NO175640B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fusjonsproteiner og DNA som koder for disse.

Ved den gentekniske fremstillingen av små eukariotiske proteiner med en molvekt på inntil 15.000 dalton oppnås det i bakterier ofte "bare et lavt utbytte. Sannsynligvis nedbygges de dannede proteinene raskt av vertsegne proteaser. Slike proteiner fremstilles derfor hensiktsmessig som fusjonsproteiner, spesielt med en vertsegen proteinandel som deretter avspaltes.

Det er nå funnet at et av bare ca. 70 aminosyrer bestående avsnitt av D-proteinet fra trp-operonet av E. coli egner seg spesielt til dannelse av fusjonsproteiner, og spesielt i området av aminosyresekvens 23 til 93 (C. Yanofsky et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 6647), i det følgende også betegnet "D'-peptid". Mellom karboksy-terminalen av dette peptidet og aminosyresekvensen for det ønskede eukariotiske proteinet befinner det seg en sekvens av en eller flere genetisk kodbare aminosyrer som tillater en kjemisk eller enzymatisk avspaltning av det ønskede proteinet. I foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse slutter det seg til aminoterminalen en kort aminosyresekvens bestående av Lys-Ala, eventuelt fulgt av en sekvens med 1 til 10, spesielt

1 til 3 ytterligere genetisk kodbare aminosyrer, fortrinnsvis av 2 aminosyrer, spesielt av Lys-Gly. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et fusjonsprotein, kjennetegnet ved den generelle formelen

hvori

n er null eller 1,

X er en sekvens på 1 til 12 genetisk kodbare aminosyrer,

D' er en sekvens på ca. 70 aminosyrer i området for aminosyresekvensen 23-93 av D-peptidet i trp-operonet for E. coli,

Y er en sekvens av en eller flere genetisk kodbare aminosyrer, som muliggjør en avspaltning av den følgende aminosyresekvensen Z, og

Z er en sekvens av genetisk kodbare aminosyrer.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse DNA, kjennetegnet ved at det koder for fusjonsproteinet som omtalt ovenfor, hvor følgende sekvens koder for D':

for X koder DNA-sekvensen (kodende streng):

5' AAA GCA AAG GGC 3'

i nukleotidsekvensen til Y som koder for aminosyrene inneholder Y C-terminalt Met, Cys, Trp, Arg eller Lys eller en av gruppene

(Asp)m - Pro, hhv. Glu - (Asp)m - Pro eller Ile - Glu - Gly - Arg

hvori m betyr 1, 2 eller 3, eller består av disse aminosyrene eller en av disse gruppene.

Det er naturligvis fordelaktig når den uønskede (vertsegne) andelen av fusjonsproteinet er minst mulig, siden cellen i dette tilfellet bare produserer "ballast" og utbyttet av det ønskede proteinet derved blir høyt. Videre oppstår ved avspaltningen av den uønskede andelen mindre biprodukter, hvilket gjør opparbeidelsen enklere. I motsatt retning virker at den (formodede) "beskyttelsesfunksjonen" for den uønskede andelen bare kan ventes fra en bestemt størrelse. Overraskende har det vist seg at det ifølge oppfinnelsen valgte segmentet fra D-proteinet oppfyller denne oppgaven, selv om det bare oppviser ca. 70 aminosyrer.

I mange tilfeller, fremfor alt ved den foretrukne utførelses-formen, hvori X står for Lys-Ala og N-terminalen inneholder denne sekvensen, dannes et uoppløselig fusjonsprotein. Dette kan på enkel måte fraskilles fra de oppløselige proteinene, hvilket letter opparbeidelsen i stor grad og forhøyer utbyttet. Dannelsen av uoppløselig fusjonsprotein er overraskende, idet på den ene siden den bakterielle andelen er relativt lav med bare ca. 70 aminosyrer og på den andre siden er bestanddel av et i vertscelle i oppløsning foreliggende protein.

"Ca. 70 aminosyrer i området for aminosyresekvensen 23 til 93 av D-peptidet" betyr at variasjoner er mulige på i og for seg kjent måte, dvs. at enkelte aminosyrer kan utelates, erstattes eller utbyttes, uten at herved egenskapene for fusjonsproteinet ifølge oppfinnelsen forandrer sin signifi-kans .

Det ønskede eukaryotiske proteinet er fortrinnsvis et biologisk aktivt protein som et hirudin eller er forstadium av et slikt protein som humant proinsulin.

Fusjonsproteinet utvinnes ved ekspresjon i et egnet system og isoleres, i den spesielt foretrukne utførelsesformen, etter oppslutning av vertscellene fra bunnfallet, hvori det anrikes på grunn av den lave oppløseligheten. Dermed er en enkel fraskillelse fra de oppløselige bestanddelene i cellen mulig.

Som vertsceller kommer alle celler i betraktning som er kjent for ekspresjonssystemer, dvs. pattedyrceller og mikroorgan-ismer, fortrinnvis bakterier, spesielt E. coli, idet den bakterielle andelen av fusjonsproteinet er et vertseget protein fra E. coli.

