NO300852B1 - Xanthan-baserte polysakkaridpolymerer fremgangsmåte til deres fremstilling, og mutant Xanthomonas - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår polysakkaridpolymerer, fremstilling av disse og mutant Xanthomonas. I særdeleshet angår den xantan-baserte polysakkaridpolymerer, definert her som polymerer som strukturelt ligner på xantan-gummi og er produsert av bestanddeler fra xantanbiosyntesen, innbefattet de xantan-baserte polymerer som er modifisert slik at den ytre mannose kan være spesifikt acetylert men ikke pyruvylert, pyruvylert men ikke acetylert eller umodifisert mens den indre mannose kan være uavhengig regulert slik at den er acetylert eller umodifisert.

Xantan-gummi blir produsert av bakterier av slekten Xanthomonas, i særdeleshet av mikroorganismer av arten X.campestris. Xantan-gummi er et produkt som i stor utstrekning blir brukt på grunn av dens usedvanlige fysiske egenskaper, dvs. dens ekstremt høye spesifikke viskositet og dens pseudo-plastisitet. Den er vanlig brukt i matvarer som et fortykningsmiddel og ved sekundær eller tertiær oljeutvinning som et mobilitetskontroll- og profilmodi-fiseringsmiddel, såvel som i petroleumsborefluider.

Kjemisk er xantan-gummi et anionisk heteropolysakkarid. Den gjentatte enhet av polymeren er en pentamer bestående av fem sukkerdeler, nærmere bestemt to glukose-, en glukuronsyre- og to mannosedeler. Disse sukkerrester er arrangert på en slik måte at glukosedelene danner ryggraden i polymerkjeden, med sidekjeder av mannose/glukuronsyre/mannoserestene generelt stikkende ut fra annen hver glukosedel. Vanligvis er denne grunnleggende struktur spesifikt acetylert og pyruvylert, som beskrevet av f.eks. P.E. Janson,

L. Kenne og B. Lindberg, i Carbohydrate Research, 45:275-282 (1975) og L.D. Melton, L. Minot, D.A. Rees og G.R. Sanderson i Carbohydrate Research 4^:245-257 (1976), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Graden av acetylering og pyruvylering er kjent å variere. Strukturen av xantan-gummi er vist ved formel I under:

På tross av den vide anvendelighet av naturlig forekommende xantan-gummi er der enkelte situasjoner hvor dens fysiske egenskaper blir begrensende. Spesielt er det ved sekundær eller tertiær oljeutvinning ikke uvanlig at temperaturen i det oljeførende reservoar og saltkonsentrasjonene i reservoar-saltlaken er høyere enn det som er optimalt for xantan-oppløsninger. Når slike forhold forekommer, kan xantan felles ut, flokkulere og/eller tape sin viskositet. Det vil derfor være ønskelig med nye viskositetsmodifiserende produkter som virker bra ved forskjellige forhold som kan oppstå under oljeutvinning, f.eks. høye temperaturer og høye saltkonsentrasjoner.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver en familie av xantan-baserte polysakkarider med forbedrede egenskaper i forhold til naturlig forekommende xantan-gummi. Modifikasjoner av xantan-gummi er tidligere beskrevet. For eksempel beskriver Bradshaw et al. (Carbohydrate Polymers, 3:23-38 (1983)) metoder til fremstilling av kjemisk modifisert xantan-gummi som er deacetylert eller depyruvylert. Forskjellige måter til kjemisk deacetylering av xantan-gummi produsert av Xanthomonas campestris er også beskrevet i US patentskriftene 3 000 790 og 3 054 689. Til dags dato har den eneste utbredte metode som har vært benyttet til disse deacetyleringsprosesser, vært kjemisk fjerning av acetatdelene fra normalt acetylert xantan-gummi. Det er funnet at kjemiske prosesser til deacetylering av xantan-gummi gir en rekke uønskede bivirkninger og kan forårsake hydrolyse av glykosidryggraden, noe som fører til en irreversibel forandring av molekylets konformasjon og nedsatt molekyl-vekt.

Xantan-gummi kan også depyruvyleres kjemisk som beskrevet av Holzwarth og Ogletree i Carbo. Res. 76:277-280 (1979). Denne kjemiske metode til depyruvylering kan også endre xantanpolymerenheten og/eller forårsake hydrolyse av glykosidryggraden. Selv om der i US patentskrift 4 296 203 er beskrevet en stamme av X. campestris som produserer ikke-pyruvylert xantan-gummi, ble denne ikke-pyruvylerte gummi enten fullt acetylert eller deacetylert ved anvendelse av kjemiske midler.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe en familie av polysakkarid-xantan-polymerer hvor den indre mannose er acetylert eller umodifisert mens den ytre mannose er acetylert, pyruvylert eller umodifisert.

Det er også et formål med den foreliggende oppfinnelse å skaffe en in-vitro-metode til oppnåelse av disse produkter og mikroorganismer som har evnen til å produsere medlemmer av denne familie av polysakkaridpolymerer in vivo. Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å skaffe fremgangsmåter til fremstilling av medlemmer av denne familie av polysakkarider ved aeorob fermentering av mikroorganismer som har evnen til å produsere de forskjellige polysakkaridpolymerer.

Andre formål med og fordeler ved oppfinnelsen vil dels bli angitt i den etterfølgende beskrivelse, dels være selvfølgelige fra beskrivelsen eller kunne læres ved praktisering av oppfinnelsen. Formålene og fordelene kan realiseres og oppnås ved hjelp av de trekk og kombinasjoner som er spesielt påpekt i kravene.

For oppnåelse av formålene og i samsvar med hensiktene med oppfinnelsen, slik den er generelt beskrevet i fremstillingen, er der skaffet en sammensetning bestående av en polysakkaridpolymer som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:2:1, og hvor D-glukosedelene er bundet i en beta-[l,4]-konfigurasjon, de indre D-mannosedeler er bundet i en alfa-[l,3]-konfigurasjon, generelt til annenhver glukosedel, D-glukuronatdelene er bundet i en beta-[l,2]konfigurasjon til de indre mannosedeler og de ytre mannosedeler er bundet til D-glukuronatdelene i en beta-[l,4]-konfigurasjon.

