NO175153B - Polypeptider - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår nye polypeptider med en aminosyresekvens som angitt i krav l's karakteriserende del, og som omfatter minst en antigen og/eller immunogen determinant gruppe i HIV-2-virusets kappeprotein (env), DNA-sekvenser som koder disse polypeptidene som angitt i krav 5, rekombinante vektorer ifølge krav 6 som inneholder disse DNA-sekvensene, transformerte E-colistammer ifølge krav 7, samt anvendelse av slike DNA-sekvenser ved fremstilling av tilsvarende polypeptider ifølge krav 8. Oppfinnelsen angår videre anvendelse av slike polypeptider ved påvisning av HIV antistoffer ifølge krav 9, spesielt for påvisning av HIV-antistoffer (HIV-2 antistoffer eller HIV-1 og HIV-2 antistoffer) eller HIV-vira (HIV-2-vira eller HIV-1- og HIV-2-vira) i humant serum eller andre biologiske sekreter.

I 1986 ble det isolert et nytt virus med betegnelsen HIV-2 fra vestafrikanske AIDS-pasienter [Clavel et al.,Science 233.343-346 (1986); Clavel et al., Nature 324, 691-695

(1986)]. Dette virus ble på grunn av sin morfologi, sin lymfotropisme og sin cytofatiske in vitro virkning på T4-positive celler satt i forbindelse med det HIV-1 virus som forårsaker AIDS. Tross disse like egenskaper viser en genetisk sammenligning av HIV-1 og HIV-2 virus likevel bare en begrenset sekvenshomologi [Guyader et al., Nature 326. 662-669 (1987)].

Mer enn 20 forskjellige HIV-2 virus ble isolert fra vestafrikanske AIDS-pasienter og også fra européiske AIDS-pasienter [Guyader et al., supra; Brun-Vezinet et al., Lancet 1, 128-132 (1987)]. Serumet fra disse AIDS-pasientene var alle negativ i HIV-1 ELISA (Brun.Vezinet et al., supra). Derfor er behovet for nøyaktige og hurtige metoder av diagnose av HIV-2 virus i humant blod og andre sekret meget stort.

Ved å bruke rekombinante DNA-teknikker fremstiltes derfor nye polypeptider med en aminosyresekvens som overensstemmer med minst en antigen og/eller immunogen determinant gruppe i HIV-2 virusets kappeprotein (env). Disse polypeptider gjør det mulig å påvise HIV-2 antistoffer eller HIV-2 virus eller fragmenter av dem i humant serum eller andre biologiske sekret.

Nærmere bestemt angår oppfinnelsen polypeptider med aminosyresekvensen

eller deler eller funksjonelle ekvivalenter av derav, som overensstemmer med minst en antigen og/eller immunogen gruppe,i HIV-2 env(60) ppolypeptidet. Oppfinnelsen angår videre slike polypeptider, fragmenter og funksjonelle ekvivalenter som i tillegg er knyttet til et affinitetspeptid og et bærerpolypeptid. I tillegg beskrives de ovenfor definerte polypeptider som også er kovalent knyttet til et affinitetspeptid samt et polypeptid som har en aminosyresekvens som overensstemmer med minst en antigen og/eller immunogen determinant gruppe i HIV-1 kappeproteinet (env) og/eller HIV-1strukturproteinet (gag). Da slike fusjons-proteiner har antigene og/eller immunogene determinante grupper fra både HIV-1 og Hiv-2 virus, er disse fusjonspoly-peptider et effektivt diagnostisk verktøy til å påvise samtidig HIV-1 og HIV-2 antistoff eller HIV-1 og HIV-2 virus eller fragmenter av disse i. humant serum eller andre biologiske sekreter.

Polypeptider ifølge denne oppfinnelse er fortrinnsvis slike som har formelen

eller

Uttrykket "funksjonelle ekvivalenter" som blir brukt i sammenheng med polypeptidene i denne oppfinnelse, refererer til polypeptider som har aminosyresekvenser som er frem-kommet ved nukleotidsubstitusjon, nukleotid-delesjon, nukleotid-innsetting eller nukleotid-addisjon fra de ovennevnte aminbsyresekvensene og overensstemmer med minst en antigen og/eller immunogen gruppe i HIV-2 env-proteinet.

Visse substitusjoner i et polypeptids aminosyresekvens har ingen innflytelse på polypeptidets biologiske aktivitet. Eksempel på slike aminosyresubstitusjoner er Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Phe, Ala/Gly, Ala/The, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu og vice versa (jfr. Doolittle, i "The Proteins", ed. Neurath,H. and Hill, R.L., Academic Press, New York [1979].

Med et affinitetspeptid forstår man peptider som inneholder en aminosyresekvens som fortrinnsvis bindes på et affini-tetskromatografibæremateriale. Eksempel på slike affinitetspeptider er peptider som inneholder minst to histidinrester (se européisk patentsøknad, Publ. nr. 282 042). Slike affinitetspeptider bindes selektivt på nitriloeddiksyre-nikkel-chelatresiner [Hochuli og Dobeli, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 748 (1987); européisk patentsøknad, Publ. nr. 253 303]. Polypeptider som inneholder et slikt affinitetspeptid , kan derved skilles selektivt fra de øvrige polypeptidene. Affinitetspeptidet kan settes i forbindelse med enten C-terminusen/N-terminusen i polypeptider med en aminosyresekvens ifølge formel I eller fragmenter/funksjonelle ekvivalenter av disse.

Uttrykket "bærerpolypeptid" som blir brukt i sammenheng med polypeptider i denne oppfinnelse, refererer til slike polypeptider som selv ikke har antigene og/eller immunogene detentiinante grupper fra HIV-2 env-proteinet, men som likevel er nødvendige for å uttrykke polypeptider med en aminosyresekvens av formel I eller fragmenter eller funksjonelle ekvivalenter av disse. Som bærerprotein kommer fortrinnsvis E. coli kloramfenikol-acetyltransferase (CAT) og dihydrofolatreduktase (DHFR) fra mus på tale.

Polypeptidene i denne oppfinnelse kan pga., fremstil-lingsmåten inneholde methionin (kodet for av ATG) som første N-terminale aminosyre. På den annen side kan den mikrobielle vert forbruke translasjonsproduktet helt eller delvis, hvorved N-terminalt methionin avspaltes.

Polypeptidene i denne oppfinnelse kan også foreligge i form av multimere, f.eks. i form av dimere, trimere, tetramere etc. Naturligvis kan polypeptidene i denne oppfinnelse også være kovalent bundet med polypeptider med en aminosyresekvens som overensstemmer med minst en antigen og/eller immunogen determinant i HIV-2 strukturproteinet. Oppfinnelsen gir videre DNA-sekvenser som koder for oppfinnelsens polypeptider, rekombinante vektorer som inneholder disse DNA-sekvensene, og encellede organismer for fremstilling av oppfinnelsens polypeptider. Metodene for å uttrykke, isolere og renfremstille oppfinnelsens polypeptider blir beskrevet. Oppfinnelsens polypeptider kan anvendes i et antall viktige immunologiske prosesser.

Oppfinnelsens polypeptider kan anvendes som diagnostisk reagens for å påvise antistoffer mot HIV-2 virus eller samtidig påvise antistoffer mot HIV-1 og HIV-2 virus (i det følgende gitt fellesbetegnelsen antistoffer mot HIV-virus) i humant serum. Da de kan fremstilles i homogen form, kan problemer med uspesifikke reaksjoner som tidligere begrenset bruken av diagnostiske reagenser til først og fremst relativt rå virale HIV-proteinlysater, elimineres.

