NO175317B

NO175317B - DNA-molekyl som koder et trombolytisk protein

Info

Publication number: NO175317B
Application number: NO874091A
Authority: NO
Inventors: Glenn R Larsen; Tim J Ahern
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 1986-01-31
Filing date: 1987-09-29
Publication date: 1994-06-20
Also published as: NO874091L; NO874091D0; NO175317C

Abstract

Trombolytiske proteiner med vevplasmlnogentype-aktivitet. Proteinene kjennetegnes ved modifisering innen 94 aminosyre N-termintisen, og/eller ved Arg-275, og/eller ved et eller flere av de N-forbundne glykosyleringsseter.Metoder for fremstilling av disse proteiner beskrives på samme måte som terapeutiske preparater som inneholder dem.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et DNA-molekyl som koder et trombolytisk protein med vevplasminogenaktivatortype-aktivitet.

Disse proteiner er aktive trombolytiske midler som har forbedrede fibrinolytiske profiler i forhold til nativt humant t-PA. Dette kan manifesteres som en øket affinitet til fibrin, redusert reaktivitet med inhibitorer av t-PA, hurtigere trombolysehastighet, øket fibrinolytisk aktivitet og/eller forlenget biologisk halveringstid. Det er også ment at proteinene ifølge oppfinnelsen lettere kan fremstilles i mere homogen form enn det native human t-PA kan fremstilles. En forbedret total farmakokinetisk profil er karakteristisk for proteinene.

Strukturen av nativt human t-PA kan ses på som omfattende en amino (N-) terminus på ca. 91 aminosyrerester, to såkalte "kringle"-områder og ved karboksy-terminus, et serinprotease-typeområde. Søkeren har funnet at N-terminus inneholder flere underområder som spiller funksjonelle roller, blant annet i fibrinbinding og i in vivo klaring av proteinet. I den senere tid er gjenvinningen av en annen form av t-PA som mangler den native N-terminus og det første kringleområdet angitt, se EP-publ. 0196920. I henhold til denne rapport er den snablede form av t-PA som begynner med Ala-160 i nativ human t-PA, fibrinolytisk aktiv.

Som beskrevet i større detalj ovenfor, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye proteinanaloger av human t-PA som bibeholder både kringleområdene av nativ human t-PA, men som også inneholder modifikasjoner innen N-terminus. Mens modifikasjonene i visse utførelsesformer involverer ute-lukkelser i N-terminus, forblir det første kringleområdet tilbake intakt og N-terminalutelatelsen er aldri større enn 94 aminosyrer. De fleste utførelsesformer involverer signifi-kant mindre utelatelse og/eller aminosyreerstatning. Ved å bibeholde mer av strukturen av nativ human t-PA tar man sikte på at proteinene ifølge oppfinnelsen selektivt bibeholder mer av de ønskede biologiske aktiviteter for nativ human t-PÅ og kan være mindre immunogene enn de mer drastisk modifiserte analoger av t-PA. Derfor har proteinene ifølge oppfinnelsen forbedret fibrinolytisk og farmakokinetisk profil i forhold til både nativ human t-PA og den snablede Ala-160 t-PA, så vel som andre modifiserte former av t-PA.

Polypeptidgraden for naturlig human t-PA inkluderer også fire konsensus-Asn-forbundede glykosyleringsseter. Det er vist at to av disse seter karakteristisk glykosyleres i t-PA-form fra melanom-avledede pattedyrceller, det vil si ved Asn-117 og Asn-448. Asn-184 glykosyleres noen ganger og Asn-218 blir karakteristisk ikke glykosylert. t-PA fra melanom-avledede pattedyrceller, for eksempel Bowes-celler, kalles også i foreliggende beskrivelse som "nativ" eller "naturlig" human t-PA.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse et DNA-molekyl som koder et trombolytisk protein med vevplasminogen-aktivatortypeaktivitet, og molekylet karakteriseres ved en aminosyresekvens i det vesentlige den samme som peptidsekvensen i human t-PA, der: a) sekvensen fra og med Cys-6 til og med Ile-86 er utelatt, b) minst et av de konsensus-N-forbundne glykosyleringsseter er modifisert til annet enn et konsensus-N-forbundet N-glykosyleringssete, og hvor eventuelt c) det er foretatt modifisering av enzymatisk spaltingssete Arg-175/Ile-276 ved at Arg er utelatt eller

erstattet av en annen aminosyre.

I en utførelsesform av oppfinnelsen angår den et DNA-molekyl som beskrevet ovenfor og som karakteriseres ved at det konsensus-N-forbundne glykosyleringssetet ved ASn-117 er modifisert slik at Asn-117 er erstattet med Gln-117.

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen angår den et DNA-molekyl som beskrevet ovenfor og som karakteriseres ved at de tre konsensus-N-forbundne glykosyleringsseter ved aminosyreposisjonene 117-119, 184-186 og 448-450 er modifisert slik at Asn-117, Asn-184 og Asn-448 er erstattet med Gin.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen et DNA-molekyl som beskrevet ovenfor og som karakteriseres ved at a) sekvensen fra og med Gly-(-3) til og med Thr-91 er utelatt og b) minst et av de konsensus-N-forbundne glykosyleringsseter er modifisert til annet enn et konsensus-N-forbundet glykosyleringssete.

Proteinene ifølge oppfinnelsen skiller seg i struktur fra human t-PA idet de inneholder modifikasjoner i peptidsekvensen (i) ved opptil tre av de Asn-forbundne glykosyleringsseter som er tilstede i nativ t-PA; (ii) i N-terminus av proteinene tilsvarende den 94 aminosyre mature N-terminus av nativ t-PA; og/eller (iii) ved det proteolytiske spaltingssete som spenner over Arg-275 og Ile-276. Disse trekk ved proteinene ifølge oppfinnelsen er beskrevet i større detalj nedenfor. Ikke desto mindre de forskjellige modifikasjoner blir nummereringen av aminosyrene som vist i en-bokstavskodesekvensen i tabell 1 bibeholdt.

A. Modifiseringer ved N- terminus

I et trekk ved oppfinnelsen blir proteinene karakterisert ved utelatelse av 1-95 aminosyrer innen peptidområdet som spenner over Gly-(-3) eller Ser-1 opptil Thr-91, i forhold til nativ human t-PA. I en utførelsesform blir for eksempel Cys-51 til Asp-87 i nativ t-PA utelatt. I to andre spesifikke ut-førelsesf ormer blir Cys-6 til og med Ser-50 henholdsvis Cys-6 til og med Ile-86 utelatt. I andre utførelsesformer er mer konservative modifikasjoner tilstede i proteinenes N-terminalområde. For eksempel inneholder visse proteiner ifølge oppfinnelsen en eller flere aminosyre-utelatelser eller -substitusjoner innen et eller flere av de følgende, mer adskilte underområder:

Disse og andre modifikasjoner innen den T-terminus som overspenner Gly-(-3) til Thr-91 er beskrevet i større detalj nedenfor.

B. Modifiseringer ved N- forbundne glykosylerlngsseter

Proteinvariantene ifølge oppfinnelsen behøver videre ikke inneholde noen N-forbundne karbohydratdeler eller kan være kun partielt glykosylerte i forhold til naturlige human t-PA. Et "partielt glykosylert" protein, slik dette uttrykket her benyttes, betyr et protein som inneholder færre N-bundne karbohydratdeler enn det fullt ut glykosylerte native human t-PA. Dette fravær av glykosylering eller kun partiell glykosylering stammer fra aminosyresubstitueringen eller utelatelsen ved en eller flere av de konsensus-N-forbundne glykosyleringserkjennelsesseter som er tilstede i det native t-PA-molekyl. Søkeren har funnet at variantproteiner ifølge oppfinnelsen med en slik modifikasjon på et eller flere N-forbundne glykosyleringsseter bibeholder t-PA-type trombolytisk aktivitet med større fibrinolytisk aktivitet i visse tilfeller, lettere kan produseres i mer homogen form enn nativ t-PA og i mange tilfeller ha lengre in vivo halverings-tider enn nativ t-PA.

N-forbundne glykosyleringserkjenningsseter antas idag å omfatte tripeptidsekvenser som spesifikt erkjennes av de egnede cellulære glykosyleringsenzymer. Disse tripeptidsekvenser er enten asparagin-X-treonin eller asparagin-X-serin, der X vanligvis er en hvilken som helst aminosyre. Deres lokalisering innen t-PA peptidsekvensen er vist i tabell 1. Et antall aminosyresubstitueringer eller utelatelser i en eller flere av de tre posisjoner for et glykosyleringserkjennelsessete resulterer ikke-glykosy-leringer av den modifiserte sekvens. Som et eksempel er både Asn-117 og Asn-184 i t-PA begge erstattet med Thr i en utførelsesform og med Gin i en annen. I minst et tilfelle av den doble Gln-erstaning burde det resulterende glykoprotein, (Gln-117-Gln-184), inneholde kun den ene N-forbundne karbohydratdel (ved Asn-448) i stedet for to eller tre slike deler slik tilfellet er i nativ t-PA. Fagmannen vil her erkjenne at analoge glykoproteiner med den samme Asn-448-monoglyko-sylering kan fremstilles ved å utelate aminosyrer eller substitusjonen av andre aminosyrer i posisjonene 117 og 184 og/eller ved å utelate eller å substituere en eller flere aminosyrer ved andre posisjoner innen de respektive glykosylerings-erkjennelsesseter, for eksempel ved Ser-119 og Ser-186 som nevnt ovenfor, og/eller ved sentrifugering, eller mere spesielt ved utelatelse, på et eller flere av "X"-stedene i tripeptidsetene. I en annen utførelsesform blir Asn i posisjonene 117, 184 og 448 erstattet med Gin. Disse resultatvarianter skulle ikke inneholde noen N-bundne karbohydratdeler, men to eller tre slike deler slik tilfellet er i nativ t-PA. I andre utførelsesformer er potensielle glykosylerlngsseter modifisert individuelt, for eksempel ved å erstatte Asn for eksempel med Gin i posisjon 117 i en idag foretrukket utførelsesform, i posisjon 184 i en annen utførelsesform og i posisjon 448 i ytterligere en utførelses-form. Foreliggende oppfinnelse omfatter slike ikke-glykosylerte, monoglykosylerte, diglykosylerte og triglykosylerte t-PA-varianter.

Eksempelvise modifikasjoner på en eller flere av disse tre konsensus-N-forbundne glykosyleringssekvenser, R<*>, R<* og R^, som funnet i forskjellige utførelsesformer av oppfinnelsen, er angitt nedenfor:

C. Modifisering av Arg- 275/ Ile- 276- spaltingssete

I henhold til et trekk ved oppfinnelsen er variantene eventuelt modifisert ved det proteolytiske spaltingssete som spenner Arg-275 og Ile-276 ved utelatelse av Arg-275 eller substituering av en annen aminosyre, fortrinnsvis en aminosyre forskjellig fra Lys eller His. Thr er idag en spesielt foretrukket erstatningsaminosyre for Arg-275 i forskjellige utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse. Proteolytisk spalting ved Arg-275 av nativ t-PA gir det såkalte "to-ls jede"-molekyl som kjent i denne teknikk. Proteiner ifølge oppfinnelsen som karakteriseres ved modifisering på dette spaltingssete kan lettere fremstilles i mer homogen form enn det tilsvarende protein uten spaltingssete-modifiseringen og kan muligens på meget viktig måte ha en forbedret fibrinolytisk profil og farmakokinetiske egenskaper.