For ytterligere oppnåelse av formålene og i samsvar med hensikten med den foreliggende oppfinnelse, er der skaffet en sammensetning omfattende xantan-gummi hvori de indre mannosedeler er acetylert i 6-0-stillingen. I en annen struktur som man kan tenke seg er både de indre og ytre mannosedeler acetylert. En ytterligere struktur er skaffet som har en porsjon av de ytre mannosedeler pyruvylert ved 4-6-posisjonen og en porsjon acetylert. En annen struktur er skaffet hvor de ytre mannosedeler er pyruvylert ved 4-6-posisjonen og de indre mannosedeler acetylert ved 6-0-posisjonen. To ytterligere strukturer er skaffet, den ene har de ytre mannosedeler pyruvylert ved 4-6-posisjonen og den andre har de mannosedeler acetylert.

Ifølge oppfinnelsen er der også påtenkt prosesser til fremstilling av de polysakkaridpolymerer som er beskrevet ovenfor. Polysakkaridpolymerene ifølge oppfinnelsen kan generelt fremstilles ved genetiske manipuleringer av de mikrobielle biosyntetiske reaksjonsveier som fører til produksjon av polysakkarider. Nærmere bestemt kan mikrobielle synteseveier til fremstilling av xantan-gummi manipuleres for å lage et in vivo- eller in vitro-system til fremstilling av en endret polymerenhet. På denne måte kan man lage systemer ved bruk av regulerbare Acetylase-I-, Acetylase-II- og Ketalase-gener, i særdeleshet for å lage polysakkarider som er acetylert eller pyruvylert i varierende grad.

De til fremstillingen hørende tegninger illustrerer forskjellige utførelsesformer for oppfinnelsen og tjener sammen med beskrivelsen til å forklare prinsippene ved oppfinnelsen. Fig. la viser BamHI-restriksjonskartet av et 16 kb område av kromosomet av X. campestris som inneholder en klynge på 12 gener som kreves for biosyntese av xantan og viser også de omtrentlige plasseringer av disse tolv gener i forhold til BamHI-restriksjonskartet. Fig. lb viser noen restriksjonsseter i og omkring genene F og G og DNA-sekvensen ved sammenføyningspunktet for genene F og G. Fig. 2 viser konstruksjonen av en slettingsmutasjon (deletion mutation)

(delCla) inne i gen F i gummigenklyngen.

Fig. 3a viser strukturen av plasmid pl3delCla avledet fra pRK290-H336 ved in vivo-innsetting av transposon TnK12 i vektorpartiet av pRK290-H336 i den omtrentlige plassering vist på figuren og den etterfølgende sletting som vist på fig. 2 av Clal DNA-fragmentet med 660 basepar inne i gen F. Fig. 3b viser strukturen av plasmid pH336KBmldelCla som har en lignende struktur som pl3delCla, inneholdende den samme 660 basepar-sletting inne i gen F. Dette plasmid inneholder en innskuddsmutasjon (KBml) ved BamHI-setet inne i gen G. Det DNA-fragment som er innsatt der er et BamHI-restriksjonsfragment som bærer kanamycinresistens-genet av plasmid pUC4-K. Fig. 4 viser den kjemiske struktur og en kjemisk representasjon av den repeterende enhet av polytetramervarianten av xantan-gummi. Fig. 5a viser strukturen av plasmid pHA3KBm2delCla som fås fra pRK290-HA3 som er identisk med pRK290-H336 bortsett fra at det ikke inneholder BamHI-fragmentene på 1,4 kb og 1,5 kb, av X-campestris-gummi biosyntetisk operon DNA og derfor mangler gener B og C, men inneholder gener D til og med M. pHA3KBm2delCla inneholder den gen-F-slettingsmutasjon som er vist på fig. 2 og en innskuddsmutasjon i BamHI-setet av gen I. Det innskutte DNA er igjen et BamHI-restriksjonsfragment av pCU4-K som bærer et gen som gir kanamycinresistens. Fig. 5b viser graden av en kromosomal slettingsmutasjon som foreligger i X. campestris-stamme XI106 med gener D til og med M slettet, mens B og C er intakte og funksjonelle i kromosomet. Fig. 6 viser skjematiske representasjoner av strukturene av repeterende enheter av de polysakkarider som fremstilles ved vill-type X. campestris og mutanter som er defekte i gener F, G eller L og alle mulige kombinasjoner av mutasjoner i gener F, G og L. De forkortelser som er brukt er: G = glukose; M = mannose; GA = glukuronsyre; Ac = acetat; Pyr = pyruvat.

Det vil nå i detalj bli henvist til de for tiden foretrukne utførelsesformer for den foreliggende oppfinnelse som sammen med de følgende eksempler tjener til å beskrive oppfinnelsens prinsipper.

Polysakkaridpolymerene ifølge oppfinnelsen er blitt beskrevet i detalj ovenfor. Disse polysakkaridpolymerer kan fremstilles in vitro med et celle-fritt enzymsystem, eller de kan fremstilles in vivo ved dyrking av celler av en passende mutantstamme. Andre måter å fremstille polysakkaridpolymerene på er også beskrevet nedenfor.

In vitro polysakkaridsyntese

Den grunnleggende metode som angår bruken av et celle-fritt system for fremstilling av ikke-variant xantan-gummi, er beskrevet av L. Ielpi,

R.O. Couso og M.A Dankert i FEBS Letters 130: 253-256 (1981), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Det er funnet at en modifisert versjon av denne metode kan benyttes til å lage variantpoly-sakkaridene ifølge oppfinnelsen.

For denne nye, modifiserte metode blir det in vitro celle-frie system generelt fremstilt ved lyse av celler av en mikroorganisme av slekten Xanthomonas, fortrinnsvis Xanthomonas campestris, i nærvær av en egnet buffer, fortrinnsvis innbefattet EDTA, og oppnåelse av de passende biosyntetiske enzymer som deretter er istand til å bearbeide eksogent tilsatte substrater. Denne generelle metode for dette in vitro-system er beskrevet i US-PS 4 713 449. Andre metoder for lyse som kan benyttes, omfatter, men er ikke begrenset til, lydbehandling, "French Pressure cell", detergentbehandling, enzymbehandling og kombinasjoner av disse.