DNA-sekvensen som koder for fusjonsproteinet ifølge oppfinnelsen innbygges på kjent måte i en vektor som sikrer en god ekspresjon i det valgte ekspresjonssystemet.

I bakterielle verter velger man hensiktsmesig promotoren og operatoren fra gruppen lac, tac, Pl eller Pj) for fagen \, hsp, omp eller en syntetisk promotor, som eksempelvis beskrevet i det tyske utlegningsskrift nr. 3 430 683 (europeisk patentpublikasjon 0 173 149).

Spesielt egnet er en vektor som fra trp-operonet fra E. coli inneholder følgende elementer: Promotoren, operatoren og ribosombindingsposisjonen for L-peptidet. I det kodende området slutter seg spesielt hensiktsmessig de første tre aminosyrene til dette L-peptidet, hvoretter over en kort aminosyresekvens aminosyrene 23 til 93 i D-proteinet i trp-operonet følger.

Mellomsekvensen Y, som muliggjør en avspaltning av det ønskede polypeptidet, avhenger av sammensetningen av dette ønskede peptidet: Når dette eksempelvis ikke inneholder metionin kan Y stå for met, hvorpå en kjemisk spaltning følger med bromcyan. Dersom i bindeleddet Y ved karboksy-terminalen står for cystein eller dersom Y står for Cys, så kan en enzymatisk cystein-spesifikk avspaltning eller en kjemisk avspaltning, eksempelvis etter S-cyanylering foregå. Dersom i broleddet Y ved karboksyterminalen står for tryptofan eller Y står for trp, kan en kjemisk avspaltning foregå med N-bromsuksinimid. Dersom Y står for Asp-Pro så kan en proteolytisk avspaltning foregå på i og for seg kjent måte (D. Piszkiewicz et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 40 (1970) 1173-1178). Asp-Pro-bindingen kan, som det ble funnet, også utformes syrelabil, når Y er

hvorved m er 1, 2 eller 3. Herved oppnås spaltningsprodukter som begynner N-terminalen med Pro hhv. avslutter C-terminalen med Asp.

Eksempler på enzymatiske spaltninger er også kjente, hvorved også modifiserte enzymer med forbedret spesifisitet kan anvendes (C. S. Craik et al., Science 228 (1985) 291-297). Dersom det ønskede eukariotiske peptidet er humant proinsulin, så kan man som sekvens Y velge en peptidsekvens hvori med trypsin avspaltbar aminosyre (Arg, Lys) er bundet til den N-terminale aminosyren (phe) av proinsulinet, eksempelvis Ala-Ser-Met-Thr-Arg, idet i dette tilfellet den arginin-spesifikke avspaltningen kan foregå med proteasen trypsin. Dersom det ønskede proteinet ikke inneholder aminosyrerekken Ile-Glu-Gly-Arg, er også en spaltning med faktoren Xa mulig (EP-A 0 161 937).

Ved utformingen av sekvensen Y har man også anledning til å ta hensyn til de syntetiske mulighetene og innbygge egnede spaltningsposisjoner for restriksjonsenzymer. DNA-sekvensen som tilsvarer aminosyresekvensen Y kan derfor også overta funksjonen av et forbindelsesledd eller en adapter.

Fusjonsproteinet ifølge oppfinnelsen eksprimeres med fordel under kontroll av trp-operonet fra E. coli. Et DNA-avsnitt som inneholder promotoren og operatoren for trp-operonet er handelsvanlig. Ekspresjonen av proteiner under kontroll av trp-operonet er ofte beskrevet, eksempelvis i EP-A2 0 036 776. Induksjonen av trp-operonet kan oppnås ved fravær av L-tryptofan og/eller nærvær av indolyl-3-akrylsyre i medium.

Under kontroll av trp-operatoren foregår først transkrip-sjonen av L-peptidet som består av 14 aminosyrer. Dette L-peptidet inneholder i posisjonene 10 og 11 L-tryptofan. Hastigheten for proteinsyntesen av L-peptidet bestemmer om det etterfølgende strukturgenet også translateres, eller om proteinsyntesen avbrytes. Ved mangel på L-tryptofan foregår en langsom syntese av L-peptidet på grunn av en lav konsentrasjon av tRNA for L-tryptofan og det foregår en syntese av følgende proteiner. Ved høye konsentrasjoner av L-tryptofan avleses derimot det tilsvarende avsnitt av mRNA raskt og det kommer til avbrudd av proteinbiosyntesen idet mRNA antar en terminator-lignende struktur (C. Yanofsky et al., se ovenf or ).