Anvendt som immunogener kan oppfinnelsens polypeptider brukes i dyr til produksjon av antistoffer som er rettet mot antigene determinante grupper i disse polypeptidene. Slike antistoffer kan i sin tur anvendes i forbindelse med oppfinnelsens polypeptider som ble passende merket, i et radioimmunassay (RIA) eller i et enzymimmunassay (ELISA) for å fastslå nærvær av HIV-2 virus eller HIV-1 og HIV-2 virus (i det følgende gitt fellesbetegnelsen HIV-virus) eller partikler av disse i humant serum eller i andre biologiske sekret, som f.eks. tårer, sæd, vaginalsekret og spytt. Partiklene (eller fragmentene) av HIV-virusene som kan påvises med denne metode, omfatter naturlige deler av det virale HIV-kappeprotein (env).

Oppfinnelsens polypeptider kan fremstilles ved hjelp av konvensjonelle peptidsyntesemetoder, i flytende eller fortrinnsvis i fast fase etter Merrifields metode (J. Am. Chem. Soc.85, 2149-2154 [1963]) eller ved hjelp av andre likeverdige metoder etter den teknikk som står til rådighet. På den annen side kan oppfinnelsens polypeptider også fremstilles ved hjelp av DNA-rekombinasjonsteknikk [Maniatis et al. i "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Eksempelvis kan DNA-sekvensene som koder for oppfinnelsens polypeptider, syntetiseres ved hjelp av konvensjonelle kjemiske metoder f.eks. ved hjelp av fosfotriestermetoden (Narang et al., i Meth. Enzymol. 68, 90-108 (1979)] eller ved hjelp av fosfodiestermetoden [Brown et al., Meth. Enzymol. 68, 109-151 (1979)]. Ved begge metodene blir vanligvis lengre oligonukleotider syntetisert, og disse henger sammen på angitte måte. DNA-fragmentenes nukleotidsekvenser kan være identiske med de nukleotidsekvensene som koder for de naturlige HIV-2 eller HIV-1 og HIV-2 polypeptider. Da den genetiske kode er degenerert, finnes det på den annen side mulighet for at forskjellige nukleotidsekvenser koder de samme polypeptider delvis eller fullstendig. I visse tilfelle kan det til nukleotidsekvensene fortrinnsvis velges slike kodoner som også foretrekkes av vertsorganismen som brukes for å uttrykke polypeptidet [Grosjean et al., Gene 18. 199-209 (1982)]. Da må man bare passe på at de DNA-sekvensene man får, ikke inneholder delsekvenser som vanskeliggjør fremstillingen av ekspresjonsvektorer, f.eks. ved at et uønsket restriksjonsenzymkuttsted innføres.

Videre kan DNA-sekvensene som koder for oppfinnelsens polypeptider, også fremstilles ved at man - fra isolert proviralt HIV-2 eller fra genomisk DNA fra celler som er blitt integrert i det provirale HIV-2 genom - isolerer et DNA-fragment som koder for den aktuelle aminosyresekvensen og deretter bygger det inn i en egnet vektor.

Etter at man har fremstilt DNA-sekvensene som koder for oppfinnelsens polypeptider, kan disse etter kjente metoder bygges inn i enhver egnet ekpresjonsvektor som gir de nødvendige ekspresjonssignaler. Egnede vektorer kan settes sammen av segmenter fra kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser, som f.eks. forskjellige kjente plasmider og fag-DNA. Herved henvises til den ovenfornevnte lærebok av Maniatis et al. Særlig egnede vektorer er plasmider fra pDS-familien [ Bujard et al., Methods in Enzymology,Hrgs. Wu og Grossmann, Academic Press, Inc., Vol 155, 416-433 (1987)]

Ved de fremstillingsmetoder som blir foretrukket i den foreliggende oppfinnelse, ble et syntetisk BamHl-fragment, som koder aminosyresekvensen med formel I (env(60)-gen), bundet med BamHl hhv. Bglll som spalter DNA fra plasmidet pRBSII.env(80)-gag(419)-6xHis, for å isolere ekspresjonsvektorene penv(60)-DHFR, pDHFR-env(60) og pRBSII-env(80)-gag-(419)-env(60)-6xHis, som koder syntesen av de spesielt foretrukne polypeptider med formlene II-IV. Syntesen av det syntetiske env(60). gen er beskrevet i eksempel 1. Dets nukleotidsekvens og den aminosyresekvens (ENV(60)) som er avledet derav, vises i figur 1. Konstruk-sjonen av plasmidene pDS78/RBSII,6xHis, penv(60)-DHFR, pDHFR-env(60),pRBSII-env(80)-gag(419)-6xHis og pRBSII-env(80)-gag(419)-env(60)-6xHis beskrives detaljert i eksemplene 2-4, 6 og 7.

Ekspresjonsvektorene som inneholder DNA-sekvensene som

operativt er bundet sammen med en ekspresjonkontrollsekvens og som koder for oppfinnelsens polypeptider, kan innføres i enhver egnet vertsorganisme på kjent måte. Da spiller f.eks. kompatibilitet med den valgte vektor, ekspresjonsproduktets toksisitet, ekspresjonskarakteristika, nødvendige biologiske sikkerhetshensyn og kostnader en rolle, og man må finne en middelvei mellom alle disse faktorer.

Som egnet vertsorganisme kommer gram-negative og gram-positive bakterier på tale, f.eks. E. coli- og B. subtilis-stammer. Særskilt foretrukne vertsorganismer i den foreliggende oppfinnelse er E. coli-stammen M15 (av Villarejo et al. i J. Bacteriol. 120. 466-474 [1974] beskrevet som OZ 291) og E. coli W3110 (ATCC nr. 27325). Foruten de ovennevnte E. coli-stammene kan man også bruke andre alminnelig tilgjengelige E. coli-stammer, f.eks. E. coli 294 (ATCC nr. 31446) og E. coli RR1 (ATCC nr. 31343).

Måten man lykkes med å uttrykke oppfinnelsens polypeptider på, er avhengig av hva man velger som ekspresjonsvektor/vertscellesystem. Vanligvis blir vertsorganismen som inneholder en ønsket ekspresjonsvektor, dyrket under betingelser som er optimale for vertsorganismens vekst. Mot slutten av den eksponensielle tilveksten, når økningen av celletall per tidsenhet antar, induseres ekspresjonen av det ønskede polypeptid, dvs. det DNA som koder det ønskede polypeptid blir transskribert, og det transkriberte mRNA blir translatert. Induksjonen kan oppnås ved å tilsette en induktor eller en derepressor til vekstmediet eller ved å endre en fysikalsk parameter, f.eks. temperaturendring. I de metoder som ble foretrukket i denne oppfinnelse, kontrolleres ekspresjonen med lac-repressoren. Ved å tilsette isopropyl-e-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) undertrykkes ikke lenger ekspresjonskontrollsekvensen og derved induseres syntesen av det ønskede polypeptid.

For å isolere små mengder av oppfinnelsens polypeptider for analytiske behov, f.eks. for polyakrylamidgelektroforeser, kan vertsorganismene oppsluttes ved hjelp av et detergens, f.eks. natriumdodecylsulfat (SDS). For å isolere store mengder av oppfinnelsens polypeptider, kan vertsorganismen oppsluttes ved hjelp av mekaniske [Charm et al. Meth. Enzymol. 22, 476-556 (1971)], enzymatiske (lysozymbe-handling) eller kjemiske (detergensbehandling, urinstoff-eller guanidiniumkloridbehandling) midler eller ved kombinasjon av disse midler.