I en utførelsesform karakteriseres proteinene ved en peptidsekvens i det vesentlige den samme som peptidsekvensen for human t-PA der Arg-275 er utelatt eller erstattet med en annen aminosyre, fortrinnsvis forskjellig fra lysin eller histidin, og minst en av konsensus-Asn-bundne glykosylerlngsseter er utelatt ellerm modifisert til andre enn en konsensus-Asn-forbundet glykosyleringssekvens.

Eksempler på proteiner av denne utførelsesform er angitt i tabell 1 nedenfor. Med uttrykket "karakterisert ved en peptidsekvens i det vesentlige den samme som peptidsekvensen til human t-PA", slik det her benyttes, menes peptidsekvensen til human t-PA, en peptidsekvens som er kodet av en DNA-sekvens som koder human t-PA eller en DNA-sekvens i stand til å hybridisere til denne under stringente hybridiserings-betingelser.

Således inkluderer proteinene ifølge oppfinnelsen analoger av t-PA som kjennetegnes ved de forskjellige modifikasjoner eller kombinasjoner av modifikasjoner som her beskrevet, og som også kan inneholde andre variasjoner slik som alleliske variasjoner eller ytterligere utelatelser, substitueringer eller innskudd av aminosyrer som fremdeles bibeholder trombolytisk aktivitet, så lenge som det DNA som koder disse proteiner (før modifiseringen ifølge oppfinnelsen) fremdeles er i stand til hybridisering til en DNA-sekvens som koder human t-PA under stringente betingelser. En andre utførelsesform er proteinene karakterisert ved en peptidsekvens i det vesentlige den samme som peptidsekvensene til human t-PA der en eller flere aminosyrer utelates i N-terminalområdet fra Gly-(-3) til og med Thr-91 og hvori (a) en eller flere Asn-forbundne glykosylerlngsseter eventuelt er utelatt eller på annen måte modifisert til andre enn et konsensus-Asn-forbundet glykosyleringssete, og/eller (b) Arg-275 eventuelt utelates eller erstattes med en annen aminosyre, fortrinnsvis forskjellig fra lysin eller histidin. Eksempler på proteiner i henhold til denne utførelsesform er vist nedenfor:

Illustrerende proteiner med N-terminalutelatelser

De følgende proteiner har den peptidsekvens som er vist i tabell 1, der R<1>, R<2> og R<3> betyr villtype-tripeptid-sekvensene, men der N-termini (Gly-(-3) til og med Thr-91) er erstattet med:

Denne utførelsesform inkluderer en subgenus av proteiner der 1 til ca. 94 aminosyrer er utelatt fra området Gly-(-3) til og med Thr-91 og en eller flere av de Åsn-forbundne glykosylerlngsseter er utelatt eller på annen måte modifisert til noe annet til en konsensus-Asn-forbundet glykosyleringssekvens som beskrevet tidligere. Videre inkludert er en subgenus av forbindelser der 1 til ca. 94 amiosyrer er utelatt fra området Gly-(-3) til og med Thr-91, og der Arg-275 er utelatt eller erstattet med en annen aminosyre, fortrinnsvis forskjellig fra lysin eller histidin. En ytterligere subgenus av denne utførelsesform karakteriseres ved utelatelse av 1 til ca. 94 aminosyrer fra området Gly-(-3) til og med Thr-91, utelatelse eller modifisering av en eller flere av de Asn-forbundne glykosylerlngsseter (se for eksempel tabellen på side 6) og utelatelse av Arg-275 eller erstatning av denne med en annen aminosyre. Eksempler på proteiner av disse subgenera er angitt i tabellene 2 og 2.5 nedenfor.

Denne utførelsesvei inkluderer også en subgenus av proteiner der N-terminal-utelatelsen omfatter en utelatelse av 1 til ca. 45 amiosyrer fra området Ser-1 til og med Ser-50. Også inkludert er en subgenus av proteiner der 1 til ca. 45 aminosyrer er utelatte fra området Ser-1 til og med Ser-50 og et eller flere glykosylerlngsseter er modifisert som beskrevet tidligere. En ytterligere subgenus omfatter proteiner med en utelatelse av 1 til ca. 45 aminosyrer fra området Ser-1 til og med Ser-50, hvori Arg-275 er utelatt eller erstattet med en annen aminosyre. I tillegg inkludert er en subgenus med en utelatelse av 1 til ca. 45 aminosyrer fra området Ser-1 til og med Ser-50 og der begge av (a) en eller flere glykosylerlngsseter, og (b) Arg-275, eventuelt er modifisert som angitt ovenfor. Eksempler på proteiner i disse subgeneri er angitt i tabell 3 nedenfor, så vel som i

tabellene 2 og 2.5.

Spesifikke proteiner ifølge oppfinnelsen kan betegnes ved en tredelt angivelse omfattende et forbindelsesnummer fra tabell 2 fulgt av en angivelse av N-terminus og så identifi-seringen av posisjon 275. For eksempel betyr forbindelse nr. 2-ll/N-6/Arg et protein der 3-glykosyleringssetet er utelatt ("2-11", se tabell 2), C-36 til og med C-43 er utelatt (N-terminus #N-6) og Arg-275 er bibeholdt.

Tabell 3: Eksempler på proteiner med en utelatelse av 1 -

ca. 45 aminosyrer i området Ser-1 til og med Ser-50 og en modifikasjon av en eller begge av (a) Arg-275 og (b) i det minste et N-forbundet glykosyleringssete (når det gjelder den generelle sekvens, se tabell 1).

11 lustrerende proteiner er son, definert i tabell 2, men med de falgende N-termini som erstatninger for villtypesekvensen av Gly-(-3) til og med Thr-91:

Under henvisning til de modifiserte N-termini som angitt i tabell 3, skal det være klart at mer enn en aminosyre kan utelates. Der flere aminosyrer er utelatt, kan de være nær hverandre eller være separert av en eller flere aminosyrer. I angivelsen av forbindelser med slike N-termini antydes størrelsen av utelatelsen ved en "An" der "n" er antallet utelatte aminosyrer. For eksempel kan N-terminuis #24 der en aminosyre er utelatt som vist i tabell 3, kalles "N-24A1", der to aminosyrer er utelatt, for eksempel S-l og Y-2 kalles N-terminus en "N-24A2", og så videre. Der kombinasjoner av utelatelser gjennomføres, for eksempel der S-l, Y-2 og 1-5 er utelatt, kan N-terminus angis som "N-24A2, N-28A1". Som angitt i teksten efter tabell 2.5, blir spesifikke forbindelser angitt ved en tredelt kode som omfatter et forbindelsesnummer fra tabell 2 fulgt av en angivelse av N-terminuselement #, for eksempel fra tabell 2.5, med en derpå følgende identifisering av status for posisjon 275. Forbindelse 2-26/N-24A2, N-28A1/- angir således proteinet det alle tre glykosylerlngsseter; R-275; S-l, Y-2 og 1-5 er utelatt. Denne utførelsesform inkluderer ytterligere en subgenus av proteiner der 1 til ca. 41 aminosyrer er utelatte fra området Cys-51 til og med Thr-91. Proteiner i denne subgenus kan eventuelt modifiseres slik at Arg-275 er utelatt eller erstattet med en annen aminosyre, fortrinnsvis forskjellig fra lysin eller histidin. Proteiner av denne subgenus kan som alternativ til eller i tilegg til modifiseringen ved Arg-275, modifiseres slik at (a) en eller flere N-forbundne glykosylerlngsseter gis avkall på som beskrevet ovenfor, og/eller (b) eller flere aminosyrer utelates i området GLy-(-3) til og med Ser-50. Eksempler på proteiner av denne subgenus tilsvarer de som er angitt i tabellene 2 og 3, men inneholder

N-termini slik som de som er angitt i tabell 4 nedenfor.

Tabell 4: Eksempler på proteiner med en utelatelse av 1 til ca. 41 amiosyrer fra området Cys-51 til og med Thr-91 (når det gjelder den generelle sekvens, se tabell 1).

Illustrerende proteiner er som angitt i tabell 2, men med de følgende N-termini i stedet for villtypesekvensene i Gly-(-3) til og med Thr-91:

Under henvisning til tabell 4 ovenfor, skal det påpekes at flere underklasser av proteiner beskrives. For eksempel angis det proteiner inneholdende en utelatelse av 1 til 37 aminosyrer (individuelt, konsekutivt eller i kombinasjon) fra Cys-51 til og med Asp-87, på samme måte som proteinene inneholdende en utelatelse av 1 til 37 aminosyrer fra Cys-51 til og med Arg-87 og en utelatelse av en eller flere aminosyrer innen området Gly-(-3) til og med Cys-51 (se N-76). Under henvisning til forbindelser inneholdende en N-terminus valgt blant N-termini N-76 til og med N-lll skal det være klart at mer enn en aminosyre kan utelates. For eksempel kan N-77 der en aminosyre er utelatt, slik som vist i tabell 4, henvises til som "N-77A1". Der seks aminosyrer er utelatt, for eksempel S-52 til og med F-57, henvises denne N-terminus til som "N-77A6", og så videre. Spesifikke proteiner er angitt som beskrevet i henhold til tabellene 2 og 3. Eksempler der tre glykosylerlngsseter og Arg-275 er utelatt, er vist nedenfor:

Illustrerende forbindelser der ingen modifikasjoner er tilstede på glykosyleringssetene, men som inneholder forskjellige utelatelser, er vist nedenfor:

Illustrerende forbindelser med de samme utelatelser som ovenfor, men som også er modifisert på det første N-forbundne glykosyleringssetet, her ved erstatning av Asn-117 med Gin, er angitt nedenfor:

2-l/N-424/Arg

2-l/N-425/Arg

2-l/N-426/Arg

2-l/N-427/Arg

2-l/N-428/Arg

2-1/N-63A2,N-92A3/Arg

2-1/N-63A1,N-92A2/Arg

2-1/N-63A1,N-92A1/Arg

Illustrerende forbindelse med de samme utelatelser som ovenfor, men som også er modifisert på alle tre glykosylerlngsseter, her ved erstatning av Asn<*>er med Gin'er, er angitt nedenfor: 2-7/N-424/Arg