Hyppigheten av translasjonen for en mRNA påvirkes sterkt av typen av nukleotid i omgivelsene for startkodonet. Ved ekspresjon av et fusjonsprotein ved hjelp av trp-operonet synes det følgelig å være gunstig å anvende nukleotidene for de første aminosyrene av L-peptidet for begynnelsen av strukturgenet for fusjonsproteinet. Ved den foretrukne utførelsen av oppfinnelsen i trp-systemet ble nukleotidene for de første 3 aminosyrene av L-peptidet ( i det følgende L'-peptid) valgt som kodoner for de N-terminale aminosyrene av fusjonsproteinet.

Oppfinnelsen vedrører derfor også vektorer, fortrinnsvis plasmider til ekspresjon av fusjonsproteiner, hvorved DNA for vektorene sett fra 5'-enden har følgende karakteristika (i egnet anordning og i fase): En promotor, en operator, et ribosom-bindingssete og strukturgenet for fusjonsproteinet, hvorved det sistnevnte inneholder aminosyresekvensen I (anheng) før sekvensen av det ønskede proteinet. Før strukturgenet, hhv. som første triplett for strukturgenet, befinner seg startkodonet (ATG) og eventuelt ytterligere kodoner for andre aminosyrer, som er anordnet mellom startkodonet og D'-sekvensen eller mellom D'-sekvensen og genet for det ønskede proteinet. Avhengig av aminosyresam-mensetningen for det ønskede proteinet foretas valget av DNA-sekvensen før strukturgenet, slik at en avspaltning av det ønskede proteinet fra fusjonsproteinet muliggjøres.

Ved ekspresjonen av fusjonsproteinet ifølge oppfinnelsen kan det vise seg hensiktsmessig å endre enkelte tripletter for de første aminosyrene etter ATG-startkodonet for å forhindre en eventuell basepardannelse i området for mRNA. Slike endringer, samt endringer, utelatelser eller addisjoner av enkelte aminosyrer i D'-proteinet er kjente for fagmannen.

Idet mindre plasmider oppviser flere fordeler består en foretrukket utførelse av oppfinnelsen i at det fra plasmider, som er avledet fra pBR 322, elimineres et DNA-avsnitt med strukturgenet for tetracyklinresistensen. Fortrinnsvis fjerner man segmenter fra HindiII-snittstedet ved posisjon 29 til PvulI-snittstedet ved posisjon 2066. Spesielt fordelaktig er det ved disse plasmidene å fjerne et noe større DNA- avsnitt, idet man benytter PvuII-snittstedet ved begynnelsen (i avleseretning) av trp-operonet (som ligger i en ikke-essensiell del). Slik kan man direkte ligere det store fragmentet som oppstår med begge PvuII-snittstedene. Det oppnådde, med ca. 2 kbp forminskede plasmidet bevirker en ekspresjonsøkning, som muligens kan tilbakeføres til et forhøyet kopiantall i vertscellen.

I de følgende eksemplene belyses oppfinnelsen nærmere.

Eksempel 1

a) Kromosomalt E. coli-DNA kuttes ved hjelp av Hinf I og 492 bp-fragmentet isoleres, som fra trp-operonet inneholder

promotoren, operatoren, strukturgenet for L-peptidet, attenuatoren og kodonene for de første seks aminosyrene av trp-E-strukturgenet. Dette fragmentet oppfylles ved hjelp av Klenow-polymerase med desoksynukleotidtrifosfater, forbindes ved begge ender med et oligonukleotid som inneholder et gjenkjenningssete for Hindlll og det etterskjæres med Hindlll. Det oppnådde Hindlll-fragmentet ligeres i Hindlll-snittsetet av pBR 322. Man får dermed plasmidet ptrpE2-l (J.

C. Edmann et al., Nature 291 (1981) 503-506). Dette overføres som beskrevet til plasmidet ptrpLl. Ved hjelp av de syntetiske oligonukleotidene (NI) og (N2)

som komplementerer til det dobbeltkjedede oligonukleotidet

(N3)

innbygges i Clal-setet for plasmidet ptrpLl DNA-sekvensen for de første tre aminosyrene av L-peptidet, samtidig dannes et restriksjonssete (Stul) for innføring av ytterligere DNA (fig. 1). Plasmidet ptrpLl omsettes med en enzymet Clal ifølge fabrikantens angivelse, blandingen ekstraheres med fenol og DNA utfelles med etanol. Det åpnede plasmidet omsettes for fjernelse av fosfatgruppene ved 5'-endene med alkalisk fosfatase fra E. coli. Det syntetiske nukleotidet fosforyleres ved 5'-endene og innføres med T4 DNA-ligase i det åpnede, fosfatase-behandlede plasmidet. Etter avsluttet ligase-reaksjon foregår transformasjonen i E. coli 294 og seleksjon av transformantene ved Amp-resistens og nærvær av et Stul-restriksjonssete.

