, men reaksjonen fullføres normalt i løpet av et tidsrom på 5 minutter til 30 timer. Når reaksjonen fortrinnsvis utføres ved romtemperatur, er den fullstendig i løpet av et tidsrom på 30 minutter.

Den ønskede forbindelse kan utvinnes fra reaksjonsblandingen, for eksempel ved å nøytralisere reaksjonsblandingen skikkelig, eller frafiltrere eventuelle uoppløselige materialer, tilsette vann og et vannublandbart oppløsnings-middel, slik som etylacetat, fraskille det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, vaske ekstrakten med vann, tørke over vannfritt magnesiumsulfat, etc, og til sist avdes-tillere oppløsningsmidlet.

Den således erholdte, ønskede forbindelse kan, om nødvendig, renses ytterligere ved hjelp av vanlige midler, for eksempel rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi eller lignende midler.

[Trinn 24]

I dette trinnet kan en CPG-bundet forbindelse (6-8) med en fosforsyretriestergruppe fremstilles analogt med fremgangsmåten beskrevet i trinn 7, men ved å bruke en forbindelse (6-3) i stedet for en nukleosidfosforamidittforbindelse som brukes som en nukleotidenhet på et DNA-synteseapparat.

[Trinnene 27 og 29]

I disse trinnene kan CPG-bundne forbindelser (6-10 og 6-11) med 2 eller 3 fosforsyretriestergrupper fremstilles fra en CPG-bundet forbindelse (6-9) fremstilt i trinn 25 ved å behandle analogt med fremgangsmåten beskrevet i trinn 24.

[Trinn 31]

I dette trinnet kan en CPG-bundet forbindelse (7-3) med en 4,4' -dimetoksytrityloksyetylsulfonyletoksygruppe fremstilles ved å behandle en kommersielt tilgjengelig, CPG-bundet forbindelse (7-2) som er befridd for en 5'-DMT-gruppe, med (2-cyanetoksy)-2-[2<1->0-(4,4'-dimetoksytrityloksyetylsulfonyl]-etoksy-N,N-diisopropylaminofosfin (7-1) [T. Horn et al., Tetrahedron Letters, 27, 4705 (1986)] analogt med fremgangsmåten beskrevet i trinn 24.

[Trinn 34]

I trinnet kan en CPG-bundet forbindelse (7-5) fremstilles ved avbeskyttelse av en DMT-gruppe fra en CPG-bundet forbindelse (7-3) fremstilt i trinn 31, og så kondensere med et nukleotid (7-4) med en DMT-gruppe i 5'-stillingen og en gruppe av alkylfosfat, fenylfosfat, alkylfosfonat eller fenyl-fosfonat i 3'-stillingen ved bruk av et kondensasjonsmiddel.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Foretrukne oppløsningsmidler er aromatiske aminer, slik som pyridin. Som kondensasjonsmidlene kommer det i betraktning disykloheksylkarbodiimid (DCC), mesitylensulfonylklorid (Ms-Cl), triisopropylbenzensulfonylklorid, mesitylensulfonyltriazol (MST), mesitylensulfonyl-3-nitrotriazol (MSNT), triisopropylbenzensulfonyltetrazol (TPS-Te), triisopropylbenzensulfonylnitroimidazol (TPS-NI) og triisopropylbenzensulfonylpyridyltetrazol; fortrinnsvis MSN, TPS-Te og TPS-NI.

Reaksjonstemperaturen er ikke av spesielt avgjørende betydning, men reaksjonen utføres ved en temperatur fra -10 til 100°C. Den tid som kreves for reaksjonen, varierer avhengig av egenskapene til oppløsningsmidlet som brukes, og reaksjonstemperaturen. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur under anvendelse av pyridin som oppløsningsmiddel, er den fullstendig i løpet av et tidsrom på 30 minutter.

[Trinn 37]

I dette trinnet kan sluttproduktet (1) fremstilles ved å kondensere en forbindelse (8) fremstilt i trinn 36 med CPG-bundet ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a-6d, 7a eller 7b), som syntetiseres på et DNA-synteseapparat, og avbeskyttelse av en 5'-ende-DMT-gruppe alene, under anvendelse av en syrekatalysator for å danne fosfittriester, oksidasjon under anvendelse av et passende oksidasjonsmiddel for å fremstille fosforsyretriester, avspalting fra CPG, fjerning av beskyttelsesgruppene og til sist rensing.

Som en syrekatalysator som brukes i kondensasjonsreaksjonen, kommer det i betraktning sure stoffer, slik som tetrazoler, fortrinnsvis tetrazol.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oksidasjonsmidlet som anvendes, forutsatt at det kan brukes som et oksidasjonsmiddel i oksidasjonsreaksjoner. Eksempler på foretrukne oksidasjonsmidler omfatter: uorganiske metalloksider, inkludert manganoksider, slik som kaliumpermanganat eller mangandioksid; ruteniumoksider, slik som ruteniumtetraoksid; selenoksider, slik som selendioksid; jernforbindelser, slik som jern(III)klorid; osmiumforbindelser, slik som osmiumtetraoksid; sølvforbindelser, slik som sølvoksid; kvikksølv-forbindelser, slik som kvikksølvacetat; blyoksidforbindelser, slik som blyoksid eller blytetraoksid; kromsyreforbindelser, slik som kaliumkromat, et kompleks av kromsyre og svovelsyre, eller et kompleks av kromsyre og pyridin; og ceriumforbindelser, slik som ceriumammoniumnitrat (CAN); uorganiske oksidasjonsmidler omfatter halogenmolekyler, slik som et klor-, brom- eller jodmolekyl; perjodider, slik som natriumperjodid; ozon; hydrogenperoksid; nitrøse forbindelser, slik som salpetersyrling; klorsyreforbindelser, slik som natriumklorid; persulfatforbindelser, slik som kaliumpersulfat eller natriumpersulfat; og organiske oksidasjonsmidler, inkludert reagenser som brukes ved DMSO-oksidasjon (en kombinasjon av dimetylsulfoksid og disykloheksylkarbodiimid, oksalylklorid, eddiksyreanhydrid eller fosforsyrepentaklorid, eller et kompleks av pyridin og svovelsyreanhydrid); peroksider, slik som tert-butylhydroperoksid; stabile kationer, slik som trifenylmetylkation; succinimider, slik som N-bromsuccinimid; hypoklorsyreforbindelser, slik som tert-butylhypokloritt; azodikarboksylsyreforbindelser, slik som azodikarboksylat; en kombinasjon av disul fider, slik som dimetyldisulfid, difenyldisulfid eller dipyridyldisulfid, og trifenylfosfin; nitritter, slik som metylnitritt; tetrahalogenerte forbindelser, slik som tetrabrommetan; og kinonforbindelser, slik som 2,3-diklor-5, 6-dicyan-p-benzokinon (DDQ); helst jod.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen og er i stand til å oppløse utgangsmaterialene i en viss utstrekning. Eksempler på foretrukne oppløsningsmidler omfatter: aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen eller xylen; halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan eller kloroform; etere, slik som eter, tetrahydrofuran, dioksan eller dimetoksyetan; amider, slik som dimetylformamid, dimetylacetamid eller heksametylfosforsyretriamid; sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid; alkoholer, slik som metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol eller isoamylalkohol; fortynnede syrer, slik som vandig svovelsyre; fortynnede baser, slik som en vandig oppløsning av natriumhydroksid; vann; ketoner, slik som aceton eller metyletylketon; heterosykliske aminer, slik som pyridin; nitriler, slik som acetonitril; fortrinnsvis heterosykliske aminer (særlig pyridin), nitriler (særlig acetonitril), etere (særlig tetrahydrofuran) og halogenerte hydrokarboner (særlig diklormetan).

Reaksjonen utføres ved en temperatur fra -50 til 100°C. Den tiden som kreves for reaksjonen, varierer, hovedsakelig avhengig av reaksjonstemperaturen og egenskapene til utgangsforbindelsen, i løpet av et tidsrom på 30 minutter til 15 timer. Oksidasjonsreaksjonen beskrevet ovenfor, akselereres ved å tilsette en faseoverføringskatalysator, slik som tri-etylbenzylammoniumklorid eller tributylbenzylammoniumbromid.

[Trinn 38]

I dette trinnet kan et mellomprodukt, mononukleotid (9), fremstilles ved å omsette en forbindelse (2) med et fosforyleringsmiddel, for eksempel bistriazolid, i nærvær av et inert oppløsningsmiddel, og tilsette vann etterfulgt av opparbeidelse.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Oppløsningsmidlet velges normalt fra aromatiske aminer, slik som pyridin. Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til V brukt i definisjonen av fosforyleringsmidlet, forutsatt at det kan fjernes under betingelsene som fjerner en beskyttelsesgruppe i en baserest etter fullførelse av kondensasjonsreaksjonen i trinn 39. V betegner vanligvis en o-klorfenoksygruppe.

Selv om reaksjonstemperaturen ikke er av spesielt avgjørende betydning, utføres reaksjonen ved en temperatur fra -20 til 100°C, normalt ved romtemperatur. Den tiden som kreves for reaksjonen, varierer avhengig av egenskapene til oppløs-ningsmidlet som brukes, og reaksjonstemperaturen. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur under anvendelse av pyridin som oppløsningsmiddel, fullføres den i løpet av et tidsrom på 1 time.

[Trinn 39]

I dette trinnet kan sluttproduktet (1) fremstilles ved å kondensere et mononukleotid (9) med CPG-bundet ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a-6d, 7a eller 7b), som syntetiseres på et DNA-synteseapparat, og avbeskyttelse av en 5'-ende-DMT-gruppe, med beskyttelsesgrupper i basen og fosforsyrerestene ved bruk av et kondensasjonsmiddel, hvorved det dannes en fosforsyretriestergruppe, fraspalte CPG ved hjelp av vanlige midler, avbeskyttelse av en beskyttelsesgruppe og til sist rensing. Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som brukes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksj onen.

Eksempler på kondensasjonsmidler omfatter: disyklokarbodiimid (DCC), mesitylensulfonylklorid (Ms-Cl), triisopropylbenzensulfonylklorid, mesitylensulfonyltriazol (MST), mesitylensulfonyl-3-nitrotriazol (MSNT), triisopropyl-benzensulf onyltetrazol (TPS-Te), triisopropylbenzensulfonylnitroimidazol (TPS-NI) og triisopropylbenzensulfonylpyridyltetrazol; fortrinnsvis MSNT, TPS-Te og TPS-NI.

Reaksjonstemperaturen er ikke av spesielt avgjørende betydning, men reaksjonen utføres ved en temperatur fra -10 til 100°C, vanligvis ved romtemperatur. Selv om den tiden som kreves for reaksjonen, varierer avhengig av egenskapene til oppløsningsmidlet som brukes, og reaksjonstemperaturen. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur under anvendelse av pyridin som oppløsningsmiddel, er den fullstendig i løpet av et tidsrom på 30 minutter.

Avspalting av ODN fra CPG-bundet ODN og fjerning av beskyttelsesgruppene med unntak av 5'-endesubstituenten, ut-føres i henhold til fremgangsmåtene som er i og for seg kjente (J. Am. Chem. Soc, 103, 3185 (1981)). Reaksjonsblandingen som inneholder forbindelsene med generell formel (1), renses ved hjelp av vanlige renseteknikker, for eksempel forskjellig kromatografi, inkludert reversfase- og ionebytterkromatografi (omfattende høyhastighetsvæskekromatografi), hvorved man får forbindelsene med den generelle formel (1).

[Trinn 40]

I dette trinnet omsettes tris(1,2,4-triazolyl)fosfitt som tidligere er fremstilt fra fosfortriklorid og 1,2,4-triazol i henhold til fremgangsmåten rapportert av B. C. Freohler, P. G. Ng og M. D. Matteucci i Nucleic Acids Res., 14, 5399

(1986), med en forbindelse (2) i et inert oppløsningsmiddel, og reaksjonen stanses ved å tilsette vann etterfulgt av opparbeidelse, hvorved man får et nukleosid-3'-H-fosfonat (10). Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsnings-midlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen. Et foretrukket oppløsningsmiddel er et slikt halogenert hydrokarbon som diklormetan. Reaksjonstemperaturen er ikke av særlig avgjørende betydning, men reaksjonen utføres ved en temperatur fra -20 til 100°C, vanligvis ved romtemperatur.

Den tiden som kreves for reaksjonen, varierer avhengig av egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes og reaksjonstemperaturen. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur under anvendelse av diklormetan som oppløsningsmiddel, er den fullstendig i løpet av et tidsrom på 30 minutter.

[Trinn 41]

I dette trinnet kan sluttproduktet (1) fremstilles ved å omsette nukleosid-3'-H-fosfonatet (10) fremstilt i trinn 40 med CPG-bundet ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a-6d, 7a eller 7b), som syntetiseres på et synteseapparat, og avbeskyttelse av en 5'-ende-DMT-gruppe alene, med beskyttelsesgrupper i base- og fosforsyrerestene ved anvendelse av et kondensasjonsmiddel, slik som pivaloylklorid i nærvær av et avsuringsmiddel, hvorved det fås en H-fosfonsyrediesterbinding, transformasjon av H-fosfon-syregruppen til en fosforsyrediestergruppe under anvendelse av et oksidasjonsmiddel, avspalting av ODN fra CPG-bundet ODN og samtidig fjerning av beskyttelsesgruppen til en baserest under basiske betingelser, og til sist rensing. Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oppløsningsmidlet som anvendes, forutsatt at det ikke har noen skadelig effekt på reaksjonen.

Et foretrukket oppløsningsmiddel er vannfritt acetonitril. Eksempler på kondensasjonsmidler omfatter syreklorider og fos-forsyreklorid, fortrinnsvis pivaloylklorid.

Det er ingen bestemt begrensning på egenskapene til oksidasjonsmidlet som anvendes for å oksidere en H-fosfonsyregruppe i ODN til en fosforsyrediestergruppe, forutsatt at det kan anvendes som et oksidasjonsmiddel i oksidasjonsreaksjoner. Eksempler på egnede oksidasjonsmidler omfatter: uorganiske metalloksider, inkludert manganoksider, slik som kaliumpermanganat eller mangandioksid; ruteniumoksider, slik som ruteniumtetraoksid; selenoksider, slik som selendioksid; jernforbindelser, slik som ferriklorid; osmiumforbindelser, slik som osmiumtetraoksid; sølvforbindelser, slik som sølvoksid; kvikk-sølvforbindelser, slik som kvikksølvacetat; blyoksidforbindelser, slik som blyoksid eller blytetraoksid; kromsyreforbindelser, slik som kaliumkromat, et kompleks av kromsyre og svovelsyre eller et kompleks av kromsyre og pyridin; og ceriumforbindelser, slik som ceriumammoniumnitrat (CAN); uorganiske oksidasjonsmidler inkludert halogenmolekyler, slik som et klor-, brom- eller jodmolekyl; perjodider, slik som natrlum-per jodid; ozon; hydrogenperoksid; nitrøse forbindelser, slik som salpetersyrling; klorsyreforbindelser, slik som natriumkloritt; og persulfatforbindelser, slik som kaliumpersulfat eller natriumpersulfat; og organiske oksidasjonsmidler, inkludert reagens brukt i DMSO-oksidasjon (en kombinasjon av dimetylsulfoksid og disykloheksylkarbodiimid, oksalylklorid, eddiksyreanhydrid eller fosforpentaklorid, eller et kompleks av pyridin og svovelsyreanhydrid); peroksider, slik som tert-butylhydroperoksid; stabile kationer, slik som trifenylmetylkation; succinimider, slik som N-bromsuccinimid; hypoklorsyreforbindelser, slik som tert-butylhypokloritt; azodikarboksylsyreforbindelser, slik som azodikarboksylat; en kombinasjon av disulfider, slik som dimetyldisulfid, difenyldisulfid eller dipyridyldisulfid og trifenylfosfin; nitritter, slik som metylnitritt; tetrahalogenerte forbindelser, slik som tetrabrommetan; og kinonforbindelser, slik som 2,3-diklor-5,6-dicyan-p-benzokinon (DDQ); helst jod.

Som det anvendte avsuringsmiddel kommer det i betraktning heterosykliske aminer, slik som pyridin eller dimetylaminopyridin, og alifatiske aminer, slik som trimetyl-

amin, trietylamin eller diisopropyletylamin; fortrinnsvis alifatiske aminer (særlig diisopropyletylamin). Reaksjonstemperaturen er ikke av særlig avgjørende betydning, men reaksjonen utføres normalt ved hjelp av en temperatur fra -50 til 50°C, fortrinnsvis ved romtemperatur.

Den tid som kreves for reaksjonen, varierer avhengig

av egenskapene til utgangsforbindelsen og oppløsningsmidlet som anvendes, samt reaksjonstemperaturen, men reaksjonen skjer normalt i løpet av et tidsrom på 5 minutter til 30 timer. Når reaksjonen utføres ved romtemperatur, er den fortrinnsvis fullstendig i løpet av et tidsrom på 30 minutter.

Spalting av ODN fra CPG-bundet ODN og fjerning av beskyttelsesgruppene bortsett fra 5'-endesubstituenten, ut-

føres i henhold til fremgangsmåtene som er kjent per se (J.

Am. Chem. Soc, 103, 3185 (1981)].

Reaksjonsblandingen som inneholder forbindelsene med

den generelle formel (1), renses ved hjelp av vanlige renseteknikker, for eksempel forskjellig kromatografi inkludert reversfase

og ionebytterkromatografi (omfattende høyhastighetsvæskekro-matografi), hvorved man får forbindelsene med den generelle formel (1).

De nye oligodeoksyribonukleotidene med formel (11) fremstilles ved hjelp av en bestemt fremgangsmåte, og omfatter de nye forbindelsene med den generelle formel (1). For anvendelse i fremgangsmåten tilveiebringer dessuten foreliggende oppfinnelse nye mellomproduktforbindelser som vil bli definert mer konkret.

I den følgende beskrivelse anvendes et forskjellig sett av definisjoner for substituentgruppene, men sammenhengen mellom de respektive definisjoner kan lett forstås. Således kan likheten for eksempel ses mellom substituentgruppen R1R2R3Z- i forbindelsene med den generelle formel (1), og substituentgruppen R<4>R<5>R<6>Z- vist for forbindelsene anvendt og fremstilt ved hjelp av den her beskrevne fremgangsmåte. Det er dessuten nødvendig å legge merke til at gruppene som er vist med indekser nede, slik som RlfR2, Ylfetc, ikke alltid er identiske med gruppene som er vist med indekser oppe, slik som R^- f R^ 7 Y f 6"tc •

I dette aspekt omfatter fremgangsmåten fremstilling av et oligodeoksyribonukleotid med et substituert fosfat i 3'-enden. Nærmere bestemt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye linkerforbindelser for anvendelse med polymerbærere ved fremstillingen av fastfasematerialer for syntese av oligodeoksyribonukleotider. Fastfasematerialene kan ha en beskyttet hydroksygruppe i enden av linkeren til polymerbæreren, som så kan avbeskyttes og omsettes for å addere nukleotider.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således for eksempel linkerforbindelser, slik som de følgende forbindelser (12) som polymerbærere kan gi beskyttede fastfasematerialer med (14) for avbeskyttelse til forbindelser (22) og etterføl-gende omsetning til forbindelser (24), (25) og (27) med til-satte nukleotider.

Fremgangsmåten for fremstilling av en forbindelse representert ved formel (11):

[hvorR4,R<5>, R6 og en gruppe Z (hvorR4,R<5>og R6 kan være like eller forskjellige fra hverandre, og hver uavhengig av hverandre er et hydrogenatom, en alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, en eventuelt substituert arylgruppe eller en eventuelt substi-

tuert antrakinonylgruppe; Z er et karbon- eller silisiumatom;R<5>,R<6>og Z kan til sammen være en fluorenylgruppe eller en xantenylgruppe; eller R4,R5,R<6>og Z kan til sammen være et hydrogenatom); R7 er et hydrogenatom, en eventuelt substituert alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, en eventuelt substituert arylgruppe eller en eventuelt substituert aralkylgruppe;Y<2>kan være like eller forskjellige og er et oksygenatom, et svovelatom eller en NH-gruppe; Y<3>er et oksygenatom, et svovelatom, en NH-gruppe, en alkylengruppe med 1-4 karbonatomer eller en fenylengruppe; X<3>er et oksygen eller svovelatom; og D er et oligodeoksyribonukleotid med en kjedelengde på 2-30, forutsatt at hydroksylgruppene i 5'- og 3'-endene ikke er inkludert i

D];

består i at:

en forbindelse med formel (12):

[hvorR<1>, R2 og R3 kan være like eller forskjellige fra hverandre, og hver uavhengig av hverandre er et hydrogenatom eller en alkoksygruppe med 1-4 karbonatomer; X<1>er en gruppe -S-,

-SO- eller -S02; A er en gruppe -(CH2)h- (hvor h er et helt tall fra 1 til 16), en gruppe -(CH2)h0- (hvor h er et helt tall fra 1 til 16), en gruppe -(CH2)J-0-CO-(CH2)k- (hvor j er et positivt helt tall, k er 0 eller et positivt helt tall, og j + k er 2-16) eller en gruppe -(CH2)j-NH-CO-(CH2)k- (hvor j er et positivt helt tall, k er 0 eller et positivt helt tall, og j + k er 2-16), en gruppe -(CH2).,-S-CO-(CH2)k- (hvor j er et positivt helt tall, k er 0 eller et positivt helt tall, og j + k er 2-16), eller en gruppe -(CH2)n-0-CO-CH2(OCH2CH2)p-OCH2- (hvor n er et positivt helt tall, p er 0 eller et positivt helt

tall, og j + k er 2-100); og Y<1>er en hydroksylgruppe, en eventuelt substituert fehyloksygruppe éller en etyloksygruppe som kan være substituert med et halogenatom],

omsettes med et polymermateriale med den generelle formel (13):

[hvor X<2>er et oksygenatom, et svovelatom eller en NH-gruppe; og P er et polymert materiale] (forutsatt at i tilfellet når Y<1>i den generelle formel (12) er en hydroksylgruppe, omsettes forbindelsen med den generelle formel (12) med et karboksyl-syreaktiverende middel før omsetningen med polymermaterialet (13), hvorved det fås et polymermateriale med den generelle formel (14):

[hvorR1,R2, R3, X1, A,X<2>og P har de samme betydninger som definert ovenfor];

forutsatt at for forbindelser med den generelle formel (12) eller (14), når A er er en gruppe med formel -(CH2)j-0-C0-(CH2)k-, er j forskjellig fra 2; og

det resulterende polymermateriale med formel (14) underkastes DNA-kjedeforlengelsesbehandling under anvendelse av et DNA-synteseapparat.

Denne fremgangsmåten er vist i de følgende reaksjons-skj emaer.

I reaksjons skjemaene ovenfor harR<1>,R<2>,R3,R<4>,R<5>,

R<6>, R7,X<1>,X<2>,X<3>, P,Y1,Y2,Y<3>, A og Z de samme betydninger som definert ovenfor (i de øvrige forbindelsene bortsett fra forbindelse (11) er imidlertid R<4>,R<5>,R<6>og Z til sammen ikke et hydrogenatom). R<8a>er en metylgruppe eller en cyanetylgruppe,R<8b>er en fenylgruppe som eventuelt er substituert med en klorgruppe, R<8>er en metylgruppe, en cyanetylgruppe eller en fenylgruppe som eventuelt er substituert med en klorgruppe,R<9a>er et hydrogenatom eller en hydrogengruppe med en beskyttelsesgruppe, X er et halogenatom (fortrinnsvis klor, brom og jod),A<1>er en alkylengruppe med 1-20 karbonatomer, m er et helt tall fra 1 til 14, n er et helt tall fra 1 til 28, B, B' og B" er hver en baserest av adeninnukleotid, guaninnukleotid, tyminnukleotid, uracilnukleotid og cytosinnukleotid beskyttet i base- og fosfatrestene (de bør velges for å tilveiebringe en ønsket basesekvens), med det forbehold at B' er baseresten i 3'-endenukleotidet i D med den ønskede basesekvens, B" er baseresten i 5'-endenukleotidet i D med den ønskede basesekvens, D er det ønskede oligonudeoksyribonukleotid (forutsatt at 5'-endehydroksylgruppen og 3'-endehydroksylgruppen ikke er inkludert), Q er en halogenalkylgruppe, en halogenfenylgruppe eller en nitrofenylgruppe, slik som en 2,2,2-trikloretylgruppe, 2,2-dikloretylgruppe, 2-kloretylgruppe, 2,2, 2-tribrom-etylgruppe, 2,2-dibrometylgruppe, 2-brometylgruppe, 2-nitrofenylgruppe, 4-nitrofenylgruppe, 2,4-dinitrofenylgruppe, 2,4,5-triklorfenylgruppe og 2,3,4,5,6-pentaklorfenylgruppe (fortrinnsvis trikloretylgruppe og ortonitrofenylgruppe), V er en lavere alkylgruppe (fortrinnsvis metyl-, etyl- og isopro-pylgrupper, særlig isopropylgruppe).