For fremstilling av variant-polysakkaridene ifølge den foreliggende oppfinnelse, blir vanligvis et lysat av en mikroorganisme inneholdende de enzymer som er nødvendige for å sette sammen de ønskede polysakkarider, inkubert med de passende substrater, som, avhengig av den ønskede gummi, kan inkludere UDP-glukose, GDP-mannose, UDP-glukuronsyre, acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat. Valg av substrater er avhengig av det polysakkarid som ønskes produsert. For eksempel fås et ikke-acetylert polysakkarid ved eliminering av acetyl-CoA som substrat. Tilsvarende kan man danne en ikke-pyruvylert gummi ved å eliminere fosfoenolpyruvat som substrat. Kjemisk og/eller enzymatisk behandling av cellelysatene for å utarme endogene substrater vil være åpenbart for en fagmann.

I tillegg kan celle-frie systemer lages fra mutant-organismer som mangler en eller flere av enzymene fra den xantan-biosyntetiske vei. Slike mutant-avledede cellelysater vil produsere de variant-gummier som er beskrevet her, enten utelukkende på grunn av mutasjonen eller på grunn av mutasjonen i forbindelse med tilbakeholdt substrat.

Den biosyntetiske prosess kan i en utførelsesform overvåkes ved innlemmelse av radioaktivt merkede substrater i de polymere enheter. Andre metoder som er kjent for fagfolk kan også benyttes for å tillate identifikasjon av de biosyntetiske mellomprodukter. Spesielt er der utviklet kromatografiske metoder til å skille og identifisere oligosakkarid-mellomproduktene. Disse innbefatter tynnskiktkromatografi og høyytelse-væskekromatografi.

Den celle-frie biosyntese av xantan er funnet å være en tidsavhengig, trinns-vis prosess som er avhengig av tilsetning av alle de tre spesifikke nukleotider. Bakgrunnen av ikke-spesifikk innlemmelse av merket substrat er minimal og vil ikke forstyrre måling av den xantan-spesifikke polymer i gummi-fraksjonen.

At lipidbærere, nærmere bestemt isoprenoid pyrofosfat, er involvert, er vist i flere polysakkarid-biosyntetiske veier. Dessuten er medvirkning av pyrofos-foryl-bundne lipidbærere i xantan-biosyntesen påvist. Det er således funnet at de xantan-biosyntetiske mellomprodukter kan utvinnes fra den organisk-oppløselige fraksjon med disse bærerlipider. De utvunnede oligosakkarider kan deretter befris fra bærerlipidene ved mild syrehydrolyse, f.eks. ved en pH-verdi på 2 i 20 min ved 90°C og defosforyleres med alkalisk fosfatase for analyse.

Ved bruk av disse metoder for utvinning av mellomprodukter er det oppdaget at visse lysater av X. campestris-mutanter ved in vitro-betingelser vil produsere ikke-acetylert eller ikke-pyruvylert xantan-gummi selv i nærvær av alle substrater som er nødvendige for ikke-variantgummisyntese. I lys av læren i den foreliggende beskrivelse vil disse metoder gjøre en fagmann i stand til å identifisere cellelysater som produserer andre endrede polysakkarider.

In vivo polysakkaridsyntese

Utviklingen av den celle-frie synteseprosess for polysakkaridene som er beskrevet ovenfor, viste at forskjellige Xanthomonas campestris-celler har alle de enzymer som er nødvendige for syntetisering av xantan-baserte polymerer som har mannoserestene acetylert, pyruvylert eller umodifisert.

Videre, for at hele celler skal syntetisere ikke-acetylert xantan-gummi, behøves en måte til å blokkere acetyleringen av enten den indre eller ytre mannose under xantan-gummisyntesen. I tillegg trengs en metode til blokke-ring av xantan-gummisyntese i både acetylerings- og pyruvyleringstrinnene for at hele celler skal kunne syntetisere ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan-gummi. Ved en utførelsesform for oppfinnelsen ble mutagenese benyttet for å endre noen av de gener som er ansvarlige for disse reaksjoner.

Transposoner, herunder, men ikke begrenset til TnlO, TnK12 (Tnl0dell6dell7KanR) og Tn903, kan brukes for å mutere Xanthomonas campestris. I én utførelsesform gir disse transposoner resistens mot henholdsvis tetracyklin og kanamycin. Transposoner har evnen til å sette seg selv inn i gener hvor de foråraker mutasjoner ved å avbryte den kodede sekvens. Transposonene kan settes inn i Xanthomonas campestris på forskjellige vektorer, herunder på såkalte selvmordsvektorer, som pRK2013. Som beskrevet av G. Ditta, D. Corbin og D.R. Helinski i Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:7347-7351 (1980), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, har vektor pRK2013 evnen til å overføre seg selv inn i ikke-enteriske bakterier såsom Xanthomonas campestris, men den er ikke i stand til å replikere seg i denne vert. Hvis selvmordsvektoren blir introdusert i en populasjon av Xanthomonas campestris-celler og denne populasjon deretter blir utsatt for enten tetracyklin eller kanamycin, vil derfor de indivi-der som overlever, være de hvor én av transposonene er satt inn i genomet til Xanthomonas campestris. Overlevende fra en slik eksponering kan underkas-tes utsortering av slike som har mistet evnen til ,å lage xantan-gummi. Slike mutanter kan synes å være mindre mukoide enn vill-type Xanthomonas campestris.

I andre utførelsesformer for oppfinnelsen kan andre måter for mutagenese bli benyttet til å lage mutanter som ikke acetylerer og/eller pyruvylerer de gummier de produserer. Slike metoder vil en fagmann lett komme på, og de inkluderer stråling, rekombinant-DNA-teknologi (spesielt som beskrevet i US patentsøknad nr. 333 868 av Capage et al., med tittelen "Recombinant-DNA Mediated Production of Xanthan Gum", som er innlevert 3. april 1989, og hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, og i eksempel 1 nedenfor) og kjemisk mutagenbehandling, men er ikke begrenset til disse metoder. Eksempler på slike mutageneseprosedyrer er beskrevet av J.H. Miller i Experiments in Molecular Genetics (1972); R.W. Davis,

D. Bostein og J.R. Roth i Advanced Bacterial Genetics (1980); og at

T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook i Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor.

