NO178345B - Fremgangsmåte for fremstilling av en ekstracellulær eksopolymer - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte for fremstilling av en ekstracellulær eksopolymer med immunomodulerende egenskaper ved dyrking av Bifidobacterium infantis/longum-stammen som er deponert ved Institut Pasteur under nr. 1-885, i et passende medium under anaerobe betingelser. Etter at mikroorganismene er fjernet fra dyrkingsmediet isoleres den således oppnådde eksopolymerden konsentreres og presipiteres ved tilsetning av et organisk løsningsmiddel hvorpå produktet fra presipiteringen frysetørkes.Den oppnådde eksopolymer har aktivitet som innvirker på cellulær og humoral. immunitet og kan anvendes som et immunomodulerende middel for terapeutisk anvendelse.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en ekstracellulær eksopolymer med immunmodulerende aktivitet og med en tilsynelatende molekylvekt fra 10.000 til 100.000 dalton, som hovedsakelig har polysakkaridnatur, som kan inneholde en proteinfraksjon på høyst 30 vekt% og som hovedsakelig omfatter glukose og galaktose i et forhold mellom 1:1 og 4:1.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

En rekke sykdommer som allergier, autoimmune sykdommer, visse infeksjonssykdommer og visse cancertyper har det felles at der er en primær eller sekundær forstyrrelse i immunsystemet. Mens primære immun-mangelfullheter er sjeldne og har generelt genetiske årsaker, er sekundære immun-mangelfullheter mer vanlig og skyldes for det meste ytre faktorer og omfatter f.eks. tilbakevendende infeksjoner, aldring, cancer, feil-ernæring, utsettelse for immunotoksiske substanser og stress.

Immunoterapi vil lindre symptomer ved primær immunsvikt og gjenopprette immunstatusen i tilfellet med sekundær immunsvikt .

Mange immunoterapeutiske midler er utviklet i form av enten immunostimulerende midler eller immunosuppresjonsmidler. Immunomodulatorer er generelt midler som ikke-spesifikt forbedrer vertens spesifikke reaktivitet og ikke-spesifikke effektormekanismer. Man kan skille mellom syntetiske immunomodulatorer og immunomodulatorer av biologisk opprinnelse. De sistnevnte er mikrobielle produkter og ekstrakter av animalsk eller til og med human opprinnelse som f.eks. thymushormoner, dialyserbare ekstrakter av leukocytter, interferoner og cytokiner.

Aktiviteten av lymfocytter eller makrofager og deres inter-modulasjoner modifiseres faktisk betydelig ved at de utsettes for strukturelle molekyler av mikroorganismer eller for biologisk aktive komponenter fremstilt ved hjelp av mikroorganismer. En rekke bakterier og bakterieprodukter har vist sin innvirkning på immunsystemet. Disse immunomodulerende midler av bakteriell opprinnelse omfatter mykobakterier og deres produkter, lipopolysakkarider av gram-bakterier, enterotoksiner av Vibrio cholerae, produkter av Streptococcus, lipoproteiner og glykoproteiner av forskjellige gram-bakterier og polysakkarider av forskjellig opprinnelse. Det foregår nå intensive studier på dette området.

Fra US 4.797.389 er det kjent at det fremstilles et polysakkarid fra celleveggen til en bakterie av slekten Bifidobacterium. Polysakkaridet i henhold til US 4.797.389 inneholder ikke proteiner og det vises i denne forbindelse til spalte 3 i US 4.797.389 som angir at polysakkaridet ifølge US-patentet ikke gir en karakteristisk reaksjon ved Lowry-reaksjonen (dvs er Lowry-negativ), mens eksopolymeren fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er Lowry-positiv. Polysakkaridet ifølge US 4.797.389 utgjøres dessuten hovedsakelig av glukose og galaktose i et molforhold på omtrent 1:2,8 (galaktose > glukose), mens eksopolymeren fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder mer glukose enn galaktose, idet forholdet mellom glukose og galaktose som nevnt er innen området 1:1 til 4:1. Dessuten blir selve bakteriene ifølge US 4.7 97.389, etter dyrking, utvunnet ved sentrifugering og deretter behandlet med lyd for å nedbryte cellene og for å oppnå polysakkaridet fra celleveggene. I motsetning til dette blir eksopolymeren fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse i realiteten "utskilt" ved hjelp av den spesifikke mikroorganis-me og ikke separert fra dennes cellevegg. Mer spesielt blir supernatanten, etter dyrking av mikroorganismene og sentrifu-ger ing av suspensjonen, utvunnet (og ikke bakteriene, som fjernes) og deretter behandlet for å oppnå eksopolymeren.