Hvert trinn vil bli nærmere beskrevet nedenunder.

(Trinn 1)

Dette trinnet er for fremstilling av en forbindelse (17) ved å omsette 2-merkaptoetanol (16) med en w-halogenkar-boksylsyre (15) i et inert oppløsningsmiddel i nærvær av et syrebindingsmiddel.

Det anvendbare oppløsningsmiddel er ikke særlig begrenset med mindre det påvirker reaksjonen, men det omfatter aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen og xylen, halogenerte hydrokarboner, slik som metylenklorid og kloroform, etere, slik som eter, tetrahydrofuran, dioksan og dimetoksyetan, amider, slik som dimetylformamid, dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, sulfoksider, slik som dimetylsulfoksid, alkoholer, slik som metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol og isoamylalkohol, fortynnede syrer, slik som vandig svovelsyre, fortynnede baser, slik som vandig natriumhydroksid, vann, ketoner, slik som aceton og metyletylketon, heterosykliske aminer, slik som pyridin, og nitriler, slik som acetonitril, fortrinnsvis ketoner, slik som aceton, og alkoholer, slik som etanol og propanol.

Det anvendbare syrebindingsmiddel omfatter alkalimetallkarbonater, slik som kaliumkarbonat og natriumkarbonat, alkalimetallhydrogenkarbonater, slik som natriumhydrogenkarbonat, alkalimetallhydroksider, slik som natriumhydroksid og kaliumhydroksid, og organiske aminer, slik som trietylamin, fortrinnsvis alkalimetallkarbonater (særlig kaliumkarbonat).

Reaksjonstemperatur og reaksjonstid varierer avhengig av oppløsningsmidlet, syrebindingsmidlet, etc, som anvendes, reaksjonen utføres under refluks med oppvarming i 8 timer når kaliumkarbonat brukes.

Etter fullførelse av reaksjonen isoleres den ønskede forbindelse fra reaksjonsblandingen ved vanlige fremgangsmåter .

Etter at reaksjonsblandingen er passende nøytralisert og eventuelle tilstedeværende, uoppløselige materialer er fjernet ved filtrering, tilsettes for eksempel et slikt vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel som etylacetat til reaksjonsblandingen. Etter at den resulterende blanding er vasket med vann, fraskilles det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, og tørkes over vannfritt magnesium-sulf at, etterfulgt av avdamping av oppløsningsmidlet, hvorved man får den ønskede forbindelse.

Den således erholdte, ønskede forbindelse kan, om ønsket, renses videre ved vanlige fremgangsmåter, slik som rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi, etc.

(Trinn 2)

Dette trinnet er for fremstilling av en forbindelse (18) som tilsvarer forbindelsen (17) hvis hydroksylgruppe er beskyttet, ved omsetning av forbindelsen (17) med et beskyttelsesreagens som kan fjernes (fortrinnsvis dimetoksytritylklorid) under en sur betingelse i et inert oppløsningsmiddel i nærvær av et syrebindingsmiddel.

Oppløsningsmidlet som anvendes, er ikke spesielt begrenset så lenge det ikke påvirker reaksjonen og kan oppløse utgangsmaterialene i en viss grad, og det omfatter slike aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen og xylen, slike halogenerte hydrokarboner som metylenklorid og kloroform, slike etere som eter, tetrahydrofuran, dioksan og dimetoksyetan, slike amider som dimetylformamid, dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, slike sulfoksider som dimetylsulfoksid, slike ketoner som aceton og metyletylketon, slike heterosykliske aminer som pyridin, og slike nitriler som acetonitril, fortrinnsvis heterosykliske aminer (spesielt pyridin).

Det beskyttende reagens som kan anvendes, omfatter tritylhalogenider, slik som tritylklorid, monometoksytrityl-klorid, dimetoksytritylklorid og trimetoksytritylklorid, fortrinnsvis dimetoksytritylklorid.

Syrebindingsmidlet som anvendes, er ikke spesielt begrenset med mindre det påvirker reaksjonen og dekomponerer produktet og utgangsmaterialene, og det omfatter fortrinnsvis aromatiske aminer, slik som pyridin og dimetylaminopyridin.

Selv om reaksjonstemperaturen og reaksjonstiden varierer avhengig av typen av beskyttelsesreagens og syrebindingsmiddel som anvendes, utføres reaksjonen ved romtemperatur i 2 timer når dimetoksytritylklorid anvendes som beskyttelsesreagens og pyridin brukes som oppløsningsmiddel og også som et syrebindingsmiddel.

Etter fullførelse av reaksjonen isoleres den ønskede forbindelse fra reaksjonsblandingen ved vanlige fremgangsmåter.

Etter at reaksjonsblandingen er passende nøytralisert og eventuelle tilstedeværende, uoppløselige stoffer er fjernet ved filtrering, tilsettes et vannublandbart, organisk oppløs-ningsmiddel, slik som etylacetat, til reaksjonsblandingen. Etter at den resulterende blanding er vasket med vann, fraskilles det organiske lag som inneholder den ønskede forbin- deise, og tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, etterfulgt av avdamping av oppløsningsmidlet, hvorved man får den ønskede forbindelse.

Den således erholdte, ønskede forbindelse kan videre, om nødvendig, renses ved hjelp av vanlige fremgangsmåter, slik som rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi, etc.

(Trinn 3)

Dette trinnet er for fremstilling av forbindelsen (18) ved omsetning av en forbindelse (19) med et dikarboksylsyreanhydrid (20) i et inert oppløsningsmiddel.

Oppløsningsmidlet som anvendes, er ikke spesielt begrenset så lenge det ikke påvirker reaksjonen og kan oppløse utgangsmaterialene i en viss grad, og det omfatter slike aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen og xylen, slike halogenerte hydrokarboner som metylenklorid og kloroform, slike etere som eter, tetrahydrofuran, dioksan og dimetoksyetan, slike amider som dimetylformamid, dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, slike sulfoksider som dimetylsulfoksid, slike ketoner som aceton og metyletylketon, slike heterosykliske aminer som pyridin, og slike nitriler som acetonitril, fortrinnsvis halogenerte hydrokarboner, slik som metylenklorid.

Syrebindingsmidlet som anvendes, omfatter slike pyri-diner som pyridin, dimetylaminopyridin og 4-pyrrolidinopyridin, fortrinnsvis dimetylaminopyridin.

Selv om dikarboksylsyreanhydridet som kan anvendes ikke er spesielt begrenset så lenge det er anhydrider av a, u-alkyldikarboksylsyre med 3-16 karbonatomer, er det fortrinnsvis ravsyreanhydrider.

Selv om reaksjonstemperaturen og reaksjonstiden varierer avhengig av typen av syreanhydridet, syrebindingsmidlet, etc. som anvendes, utføres reaksjonen ved romtemperatur i 30 minutter når ravsyreanhydrid brukes og dimetylaminopyridin brukes som et syrebindingsmiddel.

Etter at reaksjonsblandingen er passende nøytralisert og de eventuelle, tilstedeværende, uoppløselige stoffer er fjernet ved filtrering, tilsettes for eksempel et vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel, slik som etylacetat, til reaksjonsblandingen. Etter at den resulterende blanding er vasket med vann, fraskilles det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, og tørkes over vannfritt magnesium-sulf at, etterfulgt av fordamping av oppløsningsmidlet, hvorved man får den ønskede forbindelse.

Den således erholdte, ønskede forbindelse kan, om ønsket, renses videre ved hjelp av vanlige fremgangsmåter, slik som rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi, etc.

(Trinn 4)

Dette trinnet er for dannelse av en aktiv ester (12) ved omsetning av karboksylgruppen i forbindelsen (18) med en fri karboksylgruppe, med et esterdannende reagens, etterfulgt av omsetning med en eventuelt substituert fenol.

Oppløsningsmidlet som anvendes, er ikke spesielt begrenset med mindre det påvirker reaksjonen, og det omfatter slike aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen og xylen, slike halogenerte hydrokarboner som metylenklorid, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen og diklorbenzen, slike estere som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat og dietylkarbonat, slike ketoner som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon og sykloheksanon, slike nitroforbindelser som nitroetan og nitrobenzen, slike nitriler som acetonitril og isobutyronitril, slike amider som formamid, dimetylformamid (DMF), dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, og slike sulfoksider som dimetylsulfoksid og sulforan, fortrinnsvis halogenerte hydrokarboner (særlig metylenklorid) og amider (særlig dimetylformamid).

Fenolen som kan anvendes, er ikke spesielt begrenset så lenge den kan brukes som en aktiv ester, og den omfatter 4-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol, 2,4,5-triklorfenol, pentaklorfenol og 2,3,5,6-tetrafluorfenol, fortrinnsvis pentaklorfenol.

Det esterdannende reagens som kan anvendes, omfatter for eksempel slike N-hydroksyforbindelser som N-hydroksy-succinimid, 1-hydroksybenzotriazol og N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksyimid, slike diimidazolforbindelser som 1,1'- oksalyldiimidazol og N,N'-karbonyldiimidazol, slike disulfid-forbindelser som 2,2'-dipyridyldisulfid, slike ravsyreforbindelser som N,N'-disuccinimidylkarbonat, slike fosfinsyreklorid-forbindelser som N,N'-bis(2-okso-3-oksazolidinyl)fosfinsyre-klorid, slike oksalatforbindelser som N,N'-disuccinimidyloks-alat (DSO), N,N-diftalimidyloksalat (DPO), N,N'-bis(norbornen-ylsuccinimidyl)oksalat (BNO), 1,1'-bis(benzotriazolyl)oksalat (BBTO), 1,1'-bis(6-klorbenzotriazolyl)oksalat (BCTO) og 1,1'-bis(6-trifluormetylbenzotriazolyl)oksalat (BTBO) og slike karbodiimider som disykloheksylkarbodiimid (DCC), fortrinnsvis diimidazolforbindelser og karbodiimider (særlig DCC).

Selv om reaksjonstemperaturen og reaksjonstiden varierer avhengig av typen av det esterdannende reagens og oppløs-ningsmidlet som anvendes, utføres reaksjonen ved 0°C til 100°C i 5-50 timer, og særlig når pentaklorfenol og DCC anvendes i DMF, utføres reaksjonen ved romtemperatur i 18 timer.

Etter fullførelse av reaksjonen isoleres den ønskede forbindelse fra reaksjonsblandingen ved hjelp av vanlige fremgangsmåter.

Den således erholdte, ønskede forbindelse kan renses videre, om nødvendig, ved hjelp av vanlige fremgangsmåter, slik som rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi, etc.

(Trinn 5)

Dette trinnet er for fremstilling av en forbindelse (12) ved omsetning av forbindelsen (19) med en forbindelse (21) i et inert oppløsningsmiddel i nærvær av et syrebindingsmiddel .

Oppløsningsmidlet som anvendes, er ikke spesielt begrenset med mindre det påvirker reaksjonen, og det omfatter slike aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen og xylen, slike halogenerte hydrokarboner som metylenklorid, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen og diklorbenzen, slike estere som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat og dietylkarbonat, slike ketoner som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon og sykloheksanon, slike nitroforbindelser som nitroetan og nitrobenzen, slike nitriler som acetonitril og isobutyronitril, slike amider som formamid, dimetylformamid (DMF), dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, slike sulfoksider som dimetylsulfoksid og sulforan, fortrinnsvis halogenerte hydrokarboner, særlig metylenklorid.

Syrebindingsmidlet som kan anvendes, omfatter organiske baser, slik som trietylamin, tributylamin, diisopropyletylamin, N-metylmorfolin, pyridin, 4-(N,N-dimetylamino)pyridin, N,N-dimetylanilin, N,N-dietylanilin, 1,5-diazabisyklo-[4.3.0]non-5-en, 1,4-diazabisyklo[2.2.2]oktan (DABCO) og 1,8-diazabisyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU), fortrinnsvis organiske baser, særlig pyridin og N-metylmorfolin.

Selv om reaksjonstemperaturen og reaksjonstiden varierer avhengig av typen av syrebindingsmidlet som anvendes, utføres reaksjonen vanligvis ved 10°C til 40°C i 1-5 timer.

Etter fullførelse av omsetningen isoleres den ønskede forbindelse fra reaksjonsblandingen ved hjelp av vanlige fremgangsmåter .

Etter at reaksjonsblandingen er passende nøytralisert og de eventuelle tilstedeværende, uoppløselige stoffer er fjernet ved filtrering, tilsettes for eksempel et vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel, slik som etylacetat, til reaksjonsblandingen. Etter at den resulterende blanding er vasket med vann, fraskilles det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, og det tørkes over vannfritt magnes-iumsulf at, etterfulgt av fordamping av oppløsningsmidlet, hvorved man får den ønskede forbindelse.

Den således erholdte, ønskede forbindelse kan, om nødvendig, renses videre ved hjelp av vanlige fremgangsmåter, slik som rekrystallisasjon, nyutfelling, kromatografi, etc.

(Trinn 6)

Dette trinnet er for fremstilling av et polymerderi- vat (14) som kan anvendes som bæreren for å syntetisere et oligonukleotid ved å omsette forbindelsen (12) som har en aktivert karboksylgruppe, erholdt i trinn 5, med et polymermateriale (13), slik som kontrollert poreglass (CPG) hvortil en aminogruppe, en hydroksylgruppe, en sulfhydrylgruppe, etc, er bundet via en alkylengruppe i et inert oppløsningsmiddel.

Selv om polymermaterialet (13) som kan anvendes i dette trinnet ikke er spesielt begrenset så lenge det vanligvis kan brukes som en bærer, bør overflatearealet til tredi-mensjonal retikulatstruktur, andelen av hydrofilt gruppesete, kjemisk sammensetning, trykkresistens, etc, til bæreren undersøkes.

Bæreren som kan anvendes, omfatter polysakkaridderi-vater, slik som cellulose, dekstran og agarose, slike synte-tiske polymerer som polyakrylamidgel, polystyrenharpikser og polyetylenglykol, og slike uorganiske materialer som silikagel, porøst glass og metalloksider, ikke-begrensende typebe-stemt ved hjelp av kommersielt tilgjengelige bærere, slik som aminopropyl-CPG og langkjedet aminoalkyl-CPG (produsert av CPG Inc.), "Cosmosil NH2" og "Cosmosil Diol" (produsert av Nakarai Tesuku), "CPC-Silica Carrier Silane Coated", aminopropyl-CPG-550A, aminopropyl-CPG-1400A og polyetylenglykol 5000-mono-metyleter (produsert av Furuka Co.), p-alkoksybenzylalkoholharpiks, aminometylharpiks og hydroksymetylharpiks (produsert av Kokusan Kagaku K.K.) og polyetylenglykol 14000-monometyl-eter (produsert av Union Carbide).

Den funksjonelle gruppe som er bundet til bæreren, omfatter videre fortrinnsvis en aminogruppe, en sulfhydrylgruppe og hydroksylgruppe.

Oppløsningsmidlet som kan anvendes, er ikke spesielt begrenset så lenge det ikke påvirker reaksjonen og kan oppløse utgangsmaterialene i en viss utstrekning, og det omfatter fortrinnsvis slike aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen og xylen, slike halogenerte hydrokarboner som metylenklorid, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen og diklorbenzen, slike estere som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat og dietylkarbonat, slike ketoner som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon og sykloheksanon, slike nitroforbindelser som nitroetan og nitrobenzen, slike nitriler som acetonitril og isobutyronitril, slike amider som formamid, dimetylformamid, dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, slike sulfoksider som dimetylsulfoksid og sulforan, fortrinnsvis halogenerte hydrokarboner (særlig metylenklorid) og amider (særlig dimetylformamid).

Reaksjonstemperaturen er vanligvis fra -20 til 150°C, fortrinnsvis fra 0 til 50°C.

Selv om reaksjonstiden varierer avhengig av utgangsmaterialene, oppløsningsmidlet, reaksjonstemperaturen som anvendes, er den vanligvis 1-200 timer, fortrinnsvis 24-100 timer.

Etter fullførelse av reaksjonen isoleres den ønskede forbindelse fra reaksjonsblandingen ved hjelp av vanlige fremgangsmåter .

Den ønskelige polymerbærer utvinnes for eksempel ved filtrering fra reaksjonsblandingen, vaskes med et organisk oppløsningsmiddel, slik som metylenklorid, og tørkes under redusert trykk, hvorved man får den ønskede forbindelse.

(Trinn 7)

Dette trinnet er for fremstilling av en forbindelse (22) ved omsetning av forbindelsen (14) med et avbeskyttelsesreagens i et inert oppløsningsmiddel for å fjerne selektivt hydroksylgruppens beskyttelsesgruppe.

Trinn 7 til trinn 11 utføres for øvrig vanligvis i et DNA-synteseapparat.

Oppløsningsmidlet som kan anvendes, omfatter fortrinnsvis slike aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen og xylen, slike halogenerte hydrokarboner som metylenklorid, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen og diklorbenzen, slike estere som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat og dietylkarbonat, slike etere som dietyleter, diisopropyleter, tetrahydrofuran, dioksan, dimetoksyetan og dietylenglykoldimetyleter, slike alkoholer som metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, t-butanol, isoamylalkohol, dietylenglykol, glyserol, oktanol, sykloheksanol og metylcellosolv, slike ketoner som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon og sykloheksanon, slike nitroforbindelser som nitroetan og nitrobenzen, slike nitriler som acetonitril og isobutyronitril, slike amider som formamid, dimetylformamid, dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, slike sulfoksider som dimetylsulfoksid og sulforan, helst alkoholer (særlig metanol og etanol) og metylenklorid, og når eddiksyre brukes som et avbeskyttelsesreagens, er en blanding av eddiksyre og vann inkludert.

Selv om avbeskyttélsesreagenset som kan anvendes ikke er spesielt begrenset så lenge det er vanlig brukt, og dersom beskyttelsesgruppen er en triarylmetylgruppe, eddiksyre, dikloreddiksyre, trifluoreddiksyre, saltsyre og en Lewis-syre, slik som for eksempel sinkbromid, kan det fortrinnsvis anvendes eddiksyre, dikloreddiksyre og trifluoreddiksyre.

Selv om reaksjonstemperaturen varierer avhengig av reagenset, utgangsmaterialene og oppløsningsmidlet som anvendes, er den vanligvis fra -10 til 100°C, fortrinnsvis fra 0 til 50°C.

Selv om reaksjonstiden varierer avhengig av utgangsmaterialene, oppløsningsmidlet og reaksjonstemperaturen som anvendes, er den vanligvis fra 1 minutt til 50 timer, fortrinnsvis fra 1 minutt til 24 timer.

Den polymere bærer utvinnes for eksempel ved filtrering fra reaksjonsblandingen, vaskes med et organisk oppløs-ningsmiddel, slik som metylenklorid, og tørkes under redusert trykk, hvorved man får den ønskede forbindelse.

(Trinn 8)

Dette trinnet er for fremstilling av en forbindelse (24) ved omsetning av en forbindelse (23), (23') eller (23") med en dimetoksytritylgruppe i 5'-hydroksylgruppen, hvor baseresten er den i 3'-enden i en ønskelig basesekvens, og 3'-hydroksylgruppen har, via fosfor bundet til den, en ønsket alkyloksy-, fenyloksy-, aralkyloksy-, alkyl-, aralkyl- og fenylgruppe med polymermaterialet (22), etterfulgt av tioering eller alkylaminering, om nødvendig, hvorved man får en slik forbindelse (24) som har den ønskede 3'-endenukleotidenhet bundet til et polymert materiale, slik som CPG.

Forbindelsene (23), (23') og (23") som kan anvendes, vil hver for seg bli beskrevet nedenunder. (a) Dersom forbindelse (23) omsettes i dette trinnet, anvendes det et surt materiale.

Det sure materiale som kan anvendes, omfatter slike som tetrazol etc, fortrinnsvis tetrazol. Selv om oksidasjonsmidlet som kan anvendes i oksidasjonsreaksjonen i dette trinnet, ikke er spesielt begrenset så lenge som det er vanlig brukt i oksidasjonsreaksjoner, omfatter det fortrinnsvis uorganiske metalloksidasjonsmidler, slik som manganoksider, for eksempel kaliumpermanganat og mangandioksid, ruteniumoksider, for eksempel ruteniumtetraoksid, selenforbindelser, for eksempel selendioksid, jernforbindelser, for eksempel jern(III)-klorid, osmiumforbindelser, for eksempel osmiumtetraoksid, sølvforbindelser, for eksempel sølvoksid, kvikksølvforbind-elser, for eksempel kvikksølvacetat, blyoksidforbindelser, for eksempel blyoksid og blytetraoksid, kromsyreforbindelser, for eksempel kaliumkromat, kromsyre-svovelsyre-kompleks og kromsyre-pyridin-kompleks, og ceriumforbindelser, for eksempel ceriumammoniumnitrat (CAN), slike uorganiske oksidasjonsmidler som halogenmolekyler, for eksempel klormolekyl, brommolekyl og jodmolekyl, perjodsyrer, for eksempel natriumperjodat, ozon, vandig hydrogenperoksid, salpetersyrlingforbindelser, for eksempel salpetersyre, klorsyreforbindelser, for eksempel kaliumkloritt og natriumkloritt, og persvovelsyreforbindelser, for eksempel kaliumpersulfat og natriumpersulfat, og organiske oksidasjonsmidler, slik som reagenser som kan anvendes for DMSO-oksidasjon (et kompleks av dimetylsulfoksid og disykloheksylkarbodiimid, oksalylklorid, eddiksyreanhydrid eller fosforpentoksid, eller et kompleks av pyridin-svovelsyreanhydrid), peroksider, f.eks. t-butylhydroperoksid, stabile kationer, for eksempel trifenylmetylkation, succinimider, for eksempel N-bromsuccinimid, hypoklorsyreforbindelser, for eksempel t-butylhypokloritt, azodikarboksylsyreforbindelser, for eksempel azodikarboksylsyreester, disulfider, for eksempel dimetyldisulfid, difenyldisulfid og dipyridyldisulfid, og trifenylfosfin, salpetersyrlingestere, for eksempel metylnitritt, karbontetrahalogenider, for eksempel metantetrabromid, og kinonforbindelser, for eksempel 2,3-diklor-5,6-dicyan-p-benzo- kinon (DDQ), fortrinnsvis jod. Oppløsningsmidlet som kan anvendes, er ikke spesielt begrenset så lenge som det ikke påvirker reaksjonen og kan oppløse utgangsmaterialene i en viss utstrekning, og det omfatter aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen og xylen, slik som halogenerte hydrokarboner som metylenklorid og kloroform, slike etere som eter, tetrahydrofuran, dioksan og dimetoksyetan, slike amider som dimetylformamid, dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, slike sulfoksider som dimetylsulfoksid, slike ketoner som aceton og metyletylketon, slike heterosykliske aminer som pyridin, og slike nitriler som acetonitril, fortrinnsvis heterosykliske aminer, (særlig pyridin), nitriler (særlig acetonitril), etere (særlig tetrahydrofuran) og halogenerte hydrokarboner (særlig metylenklorid).

Reaksjonen kan utføres ved -50 til 100°C, og selv om reaksjonstiden varierer avhengig hovedsakelig av reaksjonstemperaturen, typene av utgangsforbindelser og oppløsningsmidlet som anvendes, er den vanligvis 5 minutter til 15 timer. (b) Oppløsningsmidlet som anvendes når forbindelsen (23') omsettes, er ikke spesielt begrenset med mindre det påvirker reaksjonen, og et slikt aromatisk amin som pyridin anvendes fortrinnsvis.

I tilfellet hvor forbindelsen (23') omsettes, anvendes vanligvis et kondensasjonsmiddel.

Kondensasjonsmidlet som anvendes, omfatter disyklokarbodiimid (DCC), mesitylensulfonsyreklorid (Ms-Cl), triiso-propylbenzensulf onsyreklor id, mesitylensulfonsyretriazolid (MST), mesitylensulfonsyre-3-nitrotriazolid (MSNT), triisopro-pylbenzensulf onsyretetrazolid (TPS-Te), triisopropylbenzensul-fonsyrenitroimidazolid (TPS-NI) og triisopropylbenzensulfon-syrepyridyltetrazolid, fortrinnsvis MSNT, TPS-Te og TPS-NI. Selv om reaksjonstemperaturen ikke er spesielt begrenset i området fra -10 til 100°C, utføres reaksjonen vanligvis ved romtemperatur. Selv om reaksjonstiden varierer avhengig av oppløsningsmidlet og reaksjonstemperaturen som anvendes, er den 30 minutter i tilfellet hvor reaksjonen utføres ved romtemperatur under anvendelse av pyridin som oppløsningsmiddel for reaksjonen.