Alternativt kan passende mutanter finnes ved at man bestemmer nærværet av det ønskede polysakkarid i kulturmediet fra hver mutant, f.eks. xantan-gummi som har den ytre mannose acetylert men ikke pyruvylert, pyruvylert men ikke acetylert, både pyruvylert og acetylert eller umodifisert, mens den indre mannose er aceylert eller umodifisert. Således kan der finnes mutanter som synes å være blokkert ved forskjellige posisjoner i xantan-gummi-syntese-veien. Mutanter av Xanthomonas campestris som produserer xantan-gummi som er acetylert ved den indre mannose og acetylert ved den ytre mannose (XI397), acetylert ved den indre mannose og pyruvylert ved den ytre mannose (XI398), acetylert ved den indre mannose og umodifisert ved den ytre mannose (X1399), umodifisert ved den indre mannose med en porsjon av de ytre mannoseenheter pyruvylert og en porsjon acetylert (X1400), umodifisert ved den indre mannose og acetylert ved den ytre mannose (X1401) og umodifisert ved den indre mannose og pyruvylert ved den ytre mannose (XI402) og umodifisert ved den indre mannose og umodifisert ved den ytre mannose (XI403), er alle deponert ved the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under deponeringsnr. henholdsvis 68033, 68034, 68035, 68036, 68037, 68038 og 68039.

Det ligger ikke utenfor oppfinnelsen omfang å ta i bruk enzyminhibitorer av Acetylase I, Acetylase II og Ketalase for å komme frem til de samme produkter. Ytterligere andre alternativer til fremstilling av denne familie av polysakkarider er påtenkt, herunder enzymatisk og kjemisk nedbrytning av naturlig xantan-gummi.

Mutantene kan dyrkes under forhold som er generelt kjent innen området for dyrking av vill-type Xanthomonas campestris. For eksempel kan de dyrkes på egnede assimilerbare karbonkilder såsom glukose, sakkarose, maltose, stiv-else, komplekse karbohydrater såsom melasse eller maissirup, forskjellige organiske syrer og lignende. Blandinger av karbonkilder kan også benyttes. Konsentrasjonen av den tilsatte karbonkilde er ofte mellom 10 og 60 g/l. Nødvendig for vekst er også en kilde til assimilerbart organisk eller uorganisk nitrogen, generelt på mellom 0,1 og 10,0 g/l, og mineraler, som lett kan velges av fagfolk. Eksempler på passende nitrogenkilder er ammoniumsalter, nitrat, urea, gjærekstrakt, pepton eller andre hydrolyserte proteinmaTCfraTC<p> ^ eller blandinger av disse. Eksempler på passende mineraler innbefatter fosfor, svovel, kalium, natrium, jern og magnesium. Disse blir ofte tilsatt sammen med et chelateringsmiddel såsom EDTA eller sitronsyre.

Optimale temperaturer for vekst av Xanthomonas campestris ligger generelt mellom 18°C og 35°C, fortrinnsvis mellom 27°C og 30°C. Xanthomonas campestris-celler dyrkes aerobt ved tilførsel av luft eller oksygen slik at et tilstrekkelig nivå av oppløst oksygen opprettholdes, f.eks. over ca. 10% metning. Fortrinnsvis holdes nivået over ca. 20%. pH-verdien blir holdt på 6,0-8,0, fortrinnsvis på 6,5-7,5.

Polysakkaridene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan utvinnes fra fermen-ter ved passende metoder. Utfelling med isopropanol, etanol eller en annen passende alkohol vil uten videre gi polysakkaridene ifølge oppfinnelsen. Generelt blir alkoholer tilsatt til en konsentrasjon på 50-75% på volumbasis, fortrinnsvis i nærvær av kaliumklorid, natriumklorid eller et annet salt. Alternativt kan polymerene utvinnes fra fermentet ved ultra-filtrering.

Mobilitetskontroll-oppløsninger til bruk ved økt (enhanced) oljeutvinning kan også fremstilles fra de variant-polysakkaridpolymerer som her er beskrevet. Oppløsninger av polysakkaridpolymerene i konsentrasjoner på 50-3000 ppm er passende for slike mobilitetskontroll-oppløsninger. Andre kjente tilsetningsstoffer kan også benyttes i kombinasjon med disse oppløsninger for å øke oljeutvinningen. Slike tilsetningsstoffer innbefatter f.eks. overflateaktive midler, alkaliske agenser eller metalliske eller organiske tverrbindingsmidler.

I likhet med xantan-gummi kan polysakkaridpolymerene også benyttes som fortykningsmidler i matvarer, kosmetiske produkter, medikamenter, papir-bindemidler, boreslam, trykksverte og lignende og som geleringsmiddel. I tillegg kan de benyttes til å redusere friksjonsmotstanden av en væskestrøm i rørledninger.

Eksempler

De følgende eksempler viser noen av de foretrukne utførelses former ifølge oppfinnelsen. Alle US patentsøknader og andre henvisninger angitt i disse eksempler er inntatt som en del av beskrivelsen.

Eksempel 1

Dette eksempel viser at der er to X. campestris-gener som koder for enzymer som katalyserer acetylering av xantan-gummi.

Capage et al., US patentsøknad nr. 333 868, beskrev nukleotidsekvensen av et 16 kb-segment av X. campestris-DNA som inneholder en genklynge som er nødvendig for biosyntese av xantan-gummi. Mutasjoner ble isolert som inaktiverte hver av de gener som er identifisert ved DNA-sekvensen. Fenotypene av mutantstammer som bærer disse mutasjoner ble bestemt. Mutasjoner i gen F (se fig. la) forårsaket ved transposon-innsetning, førte til produksjon av xantan-gummi som inneholdt intet påvisbart acetat. Innsetningsmutasjoner i gen G resulterte ikke i noen åpenbar defekt i xantan-gummi-biosyntese. Mutanter med gen G-defekter produserte høye nivåer av xantan-gummi, og denne gummi inneholdt alle de normale bestanddeler av xantan i tilnærmet normale molforhold. På grunnlag av disse opprinnelige resultater trakk man den konklusjon at gen F kodet for et enzym som katalyserte den kjente acetylering av den indre mannose av xantan, mens aktiviteten av gen G-proteinet forble ukjent.