Ca. 80$ av de oppnådde klonene oppviser det ventede restriksjonssetet; den i fig. 1 gjengitte nukleotidsekvensen ble bekreftet ved sekvensanalyse. Man oppnår plasmidet pH120/14, som etter ribosombindingssetet for L-peptidet oppviser nukleotidtripletten for de første tre aminosyrene av L-peptidet (L'-peptid), fulgt av et Stul-sete, som tillater ytterligere innføring av DNA og derved muliggjør dannelsen av fusjonsproteiner med de første tre aminosyrene fra L-peptidet.

b) I det følgende beskrives, med utgangspunkt i det ovenfor anvendte oligonukleotidet (NI), den kjemiske syntesen av

slike oligonukleotider:

Med fremgangsmåten ifølge M.J. Gait et al., Nucleic Acids Research 8 (1980) 1081-1096, bindes det ved 3'-enden stående nukleosidet, i foreliggende tilfelle guanosin-kovalent til en glasskule-bærer (CPG = controlled pore glass) LCAA (= long chain alkyl amine) (fra firma Pierce) via 3'-hydroksyfunk-sjonen. Herved omsettes guanosinet som N-2-isobutyroyl-3'-0-suksinoyl-5'-dimetoksy-trityleter i nærvær av N,N'-dicyklo-heksylkarbodiimid og 4-dimetylaminopyridin med den modifiserte bæreren, hvorved den frie karboksygruppen av suksinoyl- resten acylerer aminoresten av det langkjedede aminet på bæreren.

I de følgende syntesetrinnene anvendes basekomponentene som 5 ' - O-dimetoksytr i ty 1-nukleosid-3 '-f os f orsyremonometylester-dialkylamid eller -klorid, hvorved adeninet foreligger som N6-benzoyl-forbindelsen, cytosinet som 4N-benzoyl-for-bindelsen, guaninet som N2-isobutyryl-forbindelsen og tymin som ikke inneholder noen aminogruppe foreligger uten beskyttelsesgruppe. 40 mg av bæreren som inneholder 1 jjmol bundet guanosin behandles trinnvis med følgende reagenser:

a) metylenklorid,

b) 10$ trikloreddiksyre i metylenklorid,

c ) metanol,

d) tetrahydrofuran,

e) acetonitril,

f) 15 pmol av det tilsvarende nukleosidfosfittet og 50 pmol tetrazol i 0,3 ml vannfri acetonitril (5 minutter), g) 20$ acetanhydrid i tetrahydrofuran med 40$ lutidin og 10$ dimetylaminopyridin (2 minutter),

h) tetrahydrofuran,

i) tetrahydrofuran med 20$ vann og 40$ lutidin,

j) 3% jod i kollidin/vann/tetrahydrofuran i volumforhold

5:4:1,

k) tetrahydrofuran og

1) metanol.

Under "fosfitt" forstås her desoksyribose-3'-monofosforsyre-monometylesteren, hvorved den tredje valensen er avmettet med klor eller en tertiær aminogruppe, eksempelvis en diisopropy-laminorest. Utbyttene i de enkelte syntesetrinnene kan i ethvert tilfelle etter detrityleringsreaksjonen b) bestemmes spektrofotometrisk ved måling av absorpsjon for dimetoksytri-tylkationet ved en bølgelengde på 496 nm.

Etter avsluttet syntese av oligonukleotidet avspaltes metylfosfatbeskyttelsesgruppen for oligomeren ved hjelp av p-tiokresol og trietylamin.

Deretter fraskilles oligonukleotidet fra den faste bæreren ved 3 timers behandling med ammoniakk. En 2- til 3-dagers behandling av oligomeren med konsentrert ammoniakk avspaltes aminobeskyttelsesgruppene kvantitativt fra basene. Det oppnådde råproduktet renses ved høytrykks-væskekromatografi (HPLC) eller ved polyakrylamid-gelelektroforese.

På tilsvarende måte syntetiseres de øvrige oligonukleotidene.

c) Plasmidet ptrpE5-l (R.A. Hallewell et al., Gene 9 (1980) 27-47) omsettes med restriksjonsenzymene Hindlll og Sali

ifølge fabrikantens angivelser og det ca. 602 bpDNA-fragmentet fjernes. De syntetiserte oligonukleotidene (N4) og

(N5)

fosforyleres, inkuberes sammen ved 37°C og adderes ved hjelp av DNA-ligase til det buttendede DNA- for proinsulin (W. Wetekam et al., Gene 19 (1982) 179-183). Etter omsetning med Hindlll og Sali innbygges den nå forlengde proinsulin-DNA med enzymet T4 DNA-ligase kovalent i det åpnede plasmidet (fig.

2), hvorved plasmidet pH106/4 oppstår.

Plasmidet pH106/4 omsettes først nok en gang med Sali, de overlappende endene fullstendiggjøres med Klenow-polymerase til butte ender og deretter inkuberes med enzymet Mstl. Det isoleres et DNA-fragment på ca. 500 bp, som inneholder den samlede kodende delen av koinsulinet samt et ca. 210 bp stort avsnitt av D-proteinet fra trp-operonet av E. coli. DNA-fragmentet er buttendet og innføres i Stul-setet av plasmidetPH120/14, hvorved plasmidet pH154/25 oppstår (fig. 3). Dette er egnet til ekspresjon av et fusjonsprotein under kontroll av trp-operonet, hvori etter L'- og D'-peptidet aminosyresekvensen Ala-Ser-Met-Thr-Arg er anordnet, hvortil aminosyresekvensen av proinsulinet er tilsluttet.