Etterat oppfinnelsens polypeptider er løst ut av vertsorganismen, kan de rengjøres ved hjelp av kjente metoder, f.eks. ved sentrifugering ved forskjellige hastigheter, ved feining med ammoniumsulfat, ved dialyse (ved normaltrykk eller redusert trykk), ved preparativ isoelektrofokusering, ved preparativ gelelektroforese eller ved forskjellige kromatografiske metoder som gelfiltrasjon, høytrykksvæske-kromatografi (HPLC), ionebytterkromatografi, faseutbyt-terkromatografi eller affinitetskromatografi (f.eks. på Sepharose Blau C1-6B eller bærerbundne antistoffer som er rettet mot oppfinnelsens polypeptider). Det er imidlertid best å rengjøre oppfinnelsens polypeptider på nitrilotri-eddiksyre (NTA)-resin med den generelle formel bærermatriks-Spacer-NH-(ch2)x-<C>H(COOH-N-(CH2COO")2Ni<2+>, hvor x betyr 2,3eller 4. Som bærermatriks kommer slike materialer på tale som brukes i affinitets- og gelkromatografien, f.eks. forgrenede dekstraner, agarose (særlig de som går under varebetegnelsen Sepharose ®) eller polyakrylamid. Som spacer kommer de spacergruppene man kjenner fra affinitetskromato-grafien på tale, hvorved gruppene -0-CH2-CH(OH)-CH2- og - 0-CO- foretrekkes.

Et særlig gunstig NTA-resin for å rengjøre oppfinnelsens polypeptider har formelen

[Sepharose<R>CL 6B]-0-CH2-CH(OH)-CH2-NH-(CH2)4<C>H(COOH)--N(CH2COC~)2Ni<2+>.

Oppfinnelsens polypeptider som man får etter de ovenfor beskrevne metoder, kan som allerede nevnt, brukes som diagnostisk verktøy for å påvise antistoffer mot HIV-virus i humant blod. Oppfinnelsens polypeptider kan for dette formål brukes i tallrike kjente påvisningsmetoder.

Eksempelvis kan oppfinnelsens polypeptider merkes etter kjente metoder og disse merkede polypeptider kan blandes med en human serumprøve som man mistenker å inneholde antistoffer mot HIV-virus for å danne polypeptid/antistoffkomplek-ser. De dannede kompleksene kan da påvises etter kjente metoder. Oppfinnelsens polypeptider kan også kobles med en fast bærer og så bringes i kontakt med en human serumprøve, for å nevne et annet eksempel. Antistoffer mot HIV-virus i prøven bindes ved disse koblede polypeptider, og de komplekser som således dannes, kan - etterat man har fjernet ikke-bundet polypeptid og antistoffer ved vaskning - påvises med et reagens som f.eks. Staphylococcus aureus protein A (f.eks merket med<125>Jod) eller et annet anti-Ig-antistoff (f.eks. merket med en radioisotop eller pepperrotper-oksidase). Mange modifikasjoner og variasjoner av de ovennevnte påvisningsmetoder står til en spesialists rådighet, og noen foreslås i det følgende.

Ved å bruke antistoffer mot oppfinnelsens polypeptider (heretter benevnt anti-HIV-antistoff), kan det utvikles forskjellige diagnostiske tester for påvisning av HIV-virus eller fragmenter av disse i humant blod eller i andre biologiske sekret. Slike antistoffer kan fremstilles i et pattedyr eller en fugl ved injeksjon med en immunogen sammensetning som inneholder et av oppfinnelsens polypeptider og et fysiologisk forenlig bærermateriale. Den nødvendige mengde protein for denne injeksjon er kjent for en spesialist eller kan bestemmes etter kjente metoder. Uttrykket "bærermateriale" som settes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, refererer enten til kjente sammensetninger som er egnet for human bruk eller til kjente adjuvanter som brukes ved injeksjon i dyr. Egnede adjuvanter til bruk i mennesker og dyr er kjent for spesialisten [WHO Techn. Rep. Series 595. 1-40 (1976); Jollies et al., "Chemical and Biological Basis of Adjuvants", i Molecular Biochemistry and Biophysics Vol 13., 1-148 (1973) Springer Verlag Berlin]. Oppfinnelsens polypeptider kan også brukes etter at det er bygget inn liposomer eller andre mikrobærer-materialer, eller etter kobling til polysakkarider, andre polypeptider eller andre polymerer.

I et meget typisk eksempel injiserer man noen uker etter den første injeksjonen en eller flere tilleggsinjeksjoner, hvilket medfører et høyt innhold av anti-HIV-antistoffer. Disse kan da isoleres på kjent måte.

Naturligvis kan også monoklonale antistoffer brukes i de ovennevnte tester. Metodene for å fremstille slike antistoffer er kjent for spesialisten, Kohler et al., Nature 256, 495-497 (1975)].

De anti-HIV-antistoffene som kan fås etter de ovenfor beskrevne metoder, kan som allerede nevnt, anvendes i forskjellige diagnoastiske tester for å påvise HIV-vira eller fragmenter derav. Slike tester kan gjøres i form av radioimmunoassays enten i løsning eller på en fast bærer. Enzymimmunoassays kan også gjøres. Disse testene kan gjennomføres enten direkte eller ved hjelp av et annet antistoff som er rettet mot anti-HIV-antistoffene. Tallrike enzymaktiviteter kan være koblet til antistoffene, f.eks. peroksidase, glukoseoksidase, 3-galaktosidase og alkalisk fosfatase som viser farvning etter tilsetning av en substratløsning.

Prinsippet for mange av disse testene beror på at man lar menneskelig serum eller andre biologiske sekret som man mistenker å inneholde HIV-virus eller fragmenter derav, reagere med en kjent mengde anti-HIV-antistoff, slik at det oppstår antigen/antistoff-komplekser og så påviser disse på kjent måte.

Fagmannen vil også innse at det finnes mange andre påvisningsmetoder hvor anti-HIV-antiserum kan brukes, f.eks. forskjellige agglutinasjonstester. Herved påvises veksel-virkningen mellom antistoffer og HIV-virus eller fragmenter av dem ved hjelp av partikler som er overtrukket med anti-HIV-antistof f. Slike partikler er eksempelvis Latex-kuler, liposomer, erytrocytter, polyakrylamidkuler eller en hvilken som helst egnet polymer.

De ovenfor beskrevne metoder for å påvise HIV-virus eller antistoffer mot HIV-virus kan gjennomføres i egnede test-kits som består av en beholder som inneholder et av oppfinnelsens polypeptider eller anti-HIV-antistoff fra den foreliggende oppfinnelse.

De følgende figurer og påfølgende eksempler bidrar til å

bedre forstå denne oppfinnelse.

I figurene opptrer følgende forkortelser og symboler:

B, Bg, E, H, P, Sa, X og Xb betegner spaltningspunkter for restriksjonsenzymene BamHI, Bglll, AcoRI, Hindlll, Pstl, Sali, Xhol hhv. Xbal.

representerer promotorene for genene bla, lad og neo;

representerer de ribosomale bindingssteder for genene bla, eat, neo, og lad;

representerer terminatorene tg og Tl;

representerer det regulerbare promotor/operator element N250PSN250P29;

representerer det ribosomale bindingssted RBSII;

representerer det kodede område som er under kontroll i

av dette ribosomale bindingssted; representerer de områder som koder for de seks histidiner;

representerer det område som er nødvendig for replikasjonen (repl.)

representerer kodende områder for dihydrofolatreduktase (dhfr), kloramfenikolacetyltransferase, lac-repressor (lacl), e-lactamase (bla) og neomycinfosfotransferase (neo);

representerer det syntetiske env(60)-gen;

representerer HIV-I gag-genfragmenter. Fig. 1 Fremstilling av nukleotidsekvensen for det syntetiske HIV-2 env(60)-genet og den avledede aminosyresekvensen for HIV-2 ENV(60) polypeptidet. De individuelle oligonukleotidfragmentene, som det syntetiske HIV-2 env(60)-genet er sammensatt av, er kjennetegnet med tallene 1-14. Fig. 2 Skjematisk fremstilling av plasmidet pDS78/RBSII. Fig. 3 Nukleotidsekvens for pDS78/RBSII. I sekvensen er gjenkjennelsesstedene for restriksjonsenzymene som er oppført i fig. 2, overstreket, mens de områder som koder for 3-laktamase hhv. dihydrofolatreduktase er understreket.