(c) Selv om oppløsningsmidlet som anvendes når for-

bindelsen (23") omsettes, ikke er spesielt begrenset med mindre det påvirker reaksjonen, anvendes fortrinnsvis vannfritt acetonitril. Som reagenset som brukes som kondensasjonsmiddel, anvendes syreklorider av karboksylsyre og fosforsyre, og fortrinnsvis anvendes pivaloylklorid.

Selv om oksidasjonsmidlet for oksidasjon av et oligonukleotid med et H-fosfonat bundet til et oligonukleotid av fosfodiestertype ikke er spesielt begrenset så lenge det vanligvis anvendes for oksidasjonsreaksjoner, omfatter det fortrinnsvis uorganiske metalloksidasjonsmidler, slik som manganoksider, for eksempel kaliumpermanganat og mangandioksid, ruteniumoksider, for eksempel ruteniumtetraoksid, selenforbindelser, for eksempel selendioksid, jernforbindelser, for eksempel jern(IIIJklorid, osmiumforbindelser, for eksempel osmiumtetraoksid, sølvforbindelser, for eksempel sølvoksid, kvikk-sølvforbindelser, for eksempel kvikksølvacetat, blyoksidforbindelser, for eksempel blyoksid og blytetraoksid, kromsyreforbindelser, for eksempel kaliumkromat, kromsyre-svovelsyre-kompleks og kromsyre-pyridin-kompleks, og ceriumforbindelser, for eksempel ceriumammoniumnitrat (CAN), uorganiske oksidasjonsmidler slik som halogenmolekyler, for eksempel klormolekyl, brommolekyl og jodmolekyl, perjodsyrer, for eksempel natriumperjodat, ozon, vandig hydrogenperoksid, salpetersyrlingforbindelser slik som salpetersyrling, klorsyreforbindelser, for eksempel kaliumkloritt og natriumkloritt, og persvovelsyreforbindelser, for eksempel kaliumpersulfat og natriumpersulfat, og uorganiske oksidasjonsmidler slik som reagenser som kan anvendes for DMSO-oksidasjon (et kompleks av dimetylsulfoksid og disykloheksylkarbodiimid, oksalylklorid, eddiksyreanhydrid eller fosforpentoksid eller et kompleks av pyridin-svovelsyreanhydrid), peroksider, for eksempel t-butylhydroperoksid, stabile kationer, for eksempel trifenylmetylkation, succinimider, for eksempel N-bromsuccinimid, hypoklorsyreforbindelser, for eksempel t-butylhypokloritt, azodikarboksylsyreforbindelser, for eksempel metylazodikarboksylat, disulfider, for eksempel dimetyldisulfid, difenyldisulfid og dipyridyldisulfid og trifenylfosfin, salpetersyrlingestere, for eksempel metylnitritt, karbontetrahalogenider, for eksempel metantetrabromid, og kinonforbindelser, for eksempel 2,3- diklor-5,6-dicyan-p-benzokinon (DDQ), fortrinnsvis jodmolekyl.

Syrebindingsmidlet som kan anvendes, omfatter slike heterosykliske aminer som pyridin og dimetylaminopyridin, og slike alifatiske aminer som trimetylamin, trietylamin og diisopropyletylamin, fortrinnsvis heterosykliske aminer (særlig pyridin). Selv om reaksjonstemperaturen ikke er spesielt begrenset, er den vanligvis -50 til 50°C, fortrinnsvis romtemperatur .

Selv om reaksjonstiden varierer avhengig av utgangsmaterialene, reagenset, temperaturen, etc. som anvendes, er den vanligvis 5 minutter til 30 timer, fortrinnsvis 30 minutter når reaksjonen utføres ved romtemperatur.

Tioeringen som, om ønsket, utføres i dette trinnet, utføres på følgende måte: Etter at forbindelsen (23) er bundet til forbindelsen (22), omsettes et tioeringsreagens for å bevirke tioering i stedet for oksidasjonen med et jodmolekyl, etc, hvorved man får en forbindelse (24) som er en polymer bærer med et tioat bundet, slik som CPG.

Reagenset for tioering er ikke spesielt begrenset så lenge det kan dannet et tioat ved omsetning med treverdig fosfor, og det omfatter fortrinnsvis svovel og også tetraetyl-tiurumdisulfid (TETD) tilgjengelig fra Applied Biosystems og Beaucage-reagens tilgjengelig fra MilliGen/Biosearch. I tilfellet ved anvendelse av det førstnevnte, kan det ikke-begrensende brukes fremgangsmåten beskrevet i en kjent litteratur (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991)) eller variasjoner derav, og i tilfellet med det sistnevnte, kan ikke-begrensende fremgangsmåten beskrevet i en kjent litteratur (J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)), brukes.

Om ønsket, utføres alkylamineringen i dette trinnet på følgende måte: Etter at forbindelsen (23") er bundet til forbindelsen (22) som beskrevet ovenfor, omsettes et ønsket alkylamin med den ved romtemperatur i stedet for oksidasjonsmidlet, slik som et jodmolekyl. I henhold til denne fremgangsmåten kan det oppnås en forbindelse (24) hvor 3'-endenukleotidet som har den ønskede basesekvens, er bundet til et polymermateriale, slik som CPG, gjennom fosforamidatbinding.

(Trinn 9)

Dette trinnet utføres ved å 1) behandle polymermaterialet (24) erholdt i trinn 8 med en syre for å fjerne DMT-gruppen, 2) omsette det således behandlede polymermateriale

med et amidittreagens og en syrekatalysator, 3) underkaste det resulterende materiale en oksidasjonsreaksjon under anvendelse av et oksidasjonsmiddel, og 4) underkaste den uomsatte rest en tildekkingsreaksjon under anvendelse av eddiksyreanhydrid. I

dette trinnet gjentas de ovenfor nevnte fremgangsmåter 1) - 4) for å oppnå en forbindelse (25) hvortil bare 5'-endenukleotidet som har den ønskede basesekvens, ikke allerede er bundet. Forlengelsesreaksjonen for DNA-kjeden på et DNA-synteseapparat som anvendes i dette trinnet, utføres for eksempel ved en variasjon av fremgangsmåten ifølge Stec (J. Am. Chem. Soc, 106, 6077-6089 (1984)) under anvendelse av fosforamiditt-metoden ved å bruke "Applied Biosystems Model 380B" eller fos-foramidittmetoden (metoden ifølge H. Koester et al., i Nucleic Acids Res., 12, 4539 (1984)) under anvendelse av "Cyclone Plus" DNA-synteseapparat fra MilliGen/Biosearch, men fremgangsmåten er ikke begrenset til dette.

(Trinn 10)

Dette trinnet er for fremstilling av et polymermateriale (27) som har den ønskede basesekvens og substituenter, og som også bibeholder en beskyttelsesgruppe ved å fjerne 5'-ende-DMT-gruppen i polymermaterialet (25) erholdt i trinn 9 i henhold til fremgangsmåtene i trinn 7, etterfulgt av den samme behandling som i trinn 8 under anvendelse av forbindelsene (26), (26') og (26"), som beskrevet nedenunder, i stedet for forbindelsene (23), (23') og (23").

Forbindelsene (26), (26') og (26") er hver 2'-deoksy-ribonukleosid med en baserest hvor 5'-endenukleotidet i den ønskede basesekvens er beskyttet, eller et ribonukleosid med en beskyttet hydroksylgruppe i 2'-stilling, med en ønsket modifiserende gruppe i 5'-stillingen. Forbindelsen (26) har i 3'-stillingen en fosforamidittbinding inkludert i beskyttelsesgruppen for fosfatresten som skal anvendes til ordinær DNA-syntese. Likeledes har forbindelsen (26') en fosfodiesterbind-

ing, og forbindelsen (26") har en H-fosfonatbinding.

(Trinn 11)

Dette trinnet er for fremstilling av et ønsket oligonukleotid (11) ved avspalting av oligonukleotiddelen fra polymermaterialet (27), båret på det beskyttede polymermateriale erholdt i trinn 10, som har den ønskede basesekvens og substituenter i 5'- og 3'-endene, og fjerning av beskyttelsesgruppene bortsett fra de ønskede substituentene i 5'-enden og/eller 3'-enden. Fjerningen av beskyttelsesgruppen kan ut-føres ved hjelp av kjente fremgangsmåter (J. Am. Chem. Soc, 103, 3185 (1981)).

Den således erholdte reaksjonsblanding som inneholder forbindelsen med den generelle formel (11), renses ved hjelp av en vanlig rensebehandling som kan anvendes for rensing av nukleinsyre, for eksempel forskjellige kromatografier, slik som reversfase- og/eller ionebytterkromatografi (inkludert væskekromatografi med høy yteevne), etc, hvorved man får forbindelsen med den generelle formel (11).

(Trinn 12)

Dette trinnet er for fremstilling av en halvester av dikarboksylsyre, dvs. forbindelsen (15) som er utgangsmaterialet for foreliggende oppfinnelse, ved omsetning av den frie hydroksylgruppe i en forbindelse (29) eller den frie sulfhydrylgruppe i en forbindelse (30) med et dikarboksylsyreanhydrid som en forbindelse (28) i et inert oppløsningsmiddel i nærvær av en basisk katalysator.

Dikarboksylsyreanhydridet som kan anvendes, er ikke spesielt begrenset og omfatter fortrinnsvis dikarboksylsyre-anhydrider med 1-16 karbonatomer, og helst ravsyreanhydrid eller glutarsyreanhydrid. Den basiske katalysator som kan anvendes, omfatter fortrinnsvis aminopyridiner, slik som dimetylaminopyridin og pyrrolidinopyridin, slike tertiære aminer som trimetylamin og trietylamin, og karbonater av alkalimetaller, slik som natriumhydrogenkarbonat og kaliumkarbonat, helst dimetylaminopyridin og pyrrolidinopyridin. Oppløsningsmidlet som kan anvendes, er ikke spesielt begrenset så lenge som det ikke påvirker reaksjonen og kan oppløse utgangsmaterialene i en viss utstrekning, og det omfatter fortrinnsvis slike aromatiske hydrokarboner som benzen, toluen og xylen, slike halogenerte hydrokarboner som metylenklorid og kloroform, slike etere som eter, tetrahydrofuran, dioksan og dimetoksyetan, slike amider som dimetylformamid, dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, slike sulfoksider som dimetylsulfoksid, slike alkoholer som metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol og isoamylalkohol, slike fortynnede syrer som vandig svovelsyre, slike fortynnede baser som vandig natriumhydroksid, vann, slike ketoner som aceton og metyletylketon, slike heterosykliske aminer som pyridin, og slike nitriler som acetonitril, fortrinnsvis nitriler (særlig acetonitril), etere (særlig tetrahydrofuran) og halogenerte hydrokarboner (særlig metylenklorid).

Reaksjonen utføres ved -50 til 100°C, og selv om reaksjonstiden varierer avhengig av reaksjonstemperaturen, typen av utgangsmaterialer og oppløsningsmidlet som anvendes, er den vanligvis 30 minutter til 15 timer.

Etter fullførelse av reaksjonen samles den ønskede forbindelse opp fra reaksjonsblandingen ved hjelp av vanlige fremgangsmåter.

For eksempel etter at reaksjonsblandingen er passende nøytralisert og de eventuelt tilstedeværende, uoppløselige stoffer er fjernet ved filtrering, tilsettes for eksempel et vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel, som etylacetat, til reaksjonsblandingen. Etter at den resulterende blanding er vasket med vann, fraskilles det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, og tørkes over vannfritt magnesium-sulf at, etterfulgt av fordamping av oppløsningsmidlet, hvorved man får den ønskede forbindelse.

(Trinn 13)

Dette trinnet er for fremstilling av en forbindelse (18) ved omsetning av forbindelse (19) med dikarboksylsyre

(31) i et inert oppløsningsmiddel i nærvær av et esterdannende

reagens.

Oppløsningsmidlet som kan anvendes, er ikke spesielt begrenset med mindre det påvirker reaksjonen, og det omfatter aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen og xylen, slike halogenerte hydrokarboner som metylenklorid, kloroform, karbontetraklorid, dikloretan, klorbenzen og diklorbenzen, slike estere som etylformiat, etylacetat, propylacetat, butylacetat og dietylkarbonat, slike ketoner som aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, isoforon og sykloheksanon, slike nitroforbindelser som nitrbetan og nitrobenzen, slike nitriler som acetonitril og isobutyronitril, slike amider som formamid, dimetylformamid (DMF), dimetylacetamid og heksametylfosfortriamid, og slike sulfoksider som dimetylsulfoksid og sulforan, fortrinnsvis halogenerte hydrokarboner (særlig metylenklorid) og amider (særlig dimetylformamid).

Det esterdannende reagens som kan anvendes, omfatter for eksempel N-hydroksyforbindelser slik som N-hydroksysuccin-imid, 1-hydroksybenzotriazol og N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksyimid, slike diimidazolforbindelser som 1,1'-oksalyl-diimidazol og N,N'-karbonyldiimidazol, slike disulfidforbind-elser som 2,2'-dipyridyldisulfid, slike ravsyreforbindelser som N,N'-disuccinimidylkarbonat, slike fosfinsyrekloridfor-bindelser som N,N'-bis(2-okso-3-oksazolidinyl)fosfinsyre-klorid, slike oksalatforbindelser som N,N'-disuccinimidyl-oksalat (DSO), N,N-diftalimidyloksalat (DPO), N,N'-bis(norbor-nenylsuccinimidyl)oksalat (BNO), 1,1'-bis(benzotriazolyl)oksa-lat (BBTO), 1,1'-bis(6-klorbenzotriazolyl)oksalat (BCTO) og 1,1'-bis(6-trifluormetylbenzotriazolyl)oksalat (BTBO), og slike karbodiimider som disykloheksylkarbodiimid (DCC), fortrinnsvis diimidazolforbindelser og karbodiimider (særlig

DCC).

Selv om reaksjonstemperaturen og reaksjonstiden varierer avhengig av typen av det esterdannende reagens og oppløs-ningsmidlet som anvendes, utføres reaksjonen ved 0°C til 100°C i 5-50 timer.

Etter fullførelse; av reaksjonen isoleres den ønskede forbindelse fra reaksjonsblandingen ved hjelp av vanlige fremgangsmåter .

Etter at reaksjonsblandingen er passende nøytralisert og de eventuelt tilstedeværende, uoppløselige stoffer er fjernet ved filtrering, tilsettes for eksempel et vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel, slik som etylacetat, til reaksjonsblandingen. Etter at den resulterende blanding er vasket med vann, fraskilles det organiske lag som inneholder den ønskede forbindelse, og tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, etterfulgt av fordamping av oppløsningsmidlet, hvorved man får den ønskede forbindelse.

Ifølge fremgangsmåten beskrevet ovenfor kan et modifisert oligonukleotid med en ønsket substituent i 3'-enden til oligonukleotidet lett syntetiseres via fosfat på et DNA-synteseapparat, hvorved man får modifisert oligonukleotid med høy renhet i en stor mengde under anvendelse av enkle rensefrem-gangsmåter til en lav kostnad. Anvendbart oligonukleotid med en substituent i 3'-enden er beskrevet i japansk patentsøknad nr. Hei-301744, som har anti-AIDS-aktiviteter.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse utviser en spesifikk, cytopatisk aktivitet mot AIDS-virus (HIV-1) og kan spesifikt inhibere proliferasjonen av viruset i infiserte celler. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan følgelig anvendes til behandling og forhindring av AIDS.

Foreliggende oppfinnelse er konkret forklart ved illustrasjon med de følgende eksempler.

[Testeksempel 1] Måling av anti- HIV- l- aktivitet av modifiserte oli<g>odeoks<y>ribonukleotider

Anti-HIV-l-aktivitet ble målt ved hjelp av fremgangsmåten til Pauel et al. (R. Pauel et al., J. Virological Methods, 20, 309-321 (1988)). Som oppsummering, ble MT-4-celler i den eksponentielle vekstfase sentrifugert i 5 minutter ved 150 x g. Den erholdte cellepellet ble oppslemmet i dyrk-ningsmedier og infisert med HIV-1 (type UIB) i 1 time ved 37°C og en konsentrasjon på 10 CCID50. HIV-l-infiserte MT-4-celler ble erholdt ved sentrifugering i RPMI-1640-kulturmedier inne holdende 10% føtalt kalveserum (heretter "serumkulturmedier").

HIV-l-infiserte MT-4-celler og ikke-HIV-l-infiserte MT-4-celler ble oppslemmet i serumkulturmedier slik at en konsentrasjon på 4 x 10<5>celler/ml av hver ble oppnådd. 100 ul av en oppløsning av trinnvis fortynnet prøveforbindelse (oppløst i serumkulturmedium), fremstilt på forhånd, ble plassert i hver brønn i 98-brønners mikrotiterplater. Så ble 100 ul av hver av de ovenfor nevnte cellesuspensjoner tilsatt til hver brønn i mikrotiterplater, og deres celler ble dyrket i 6 dager i nærvær av 5% karbondioksidgass.

Som en kontroll ble HIV-l-infiserte MT-4-celler og ikke-HIV-1-infiserte MT-4-celler hvor ingen prøveforbindelse var tilsatt, dyrket på samme måte.

Etter dyrkingen ble antall levende celler målt basert på MTT(3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromid )-metoden (L. M. Green et al., J. Immunol. Methods, 70, 257-268 (1984)). Så ble den cytopatiske aktivitet av HIV-1 målt. Med den cytopatiske aktivitet av HIV-l-infiserte MT-4-celler hvor ingen prøveforbindelse var tilsatt som 100%, og den cytopatiske aktivitet av ikke-HIV-1- (type UIB) infiserte MT-4-celler hvor ingen prøveforbindelse var tilsatt som 0%, ble den konsentrasjon av prøven som inhiberte den cytopatiske aktivitet av HIV-l-infiserte MT-4-celler med 50% (IC50), bereg-net. Cytotoksisiteten til prøvefprbindelsen ble bestemt som den konsentrasjon som inhiberte formeringen av ikke-HIV-l-infiserte MT-4-celler med 50% (CC50). Resultatene av disse mål-ingene er vist i tabell 2.

Det ble følgelig definitivt vist ved hjelp av testre-sultatene at alle modifiserte oligodeoksyribonukleotider angitt i tabell 2, har en særlig sterk anti-(HIV-1)-aktivitet ved konsentrasjoner som er lavere enn 10 ug/ml.

Med mindre annet er angitt, betegner basesekvensen (for eksempel TGGGAGG) brukt i de følgende kjemiske struktu-rer, trietylaminsaltet av det respektive oligodeoksyribonukleotid, som ikke har en hydroksygruppe i både 5'- og 3'-stillingen.

Oppfinnelsen er videre illustrert ved hjelp av de følgende eksempler. I eksemplene er alle mesh-størrelser ifølge Tyler-standarden, og kjernemagnetiske resonansspektra ble erholdt ved å bruke trimetylsilan som en intern standard hvor det er angitt ved hjelp av forkortelsen "TMS". Mengden av oligodeoksyribonukleotidderivat fremstilt i hvert av disse eksemplene, ble målt ved hjelp av den optiske tetthet ved 260 nm [OD (260 nm)].

Eksempel 1

Ka) 5'- O- trityltymidin- 2- cyanetyl- N, N- diisopropylfosforamiditt

969 mg (2 mmol) 5'-O-trityltymidin [J. Am. Chem. Soc, 80, 6212 (1958)] ble tørket tre ganger ved hjelp av azeotrop destillasjon med pyridin, hvoretter det ble oppløst i 10 ml tetrahydrofuran. 1,39 ml (8 mmol) N,N-diisopropyl-N-

etylamin og 0,822 ml (4 mmol) 2-cyanetyl-N,N-diisopropylklor-fosforamiditt ble så tilsatt til oppløsningen, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter i argonatmosfære. Ved slutten av dette tidsrommet ble den resulterende utfelling filtrert fra reaksjonsblandingen, og filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble oppløst i 100 ml etylacetat, og oppløsningen ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml av en isavkjølt 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat. Oppløsningen ble så tørket over vannfritt natriumsulfat, hvoretter oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 40 g silikagel (70-230 mesh) under anvendelse av en blanding av metylenklorid, etylacetat og trietylamin i volumforholdet 45:45:10 som elueringsmiddel, hvorved man fikk 1,35 g (utbytte 98%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,62, 7,57 (til sammen 1H, to singletter),

7,46-7,20 (15H, multiplett),

6,46-6,37 (1H, multiplett),

4,68 (1H, bred singlett),

4,19, 4,15 (til sammen 1H, to brede singletter), 3,90-3,30 (6H, multiplett),

2,63-2,28 (4H, multiplett),

1,47 (3H, singlett),

1,23-1,00 (12H, multiplett).

Kb) En forbindelse med formel Kb):

Syntese ble utført ved å bruke et "Cyclone Plus" DNA/RNA-synteseapparat produsert av MilliGen/Biosearch (en avdeling av Millipore Ltd., Japan). I dette ble de kjemiske reagensene som tilsvarer nukleotidrestene i formel l(b) ovenfor, fylt for å syntetisere oligonukleotidet ovenfor. En programkassett for amidittmetoden ble innsatt i maskinen. Syntesen ble utført på en 15 umol skala. I dette tilfellet ble det brukt en 35 mM acetonitriloppløsning av 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] i stedet for en 2-cyanetylfos-foramidittoppløsning som tilsvarer tymidin. Reaksjonskolonnen var en kolonne for en reaksjon i 15,0 umol skala, pakket med 5 umol G-CPG [dvs. guanindeoksyribonukleosid (G) koblet til kontrollert poreglass (CPG)]. Konsentrasjonen av nukleotid på glassfyllstoffet var 35-44 umol/g, og CPG-fyllstoffet hadde en gjennomsnittlig porestørrelse på 50 nm. Den ønskede basesekvens TGGGAG ble tastet inn (som vanlig er, omfatter basesekvensen som her er nevnt, samt de som det er henvist til heretter, den basen som er blitt koblet til CPG), og programmet ble kjørt uten syrebehandling etter bindingsdannelse med den terminale T, hvorved man fikk et derivat hvor det ønskede, beskyttede oligonukleotid var koblet til det kontrollerte poreglass (CPG). Dette ble tørket under vakuum, fjernet fra kolonnen og nedsenket i ca. 10 ml 29% vandig ammoniakk. Det fikk så reagere ved romtemperatur i ca. 2 dager i en lukket beholder. Ved slutten av dette tidsrommet ble CPG fjernet ved filtrering og vasket to ganger, hver gang med 10 ml vann; filtratet og vaskeoppløsningene ble så slått sammen. Den kombi-nerte blanding ble så vasket tre ganger, hver gang med 30 ml dietyleter, hvoretter ammoniakken og dietyleteren ble fjernet ved avdamping under vakuum. Den resulterende, vandige oppløs-ning ble konsentrert til ca. 3 ml ved fordamping under redusert trykk, og den konsentrerte oppløsning ble filtrert ved hjelp av et milliporefilter (0,45 pm). Filtratet ble delt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne gjennom en 20,0 x 250 mm kolonne, "Inertsil PREP-ODS", som tidligere var blitt ekvill-brert med en 0,1 M vandig trietylammoniumacetatbuffer (TEAA)

(pH 7,3), inneholdende 20 volum% acetonitril, og ble overvåket

ved hjelp av ultrafiolett lys ved 254 nm. Det ønskede produkt ble eluert under anvendelse av en gradientelueringsmetode med 0,1 M TEAA inneholdende acetonitril ved konsentrasjoner i området fra 20 til 50 volum%>med en lineær gradient på 8 ml/minutt i løpet av et tidsrom på 30 minutter. Fraksjoner eluert etter 17,2 minutter, ble samlet opp og oppløsningen befridd for acetonitril ved inndamping under redusert trykk, hvoretter den resulterende, vandige oppløsning ble lyofilisert. Det således erholdte produkt ble oppløst i 50 ml vann og på nytt lyofilisert, hvorved man fikk 94,8 OD (260 nm) av forbindelsen med formel l(b) som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Xæak6 nm:

254.

Retensjonstid: 23,3 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS; elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient; 1 ml/minutt,

254 nm).