Den foreliggende oppfinnelse adderer et ytterligere element til området som gjelder immunoterapi, og vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en ny ekstracellulær eksopolymer med svært interessante immunomodulerende egenskaper.

Andre formål med den foreliggende oppfinnelse vil fremkomme av det etterfølgende.

Eksopolymeren fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse ved dyrking av utvalgte stammer av en nylig isolert art, Bifidobacterium infantis longum, en grann- bakterie med taksonomiske egenskaper mellom Bifidobacterium infantis og Bifidobacterium longum. Da man ved forsøk har vist at eksopolymeren har immunomodulerende egenskaper, er den således av interesse innen human- og veterinærmedisin.

Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at en biologisk ren bakteriestamme av Bifidobacterium infantis longum som er deponert ved Colleetion Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM/Institut Pasteur) under nr. 1-885 dyrkes under anaerobe forhold i et passende medium og at etter at mikroorganismene er fjernet fra dyrkingsmediet isoleres den således dannede eksopolymer, konsentreres og presipiteres deretter ved tilsetning av et organisk løsningsmiddel hvorpå produktet oppnådd ved presipiteringen til slutt frysetørkes.

Bakteriestammen betegnet IBS kan dyrkes i ethvert passende medium hvis bestanddeler har en molekylvekt under 10000 dalton, og under anaerobe forhold, foretrukket ved omtrent 37°C. Den detaljerte sammensetning av et slikt medium er beskrevet i det etterfølgende.

Mikroorganismene fjernes foretrukket fra dyrkingsmediet ved sentrifugering, eksopolymeren isoleres, f.eks. ved ultrafiltrering på en kalibrert, porøs membran med en retensjonsterskel som er større enn eller lik 10000 dalton.

Det således isolerte produkt konsentreres deretter, dialyseres, presipiteres ved tilsetning av et organisk løsnings-middel, foretrukket etanol, og frysetørkes til slutt.

Den oppnådde eksopolymer har hovedsakelig polysakkaridnatur og består primært av glukose og galaktose i et forhold mellom 1:1 og 4:1, og inneholder en proteinfraksjon som høyst er 30 vekt%. I polysakkaridfraksjonen er forholdet mellom glukose og galaktose i området fra 1:1 til 4:1 og foretrukket 3:2.

Eksopolymeren fremstilt i henhold til oppfinnelsen har en molekylvekt fra 10000 til 100000 dalton, og foretrukket fra 20000 til 30000 dalton. Den kan danne aggregater med en molekylvekt på omtrent IO<6> dalton i likevekt med enheter med lavere molekylvekt. Den inneholder heller ikke nukleinsyrer, lipider og organiske syrer.

Den således isolerte og rensede eksopolymer har interessante immunomodulerende egenskaper og er ikke giftig. Både forsøk i in-vitro og in-vivo har vist at eksopolymeren fra stammen IBS opptrer som en immunomodulator og den øker vertens ikke-spesif ikke resistens. Den har også klare antileukemi- (a-ntitumor)egenskaper som kan knyttes til dens immunomodulerende egenskaper som beskrevet i "Determination of the immuno-modulatory properties of the exopolymer produced by the strain

IBS" .

Således kan eksopolymeren fremstilt ved hjelp av stammen IBS fordelaktig anvendes som en aktiv bestanddel i forskjellige farmasøytika som tilføres oralt, parenteralt og lokalt. Disse farmasøytika kan være i former som vanligvis anvendes innen human- eller veterinærmedisin, f.eks. i form av enkle eller sukkerbelagte tabletter, kapsler, små piller, oppløsninger, siruper, stikkpiller, injeserbare preparater, pessarer, kremer, pomader, lotion, dråper og øyelotion. De fremstilles alle ved vanlig anvendte metoder.