Når DNA-sekvensen ble benyttet til å forutsi aminosyresekvensene av produktene av genene F og G (gpF og gpG), ble imidlertid disse proteiner funnet å ha utstrakt homologi med hverandre. Denne oppdagelse indikerte at funksjonene av gpF og gpG kunne være like. Fenotypene av mutanter defekte i gen G ble deretter undersøkt på nytt og blandingene av xantaner produsert av disse mutanter ble nøye kvantifisert. Disse data viste en liten (5-10%), men betydningsfull reduksjon i acetatinnholdet av gummi fremstilt ved G"mutanter sammenlignet med vill-type X. campestris. Følgelig ble ytterligere forsøk utført for å bestemme hvilken rolle gpG kunne ha i acetylering av xantan.

Den hypotese at gpG normalt styrer 10% av acetyleringen av xantan-gummi, var tilsynelatende i strid med den observasjon at transposon-innsetningsmutasjoner i gen F resulterte i eliminering av acetylering. Det var klart at disse mutante gummier ikke bibeholdt 10% av det normale acetatinnhold. Det var imidlertid mulig at innsetninger i gen F reduserte eller eliminerte ekspresjonen av gen G som et resultat av såkalte "polare" virkninger. Innsetninger av TnlO reduserer generelt ekspresjonen av gener som er anordnet på ned-strømsiden med hensyn til transkripsjon fra innsetningssetet, slik det er rapportert av N. Kleckner et al. i J. Mol. Bio. 9.7:561-575 (1975). Reduk-sjonen kan dessuten være ganske alvorlig i tilfeller hvor nedstrøms genet er

"koblet translasjonelt" til det gen som inneholder den innskuddsmutasjon som er rapportert av D.S. Oppenheim og C. Yanofsky i Genet. 9.5:785-795 (1980). Translasjonen kobling er et fenomen hvor det translasjonelle stoppsignal av et gen overlapper det translasjonelle startsignal av et tilstøtende gen på ned-strømsiden. I noen tilfeller hvor slik kobling finner sted er initiering av translasjon av nedstrømsgenet i hovedsak eller fullstendig avhengig av avslutning av translasjon av genet på oppstrømssiden som finner sted ved kobleren. Således kan innskudd i oppstrømkomponenten av de koblede gener dramatisk redusere eller til og med eliminere ekspresjon av nedstrømsgenet fordi disse innskudd ufravikelig bevirker rammeskift og for tidlig avslutning av translasjon av oppstrømgenet.

DNA-sekvensen av gummigen-klyngen viste at den translasjonelle stopp av gen F faktisk overlapper den translasjonelle start av gen G, dvs. de to er "koblet" (se fig. lb). Dessuten er ikke sekvensen for det translasjonelle initieringssignal for gen G spesielt sterkt, hvilket antyder at den translasjonelle kobling kan spille en betydelig rolle i gen G-ekspresjon. For å teste denne hypotese ble en slettingsmutasjon (som vist på fig. 2) konstruert inne i kodesekvensen for gen F. Denne sletting eliminerte 660 basepar mellom Clal-setene inne i gen F. Det slettede DNA faller helt og holdent innenfor kodingssekvensen av gen F og ikke noe fremmed DNA er innsatt. Således fjerner slettingen en stor porsjon (ca. 60%) av genet, men forandrer ikke leserammen, da antall basepar som slettes er fullstendig delelig med 3. Det mutante gpF som produseres ved denne slettingsmutasjon (gpFdel) mangler 220 aminosyrer ut av et samlet antall på 364, men den translasjonelle start av gen F og den translasjonelle stopp av gen F koblet til starten av gen G, forblir uendret. Eliminasjon av to tredjedeler av aminosyrerestene av gpF vil sann-synligvis, skjønt ikke med sikkerhet, føre til eliminasjon av all protein-aktivitet. Således er det sannsynlig at eventuell resterende acetylaseaktivitet fra denne mutant skyldes aktiviteten av gpG.

Denne CJal-slettingsmutasjon ble konstruert på plasmid pRK290-H336.13 (fig. 3a) som bærer en ellers vill-type gummigen-klynge og en innsetning av transposon Tnl0dell6dell7KanR beskrevet av Way et al. i Gene 32:369-379

(1984) og her kalt TnK12, anordnet inne i plasmidets vektorposisjon. TnK12-innskuddet skaffer passende medikamentresistenser for seleksjon av plasmid-overføring. Det slettede plasmid kalt pl3delCla ble overført inn i X. campestris Gum"slettingsstamme X1231, som mangler gener B-M, og polysakkarid fremstilt av den resulterende stamme X1231 (pl3delCla) ble analysert. Denne gummi inneholdt en lav, men betydningsfull mengde acetat, grovt regnet 10-15% av den mengde som normalt finnes i vill-type-xantan. Resulta-tet indikerte at både gpF og gpG er acetylaser og at størsteparten av acetyleringen av xantan katalyseres ved gpF, idet en mindre del av xantan-acetyleringen katalyseres ved gpG. Der forble imidlertid en mulighet for at acetylering på det lave nivå som observeres i mutanten X1231 (pl3delCla) var et resultat ikke fra aktiviteten av gpG, men fra en resterende aktivitet av gpFdel. For å undersøke denne mulighet, ble et dobbeltmutant-derivat av plasmid pRK290-H336 konstruert. Som vist på fig. 3b kombinerte denne doble mutant gen F CJal-slettingsmutasjonen og en innskuddsmutasjon (KBml) i gen G. Dobbeltmutant-plasmidet pH336KBmldelCla ble overført inn i stamme X1231 og det polysakkrid som ble produsert ble analysert. Dersom det lave nivå acetylering som ble observert i gummi produsert ved X1231 (pl3delCla) er et resultat av aktiviteten av gpG, skulle dobbelt-mutanten X1231 (pH336KBmldelCla) eliminere gpG-aktivitet på grunn av innskuddsmutasjonen i gen G og ingen acetylering skulle observeres. Dersom imidlertid den virkelige kilde til acetyleringsaktivitet i X1231(pl3delCla) er mutanten gpFdel, skulle tilføyelsen av gen G-innsetting ikke virke inn på acetylering og det samme 10% nivå som ble observert i X1231(pl3delCla) skulle kunne ses i gummi fremstilt av dobbeltmutant-stammen. Det polysakkarid som ble fremstilt ved stamme X1231(pH336KBmldelCla) ble funnet å ikke inneholde noe acetat. Dette beviste at gpG katalyserer acetylering av xantan og at i vill-type-stammer er gpG ansvarlig for ca. 10% av den samlede acetylering som observeres.