Eksempel 2

( 2a) 5'- tritvlamino- 5'- deoksytymidin

557 mg tritylklorid ble tilsatt til en oppløsning av 560 mg (2 mmol) 3'-0-acetyl-5'-amino-5'-deoksytymidin [som var blitt fremstilt ved fremgangsmåten rapportert av J. P. Horwitz et al. i J. Org. Chem., 27, 3045 (1962)] i 20 ml tørt pyridin, og den resulterende blanding ble varmet opp under refluks i 1 time mens fuktighet ble utelukket. Etter at det var fast-slått ved hjelp av tynnsjiktskromatografi (under anvendelse av metylenklorid inneholdende 5 volum% metanol som fremkallings-oppløsningsmiddel) at startforbindelsen hadde forsvunnet, ble oppløsningsmidlet fjernet fra reaksjonsblandingen ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble blandet med 10 ml hver av metanol og vann, og så ble blandingen konsentrert ved destillasjon under redusert trykk. Denne opera-sjonen ble gjentatt tre ganger, hvoretter resten ble oppløst i 30 ml etylacetat, og den resulterende oppløsning ble vasket med 20 ml hver av en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid, 0,2 N vandig saltsyre og en 5% vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat. Den organiske oppløsning ble så tør-ket over vannfritt magnesiumsulfat, og oppløsningen ble så inndampet til tørrhet under redusert trykk. Resten ble oppløst i 30 ml metanol mettet med ammoniakkgass, og kolben som inneholdt oppløsningen, ble lukket tett. Den fikk så stå over natten ved romtemperatur. Ved slutten av dette tidsrommet ble reaksjonsblandingen befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble oppløst i 10 ml metylenklorid. Oppløsningen ble renset ved kolonnekromatografi gjennom silikagel under anvendelse av metylenklorid inneholdende 5 volum% metanol som elueringsmiddel. Fraksjonene som inneholdt den ønskede forbindelse, ble slått sammen, og det ble inndampet til tørrhet under redusert trykk. Ved lyofilisering av resten fra benzen ble det erholdt 338 mg av tittelforbindelsen som et hvitt pulver.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,38 (1H, bred singlett),

7,48-7,18 (15H, multiplett),

7,04 (1H, multiplett),

6,67 (1H, triplett, J = 6,60 Hz),

4,35-4,29 (1H, multiplett),

4,01-3,95 (1H, multiplett),

2,62-2,06 (5H, multiplett),

1,84 (3H, singlett).

2( b) 5'- tritylamino- 5'- deoksytymidin- 2- cyanetyl- N, N- diisopropylfosforamiditt

0,15 g (0,31 mmol) 5'-tritylamino-5'-deoksytymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 2 ml metylenklorid. 0,23 ml (1,2 mmol) N,N-diisopropyl-N-etylamin ble så tilsatt til den resulterende oppløsning, hvoretter 0,08 ml (0,36 mmol) 2-cyanetyl-N,N-diisopropylklorfosforamiditt ble tilsatt i løpet av et tidsrom på 2 minutter i en nitrogen-

strøm. Den resulterende blanding ble så omrørt ved romtemperatur i 60 minutter. Ved slutten av dette tidsrommet ble det bekreftet at utgangsforbindelsen hadde forsvunnet ved hjelp av tynnsjiktskromatografi, og reaksjonsblandingen ble fortynnet med 30 ml etylacetat. Den resulterende, organiske oppløsning ble vasket med en mettet, vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og med en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid i nevnte rekkefølge. Det organiske lag ble filtrert gjennom et "1PS" filterpapir (Whatman), og filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 15 g silikagel (70-230 mesh), under anvendelse av etylacetat som elueringsmiddel, hvorved man fikk 0,19 g (utbytte 89%) av tittelforbindelsen som et skumaktig stoff.

<1>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,50-7,19 (15H, multiplett),

7,15, 7,06 (til sammen 1H, to singletter),

6,30-6,26 (1H, multiplett),

4,55-4,35 (1H, multiplett),

4,12-4,07 (1H, multiplett),

3,84-3,53 (4H, multiplett),

2,64-2,09 (6H, multiplett),

1,86, 1,84 (til sammen 3H, to singletter),

1,19-1,10 (12H, multiplett).

2( c) En forbindelse med formel 2( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men anvende 5'-tritylamino-5' - deoksytymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i fremstilling 2(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM vandig trimetylam-moniumhydrogenkarbonatbuffer (TEAB), pH 7,5, 20~* 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Eluatet ble opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel lb, hvorved man fikk 168 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff. Analyse ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 19,20 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

254.

Eksempel 3

3( a) 5'- O- benzhydryltymidin

350 mg (8 mmol) natriumhydrid (som en 55 vekt% dispersjon i mineralolje) ble tilsatt til en oppløsning av 1,426 g (4 mmol) 3'-0-[(1,1-dimetyletyl)dimetylsilyl]tymidin [Can. J. Chem., 56, 2768 (1978)] i 8 ml tetrahydrofuran under argonatmosfære, og den resulterende blanding ble omrørt ved 60°C i 2 timer og fikk så avkjøles til romtemperatur. En opp-løsning av 988 mg (4 mmol) benzylbromid i 2 ml tetrahydrofuran ble så dråpevis tilsatt til blandingen, etterfulgt av 300 mg (2 mmol) natriumjodid. Reaksjonsblandingen ble så omrørt ved romtemperatur i 17 timer, hvoretter den ble befridd for opp-løsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Konsentratet ble oppløst i 50 ml etylacetat, og den resulterende oppløsning ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml av en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid. Den ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Resten ble oppløst i 4 ml tetra-

hydrofuran, og 4 ml av en 1 M tetrahydrofuranoppløsning av tetrabutylammoniumfluorid ble tilsatt til oppløsningen. Den resulterende blanding ble så omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble oppløst i 50 ml etylacetat. Den resulterende oppløsning ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml av en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid. Blandingen ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og så ble oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 60 g silikagel (230-400 mesh) under anvendelse av en gradientelueringsmetode med metylenklorid som inneholder fra 1 til 2,5 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 377,7 mg (utbytte 23%) av tittelforbindelsen .

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

9,85 (1H, bred singlett),

7,56 (1H, singlett),

7,38-7,20 (10H, multiplett),

6,45 (1H, triplett, J = 6,92 Hz),

5,40 (1H, singlett),

4,62-4,58 (1H, multiplett),

4,17-4,15 (1H, multiplett),

3,75-3,58 (2H, multiplett),

2,47-2,22 (2H, multiplett),

1,36 (3H, singlett).

3( b) 5'- O- benzhvdryltvmidin- 2- cvanetyl- N, N- diisopropylfosforamiditt

204,2 mg (0,5 mmol) 5'-O-benzhydryltymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tørket tre ganger ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 2,5 ml tetrahydrofuran. 0,348 ml (2 mmol) N,N-diisopropyl-N-etylamin og 0,223 ml (1 mmol) 2-cyanetyl-N,N-diisopropylklorfosfor-amiditt ble tilsatt til oppløsningen under argonatmosfære, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Ved slutten av dette tidsrom ble reaksjonsblandingen befridd for utfellinger ved filtrering, og filtratet ble konsentrert ved inndamping under redusert trykk. Konsentratet ble oppløst i 50 ml etylacetat, og den resulterende oppløsning ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml av en isavkjølt, 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat, og tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble så fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 30 g silikagel (70-230 mesh), under anvendelse av en blanding av metylenklorid, etylacetat og trietylamin i volumforholdet 45:45:10 som elueringsmiddel. Fraksjoner som inneholdt tittelforbindelsen, ble slått sammen og oppløsningsmidlet avdestillert. Den samme kromatografifrem-gangsmåte ble gjentatt, hvorved man fikk 213,4 mg (utbytte 70%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonans spektrum (CDC£3, 270 MHz, TMS), 6 ppm: 7,55, 7,51 (til sammen 1H, to singletter), 7,43-7,22 (10H, multiplett),

6,48-6,42 (1H, multiplett),

5,44, 5,42 (til sammen 1H, to singletter), 4,73-4,64 (1H, multiplett),

4,25, 4,19 (til sammen 1H, to brede singletter), 3,90-3,55 (6H, multiplett),

2,68-2,24 (4H, multiplett),

1,39 (3H, singlett),

1,30-1,10 (12H, multiplett).

3( c) En forbindelse med formel 3( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke 5'-0-benzhydryltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble delt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-væskekromatografikolonne med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 15 -» 45 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 20,2 minutter, ble slått sammen og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk 76 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maksnm: 255.

Retensjonstid: 17,3 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -* 40 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt, 254 nm).

Eksempel 4

En forbindelse med formel 4( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men taste inn basesekvensen TGGGAGG i DNA/RNA-synteseapparatet beskrevet i eksempel l(b), ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Lignende opparbeidelse som den som er beskrevet i eksempel l(b), ga 180 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff. Analyse ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -* 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,22 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Aoak8 nm:

255.

Eksempel 5

5( a) 5'- 0- r( 1. 1- dimetvletvl) difenvlsilvlltvmidin

1,43 ml (5,5 mmol) t-butyldifenylsilylklorid ble tilsatt til en oppløsning av 1,21 g (5 mmol) tymidin og 0,749 g (11 mmol) imidazol i 10 ml dimetylformamid under argonatmosfære, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 140 minutter. Ved slutten av dette tidsrom ble oppløs-ningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble oppløst i 100 ml metylenklorid. Opp-løsningen ble så vasket 5 ganger, hver gang med 100 ml vann. Oppløsningen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat, hvoretter oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk. Resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 100 g silikagel (70-230 mesh) under anvendelse av en gradientelueringsmetode med metylenklorid inneholdende fra 0,5 til 3 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 1,5 g (utbytte 62%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

10,52 (1H, bred singlett),

7,73-7,32 (10H, multiplett),

7,57 (1H, singlett),

6,53-6,47 (1H, multiplett),

4,63 (1H, bred singlett),

4,48 (1H, bred singlett),

4,11 (1H, bred singlett),

4,04-3,85 (2H, multiplett),

2,58-2,16 (2H, multiplett),

1,59 (3H, singlet^),

1,10 (9H, singlett).

5( b) 5'- 0- r( 1, 1- dimetvletvl) difenvlsilvl1tvmidin- 2- evanetyl-N, N- diisopropylfosforamiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 3(b), men bruke 240 mg (0,5 mmol) 5' -0-[(1,1-dimetyletyl)difenylsilyl]tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor], ble det erholdt 254,4 mg (utbytte 74,7%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonans spektrum (CDC£3, 270 MHz, TMS), 6 ppm:

7.69- 7,36 (11H, multiplett),

6,43-6,38 (1H, multiplett),

4.70- 4,62 (1H, multiplett),

4,16-4,09 (1H, multiplett),

4,04-3,55 (6H, multiplett),

2,67-2,15 (4H, multiplett),

1,61 (3H, singlett),

1,22-1,05 (12H, multiplett).

5( c) En forbindelse med formel 5( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke 5'-0-[(1,1-dimetyletyl)-difenylsilyl]tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble delt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved kromatografi gjennom reversfase-væskekromatografikolonne med høy yteevne ("Inertsil PREP-0DS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 22,4 minutter, ble slått sammen og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 54 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.oakE nm:

255.

Retensjonstid: 22,0 minutter.

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt,

254 nm).

Eksempel 6

6 ( a) 5'- O-( 3, 5- dibenzvloksvbenzyl) tymidin

175 mg (4 mmol) natriumhydrid (som en 55 vekt% dispersjon i mineralolje) ble tilsatt til en oppløsning av 713 mg (2 mmol) 3'-0-[(1,1-dimetyletyl)dimetylsilyl]tymidin [Can. J. Chem., 56, 2768 (1978)] i 4 ml tetrahydrofuran under argonatmosfære, og den resulterende blanding ble omrørt ved 60°C i 2 timer. Ved slutten av dette tidsrom fikk blandingen avkjøles til romtemperatur, og så ble en oppløsning av 767 mg (2 mmol) 3,5-dibenzyloksybenzylbromid [Chem. Ber., 102, 2887 (1969)] i 1 ml tetrahydrofuran dråpevis tilsatt. 149,9 mg (1 mmol) natriumjodid ble så tilsatt til den resulterende blanding, hvoretter blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk, resten ble oppløst i 50 ml etylacetat, og den resulterende oppløsning ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml av 0,01 N vandig saltsyre. Oppløsnin-gen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat, hvoretter oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk. Resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 100 g silikagel (230-400 mesh) under anvendelse av en gradientelueringsmetode, med metylenklorid inneholdende fra 0,5 til 3 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 637,3 mg av en blanding inneholdende 3'-0-[(1,1-dimetyletyl)dimetylsilyl]-5'-O-(3,5-dibenzyloksybenzy1)tymidin.

Alt dette ble oppløst i 1,93 ml tetrahydrofuran. 1,93 ml av en 1 M tetrahydrofuranoppløsning av tetrabutylammoniumfluorid ble tilsatt til oppløsningen, og den resulte rende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Ved slutten av dette tidsrommet ble oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble oppløst i 50 ml etylacetat. Denne oppløsningen ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml av en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid. Oppløsningen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat, oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk og resten renset ved kromatografi gjennom 30 g silikagel (230-400 mesh) under anvendelse av en gradientelueringsmetode, med metylenklorid inneholdende fra 1 til 3 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 258,5 mg (utbytte 23,7%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,87 (1H, singlett),

7,52 (1H, singlett),

7,43-6,52 (1H, multiplett),

6,37 (1H, triplett, J = 6,75 Hz),

5,03 (4H, singlett),

4,51 (2H, dublett, J = 3,30 Hz),

4,50-4,44 (1H, multiplett),

4,06-4,03 (1H, multiplett),

3,77-3,63 (2H, multiplett),

2,32-2,12 (2H, multiplett),

1,67 (3H, singlett).

6( b) 5'-0-(3. 5- dibenzyloksybenzvl) tymidin- 2- evanetyl- N. N- di-isopropylf osf oramiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 3(b), men bruke 258,5 mg (0,475 mmol) 5'-0-(3, 5-dibenzyloksybenzyl)tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor], ble det erholdt 307,7 mg (87%) av tittelforbindelsen .

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,56, 7,53 (til sammen 1H, to singletter),

7,42-6,56 (13H, multiplett),

6,40 (1H, triplett, J = 6,60 Hz),

5,02 (4H, singlett),

4.67- 4,58 (1H, multiplett),

4,53, 4,51 (til sammen 2H, to singletter), 4,23, 4,17 (til sammen 1H, to brede singletter), 3,90-3,52 (6H, multiplett),

2.68- 2,53 (2H, multiplett),

2,49-2,12 (2H, multiplett),

1,65 (3H, singlett),

1,18 (12H, dublett, J = 5,94 Hz).

6( c) En forbindelse med formel 6( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(3,5-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen erholdt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-væskekromatografikolonne med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 19,8 minutter, ble slått sammen og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 64,6 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A,makBnm:

255.

Retensjonstid: 22,8 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -> 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt,

254 nm).

Eksempel 7

7 ( a) 5'- 0-( 3, 4- dibenzvloksybenzyl) tvmidin

713 mg (2 mmol) 3'-0-[(1,1-dimetyletyl)dimetylsilyl]-tymidin [Can. J. Chem., 56, 2768 (1978)] ble oppløst i 5 ml tetrahydrofuran, og 175 mg (4 mmol) natriumhydrid (som en 55 vekt% dispersjon i mineralolje) ble tilsatt til den resulterende oppløsning under argonatmosfære. Blandingen ble så omrørt ved 60°C i 2 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble temperaturen i blandingen redusert til romtemperatur, og så ble 678 mg (2 mmol) 3,4-dibenzyloksybenzylklorid tilsatt, etterfulgt av 149,9 mg (1 mmol) natriumjodid, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 19 timer, og så ved 60°C i 5 timer. Ved slutten av dette tidsrommet ble oppløs-ningsmidlet avdestillert under redusert trykk, og resten ble oppløst i 50 ml etylacetat. Den resulterende oppløsning ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml 0,01 N vandig saltsyre; den ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Oppløsnings-midlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble oppløst i 4 ml tetrahydrofuran, og 4 ml av en 1 M oppløsning av tetrabutylammoniumfluorid i tetrahydrofuran ble tilsatt til oppløsningen. Blandingen ble så omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Ved slutten av dette tidsrommet ble oppløs-ningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble oppløst i 50 ml etylacetat. Den resulterende opp-løsning ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml av en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid, og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Oppløsningsmidlet ble så fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble tilført en kromatografikolonne ["LiChroprep" Si60, 40-63 um, størrelse C, Merck], og det ble eluert under anvendelse av en gradientelueringsmetode med metylenklorid inneholdende fra 1 til 4 volum%

metanol, hvorved man fikk 345,4 mg (utbytte 31,7%) av tittelforbindelsen.

<1>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,26 (1H, singlett),

7,50 (1H, singlett),

7,47-7,28 (10H, multiplett),

6,91-6,79 (3H, multiplett),

6,36 (1H, triplett, J = 6,75 Hz),

5,17 (4H, singlett),

4,47, 4,45 (til sammen 2H, to singletter),

4,41-4,36 (1H, multiplett),

4,04-4,01 (1H, multiplett),

3,72-3,56 (2H, multiplett),

2,31-2,05 (2H, multiplett),

1,62 (3H, singlett).

7 ( b) 5'- 0-( 3. 4- dibenzvloksybenzyl) tymidin- 2- cyanetvl- N. N- diisopropylfosforamiditt

271,7 mg (0,499 mmol) 5<1->0-(3,4-dibenzyloksybenzyl)-tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tør-ket tre ganger ved azeotrop destillasjon med pyridin, hvoretter det ble oppløst i 2,5 ml tetrahydrofuran. 0,348 ml (2 mmol) N,N-diisopropyl-N-etylamin og 0,223 ml (1 mmol) 2-cyanetyl-N,N-diisopropylklorfosforamiditt ble tilsatt til den resulterende oppløsning, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur under argonatmosfære i 2 timer. Ved slutten av dette tidsrommet ble oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble oppløst i 50 ml etylacetat, og den resulterende oppløsning ble vasket to ganger, hver gang med 50 ml av en isavkjølt 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat, og så ble det tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble tilført en kolonne inneholdende 30 g (70-230 mesh) silikagel. Det ble så eluert med en blanding av metylenklorid, etylacetat og trietylamin i et volumforhold på 45:45:10. Fraksjonene som inneholdt det ønskede produkt, ble slått sammen, oppløsningsmidlet

ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble tilført en kolonne inneholdende 30 g (70-230 mesh) silikagel. Det ble så eluert med en blanding av metylenklorid, etylacetat og trietylamin i volumforholdet 6:3:1, hvorved man fikk 286,9 mg (utbytte 77%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,07 (1H, bred singlett),

7,53, 7,51 (til sammen 1H, to singletter),

7,45-7,25 (10H, multiplett),

6,92-6,81 (3H, multiplett),

6,37 (1H, triplett, J = 6,60 Hz),

5,15 (4H, singlett),

4,62-4,53 (1H, multiplett),

4,47 (2H, singlett),

4,22, 4,14 (til sammen 1H, to brede singletter), 3,90-3,53 (6H, multiplett),

2,68-2,53 (2H, multiplett),

2,47-2,05 (2H, multiplett),

1,58 (3H, singlett),

1,17 (12H, dublett, J = 5,94 Hz).

7( c) En forbindelse med formel 7( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble så opp delt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-væskekromatografikolonne med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner som eluerte etter 22,5 minutter, ble slått sammen og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 55,7 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Anaks nm:

254.

Retensjonstid: 13,6 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt,

254 nm).

Eksempel 8

En forbindelse med formel 8( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl )tymidin-2-cyanetyl-N, N-diisopropylf osf oramiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, under anvendelse av en kolonne pakket med 5 umol A-CPG [dvs. adenindeoksyribonukleosid (A) koblet til kontrollert poreglass] og taste inn en basesekvens TGGGA i synteseapparatet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-væskekromatografikolonne med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner som eluerte etter 23,3 minutter, ble slått sammen og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 86,2 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), ^.makB. nm:

256.

Retensjonstid: 14,2 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -* 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt,

254 nm).

Eksempel 9

En forbindelse med formel 9( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, og taste inn en basesekvens TGGG i synteseapparatet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-væskekromatografikolonne med høy yteevne

("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 MTEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 25 -> 55 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 19,5 minutter, ble slått sammen og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 77,5 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), kaaks.nm:

255.

Retensjonstid: 14,8 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -> 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt,

254 nm).

Eksempel 10

En forbindelse med formel 10( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b) ovenfor] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, og taste inn en basesekvens TGGGG i synteseapparatet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-væskekromatografikolonne med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 MTEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -> 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 22,9 minutter, ble slått sammen og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 19,8 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maksnm:

254.

Retensjonstid: 14,1 minutter

254 nm).

Eksempel 11

11( a) 5'- O- r( pyren- 1- yl) metyl] tymidin

En blanding av 875 mg natriumhydrid (som en 55 vekt% dispersjon i mineralolje) i 5 ml dimetylsulfoksid ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter i nitrogenatmosfære, og så ble en oppløsning av 2,42 g (10 mmol) tymidin i 5 ml dimetylsulfoksid tilsatt dråpevis til den resulterende blanding. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter, hvoretter en suspensjon av 2,51 g (10 mmol) 1-(klormety1)pyren [Acta Chem. Scand., 10, 1362 (1956)] i 15 ml dimetylsulfoksid ble tilsatt. Blandingen ble så omrørt ved romtemperatur i 90 minutter. Ved slutten av dette tidsrom ble reaksjonsblandingen helt over i 100 ml isvann, og den vandige blanding ble ekstrahert med 100 ml etylacetat og så med 100 ml metylenklorid. Ekstrakten ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og så ble oppløs-ningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 150 g silikagel (230-400 mesh) under anvendelse av en gradientelueringsmetode, med blandinger av metylenklorid inneholdende fra 0 til 4 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 292,4 mg (utbytte 6,4%) av tittelforbindelsen.

<1>H kjernemagnetisk resonansspektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksid, 270 MHz, TMS), 6 ppm:

8,44-8,07 (9H, multiplett),

7,44 (1H, singlett),

6.19 (1H, triplett, J = 6,75 Hz),

5,33 (1H, dublett, J = 5,4 Hz),

5,29 (2H, singlett),

4,37-4,30 (1H, multiplett),

4,00-3,96 (1H, multiplett),

3,92-3,79 (2H, multiplett),

2,10-2,04 (2H, multiplett),

1.20 (3H, singlett).

ll( b) 5'- O- T( pyren- 1- yl) metylltymidin- 2- cyanetyl- N. N- diiso-propvlfosforamiditt

91,3 mg (0,2 mmol) 5'-0-[(pyren-1-yl)metyl]tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tørket tre ganger ved azeotrop destillasjon med pyridin, hvoretter det ble oppslemmet i 2 ml tetrahydrofuran. 139 ul (0,8 mmol) N,N-diisopropyl-N-etylamin og 89 ul (0,4 mmol) 2-cyanetyl-N,N-di-isopropylklorfosforamiditt ble tilsatt til suspensjonen under argonatmosfære, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Ved slutten av dette tidsrom ble utfellingene fjernet ved filtrering, og filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble oppløst i 20 ml etylacetat, og den resulterende oppløsning ble vasket to ganger, hver gang med 20 ml av en isavkjølt 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat. Oppløsningen ble tørket over vannfritt natriumsulfat, og så ble oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble renset ved kolonnekromåto-grafi gjennom 30 g silikagel (70-230 mesh) under anvendelse av en blanding av metylenklorid, etylacetat og trietylamin i volumforholdet 6:3:1 som elueringsmiddel, hvorved man fikk 100,2 mg (utbytte 76%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,36-7,99 (9H, multiplett),

7,50, 7,46 (til sammen 1H, to singletter), 6,35 (1H, triplett, J = 6,60 Hz),

5,38-5,22 (2H, multiplett),

4,60-4,50 (1H, multiplett),

4,25-4,17 (1H, multiplett),

4,01-3,77 (2H, multiplett),

3,73-3,44 (4H, multiplett),

2,78-2,09 (4H, multiplett),

1,31, 1,29 (til sammen 3H, to singletter), 1,10-1,05 (12H, multiplett).

ll( c) En forbindelse med formel 11( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-[(pyren-l-yl)metyl]-tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel (b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-væskekromatografikolonne med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 15,4 minutter, ble slått sammen og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 80 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maksnm:

243.

Retensjonstid: 16,4 minutter

254 nm).

Eksempel 12

12( a) O- dimetoksvtrityletylenglvkol

3,1 g (50 mmol) etylenglykol ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 40 ml pyridin. 3,38 g (10 mmol) 4,4'-dimetoksytritylklorid ble tilsatt til oppløs-ningen, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Etter at det var blitt bekreftet ved hjelp av tynnsjiktskromatografi at utgangsforbindelsen hadde forsvunnet, ble 5 ml metanol tilsatt til reaksjonsblandingen, og blandingen ble så konsentrert til ca. halvparten av volumet ved destillasjon under redusert trykk. Konsentratet blé opp-løst i 100 ml metylenklorid, og den resulterende oppløsning ble vasket med en mettet, vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat. Den organiske oppløsning ble filtrert gjennom et "1PS" filterpapir (Whatman), og filtratet ble befridd for opp-løsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 100 g silikagel (70-230 mesh) under anvendelse av metylenklorid inneholdende 1 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 1,97 g av tittelforbindelsen som et gummiaktig stoff.