Den aktive bestanddel (eksopolymeren) kan innlemmes i slike farmasøytika alene eller sammen med andre farmasøytisk aktive midler. Hjelpestoffene som er anvendt for dette formål er vanlige hjelpestoffer som talkum, gummi arabicum, mannitol, stivelse, magnesiumstearat, kakaosmør, vandige eller ikke-vandige bærere, fettaktige substanser av animalsk eller vegetabilsk opprinnelse, paraffinderivater, glykoler, forskjellige fuktemidler, dispergeringsmidler eller emulge-ringsmidler og konserveringsmidler.

I dyr er det observert betydelige immunomodulerende effekter hos mus i doser mellom 4-400 \ i. g pr. mus.

De etterfølgende eksempler er angitt for å illustrere den foreliggende oppfinnelse. Eksemplene vedrører mer spesielt fremstillingen av eksopolymeren (også betegnet PB3D) og dens farmakologiske virkninger.

FREMSTILLING AV EKSOPOLYMEREN VED DYRKING AV BAKTERIESTAMMEN IBS AV BIFIDOBACTERIUM INFANTIS LONGUM

Trinn A: dyrking av stammen IBS

Stammen IBS dyrkes under anaerobe betingelser ved 37°C (luften fjernes ved begynnende fermentering) i følgende næringsmedium:

En fast bærer med handelsbetegnelsen CYTODEX eller en ekvivalent kan fordelaktig tilsettes til dyrkingsmediet for å forbedre utbyttet. Under disse forhold danner stammen IBS en eksopolymer som kan kvantifiseres i supernatanten ved anven-deise av en ELISA-metode som er utviklet for dette formål og som beskrives i det etterfølgende.

Eksempel

10 1 av det ovennevnte dyrkingsmedium fremstilles og plasseres i en 12 1 fermentor for sterilisering. Fermentoren inokuleres deretter med 1000 ml av en kultur av lBS-stammen dyrket i det samme medium i 48 timer. En blanding av 90 % N2 og 10 % C02 bobles inn i blandingen i 20 minutter i en mengde på 3 1 pr. minutt. Inkubasjonen gjennomføres ved 37°C med omrøring ved 400 rpm under en N2/C02-blanding i det vanlige forhold som injeseres inn i mediet under de to første timene av fermente-ringen. Etter 48 timer, og ved endt fermentering, bestemmes mengden dannet polysakkarid ved hjelp av ELISA-metoden. Minimumsutbyttet er 35 ug/ml.

Trinn B: isolering og rensing av dannet eksopol<y>mer

Ved endt fermentering separeres cellene ved sentrifugering. Når cellene er sedimentert, ultrafiltreres supernatanten ved anvendelse av et apparat av typen Amicon hulfiber H5 P10-43. Bare molekylene som er tyngre enn 10000 dalton tilbakeholdes. Oppløsningen som inneholder den dannede eksopolymer konsentreres til en tiendedel og dialyseres deretter.

Den konsentrerte oppløsning presipiteres med alkohol (etanol: vann, 3:1 v/v).

Til slutt frysetørkes produktet som er presipitert med etanol. Det således oppnådde produkt er hvitaktig og har et fibrøst utseende.

Eksempel

Fra den ovennevnte kultur oppnås 10 1 supernatantvæske som konsentreres til 1 1 ved ultrafiltrering. Volumet justeres til 10 1 med destillert vann og reduseres på nytt ved ultrafiltrering til omtrent 1 1. Denne operasjon gjennomføres 2 ganger. 1 1 konsentratet som således oppnås presipiteres deretter med etanol (3:1, v/v). Det oppnådde presipitat frysetørkes til å gi omtrent 400 mg frysetørket substans.

ELISA- metoden

Det antigen som anvendes er et polysakkaridpreparat hvis renhet sikres ved ytterligere deproteinering med fenol. En initial dose på 0,5 mg injiseres inn i en kanin i to injeksjo-ner - en intraperitoneal og den andre subkutan - sammen med Freunds adjuvans. Injeksjonen gjentas på dag 15 ved anvendelse av Freunds adjuvans. Femten dager senere tas det blodprøver av kaninen for å oppnå et antiserum med høye antistoffnivåer som, ved hjelp av ELISA-metoden, gjør det mulig å gjenkjenne eksopolymeren renset ved kromatografering på en SEPHADEX G 2 00 kolonne og eksopolymeren som er tilstede i supernatanten av kulturene av Bifidobacterium etter presipitering med etanol.