2-7/N-425/Arg

2-7/N-426/Arg

2-7/N-427/Arg

2-7/N-428/Arg

2-7/N-63A2,N-92A3/Arg

2-7/N-63A1,N-92A2/Arg

2-7/N-63A1,N-92Al/Arg

Således inkluderer denne utførelsesform videre en subgenus av proteiner, der en eller flere utelatelser på mindre enn ca. 20 aminosyrer er tilstede i området Gly-(-3) til og med Thr-91. Proteiner av denne subgenus kan også modifiseres ved Arg-275 og/eller ved en eller flere av de Asn-forbundne glykosylerlngsseter. Eksempler på proteiner av denne subgenus tilsvarer de som er angitt i tabellene 2 til og med 4, men inneholder i stedet for den beskrevne villtype N-terminus en N-terminus av den type som er beskrevet i tabell 5 nedenfor. Ytterligere eksempler på forbindelser av denne subgenus er også angitt ovenfor ved deres tredelte kodeangivelse. I en tredje utførelsesform karakteriseres proteinene ved en peptidsekvens i det vesentlige den samme som peptidsekvensen til human t-PA der forskjellige aminosyrer innsettes i stedet for 1-94 av aminosyrene i området Gly-(-3) til og med Thr-91. Denne utførelsesform inkluderer en subgenus av forbindelser som karakteriseres ved erstatning av en eller flere aminosyrer innen den ovenfor nevnte N-terminus og ved modifisering ved Arg-275 som nevnt tidligere. Videre inkludert er en subgenus av forbindelser som karakteriseres ved en ovenfor nevnte erstatning av en eller flere aminosyrer innenfor denne N-terminus, og modifisering, som tidligere nevnt, ved en eller flere av de konsensus-Asn-forbundne glykosylerlngsseter. En ytterligere subgenus av denne utførelsesform karakteriseres ved substituering av en eller flere aminosyrer innen denne N-terminus og modifisering som tidligere beskrevet, både ved Arg-275 og ved en eller flere av de N—forbundne glykosylerlngsseter. I et aspekt ved denne utførelsesform ligger aminosyre-substitueringen eller —substitueringene innen området Gly-(-3) til og med Ser-50, med eller uten modifisering ved Arg-275 og/eller en eller flere av de N-forbundne glykosylerlngsseter. I et annet trekk ved oppfinnelsen ligger aminosyre-substitueringen(e) innen området Cys-51 til og med Thr-91, også her med eller uten modifisering ved Arg-275 og/eller en eller flere av de N-forbundne glykosylerlngsseter. I et ytterligere trekk blir 1 til ca. 11, fortrinnsvis 1 til ca. 6 aminosyrer erstattet innen et eller flere av de følgende områder, igjen med eller uten annen ovenfor nevnte modifisering:

I et ytterligere trekk ved oppfinnelsen, skjer substituering i en eller flere av de følgende områder: R-7 til og med S-20, W-21 til og med Y-33, N-37 til og med 0-42 samt H-44 til og med S-50. I et ytterligere trekk ved denne utførelsesform, modifiseres N-terminus nok en gang ved substituering av 1 til ca. 11, og fortrinnsvis 1 til ca. 6 aminosyrer i en eller flere av de ovenfor angitte områder, og modifiseres ytterligere ved utelatelse av 1 til 93 og fortrinnsvis 1 til ca.

45 og aller helst 1 til ca. 15 aminosyrer.

Illustrerende aminosyre-substitueringer er vist i tabell 6-A nedenfor, og eksempelproteiner er angitt i tabell 6-B. Av erstatningsaminosyrene for R-40, A-41 og 0-42 som angitt i Tabell 6-A, er S en foretrukket erstatning for R-40, V og L foretrukne erstatninger for A-41 henholdsvis Q-42. Det skal påpekes at proteiner ifølge oppfinnelsen som omfatter substitueringene identifisert for R-40, A-41 og 0-42 i tabell 6-A på det nåværende tidspunkt er foretrukket alene, eller, som i andre aspekter og subgeneri ifølge oppfinnelsen, i kombinasjon med andre substitueringer og/eller utelatelser innen N-terminus og/eller modifiseringer på R-275 og/eller minst et glykosyleringssete. I den grad de foreliggende proteiner er modifisert ved substituering i stedet for utelatelse, bibeholder proteinene mer av den native t-PA-konformasjon og bibeholder selektivt mer av de ønskede biologiske egenskaper til nativt t-PA.

Tabell 5: Proteineksempler med en eller flere utelatelser på

mindre enn ca. 20 aminosyrer innen området Gly-(-3) til og med Thr-91 (for den generelle sekvens, se tabell 1).

Illustrerende proteiner er definert i tabell 2, men med de følgende N-termini i stedet for villtypesekvensen i Gly-(-3) til og med Thr-91:

Og under henvisning til tabellene 2.5, 3 og 4: N-l

N-2

N-6 til og med N-ll N-15 til og med N-17 N-24A1 til og med Al9 N-27A1 til og med Al9 N-44A1 til og med Al9 N-73A1 til og med Al9 N-95A1 til og med Al9 NlllAl til og med A5

Tabell 6-B: Proteineksempler Inneholdende substituering for en eller flere aminosyrer innen området Gly-(-3) til og med Thr-91 (for den generelle sekvens, se tabell 1)

Proteiner ifølge oppfinnelsen som omfatter aminosyre-substituering kan angis ved en tredelt kode som beskrevet tidligere. Det skal selvfølgelig være klart at mer enn en villtype-aminosyre kan erstattes. Ved å angi forbindelsene med slike N-termini søkes det å indikere antall substitueringer ved "sn" der "n" er antallet erstattede aminosyrer, for eksempel med erstatning av aminosyre som (men ikke begrenset til) de som er angitt i tabell 6-A. For eksempel angir N-terminus #N-122sl N-terminus 122 som angitt i tabell 6-B, mens N-terminus #N-122s4 angir den N-terminus hvor S-l er erstattet med G og de følgende tre villtype-aminosyrer er erstattet med andre aminosyrer. Proteiner ifølge denne utførelsesform inneholdende flere aminosyre-substitueringer kan angis ved en streng av N-terminus-angivelser som indikerer spesifikke erstatninger, det hele som følger:

Illustrerende forbindelser med flere N-terminal-substitueringer med Asn-117 erstattet av Gin og Arg-275 erstattet med Thr:

En subgenus av spesiell interesse karakteriseres ved erstatning av en eller flere av Y-67 til og med S-69 med eventuell utelatelse av, og/eller erstatning for, en eller flere aminosyrer fra og med Gly-(-3) til og med L-66, med eller uten modifiseringer som angitt ovenfor på et eller flere av glykosyleringssetene og/eller på Arg-275.

I et trekk ved oppfinnelsen inneholder proteinene minst en såkalt "kompleks karbohydrat"-sukkerdel som er karakteristisk for pattedyr-glykoproteiner. Som eksemplifisert i større detalj nedenfor kan slike "kompleks karbohydrat"-glykoproteiner fremstilles ved eksprimering av et DNA-molekyl som koder den ønskede polypeptidsekvens i pattedyrvertsceller. Egnede pattedyrvertsceller og metoder for transformering, dyrkning, forsterkning, bedømmelse og produktproduksjon og -rensing er kjent i denne teknikk, det skal henvises til for eksempel Gething and Sambrook, "Nature" 293:620-625 (1981), eller alternativt, Kaufman et al., "Molecular and Cellular Biology", 5 (7):1750-1759 (1985) eller Howley et al. i US-PS 4.419.446.

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen involverer t-PA-varianter som angitt ovenfor hvori hver karbohydratdel er en behandlet del av det opprinnelige doicol-forbundne oligo-sakkarid som er karakteristiske for insektcélleproduserte glykoproteiner i motsetning til en "kompleks karbohydrat"-substituent som er karakteristiske for pattedyr-glykoproteiner, inkludert pattedyr-avledet t-PA. Slike insekt-celletype-glykosylering kalles her for enkelhets skyld "høymannose"-karbohydrat. For foreliggende søknads formål er komplekse og høymannose-karbohydrater som definert av Kornfeld et al., "Ann. Rev. Biochem.", 54:631-64 (1985). "Høymannose"-varianter i henhold til oppfinnelsen karakteriseres ved en variantpolypeptidryggrad som beskrevet ovenfor og som inneholder minst et opptatt N-forbundet glykosyleringssete. Slike varianter kan fremstilles ved eksprimering av en DNA-sekvens som koder en variant i insektsvertscellene. Egnede slike så vel som metoder og stoffer for transformering/transfektering, insektscellekulturer, bedømmelse og produktproksjon og -rensning som kan benyttes ved å gjennom-føre dette trekk ved oppfinnelsen er kjent i teknikken. Glykoproteinet som fremstilles på denne måte skiller seg også fra naturlig t-PA og fra t-PA som tidligere er fremstilt ved rekombinante konstruksjonsteknikker i pattedyrceller idet variantene ved dette aspekt av oppfinnelsen ikke inneholder terminal sialinsyre eller galaktosesubstituenter på karbo-hydratdelene eller andre protelnmodifikasjoner som er karakteristiske for pattedyravledede glykoproteiner.

Proteinene ifølge oppfinnelsen som ikke inneholder N-forbundne karbohydratdeler kan også fremstilles ved å eksprimere et DNA-molekyl som koder den ønskede variant, for eksempel forbindelsene 1-6 til og med 1-11 i tabell 1, i pattedyr-, insekt-, gjær- eller bakterievertsceller, der eukaryotiske vertsceller idag er foretrukket. Som antydet ovenfor er også egnede pattedyr- og insektsvertsceller og i tillegg egnede gjær- og bakterievertsceller så vel som metoder og stoffer for transformerlng/transfektering, celledyrking, bedømmelse og produktproduksjon og -rensning som kan benyttes ved dette trekk i oppfinnelsen, også kjent i teknikken.

I tillegg omfatter, slik det burde fremgå for fagmannen, foreliggende oppfinnelse også andre t-PA-varianter som karakteriseres ved, i stedet for av aminosyre-utelatelse innen området Gly-(-3) eller Ser-1 til og med Thr-91, av en eller flere aminosyre-substitueringer innen dette området, spesielt i området Arg-7 til og med Ser-50, eller ved en kombinasjon eller utelatelse og substituering. cDNA'er som koder disse forbindelser kan lett fremstilles, for eksempel ved fremgangsmåter som er sterkt analoge de mutagenese-prosedyrer som her beskrives ved bruk av egnede mutageneseoligonukleotider. Disse cDNA'er kan eventuelt mutageniseres på en eller flere av kodonene for R<1>, R<2> og R<3> og/eller Arg-275, og kan skytes inn i eksprimeringsvektorer og uttrykkes i vertsceller ved de heri beskrevne metoder. Det er klart at disse proteiner vil dele de fordelaktige farmakokinetlske egenskaper til andre forbindelser ifølge oppfinnelsen og muligens unngå utilbørlig antigenisitet ved administreringen i farmasøytiske preparater analoge de som her er beskrevet.

Slik det fremgår av det ovenfor anførte, fremstilles alle varianter av oppfinnelsen ved rekombinant teknikker ved bruk av DNA-sekvenser som koder analoger som også kan inneholde færre eller eventuelt ingen potensielle glykosylerlngsseter i forhold til naturlig human t-PA og/eller utelatelse eller erstatning av Arg-275. Slike DNA-sekvenser kan fremstilles ved konvensjonell seterettet mutagenese av DNA-sekvenser som koder t-PA.