<1>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,45-6,82 (13H, multiplett),

3,79 (6H, singlett),

3,75 (2H, triplett, J = 4,95 Hz),

3,25 (2H, triplett, J « 4,62 Hz),

1,95 (1H, triplett).

12( b) En forbindelse med formel 12( b):

0,18 g (0,5 mmol) O-dimetoksytrityletylenglykol [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 2 ml metylenklorid. 75 mg (0,75 mmol) ravsyreanhydrid og 92 mg (0,75 mmol) 4-(dimetylamino)pyridin ble så tilsatt til oppløs-ningen, og den resulterende blanding ble omrørt i 1 time. Etter at det var blitt bekreftet ved hjelp av tynnsjiktskromatografi at utgangsmaterialet hadde forsvunnet, ble reaksjonsblandingen fortynnet med metylenklorid, og den fortynnede oppløsning ble vasket med en 0,5 M vandig oppløsning av kaliumdihydrogenfosfat (pH 5,0) og med vann i denne rekkefølge. Det organiske lag ble tørket over vannfritt natriumsulfat, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, hvorved man fikk O-dimetoksytrityletylenglykolmonosuc-cinat.

Alt av denne forbindelsen ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 3 ml dimetylformamid. 0,16 g (0,75 mmol) pentaklorfenol og 0,16 g (0,75 mmol) 1,3-disykloheksylkarbodiimid ble så tilsatt til oppløsningen, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 42 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble uoppløselige materialer frafiltrert, og filtratet ble konsentrert ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble blandet med benzen, og de resulterende, uoppløselige materialer ble på nytt frafiltrert, hvoretter oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk.

0,25 g (0,2 mmol) av resten fremstilt som beskrevet ovenfor, ble oppløst i 4 ml dimetylformamid, og 60 pl (0,44 mmol) trietylamin og 2,0 g (3-aminopropyl)-CPG (inneholdende 0,129 mmol/g aminogrupper) ble tilsatt til oppløsnin-gen. Den resulterende blanding fikk så stå ved romtemperatur i 36 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble CPG-bæreren samlet opp ved filtrering, vasket med metylenklorid og så tørket under vakuum. CPG-bæreren ble blandet med 10 ml hver av "cap A"-og "cap B"-oppløsning (Millipore Ltd., Japan), og blandingen fikk stå i 10 minutter for å acetylere eventuelle aminogrupper som det gjenstår å omsette. Reaksjonsproduktet ble så vasket med pyridin og metylenklorid i denne rekkefølge, hvoretter det ble tørket under vakuum, hvorved man fikk tittelforbindelsen

med formel 12(b). "Cap A"-oppløsning er en blanding av eddiksyreanhydrid og tetrahydrofuran i volumforholdet 1:9, og "cap B"-oppløsning er en blanding av N-metylimidazol og tetrahydrofuran i volumforholdet 1:4.

Andelen av rester avledet fra O-dimetoksytrityletylenglykol innført i forbindelsen ifølge eksempel 12(b), ble analysert kvantitativt på følgende måte. En blanding av 9,6 mg av forbindelsen ifølge eksempel 12(b) og en avblokkeringsopp-løsning (en oppløsning av dikloreddiksyre i metylenklorid, Millipore Ltd., Japan) ble ristet i 3 minutter, og så ble det tilsatt tilstrekkelig metylenklorid til oppløsningen til at det totale volum ble 20 ml. 0,4 ml av denne oppløsning ble tatt i et testrør og brukt for måling. Prøveoppløsningen ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble oppløst i en blanding av perklorsyre og etanol i volumforholdet 3:2. Absorbansen av dimetoksytritylkationet i oppløsningen ble bestemt ved 500 nm.

Som et resultat, ble det funnet at mengden av dimetoksytritylgruppe innført var 40,0 umol/g.

12( c) En forbindelse med formel 12( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke en kolonne pakket med 125 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 12(b), og ved å taste inn basesekvensen TGGGAGZ (hvor Z er en intetsigende kode som forklart i eksempel 17) i synteseapparatet, ble tittelforbindelsen fremstilt ved å bruke et DNA/RNA-synteseapparat som beskrevet i eksempel l(b). Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -> 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm) og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 165 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væske-kromatograf i med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm), viste at prøven har en retensjonstid på 18,76 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

254.

Eksempel 13

En forbindelse med formel 13( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 12(c), men bruke 151 mg (5 umol) "3'-amino-ON-CPG" (varemerke for et produkt fra Clontech), ble tittelforbindelsen fremstilt. Produktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -+ 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm) og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk 165 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven har en retensjonstid på 18,76 minutter. Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), ABaks nm: 255.

Eksempel 14

En forbindelse med formel 14( a):

En lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 12(c), ble gjentatt, men med den følgende modifika-sjon. Forbindelsen ifølge eksempel 12(b) ble først koblet med guanindeoksyribonukleotid-p-amiditt i ende-3'-stillingen, og kolonnen ble så fjernet fra synteseapparatet uten oksidasjon med en oksidasjonsoppløsning. 5 ml av en acetonitriloppløsning av tetraetyltiuramdisulfid (TETD) (Applied Biosystems) ble så tilsatt til kolonnen som så fikk stå ved romtemperatur i 15 minutter. Kolonnen ble så vasket med acetonitril og montert til synteseapparatet.

I rensetrinnet ble kromatografi utført gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -+ 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Ved opparbeidelse på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), ble 33 OD (260 nm) av tittelforbindelsen erholdt som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,92 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), AmakB nm:

254.

Eksempel 15

15( a) 5'- 0- trityl- N- benzoyl- 2'- deoksycytidin

3,31 g (10 mmol) N-benzoyl-2'-deoksycytidin ble tilsatt til 25 ml pyridin, og så ble 3,07 g (11 mmol) tritylklorid tilsatt til suspensjonen. Den resulterende suspensjon ble omrørt ved 100°C i 1 time, hvoretter den fikk avkjøles til romtemperatur. Pyridinet ble så fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble oppløst i en blanding av etylacetat og en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid. Det organiske lag ble fraskilt og vasket to ganger, hver gang med en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid. Oppløsningen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat, hvoretter oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble renset ved kolonnekromatografi gjennom silikagel ("Lober column Si-60, Size C" ) under anvendelse av en gradientelueringsmetode, med blandinger av metanol og metylenklorid som elueringsmiddel i volumforholdet 2:98 til 5:95, hvorved man fikk 1,47 g (utbytte 26%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,72 (1H, bred singlett),

8,26 (1H, dublett, J = 7,3 Hz),

7,89 (1H, dublett, J = 7,3 Hz),

7,26-7,64 (20H, multiplett),

6,29 (1H, triplett, J = 5,9 Hz),

4,48-4,53 (1H, multiplett),

4,12-4,16 (1H, multiplett),

3,42-3,57 (2H, multiplett),

2,23-2,77 (2H, multiplett),

2,51 (1H, bred singlett).

15( b) 5 ' - O- tritvl- N- benzoyl- 2 ' - deoksycytidin- 2- cyanetyl- N. N-. diisopropylfosforamiditt

402 mg (0,7 mmol) 5'-0-trityl-N-benzoyl-2'-deoksycytidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tør-ket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 3,5 ml metylenklorid. 60 mg (0,35 mmol) diisopropylammonium-

tetrazolid ble tilsatt til oppløsningen. 245 ul (0,77 mmol) 2-cyanetyl-N,N,N',N'-tetraisopropylfosfordiamiditt ble så dråpevis tilsatt under argonatmosfære. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 3,5 timer under den samme atmosfære. Ved slutten av dette tidsrom ble metylenkloridet fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble oppløst i etylacetat, og oppløsningen ble vasket med en 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat og med en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid i denne rek-kefølge. Oppløsningen ble så tørket over vannfritt magnesium-sulf at, hvoretter oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 23 g silikagel (70-230 mesh), under anvendelse av etylacetat som elueringsmiddel, hvorved man fikk 337 mg (utbytte 62%) av tittelforbindelsen som et skumstoff.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,87 (1H, bred singlett),

8,52 &. 8,43 (1H, dublett, J = 7,3 Hz),

8,12 & 8,11 (1H, dublett, J = 7,3 Hz),

7,23-7,86 (20H, multiplett),

6,49-6,55 (1H, multiplett),

4,79-4,91 (1H, multiplett),

4,46-4,47 (1H, multiplett),

3,60-4,10 (6H, multiplett),

2,46-3,08 (4H, multiplett),

1,29-1,40 (12H, multiplett).

15( c) En forbindelse med formel 15( c):

En lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), ble gjentatt, bortsett fra at en 35 mM aceto-nitriloppløsning av forbindelsen ifølge eksempel 15(b) ble plassert i amidittflasken (henvist til som "X"), og basesekvensen XGGGG ble tastet inn i synteseapparatet. Den således erholdte, 90% vandige formamidoppløsning inneholdende tittelforbindelsen, ble varmet opp ved 95°C i 5 minutter og så øye-blikkelig avkjølt på is. Reaksjonsblandingen ble så oppdelt i fire porsjoner, og hver ble renset ved reversfase-væskekroma-tograf i med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,0, elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 260 nm, kolonnetemperatur 60°C). Fraksjoner eluert etter 20,9 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk 68 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.mak6nm:

254.

Retensjonstid: 13,25 minutter

[væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS-2": 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5,

elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B,

20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm)].

Eksempel 16

16( a) En forbindelse med formel 16( a):

0,26 g (0,5 mmol) O-dimetoksytritylheksaetylenglykol [Nucleic Acids Res., 18, 6353 (1990)] ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 2 ml metylenklorid. 75 mg (0,75 mmol) ravsyreanhydrid og 92 mg (0,75 mmol) 4-(di metylamino)pyridin ble så tilsatt til oppløsningen, og den resulterende blanding ble omrørt i 2 timer. Etter at full-førelse av reaksjonen var blitt bekreftet ved hjelp av tynnsjiktskromatografi, ble reaksjonsblandingen fortynnet med metylenklorid, og den fortynnede blanding ble vasket med en 0,5 M vandig oppløsning av kaliumdihydrogenfosfat (pH 5,0) og med vann i denne rekkefølge. Det organiske lag ble så tørket over vannfritt natriumsulfat, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, hvorved man fikk 0-di-metoksytritylheksaetylenglykolmonosuccinat.

Alt av dette produktet ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 3 ml dimetylformamid. 0,23 g (0,37 mmol) pentaklorfenol og 0,12 g (0,56 mmol) 1,3-disykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til oppløsningen, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble de uoppløselige materialer som var blitt utfelt, frafiltrert, og filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved fordamping under redusert trykk. Resten ble oppløst i benzen, og de resulterende, uoppløselige materialer ble på nytt frafiltrert, hvoretter oppløsnings-midlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. 30 ul (0,22 mmol) trietylamin og 1,0 g (3-aminopropyl)-CPG (inneholdende 0,129 mmol/g aminogrupper) ble så tilsatt til en oppløsning av 0,23 g (0,18 mmol) av resten i 5 ml dimetylformamid, og den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i 24 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble CPG-bæreren samlet opp ved filtrering og vasket med metylenklorid, hvoretter den ble tørket under vakuum. For å acetylere de aminogruppene som var tilbake uomsatt, ble CPG-bæreren blandet med 3 ml hver av "cap A"- og "cap B"-oppløsninger (Millipore Ltd., Japan), og blandingen fikk stå i 10 minutter. Reaksjonsproduktet ble så vasket med pyridin og med metylenklorid i denne rekkefølge, hvoretter det ble tørket under vakuum, hvorved man fikk tittelforbindelsen.

Mengden av O-dimetoksytritylheksaetylenglykol-rester innført i forbindelsen ifølge eksempel 16(a), ble bestemt på følgende måte. Forbindelsen (9,7 mg) ifølge eksempel 16(a) ble målt nøyaktig, og en avblokkeringsoppløsning (en metylen-kloridoppløsning av dikloreddiksyre, Millipore Ltd., Japan) ble tilsatt. Blandingen ble ristet i 3 minutter, og så ble det tilsatt tilstrekkelig metylenklorid til å gi 20 ml. 0,4 ml av dette ble tatt opp i et testrør, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. 3 ml av en blanding av perklorsyre og etanol i volumforholdet 3:2 ble tilsatt til resten, og absorbansen (e = 71.700) for dimetoksytritylkationet ved 500 nm ble målt.

Mengden av dimetoksytritylgruppe innført var

59,1 umol/g.

16( b) En forbindelse med formel 16( b):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 12(c), men bruke en kolonne pakket med 85 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 16(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Produktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TE AB, pH 7,5, 5 -» 50 volum% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Ved opparbeidelse på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), ble tittelforbindelsen med formel 16(b) erholdt med 151 OD

(260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,50 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amak8. nm:

254.

Eksempel 17

En forbindelse med formel 17( a);

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke en kolonne pakket med 85 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 16(a) og bruke en 35 mM acetonitriloppløsning av O-dimetoksytritylheksaetylenglykol-O-(2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt) [Nucleic Acids Res., 18, 6353 (1990)] plassert i amidittflasken (og her henvist til som "X"), og ved å taste inn basesekvensen TGGGAGXZ i synteseapparatet, ble tittelforbindelsen fremstilt. I dette eksemplet og ellers er X som definert ovenfor og Z er en intetsigende kode, det vil si en kode tastet inn på synteseapparatet som ikke gir en virkelig base. Når den intetsigende kode tastes inn på synteseapparatet, kan hvilken som helst av kodene A, G, C, T og X tastes inn, men vil ikke resultere i at en base adderes til sekvensen. Produktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 5 -» 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Ved opparbeidelse på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), ble tittelforbindelsen med 136 OD (260 nm) erholdt som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væske-kromatograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,32 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maks. nm:

254.

Eksempel 18

En forbindelse med formel 18( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 17, men taste inn basesekvensen TGGGAGXXZ (hvor X og Z er som definert i eksempel 17) i synteseapparatet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Produktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 5 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 136 OD (260 nm) av tittelforbindelsen med formel 18(a) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,20 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

255.

Eksempel 19

En forbindelse med formel 19( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 17, men taste inn basesekvensen TGGGAGXXXZ (hvor X og Z er som definert i eksempel 17) i synteseapparatet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TE AB, pH 7,5, 5 -+ 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 110 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 17,99 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.aialcs^ nm:

254.

Eksempel 20

En forbindelse med formel 20( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 2(c), men bruke en kolonne pakket med 85 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 16(a) og taste inn basesekvensen TGGGAGZ (hvor Z er som definert i eksempel 17) i DNA/RNA-synteseapparatet beskrevet i eksempel l(b), ble tittelforbindelsen fremstilt. Produktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -* 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 177 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 19,10 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.æaks nm:

254.

Eksempel 21

21( a) En forbindelse med formel 21( a):

En oppløsning av 250 mg "5' -f osf at-ON" (et varemerke for et produkt fra Clontech) i 5,2 ml acetonitril og en kolonne pakket med 15 umol C-CPG (Millipore Ltd., Japan) ble brukt i DNA/RNA-synteseapparatet beskrevet i eksempel l(b), for å fremstille tittelforbindelsen kvantitativt.

21( b) En forbindelse med formel 21( b):

5 ml av en avblokkeringsoppløsning (Millipore Ltd., Japan) ble tilsatt til en filterutstyrt kolonne pakket med 115 mg (4 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a). Den fikk så stå i 1 minutt, hvoretter den ble vasket med 5 ml metylenklorid og så behandlet med en avblokkeringsoppløsning i 1 minutt. Blandingen ble så vasket med 5 ml metylenklorid og med 5 ml pyridin i denne rekkefølge, hvoretter den ble destil-lert azeotropt med pyridin. En oppløsning av 20 mg trietylammonium-5' -0-dimetoksytrityl-2-N-isobutyryl-2' -deoksyguanosin-3'-o-(2-klorfenyl)-fosfat [Nucleic Acids Res., 8, 5461 (1980)] i 0,5 ml pyridin ble så tilsatt til destillatet, hvoretter oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. En oppløsning av 40 mg 2,4,6-trimetylbenzensulfonyl-3-nitrotriazol i 0,5 ml pyridin ble tilsatt til resten, og den resulterende blanding ble varmet opp til 40°C i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble så vasket tre ganger, hver gang med 5 ml pyridin, og så ble 2,5 ml "cap A"-oppløsning (Millipore Ltd., Japan) og 2,5 ml "cap B"-oppløsning (Millipore Ltd., Japan) tilsatt til blandingen. Blandingen fikk stå i 3 minutter, hvoretter den ble vasket tre ganger, hver gang med 5 ml metylenklorid, hvorved man fikk tittelforbindelsen.

21( c) En forbindelse med formel 21( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke en kolonne pakket med 115 mg (4 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(b) og tymi-dindeoksyribonukleotid-p-amiditt (Millipore Ltd., Japan) i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfos-foramidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 5 -» 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 85 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("InertsilODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 50 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 21,5 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

254.

Eksempel 22

22( a) Trietylammonium- 5'- 0- dimetoksvtrityl- 2- N- isobutyrvl- 2'-deoksvauanosin- 31- 0- fenylfosfat

0,8 g (11,55 mmol) 1,2,4-triazol ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppslemmet i 10 ml "dioksan. 0,52 ml (3,5 mmol) fenylfosfordikloridat ble tilsatt til suspensjonen, etterfulgt av 1,0 ml (7,35 mmol) trietylamin, mens det ble isavkjølt og omrørt, og temperaturen fikk så øke til romtemperatur. Blandingen ble omrørt i 2 timer, hvoretter det avsatte hydroklorid ble frafiltrert, hvorved man fikk en dioksanoppløsning som inneholdt 0,35 mmol/ml fenylfosforbis-(triazolidat).

1 ml (0,35 mmol) av dioksanoppløsningen av fenylfos-forbis(triazolidat) fremstilt som beskrevet ovenfor, ble tilsatt til 0,15 g (0,23 mmol) 5'-0-dimetoksytrityl-2-N-isobutyryl-2'-deoksyguanosin [Methods Enzymol., 65, 610 (1980)], og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Ved slutten av dette tidsrommet ble det tilsatt ca. 10 ml 30 volum% vandig pyridin. Reaksjonsblandingen ble så ekstrahert med 30 ml metylenklorid, og ekstrakten ble vasket med 0,1 M TEAB. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble oppløst i 1 ml metylenklorid og triturert med 30 ml av en blanding av heksan og dietyleter i volumforholdet 1:1, inneholdende 1 volum% trietylamin, hvorved man fikk 81 mg (utbytte 40%) av tittelforbindelsen som et pulver.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

12,07 (1H, bred singlett),

9,67 (1H, bred singlett),

7,80-7,64 (1H, multiplett),

7.47- 6,91 (18H, multiplett),

6,12-6,10 (1H, multiplett),

5.48- 5,45 (1H, multiplett),

4,64-4,58 (1H, multiplett),

4,28 (1H, multiplett),

3,74 (6H, singlett),

3,38-3,18 (2H, multiplett),

2,98-2,89 (6H, multiplett),

2,73-2,51 (2H, multiplett),

2,34-2,29 (1H, multiplett),

1,25-1,19 (9H, multiplett),

1,12-0,99 (6H, multiplett).

22( b) En forbindelse med formel 22( b):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 21(b), men bruke 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a) og forbindelsen ifølge eksempel 22(a), ble tittelforbindelsen erholdt.

22( c) En forbindelse med formel 22( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke en kolonne pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 22(b), ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble så renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5,.20 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 66 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,22 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20),<A.>nalte. nm:

255.

Eksempel 23

En forbindelse med formel 23( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke en kolonne pakket med 115 mg (4 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(b), ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -> 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 56 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven har en retensjonstid på 18,38 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maksnm:

255.

Eksempel 24

24( a) En forbindelse med formel 24( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 21(b), men bruke 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a) og trietylammonium-5'-O-dimetoksytrityl-2-N-isobutyryl-2'-deoksyguanosin-3'-(4-klorfenyl)-fosfat [Methods Enzymol., 65, 610 (1980)], ble tittelforbindelsen erholdt.

24( b) En forbindelse med formel 24( b):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke en kolonne pakket med 143 mg (4 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 24(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -> 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 55 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-vaeskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -* 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven har en retensjonstid på 18,55 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.oaksnm:

255.

Eksempel 25

DMT- O- TGGGAG- OH

Den ønskede basesekvens (5'-TGGGAG-3') ble tastet inn på et 380B synteseapparat (et produkt fra Applied Biosystems Inc.), og en kolonne med kontrollert poreglass (skala 1 umol) bundet til det tilsvarende nukleosid (2'-deoksyguanosin) i 3'-enden, ble forbundet med det. Syntesen ble utført i en skala på 1 umol. Apparatet ble innstilt for ikke å beskytte DMT-gruppen etter fullførelse av reaksjonen, og produktet med en DMT-gruppe ble automatisk befridd for harpiksen, hvorved man fikk et oligodeoksyribonukleotid som en ammoniakkoppløsning. Denne oppløsning ble lukket inne i et glass og varmet opp ved 55°C i 8 timer, og ammoniakken ble avdampet i en nitrogenstrøm. Den resulterende rest ble oppløst i en liten mengde 0,1 M TEAA (pH 7,0). Denne oppløsning ble filtrert gjennom et milliporefilter (0,2 um), og filtratet ble renset ved reversfase-væske-kromatograf i med høy yteevne ("Cosmosil 5C18-AR", 20 x 250 mm) under betingelsene som er angitt nedenunder. Fraksjoner eluert etter 13,5 minutter, ble samlet opp og befridd for oppløs-ningsmidlet (acetonitril) ved destillasjon under redusert trykk etterfulgt av lyofilisering, hvorved man fikk 800 ug av tittelforbindelsen.

Elueringstid: 17,0 minutter.

Betingelser for preparativ væskekromatografi med høy yteevne: Bufferoppløsning A: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer (pH 7,0); bufferoppløsning B: 100% acetonitril; strømningshastighet: 9 ml/minutt.

Eksemplene 26- 81

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 25, ble forbindelsene ifølge eksemplene 26-81 syntetisert. Forbindelsesnavnene og deres elueringstider er angitt i tabell 3.

Eksempel 82

82( a) En forbindelse med formel 82( a):

De påkrevde reagenser for syntese som nærmere angitt nedenunder, ble tilført et "Cyclone Plus" DNA/RNA-synteseapparat, MilliGen/Biosearch (Millipore Ltd., Japan). Det ble også installert en programkassett for amidittmetoden

(15 umol). Det ble anvendt en omtrent 35 mM acetonitriloppløs-ning av 5'-0-dimetoksytrityl-2-N-isobutyryl-2'-deoksyguanosin-3'-0-(metyl-N,N-diisopropylfosforamiditt) (Sigma) i stedet for p-cyanetylamidittet som tilsvarer guanosin. Ved å bruke en tom kolonne (15,0 umol) pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a), taste inn basesekvensen GX i synteseapparatet og la programmet arbeide uten syrebehandling etter binding med en base, G, ble tittelforbindelsen erholdt.

82( b) En forbindelse med formel 82( b):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke en kolonne pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 82(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Produktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -♦ 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 66 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væske-kromatograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -* 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven har en retensjonstid på 17,54 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Xmaks nm: 254.

Eksempel 83

83( a) En forbindelse med formel 83( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 82(a), men bruke 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Nærmere bestemt ble kolonnen etter kobling med 5'-0-dimetoksytrityl-2-N-isobutyryl-2'-deoksyguanosin-3'-0-(metyl-N,N-diisopropyl)fosforamiditt tatt bort fra DNA/RNA-synteseapparatet uten oksidasjon med en oksidasjonsoppløsning. 5 ml av en acetonitriloppløsning av tetraetyltiuramdisulfid (TETD) (Applied Biosystems) ble tilsatt til kolonnen, og kolonnen fikk stå ved romtemperatur i 15 minutter. Kolonnen ble så vasket med acetonitril og installert i synteseapparatet. 83( h ) En forbindelse med formel 83( b):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke en kolonne pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 83(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 50% acetonitril, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 111 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven har en retensjonstid på 17,72 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaksnm:

254.