Eksempel 2

Dette eksempel viser at målresten for acetylering ved gpG (men ikke gpF) er den ytre mannose av den xantan-repeterende enhet og at denne acetylering fremmes når pyruvylering av den ytre mannose blokkeres.

Mutasjoner i gen L (fig. la) av den xantan-biosyntetiske gen-klynge var tidligere vist å inaktivere det ketalase-enzym som katalyserer pyruvylering av den ytre mannose. Mutanter som mangler gpL-aktivitet produserer xantan-gummi som mangler pyruvat. Opprinnelige undersøkelser av slike mutanter viste imidlertid at disse ikke-pyruvylerte polymerer inneholdt usedvanlig høye nivåer acetat, generelt 0,8 acetat/mannose. Således kan den ytre mannose effektivt acetyleres når pyruvylering er genetisk blokkert og videre under-søkelser har vist at denne acetylering katalyseres av gpG og ikke gpF.

For å undersøke interaksjonen av de to acetylasegener med ketalasegenet og hverandre, ble et sett på åtte mutantstammer omfattende alle kombinasjoner av mutasjoner i gen F (Acetylase I), gen G (Acetylase II) og gen L (Ketalase) konstruert. De forskjellige kombinasjoner av mutasjoner ble konstruert på plasmid pRK290-H336 som inneholder hele gummigen-klyngen.

Den gen F-mutasjon som anvendes i disse konstruksjoner er iramme-slettingen inne i dette gen. Som beskrevet ovenfor eliminerer denne sletting 660 basepar mellom CJal-setene anordnet inne i gen F. Det slettede DNA faller helt og holdent innenfor kodesekvensen av gen F og ikke noe fremmed DNA er innsatt. Således fjerner slettingen en stor porsjon (ca. 66%) av genet, men forandrer ikke leserammen da antall basepar som slettes er fullt delelig med 3. Det mutante gpF som produseres ved denne slettingsmutasjon (gpFdel) mangler 220 aminosyrer ut av et samlet antall på 364, men transla-sjonsstarten av F og dens translasjonsstans koblet til starten av G forblir uendret. Eliminasjonen av to tredjedeler av aminosyreresten av gpF ble vist ovenfor å eliminere gpF-aktivitet.

Den gen G-mutasjon som anvendes i disse mutanter er et innskudd (KBml) inne i gen G ved et Baml-sete som avbryter kodesekvensen for gen G. Det innskutte DNA er et restriksjonsfragment som inneholder 1,3 kb Kan<r->DNA-segmentet av plasmid pUC4-K som beskrevet av J. Vieira og J. Messing i Gene 12:259-268 (1982) som til slutt fås fra det kanamycin-resistente gen av transposon Tn903.

De gen L-mutasjoner som ble anvendt var av to typer. En er et innskudd av transposon TnK12 inne i kodeområdet av gen L. Den annen type fås fra dette innskudd ved sletting av et 3 kb Hindlll-fragment av TnK12 som bærer de gener som koder for resistens for kanamycin og streptomycin. I denne TnK12-slettingsmutasjon forblir der fortsatt et innskudd av 1 kb av TnK12-DNA inne i gen L-kodingssekvensen og dette fører til innskuddsin-aktivering av gen L-produktet.

De forskjellige kombinasjoner av disse mutasjoner ble konstruert på plasmid pRK290-H336 ved bruk av in vitro rekombinant-DNA-teknologi. De åtte mutante plasmider som ble oppnådd, ble deretter overført konjugalt fra E. coli inn i X. campestris-stamme X1231 som inneholder den slettingsmutasjon som eliminerer hele gummi-genklyngen fra kromosomet. De åtte resulterende stammer X1396-X1403 (tabell 1) ble deretter analysert for polymer-produksjon.

Alle stammer ble dyrket i 50 ml hver av FXC-RAH-1-medium ved pH 7,0 som inneholdt:

3,2 g/l N-Z-amin AS

1,7 g/lMgS04 . 7H20

0,7 g/lKH2<P>04

40 g/l glukose

19,5 g/l (2-(N-morfolin)etansulfonsyre

5-10 mg/l kanamycin

1 mg/l tetracyklin (dersom det ble anvendt)

i 300 ml risteflasker med avbøyningsplater. Temperaturen ble holdt på 30°C. Etter ca. 60 timers inkubasjon ble kulturvæskene fortynnet med 2-4 volumer destillert H20 og cellene fjernet ved sentrifugering ved 14.000-18.000 x g i 30 min ved 10°C. Gummi ble utfelt fra supernatantene ved tilsetning av 2-3 volumer 2-propanol og samlet opp ved sentrifugering ved anvendelse av de betingelser som tidligere er beskrevet. Utfellingene ble deretter rehydratisert i 100-300 ml 20 mM NaCl og utfellingene gjentatt. Gummiene ble til slutt rehydratisert i 100 ml destillert H20 hver. Prøver av hver ble deretter dia-lysert mot 4 1 destillert HzO i 4 dager med daglige H20-forandringer i 12.000-14.000 MW-avskjæringspunkt celluloserør.

Triplikat-prøver av hver renset gummi ble deretter gjort 3-4 ganger mer konsentrert ved vakuumtørking og hydrolysert i 2 M trifluoreddiksyre ved 120°C i 2-2,5 timer. Etter nøytralisering med 1,2 M Na2C03 ble hydro-lysatene filtrert gjennom 0,45 mim filtere og var klare for analyse ved høyytelse-væskekromatografi (HPLC).

Analysene ble utført ved bruk av et Beckman HPLC utstyrt med en Aminex HPX-87H ioneeksklusjonskolonne (300 x 7,8 mm). Organiske syrer ble detektert ved ultrafiolett absorbans ved 214 nm. Brytningsindeksen ble brukt til å påvise nøytrale sukkere. Kolonnen ble kjørt isokratisk med 0,01 N H2S04 som den mobile fase ved en strømningshastighet på 0,6 ml/min ved 45°C.