Fig. 4 Skjematisk fremstilling av plasmidet pDMI,l

Fig. 5 Nukleotidsekvens for plasmidet pDMI,l. I sekvensen er gjenkjennesesstedene for restriksjonsenzymene som er oppført i fig.4, overstreket, mens områder som koder for neomycinfosfotransferase hhv. lac-repressor, er understreket. Fig.6 Skjematisk fremstilling av Xho/BamHI-fragmenter med det regulerbare promotor/operator-element N250PSN250-P29, det ribosomale bindingssted RBSII og området som koder for seks histidiner. Fig. 7 Skjematisk fremstilling av oppbygningen av plasmidet pDS78/RBSII,6xHis under anvendelse av plasmidet pDS78/RBSII og av XhoI/BamHI-fragmentet med det regulerbare promotor/operator-element N250PSN250P29, det ribosomale bindingssted RBSII samt regionen som koder for seks histidiner. Fig. 8 Skjematisk fremstilling av oppbygningen av plasmidet

penv(69)-DHFR.

Fig. 9 Skjematisk fremstilling av oppbygningen av plasmidet

pDHFR-env(80).

Fig.10 Reaktiviteten hos ENV(60)-DHFR og DHFR-ENV(60)

polypeptid med HIV-positive serumer.

Den øvre delen viser den elektroforetiske analyse av E. coli M15 lysater som inneholder plasmidene pDS78/RBSII,6xHis (spor a), penv(60)-DHFR (spor b) hhv. pDHFR-env(60) (spor c). Spor d inneholder rengjort HIV-1 ENV(80)-DHFR. Den undre del viser de tilsvarende immunoblots som ble utviklet med HIV-2 (venstre) hhv. HIV-1 (høyre) positivt serum. M-sporene inneholder på forhånd farvede molekylar-vektsstandarder hvis størrelse er angitt i kilo-dalton. Fig.11 Skjematisk fremstilling av plasmidet pDS56/RBSII. Fig.12 Nukleosidsekvens for plasmidet pDS56/RBSII. Spaltningsstedene som er oppført i fig. 11 for restrik-sjonsenzymer er overstreket mens området som kontrolleres av RBSII, er understreket. Fig.13 Skjematisk fremstilling av oppbygningen og isolerin-gen av BamHI/Xbal-fragmentet med området som koder for 6 histidiner, terminator t0, cat-genet og terminator Tl, som innsettes ved oppbygningen av plasmidet pRBSII-6xHis. Fig.14 Skjematisk fremstilling av plasmidet pRBSII-6xHis ved sammenknytning av BamHI/Xbal-fragmentet som vises i Fig.13 med plasmidets, pDS56/RBSII, Xbal/BamHI-fragment som inneholder replikasjonsområdet. Fig.15 Skjematisk fremstilling av HIV-1 BamHI/Bglll-

gag(419)-genfragmentet.

Fig.16 Fremstilling av nukleotidsekvensen for HIV-1 gag-genfragmentet som finnes i plasmidet pU-GAG.Fig.17Fremstilling av HIV-1 gag-genfragmentet som finnes i

plasmidet p2-3U/HindIII 10.

Fig.18 Skjematisk fremstilling av oppbygningen av plasmidet

pRBSII-gag(419)-6xHis.

Fig.19 Skjematisk fremstilling av en oppbygning av plasmidet

pRBSII-env(80)-gag(419)-6xHis.

Fig.20 Skjematisk fremstilling av oppbygningen av plasmidet pRBSII-env(80)-gag-(419)-env(60)-6xHis.

Eksempel 1

Fremstilling av syntetisk env( 60)- aen

A) Prinsipp

Det syntetiske HIV-2 env(60)-genet ble sammensatt av 14 oligonukleotidfragmenter hvis lengde varierte mellom 17 og 31 nukleotider (se fig.l).

B) Syntese av oliqonukleotidfragmentene

Oligonukleotidfragmentene 1-14 ble fremstilt samtidig på fast bærermateriale etter metoden som er beskrevet av Bannwarth og Iaisa i DNA 5, 413-419 (1986).

C) Sammensetning av oliqonukleotidfracrmentene

100 pmol av oligofragmentene 2, 3, 8, 9, 10 hhv. 4, 5, 6, 7, 11, 13 ble fosforylert i 15 minutter ved 37°C i 100 pl kinasebuffer [Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold

Spring Harbor Laboratory (1982)] som inneholder 100 enheter polynukleotidkinase og 100 pCi -y-<3>2P-ATP (5000 Ci/mmol) . Deretter ble det tilsatt et 10-foldig overskudd av kaldt ATP til reaksjonsblandingen. Etter en ny inkubasjonstid på 90 minutter ble polynukleotidkinasen varmedeaktivert (2 min, 95°C), og de fosforylerte oligonukleotidfragmentene ble felt i løpet av 30 min ved -78°C etter tilsetning av 10 pl 5M litiumacetat (LiOAc) og 100 pl isopropanol. De utfelte oligonukleotidfragmentene 2, 3, 8, 9, 10 og det ikke-fosforylerte fragment 1 hhv. de fosforylerte oligonukleotidfragmentene 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13 og det ikke-fosforylerte fragment 14 ble hybridisert etter kjente litteraturmetoder [Maniatis et al., supra] og deretter ligert i 100 pl ligasebuffer [Maniatis et al., supra] som inneholdt 31 enheter T4-ligase (37°C, 1,5 timer). Deretter ble subfragmentene som man fikk, felt som beskrevet ovenfor og så vasket med etanol og tørket. Subfragmentene ble så adskilt ved hjelp av 6% polyakrylamidgelelektroforese, eluert etter standardmetoder [Maniatis et al., supra], avsaltet ved hjelp av en Sephadex G-50 søyle og så knyttet sammen med hverandre til det ønskede HIV-2 env(60)-genet ved hjelp av T4-ligase som beskrevet ovenfor. Etter rengjøring av HIV-2 env(60)-genet ved hjelp av de ovenfor beskrevne metoder (polyakrylamidgelelektroforese, eluering og avsaltning), ble det fosforylert som beskrevet ovenfor.

Eksempel 2

Oppbygning av plasmidet pDS78/ 6xHis

A. Beskrivelse av plasmidene pDS78/ RBSII og pDMI. l

For å bygge opp plasmidet pDS78/RBSII,6xHis anvendte man plasmidet pDS78/RBSII. Transformerte E.coli-celler med dette plasmidet og også plasmidet pDMI,l ble deponert i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Gottingen i henhold til Budapest-traktaten [E.coli M15 (pDS78/RBSII,pDMI,1), DSM-nr:4232], den 3. september 1987.