Eksempel 84

84( a) En forbindelse med formel 84( a):

De påkrevde reagenser for syntese som nærmere angitt nedenunder, ble tilført et "Cyclone Plus" DNA/RNA-synteseapparat, MilliGen/Biosearch (Millipore Ltd., Japan). Det ble også installert en programkassett for amidittmetoden (15 umol). Det ble anvendt en omtrent 35 mM tetrahydrofuran-oppløsning av deoksyguanosin-(N-iBu)-metylfosfonamiditt (American Bionetic Inc.) i stedet for en p-cyanetylamidittopp-løsning som tilsvarer guanosin. Ved å bruke en tom kolonne (15,0 umol) pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a) som en fast bærer, inntasting av en basesekvens GZ (hvor Z er som definert i eksempel 17) og la et program uten syrebehandling etter binding med en base G, arbeide, ble tittelforbindelsen erholdt.

84( b) En forbindelse med formel 84( b):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke en kolonne pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 84(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 159 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven har en retensjonstid på 18,03 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maksnm:

254.

Eksempel 85

85( a) En forbindelse med formel 85( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 84(a), men bruke en kolonne pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Nærmere bestemt ble kolonnen fjernet fra synteseapparatet uten oksidasjon ved hjelp av en oksidasjonsoppløsning etter kobling med deoksyguanosin-(N-iBu)-metylfosfonamiditt, og så ble 5 ml av en acetonitrilopp-løsning av tetraetyltiuramdisulfid (TETD) (Applied Biosystems) tilsatt til kolonnen. Kolonnen fikk stå ved romtemperatur i 15 minutter, hvoretter den ble vasket med acetonitril og på nytt installert i synteseapparatet.

85( b) En forbindelse med formel 85( b):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), men bruke en kolonne pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 85(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 124 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,07 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A,maksnm:

254.

Eksempel 86

En forbindelse med formel 86( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke en kolonne pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a), og taste inn basesekvensen TGGGAGZ (hvor Z er som definert i eksempel 17) i DNA/RNA-synteseapparatet beskrevet i eksempel l(b), ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -» 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 54 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 15 -> 65 volum%, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 15,20 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A,makBnm:

255.

Eksempel 87

En forbindelse med formel 87( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 86, men bruke en kolonne pakket med 143 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 21(a), ble tittelforbindelsen fremstilt. Nærmere bestemt ble kolonnen fjernet fra DNA/RNA-synteseapparatet uten oksidasjon ved hjelp av en oksidasjonsoppløsning etter først å ha koblet med G-p-amiditt i 3'-enden. 5 ml av en acetonitriloppløsning av tetraetyltiuramdisulfid (TETD) (Applied Biosystems) ble tilsatt til kolonnen, og kolonnen fikk stå ved romtemperatur i 15 minutter, hvoretter den ble vasket med acetonitril og installert i synteseapparatet.

Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -> 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 136 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,02 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.Baksnm:

254.

Eksempel 88

En forbindelse med formel 88( a):

"Dowex 50W-X2"-ionebytterharpiks (et varemerke for et produkt fra Dow Chemical Co., H-form, ca. 1 ml) ble pakket i en kolonne, og 3 ml 20 volum% vandig pyridin ble sendt gjennom kolonnen som så ble vasket med vann for å fremstille pyridin-iumformen av harpiksen i kolonnen. Ved å følge en lignende fremgangsmåte, men bruke 3 ml av en 1 N vandig oppløsning av natriumhydroksid, ble natriumformen av harpiksen fremstilt i en annen kolonne. Forbindelsen ifølge eksempel l(b) med 27 OD ble tilført en kombinasjon av pyridiniumformharpikskolonnen og natriumformharpikskolonnen etter hverandre i den rekkefølge, og så ble kolonnen eluert med vann, hvorved man fikk tittelforbindelsen (et natriumsalt) med 27 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væske-kromatograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: aceto-

nitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient,

1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,12 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.nakBnm:

256.

Eksempel 89

En forbindelse med formel 89( a):

"Dowex 50W-X2"-ionebytterharpiks (et varemerke for et produkt fra Dow Chemical Co., H-form, ca. 1 ml) ble pakket i en kolonne, og 3 ml 20 volum% vandig pyridin ble sendt gjennom kolonnen som så ble vasket med vann, hvorved man fikk en pyri-diniumform av harpiksen i kolonnen. Ved å følge en lignende fremgangsmåte, men bruke 3 ml av en 1 N vandig oppløsning av kaliumhydroksid, ble en kaliumform av harpiksen fremstilt i en annen kolonne. Forbindelsen ifølge eksempel l(b) med 27 OD ble tilført en kombinasjon av pyridiniumformharpikskolonnen og kaliumformharpikskolonnen i rekkefølge, og kolonnene ble eluert med vann, hvorved man fikk tittelforbindelsen (et kal-iumsalt) med 27 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 18,18 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maksnm:

254.

Eksempel 90

En forbindelse med formel 90( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 14(a), men bruke 5' -0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 10 -» 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 119 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at denne prøven hadde en retensjonstid på 19,20 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A,Baks>nm:

254.

Eksempel 91

En forbindelse med formel 91( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 82(b), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 20 -» 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 50 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at denne prøven hadde en retensjonstid på 19,15 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

254.

Eksempel 92

En forbindelse med formel 92( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 22(c), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 15 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 67 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at denne prøven hadde en retensjonstid på 19,51 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

255.

Eksempel 93

En forbindelse med formel 93( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 16(b), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N, N-diisopropylf osf oramidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ( "Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 15 -» 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 96 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient,

1 ml/minutt, 260 nm) viste at denne prøven hadde en reten-

sjonstid på 19,26 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.,,^ nm: 254.

Eksempel 94

En forbindelse med formel 94( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 12(c), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 15 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 97 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at denne prøven hadde en retensjonstid på 19,16 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaksnm:

254.

Eksempel 95

En forbindelse med formel 95( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 23(a), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 15 -» 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 83 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 19,80 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), AMkB nm:

255.

Eksempel 96

En forbindelse med formel 96( a):

En lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 15(c), ble gjentatt, men det ble brukt en kolonne pakket med 125 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 12(b) og basesekvensen XGGGGZ (hvor Z er som definert i eksempel 17) ble tastet inn i synteseapparatet. Den således erholdte, 90 volum%, vandige formamidoppløsning inneholdende tittelforbindelsen, ble så varmet opp ved 95°C i 5 minutter. Etter denne oppvarmingen ble oppløsningen avkjølt hurtig. Reaksjonsblandingen ble så oppdelt i fire porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,0, elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 260 nm, kolonnetemperatur 60°C). Fraksjoner eluert etter 20,7 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 79 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

253.

Retensjonstid: 13,22 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS-2", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5,

elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B,

20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm).

Eksempel 97

En forbindelse med formel 97( a):

En lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), ble gjentatt, bortsett fra at en 35 mM aceto-nitriloppløsning av forbindelsen ifølge eksempel 15(b) i amidittflasken X ble brukt, og basesekvensen XGCGG ble tastet inn i synteseapparatet som et program. Den således erholdte, 90% vandige formamidoppløsning inneholdende tittelforbindelsen, ble varmet opp ved 95°C i 5 minutter. Etter denne oppvarmingen ble oppløsningen avkjølt hurtig. Reaksjonsblandingen ble så oppdelt i fire porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,0, elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 260 nm, kolonnetemperatur 60°C). Fraksjoner eluert etter 21,7 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 123 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maks nm:

255.

Retensjonstid: 13,58 minutter

elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B,

20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm).

Eksempel 98

En forbindelse med formel 98( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 83(b), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 15 -> 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 92 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 19,46 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), AmakB nm:

254.

Eksempel 99

En forbindelse med formel 99( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 86, men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksybenz-yl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ( "Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 15 -> 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 43 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -♦ 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient,

260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 19,12 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

254.

Eksempel 100

En forbindelse med formel 100( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 87, men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksybenz-yl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("PreparativeC18", Waters, 1,5 x 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7,5, 15 -> 50% acetonitril, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk tittelforbindelsen med 36 OD (260 nm) som et amorft, fast stoff. Analyse ved hjelp av reversfase-væskekro-matograf i med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 60 volum% B, 20 minutter, lineær gradient,

260 nm) viste at prøven hadde en retensjonstid på 19,11 minutter.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Aæaks nm:

255.

Eksempel 101

En forbindelse med formel lOl( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke en 35 mM acetonitrilopp-løsning av 5'-0-(3,4-dibenzyloksybenzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i amidittflasken X og taste inn basesekvensen XTGGGG i synteseapparatet som et program, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 25 -> 55 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 19,8 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 173,1 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), kaakBnm: 255.

Retensjonstid: 15,1 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50. volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt, 254 nm).

Eksempel 102

En forbindelse med formel 102( a) :

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(3,4-dibenzyloksy-benzyl )tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 7(b)] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet og taste inn basesekvensen TGGGGG i synteseapparatet som et program, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatograf i med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 25 -» 55 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 17,4 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 120,2 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.mak8nm:

254.

Retensjonstid: 13,1 minutter

254 nm).

Eksempel 103

103( a) 5'- 0- r( naftalen- 2- yl) metyl1tymidin

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 6(a), men bruke 442 mg (2 mmol) 2-brommetylnaftalen, ble 253,1 mg (utbytte 33%) av tittelforbindelsen erholdt.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDCfi3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,12 (1H, bred singlett),

7,88-7,43 (8H, multiplett),

6,40 (1H, triplett, J = 6,75 Hz),

4,76 (2H, singlett),

4,61-4,54 (1H, multiplett),

4,12-4,10 (1H, multiplett),

3,88-3,72 (2H, multiplett),

2,40-2,20 (2H, multiplett),

2,05 (1H, bred singlett),

1,58 (3H, singlett).

103( b) 5'- 0- f( naftalen- 2- vl) metvl1tvmidin- 2- cvanetyl- N. N- diisopropylfosforamiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel ll(b), men bruke 77 mg (0,2 mmol) 5'-0-[ (naftalen-2-yl)metyl]tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor], ble det erholdt 62,5 mg (utbytte 54%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,88-7,43 (8H, multiplett),

6,39 (1H, triplett, J = 7,26 Hz),

4,75 (2H, bred singlett),

4,68-4,60 (1H, multiplett),

4,25, 4,20 (til sammen 1H, to brede singletter), 3,90-3,53 (6H, multiplett),

2,68-2,18 (4H, multiplett),

1,57, 1,55 (til sammen 3H, to singletter), 1,17 (12H, dublett, J = 6,60 Hz).

103( c) En forbindelse med formel 103( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-[(naftalen-2-yl)-metyl]-tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b)] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -> 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient,

7 ml/minutt, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 12,8 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 257,5 OD

(260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Xroaksnm:

255.

Retensjonstid: 13,9 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -> 40 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt,

254 nm).

Eksempel 104

104( a) 5'- 0-( 4- fenylbenzyl) tvmidin

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 6(a), men bruke 405 mg (2 mmol) 4-fenyl-benzylklorid, ble 387,8 mg (utbytte 47%) av tittelforbindelsen erholdt.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3+ CD30D, 4:1 volum/volum, TMS, 270 MHz), 6 ppm:

7,65-7,33 (10H, multiplett),

6,37 (1H, triplett, J = 7,26 Hz),

4,64 (2H, singlett),

4,55-4,48 (1H, multiplett),

4,13-4,09 (1H, multiplett),

3,87-3,70 (2H, multiplett),

2,38-2,15 (2H, multiplett),

1,63 (3H, singlett).

104( b) 5'- Q-( 4- fenylbenzyl) tvmidin- 2- cvanetyl- N, N- diisopro-pylf osf oramiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel ll(b), men bruke 82 mg (0,2 mmol) 5'-0-(4-fenylbenzyl)tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor], ble 71,8 mg (utbytte 59%) av tittelforbindelsen erholdt.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,62-7,34 (10H, multiplett),

6,40 (1H, triplett, J = 6,60 Hz),

4,70-4,60 (3H, multiplett),

4,27, 4,20 (til sammen 1H, to brede singletter), 3,90-3,55 (6H, multiplett),

2,67-2,57 (2H, multiplett),

2,53-2,16 (2H, multiplett),

1,63 (3H, singlett),

1,19 (12H, dublett, J = 6,60 Hz).

104( c) En forbindelse med formel I04( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(4-fenylbenzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -♦ 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, temperatur 60°C, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 16,1 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk 281,8 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Xoaks nm:

255.

Retensjonstid: 7,1 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -> 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt, 60°C, 254 nm).

Eksempel 105

105( a) 5'- 0-( 2- fenvlbenzvl) tvmidin

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 6(a), men bruke 365 ul (2 mmol) 2-fenyl-benzylbromid, ble 133,2 mg (utbytte 16%) av tittelforbindelsen erholdt.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,13 (1H, bred singlett),

7.50- 7,28 (10H, multiplett),

6,34 (1H, triplett, J = 6,75 Hz),

4,57, 4,50 (2H, to dubletter, J = 13,0 Hz),

4,30 (1H, bred singlett),

3,98 (1H, bred singlett),

3,73-3,52 (2H, multiplett),

2,32-2,05 (2H, multiplett),

1,90 (1H, bred singlett),

1,51 (3H, singlett).

105( b) 5'- Q-( 2- fenvlbenzyl) tvmidin- 2- cyanetyl- N. N- diisopropylfosforamiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel ll(b), men bruke 82 mg (0,2 mmol) 5'-0-(2-fenylbenzyl)tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor], ble 89,9 mg (utbytte 73%) av tittelforbindelsen erholdt.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7.51- 7,29 (10H, multiplett),

6,36 (1H, triplett, J = 7,92 Hz),

4,55-4,45 (3H, multiplett),

4,19, 4,11 (til sammen 1H, to singletter), 3,90-3,52 (6H, multiplett),

2,66-2,54 (2H, multiplett), 2,45-2,03 (2H, multiplett),

1,51 (3H, singlett),

1,19 (12H, dublett, J = 6,60 Hz).

105( c) En forbindelse med formel 105( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(2-fenylbenzyl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekroma-tograf i med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 MTEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -> 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 60°C, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 14,8 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 172,2 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A,maksnm:

252.

Retensjonstid: 6,1 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt, 60°C, 254 nm).

Eksempel 106

106( a) 3'- 0- triisopropylsilvl- 5'- 0-( 4, 4'- dimetoksytrityl)-tymidin

1,485 g (2,73 mmol) 5'-0-(4,4'-dimetoksytrityl)tymidin og 0,37 g (5,45 mmol) imidazol ble først tørket ved azeo-

trop destillasjon under redusert trykk med pyridin og så opp-løst i 6 ml dimetylformamid. 875 ul (4,09 mmol) triisopropylsilylklorid ble tilsatt til denne oppløsningen, og den resulterende blanding ble omrørt over natten ved romtemperatur. Ved slutten av dette tidsrommet ble 875 ul triisopropylsilylklorid og 0,37 g imidazol tilsatt til blandingen som så ble omrørt i én dag. Reaksjonsblandingen ble så fortynnet med 100 ml etylacetat, og den fortynnede blanding ble vasket to ganger, hver gang med 100 ml av en 5% vekt/volum vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat. Det organiske lag ble tørket over vannfritt natriumsulfat, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 100 g silikagel (70-230 mesh), under anvendelse av metylenklorid som inneholdt fra 0 til 3 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 1,861 g (utbytte 97%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,08 (1H, singlett),

7,67 (1H, singlett),

7,42-6,80 (13H, multiplett),

6,39 (1H, triplett, J = 5,94 Hz),

4,60-4,55 (1H, multiplett),

4,06-4,03 (1H, multiplett),

3,79 (6H, singlett),

3,53-3,26 (2H, multiplett),

2,52-2,18 (2H, multiplett),

1,50 (3H, singlett),

1,03-0,90 (21H, multiplett).

106( b) 3'- 0-( triisopropvlsilvl) tvmidin

1,6 ml trifluoreddiksyre ble tilsatt dråpevis til en oppløsning av 1,861 g (2,655 mmol) 3'-0-triisopropylsilyl-5'-0-(4,4'-dimetoksytrityl)tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] i 80 ml kloroform under avkjøling på et isbad og omrøring. Den resulterende blanding ble omrørt i.

10 minutter, og så ble 2 ml pyridin tilsatt. Reaksjonsblandingen ble vasket to ganger, hver gang med 100 ml av en 5% vekt/volum vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat, og tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 50 g silikagel (70-230 mesh), under anvendelse av metylenklorid inneholdende 4 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 0,9965 g (utbytte 94%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,17 (1H, bred singlett),

7,36 (1H, singlett),

6,12 (1H, triplett, J = 5,94 Hz),

4,63-4,59 (1H, multiplett),

4,03-4,00 (1H, multiplett),

3,96-3,74 (2H, multiplett),

2,48 (1H, bred singlett),

2,45-2,21 (2H, multiplett),

1,91 (3H, singlett),

1,15-1,00 (21H, multiplett).

1Q6( c) 3'- O- triisopropylsilvl- 5'- 0-\( 4- benzyloksy) benzyl!-tymidin

88 mg (2 mmol) natriumhydrid (som en 55 vekt% dispersjon i mineralolje) ble tilsatt til en oppløsning av 398 mg (1 mmol) 3<1->0-(triisopropylsilyl)tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i 2,5 ml tetrahydrofuran, og den resulterende blanding fikk stå ved 60°C i 2 timer og ble så avkjølt til romtemperatur. 232 mg (1 mmol) 4-benzyloksybenzyl-klorid og 75 mg (0,5 mmol) natriumjodid ble tilsatt til blandingen, og reaksjonsblandingen ble så omrørt over natten ved romtemperatur, og så ved 55°C i 8 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble oppløst i 100 ml etylacetat. Den resulterende oppløsning ble vasket to ganger, hver gang med 100 ml 0,01 N vandig saltsyre. Det organiske lag ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 30 g silikagel (230-400 mesh), under anvendelse av metylenklorid inneholdende fra 1 til 2 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 237 mg (utbytte 40%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,00 (1H, bred singlett),

7,59 (1H, singlett),

7,48-6,90 (9H, multiplett),

6,36 (1H, triplett, J = 6,60 Hz),

5,07 (2H, singlett),

4,56-4,46 (1H, multiplett),

4,50 (2H, singlett),

4,07-4,03 (1H, multiplett),

3,80-3,60 (2H, multiplett),

2,33-2,08 (2H, multiplett),

1,56 (3H, singlett),

1,10-0,97 (21H, multiplett).

106( d) 5'- O- r( 4- benzvloksv) benzv! 1tvmidin

1,5 ml av en 1 M tetrahydrofuranoppløsning av tetrabutylammoniumfluorid ble tilsatt til en oppløsning av 237 mg (0,4 mmol) 3'-0-triisopropylsilyl-5'-O-[(4-benzyloksy)benzyl]-tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (c) ovenfor] i 1,5 ml tetrahydrofuran, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Ved slutten av dette tidsrommet ble reaksjonsblandingen befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble opp-løst i 100 ml etylacetat. Denne oppløsningen ble vasket to ganger, hver gang med 100 ml av en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid og ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble renset ved kolonne-kromatograf i gjennom 30 g silikagel (230-400 mesh), under anvendelse av metylenklorid inneholdende fra 1 til 4 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 108,5 mg (utbytte 61%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,11 (1H, bred singlett),

7,56 (1H, singlett),

7,47-6,93 (9H, multiplett),

6,38 (1H, triplett, J = 7,26 Hz),

5,06 (2H, singlett),

4,57-4,47 (1H, multiplett),

4,52 (2H, singlett),

4,10-4,06 (1H, multiplett),

3,80-3,64 (2H, multiplett),

2,38-2,15 (2H, multiplett),

1,67 (3H, singlett).

106( e) 5'-O- r( 4- benzyloksy) benzyl] tymidin- 2- cvanetyl- N. N- di-isopropylf osforamiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel ll(b), men bruke 88 mg (0,2 mmol) 5'-0-[(4-benzyloksy)benzyl]tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (d) ovenfor], ble 104,8 mg (utbytte 82%) av tittelforbindelsen erholdt.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,58, 7,56 (til sammen 1H, to singletter),

7,46-6,93 (9H, multiplett),

6,37 (1H, triplett, J = 6,60 Hz),

5,06 (2H, singlett),

4,64-4,54 (1H, multiplett),

4,60, 4,59 (2H, singlett),

4,25-4,15 (1H, multiplett),

3,90-3,50 (6H, multiplett),

2,66-2,54 (2H, multiplett),

2,50-2,10 (2H, multiplett),

1,65 (3H, singlett),

1,18 (12H, dublett, J = 7,26 Hz).

106( f) En forbindelse med formel 106( f):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-[(4-benzyloksy)-benzyl]tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (e) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N, N-diisopropylf osf oramidittet, ble tittelforbindelsen syntetisert. Reaksjonsproduktet bie oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatograf i med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -* 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 60°C, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 17,0 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 208,8 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.mak6 nm:

254.

Retensjonstid: 8,1 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, vandig oppløsning av 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt, 60°C, 254 nm).

Eksempel 107

107( a) 5'- 0-( 9- fenvlxanten- 9- vl) tvmidin

585 mg (2 mmol) 9-klor-9-fenylxanten ble tilsatt til en oppløsning av 484 mg (2 mmol) tymidin i 20 ml pyridin, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 1 time mens den ble beskyttet mot lys. Reaksjonsblandingen ble

så fortynnet med 200 ml metylenklorid, og den fortynnede blanding ble vasket to ganger, hver gang med 200 ml av en 5% vekt/volum vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat. Det organiske lag ble tørket over vannfritt natriumsulfat, og opp-løsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 35 g silikagel (70-230 mesh) under anvendelse av metylenklorid inneholdende fra 0 til 2,5 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 647,8 mg (utbytte 65%) av tittelforbindelsen.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,33 (1H, bred singlett),

7,62 (1H, singlett),

7,45-7,02 (13H, multiplett),

6,36 (1H, triplett, J = 5,94 Hz),

4,49-4,41 (1H, multiplett),

4,02-3,96 (1H, multiplett),

3,29-3,12 (2H, multiplett),

2,52-2,24 (2H, multiplett),

1,99 (1H, dublett, J = 3,96 Hz),

1,67 (3H, singlett).

107( b) 5'- 0-( 9- fenylxanten- 9- yl) tymidin- 2- cvanetyl- N. N- diiso-propylf osf oramiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 11(b), men bruke 100 mg (0,2 mmol) 5'-0-(9-fenylxanten-9-yl)tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor], ble det erholdt 134,9 mg (utbytte 99%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,03 (1H, bred singlett),

7,69, 7,64 (til sammen 1H, to singletter),

7,40-7,03 (13H, multiplett),

6,40-6,32 (1H, multiplett),

4,58-4,47 (1H, multiplett),

4,15-4,05 (1H, multiplett),

3,90-3,10 (6H, multiplett),

2,82-2,28 (4H, multiplett),

1,63, 1,62 (til sammen 3H, to singletter), 1,16 (12H, dublett, J = 6,6 Hz).

107( c) En forbindelse med formel 107( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(9-fenylxanten-9-yl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen syntetisert. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væske-kromatograf i med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -* 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 60°C, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 19,7 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 145,6 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Xmaks nm:

249.

Retensjonstid: 10,9 minutter

Eksempel 108

108( a) 5'- 0-( 9- fenvlfluoren- 9- vl) tvmidin

770 mg (2,4 mmol) 9-brom-9-fenylfluoren ble tilsatt til en oppløsning av 242 mg (1 mmol) tymidin i 10 ml pyridin, og den resulterende blanding ble omrørt ved 100°C i 8 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble reaksjonsblandingen konsentrert ved inndamping under redusert trykk, og konsentratet ble oppløst i 100 ml metylenklorid. Oppløsningen ble vasket med 100 ml av en 5% vekt/volum vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløs-ningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 30 g silikagel (230-400 mesh), under anvendelse av metylenklorid inneholdende fra 1 til 3 volum% metanol som elueringsmiddel, hvorved man fikk 194,2 mg (utbytte 37%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,06 (1H, bred singlett),

7,76 (1H, singlett),

7,72-7,20 (13H, multiplett),

6,41 (1H, triplett, J = 6,60 Hz),

4,64-4,58 (1H, multiplett),

3,95-3,90 (1H, multiplett),

3,49-3,13 (2H, multiplett),

2,45-2,38 (2H, multiplett),

1,88 (1H, dublett, J = 3,96 Hz),

1,48 (3H, singlett).

108( b) 5'-0-( 9- fenylfluoren- 9- vl) tymidin- 2- cvanetvl- N. N- diisopropylfosforamiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel ll(b), men bruke 105 mg (0,2 mmol) 5'-0-(9-fenylfluoren-9-yl)tymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor], ble 110,8 mg (utbytte 76%) av tittelforbindelsen erholdt.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,00 (1H, bred singlett),

7,80 (1H, singlett),

7,78-7,20 (13H, multiplett),

6,44-6,37 (1H, multiplett),

4,72-4,62 (1H, multiplett),

4,10-4,00 (1H, multiplett),

3,90-3,10 (6H, multiplett),

2,75-2,34 (4H, multiplett),

1,46, 1,45 (til sammen 3H, to singletter),

1,18 (12H, dublett, J = 6,60 Hz).