DNA-sekvensene som koder t-PA er klonet og karakterisert, se for eksempel D- Pennica et al., "Nature" (London) 301:214

(1983) samt R. Kaufman et al., "Mol. Cell. Biol.", 5(7):1750

(1985). Et klon, ATCC 39891 som koder en trombolytisk aktiv t-PA-analog er unik idet den inneholder en Met-rest i posisjon 245 i stedet for Val. Karakteristisk koder DNA-sekvensen en ledersekvens som prosesseres, det vil si erkjennes og fjernes av vertscellen, fulgt av aminosyreresten i fullengdeproteinet, ut fra Gly.Ala.Arg.Ser.Tyr.Gin.. Avhengig av medium og vertscelle der DNA-sekvensen eksprimeres, kan det således fremstilte protein begynne med Gly.Ala.Arg-aminoterminus eller prosesseres ytterligere slik at de første tre aminosyrerester proteolytisk fjernes. I det sistnevnte tilfellet har det mature protein en aminoterminus omfattende: Ser.Tyr.Gln.Leu.... t-PA-varianter med disse aminotermini er trombolytisk aktive og omfattes av oppfinnelsen. Varianter ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også proteiner med enten Met-245 eller Val-245, så vel som andre varianter, for eksempel allelinvariasjoner eller andre aminosyresubstitueringer eller utelatelser, som fremdeles bibeholder trombolytisk aktivitet.

Oppfinnelsen omfatter også forbindelser som beskrevet ovenfor som inneholder den ytterligere modifikasjon i polypeptid-området over Asn-218 til og med Thr-220. Spesifikt blir forbindelser i denne utførelsesform ytterligere kjennetegnet ved en aminosyre forskjellig fra Asn eller en peptidbinding i posisjon 218 og/eller en aminosyre forskjellig fra Pro eller en peptidbinding i posisjon 219 og/eller en aminosyre forskjellig fra Ser eller Thr eller en peptidbinding i posisjon 220. Forbindelser ifølge denne utførelsesform mangler således det konsensus-N-forbundne glykosyleringssetet som er karakteristisk, ikke glykosyleres i t-PA fremstilt av melanom-avledede pattedyrceller.

Som nevnt ovenfor kan DNA-sekvenser som koder individuelle varianter ifølge oppfinnelsen fremstilles ved konvensjonelle seterettet mutagenese av en DNA-sekvens som koder human t-PA eller analoger eller varianter derav.

Slike metoder for mutagenese inkluderer M13-systemet i henhold til Zoller og Smith, "Nucleic Acids Res." 10:6487-6500 (1982); "Methods Enzymol." 100: 468-500 (1983); og DNA 3:479-488 (1984), ved bruk av enkeltstrenget DNA og metoden i henhold til ved bruk av heterodupleksert DNA. Forskjellige eksempler på oligonukleotider som benyttes i henhold til slike metoder for å bevirke utelatelser i N-terminus eller for å omdanne en asparaginrest til for eksempel treonin eller glutamin, er vist i tabell 7. Det skal selvfølgelig være klart at DNA som koder hver av glykoproteinet ifølge oppfinnelsen analogt kan fremstilles av fagmannen ved seterettet mutagenese ved å benytte et eller flere hensiktsmessig valgte oligonukleotider. Eksprimering av DNA ved konvensjonelle midler 1 et pattedyr-, gjær-, bakterie- eller insektsverts-cellesystem gir den ønskede variant. Pattedyreksprimerings-systemer og de forskjellige varianter som derved oppnås er for tiden foretrukket.

De pattedyrcelleeksprimeringsvektorer som her beskrives kan syntetiseres ved teknikker som er velkjente for fagmannen. Komponentene av vektorene slik som bakterielle replikoner, seleksjonsgener, forbedrere, promotere og lignende, kan oppnås fra naturlige kilder eller syntetiseres ved kjente prosedyrer, se for eksempel Kaufman et al., "J. Mol. Biol.", 159:51-521 (1982); Kaufman, "Proe. Nati. Acad. Sic", 82:689-693 (1985).

Etablerte cellelinjer inkludert transformerte cellelinjer er egnede som verter. Vanlige diploidceller, cellerstammer avledet fra ln vitro-dyrkning av primærvev, så vel som primær eksplanter (inkludert relativt udifferensierte celler slik som hematopoetinstammeceller) er også egnet. Kandidatceller behøver ikke å være genotypisk defisiente i seleksjonsgenet så lenge seleksjonsgenet virker dominant.

Vertscellene er fortrinnsvis etablerte pattedyrcellelinjer. For stabil Integrering av vektor-DNA til kromosomalt DNA og for efterfølgende forsterking av det integrerte vektor-DNA, begge ved konvensjonelle metoder, er CHO (Chinese hamster Ovary)-celler idag foretrukket. Alternativt kan vektor-DNA inneholde hele eller en del av bovinpapillom virusgenomet (Lusky et al., "Cell", 36:391-401 (1984) og bæres i cellelinjer slik som C127-museceller som et stabilt episomt element. Andre brukbare pattedyrcellelinjer inkluderer, men er ikke begrenset til HeLa, COS-l-apeceller, mus L-929-celler, 3T3-linjer avledet fra Swiss-, Balb-c- eller NIH-mus, BHK- eller HaK-hamstercellelinjer og lignende.

Stabile transformanter bedømmes så med henblikk på eksprimering av produktet ved standard immunologiske eller enzyma-tiske analyser. Nærværet av DNA som koder variantproteinene kan detekteres ved standardprosedyrer som Southern-blotting. Transienteksprimering av DNA som koder variantene i løpet av noen dager efter innføring av eksprimeringsvektor-DNA til egnede vertsceller som COS-l-apeceller, måles uten seleksjon ved aktivitets- eller immunologisk analyse av proteinene i dyrkingsmediet.

Når det gjelder bakteriell eksprimering, kan det DNA som koder variantene modifiseres ytterligere til å innholde forskjellige kodoner for bakteriell eksprimering som kjent i denne teknikk og er fortrinnsvis operativt forbundet i ramme til en nukleotidsekvens som koder et sekretorisk lederpoly-peptid som tillater bakteriell eksprimering, sekresjon og prosessering av det mature variantprotein, også som kjent i denne teknikk. Forbindelsene som eksprimeres i pattedyr-, insekt-, gjær- eller bakterielle vertsceller kan så gjenvinnes, renses og/eller karakteriseres med henblikk på fysikokjemiske, biokjemiske og/eller kliniske parametre, alt ved i og for seg kjente metoder.

Disse forbindelser er funnet å binde ti monoklonale antistoffer rettet mot human t-PA og kan således gjenvinnes og/eller renses ved immunoaffinitetskromatografi ved bruk av slike antistoffer. Videre har disse forbindelser t-PA-type enzymatisk aktivitet, for eksempel aktiverer forbindelser ifølge oppfinnelsen aktivt plasminogen i nærvær av flbrin for å fremtvinge fibrinolyse, målt i en indirekte analyse ved bruk av plasminkromogent substrat S-2251 som kjent i denne teknikk.

Oppfinnelsen omfatter også preparater for trombolytisk terapi og som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en variant som beskrevet ovenfor i blanding med en farmasøytisk aksep-terbar parenteral bærer. Slike preparater kan benyttes på samme måte som beskrevet for human t-PA og skal være brukbare for mennesker og lavere dyr som hunder, katter og andre pattedyr som kjennes å være ofre for trombotiske kardio-vaskulære problemer. Det skal være klart at preparatene brukes både for behandling og hensiktsmessig også for for-hindring av trombotiske tilstander. Den nøyaktige dosering og administreringsmetoden bestemmes av den behandlende lege avhengig av potens og farmakokinetisk profil for den angjeldende forbindelse så vel som forskjellige faktorer som modifiserer virkningen av medikantene, for eksempel kroppsvekt, kjønn, diett, administreringstid, medikamentkombinasjon, reaksjonssensitiviteter og det angjeldende tilfellets alvorlighet.

De følgende eksempler er gitt for å Illustrere utførelses-former av oppfinnelsen. Det skal være klart at disse eksempler er illustrerende og oppfinnelsen er ikke å anse som begrenset til disse, men til det som angis i de ledsagende krav

I hvert av eksemplene som involvere insektcelleeksprimering var den nukleære polyhedrosevirus som ble benyttet L-l-varianten av Autographa californica, og den benyttede insektcellelinje var Spodoptera frugiperda IPLB-SF21-celle-linje (Vaughn, J.L. et al., "In Vitro" (1977) 13, 213-217). Celle- og viralmanipuleringer er som angitt i litteraturen (Pennock, G.D., et al., supra, Miller, D.W., Safer, P. og Miller, L.K., "Genetic Engineering", vol. 8, s. 277-298, J.K. Setlow og A. Hollaender, utg. Plenum Press, 1986). RF-ml3-vektorene, mpl8 og mpll, er kommersielt tilgjengelige fra New England Biolabs. Imidlertid vil fagmannen erkjenne at andre vimser, stammer, vertsceller, promotere og vektorer inneholdende det relevante cDNA som beskrevet ovenfor, også kan benyttes ved gjennomføring av hver utførelsesform ifølge oppfinnelsen. DNA-manipuleringene som ble benyttet er, hvis ikke annet spesielt er angitt, i henhold til Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor, NY 1982).

Som fagmannen vil erkjenne kan oligonukleotider lett konstrueres for bruk ved utelatelse av en eller flere aminosyrer eller innskyting en annen (det vil si erstatning) aminosyre ved et ønsket sete ved utelatelse av et eller flere kodoner henholdsvis å erstatte kodonet med den ønskede erstatningsaminosyre i oligonukleotidet.

Andre mutageneseoligonukleotider kan konstrueres, basert på en ca. 20-50 nukleotidsekvens som spenner over det ønskede setet, med erstatning eller utelatelse av den eller de originale kodoner man ønsker å skifte ut.

Plasmid- avledninger

Mutagenese av cDNA'er på kodoner for de forskjellige aminosyrer ble gjennomført ved bruk et egnet restriksjonsfragment av cDNA i M13-plasmider i henhold til Zoller og Smith. Utelatelsene innen dette cDNA ble gjennomført ved utsløyfingsmutagenese ved bruk av et egnet restriksjonsfragment, for eksempel Sacl-fragmentet, til cDNA enten i M13-vektorer eller ved en heterodupleks utsløyfing i plasmid pSVPA4.