Andelen av pDS78/RBSII (fig. 2 og 3) som ligger mellom restriksjonskuttstedene for Xbal og Xhol og inneholder replikasjonsområdet og genet for B-laktamase som gir cellene ampicillinresistens, stammer opprinnelig fra plasmidet pBR322 [Bolivar et al., Gene 2, 95-113 (1977); Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43_, 77-90 (1979)]. Derimot er genet for 3-laktamase modifisert slik at spaltningsstedene for restriksjonsenzymene HincII og Pstl er eliminert. Disse forandringene i DNA-sekvensen virker ikke inn på3-laktamasens aminosyresekvens. Den gjenværende del av plasmidet inneholder det regulerbare promotor/operator-element N250PSN250P29 og det ribosomale bindingssted RBSII. Dette ribosomale bindingssted ble avledet det ribosomale bindingssted for promotor Pq25^ra E.coli-fagen T5 [R. Gentz, avhandling, Universitåt Heidelberg, BRD (19849] og fremstilt som EcoRI/BamHI-fragment med DNA-syntese. Så følger genet fra dihydrofolatreduktase fra muse-cellelinje AT-3000 [Chang et al., Nature 275. 617-624 (1978); Master et al., Gene21, 59-63 (1983)] som ble avgjørende forandret slik at det ble innført et spaltningssted for restriksjonsenzymet Bglll direkte foran terminasjonskodonet for translasjonen.

Videre inneholder plasmidet pDS78/RBSII terminatoren t0fra E.coli-faget lambda [Schwarz et al., Nature 272. 410-414

(1978)], det promotorfrie genet fra kloramfenikolacetyltransferase [Marcoli et al., FEBS Letters, 110. 11-14

(1980)] og terminatoren Tl fra E.coli rrnB-operon [Brosius et al., J. Mol. Biol., 148, 107-127 (1981)].

pDS78/RBSII inneholder det regulerbare promotor/operator-element N250PSN250P29 samt det ribosomale bindingsstedRBSII. På grunn av disse ekspresjonssignalenes høye effektivitet kan plasmidet pDS78/RBSII,6xHis bare forbli stabilt i E.coli-cellene når promotor/operator-elementet blir undertrykket ved at det bindes en lac-repressor på operatoren, lac-repressoren er kodet i lacl-genet. N250PSN-250P29kan bare undertrykkes varig når det finnes et tilstrekkelig antall represjonsmolkyler i cellene. Derfor

ble det benyttet lacl^-allel som inneholder en promotor-mutant som medfører en forhøyet ekspresjon av repressor-genet. Dette lacl^-allelet finnes i plasmidet pDMI,l (fig. 4 og 5) . Dette plasmidet har i tillegg til lad-genet også neo-genet som gir bakteriene kanamycinresistens, hvilket brukes som seleksjonsmarkør. pDMI,l er kompatibelt med de ovennevnte plasmidene. E.coli-celler som blir transformert med slike ekspresjonsvektorer, må inneholde pDMI,l for å være forvisset om at ekspresjonsvektoren blir holdt stabil i cellene. En induksjon av dette systemet kan man oppnå ved å tilsette IPTG til mediet ved den ønskede cellemengde.

Plasmidet pDMI,l (fig. 4 og 5) bærer neomycinfosfotransfer-asens neo-gen fra transposonet Tn5 [Beck et al., Gene 19., 327-336 (1982)] som gir E.coli-celler kanamycinresistens, og lac I-genet [Farabough, Nature 274, 765-769 (1978)] med promotormutasjonen Iq [Calos, Nature 274, 762-765, (1978)] som koder for lac-repressoren. Dessuten inneholder plasmidet pDMI,l et område av plasmidet pACYC184 [Chang et al., J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)] som inneholder alle informasjoner som er nødvendige for replikasjonen og den stabile gjengivelse i dattercellene.

B. Oppbygning av plasmidet pDS78/ RBSII. 6xHis

For å bygge opp plasmidet pDS78/RBSII,6xHis (fig. 6 og 7) ble EcoRI/BamHI-fragmentet fra pDS78/RBSII forlenget med et område som koder for seks histidiner ved hjelp av det ribosomale bindingsstedet RBSII.

Til dette ble deretter to komplementære oligonukleotoder, hvis nukleotidsekvens er fremstilt som dobbeltkjedet DNA-sekvens i fig.6, syntetisert som tidligere beskrevet (eks. 1, Avsnitt B). De frysetørkede oligonukleotidene ble opptatt i vann og oppløst 1 time ved 4°C. DNA-konsentrasjonen var lOOnmol/ml. For å fosforylere ble 150 pmol av hver av oligonukleotidene inkubert i 20 pl 50 mM Tris/HCl [pH 8,5] og lOmM MgCL2med 2 pmol >/-[<32>P]-ATP (5000 Ci/mmol) og 1 enhet (E) polynukleotidkinase i 20 minutter ved 37°C. Deretter tilsattes 5 nmol ATP og etter ytterligere 2 0 minutter ved 37°C ble reaksjonene avsluttet ved oppvarming til 65°C.

DNA fra plasmidet pDS78/RBSII ble bearbeidet for å ligere med de to fosforylerte oligonukleotidene idet 2 pmol av plasmid- DNA først ble spaltet med restriksjonsenzymet BamHI.Prøven ble ekstrahert med fenol, behandlet med eter og DNA utfelt med litiumacetat/isopropanol som tidligere beskrevet. Sedimentet ble tørket og oppløst i 2Opi TE-buffer. For å ligere med de fosforylerte oligonukleotidene ble så 1,5 pmol plasmid DNA som var kuttet med BamHI, inkubert med 60 pmol av hver av de fosforylerte oligonukleotidene i 2 enheter T4-DNA-ligase i 2 timer ved 15°C. Etter inkubasjon ved 65°C i 5 minutter ble det ligerte DNA spaltet med restriksjonsenzymene Xhol og BamHI. Deretter ble XhoI/BamHI-fragmentet med regulerbare promotor N250PSN250P29, det ribosomale bindingssted RBSII samt området som koder for 6 histidiner, isolert ved hjelp av agarose-gelelekroforese.

For oppbygning av plasmidet pDS78/RBSII,6xHis ble det omtalte XhoI/BamHI-fragmentet integrert i plasmidet

pDS78/RBSII, hvorved det opprinnelige XhoI/BamHI-fragmentet i dette plasmidet ble erstattet (fig. 7). I tillegg ble så 1 pmol DNA av plasmidet pDS78/RBSII spaltet med restriksjonsenzymene Xhol og BamHI før det større DNA-fragment ble isolert med agarose-gelelektroforese. 0.05 pmol av dette fragment ble deretter inkubert i 2 timer ved 15°C med 0,1 pmol av det isolerte XhoI/BamHI-fragment i ligeringsbuffer med 2 enheter T4-DNA ligase. E.coli-M15-cellene som inneholdt plasmidet pDMI,l ble fremstilt for transformering etter Morrisons metode [Methods Enzymol. 68., 326-331

(1979)]. Ligeringsblandingen ble etter 7 minutters oppvarming på 65°C tilsatt 200pl kompetente celler. Blandingen ble holdt 30 minutter i is, så inkubert ved 42°C og etter tilsetning av 0,5 ml LB-medium inkubert 90 minutter ved 37°C. Cellene ble deretter utsådd på LB-agarskåler som inneholdt lOOpg/ml ampicillin og 25 pl/ml kanamycin, og holdt 12 timer i en rysteinkubator. Deretter ble cellene sedimentert og plasmid-DNAet isolert etter Birnboim og Dolys metode [Nucleic Acids Res.7, 1515-1523 (1979)].

0.2 pg av hver av de isolerte plasmidene ble spaltet med restriksjonsenzymene Xhol og BamHI for å påvise om et fragment som inneholder det regulerbare operator/repressor-element N250PSN250P29, det ribosomale bindingssted RBSII samt det området som koder for de seks histidiner, finnes i disse plasmidene. Plasmider med et slikt fragment fikk betegnelsen pDS78/RBSII,6xHis (fig. 7).