Eksempel 2

Plasmidet pH154/25 (fig. 3) omsettes med restriksjonsenzymene BamHI og Xmalll. De overstående endene oppfylles ved hjelp av Klenow-polymerase og sammenknytes med T4 DNA-ligase. Man får plasmidet pH-254 (fig. 4) som egner seg til ekspresjon av et fusjonsprotein med aminosyresekvensen L', D'-proinsulin under kontroll av trp-promotoren. Plasmidet er noe mindre enn pH154/25, hvilket kan være fordelaktig.

Eksempel 3

Ved inkubering av plasmidet pH254 (eksempel 2; fig. 4) med restriksjonsenzymene Mlul og Sali settes et DNA-avsnitt med 280 bp fri, dette fraskilles. Restplasmidet omvandles med Klenow-polymerase til den buttendede formen og ringsluttes med DNA-ligase igjen kovalent. Derved oppstår plasmidet pH255 (fig. 4), som er egnet til innføring av et strukturgen ved et av restriks j onssetene Mlul, Sali og EcoRI. Under induksjonsbetingelser foregår dannelsen av et fusjonsprotein med L',D'-proteinet. Naturligvis kan ytterligere restrik-sjonsseter innføres i plasmidet pH255 ved hjelp av egnede forbindelsesledd.

Eksempel 4

Plasmidet pH154/25 (fig. 3) inkuberes med enzymene Mlul og EcoRI og det frigitte DNA-fragmentet (ca. 300p) fjernes. Restplasmidet oppfylles med Klenow-polymerase. Ring-slutningen foregår ved innvirkning av DNA-ligase. Plasmidet pH256 som oppstår (fig. 5) kan anvendes til innføring av strukturgener i EcoRI-setet.

Eksempel 5

Ved fjernelse av et 600 bp-fragment fra plasmidet pH256 (eksempel 4; fig. 5) med restriksjonsenzymene BamHI og Nrul får man plasmidet pH257 (fig. 5). For dette formål inkuberes pH256 først med BamHI og butte ender oppnås med Klenow-polymerase. Etter inkubering med Nrul og fraskillelse av 600 bp-fragmentet foregår dannelsen av pH257 etter inkubering med DNA-ligase.

Eksempel 6

Ved innføring av lac-repressoren (P.J. Farabaugh, Nature 274

(1978) 765-769) i plasmidet pKK 177-3 (Amann et al., Gene 25

(1983) 167) får man plasmidet pJF118. Dette omsettes med EcoEI og Sali og restplasmidet isoleres.

Fra plasmidet pH106/4 (fig. 2) oppnås ved innvirkning av Sali og inkubering med Mstl et ca. 495 bp stort fragment.

De syntetisk fremstilte oligonukleotidene (N6) og (N7)

fosforyleres og adderes med DNA-ligase til det butt-endende DNA-fragmentet. Ved omsetning med EcoRI og Sali settes de overlappende endene fri, hvilket tillater en ligering i det åpnede plasmidet pJF118.

Etter transformasjon av det på denne måten fremstilte hybridplasmidet i E. Coli 294 utvelges på grunnlag av størrelsen av restriksjonsfragmentene de riktige klonene. Dette plasmidet betegnes som pJ120 (fig. 6).

Ekspresjonen av fusjonsproteinet gjennomføres i ristekolbe på følgende måte: Fra en kultur som har stått over natten av E. coli 294-transformanter som inneholder plasmidet pJ120, i LB-medium (J.H. Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Gold Spring Harbor Laboratory, 1972 ) med 50 jjg/ml ampicillin startes en frisk kultur i forhold ca. 1:100 og veksten følges ved hjelp av OD-måling. Ved OD = 0,5 blandes kulturen med så mye isopropyl-e-D-galaktopyranosid (IPTG) at dens konsentrasjon utgjør 1 mM, og bakteriene fraskilles etter 150 til 180 minutter. Bakteriene kokes i 5 minutter i en bufferblanding (7M urinstoff, 0,1$ SDS, 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0) og prøvene påføres på en SDS-gelelektroforeseplate. Etter elektroforese oppnås det fra bakterier som inneholder plasmidet pJ120 et proteinbånd som tilsvarer størrelsen av det ventede fusjonsproteinet og som reagerer med antistoffer mot insulin. Etter isolering av fusjonsproteinet kan man ved bromcyanspaltning sette det ventede proinsulin-derivatet fri. Etter oppslutning av bakteriene (French Press; "Dyno-Muhle") og sentrifugering befinner L',D'-proinsulin-fusjonsproteinet seg i bunnfallet, slik at det allerede med supernatanten kan fraskilles betydelige mengder av øvrige proteiner.