Dette plasmid ble konstruert for å tillate eksprimering av t-PA glykoprotein i pattedyrceller. Dette plasmid ble fremstilt ved først å fjerne det DNA som koder SV40 stort T polypeptid fra plasmidet pspLT5 (Zhu, Z. et al., 1984, "J. Virology", ELL: 170-180). Dette ble gjennomført ved å utføre en total Xhol-nedbrytning fulgt av partiell Bam-Hl-restriksjons-endonuklease-nedbrytning. Det SV40 stort T kodende området i pspLT5 ble erstattet med human t-PA-kodende sekvens ved å ligere et kohesivt Sall/BamHl t-PA-kodende restriksjonsfragment, isolert ved nedbrytningsplasmidet J205 (ATCC nr. 39568) med Sali og BamHl til den opphavs-Xhol/BamHl-kutt-vektor pspLT5, fremstilt som beskrevet ovenfor. Som et resultat vil t-PA transkriberes i denne vektor under kontroll av Sv40-sen-promoter som innføres i pattedyrceller. Dette sluttkonstrukt er angitt som pSVPA4.

Plasmid pLDSG er en forsterkbar vektor for eksprimering av t-PA i pattedyrceller slik som CHO-celler. pLDSG inneholder en muse-DHFR cDNA-transkripsjonsenhet som benytter adenovirus type 2 hoved-senpromoter, MLP, simianvirus 40 (SV40)-for-sterkeren og replikeringsopprinnelsen, SV40-senpromoteren (i den samme orientering som adenovirus MLP), et gen som koder tetracyklinresistans og et cDNA-kodende human t-PA (Val-245) i riktig orientering med henblikk på adenovirus type 2 MLP. Fremstillingen av pLDSG fra pCVSVL2 (ATCC nr. 39813) og en t-PA-kodende cDNA er beskrevet i detalj på samme måte som kotransformering med, og forsterking av, pLDSG i CHO-celler, se Kaufman et al., "Mol. and Cell. Bio.", 5(7):1750-1759

(1985).

Plasmid pWGSM er identisk med pLDSG bortsett fra at cDNA-innskuddene koder Met-245 human t-PA. pWSGM kan konstrueres ved bruk av cDNA fra plasmid J205 (ATCC nr. 39568) eller pIVAPA/1 (ATCC nr. 39891). I hele beskrivelsen kan pWGSM og pLDSG benyttes om hverandre, selv om, som tidligere antydet, den førstnevnte vektor gir Val-245-proteiner og den siste Met-245-proteiner.

pIVPA/1 (ATCC nr. 39891) er en bakuloviral transplasserings-vektor inneholdende et t-PA-kodende cDNA. pIVPA/1 og mutage-niserte derivater derav benyttes for å skyte inn et ønsket cDNA i et bakuloviralt genom slik at cDNA vil være under transkripsjonen kontroll av den bakulovirale polyhedrinpromoter.

Heterodupleks mutagenese

Mutagenese via heteroduplekset DNA av spesifikke arealer i t-PA eksprimeringsplasmidet, pSVPA4, involverer følgende trinn:

Fremstilling av ampicillin-sensitiv pSVPA4 DNA

1. Plasmid pSVPA4 (15 ;jg) ble linearisert med Pvul fullstendig. Denne blanding ble ekstrahert med fenol/kloroform og dette DNA "ble precipitert ved bruk av to volumer etanol med 0,1 M NaCl tilstede. 2. Dette DNA ble resuspendert i en 21 pl vann, 1 pl dNTB-oppløsning (inneholdende 2 mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP), 2,5 pl 10X nick-translasjonsbuffer (0,5 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M MgSC>4, 10 mM DTT, 500 pg/ml) og 0,5 pl eller 2 enheter DNA-polymerase 1-stort fragment fra New England Biolabs. Denne blanding ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter og derefter fenol/kloroform-ekstrahert, fulgt av etanolprecipitering som beskrevet ovenfor. 3. Det precipiterte DNA ble resuspendert til 0,2 pg/pl ved tilsetning av 75 pl vann.

Fremstilling av ampicillin-resistent pSVPA4 DNA

1. Plasmid pSVPA4 (15 pg) ble brutt ned med Sac I hvilket skjærer dette plasmid to ganger I den t-PA-kodende sekvens og gir to restriksjonsfragmenter, et 1,4 kbp t-PA som koder restriksjonsfragment pluss opphavsvektoren. Ef ter restriksjonsnedbrytning ble 1 pl eller 28 enheter kalve-innvollsalkalisk fosfat fra Boehringer Mannheim tilsatt og så inkubert ved 37'C i 5 minutter. De to bånd ble separert ved å helle blandingen på et 0,7$ agarosegel. Opphavs-vektor-restriksjonsfragmentet ble skåret ut fra gelen og ekstrahert ved adsorpsjon på silisiumdioksyd ved 4°C, fulgt av eluering i 50 mM Tris/l mM EDTA ved 37° C i 30 minutter. Det eluerte DNA ble justert til en sluttkonsen-trasjon på 0,2 pg/pl.

Heterodupleks-modning

1. Bland 6 pl eller 1,2 pg ampicillin-sensitivt pSVPA4 DNA med 6 pl eller 1,2 pg ampicillin-resistent pSVPA4 DNA. 2. Tilsett et likt volum (12 pl) 0,4 M NaOH. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. 3. Tilsett langsomt 4,5 volumer eller 108 pl 0,1 M Tris-Cl pH 7,5/20 mM HC1. 4. 50 picomol eller 5 pl fosforylert mutagent oligonukleotld ble tilsatt til 45 pl heterodupleks blanding. 5. Denne blanding ble inkubert ved 68° C i to timer og så langsomt avkjølt til romtemperatur.

Mutagenese

1. Hver mutagenese-reaksjon ble Justert til de følgende konsentrasjoner ved tilsetning av 7 pl til heterodupleks blandingene, 2 mM MgCl/0,2 mM ATP/a60 pm dATP, dTTP, dGTP, dCTP/4 mM DTT/40 enheter/ml Klenow-fragment E. voli DNA-polymerase I (B.R.L.), 2000 enheter/ml T4 DNA-ligase (N.E.B.). Denne blanding ble inkubert ved romtemperatur i

2 timer.

2. Reaksjonsblandingen ble så fenolrkloroform-ekstrahert fulgt av etanol-precipitering. Det precipiterte DNA ble resuspendert i 12 p. 50 mM Tris-Cl/1 mM EDTA. 4 pl av dette ble benyttet for å transformere kompetente HB101-bakterier. 3. Ampicillin-resistente kolonier ble avsøkt med 1 x 10^ cpm/ml av et <32>p-merket avsøkningsoligonukleotid i 5X SSC, 0,156 SDS, 5X denhardfs reagens og 100 pg/ml denaturert

laksesperma DNA.

4. Filtrene ble vasket med 5X SSC, 0, 1% SDS ved en temperatur på 5°C under den beregnede smeltetemperatur for oligo-nukleotidproben. 5. DNA ble fremstilt fra positivt hybridiserende kloner og analysert til å begynne med ved nedbrytning med forskjellige restriksjonsenzymer og agarosegelelektroforese. DNA ble overført til nitrocellulose og filteret ble preparert og hybridisert til avsøkningsprober for å sikre at mutagent oligonukleotld ble innført i det riktige

fragment.

6. DNA ble så retransformert til E. coli og ampicillin-resistente klonier ble avsøkt med henblikk på hybridisering til avsøkningsoligonukleotidet. 7. De endelige mutasjoner ble bekreftet ved DNA-avsøkning i henhold til Sanger.

Fremstilling av mutagenlserte cDNA' er: M13- metoden

Det følgende skjematiske restriksjonskart viser en cDNA-kodende human t-PA (over) med spaltingsseter antydet for spesifikke endonukleaser, antydet under.

Initieringskodonet, ATG, og de cDNA-områder som koder (a), R<*>, R<2> og R<3> er antydet. Således kan mutagenese ved N-terminus gjennomføres ved bruk av SacI-fragmentet eller Bglll/Narl-fragmentet. Mutagenese på Arg-275 og/eller ved R<1 >og/eller R<2> kan gjennomføres ved for eksempel å bruke Sacl-fragmentet eller BglII/SacI-fragmentet. Mutagenese på R<3> kan gjennomføres ved å benytte et EcoRI/Xmal- eller EcoRI/Apal-fragment. Valget av restriksjonsfragment kan bestemmes basert på hensiktsmessighetsbetraktninger ved bruk av spesielle vektorer for mutagenese og/eller for eksprimeringsvektor-konstruksjon.

Generelt kan cDNA-restriksjonsfragmentet som skal mutageniseres skjæres ut fra tilstedeværende full-lengde cDNA, for eksempel i pWGSM, pIVPA/1 eller pSVPA4, ved bruk av antydede endonuklease-enzymer, og så mutageniseres, for eksempel med de oligonukleotider som er vist i tabell 7 eller andre oligonukleotider som er angitt for ønsket mutagenese.

Eksempelvise mutagenlserte cDNA-fragmenter som således kan fremstilles er vist i tabell 8 nedenfor. Ef ter mutagenese kan fragmentet, med eller uten ytterligere mutagenses, så skjæres ut fra M13-vektoren og ligeres tilbake i en eksprimeringsvektor som inneholder full-lengde- eller partiell-cDNA som tidligere er spaltet med det eller de samme enzymer som ble benyttet for utskjæring av det mutagenlserte fragment fra M13-vektoren. Ved denne metode kan full-lengde cDNA, mutagenisert som ønsket, remonteres ved bruk av et eller flere mutagenlserte fragmenter som restriksjons-fragmentkassetter.

cDNA'er som koder de følgende illustrerende forbindelser (se

tabellen, side 9 samt tabellene 2.0, 2.5 & 3) kan fremstilles fra de mutagenlserte fragmenter fra tabell 8 som følger:

Plasmidene pIVPA eller pSVPA4 , kan i tillegg til anvendelig som eksprimeringsvektorer også benyttes som et "depot" ved konstruksjonen av cDNA med en hvilken som helst ønsket permutasjon av mutagenlserte seter. Således kan "pIVPA/A"-eller "pSVPA4/a"-mutagenlserte (via M13 eller heterodupleksering) inneholdende en ønsket modifisering i cDNA-området som koder N-terminalområdet, brytes ned med Narl (partielt) og Xmal (Smal) (totalt) for å fjerne cDNA-området som koder proteinområdet som spenner over R<1>, R<2> og R<3>. Et andre pIVPA-eller pSVPA4-plasmid, hvis ønskelig mutagenlserte (via M13 eller heterodupleksering), ved en hvilken som helst kombinasjon av Arg-275-, R<1->, R<2-> og R<3->kodende områder, kan så brytes ned med Narl (totalt) og Xmal (Smal) (totalt) og Narl/Xmal (Smal)-fragmentet kan så identifiseres, isoleres og ligeres inn i Narl/Xmal (Smal)-nedbrutt pIVPA/A eller pSVPA4/A. Slik bruk av Narl/Zmal (Smal)-restriksjonsfragment-kassett tillater for eksempel konstruering av de ønskede mutagenlserte cDNA'er i pIVPA eller pSVPA4. Det mutagenlserte cDNA kan så overføres, for eksempel som en Bglll/Xmal-restriksjonsfragmentkassett til Bglll/Xmal-nedbrutt pWGSM for pattedyreksprimering, hvis dette er ønsket.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

FREMSTILLING AV GLN-117-UTELATELSESVARIANTER

A. Fremstilling av Gln- 117 stump cDNA.

cDNA-molekyler som koder polypeptidsekvensen av forbindelsene 2-l/N-21/Arg, 2-l/N-22/Arg og 2-l/N-23/Arg ble fremstilt ved å bruke den oligonukleotid-rettede mutagenesemetode ifølge Zoller og Smith. Spesielt ble mutagenesevektoren RF M13/t-PA, inneholdende t-PA-genet, konstruert fra pattedyr t-PA eksprimeringsplasmid pSVPA4. RF M13/t-PA ble konstruert ved en første nedbrytnings-PSVPA4 til fullførelse med restrik-sjonsendonuklease Sacl. Ca. 1436 basepar (bp) SacI-fragmentet koder en stor andel av polypeptidsekvensen i t-PA og inkluderer nukleotidsekvensen som koder de konsensus-N-bundne glykosylerlngsseter som omfatter asparaginene 117, 184 og 218. Dette 1436 bp (herefter kalt 1,4 kbp) fragment ble renset ved preparativ agarosegel-elektroforese.