Molforholdene av komponentene i hvert hydrolysat ble beregnet ved bruk av en serie beregningskurver basert på toppunktsarealer for hvert sukker og hver organisk syre.

Molforholdene mellom acetat og pyruvat i forhold til mannose er vist i tabell 2.

De følgende nøkkelobservasjoner angående dataene i tabell 2 kan gjøres:

1. Slettingen på 660 bp i gen F inaktiverte gen F-proteinet (Acetylase

I). Se X1402 vs. X1398. 2. Gen G-proteinet (Acetylase II) acetylerte xantan og ved et sterkt redusert nivå sammenlignet med vill-type når Ketalase var aktivt. Se X1400 vs. X1396, beskrevet i eksempel 4. 3. Dersom Ketalase ble inaktivert, øket acetylering ved Acetylase II dramatisk (X1400 vs. X1401), beskrevet i eksempel 4. 4. Graden av acetylering ved Acetylase I øket ikke i samsvar med inaktiveringen av Ketalase. Se X1398 vs. XI399, beskrevet i eksempel 4. 5. Pyruvylering varierte ikke i nevneverdig grad uansett graden av acetylering. Se X1396, X1398, X1400 og X1402, beskrevet i eksempel 4.

Disse data antyder at gen G-protein (Acetylase II) katalyserer acetyleringen av den eksterne mannose av xantan. Dette synes å inntreffe i en begrenset utstrekning når Ketalase er aktiv, men øker dramatisk i Ketalase"mutanter. Disse data antyder at pyruvylering blokkerer acetylering, men det motsatte er ikke tilfelle da pyruvyleringen ikke forandret seg nevneverdig, uansett graden av acetylering. Gen F-proteinet (Acetylase I) katalyserer acetyleringen av kun den indre mannose og tidligere data for polytrimer- og polytetramer-varianter av xantan, i US patent nr. 4 713 449 og US patentsøknad nr. 844 335 har vist at Ketalase katalyserer kun pyruvyleringen av den eksterne mannose.

Eksempel 3

Dette eksempel viser at gpG (Acetylase II) ikke katalyserer acetylering av den indre mannose av xantanets repeterende enhet.

Gen I av gummigen-klyngen koder for Transferase V (fig. 1) det enzym som føyer mannose til det lipidkoblede tetrasakkaridmellomprodukt i xantan-biosyntesen. Dette system er beskrevet i US-PS 4 713 449. Mutasjoner som inaktiverer gen I fører til syntesen av et lipidkoblet tetrasakkarid. Denne repeterende tetrasakkarid-enhet polymeriseres for å gi polytetramer-gummi som inneholder den indre mannose i sine normale koblinger, men mangler den ytre mannose som normalt finnes på xantan-gummi (fig. 4). Et dobbeltmutant-plasmid, pKBm2delCla, ble konstruert som inneholder en innskuddsmutasjon inne i gen I og Clal-slettingsmutasjonen inne i gen F (se fig. 5). Dobbeltmutant-plasmidet pKBm2delCla ble overført inn i X. campestris-slettingsstammen XI106 som inneholder bare gummigener B og C i sitt kromosom. Gener B og C er skaffet av kromosomet da mutantplasmidet som fås fra pRK290-HA3, ikke bærer B eller C, men inneholder alle de resterende gummigener D til og med M. Den resulterende stamme, XI106 (pKBm2delCla) eller X1419 ble analysert for polymersammensetning to ganger. Ingen av analysene påviste acetat i polymeren. Dette resultat viser at Acetylase II ikke kan acetylere den indre mannose av polytetrameren i noen særlig grad. I denne mutantstamme er Acetylase II aktivt fordi gen G ikke er mutert og gen F-mutasjonen er den ikke-polare Clal-sletting som ovenfor er blitt vist å ikke virke inn på ekspresjonen av gen G.

Eksempel 4

Dette eksempel beskriver de repeterende enheter som utgjør polysakkarid-familien som kan fremstilles ved genetisk regulering av acetylering og pyruvylering av den pentasakkarid-repeterende enhet av xantan-gummi. Strukturen av disse repeterende enheter er vist i skjematisk form på fig. 6.

(a) Vill-type (XI396); Acetylase I<+>, Acetylase II<+>, Ketalase<+>.

Normalt xantan er i utstrakt grad acetylert ved den indre mannoserest og er ofte pyruvylert på den ytre mannoserest. I motsetning til hva som er den generelle antagelse, blir en betydelig prosentandel (10-20%) av de ytre mannoserester av normalt xantan acetylert. Således er de repeterende enheter av normalt xantan heterogene med hensyn til modifikasjoner av den ytre mannose inneholdende enten pyruvat eller acetat.

(b) L-(X1397); Acetylase I<+>, Acetylase II<+>, Ketalase-.

Denne polymer inneholder ikke noe pyruvat og som et resultat er den sterkt acetylert ved den ytre mannoserest. Den indre mannoserest er sterkt acetylert som i vill-type.

(c) G- (X 1398); Acetylase T, Acetylase II-, Ketalase<+>.

Denne polymer er sterkt acetylert på den indre mannose som i vill-type, og den ytre mannose er pyruvylert på vill-type-måte. Der er imidlertid ingen acetylering av den ytre mannose.

(d) G-, L- (XI399); Acetylase T, Acetylase II-, Ketalase-.

Denne polymer har det høye nivå av vill-type-acetylering av den indre mannose, men den ytre mannose er umodifisert.

(e) F- (XI400); Acetylase I-, Acetylase II<+>, Ketalase<+>.

Den indre mannose av denne polymer er umodifisert, mens den ytre mannose er modifisert som i vill-type. Det vil si at den ytre mannose er generelt pyruvylert, men en betydelig fraksjon av de ytre mannoserester er acetylert istedet.

(f) F-, L- (X1401); Acetylase I-, Acetylase IT, Ketalase-.

Denne polymer inneholder en umodifisert, indre mannose. Den ytre mannose er ikke pyruvylert, men er sterkt acetylert.

(g) F-, G- (X1402); Acetylase I-, Acetylase II-, Ketalase<+>.

Denne polymer er ikke acetylert verken ved de indre eller de ytre mannoserester. Pyruvylering av den ytre mannose finner sted normalt som i vill-type.