ELISA-forsøket gjennomføres på en mikroplate. Antigenet adsorberes. Ledig rom i brønnene fylles med serumalbumin. Det gjennomføres deretter inkubasjon med de spesifikke antistoffer som er oppnådd fra kaninen. Deretter tilsettes antistoffene som er rettet mot kaninens antistoffer. De er konjugert til alkalisk fosfatase. Til slutt tilsettes substratet (ortonitrofenylfosfat). Etter inkubasjon stanses reaksjonen ved anvendelse av 3M NaOH. Optisk tetthet (absorbans) måles ved 405 nm på et ELISA-måleapparat. Ved hjelp av denne prosedyre oppnås tilstrekkelig høye antistofftitre til å gi positiv avlesing for 10-<4->fortynninger av antiserum for rensede antigen-konsentrasjoner på 4 jig.

Karakterisering av eksopolymeren dannet ved hjelp av

stammen IBS

1) Det oppnådde produkt utgjøres i alt vesentlig av glucider (målt ved fenol/svovelsyre-metoden) og proteiner (målt ved Lowry-metoden) i et forhold på 5:1.

Produktet inneholder ikke nukleinsyrer ifølge de analytiske resultater som oppnås ved ionebytterkromatografi eller ved gasskromatografi. Hydrolysatet inneholder ingen pentoser i noen av tilfellene. Produktet innholder ikke lipider i henhold til resultatene som var oppnådd ved gasskromatografi etter ekstraksjon med n-heptan. Der finnes ingen organiske syrer i henhold til målinger gjennomført med ionebytterkromatografi. 2) I henhold til resultatene som var oppnådd ved høytrykks-væskekromatografi (HPLC) på en RP-8 300 Å kolonne, er produktet av glykoprotein-natur. 3) Gluciddelen utgjøres av glukose og galaktose i henhold til analytiske resultater oppnådd ved ionebytterkromatografi, tynnsjiktkromatografi og gasskromatogra.fi. 4) Glukose og galaktose er tilstede i forholdet 3:2 i henhold til resultatene oppnådd ved gasskromatografi fra monomerene som er hydrolysert ved metanolyse og deretter acetylert ved hjelp av trifluoracetylering. 5) Polysakkariddelen er forgrenet med bindingene 1-2, 1-3, 1-4 og 1-6 i henhold til det kromatogram som oppnås ved gasskromatografi fra de metylerte monomerer (ved metanolyse) og de acetylerte monomerer (ved trifluoracetylering) . 6) Den biologiske aktivitet som måles ved evnen til å stimulere en økning i antall plakk-dannende celler (PFC), stammer fra gluciddelen og opprettholdes etter behandling med proteinase K som bryter ned proteindelen. 7) Den omtrentlige molekylvekt varierer mellom 2 0000 og 30000 dalton i henhold til de resultater som er oppnådd ved kromatografi på en SEPHADEX G 2 00 (topp med lav molekylvekt) .

Eksopolymeren kan danne aggregater med molekylvekt på omtrent IO<6> dalton i likevekt med enhetene med lavere molekylvekt.

BESTEMMELSE AV DE IMMUNOMODULERENDE EGENSKAPER FOR EKSOPOLYMEREN DANNET VED HJELP AV STAMMEN IBS ( IN VITRO- PRØVING)

Proliferasjon av splenocytter

Proliferasjon av splenocytter i nærvær av mitogener kan måles ved reduksjon av MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) til formazan ved hjelp av mitokondrie-dehydrogenase.

Eksempel

Proliferasjon (splenocytter fra mus C57BL/6) uttrykkes ved optisk tetthet (absorbans) ved 560 nm som en funksjon av konsentrasjonen av PB3D eller av LPS som tjener som en referanse:

PB3D induserer en proliferasjon som er litt mindre enn den som induseres ved LPS.