Sacl-fragmentet av dette t-PA cDNA, oppnådd som et Sacl-fragment ovenfor, ble ligert til en linearisert dobbelt-strenget RF M13mpl8 DNA-vektor som på forhånd var brutt ned med Sacl. Ligeringsblandingen ble benyttet for å transformere transformasjonskompetente bakterielle JMlOl-celler. M13-plaquene inneholdende t-PA-avledet DNA fremstilt fra transformerte celler ble Identifisert og isolert ved analytisk DNA-restriksjonsanalyse og/eller plaquehybrldisering. Radiomerkede oligonukleotider (~17-merer, med positiv polaritet) avledet fra innen Sacl-restriksjonssetene av den t-PA-kodende nukleotidsekvens som er angitt i tabell I, ble benyttet som prober når filterhybridisering ble benyttet for å detektere viralplaquer inneholdende t-PA DNA. Alle oligonukleotider ble fremstilt ved automatisert syntese med en "Applied Biosystems" DNA-syntetisør i henhold til produsentens instruksj oner.

Flere av de positive plaquer som ble detektert ved restrik-sjons- eller hybridiseringsanalyse ble så ytterligere klonet ved konvensjonell plaque-rensing. Renset M13/t-PA-bakteriofag oppnådd fra plaque-renseprosedyren ble benyttet for å infisere JMlOl-celler. Disse infiserte celler ga cytoplasmisk dobbelt-strenget "RF" M13/t-PA-plasmid DNA. De infiserte celler produserer også bakteriofag i dyrkingsmediet inneholdende enkelt-strenget DNA som er komplementær til 1,4 kbp Sacl-fragmentet av t-PA og til M13 DNA. Enkelt-strenget DNA ble renset fra den M13/t-PA-holdige fag isolert fra dyrkingsmediet. Dette enkelt-strengede M13/t-PA DNA ble benyttet som en sjablon i en mutagenesereaksjon ifølge Zoller og Smith ved bruk av oligonukleotld #3 i tabell 7. Denne mutagenese-hendelse endrer Asn-kodonet til et Gln-kodon i posisjon 117 av den derpå følgende oppnådde kodende streng av DNA ved å endre DNA-sekvensen fra "AAC" til "CAG". Efter mutagenese-reaks j onen ble dette DNA transformert inn i bakteriestammen JM101. For å identifisere mutagenlserte cDNA'er, ble transformantplaquene ved DNA-hybridisering ved bruk av radiomerkede oligonukleotld #4 fra tabell 7. Alle eksempelangitte oligonukleotider i tabell7 er av positiv polaritet, det vil si representerer andeler av en kodende heller enn en ikke-kodende streng av DNA. Alle hybridiseringspositive plaquer ble ytterligere renset ved efterfølgende sekundærinfeksjoner av JMlOl-celler med M13-fagholdig mutagenisert DNA.

RF M13/t-PA-plasmid DNA ble renset fra JMlOl-celler infisert med renset M13-fag inneholdende mutagenisert t-PA cDNA. Det således oppnådd RF M13/t-PA-plasmid inneholdende Gln-117-mutageniserte Sacl-restriksjonsfragment av t-PA DNA. Dette kan så mutgeniseres ytterligere, igjen i henhold til Zoller og Smith, men ved å benytte oligonukleotidene som beskrevet nedenfor. De nedenfor beskrevne oligonukleotider ble konstruert for å indusere en utelatelse ("utsløyfing") i cDNA-området som koder N-terminaldomenet.

Utelatelsesmutagenese 1; Oligonukleotld #8 i tabell 7 induserte en cDNA-utelatelse som koder Cys-6 til og med Ser-50. Efter denne andre mutagenesereaksjon ble dette DNA transformert inn i JMlOl-celler. For å identifisere mutagenlserte cDNA'er ble transformantplaquene avsøkt som ovenfor, men ved å benytte radiomerket oligonukleotld #9 i tabell 7. Hybridiseringspositive plaquer kan renses ytterligere ved efterfølgende sekundærinfeksjon av JMlOl-celler med M13-fag inneholdende det to ganger mutagenlserte t-PA cDNA. Det cDNA som fremstilt nedenfor og som inneholder dette mutagenlserte restriksjonsfragment koder forbindelse 2-l/N-21/Arg hvori Ile-5 kovalent er bundet til Cys-51 ved en peptidbinding.

Utelatelsesmutagenese 2: Oligonukleotld #10 i tabell 7 induserte en cDNA-utelatelse som koder Cys-6 til og med Ile-86. Efter denne andre mutagenesereaksjon ble dette DNA transformert inn i JMlOl-celler. For å identifisere mutagenlserte cDNA'er ble transformantplaquene avsøkt som ovenfor, men ved å benytte radiomerket oligonukleotld #11 i tabell 7. Hybridiseringspositive plaquer kan renses ytterligere ved efterfølgende sekundærlnfeksjon av JMlOl-celler med M13-fag inneholdende det to ganger mutagenlserte t-PA cDNA. Det cDNA som fremstilt nedenfor og som inneholder dette mutagenlserte restriksjonsfragment koder forbindelse 2-l/N-22/Arg hvori Ile-5 kovalent er bundet til Asp-87 ved en peptidbinding.

Utelatelsesmutagenese 3: Oligonukleotld #12 1 tabell 7 induserte en cDNA-utelatelse som koder Cys-51 til og med Asp-87. Efter denne andre mutagenesereaksjon ble dette DNA transformert inn i JMlOl-celler. For å identifisere mutagenlserte cDNA'er ble transformantplaquene avsøkt som ovenfor, men ved å benytte radiomerket oligonukleotld #13 fra tabell 7. Hybridiseringspositive plaquer kan renses ytterligere ved efterfølgende sekundærlnfeksjon av JMlOl-celler med M13-fag inneholdende det to ganger mutagenlserte t-PA cDNA. Det cDNA som fremstilt nedenfor og som inneholder dette mutagenlserte restriksjonsfragment koder forbindelse 2-l/N-23/Arg hvori Ser-50 kovalent er bundet til Thr-88 ved en peptidbinding.

Hvert av disse mutagenlserte restriksjonsfragmenter kan så ligeres tilbake til pattedyreksprimeringsvektoren pSVPA4 som et Sacl-kassett ved metoder analoge de som er beskrevet i eksempel 3B, eller fremstilt for innskyting i insektcelle-eksprimeringsvektoren pIVPA/1 (ATCC nr. 39891) som en Bglll/SacI-kassett avledet fra modifisert RF M13/t-PA DNA.

B. Fremstilling av vektorer som benyttes for eksprimering av

hø<y>mannose Gln- 117- utelatelsesvarianter.

Det rensede RF M13/t-PA inneholdende modifisert og avstumpet t-PA cDNA, fremstilt som beskrevet ovenfor, kan brytes ned med restriksjonsendonukleasene Bglll og Sacl. Det omtrent 1,2 kbp Bglll/SacI-restriksjonsfragment ble renset ved konvensjonell preparativ gelelektroforese. BglII/Sacl-fragmentet som ble oppnådd på denne måte utgjør en mutagenisert kassett som mangler en 5'- og 3'-del av DNA som koder amino- og karboksytermini av det translaterte protein.

Insekteksprimeringsvektor pIVPA/1 (ATCC nr. 39891) inneholder et villtype t-PA cDNA-innskudd som operativt er bundet til en polyhedrinpromoter sammen med bakulovirus flankerende DNA-sekvenser. pIVPA/1 ble brutt ned med Bglll og Sacl for derved å skjære ut et t-PA-kodende område som overspenner N-terminus og R<*> og R<2>. Bglll/SacI-kassettene inneholdende de mutagenlserte, N-terminal-modifiserte t-PA cDNA-fragmenter kan hver så ligeres til pIVPA/l-eksprimeringsvektor DNA som på forhånd er renset efter nedbrytning med Bglll og Sacl. De resulterende plasmider, pIVPA/A FBR; Gln-117, pIVPA/A FBR/a EGF; Gln-117; pIVPA/A EGF, Gln-117 skal inneholde de mutagenlserte cDNA'er som koder forbindelsene 2-l/N-21/Arg, 2-l/N-22/Arg og 2-l/N-23/Arg, nå operativt bundet til polyhedrinpromoteren. Nukleotidsekvensen av hvert mutagenisert cDNA-innskudd kan bekreftes ved superviklingssekvensering med plasmid som substrat, se til dette E.Y. Chen et al., 1985, "DNA" 4(2): 165-170.

B. Innføring av det mutagenlserte cDNA i insektviruset. Hvert av pIVPA-plasmidene inneholdende de mutagenlserte cDNA'er kan innføres i insektviruset ved kotransfeksjon med villtype AcNPV i Spodoptera-celler. 1 pg av renset Autographa californica NPV DNA og 10 pg av det ønskede pIVPA DNA innføres i Spodoptera-celler som vokser på vevkulturplater ved en kalsiumfosfat-transfeksjonsprosedyre (Potter, K.N. og Miller, L.K., "J. Invertebr. Path." (1980), 36 431-432). Den samtidige innføring av disse DNA'er i cellene resulterte 1 en dobbel rekombinasjonshendelse mellom pIVPA-plasmidet som inneholdt de mutagenlserte cDNA<*>er og det virale DNA i områdene for homologi mellom de to; det vil si at poly-hedrlngenområdet fra avkomviruset fra rekombineringshendelsen inneholder det mutagenlserte cDNA-innskudd fra pIVPA-plasmidet.

Isolering av virus inneholdende nukleotidsekvensen som koder proteinene ifølge oppfinnelsen.