108( c) En forbindelse med formel 108( c):

V-0—TGGGAG-OH 108(c)

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(9-fenylfluoren-9-yl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-0-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen syntetisert. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væske-kromatograf i med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 60°C, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 19,1 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 291,2 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Aoaksnm:

255.

Retensjonstid: 10,4 minutter

Eksempel 109

109( a) 5'-( S- trifenvlmetvl) tio- 5'- deoksvtvmidin- 2- cvanetvl-N, N- diisopropylfosforamiditt

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel ll(b), men bruke 100 mg (0,2 mmol) 5'-(S-trifenylmetyl)tio-5'-deoksytymidin [B. S. Sproate, B. Beijer, P. Rider, P. Neuner, Nucleic Acids Res., 15, (12) 4837

(1987)], ble det erholdt 88 mg (utbytte 62%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,45-7,18 (16H, multiplett),

6,23-6,17 (1H, multiplett),

4,31-4,20 (1H, multiplett),

4,11-4,00 (1H, multiplett),

3,85-3,43 (4H, multiplett),

2,62-1,98 (4H, multiplett),

1,56 (3H, singlett),

1,20-1,05 (12H, multiplett).

109( b) En forbindelse med formel 109( b):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-(S-trifenylmetyl)tio-5'-deoksytymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen syntetisert. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 15 cm, elueringsmiddel A: 50 mM TEAB, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -» 50 volum% B, lineær gradient, 254 nm). Det ble så opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 122,3 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

254.

Retensjonstid: 19,0 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil ODS", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 10 -» 60 volum% B,

20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 60°C,

260 nm).

Eksempel 110

En forbindelsé med formel 110( a):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-0-(9-fenylfluoren-9-yl)tymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i eksempel 108(b)] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet og taste inn basesekvensen TGGGG i synteseapparatet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble oppdelt i tre porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 25 -» 55 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 60°C, 254 nm). Fraksjoner eluert etter 14,6 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 28,3 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.BakBnm:

256.

Retensjonstid: 10,7 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("YMC-Pack" A-312, S-5, 120A, ODS, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,3, elueringsmiddel B: acetonitril, 20 -* 50 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 2 ml/minutt, 60°C, 254 nm).

Eksempel 111

En forbindelse med formel lll( a):

En lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 15(c), ble gjentatt, men det ble brukt en kolonne pakket med 125 mg (5 umol) av forbindelsen ifølge eksempel 12(b), og basesekvensen XGCGGZ (hvor Z er som definert i eksempel 17) ble tastet inn i DNA/RNA-synteseapparatet beskrevet i eksempel l(b). Den således erholdte, 90% vandige formamid-oppløsning inneholdende tittelforbindelsen, ble varmet opp ved 95°C i 5 minutter. Etter denne oppvarmingen ble oppløsningen avkjølt hurtig. Reaksjonsblandingen ble oppdelt i fire porsjoner, og hver porsjon ble renset ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,0, elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 260 nm, kolonnetemperatur 60°C). Fraksjoner eluert etter 20,8 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 82 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.nal<snm:

254.

Retensjonstid: 13,38 minutter

elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B,

20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm).

Eksempel 112

112( a) 51 - r( 3. 4- dibenzyloksy) benzyltio1- 5'- deoksytymidin

258 mg (1 mmol) 5'-deoksy-5'-merkaptotymidin ble tilsatt til 20 ml aceton. 406 mg (1,2 mmol) 3,4-dibenzyloksybenzylklorid og 1 g vannfritt kaliumkarbonat ble så tilsatt til oppløsningen under nitrogenatmosfære. Den resulterende blanding ble omrørt mens det ble varmet opp under refluks i 1 time. Ved slutten av dette tidsrom ble utfellinger filtrert fra reaksjonsblandingen, og filtratet ble befridd for oppløs-ningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble oppløst i en liten mengde metylenklorid og renset ved kolonnekromatografi gjennom 10 g silikagel under anvendelse av en blanding av metanol og metylenklorid i volumforholdet 5:95 som elueringsmiddel, hvorved man fikk 452 mg av tittelforbindelsen som en fargeløs, karamellignende rest. Denne resten ble lyofilisert fra benzen, hvorved man fikk 180 mg (utbytte 32%) av tittelforbindelsen som hvite krystaller.

<l>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,26 (1H, bred singlett),

6,78-7,46 (14H, multiplett),

6,20 (1H, triplett, J = 6,6 Hz),

5,15 & 5,17 (til sammen 4H, to singletter), 4,20-4,27 (1H, multiplett),

3,87-3,91 (1H, multiplett),

3,67-3,68 (2H, multiplett),

2,61-2,70 (2H, multiplett),

2,09-2,40 (2H, multiplett),

1,91-1,92 (3H, multiplett).

112( b) 5'- r( 3. 4- dibenzyloksy) benzvltio1- 5'- deoksvtymidin- 2-cyanety1- N. N- diisopropylfosforamiditt

112 mg (0,2 mmol) 5'-[(3,4-dibenzyloksy)benzyltio]-5'-deoksytymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 1 ml metylenklorid. 17 mg (0,1 mmol) diisopropylammoniumtetrazolid ble så tilsatt til oppløsningen. 70 ul (0,22 mmol) 2-cyanetyl-N,N,N<1>,N'-tetraisopropylfosfordiamiditt ble så til-

satt dråpevis til blandingen under argonatmosfaere. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer under den samme atmosfære. Metylenkloridet ble så fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble oppløst i 10 ml etylacetat, og oppløsningen ble vasket med en 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat og med en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid i denne rekkefølge. Oppløsningen ble så tørket over vannfritt natriumsulfat, hvoretter oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og den resulterende rest ble renset ved kol-onnekromatograf i gjennom 10 g silikagel (70-230 mesh), under anvendelse av etylacetat som elueringsmiddel, hvorved man fikk 115 mg (utbytte 76%) av tittelforbindelsen som et karamellignende stoff.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,16 (1H, bred singlett),

6,76-7,45 (14H, multiplett),

6,23-6,29 (1H, multiplett),

5,14-5,16 (4H, multiplett),

4,38-4,46 (1H, multiplett),

4.08- 4,16 (1H, multiplett),

3,50-3,90 (6H, multiplett),

2.09- 2,80 (6H, multiplett),

1,91-1,93 (3H, multiplett),

1,08-1,58 (12H, multiplett).

112( c) En forbindelse med formel 112( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-[(3,4-dibenzyloksy)- benzyl tio] -5' -deoksytymidin-2-cyanetyl-N, N-diisopropylf osf or-amiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamid-ittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 150 mm, elueringsmiddel A: 50 mM vandig trietylammoniumhydrogenkarbonatbuffer (TEAB), pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 15-50 volum% B, lineær gradient, 260 nm). De eluerte fraksjoner som inneholdt tittelforbindelsen, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 57 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.maksnm:

253.

Retensjonstid: 16,85 minutter

Væskekromatografi med høy yteevne ("Inertsil 0DS-2", 6 x 150 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,5,

elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B,

20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm).

Eksempel 113

113( a) 5'- r( antracen- 9- yl) metyltio1- 5'- deoksytymidin

258 mg (1 mmol) 5'-deoksy-5'-merkaptotymidin ble tilsatt til 20 ml aceton. 272 mg (1,2 mmol) 9-klormetylantracen og 1 g vannfritt kaliumkarbonat ble så tilsatt til oppløsnin-gen under nitrogenatmosfære. Den resulterende blanding ble så omrørt mens det ble varmet opp under refluks i 2 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble utfellinger filtrert fra reaksjonsblandingen, og filtratet ble befridd for oppløsningsmid-del ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble krystallisert fra 10 ml etanol, hvorved man fikk 156 mg (utbytte 35%) av tittelforbindelsen som lysegule krystaller.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksid, 270 MHz, TMS), 6 ppm:

8,56 (1H, singlett),

8,40 (2H, dublett, J = 8,7 Hz),

8,09 (2H, dublett, J = 8,2 Hz),

7,51-7,61 (5H, multiplett),

6,24-6,28 (1H, multiplett),

5,43 (1H, bred singlett),

4,87-4,89 (2H, multiplett),

4,24-4,25 (1H, triplett, J = 2,7 Hz),

4,03-4,07 (1H, multiplett),

3,05 (2H, dublett, J = 6,5 Hz),

2,07-2,29 (2H, multiplett), 1,72-1,73 (3H, multiplett).

113( b) 5'- r( antracen- 9- vl) metvltio1- 5'- deoksytymidin- 2- cvanetyl- N. N- diisopropylfosforamiditt 74 mg (0,165 mmol) 5'-[(antracen-9-yl)metyltio]-5'-deoksytymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 1 ml tetrahydrofuran. 0,115 ml (0,659 mmol) N,N-diisopropyl-N-etylamin ble tilsatt til oppløsningen. 49 ul (0,22 mmol) 2-cyanetyl-N,N-diisopropylklorfosforamiditt ble så tilsatt dråpevis til blandingen under argonatmosfære. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 1,75 timer under den samme atmosfære. Tetrahydrofuranet ble så fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble oppløst i 10 ml etylacetat, og oppløsningen ble vasket med en 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat og med en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid i denne rekkefølge. Oppløsningen ble tørket over vannfritt natriumsulfat, og så ble oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 10 g silikagel (70-230 mesh), under anvendelse av etylacetat som elueringsmiddel, hvorved man fikk 85 mg (utbytte 79%) av tittelforbindelsen som et skumlignende stoff.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,26-8,43 (10H, multiplett),

6,26-6,33 (1H, multiplett),

4,74-4,93 (2H, multiplett),

4,32-4,42 (1H, multiplett),

4,20-4,28 (1H, multiplett),

3,49-3,80 (4H, multiplett),

2,89-3,11 (2H, multiplett),

1,93-2,68 (4H, multiplett),

1,71-1,76 (3H, multiplett),

1,08-1,22 (12H, multiplett).

113( c) En forbindelse med formel 113( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-[(antracen-9-yl)metyltio]-5'-deoksytymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 150 mm, elueringsmiddel A: 50 mM TEAB, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 15-50 volum% B, lineær gradient, 260 nm). De eluerte fraksjoner inneholdende tittelforbindelsen, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 1(b), hvorved man fikk 30 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.^^ nm:

255.

Retensjonstid: 13,52 minutter

elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B,

20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt,

260 nm).

Eksempel 114

114( a) 5'- T( 2- naftyl) metyltio1- 5'- deoksytymidin

258 mg (1 mmol) 5'-deoksy-5'-merkaptotymidin ble tilsatt til 20 ml aceton. 265 mg (1,2 mmol) 2-brommetylnaftalen og 1 g vannfritt kaliumkarbonat ble så tilsatt til oppløsnin-gen under argonatmosfære. Den resulterende blanding ble omrørt mens den ble varmet opp ved refluks i 2 timer. Ved slutten av dette tidsrommet ble utfellinger filtrert fra reaksjonsblandingen, og filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble krystallisert fra 10 ml etanol, hvorved man fikk 100 mg (utbytte 25%) av tittelforbindelsen som hvite krystaller.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksid, 270 MHz, TMS), 6 ppm:

7,84-7,90 (1H, bred singlett),

7,78 (1H, singlett),

7,46-7,53 (4H, multiplett),

6,16-6,19 (1H, multiplett),

5,34 (1H, dublett, J = 4,4 Hz),

4,14-4,19 (1H, multiplett),

3,92-3,99 (2H, multiplett),

3,83-3,87 (1H, multiplett),

2,62-2,78 (2H, multiplett),

2,02-2,23 (2H, multiplett),

1,75-1,79 (3H, multiplett).

114( b) 5'- r( 2- naftyl) metyltio1- 5'- deoksytymidin- 2- cvanetyl-N. N- diisopropylfosforamiditt

79,7 mg (0,2 mmol) 5'-[(2-naftyl)metyltio]-5'-deoksytymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tør-ket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 2,5 ml tetrahydrofuran. 0,084 ml (0,48 mmol) diisopropylamin ble så tilsatt til oppløsningen. 54 ul (0,24 mmol) 2-cyanetyl-

N, N-diisopropylklorfosforamiditt ble så tilsatt dråpevis til blandingen under argonatmosfære. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 1,75 time under den samme atmosfære. Tetrahydrofuranet ble så fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble oppløst i 10 ml etylacetat, og oppløsningen ble vasket med en 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat og med en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid i den rekkefølge. Oppløsningen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat, hvoretter oppløs-ningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og resten ble renset ved kolonnekromatografi gjennom 10 g silikagel (70-230 mesh), under anvendelse av etylacetat som elueringsmiddel, hvorved man fikk 67 mg (utbytte 56%) av tittelforbindelsen som et skumlignende stoff.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

8,32 (1H, bred singlett),

7,26-7,85 (8H, multiplett),

6,27 (1H, multiplett),

4,38-4,46 (1H, multiplett),

4,11-4,19 (1H, multiplett),

3,93-3,95 (2H, multiplett),

3,47-3,90 (4H, multiplett),

2,10-2,88 (6H, multiplett),

1,62-1,90 (3H, multiplett),

1,10-1,21 (12H, multiplett).

114( c) En forbindelse med formel 114( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-[(2-naftyl)metyltio]-5'-deoksytymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt

[fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N, N-diisopropylf osf oramidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom en reversfase-silikagelkolonne ("Preparative C18", Waters, 1,5 x 150 mm, elueringsmiddel A: 50 mM TEAB, pH 7,5, elueringsmiddel B: acetonitril, 15-50 volum% B, lineær gradient, 260 nm). De eluerte fraksjoner inneholdende tittelforbindelsen, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 165 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), A.makBnm:

254.

Retensjonstid: 12,07 minutter

elueringsmiddel B: acetonitril, 10-60 volum% B,

20 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm).

Eksempel 115

115( a) 5'-{ 3, 5- bisr3. 5-( dibenzyloksy) benzyloksy] benzvltio1-5'- deoksytymidin

258 mg (1 mmol) 5'-deoksy-5'-merkaptotymidin ble tilsatt til 20 ml aceton. 969 mg (1,2 mmol) 3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy )benzyloksy]benzylbromid og 1 g vannfritt kaliumkarbonat ble så tilsatt til oppløsningen under argonatmosfære. Den resulterende blanding ble omrørt mens den ble varmet opp under refluks i 2 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble utfellinger filtrert fra reaksjonsblandingen, og filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Resten ble lyofilisert fra benzen, hvorved man fikk 365 mg (utbytte 37%) av tittelforbindelsen som et hvitt pulver.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,99 (1H, bred singlett),

7,23-7,42 (21H, multiplett),

6,49-6,68 (9H, multiplett),

4,98-5,03 (12H, multiplett),

4,18-4,26 (1H, multiplett),

3,87-3,91 (1H, multiplett),

3,64-3,71 (2H, multiplett),

2,67 (2H, dublett, J = 5,7 Hz),

2,00-2,64 (2H, multiplett),

1,86-1,92 (3H, multiplett).

115( b) 5' - <" 3, 5- bisT3, 5-( dibenzyloksy) benzyloksy 1 benzyl tio >-5'- deoksytymidin- 2- cyanetyl- N, N- diisopropvlfosforamiditt

197 mg (0,2 mmol) 5'-{3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy] benzyltio} -5 ' -deoksytymidin [fremstilt som beskrevet i trinn (a) ovenfor] ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 1 ml metylenklorid. 0,017 g (0,1 mmol) diisopropylammoniumtetrazolid ble så tilsatt til oppløsningen.

70 pl (0,22 mmol) 2-cyanetyl-N,N,N',N'-tetraisopropylfosfor-diamiditt ble så tilsatt dråpevis til blandingen under argonatmosfære. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer under den samme atmosfære. Tetrahydrofuranet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Den resulterende rest ble oppløst i 10 ml etylacetat, og oppløsningen ble vasket med en 10% vekt/volum vandig oppløsning av natriumkarbonat og med en mettet, vandig oppløsning av natriumklorid i den rekkefølge. Oppløsningen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat, hvoretter oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble renset ved

kolonnekromatografi gjennom 10 g silikagel (70-230 mesh) under anvendelse av etylacetat som elueringsmiddel, hvorved man fikk 103 mg (utbytte 43%) av tittelforbindelsen som et karamellignende stoff.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,27-7,44 (20H, multiplett),

6,51-6,69 (10H, multiplett),

4,98-5,05 (12H, multiplett),

4,44-4,51 (1H, multiplett).

4,13-4,18 (1H, multiplett),

3,47-3,87 (6H, multiplett),

2,17-2,84 (6H, multiplett),

1,92 (3H, singlett),

1,08-1,34 (12H, multiplett).

115( c) En forbindelse med formel 115( c):

Ved å følge en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel l(b), men bruke 5'-{3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy )benzyloksy]benzyltio}-5'-deoksytymidin-2-cyanetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt [fremstilt som beskrevet i trinn (b) ovenfor] i stedet for 5'-O-trityltymidin-2-cyanetyl-N,N-diiso-propylf osf oramidittet, ble tittelforbindelsen fremstilt. Reaksjonsproduktet ble renset ved kromatografi gjennom reversfase-væskekromatograf ikolonne med høy yteevne ("Inertsil PREP-ODS", 20,0 x 250 mm, elueringsmiddel A: 0,1 M TEAA, pH 7,0, elueringsmiddel B: acetonitril, 30-100 volum% B, 30 minutter, lineær gradient, 7 ml/minutt, 260 nm, kolonnetemperatur 60°C). Fraksjoner eluert etter 26,5 minutter, ble samlet opp og opparbeidet på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel l(b), hvorved man fikk 86 OD (260 nm) av tittelforbindelsen som et amorft, fast stoff.

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum (H20), Amaks nm:

257.

Retensjonstid: 18,44 minutter

elueringsmiddel B: acetonitril, 40-100 volum% B,

25 minutter, lineær gradient, 1 ml/minutt, 260 nm).

Fremstillinger

De følgende fremstillinger illustrerer fremstillingen av alternative utgangsmaterialer for fremstillingen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fremstilling 1

2- r 2- 0-( 4. 4'- dimetoksvtritvloksv) etvlsulfonylletylmonosuccinat

1,37 g (3,0 mmol) 2-[2-0-(4,4'-dimetoksytrityloksy)-etylsulfonyl]etanol [Tetrahedron Lett. 27, 4705 (1986)] ble tørket ved hjelp av azeotrop destillasjon under redusert trykk med pyridin og så oppløst i 12 ml metylenklorid. 315 mg (3,15 mmol) ravsyreanhydrid og 384 mg (3,15 mmol) 4-(dimetylamino)pyridin ble tilsatt til den resulterende oppløsning som så ble omrørt i 30 minutter. Etter at fullførelsen av reaksjonen var blitt bekreftet ved hjelp av tynnsjiktskromatografi, ble 80 ml metylenklorid tilsatt til reaksjonsblandingen. Den resulterende blanding ble så vasket med en 0,5 M vandig oppløsning av kaliumdihydrogenfosfat (pH 5,0) og med vann i den rekkefølge, og det organiske lag ble tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble så fjernet ved destillasjon under redusert trykk, hvorved man fikk 1,60 g (utbytte 96%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDCfi3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,40-6,83 (13H, multiplett),

4,58-4,53 (2H, triplett, J = 5,94 Hz),

3,79 (6H, singlett),

3,68-3,64 (2H, triplett, J = 5,61 Hz),

3,50-3,45 (2H, triplett, J = 5,94 Hz),

3,18-3,14 (2H, triplett, J = 5,61 Hz),

2,71-2,61 (4H, multiplett).

Fremstilling 2

En forbindelse med formel 2( p):

1,60 g (2,87 mmol) 2-[2-0-(4,4'-dimetoksytrityloksy)-etylsulfonyl]etylmonosuccinat (fremstilt som beskrevet i fremstilling 1) ble oppløst i 18 ml dimetylformamid, og 0,96 g (3,6 mmol) pentaklorfenol og 0,96 g (4,5 mmol) 1,3-disykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til den resulterende oppløsning som så ble omrørt i 18 timer. De uoppløselige stoffer som utfeltes, ble fraskilt ved filtrering, og oppløsningsmidlet ble fjernet fra filtratet ved fordamping under redusert trykk. Benzen ble tilsatt til resten, og ytterligere uoppløselige stoffer som utfeltes, ble fraskilt ved filtrering. Oppløs-ningsmidlet ble på nytt fjernet fra filtratet ved fordamping under redusert trykk.

Resten (0,16 g, 0,2 mmol) ble oppløst i 4 ml dimetylformamid, og 15 ul (0,11 mmol) trietylamin og 1,0 g aminopropyl-CPG (85,7 umol/g aminogrupper ble innført) ble tilsatt til oppløsningen som så ble satt ved romtemperatur i 24 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble CPG-bæreren samlet opp ved filtrering, vasket med metylenklorid og så tørket ved inndamping under redusert trykk. 5 ml hver av "cap A"- og "cap B"-oppløs-ninger (Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til CPG-bæreren, og blandingen fikk stå i 5 minutter. Blandingen ble så vasket med pyridin og med metylenklorid i den rekkefølge, og tørket ved inndamping under redusert trykk, hvorved man fikk tittelforbindelsen .

Mengden av forbindelsen ifølge fremstilling 1 innført i tittelforbindelsen, ble bestemt i henhold til den følgende metode. En avblokkeringsoppløsning (en 3 volum% oppløsning av dikloreddiksyre i metylenklorid, Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til 11,4 mg av tittelforbindelsen, og blandingen ble ristet i 3 minutter, hvoretter tilstrekkelig metylenklorid ble tilsatt slik at den totale mengde ble 20 ml. 0,4 ml av oppløs-ningsmidlet ble avdestillert, og så ble 3 ml av en oppløsning av perklorsyre i etanol i volumforholdet 3:2 tilsatt til resten, og absorbansen til dimetoksytritylkationet ved 500 nm ble målt (6 = 71.700).

Mengden av dimetoksytritylgrupper innført var

53,1 umol/g.

Fremstilling 3

2- r2- 0-( 4. 4'- dimetoksvtritvloksy) etvlsulfonylletvl- 2, 2, 2- tri-kloretoksykarbonat

1,1 g (2,4 mmol) 2-[2-0-(4,4'-dimetoksytrityloksy)-etylsulfonyl]etanol [Tetrahedron Lett. 27, '4705 (1986)] ble tørket ved azeotrop destillasjon under redusert trykk med pyridin og så oppløst i 12 ml metylenklorid. 0,35 ml (2,6 mmol) 2,2,2-trikloretoksykarbonylklorid ble tilsatt til opp-løsningen som så ble omrørt i 2 timer. Etter at fullførelsen av reaksjonen var blitt bekreftet ved hjelp av tynnsjiktskromatografi, ble reaksjonsblandingen helt over i en blanding av 100 ml metylenklorid og 100 ml av en 5% vekt/volum vandig opp-løsning av natriumhydrogenkarbonat for å bevirke fasesepara-sjon. De organiske lag ble vasket med en 5% vekt/volum vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat, og de ble så samlet opp og tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble så fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og resten ble renset ved reversfase-kolonnekromatografi ("Preparative C18", Waters, <J) 2,2 x 7,0 cm, oppløsningsmiddel: 60 vo^um% vandig acetonitril), hvorved man fikk 1,35 g (utbytte 89%) av tittelforbindelsen som et amorft pulver.

<X>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,41-6,83 (13H, multiplett),

4,75 (2H, singlett),

4,70-4,66 (2H, triplett, J = 5,94 Hz),

3,80 (6H, singlett),

3,68-3,64 (2H, triplett, J = 5,28 Hz),

3,61-3,56 (2H, triplett, J = 6,27 Hz),

3,23-3,19 (2H, triplett, J = 5,28 Hz).

Fremstilling 4

En forbindelse med formel 4( p):

0,126 g (0,2 mmol) 2-[2-0-(4,4'-dimetoksytrityloksy)-etylsulfonyl]etyl-2,2,2-trikloretoksykarbonat (fremstilt som beskrevet i fremstilling 3) ble oppløst i 5 ml dimetylformamid, og 15 ul (0,11 mmol) trietylamin, og 1,0 g aminopropyl-CPG (85,7 umol/g aminogrupper innføres) ble tilsatt til den resulterende oppløsning og vasket med en 1 volum% oppløsning av trietylamin i dimetylformamid. Blandingen fikk så stå ved romtemperatur i 4 dager. Ved slutten av dette tidsrom ble CPG-bæreren samlet opp ved filtrering og vasket med metylenklorid, hvoretter den ble tørket ved inndamping under redusert trykk. 5 ml hver av "cap A"- og "cap B"-oppløsninger (Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til CPG-bæreren, og blandingen fikk stå i 5 minutter. Blandingen ble så vasket med pyridin og med metylenklorid i den rekkefølge, og ble tørket ved inndamping under redusert trykk, hvorved man fikk tittelforbindelsen.