BESTEMMELSE AV DE IMMUNOMODULERENDE EGENSKAPER FOR EKSOPOLYMEREN DANNET VED HJELP AV STAMMEN IBS ( IN VIVO- PRØVING)

Stimulering av produksjonen av antistoff- svntetiserende celler

I en mus stimulerer eksopolymeren ikke-spesifikt dannelse av antistoff-syntetiserende celler når den tilføres oralt sammen med røde blodlegemer fra sau eller intraperitonealt uten røde blodlegemer fra sau. Eksopolymeren normaliserer også denne evne i musen som er immunosupprimert med cyklofosfamid.

Eksempel

Etter oral tilførsel av PB3D i 5 dager og en booster-dose på den 19. og 20. dag (organigram A) eller uten en booster-dose (organigram B), observeres en økning i antall PFC i musens milt, avhengig av den tilførte dose.

Eksempel

Etter intraperitoneal tilførsel av en enkel dose på 400 (lg/mus av PB3D, observeres en betydelig økning i antall PFC etter 4 dager.

Eksempel

Eksopolymeren tilført til mus som var immunosupprimert med cyklofosfamid gjør det mulig å observere mindre immunosuppresjon eller hurtigere restituering av normalt antall PFC i behandlet mus sammenlignet med ubehandlede mus.

Innvirkning på sammensetningen av serumproteiner

Forskjellige immunomodulatorer modifiserer det immuno-elektroforetiske spor for serumproteinene kjent som X, LA og

LB. Eksopolymeren fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse bevirker en slik modifikasjon.

Eksempel

Intraperitoneal tilførsel av 400 |ig/mus PB3D gir, etter 24 timer og etter 4 dager, en modifikasjon i serumproteinene som er sammenlignbar med den som bevirkes ved lipopolysakkaridet fra Escherichia coli (LPS).

Eksempel

Likeledes ga oral tilførsel av totalt 400 jig og tilførsel oppdelt i 5 påfølgende daglige doser på 80 [ Lg, en modifikasjon i proteinet som kunne sees 5 dager etter tilførsel av eks opolymeren.

Kolloidal karbon- clearance

Eksopolymeren tilføres intravenøst (2,5 mg/mus) til Balb/c-mus. Etter 48 timer injeseres 0,2 ml av en suspensjon av kolloidalt karbon intravenøst. Forsvinning av karbon i blodet, kalt clearance, uttrykkes ved hjelp av log-kurven for karbonnivået versus tid. Eksopolymeren øker clearance.

Økning av ikke- spesifikk resistens

I musene som var immunosupprimert med cyklofosfamid og utsatt for kulde, var det mulig å observere at eksopolymeren fremstilt i henhold til oppfinnelsen økte vertens ikke-spesifikke resistens overfor en bakteriell infeksjon som er fremkalt ved hjelp av Pseudomonas i slimhinnemembranene eller overfor en virusinfeksjon (Coxsackie B virus).

Eksempel

Immunosuppresjon oppnås ved intraperitoneal tilførsel av 200 mg/kg cyklofosfamid. På den tredje dag, begynner den fem dager lange orale behandling med eksopolymeren (80 |ig/mus/dag) . Kontrollmusene mottok ekvivalent mengde saltvann. Noen få timer etter endt behandling infiseres musene intranasalt med en stamme av Pseudomonas aeruginosa som er gjort patogen for mus. Graden av overlevelse er større for gruppen av behandlede mus:

Eksempel

Det fremkalles immunosuppresjon ved hjelp av enkel intraperitoneal tilførsel av 200 mg/kg cyklofosfamid. På den tredje dag, starter den fem dager lange orale behandling med eksopolymeren (80 p.g/mus/dag) . Kontrollmusene mottok en ekvivalent mengde saltvann. Noen få timer etter endt behandling infiseres musene intraperitonealt med Coxsackie B5 virus (0,5 ml med IO<7 >PFU) og graden av overlevelse evalueres. Den er større for

gruppen av behandlede mus:

Forsøk i forbindelse med spontan eller indusert leukemi

Eksopolymeren fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse kan utsette forekomsten av leukemi i AKR-mus (stamme av innavlet mus som svært ofte utvikler spontan leukemi). Eksopolymeren er også istand til å utsette forekomsten av leukemi indusert ved en carcinogen substans som metylcholantren i RF-mus (stammen RF er en innavlet stamme hvor metylcholantren gir snarlig opptreden av leukemi).