Avkomviruset som er tilstede i mediet over de transfekterte celler plaques på et friskt monosjikt av celler ved flere forskjellige fortynninger. Disse plaquer analyseres og rekombinanter plukkes ut basert på PIB-minus fenotypen som følger: En virus som har mistet sitt polyhedringen som tilfellet er med et virus som inneholder et mutagenisert cDNA, vil ikke produsere PIB'er. Plaquer som synes PIB-manglende velges ut, skjæres ut og forsterkes på friske celler. Supernatanten over disse celler analyseres så på t-PA-type-enzymatlsk aktivitet. Positive analyseresultater antyder at glykoproteinet virkelig er fremstilt.

En alternativ metode for vlrusrensing via den plaquehevende protokoll skiller seg lett fra de trinn som er beskrevet ovenfor og skal beskrives nedenfor. Avkomviruset fra transfeksjon plaques ved egnet fortynning på cellekulturplater. Det fremstilles en nitrocellulosereplika av cellemonosjiktet og virusplaquene. Agaroseoversjiktet fjernes fra platen som viruskilde efter at resultatene av de følgende trinn er oppnådd.

Nitrocellulosefilteret probes med radioaktive DNA-fragmenter som er representative for genet som plasseres i viralkromosomet. Som positive bedømmes de som inneholder fremmed-genet. Den hybridiserte probe fjernes. Filteret probes igjen med radioaktivt DNA som er representativt for en del av viralkromosomet som fjernes ved substituering med fremmed-DNA. Som positive bedømmes de som fremdeles har et polyhedringen.

Hybridiseringsproben fjernes og filteret probes igjen med et radioaktivt DNA-fragment som identifiserer viralplaquer uansett polyhedringenets tilstand. Et egnet fragment kan være EcoRI I-fragmentet. Disse bedømmes som avkomvirus. Man velger de plaquer som er positive for fremmedgen-DNA-proben, negative mot polyhedringenproben og positive for viral-DNA-proben. Disse er sterke kandidater for den ønskede genotype.

C. Fremstilling og karakterisering av høymannose

glykoprotein.

Antistoffer har vært brukt for å demonstrere nærværet av variantproteiner i de ekstracellulære media av infiserte celler. Rekombinantvirus, fremstilt som ovenfor, benyttes for å infisere celler som er benyttet i vanlig TC-100-nærings-saltoppløsning, men i stedet for standardmediasupplement på 1056 fetalkalveserum, ble dette erstattet med en 5056 egge-plomme-anrikning (til 156 totalvolum). Tidligere eksperimenter har vist et mer intakt protein under disse betingelser. Supernatanten fra de infiserte celler fraksjoneres på en affinitetskolonne som har festet et monoklont antistoff til naturlig human t-PA. Proteinet som spesifikt holdes tilbake av kolonnen elueres og analyseres på t-PA enzymatisk aktivitet. En fiksert mengde av aktivitetsenheter av dette og kontroll t-PA-preparater ble separeret på en akrylamidgel. Denne gel flekkes så med et sølvbasert reagens for å vise proteinmønsteret. Dette åpenbarer at viruset efter infisering av insektcellene fører til ekstracellulær produksjon av et protein med t-PA-type aktivitet.

Radiomerket protein fremstilles for ytterligere karakterisering ved først å inkubere Spodoptera frugiperda-celler infisert med viruset (m.o.i=l) i 48 timer. Kulturplatene fylles så med metionin-manglende media. Metionin-manglende media supplert med <35>S-metionin settes så til kulturplatene. Cellekulturene inkuberes i 4 timer. Supernatanten inneholdende det radiomerkede glykoprotein kan analyseres ved SDS-PAGE, 7,556, mot villtype (det vil si full-lengde full-glykosylert) t-PA, fremstilt på analog måte 1 insektceller og mot pattedyr-t-PA som for eksempel er fremstilt ved metoden ifølge R. Kaufman et al., "Mol. Cell. Biol." 5(7):1750

(1985), men i nærvær av tunicamycin (ikke-glykosylert). De partielt glykosylerte stump-proteiner som fremstilles i eksempél 1 skal ha øket gelmobilitet i forhold til den full-glykosylerte analog og den Ikke-glykosylerte full-lengde-analog.

EKSEMPEL 2

FREMSTILLING AV ANDRE PROTEINER IFØLGE OPPFINNELSEN

A. Fremstilling av andre cDNA' er

Mutagenesemetodene ifølge eksempel 1 kan benyttes med andre konvensjonelt fremstilte syntetiske oligonukleotider som modifiserer den opprinnelige t-PA DNA-sekvens for å fremstille proteiner som er modifisert i N-terminalområdet og/eller eventuelt modifisert ved N-forbundne glykosylerlngsseter og/eller ved Arg-275 med den eller de egnede kodon-endringer som er beskrevet tidligere, se for eksempel "Preparatlon of Mutagenized cDNAs: M13 Method" samt rutene (a) - (h) ovenfor.

For eksempel kan cDNA som koder forbindelsene D-6, D-l og D-3 fremstilles ved bruk av Sacl-restriksjonsfragmentet i M13 t-PA og mutagenisering med oligonukleotIdene #8, 10 og henholdsvis 12, men ikke med oligonukleotld #3. Arg-275 kan utelates eller erstattes, for eksempel med Thr, ved bruk av oligo'ene 14 henholdsvis 15. Vektorkonstruksjon, transfeksjon og eksprimering kan gjennomføres som i eksempel 1 for insektceller som beskrevet nedenfor i eksempel 3 for pattedyrceller.

Enkelt-strenget DNA fra M13 mutagenesevektoren (RF M13/t-PA), fremstilt som i eksempel 1, kan også benyttes som en sjablon for å mutagenlsere på setespesifikk måte ved Arg-275 og/eller ved glykosyleringssetet R<1> eller R<2> eller begge. Området som koder konsensus-tripeptid som omfatter Asn-218, kan mutageniseres på tilsvarende måte. For å fremstille multippel-modifikasjoner av proteinet ved disse seter kan man benytte en interativ prosess. Efter identifisering og rensing av M13-fagen inneholdende et modifisert R^-sete kan for eksempel en enkelt-strenget DNA inneholdende dette modifiserte setet renses fra fagen og benyttes som sjablon for å initiere en andre runde mutagenese innen R<2->setet og/eller ved Arg-275. Denne prosess kan gjentas inntil alle ønskede modifikasjoner er oppnådd. Så kan cDNA som koder forbindelsene 2-2/N-23/Arg, 2-2/N-21/Arg og 2-2/N-22/Arg fremstilles ved fremgangsmåten ifølge eksempel 1, men ved å erstatte mutagenese-oligonukleotidet #5 med oligonukleotidet #3 og å avsøke oligonukleotidet #6 med henblikk på oligonukleotidet #4. cDNA som koder forbindelsene 2-6(N-21/Arg, 2-6/N-22/Arg og 2-6/N-23/Arg kan fremstilles ved to ganger å mutagenlsere Sacl-fragmentet som beskrevet i eksempel 1 og ved i tillegg å mutagenlsere og avsøke med oligonukleotidene #5 og #6. Vektorkonstruksjon, transfeksjon og eksprimering er som angitt i eksempel 1 for insektceller eller som beskrevet nedenfor for pattedyrceller, se rutene (a) - (h) ovenfor.

RF M13/t-PA mutagenesevektoren inneholder ikke DNA-sekvensen som koder R<3>, det N-forbundne glykosyleringssetet av t-PA som er mest proksimalt til karboksy-terminus av proteinet. For derfor å gjennomføre DNA-modifiseringer ved dette setet, ble det laget en ny M13/t-PA mutagenese RF-vektor kalt M13/t-PA:R1-Xmal. Denne vektor ble konstruert ved å bryte ned M13-vektor M13mpll fullstendig med EcoRI og Xmal. Rl/Xmal-nedbrutt M13-vektor ble ligert til et renset EcoRI/Xmal t-PA-restriksjonsfragment (omtrent 439 bp, herefter kalt 0,4 kbp) som koder et polypeptidområde som omfatter glykosyleringssetet R<3>. Dette 0,4 kbp-restriksjonsfragment ble renset efter nedbrytning av plasmidet pWGSM med EcoRI og Xmal. Pattedyr-eksprimeringsplasmid pWGSM som koder t-PA-genet er identisk innen 439 bp EcoRi/Xmal-fragmentet med det plasmid pLDSG som beskrives av Kaufman et al., "Mol. Cell. Biol.", 5, 1750-1759

(1985).

Ligeringsblandingen ble benyttet for å transformere kompetente bakterielle JMlOl-celler. Diverse plaquer ble plukket ut og analysert med henblikk på nærværet av 0,4 kbp t-PA EcoRI/Xmal-fragmentet ved standard DNA-restriksjonsfragment analyse. Dobbelt-strenget RF M13 DNA ble renset fra celler inneholdende 0,4 kbp t-PA fragmentet. Dette DNA ble kalt RF M13/t-PA:RI-XmaI-mutagensevektor. Som tidligere antydet i eksempel IA, kan denne vektor når den transformeres inn i kompetente JMlOl-celler benyttes for å fremstille M13/t-PA:RI-Xmal-fag hvorfra enkelt-strenget M13/t-PA:RI-XmaI DNA kan renses. Dette enkelt-strengede DNA kan benyttes som sjablon ved den seterettede mutagenesereaksjon for å modi-fisere t-PA DNA og det N-forbundne glykosyleringssetet R<3>.

Modifisert R<3> kodingssekvens kan benyttes for å erstatte villtype R<3->sekvensen som er tilstede i enten modifisert pIVPA/1 som fremstilt i eksempel 1 (stump og/eller modifisert ved R<1> og/eller R<2>) eller villtype pIVPA/1 plasmid DNA. Dette kan gjennomføres ved først å gjennomføre en total Sacl/Apal-nedbrytning av den R<3->modifiserte Ml3/t-PA:RI/Xmal-mutagenese plasmidvektor og isolering av det således fremstilte R<3->modifiserte 165 basepar t-PA-restriksjonsfragment. Insekt-eksprimeringsvektoren pIVPA/1 eller pIVPA/l-plasmid DNA modifisert for eksempel som i eksempel 1, kan på samme måte brytes ned totalt med Sacl og Apal for å skjære ut 165 bp villtype t-PA-restriksjonsfragmentet som koder det umodifi-serte R<3->setet. Ligering av den rensede insekteksprimeringsvektor som mangler 165 bp-fragmentet til det modifiserte R<3 >165 bp-fragment gir en ny insekteksprimeringsvektor. Eksprimering av vektoren gir et stumpt protein som er modifisert på R<3->setet så vel som på et hvilket som helst eller alle andre konsensus-N-forbundne glykosylerlngsseter som er tilstede i naturlig

t-PA og/eller ved Arg-275.

pIVPA-plasmidet som inneholder det modifiserte cDNA kan også benyttes for å danne Bglll/Apal-fragmentet av det modifiserte t-PA cDNA som spenner over utelatelsesreglonen 1 N-terminaldomenet så vel som området som koder R<*>, R<2> og R<3> el ler Nar I/Xmal-fragmentet som spenner over R<*>, R<2> og R<3>. Et hvilket som helst av disse fragmenter kan skytes inn i pattedyreksprimeringsvektorer som pSVPA4 eller pWGSM som beskrevet i eksempel 3.