De angitte induksjonbetingelsene gjelder for ristekulturer; ved større fermenteringer kan tilsvarende endrede OD-verdier og eventuelt lett endrede IPTG-konsentrasjoner være hensikts-messige .

Eksempel 7

Fra E. coli 294-transformanter, som inneholder plasmidet pH154/25 (fig. 3) fremstilles en kultur over natten i LB-medium med 50 jjg/ml ampicillin og som neste mål fortynnes i forhold ca. 1:100 i M9-medium (J.H. Miller, se ovenfor) med 2000 pg/ml casaminosyre og 1 pg/ml tiamin. Ved OD = 0,5 tilsettes indolyl-3-akrylsyre slik at sluttkonsentrasjonen utgjør 15 jjg/ml. Etter 2 til 3 timers inkubering frasentrifugeres bakteriene. En SDS-gelelektroforese viser ved det for fusjonsproteinet ventede setet et meget tydelig proteinbånd som reagerer med antistoffer mot insulin. Etter oppslutning av bakteriene og sentrifugering befinner L',D'-proinsulin-fusjonsproteinet seg i bunnfallet, slik at det også i dette tilfellet med supernatanten fjernes betydelige mengder av de øvrige proteinene.

Også i det foreliggende tilfellet gjelder de angitte induksjonsbetingelsene for ristekulturer. Fermenteringer i større volumer krever endrede konsentrasjoner av casaminosyrer, henholdsvis en tilsats av L-tryptofan.

Eksempel 8

Plasmidet pH154/25 (fig.3) åpnes med EcoEI og de overstående DNA-enkeltkjedene oppfylles med Klenow-polymerase. Det på denne måten oppnådde DNA inkuberes med enzymet Mlul og det for insulin kodende DNA skjæres ut av plasmidet. Ved gelelektroforetisk adskillelse fraskilles dette fragmentet fra restplasmidet og restplasmidet isoleres.

Plasmidet ifølge fig. 3 i det tyske utlegningsskrift nr.

3 429 430 (europeisk patentpublikasjon EP-A1 0 171 024) omsettes med restriksjonsenzymene Accl og Sali og DNA-fragmentet som inneholder hirudinsekvensen fraskilles. Etter oppfylling av de ovenstående endene av Sall-snittsetet med Klenow-polymerase ligeres DNA-segmentet med det syntetiske DNA av formel (N8)

Ligeringsproduktet inkuberes med Mlul. Etter inaktivering av enzymet ved 65 °C behandles DNA-blandingen med alkalisk kvegfosfatase i 1 time ved 37"C. Herpå fjernes fosfatasen og restriksjonsenzymet ved hjelp av fenolekstraksjon fra blandingen og DNA renses ved etanolutfelling. Det på denne måten behandlede DNA innføres med T4-ligase i det åpnede restplasmidet pH154/25, hvorved man oppnår plasmidet pK150, som blirkarakterisert vedrestriksjonsanalyse og DNA-sekvensering ifølge Maxam og Gilbert (fig. 7).

Eksempel 9

E. coli 294-bakterier, som inneholder plasmidet pK150 (fig. 7) får stå i LB-medium med 30 til 50 jjg/ml ampicillin over natten ved 37°C. Kulturen fortynnes med M9-medium som inneholder 2000 jjg/ml casaminosyrer og 1 jjg/ml tiamin, i forhold 1:100 og inkuberes ved 37°C under stadig omrøring. Ved en OD^qq = 0,5 hhv. 1 tilsettes indolyl-3-akrylsyre til en sluttkonsentrasjon på 15 pg/ml og det inkuberes 2 til 3 timer, henholdsvis 16 timer. Deretter frasentrifugeres bakteriene og oppsluttes i 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 6,5) under trykk. De tungt oppløselige proteinene frasentrifugeres og analyseres ved hjelp av SDS-polyakrylamid-elektroforese. Det viser seg at celler hvis trp-operon er indusert i området under 20.000 dalton, men over 14.000 dalton, inneholder et nytt protein som ikke finnes i ikke-induserte celler. Etter isolering av fusjonsproteinet og omsetning med bromcyan settes hirudin fri.

Eksempel 10

I det følgende beskrives konstruksjoner som tillater at det foran 5'-enden av trp-D-sekvensen innføres DNA-sekvenser som inneholder mest mulig tallrike gjenkjenningsseter for forskjellige restriksjonsenzymer, for å kunne innbygge trp-D-sekvensen mest mulig universelt i de forskjellige pro-karyotiske ekspresjonssystemene.

Plasmidene pUC12 og pUC13 (Pharmacia P-L Biochemicals, 5401 St. Goar: "The Molecular Biology Catalogue" 1983, Appendix, side 89) inneholder en poly-forbindelsessekvens, hvorved i plasmidet pUC13 mellom restriksjonssnittsetene for Xmal og SacI MstI-HindIII-trp-fragmentet fra plasmidet pl06/4 (fig. 2), fusjonert med HindIII-hirudin-SacI-fragmentet fra plasmid pK150 (fig. 7) skal innføres.