Eksempel

To grupper AKR-mus fikk ved oral tilførsel en femdagers PB3D-terapi hver måned, mens en tredje gruppe ikke mottok testproduktet og tjente som kontrollgruppe. Av de to behandlede grupper ble en gruppe gitt en total månedlig dose på 400 Jig (80 jig/dag/mus i fem påfølgende dager) ,

mens den andre gruppen mottok en total månedlig dose på 4 fig (0,8 jig/dag/mus i fem påfølgende dager).

De oppnådde resultater viste en utsettelse i forekomsten av leukemi i de behandlede mus. Denne forskjell var klart signifikant i gruppen som mottok en total månedlig dose på 400 jig. Dette ble bekreftet ved hjelp av et annet forsøk hvor de behandlede grupper mottok henholdsvis 400 fig og 40 jig PB3D.

Forsøk 1

Forsøk 2

Eksempel

Under de to måneder før topisk tilførsel av metylcholantren mottok to grupper RF-mus oral tilførsel av PB3D med tre ukers mellomrom. En av gruppene fikk månedlig en total dose på 400 ug (80 ug/dag/mus i fem påfølgende dager) , mens den andre mottok en total månedlig dose på 4 ug (0,8 ug/dag/mus i fem påfølgende dager). Kontrollgruppen fikk ingen behandling. Leukemi ble indusert ved kutan påføring på et barbert område på kroppen. Tilførsel av PB3D forsinket forekomst av leukemi. Denne forsinkelse var klart signifikant i gruppen som mottok 400 ug PB3D.

Akutt giftighet

Forsøk med hensyn på akutt giftighet er gjennomført ved intravenøs injeksjon av eksopolymeren i følgende doser: 1 ug, 10 ug, 15 ug, 100 ug, 300 ug, 600 ug og 1200 ug pr. mus inn i kaudalvenen i fem mus for hver dose. Ingen dose ga negative reaksjoner i musene som fremdeles var i live to måneder etter injeksjonen.

Beskrivelse av stammen

Stammen IBS av Bifidobacterium infantis longum ble deponert 6. juli 1989 i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux,

75724 Paris, Cedex, Frankrike). Stammen har deponeringsnr. I-885.

Denne stamme var isolert fra avfallsvann inneholdende faeces-substans av human opprinnelse og hadde taksonomiske egenskaper mellom Bifidobacterium infantis og Bifidobacterium longum og kan typebestemmes ved hjelp av profilen for de strukturelle komponenter, profilene av fermeteringskatabolittene av D-glukose og resistensprofilen overfor antibiotika og dannelse av eksopolymeren.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en ekstracellulær eksopolymer med immunmodulerende aktivitet og med en tilsynelatende molekylvekt fra 10.000 til 100.000 dalton, som hovedsakelig har polysakkaridnatur, som kan inneholde en proteinfraksjon på høyst 30 vekt% og som hovedsakelig omfatter glukose og galaktose i et forhold mellom 1:1 og 4:1, karakterisert ved at en biologisk ren bakteriestamme av Bifidobacterium infantis longum som er deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM/Institut Pasteur) under nr. 1-885 dyrkes under anaerobe forhold i et passende medium og at etter at mikroorganismene er fjernet fra dyrkingsmediet isoleres den således dannede eksopolymer, konsentreres og presipiteres deretter ved tilsetning av et organisk løsningsmiddel hvorpå produktet oppnådd ved presipiteringen til slutt frysetørkes.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at eksopolymeren isoleres fra dyrkingsmediet ved ultrafiltrering på en kalibrert, porøs membran med en retensjonsterskel som er større eller lik 10.000 dalton.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at eksopolymeren isolert fra dyrkingsmediet konsentreres ved ultrafiltrering.

4. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1 til 3, karakterisert ved at eksopolymeren presipiteres ved tilsetning av alkohol, foretrukket etanol.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at forholdet mellom glukose og galaktose i produkter som fremstilles er 3:2.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den tilsynelatende molekylvekt i produktet som fremstilles er mellom 20.000 og 30.000 dalton og at den fremstilte eksopolymer danner aggregater med molekylvekt på omtrent IO<6> dalton i likevekt med enhetene med lavere molekylvekt.