For å påvise at pDS78/RBSII,6xHis har den riktige sekvens, ble det dobbeltkjedede sirkulære plasmid-DNA sekvensert, hvorved det ble benyttet en startersekvens (primer) som var merket med"Y-[3<2>P]-ATP. Denne startersekvens inneholder nukleotidene fra posisjon 89-108 i plasmidet pDS78/RBSII. 0.3 pmol av det isolerte plasmid-DNA ble felt med alkohol, sedimentet vasket en gang med 80% etanol, tørket og til slutt oppløst i 8pl 1/4 TE-buffer. Prøven ble inkubert i 5 minutter ved 95°C, avkjølt til 0°C og sentrifugert (Eppen-dorf-Tischsentrifuge, i 2 minutter, 12 000 upm). 1,5 pmol av startersekvensen i et volum av 2pl ble tilsatt før prøven ble inkubert i 5 minutter ved 42°C. Så ble DNAet sekvensert etter Sanger et al's metode [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-6567 (1977)]. Ettersom det ble brukt en "primer" som var radioaktivt merket, ble alle reaksjonene utført med umerkede deoksynukleotidtrifosfater. DNA-sekvensanalysen viste at pDS78/RBSII,6xHis inneholdt den sekvens som angis i fig. 6.

Eksempel 3

Oppbygning av plasmidet penv( 69)- DHFR

A) Prinsipp

For å konstruere plasmidet penv(69)-DHFR ble plasmidet pDS78/RBSII,6xHis som var linearisert med restriksjonsenzymet BamHI, koblet til det syntetiserte HIV-2env(60)-genet (fig. 8).

B) Fremstilling av<p>lasmidet pDS78/ RBSII, 6xHis ( f racrment 1) polarisert med BamHI4pmol av plasmidet pDS78/RBSII ble spaltet med restriksjonsenzymet BamHI. Deretter ble DNAet behandlet med CIP[calf intestestinal phosphatase]. Enzymene ble så varmeak-tivert og etter tilsetning av prøvebuffer ble DNAet utskilt i en1% lavtsmeltende agarose-gel. Det tilsvarende DNA-bånd ble kuttet etter farving med etidiumbromid i UV-lys (3 00 nm) og DNAet ekstrahert etter standardmetode [Maniatis et al., supra].

C) Fremstilling av HIV- 2 env( 60)- genet ( fragment 2)

Fremstillingen av dette genet er beskrevet i eksempel 1.

D) Sammensetning av plasmidet penv( 60)- DHFR

0,05 pmol av fra<g>mentet 1 og 0,1 pmol av fragmentet 2 ble inkubert med 1E T4-ligase (15°C, 2h) . Etter varmeaktivering av enzymet ble DNAet transformert i E. coli-stammen M15 som inneholdt plasmidet pDMI,l. Cellene ble utsådd på LB-agarskåler som inneholdt 100 pg/ml ampicillin og 25 pg/ml kanamycin. Skålene ble inkubert i 15 timer ved 37°C. Ligeringen gav ca 500 kolonier. Enkelte kolonier ble overført i 10 ml LB-medium, fikk stå over natten, og til slutt ble plasmid-DNAet isolert etter standardmetoder [Maniatis et al., supra].

E) Sekvensanalyse av HIV- 2 env( 60)- genet som er integrert i plasmidet pDS78/ RBSII, 6xHis

For å påvise at det er den riktige HIV-2 env(60)-gensekvens i riktig orientering som finnes i BamHI-setet i plasmidet pDS78/RBSII,6xHis, ble det dobbeltkjedede sirkulære plasmid-Dna sekvensert, hvorved en startersekvens (primer) merket med["Y-<32>P]-ATP ble benyttet.

0,3 pmol av det isolerte plasmid-DNA ble felt med alkohol, sedimentet vasket en gang med 80% alkohol, tørket og til slutt oppløst i 8 pl 1/4 TE-buffer. Etter tilsetning av 2 pmol av den radioaktivt merkede startersekvensen ble prøven inkubert i 2 minutter ved 95°C og i 5 minutter ved 42°C. Deretter ble prøven sekvensert etter Sanger et al's metode [Proe. Nati. Acad. Sei USA 74.5463-6567 (1977)]. Sekvensanalysen viste at den korrekte HIV-2 env(60)-gensekvensen var blitt integrert i BamHI restriksjonsstedet i plasmidet pDS78/RBSII,6xHis.

Eksempel 4

Oppbygning av plasmidet pDHFR- env( 60)

A) Prinsipp

For å konstruere plasmidet pDHFR-env(60) ble plasmidet pDS78/RBSII,6xHis som var linearisert med restriksjonsenzymet Bglll, koblet med det syntetisk fremstilte HIV-2 env(60)-genet fig. 9).

B) Fremstilling av Bglll- linearisert plasmid PDS78/ RBSII.-6xHis ( fragment 1)

4 pmol av plasmidet pDS78/RBSII,6xHis ble spaltet med restriksjonsenzymet Bglll. Deretter ble DNAet behandlet med CIP [calf intestinal phosphatase]. Enzymene ble varme-aktivert og etter tilsetning av prøvebuffer ble DNAet utskilt i en 1% lavtsmeSsande agarosegel. Det tilsvarende DNA-bånd ble skåret ut etter farving med etiumbromid under UV-lys (300nm) og DNAet ekstrahert etter standardmetode

[Maniatis et al., supra].

C) Fremstilling av plasmidet pDHFR- envf60)

Fremstillingen av dette genet er beskrevet i eksempel 1.

D) Oppbygning av plasmidet pDHFR- env( 60)

0,05 pmol av fra<g>mentet 1 og 0,1 pmol av fragmentet 2 ble inkubert med 1E T4-ligase (15°C, 2h). Etter varmeaktivering av enzymet ble DNAet transformert i E. coli-stammen M15 som inneholdt plasmidet pDMI,l. Cellene ble utsådd på LB-agarskåler som inneholdt 100 pg/ml ampicillin og 25 jjg/ml kanamycin. Skålene ble inkubert i 15 timer ved 37°C. Ligeringen gav ca 500 kolonier. Enkelte kolonier ble overført i 10 ml LB-medium, fikk stå over natten, og til slutt ble plasmid-DNAet isolert etter standardmetoder [Maniatis et al., supra].

E) Sekvensanalyse av HIV- 2 env( 60 )- genet som er integrert i plasmidet PDS78/ RBSII. 6xHis

For å påvise at det er den riktige HIV-2 env(60)-gensekvens i riktig orientering som finnes i Bglll-setet i plasmidet pDS78/RBSII,6xHis, ble det dobbeltkjedede sirkulære plasmid-DNA sekvensert, hvorved en startersekvens (primer) merket med[*Y-<32>P]-ATP ble benyttet.

0,3pmol av det isolerte plasmid-DNA ble felt med alkohol, sedimentet, vasket en gang med 80% alkohol, tørket og til slutt oppløst i 8 pl 1/4 TE-buffer. Etter tilsetning av 2 pmol av den radioaktivt merkede startersekvensen, ble prøven inkubert i 2 minutter ved 95°C og i 5 minutter ved 42°C. Deretter ble prøven sekvensert etter Sanger et al<1>s metode [Proe. Nati. Acad. Sei USA 74, 5463-6567 (1977)]. Sekvensanalysen viste at den korrekte HIV-2 env(60)-gensekvensen var blitt integrert i Bglll-restriksjonsstedet i plasmidetPDS78/RBSII,6xHis.

Eksempel 5

Reaktivitet av ENV( 601- DHFR oa DHFR- ENV( 60) polypeptid med HIV- positive sera

A. Prinsipp

For å påvise at env(60)-genet koder en determinant gruppe som gjenkjennes av antistoffer i sera fra HIV-2-smittede personer, ble polypeptidene ENV(60)-DHFR og DHFR-ENV(60) uttrykt i E.coli, deretter overført på nitrocellulosefilter og inkubert med egnede sera. HIV-1 ENV(80)-DHFR polypeptid [Certa et al., EMBO J. 5, 3051-3056 (1986) tjente som kontroll.