EKSEMPEL 3

FREMSTILLING AV FORBINDELSENE D-6, D-l OG D-3 I PATTEDYRCELLER

A. Fremstilling av cDNA

cDNA-molekyler som koder polypeptidsekvensene av forbindelsene D-6, D-l og D-3 ble fremstilt ved bruk av mutagense-oligonukleotIdene #8, 10 henholdsvis 12 og SacI-fragmentet av t-PA cDNA som sjablon ved M13-metoden ifølge eksempel 1 eller ved heterodupleks mutagenese (Moranaga heterodupleks mutagenese-protokoll; begge, supra). Mutanter som var selektert ved DNA-hybridisering ved bruk av avsøkningsoligo-nukleotider 9, 11 henholdsvis 13 ble bekreftet ved DNA-

sekvensanalyse til å være korrekte i den modifiserte DNA-sekvens .

B. Fremstilling av modifisert t- PA- vektor

Hvert modifiserte cDNA som ble fremstilt i eksempel IA (a, Gln-117) eller 3A (a) ble først fjernet fra M13-mutagenesevektoren RF M13/t-PA ved total nedbrytning av vektoren med Sacl. Det ca. 1,4 kbp-restriksjonsfragment i hvert mutagenlserte cDNA ble renset ved gelelektroforese og så ligert inn i pSVPA4 som følger. Først ble pSVPA4 brutt ned med Sacl for å fjerne villtype t-PA 1,4 kbp-restrIksjonsfragmentet. Den gjenværende andel av Sacl-nedbrutt pSVPA4 ble så ligert til 1,4 kbp-restriksjonsfragmentet av det mutagenlserte cDNA. Denne ligeringshendelse kan gi to orienteringer av det innskutte fragment. Den riktige orientering i hvert tilfelle kan identifiseres ved bruk av Ecol og PvuII som enzymer ved konvensjonell analytisk restriksjonsenzymanalyse. Denne erstatning tillater at SacI-fragmentet kan benyttes som et kassetttfragment melleom RF M13/t-PA-mutagensevektoren og pSVPA4-pattedyreksprimeringsvektoren. Modifiserte M13 Sacl-fragmenter (stumpe og eventuelt modifisert ved R<1> og/eller R<2>) kan skytes inn i SAcI-nedbrutt pSVPA4 DNA som på forhånd eller efterpå modifiseres ved R<3>, hvis dette er ønsket. Alternativt kan DNA som på forhånd er modifisert ved R<1>, R<2 >og R<3> skjæres ut fra vektorer som pIVPA eller pSVPA4 som et Narl/Apal- eller NarI/Xmal-fragment. Det således oppnådde fragment kan skytes inn i vektorer som pSVPA4 eller pWGSM, på forhånd brutt ned med Narl (partielt) og Apal eller Xmal (totalt). Ved denne metode kan en hvilken som helst kombinasjon av N-terminalutelatelse og/eller substituering og/eller glykosyleringssetemutagenese og/eller Arg-275-mutagenese oppnås.

C. Transfektering av COS ( SV40- transformerte afrikanske grønnapenvre)- celler

COS-l-celler (ATCC CRL 1650) ble transfektert ved metoden ifølge Lopata, M.A. et al., "Nucl. Acids Res.", 12:5707-57171

(1984) med de vektorer som ble fremstilt i eksempel 3B, det vil si modifisert pSVPA4. Serumholdig medium ble erstattet med serumfritt medium 24 timer efter transfektering og kondisjonert medium ble analysert både på nærvær av plas-minogenaktiverende aktivitet, ved bruk av det kromogene substrat S-2251, eller nærværet av t-PA antigen ved en ELISA-analyse, 48 og 72 timer efter transfektering.

D. Viral propagerlng 1 CV1 ( afrikanske grønnapenyre)- celler

Modifisert kompleks karbohydratprotein kan fremstilles ved infektering av CVl-celler (ATCC CCL 70) med SV40 viral lagervare propagert som beskrevet av Gething og Sambrook ("Nature", 293:620-625. 1981). Dette ble gjennomført ved først totalt å bryte ned modifisert pSVPA4 med restriksjons-endonukleasen BamHl for å fjerne den bakterielle shuttlevektor pXf3 fra SV40 viral DNA. Før transfektering av dette DNA til CVl-celler sammen med hjelpevirus SV40-rINS-pBR322 DNA (beskrevet nedenfor), blir BamHl linearisert SV40/t-PA DNA sirkulariset ved ligering ved små DNA-konsentrasjoner (1 jjg/ml). Denne prosess ble gjentatt med insulin inneholdende SV40-vektoren SV40-rINS/-pBR322 (Horowitz, M. et al., 1982, "Eukaryotic Viral Vectors", s. 47-53, Cold Sping Harbor Laboratory). Den bakterielle shuttlevektor pBR322 i SV40-rINS-pBR322 ble fjernet ved en total EcoRI-nedbrytning. Det linearisete insulin/SV40 viral DNA ble så sirkularisert ved ligering ved en DNA-konsentrasjon på 1 pg/ml. Det er nødven-dig å transfektere CVl-celler med sirkulært ligert pSVPA4 og SV40-rINS DNA'er, ved ekvimolare mengder for å generere virale lagerbeholdninger. SV40-rINS benyttes for å tilveie-bringe "sene" SV40-proteiner, mens pSVPA4 gir de "tidlige" SV40-proteiner som er nødvendige for virus DNA-produksjon, mens de også koder proteinene ifølge oppfinnelsen. Når som et resultat celler transfekteres med både disse DNA'er som beskrevet av Gething og Sambrook, produseres SV40-virus som inneholder DNA fra begge viralvektorer. Ved efterfølgende infeksjon av CVl-celler med forsterket virus har gitt proteiner med t-PA-type aktivitet som kan analyseres 72 timer efter infeksjon som beskrevet i eksempel 3C.

EKSEMPEL 4

FREMSTILLING AV ANDRE PROTEINER

cDNA'er som koder forskjellige proteiner ifølge oppfinnelsen er fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge eksemplene 1, 2 og 3. Bglll/Xmal-restriksjonsfragmentkassetten kan så skjæres ut fra både pIVPA- eller pSVPA4-vektor inneholdende det cDNA som koder det stumpe protein med eller uten modifisering på et eller flere glykosylerlngsseter. Det utskårede Bglll/Xmal-fragment kan så ligeres inn i Bglll/Xmal-kuttet pSVPA4 eller pWGSM for innføring i pattedyrceller. Eksprimering av slik cDNA i pattedyrvertsceller, for eksempel Ifølge eksempel 3 eller ved metoden i henhold til Kaufman et al., supra (CHO-vertsceller) eller ved metoden ifølge Eowley et al., US-PS 4.419.446 (1983) (BPV-eksprimeringssystemer) gir de tilsvarende pattedyr-avledede stumpe proteiner. Således ble cDNA'er som koder forbindelsene 2-l/N-21/Arg (a FBR, Gln-117) og 2-l/N-22/Arg (A FBR/EGF, Gln-117) fremstilt og skutt inn i pSVPA4 som beskrevet ovenfor. cDNA som koder forbindelsen 2-l/N-23/Arg (a EGF, Gln-117) ble fremstilt ved å benytte mutageneseoligonukleotid 12 og avsøkningsoligonukleotid #13 (tabell 7), men ved den heteroduplekse metode som er beskrevet ovenfor med pSVPA4 som på forhånd var mutagenisert i posisjon 117 (som ovenfor) som sjablon. På samme måte ble cDNA'er som koder forbindelsene D-2 (A FBR) og D-3 (a EGF/FBR) fremstilt ved M13-mutagenese som beskrevet ovenfor og skutt inn som SacI-fragmentet i Sacl-nedbrutt pSVPA4. cDNA som koder forbindelsen D-6 (a EGF) ble fremstilt ved den heteroduplekse metode som beskrevet ovenfor ved bruk av pSVPA4 som sjablon og mutageneseoligonukleotid #12, og avsøkning med oligonukleotld #13.

For å fremstille de cDNA'er som koder proteinene for forsterkning og eksprimering i pattedyrceller, ble cDNA inneholdt i pSVPA4 eller pIVPA skåret ut som et Bglll/Xmal-fragment og ligert inn i renset Bglll/Xmal-nedbrutt pWGSM. I hvert tilfelle ble den resulterende pWGSM-vektor innført i CHO-celler og forsterket i henhold til Kaufman, ovenfor. De transformerte og forsterkede CHO-celler produserer forbindelsene D-6, D-l, D-3, 2-l/N-23/Arg, 2-l/N-21/Arg og 2-1/N-22/Arg som ble detektert i dyrkingsmediet ved human t-PA spesifikke antistoffer. Forbindelsene kan så gjenvinnes og renses ved immunoaffinitetskromatografi.

EKSEMPEL 5

Eksempel 4 kan gjentas ved bruk av cDNA som koder proteinene modifisert innen N-terminus og/eller ved R-275 med eller uten modifisering ved R<1>, R<2> og/eller R<3> for å produsere det ønskede protein i CHO-celler. Mutagenlserte cDNA<*>er kan fremstilles som beskrevet ovenfor. Således blir cDNA'er som koder forbindelsene 2-7/N-23/Arg, 2-7/N-21/Arg og

2-7/N-22/Arg fremstilt i pIVPA som beskrevet i eksempel 1. cDNA'ene kan så skjæres ut som et Bglll/Xmal-fragment og ligeres Inn i renset, Bgllll/Xmal-nedbrutt pWGSM, og den resulterende vektor transformeres og forsterkes i CHO-celler slik som i eksempel 4 for derved å fremstille forbindelsene

|2-7/N-23/Arg, 2-7/N-21/Arg og 2-7/N-22/Arg.

Claims

1. DNA-molekyl som koder et trombolytisk protein med vev-plasminogenaktivatortypeaktivitet, karakterisert ved en aminosyresekvens i det vesentlige den samme som peptidsekvensen i human t-PA, der: a) sekvensen fra og med Cys-6 til og med Ile-86 er utelatt, b) minst et av de konsensus-N-forbundne glykosylerlngsseter er modifisert til annet enn et konsensus-N-forbundet N-glykosyleringssete, og hvor eventuelt c) det er foretatt modifisering av enzymatisk spaltingssete Arg-275/Ile-276 ved at Arg er utelatt eller erstattet av en annen aminosyre.

2. DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det konsensus-N-forbundne glykosyleringsseteet ved Asn-117 er modifisert slik at Asn-117 er erstattet med Gln-117.

3. DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at de tre konsensus-N-forbundne glykosylerlngsseter ved aminosyreposisjonene 117-119, 184-186 og 448-450 er modifisert slik at Asn-117, Asn-184 og Asn-448 er erstattet med Gin.

4. DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at a) sekvensen fra og med Gly-(-3) til og med Thr-91 er utelatt og b) minst et av de konsensus-N-forbundne glykosylerlngsseter er modifisert til annet enn et konsensus-N-forbundet glykosyleringssete.