Mengden av forbindelsen fra fremstilling 3 innført i tittelforbindelsen, ble bestemt i henhold til den følgende metode. En avblokkeringsoppløsning (en 3 volum% oppløsning av dikloreddiksyre i metylenklorid, Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til 11,4 mg av tittelforbindelsen, og blandingen ble ristet i 3 minutter, hvoretter tilstrekkelig metylenklorid ble tilsatt til å gi en total mengde på 20 ml. 0,4 ml av oppløs-ningsmidlet ble avdestillert, og så ble 3 ml av en oppløsning av perklorsyre i etanol i volumforholdet 3:2 tilsatt til resten, og absorbansen til dimetoksytritylkationet ved 500 nm ble målt (e = 71.700).

Mengden av dimetoksytritylgrupper innført var

24,0 umol/g.

Fremstilling 5

En forbindelse med formell 5( p):

1,60 g (2,87 mmol) 2-[2-0-(4,4'-dimetoksytrityloksy)-etylsulfonyl]etylmonosuccinat (fremstilt som beskrevet i fremstilling 1) ble oppløst i 18 ml dimetylformamid, og 0,96 g (3,6 mmol) pentaklorfenol og 0,96 g (4,5 mmol) 1,3-disykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til oppløsningen. Den resulterende blanding ble så omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Ved slutten av dette tidsrommet ble utfellinger filtrert fra reaksjonsblandingen, og filtratet ble befridd for oppløsnings-midlet ved destillasjon under redusert trykk. Benzen ble tilsatt til resten. De resulterende utfellinger ble frafiltrert, og filtratet ble på nytt befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. 1,0 g (0,92 mmol) av resten ble brukt i det følgende trinn.

1,0 g (0,92 mmol) av denne resten, 75 ul (0,55 mmol) trietylamin og "Cosmosil 150 NH2-300" (med 450 umol aminogrupper pr. lg silikageloverflate, fremstilt av Nacalai Tesque Co. Ltd.) ble tilsatt til 20 ml dimetylformamid. Den resulterende blanding ble så omrørt ved romtemperatur i 20 timer. Den ønskede bærer, nemlig substituert "Cosmosil 150 NH2-300", ble samlet opp, vasket med metylenklorid og tørket ved inndamping under redusert trykk. 10 ml hver av "cap A"- og "cap B"-oppløsninger (Nippon Millipore Limited) ble tilsatt

til bæreren, og blandingen fikk stå i 10 minutter. Blandingen ble så vasket med pyridin og med metylenklorid i den rekkeføl-ge, og ble tørket ved inndamping under redusert trykk, hvorved man fikk tittelforbindelsen.

Mengden av forbindelsen fra fremstilling 1 innført i tittelforbindelsen, ble bestemt i henhold til den følgende metode. En avblokkeringsoppløsning (en 3 volum% oppløsning av dikloreddiksyre i metylenklorid, Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til 5,4 mg av tittelforbindelsen, og blandingen ble ristet i 3 minutter, hvoretter tilstrekkelig metylenklorid ble tilsatt til å gi en total mengde på 20 ml. 0,4 ml av oppløs-ningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og 3 ml av en oppløsning av perklorsyre i etanol i volumforholdet 3:2 ble tilsatt til resten, og absorbansen til dimetoksytritylkationet ved 500 nm ble målt (6 - 71.700).

Mengden av dimetoksytritylgrupper innført ble funnet å være 51,8 umol/g.

Fremstilling 6

En forbindelse med formel 6( p):

1,60 g (2,87 mmol) 2-[2-0-(4,4'-dimetoksytrityloksy)-etylsulfonyl]etylmonosuccinat (fremstilt som beskrevet i fremstilling 1) ble oppløst i 18 ml dimetylformamid, og 0,96 g (3,6 mmol) pentaklorfenol og 0,96 g (4,5 mmol) 1,3-disykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til oppløsningen. Den resulterende blanding ble så omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble utfellinger filtrert fra.reaksjonsblandingen, og filtratet ble befridd for oppløsningsmid-let ved destillasjon under redusert trykk. Benzen ble tilsatt til resten. De resulterende utfellinger ble frafiltrert, og filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. 0,48 g (0,6 mmol) av resten ble brukt i det følgende trinn.

0,48 g (0,6 mmol) av denne resten, 110 mg (0,9 mmol) 4-(dimetylamino)pyridin og 1,0 g av en p-alkoksybenzylalkoholharpiks (med 0,9 mmol aminogrupper pr. lg" av silikagelover-flaten, fremstilt av Kokusan Kagaku Co. Ltd.) ble tilsatt til 15 ml dimetylformamid, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 25 timer. Ved slutten av dette tidsrom ble denønskede bærer, nemlig den substituerte p-alkoksybenzylalkoholharpiks, samlet opp, vasket med metylenklorid, med met-

anol og med dietyleter i den rekkefølge, og tørket ved inndamping under redusert trykk. 10 ml hver av "cap A"- og "cap B"-oppløsninger (Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til bæreren, og blandingen fikk stå i 15 minutter. Blandingen ble så vasket med metylenklorid, med metanol og med dietyleter i den rekkefølge, og ble tørket ved inndamping under redusert trykk, hvorved man fikk tittelforbindelsen.

Mengden av forbindelsen fra fremstilling 1 innført i tittelforbindelsen, ble bestemt i henhold til den følgende metode. En avblokkeringsoppløsning (en 3 volum% oppløsning av dikloreddiksyre i metylenklorid, Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til 10,6 mg av tittelforbindelsen, og blandingen ble ristet i 3 minutter, hvoretter tilstrekkelig metylenklorid ble tilsatt til å gi en totalmengde på 20 ml. 0,4 ml av oppløs-ningsmidlet ble avdestillert, og så ble 6 ml av en oppløsning av perklorsyre i etanol i volumforholdet 3:2 tilsatt til resten, og absorbansen til dimetoksytritylkationet ved 500 nm ble målt (€ = 71.700).

Mengden av dimetoksytritylgrupper innført ble funnet å være 302 umol/g.

Fremstilling 7

En forbindelse med formel 7( p):

9,9 g (3,3 mmol) poly(oksyetylen)diglykol ble tørket ved azeotrop destillasjon med pyridin og så oppløst i 10 ml metylenklorid. 226 mg (1,1 mmol) 1,3-disykloheksylkarbbdiimid ble så tilsatt til oppløsningen under isavkjøling. Den resulterende blanding ble så omrørt under isavkjøling i 15 minutter. Ved slutten av dette tidsrom ble 2 ml av en metylenklor-idoppløsning inneholdende 0,5 g (1,1 mmol) 2-[2-0-(4,4'-dimet-oksytrityloksy)etylsulfonyl]etanol [Tetrahedron Lett., 27, 4705 (1986)] og 0,13 g (1,1 mmol) 4-(dimetylamino)pyridin til-

satt til oppløsningen. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Utfellinger ble frafiltrert.Reaksjonsblandingen ble så konsentrert til 50 ml ved inndamping under redusert trykk. 500 ml kald dietyleter ble så tilsatt til den konsentrerte oppløsning, og de erholdte utfellinger ble samlet opp og tørket ved inndamping under redusert

trykk. De resulterende utfellinger ble oppløst i metylenklorid og renset ved kolonnekromatografi gjennom 200 g silikagel (70-230 mesh) under anvendelse av en blanding av metanol og metylenklorid i volumforholdet 2:8 som elueringsmiddel, hvorved man fikk 2,77 g (utbytte 72%) av tittelforbindelsen.

<*>H kjernemagnetisk resonansspektrum (CDC£3, 270 MHz,

TMS), 6 ppm:

7,09-7,43 (multiplett),

6,81-6,88 (multiplett),

4,58-4,64 (multiplett),

3,65 (singlett),

3,50-3,53 (multiplett),

3,46-3,49 (multiplett),

3,31-3,34 (multiplett).

Fremstilling 8

En forbindelse med formel 8( p):

0,7 g (0,2 mmol) av forbindelsen fra fremstilling 7 ble oppløst i 6 ml metylenklorid, og 2 ml dimetylformamidopp-løsning inneholdende 63 mg (0,24 mmol) pentaklorfenol og 64 mg (0,3 mmol) 1,3-disykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til opp-løsningen under isavkjøling. Den resulterende oppløsning ble så omrørt ved romtemperatur i 7 dager. Ved slutten av dette tidsrom ble utfellinger filtrert fra reaksjonsblandingen, og filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon

under redusert trykk. Den resulterende rest ble oppløst i 10 ml metylenklorid. 100 ml dietyleter ble tilsatt til oppløs-ningen under isavkjøling, og de resulterende utfellinger ble frafiltrert. Filtratet ble befridd for oppløsningsmidlet ved destillasjon under redusert trykk. Filtratet, 37 mg (0,3 mmol) 4-(dimetylamino)pyridin og 0,25 g av en p-alkoksybenzylalkoholharpiks (med 0,9 mmol aminogrupper pr. 1 g av silikagel-overflaten, produsert av Kokusan Kagaku Co. Ltd.) ble tilsatt til 6 ml dimetylformamid. Den resulterende blanding ble satt ved romtemperatur i 24 timer. Den ønskede bærer, nemlig en substituert p-alkoksybenzylalkoholharpiks, ble samlet opp, vasket med pyridin, med metylenklorid og med dietyleter i den rekkefølge, og tørket ved inndamping under redusert trykk. 10 ml hver av "cap A"- og "cap B"-oppløsningene (Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til bæreren, og blandingen fikk stå i 15 minutter. Blandingen ble så vasket med metylenklorid, med metanol og med dietyleter i den rekkefølge, og ble tørket ved inndamping under redusert trykk, hvorved man fikk tittelforbindelsen.

Mengden av forbindelsen fra fremstilling 1 innført i tittelforbindelsen, ble bestemt i henhold til den følgende metode. En avblokkeringsoppløsning (en 3 volum% oppløsning av dikloreddiksyre i metylenklorid, Nippon Millipore Limited) ble tilsatt til 6,7 mg av tittelforbindelsen, og blandingen ble ristet i 3 minutter, hvoretter tilstrekkelig metylenklorid ble tilsatt til å gi en totalmengde på 20 ml. 0,4 ml av oppløs-ningsmidlet ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk, og så ble 20 ml av en oppløsning av perklorsyre i etanol i volumforholdet 3:2 tilsatt til resten, og absorbansen til dimetoksytritylkationet ved 500 nm ble målt (e = 71.700).

Den innførte mengde av dimetoksytrityl grupper, ble funnet å være 16 umol/g.

Preparateksempel 1

Injeksjonspreparat

Et injeksjonspreparat ble fremstilt ved å røre ut 1,5 vekt% av forbindelsen fra eksempel 25 i 10 volum% propyl-englykol, tilsette tilstrekkelig vann for injeksjoner til å gi det påkrevde sluttvolum og sterilisering.

Preparateksempel 2

Tablettpreparat

Tabletter som hver inneholdt 100 mg av bestanddelene, ble fremstilt ved å tilsette en oppmalt blanding av de ovenfor nevnte gjenstander nr. 1-4 til en forgranulert blanding av gjenstander nr. 5-8, og så presse den ovenfor fremstilte blanding på en egnet tabletteringsmaskin.

Preparateksempel 3

Kapselpre<p>arat

Ifølge vanlige midler ble kapsler som omfatter 200 mg av de ovenfor nevnte bestanddeler, fremstilt ved å pulverisere en blanding av bestanddelene i et egnet blandeapparat, sende blandingen gjennom en sikt og til sist blande godt;*

Preparateksempel 4

Hardkapselpreparat

Enhetskapsler ble fremstilt ved å blande 100 mg av pulverforbindelsen fra eksempel 25, 150 mg laktose, 50 mg cellulose og 6 mg magnesiumstearat, fylle den ovenfor nevnte blanding i standard 2-stykkers hardgelatinkapsler, vaske og til sist tørke.

Preparateksempel 5

Mykkapselpreparat

Myke kapsler omfattende 100 mg av den aktive bestand-del, ble fremstilt ved å blande forbindelsen fra eksempel 25 i en fordøyelig olje (slik som soyabønneolje, bomullsfrøolje eller olivenolje), fylle denne blandingen i egnede gelatin-kapsler ved hjelp av en motorpumpe, vaske og til sist tørke.

Preparateksempel 6

Tablettpreparat

Tabletter ble fremstilt i henhold til vanlige måter ved å granulere en blanding av 100 mg av forbindelsen fra eksempel 25, 0,2 mg kolloidalt silisiumdioksid, 5 mg magnesiumstearat, 275 mg finkrystallinsk cellulose, 11 mg stivelse og 98,8 mg laktose.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert vedat den har den generelle formel (1):

hvor: RlfR2og R3uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av hydrogenatomer, alkylgrupper med 1-4 karbonatomer, arylgrupper som definert nedenunder, og antrakinonylgrupper som er usubstituerte eller er substituert med minst én substituent som fortrinnsvis er valgt fra gruppen bestående av substituentene 1 definert nedenunder, Z er et karbonatom eller et silisiumatom<*>,* eller R2og R3og Z er til sammen en fluorenyl- eller xantenylgruppe, R4er et hydrogenatom, en usubstituert alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, en substituert alkylgruppe med 1-4 karbonatomer og som er substituert med minst én substituent fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av substituentene 2 definert nedenunder, en arylgruppe som definert nedenunder, eller en aralkylgruppe som definert nedenunder, Ylr Y3og Y4er uavhengig valgt fra gruppen bestående av oksygenatomer, svovelatomer og grupper med formel >NH, Y2er et oksygenatom, et svovelatom, en gruppe med formel >NH, en alkylengruppe med 1-4 karbonatomer eller en fenylengruppe, X er en usubstituert alkylengruppe med 1-10 karbonatomer eller en alkylengruppe med 1-10 karbonatomer og som er substituert med minst én hydroksygruppe, m og n er hver uavhengig av hverandre 0 eller et helt tall fra 1 til 10, og B er et oligodeoksyribonukleotid med en kjedelengde på 3-9, hvor arylgruppen er en aromatisk, karbosyklisk gruppe med 6-20 ringkarbonatomer og som er usubstituert eller er substituert med minst én substituent valgt fra gruppen bestående av substituentene 1 definert nedenunder, hvor aralkylgruppen er en alkylgruppe med 1-4 karbonatomer og som er substituert med minst én arylgruppe som definert ovenfor, idet substituentene 1 er valgt fra gruppen bestående av alkylgrupper med 1-4 karbonatomer, halogenalkylgrupper med 1-4 karbonatomer, halogenatomer, nitrogrupper, cyangrupper, aminogrupper, alkoksygrupper med 1-4 karbonatomer, alkyltiogrupper med 1-4 karbonatomer, arylgrupper som definert ovenfor, aryloksygrupper hvor aryIdelen er som definert ovenfor, og aralkyloksygrupper hvor aralkyldelen er som definert ovenfor, forutsatt at, når substituenten 1 er en arylgruppe eller en gruppe inneholdende en arylgruppe, som er substituert med en ytterligere arylgruppe, eller gruppe som inneholder en arylgruppe, er den ytterligere gruppen ikke i seg selv substituert med en arylgruppe eller en gruppe som inneholder en arylgruppe; og idet substituentene 2 er valgt fra gruppen bestående av aminogrupper, alkoksygrupper med 1-4 karbonatomer og halo-gena tomer, eller et salt derav, forutsatt at når Z er et karbonatom, m = 0, Y1er oksygen og R1#R2og R3er en usubstituert eller substituert fenylgruppe, er B ikke valgt fra gruppen bestående av„ CGTCACACAATA, ACGCTCAATT, AATTCACCGTG, GCTGTTGACT, ATTTTACCTCT, GGCGGTGATA, ATGAGCAC, AATTGTGC, TCATTATCA, CCGCCAGAG, GTAAAATAGTCA og ACACGCACGGTG.

2. Forbindelser ifølge krav 1,karakterisert vedat oligodeoksyribonukleotid B har en kjedelengde på 4-8.

3. Forbindelser ifølge krav 2,karakterisert vedat oligodeoksyribonukleotid B har en kjedelengde på 5 eller 6.

4. Forbindelser ifølge krav 2,karakterisert vedat det fjerde deoksyribo-nukleotid fra 5'-enden til B er guanindeoksyribonukleotid.

5. Forbindelser ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er valgt fra gruppen bestående av en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy]benzyloksy-, tert-butyldifenylsilyloksy-, fenylfluorenyloksy- og fenylxantenyloksygruppe, gruppen med formel [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]mH er valgt fra gruppen bestående av et hydrogenatom og en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl-, -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforyl-, fenylfosforyl-, 4-klorfenylfosforyl-, 2-nitrofenylfosforyl-, 4-nitrofenylfosforyl-, etylfosforyl- og -O-etyltiofosforylgruppe, og B er valgt fra gruppen bestående av TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, GGGCGGGGC, TAGGAGG, TGGGAGGT, TGGGCGCAG, CCG, TCGGAGG, TGmCGAGG, CTGGGAGG, TGG, TGGGAmGG, TGGGAGA, AATGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG, CGGGT, TGGGC og TGGGT.

6. Forbindelser ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er valgt fra gruppen bestående av en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3, 5-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy]benzyloksy-, tert-butyldifenylsilyloksy-, fenylfluorenyloksy- og fenylxantenyloksygruppe, gruppen med formel [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]mH er valgt fra gruppen bestående av et hydrogenatom og en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl-, -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforyl-, fenylfosforyl-, 4-klorfenylfosforyl-, 2-nitrofenylfosforyl-, 4-nitrofenylfosforyl-, etylfosforyl- og -O-etyltiofosforylgruppe, og B er valgt fra gruppen bestående av TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG og CGCGG.

7. Forbindelser ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er valgt fra gruppen bestående av en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy-, 3,5-bis[3,5-(dibenzyloksy)benzyloksy]benzyloksy-, tert-butyldifenylsilyloksy-, fenylfluorenyloksy- og fenylxantenyloksygruppe, gruppen med formel [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]1IiH er valgt fra gruppen bestående av et hydrogenatom og en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl- og -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforylgruppe, og B er valgt fra gruppen bestående av TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG og CGCGG<*>.

8. Forbindelser ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er valgt fra gruppen bestående av en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy- og 3,5-(dibenzyloksy)-benzyloksygruppe, gruppen med formel [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]nH er valgt fra gruppen bestående av et hydrogenatom og en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfosfonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfos-foryl-, -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforyl-, fenylfosforyl-, 4-klorfenylfosforyl-, 2-nitrofenylfosforyl-, 4-nitrofenylfosforyl-, etylfosforyl- og -O-etyltiofosforylgruppe, og B er valgt fra gruppen bestående av TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG og CGCGG.

9. Forbindelser ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel RjR^Z-Y! er valgt fra gruppen bestående av en trifenylmetyloksy-, 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksy- og 3,5-(dibenzyloksy)-benzyloksygruppe, gruppen med formel [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]BH er valgt fra gruppen bestående av et hydrogenatom og en metylfosforyl-, 2-klorfenylfosforyl-, -O-metyltiofosforyl-, metylfos fonyl-, metyltiofosfonyl-, fenylfosfonyl-, 2-hydroksyetylfosforyl- og -0-(2-hydroksyetyl)tiofosforylgruppe, og B er valgt fra gruppen bestående av TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG og CGCGG.

10. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er TGGGAG.

11. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et svovelatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er TGGGAG.

12. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, m er 0, n er 0, og B er TGGGAG.

13. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R^RaZ-Yi er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, R4er en metylgruppe, m er 1, n er 0, og B er TGGGAG.

14. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er TGGGAG.

15. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et svovelatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er TGGGAG.

16. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel RiR^Z-Yi er en trifenylmetyloksygruppe, m er 0, n er 0, og B er TGGGAG.

17. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, R4er en metylgruppe, m er 1, n er 0, og B er TGGGAG.

18. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R^RaZ-Y! er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er CGGGG.

19. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R^RaZ-Y! er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et svovelatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er CGGGG.

20. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel RiR2R3Z~Yier en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, m er 0, n er 0, og B er CGGGG.

21. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, R4er en metylgruppe, m er 1, n er 0, og B er CGGGG.

22. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er CGGGG.

23. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et svovelatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er CGGGG.

24. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel RiR2R3Z-Yi er en trifenylmetyloksygruppe, m er 0, n er 0, og B er CGGGG.

25. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, R4er en metylgruppe, m er 1, n er 0, og B er CGGGG.

26. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er CGCGG.

27. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel RiR2R3Z-Yi er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et svovelatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er CGCGG.

28. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel RjR^Z-Yi er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, m er 0, n er 0, og B er CGCGG.

29. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en 3,4-(dibenzyloksy)benzyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, R4er en metylgruppe, m er 1, n er 0, og B er CGCGG.

30. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er CGCGG.

31. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et svovelatom, Y3er et oksygenatom, Y4er et oksygenatom, R4er et hydrogenatom, X er en etylengruppe, m er 1, n er 1, og B er CGCGG.

32. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, m er 0, n er 0, og B er CGCGG.

33. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen med formel R1R2R3Z-Y1er en trifenylmetyloksygruppe, Y2er et oksygenatom, Y3er et oksygenatom, R4er en metylgruppe, m er 1, n er 0, og B er CGCGG.

34. Preparat for behandling eller profylakse av virusinfeksjoner, karakterisert vedat det omfatter en effektiv mengde av minst én forbindelse som definert i krav 1.

35. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling av et preparat for behandling eller profylakse av en virusinfeksjon hos et pattedyr som kan være et menneske.

36. Forbindelse, karakterisert vedat den har de følgende generelle formler (12), (14), (22), (24), (25) eller (27):

hvor:R<1>, R2 ogR<3>kan være like eller forskjellige fra hverandre, og hver uavhengig er et hydrogenatom eller en alkoksygruppe med 1-4 karbonatomer,R<4>,R<5>ogR<6>kan være like eller forskjellige og er hver uavhengig av hverandre et hydrogenatom, en alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, en eventuelt substituert arylgruppe eller en eventuelt substituert antrakinonylgruppe, Z er et karbon- eller silisiumatom,R<5>,R<6>og Z kan sammen være en fluoreny-1 gruppe eller en xantenylgruppe, ellerR<4>,R<5>,R<6>og Z kan til sammen være et hydrogenatom, R<7>er et hydrogenatom, en eventuelt substituert alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, en eventuelt substituert arylgruppe eller en eventuelt substituert aralkylgruppe, R<8>er en metylgruppe, en cyanetylgruppe eller en fenylgruppe som eventuelt er substituert med en klorgruppe,R<8a>er en metylgruppe eller en cyanetylgruppe,R<8b>er en fenylgruppe som eventuelt er substituert med en klorgruppe,R<9a>er et hydrogenatom eller en hydrogengruppe med en beskyttelsesgruppe, A er en gruppe -(CH2)h- (hvor h er et helt tall fra 1 til 16), en gruppe -(CH2)hO- (hvor h er et helt tall fra 1 til 16), en gruppe -(CH2).,-0-CO-(CH2)k- (hvor j er et positivt helt tall, k er 0 eller et positivt helt tall, og j + k er 2-16) eller en gruppe -(CH2)j-NH-CO-(CH2)k- (hvor j er et positivt helt tall, k er 0 eller et positivt helt tall, og j + k er 2-16), en gruppe -(CH2)j-S-CO-(CH2)k- (hvor j er et positivt helt tall, k er 0 eller et positivt helt tall, og j + k er 2-16) eller en gruppe -(CH2)n-0-CO-CH2(OCH2CH2)p-OCH2- (hvor n er et positivt helt tall, p er 0 eller et positivt helt tall, og j + k er 2-100), B, B' og B" er hver baseresten i adeninnukleotid, guaninnukleotid, tymidinnukleotid eller cytosinnukleotid beskyttet i basen og fosfatrestene, P er et polymermateriale, X er et halogenatom, XI er en gruppe -S-, -SO- eller -S02, X<2>er et oksygenatom, et svovelatom eller en NH-gruppe, X<3>er et oksygen- eller svovelatom, Y<1>er en hydroksylgruppe, en eventuelt substituert fenyloksygruppe eller en etyloksygruppe som kan være substituert med et halogenatom, Y<2>er et oksygenatom, et svovelatom eller en NH-gruppe, Y<3>er et oksygenatom, et svovelatom, en NH-gruppe, en alkylengruppe med 1-4 karbonatomer eller en fenylengruppe, forutsatt at for forbindelser med den generelle formel (12) eller (14), når A er er en gruppe med formel -(CH2).,-0-C0-(CH2)k-, er j forskjellig fra 2.