(h) F-, G-, L- (X1403); Acetylase I-, Acetylase II-, Ketalase-.

Denne polymer inneholder ikke noe acetat eller pyruvat. Verken de indre eller de ytre mannoserester er modifisert.

Claims (24)

1. Vannoppløselig polysakkaridpolymer som omfatter gjentagende pentamerenheter som har et D-glukose: D-mannose: D-glukuronsyreforhold på ca 2:2:1, der D-glukosedelene er bundet i en beta- 1,4 -konfigurasjon, indre D-mannosedeler er bundet i en alfa- 1,3 - konfigurasjon primært til alternerende glykosedeler, D-glukoronsyredelene er bundet i en beta- 1,2 -konfigurasjon til nevnte indre mannosedeler, og ytre mannosedeler er bundet til nevnte glukuronsyredeler i en beta- 1,4 -konfigurasjon, karakterisert ved at nevnte indre mannosedeler ikke er acetylerte en del av nevnte ytre mannosedeler er acetylerte, og en del av ytre mannosedeler er pyruvylert eller ikke pyruvylert.

2. Polysakkaridpolymer som angitt i krav 1, karakterisert ved at en del av nevnte ytre mannosedeler er pyruvylert.

3. Polysakkaridpolymer som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte ytre mannosedeler ikke er pyruvylert.

4. Vannoppløselig polysakkaridpolymer som omfatter gjentatte pentamerenheter som har et D-glukose: D-mannose: D-glukuronsyreforhold på ca 2:2:1, der D-glukosedelene er bundet i en beta- 1,4 -konfigurasjon, indre D-mannosedeler er bundet i en alfa- 1,3 -konfigurasjon primært til alternerende glukosedeler, D-glukuronsyredelene er bundet i en beta- 1,2 -konfigurasjon til nevnte indre mannosedeler og ytre mannosedeler er bundet til nevnte glukuronsyredeler i en beta- 1,4 -konfigurasjon, karakterisert ved at de ytre mannosedeler ikke er acetylerte og en del av nevnte indre mannosedeler er acetylerte, og en del av ytre mannosedeler er pyruvylert eller ikke pyruvylert.

5. Polysakkaridpolymer som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte ytre mannosedeler ikke er pyruvylerte.

6. Polysakkaridpolymer som angitt i krav 4, karakterisert ved at en del av nevnte ytre mannosedeler er pyruvylerte.

7. Fremgangsmåte til fremstilling av en vannoppløselig polysakkaridpolymer som omfatter gjentatte Pentamerenheter som har et D-glukose: D-mannose: D-glukuronsyreforhold på ca 2:2:1, hvori D-glukosedelene er bundet i en beta- 1,4 -konfigurasjon, indre D-mannosedeler er bundet i en alfa- 1,3 -konfigurasjon primært til alternerende glukosedeler, D-glukuronsyredelene er bundet i en beta- 1,2 -konfigurasjon til nevnte indre mannosedeler og ytre mannosedeler er bundet til nevnte glukuronsyredeler i en beta- 1,4 -konfigurasjon, hvori de nevnte indre mannosedeler ikke er acetylerte og en del av nevnte ytre mannosedeler er acetylerte, karakterisert ved at den omfatter: (a) å pode en mikroorganisme av slekten Xanthomonas som er ute av stand til å uttrykke et funksjonelt gen F protein fra xanthan-gummi gen-klyngen, i et egnet vekstmedium; og (b) dyrke nevnte Xanthomonas under betingelser som er egnet til å fremstille nevnte polysakkaridpolymer.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at en del av nevnte ytre mannosedeler er pyruvylerte.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte ytre mannosedeler ikke er pyruvylerte.

10. Fremgangsmåte til fremstilling av en vannoppløselig polysakkaridpolymer som omfatter gjentatte pentamerenheter som har et D-glukose: D-mannose: D-glukuronsyreforhold på ca 2:2:1, hvor D-glukosedelene er bundet i en beta- 1,4 -konfigurasjon, indre D-mannosedeler er bundet i en alfa- 1,3 - konfigurasjon primært til alternerende glukosedeler, D-glukuronsyredeler er bundet i en beta- 1,2 -konfigurasjon til nevnte indre mannosedeler, og ytre mannosedeler er bundet til nevnte glukoronsyredeler i en beta- 1,4 -konfigurasjon, hvori nevnte ytre mannosedeler ikke er acetylerte og en del av nevnte indre mannosedeler er acetylerte, karakterisert ved at den omfatter; (a) å pode en mikroorganisme av slekten Xanthomonas som er ute av stand til å uttrykke et funksjonelt G protein fra xanthan-gummi gen-klyngen, i et egnet vekstmedium; og (b) dyrke nevnte Xanthomonas under betingelser egnet til å fremstille polysakkaridpolymerer.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte ytre mannosedeler ikke er pyruvylerte.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at en del av nevnte ytre mannosedeler er pyruvylerte.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er Xanthomonas campestris.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er Xanthomonas campestris.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er en Acetylase I defekt mutant av Xanthomonas.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er en Acetylase I og Ketalase-defekt mutant av Xanthomonas.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er en Acetylase II defekt mutant av Xanthomonas.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er en Acetylase II og Ketalase-defekt mutant av Xanthomonas.

19. Mutant Xanthomonas, karakterisert ved at den omfatter minst en mutasjon til minst ett xanthan biosyntesegen og at denne mutasjonen tillater produksjon av polysakkaridpolymerer som angitt i krav 1.

20. Xanthomonas som angitt i krav 19, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er en Acetylase I defekt mutant av Xanthomonas.

21. Xanthomonas som angitt i krav 19, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er en Acetylase I og Ketalase-defekt mutant av Xanthomonas.

22. Mutant Xanthomonas, karakterisert ved at den omfatter minst en mutasjon til minst ett xanthan biosyntesegen og at denne mutasjonen tillater fremstilling av polysakkaridpolymer som angitt i krav 4.

23. Xanthomonas som angitt i krav 22, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er en Acetylase II defekt mutant av Xanthomonas.

24. Xanthomonas som angitt i krav 22, karakterisert ved at nevnte Xanthomonas er en Acetylase II og Ketalase-defekt mutant av Xanthomonas.