For dette formålet behandles DNA i plasmidet pUC13 først med restriksjonsenzymet Xmal. Endene av det lineariserte plasmidet oppfylles ved hjelp av Klenow-polymerase-reaksjon. Etter etanolutfelling behandles DNA med enzymet SacI og utfelles på nytt med etanol fra reaksjonsblandingen. DNA omsettes så i en vandig 1igeringsblanding med Mstl-Hindlll-trp-D-fragmentet, isolert fra plasmidet pH106/4 og Hindlll-Sacl-hirudinfragmentet, isolert fra plasmidet pK150, og T4 DNA-ligase.

Det på denne måten fremstilte plasmidet pK160 inneholder umiddelbart før begynnelsen av trp-D-sekvensen en multippel restriksjonsenzym-gjenkjenningssekvens, som omfatter snittstedene for enzymene Xmal, Smal, BamHI, Xbal, HincII, Sali, AccI, Pstl og Hindlll. Ved denne konstruksjonen oppnås videre etter 3'-enden av hirudin-sekvensen et EcoRI-snittsete (fig.8).

Eksempel 11

Plasmidet pH131/5 fremstilles (ifølge den tyske patent-publikasjonen nr. P 35 14 113.1, eksempel 1, fig. 1) på følgende måte:

Plasmidet ptrpLl (J.C. Edman et al., Nature 291 (1981) 503-506) åpnes med Clal og ligeres med det syntetisk fremstilte, selv-komplementære oligonukleotidet (N9)

Det på denne måten oppnådde plasmidet pH131/5 (fig. 9) åpnes ved det på denne måten innførte snittstedet for restriksjonsenzymet Ncol og de dannede overstående enkeltkjede-endene oppfylles ved hjelp av Klenow-polymerase-reaksjon. Det liniariserte, glattendede DNA etterskjæres nå med enzymet EcoRI og den største av de dannede DNA-sekvensene fraskilles ved hjelp av etanolutfelling fra den mindre sekvensen. Det på denne måten dannede restplasmid-DNA for plasmidet pH131/5 ligeres nå med et for trp-D'-hirudin kodende fragment fra pK160 ved T4-ligase-reaksjon. Dette fragmentet ble ved åpning av plasmidet med HincII og EcoRI avspaltet fra plasmidet pK160. Fragmentet fraskilles gelelektroforetisk fra restplasmidet og eineres deretter fra gelmaterialet. Ligeringsproduktet transformeres etter E. coli K12. Plasmid-DNA'et inneholdende kloner isoleres og karakteriseres ved restriksjonsanalyse og DNA-sekvensanalyse. Det på denne måten fremstilte plasmidet pK170 inneholder fusjonert til trp-operatoren en DNA-sekvens som koder for Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-trp-D'-(hirudin) (fig. 9).

Eksempel 12

Plasmidet pJF118 (eksempel 6) åpnes med EcoRI og de overstående DNA-endene overføres ved hjelp av Klenow-polymerase-reaksjon til glatte ender. Det på denne måten behandlede DNA skjæres deretter med enzymet Sali og fraskilles gelelektroforetisk fra det korte EcoRI Sall-fragmentet.

Plasmidet pK170 (eksempel 11) spaltes med Ncol og de overstående endene overføres ved hjelp av Klenow-polymerase til glatte ender. Plasmid-DNA fraskilles fra reaksjonsblandingen ved etanolutfelling og behandles med enzymene Hindlll og BamHI. Fra de dannede fragmentene isoleres to, nemlig Ncol (med oppfylt ende )-trpD'-HindIII-fragmentet og HindIII-hirudin-BamHI-fragmentet (tysk utlegningsskrift nr. 3 429 430). Begge fragmentene isoleres etter gelelektroforetisk adskillelse.

Videre isoleres BamHI-Sall-hirudinll-fragmentet ifølge fig. 2r i det tyske utlegningsskrift nr. 3 429 430. I en ligeringsreaksjon omsettes nå de fire fragmentene, nemlig pJF118-restplasmidet, NcoI-trpD'-HindIII-fragmentet, Hindlll-hirudin-BamHI-fragmentet og hirudinll-fragmentet med hverandre og det oppnådde plasmidet pK180 (fig. 10) transformeres etter E. coli K12-W 3110. Riktige plasmider finnes ved at et EcoRI-trpD'-hirudin-SalI-fragment kan påvises i plasmid-DNA. trpD'-hirudin-sekvensen er nå knyttet til tac-promotoren. Fusjonsproteinet eksprimeres ifølge eksempel 6.