B. Ekspresjon av ENV( 60)- DDHFR og DHFR- ENV( 60)- polypeptider i E. coli

E.coli M15-celler som inneholder plasmidet pDMI,l, ble transformert med plasmidet penv(60)-DHFR hhv. pDHFR-env(60) og fikk vokse i LB-medium [Maniatis et al., supra] som inneholdt 100 pg/ml ampicillin og 2 0 pg/ml kanamycin. Ved en optisk tetthet av OD60o=0'7 ble kulturene indusert med IPTG (2 mM sluttkonsentrasjon) og fikk vokse i ytterligere 4 timer. Deretter ble cellene utvunnet ved hjelp av sentri-fuger ing.

C. Analyse av E. coli- eksprimerte ENV( 60)- DHFR og DHFR-ENV ( 60) - polypeptider 50 pl av cellekulturene ble resuspendert i 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 som inneholdt 3% SDS, 3% e-mercaptoetanol og 20% glyserin. Prøvene ble kokt i 5 minutter og til slutt utskilt ved hjelp av 12,5% polyakrylamidgelelektroforese [U.K. Laemmli, Nature 227. 680-685 (1970)]. Proteinbåndene ble synliggjort ved hjelp av Coomassie-blå-farving (fig. 10, øverste del).

D. Reaktivitet hos ENV( 60)- DHFR oa DHFR- ENVf60))- polypeptider med HIV- antistoffer

Prøver av de induserte cellekulturene (se avsnitt B), et E. coli kontroll-lysat og rengjort HIV-1 ENV(80)-DHFR-polypeptid (1 pg pr. spor) ble utskilt elektroforetisk (2 geler) som beskrevet i avsnitt C. Hver av de ufarvede gelene ble dekket med en nitrocellulosemembran. De belagte gelene ble så dekket med 2 blad filterpapir og overført i et overførings-kammer. Dette ble fylt med overføringsbuffer (25 mM Tris, pH 8,3 med 192 mM glycin og 20% metanol), og overføringen av polypeptidene ble gjort under 12 timer ved4°C og lOOmA strømstyrke. Deretter ble nitrocellulosemembranene først inkubert i 4 timer ved værelsestemperatur i PBS [Maniatis et al., supra] inneholdende 5% tørket magermelk. Så ble den ene cellulosemenbranen inkubert i 4 timer ved værelsestemperatur i PBS som inneholdt 5% tørket magermelk og 1:1000 fortynnet HIV-l-positivt serum og den andre membranen i PBS som inneholdt 5% tørket magermelk og 1:1000 fortynnet HIV-2-positivt serum. Deretter ble nitrocellulosemembranene først vasket 3x med PBS som inneholdt 0,3% Tween-20 og så inkubert i 1 time ved værelsestemperatur iPBS som inneholdt 0,3% Tween-20, 5% gjeteserum og 1:2000 fortynnet gjete-anti-human- IgG-peroksidase-konjugat (Nordic). Etter tre vaskinger med PBS ble proteinbåndene på nitrocellulosemembranene som hadde reagert med antistoffene, synliggjort ved hjelp av inkubering i 25 ml PBS som inneholdt 5 pg 4-klor-l-naftol og 5pl 30% hydrogenperoksyd. Reaksjonen ble.stoppet ved å tilsette

PBS.

Som man kan se av fig. 10, gjenkjennes ENV(60)-DHFR- og DHFR-ENV(60)-polypeptidene bare av antistoff i blod fra HIV-2-infiserte pasienter. På den annen side gjenkjennes ENV(80)-DHFR-pplypeptidet bare av antistoffer i blod fra HIV-1 infiserte pasienter.

Eksempel 6

Oppbygning av plasmidet pRBSII- 6xHis

A. Beskrivelse av plasmidet pDS56/ RBSII

For å konstruere plasmidet pRBSII-6xHis ble plasmidet pDS56/RBSII anvendt. Transformerte E.coli-celler med dette plasmidet og også med plasmidet pDMI,l ble deponert 23. desember 1987 i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Braunschweig ifølge overenskomsten i Budapest [E.coli M15 (pDS56/BSII;pDMI,1), DSM-Nr.:4330].

Andelen av pDS56/RBSII (Fig. 11 og 12) som ligger mellom spaltningsstedene for restriksjonsenzymene Xbal og Xhol og inneholder replikasjonsområdet samt genet for P-laktamase som gir cellene ampicillinresistens, stammer opprinnelig fra plasmidet pRB322 (Bolivar et al., supra, Sutcliffe, supra). Men genet for p<->laktamase er modifisert slik at spaltningsstedene for restriksjonsenzymene HincII og Pstl er eliminert. Denne forandringen i DNA-sekvensen har ingen virkning på aminosyresekvensen i B-laktamasen. Den gjenværende del av plasmidet inneholder det regulerbare promotor/operator-element N250PSN250P29 fulgt av ribosombindingssted RBSII som er en del av et EcoRI/BamHI-fragment. Så følger terminatoren t0fra E.coli-faget lambda (Schwarz et al., supra), det promotorfrie genet kloramfenikolacetyltransferase (Marcoli et al., supra) og terminator TI fra E.coli rrnB-operon.

(Brosius et al., supra).

På grunn av den høye effekt av ekspresjonssignalene N250PSH250P29 og RBSII kan plasmidet pDS56/RBSII og dets derivater som plasmidet pRBSII-6xHis bare holdes stabilt i E.coli-celler når promotor/operator-elementet er reprimert ved at en lac-repressor er bundet til operatoren (se eksempel 2, avsnitt A).

b: Oppbygning av plasmidet pRBSII- 6xHis

(1) 2 pmol av plasmidet pDS56/RBSII ble spaltet med restriksjonsenzymet Hindlll. Etter opparbeidning av prøven ble det tilsatt til det kuttede plasmidet 50pmol av en fosforylert adaptor (som koder for 6 histidiner), og prøven ble inkubert med T4-DNA-ligase som beskrevet.Etter opparbeidning av ligeringstilsetningen ble DNAet kuttet med restriksjonsenzymene BamHI og Xbal, og BamHi/Xbal-fragmentet ble isolert med området som koder for 6 histidiner, terminatoren tg, cat-genet og terminatoren Tl ved hjelp av agarose-gelelektroforese (fig. 13). (2)2pmol av plasmidet pDS56/RBSII ble spaltet med restriksjonsenzymene Xbal og BamHI, og Xbal/BamHI-fragmentet ble isolert med replikasjonsområdet, bla-genet, promotoren N250PSN250P29 og ribosombindingsstedet RBSII ved hjelp av agarose-gelelektroforese (fig.14). (3) 0,1 pmol av hver av de isolerte fragmentene ble ligert som beskrevet (eksempel2) og deretter transformert i E.coli-stammen M15 (pDMI,l). Etter utsåing og inkubering (eksempel 2.B) fikk enkelte kolonier vokse i 10 ml medium som

beskrevet, og plasmidene ble isolert etter Birnboim og Dolys metode (supra). En restriksjonsanalyse med enzymene BamHI og Xbal viste at plasmidene inneholdt de 2 ønskede fragmentene. Disse plasmidene fikk betegnelsen pBSII-6xHis (fig.14).