Eksempel 13

Ved plasmidene som er avledet fra pBR322, som pH120/14 (eksempel 1, fig. 1), pH154/25 (eksempel 1, fig. 3), pH256 (eksempel 4, fig. 5), pK150 (eksempel 8, fig. 7) og pK170 (eksempel 11, fig. 9) befinner det seg - på fig.ene i urviserretning - mellom startkodonet for fusjonsproteinet og det nærmeste Hindlll-setet (tilsvarende Hindlll ved posisjon 29 i pBR322) et ytterligere PvuII-sete i området av fragmentet som inneholder trp-promotoren og -operatoren, men riktignok utenfor promotor-området.

Det er nå funnet at ved fjernelse av DNA-avsnittet som er begrenset av det omtalte PvuII-setet og PvuII-setet som tilsvarer posisjonen 2066 i pBR322, kan utbyttet av et klonet protein (eller fusjonsprotein) forhøyes betydelig.

I det følgende beskrives eksempelvis forkortelsen av plasmidet pH154/25 til pH154/25<*>, som for de øvrige proteinene kan foregå på tilsvarende måte (hvorved de forkortede plasmidene i ethvert tilfelle er merket med en stjerne): pH154/25 omsettes (ifølge fabrikantens angivelser) med PvuII hvorved tre fragmenter oppstår: Fragment 1: fra PvuII-restriksjonssetet for proinsulin inntil det PvuII-restriksjonssetet som tilsvarer posisjonen 2066 i pBR322,

fragment 2: fra PvuII-restriksjonssetet nær trp-promotoren

til PvuII-setet for proinsulin og

fragment 3: fra PvuII-setet nær trp-promotorfragmentet inntil det PvuII-setet som tilsvarer posisjonen 2066 i pBR322.

Fragmentene kan adskilles ved elektroforese på agarose og deretter isoleres (Maniatis "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor 1982).

Fragmentene 1 og 2 forbindes under "blunt end"-betingelser med enzymet T4 DNA-ligase. Etter transformasjon i E. coli 294 undersøker man i hvilke kolonier et plasmid med den full-stendige proinsulinsekvensen er tilstede og dermed fragmentene foreligger i den ønskede anordningen. Plasmidet pH154/25<*>er gjengitt i fig. 11.

Ved ekspresjonen, som foregår som beskrevet i de ovenfor angitte eksemplene, observeres en betydelig økning av fusj onsproteinandelen.

Eksempel 14

Plasmidet pH154/25<*>(eksempel 13, fig. 11) nedbrytes med Hindlll og Sali og det lille fragmentet (med proinsulinsekvensen) fraskilles gelelektroforetisk. Det store fragmentet isoleres og ligeres med det syntetiske DNA (N10)

Plasmidet plntl3 (fig.12) oppstår.

DNA (N10) koder for en aminosyresekvens som inneholder flere spaltningssteder for en kjemisk spaltning:

a) Met for bromcyan,

b) Trp for N-bromsuksinimid (NBS eller BSI ),

c) Asp-Pro for proteolytisk spaltning, hvorved det foran-stående Glu ytterligere svekker Asp-Pro-bindingen overfor

innvirkningen av syrer.

Innføringen av dette Hindlll-Sall-forbindelsesleddet (N10) i leserammen for et kodet polypeptid tillater altså de angitte mulighetene for en kjemisk avspaltning, avhengig av amino-syrerekkefølgen for det ønskede proteinet, henholdsvis dets følsomhet overfor spaltningsreagensene.

Figurene er ikke gjengitt i riktig målestokk.

Aminosyresekvens I

DNA-sekvens I

Claims (3)

1. Fusjonsprotein,karakterisert vedden generelle formelen Met-Xn-D<*->Y-Z hvori n er null eller 1, X er en sekvens på 1 til 12 genetisk kodbare aminosyrer, D' er en sekvens på ca. 70 aminosyrer i området for aminosyresekvensen 23-93 av D-peptidet i trp-operonet for E. coli, Y er en sekvens av en eller flere genetisk kodbare aminosyrer, som muliggjør en avspaltning av den følgende aminosyresekvensen Z, og Z er en sekvens av genetisk kodbare aminosyrer.

2. Fusjonsprotein ifølge krav 1,karakterisertved at n er 1 og X består av inntil 5 aminosyrer, hvorved fortrinnsvis Lys-Ala står N-terminalt i X og/eller at Y C-terminalt inneholder Met, Cys, Trp, Arg eller Lys eller en av gruppene (Asp)m-Pro hhv. Glu-(Asp )m-Pro eller Ile-Glu-Gly-Arg hvori m er 1, 2 eller 3, eller består av en av disse aminosyrene, eller en av disse gruppene og/eller at Z står for aminosyresekvensen fra humant proinsulin eller et hirudin.

3. DNA,karakterisert vedat det koder for fusjonsproteinet ifølge krav 1 eller 2, hvor følgende sekvens koder for D': for X koder DNA-sekvensen (kodende streng):

i nukleotidsekvensen til Y som koder for aminosyrene inneholder Y C-terminalt Met, Cys, Trp, Arg eller Lys eller en av gruppene

hvori m betyr 1, 2 eller 3, eller består av disse aminosyrene eller en av disse gruppene.