Eksempel 7

Oppbygning av plasmidet pRBSII- env( 80)- gag f 419)- env( 60)-6xHis

A) Prinsipp

For å konstruere plasmidet pRBSII-env(80)-gag(419)-env(60)-6xHis ble HIV-2 genet env(60) samt HIV-l-genene env(80) og gag(60) knyttet sammen med ekspresjonsvektoren pRBSII-6xHis. B) Fremstilling av plasmidet pRBSII- 6xHis som er kuttet

med restriksjonsenzymene BamHI og Bglll

2 pmol av plasmidet pRBSII-6xHis ble spaltet med 10 enheter av hver de to restriksjonsenhetene BamHI og Bglll. Etter tilsetning av prøvebuffer ble DNAet utskilt på et 1% agarosegel. Båndet som tilsvarte plasmid-DNAet ble skåret ut etter farving med etiumbromid under UV-lys 300 nm) og rengjort ved elektroeluering (Maniatis et al., supra). Endene av det rengjorte fragmentet ble så defosforylert med fosfatase. Deretter ble DNAet ekstrahert med fenol:kloroform (1:1), felt med etanol og løst i 1/4 TE-buffer.

C) Fremstilling av HIV- 1 gag( 419)- genet

2 pmol av plasmidet pU-GAG som inneholder et Sstl/Bglll-fragment av HIV-1 gag-genet (hvis nukleotidsekvens er vist i figur 16), ble fordøyet med 12 enheter av restriksjonsenzymet Xmnl. Deretter ble DNAet ekstrahert med fenolkloro-form (1:1) og felt med 2 volumdeler etanol ved -2<C>C. DNA-pelleten ble oppløst i 50 pl 50mM Tris-HCl, pH 7,6 inneholdende lOmM MgCl2, lOmM DTT, 0,5mM ATP, lOOpmol fosforylert loer BamHI-venstre (5'-CCGGATCCGG-3•). Etter tilsetning av en enhet T4-DNA-ligase ble det inkubert over natten ved 65°C og volumet justert til 100 pl med restrik-sjonsenzym-buffer. 100 enheter BamHI og 10 enheter Hindlll ble tilsatt og blandingen deretter inkubert i 3 timer ved 37°C. Deretter ble DNAet ekstrahert med fenol og kloroform og felt med etanol. DNA-pelleten ble løst i prøvebuffer og utskilt på et 6% polyakrylamidgel. Etter farving med etiumbromid ble det skåret ut et bånd med 250 basepar og dette ble isolert ved elektroeluering. 2 pmol av plasmidet p2-3U/HindIII10 som inneholder et fragment av HIV-1 gag-genet (hvis sekvens er vist i fig. 17), ble fordøyet med 11 enheter Bglll i en time ved 37°C, oppvarmet til 65°C, avkjølt til værelsestemperatur og inkubert i 45 minutter med Klenow-fragmentet fra E.coli DNA-polymerase. Deretter ble DNAet ekstrahert med fenol:kloroform (1:1), felt med etanol, opptatt i 50 pl 50 mM Tris-HCl, pH7,6 inneholdende 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 pmol fosforylert 12-mer Bglll-linker (5<1->GGAAGATCTTCC-3<1>) og 1 enhet T4 DNA-ligase og inkubert over natten ved 14°C. Reaksjonsblandingen ble så oppvarmet til 65°C og volumet justert til 100 pl med restriksjonsenzymbuffer. 100 enheter Bglll ble tilsatt og deretter ble det inkubert i 3 timer ved 37'C. Etter tilsetning av NaCl (50 mM sluttkonsentrasjon) ble det tilsatt 10 enheter Hindlll og deretter inkubert 1 time ved 37°C. Etter ekstrahering med fenol:kloroform (1:1) ble DNAet felt med etanol og så påført en 1% agarosegel. Et fragment med 1020 basepar ble skåret ut og isolert med elektroeluering og rengjort. 1 pmol av BamHI-Hindlll-fragmentet og 1 pmol av Hindlll-BglII-fragmentet ble koblet sammen med hverandre med 1 enhet T4-DNA-ligase. Etter varmeaktivering av ligasen ble de ligerte fragmentene spaltet med BamHI og Bglll og påført en 1% agarosegel. Det fragmentet som tilsvarer HIV-1 gag(419)-genet, ble isolert ved elektroeluering og rengjort (fig. 15) .

D) Fremstilling av HIV- 1 env( 80)- genet

Fremstillingen av HIV-1 env(80)-genet ble fremstilt som beskrevet av Certa et al._ [EMBOJ.5, 3051-3056 (19869].

E) Fremstilling av HIV- 2 env( 60)- genet

Fremstillingen av HIV-2 env(60)-genet er beskrevet i eksempel 1.

F) Oppbygning av<p>lasmidet pRBSII- gag( 419)- 6xHis

For å bygge opp plasmidet pRBSII-gag(419)-6xHis ble 0,1 pmol av vektoren pRBSII-6xHis som var linearisert med BamHI og

Bglll (se B) koblet med 1 enhet T4-DNA-ligase ved inkubasjon over natten ved 14"C. Etter varmeinaktivering av enzymet ble DNAet transformert i E.coli-stammen W3110 som inneholdt plasmidet pSMI,l. Cellene ble utsådd på LB-agarskåler som inneholdt 100 pg/ml ampicillin og 25>jg/ml kanamycin. Skålene ble inkubert over natten ved 37°C. Enkelte kolonier fikk vokse over natten ved 37"C og deretter ble plasmid-DNAet isolert etter standardmetoder [Maniatis et al., supra](fig. 18).

G) Oppbygning av plasmidet pRBSII- env( 80)- gag( 419)- 6sHis

For å bygge opp plasmidet pRBSII-env(80)-gag(419)-6sHis ble 0,1 pmol av plasmidet pRBSII-gag(419)-6xHis spaltet med BamHI og behandlet med CIP. DNAet ble ekstrahert med fenol: kloroform (1:1) og felt med 2 volumenheter etanol. Plasmid-DNAet pRBSII-gag(419)-6xHis som var linearisert med BamHI, ble inkubert over natten ved 14"C med 0,3 pmol av HIV-1 env(80)-genet og 1 enhet T4-DNA-ligase. Etter varmeaktivering av enzymet ble DNAet transformert i E.coli-stammen W3110 som inneholdt plasmidet pDMI,l. Cellene ble utsådd på LB-agar-skåler som inneholdt 100 pg/ml ampicillin og 25 pg/ml kanamycin. Skålene ble inkubert over natten ved 37°C. Enkelte kolonier fikk vokse over natten ved 37°C og deretter ble plasmid-DNAet isolert etter standardmetoder [Maniatis et al., supra] (fig. 19).

H) Oppbygning av plasmidet pRBSII- env( 80)- gag( 419)- envf60)-6xHis

For å bygge opp plasmidet pRBSII-env(80)-gag(419)-env(60)-6xHis ble 0,1 pmol av plasmidet pRBSII-env(80)-gag(419)-6sHis spaltet med Bglll og behandlet med CIP. Deretter ble DNAet ekstrahert med fenol: kloroform (1:1) og felt med 2 volumenheter etanol. Plasmid-DNAet pRBSII-env(80)-gag(419)-6xHis som var linearisert med Bglll, ble inkubert over natten ved 14°C med 0,3 pmol av HIV-2 env(60)-genet og 1 enhet T4-DNA-ligase. Etter varmeaktivering av enzymet ble DNAet transformert i E.coli-stammen W3110 som inneholdt plasmidet pDMI,l. Cellene ble utsådd på LB-agar-skåler som inneholdt 100 pg/ml ampicillin og 25 pg/ml kanamycin. Skålene ble inkubert over natten ved 37°C. Enkelte kolonier fikk vokse over natten ved 37°C og deretter ble plasmid-DNAet isolert etter standardmetoder [Maniatis et al., supra]

(fig. 20).

Eksempel 8

Reaktiviteten hos ENV780)- GAG( 419)- ENV( 60)- polvpeptidet med HIV- positive sera

A) Prinsipp

For å påvise at ENV(80)-GAG(419)-ENV(60)-polypeptidet reagerer med sera fra HIV-1- og HIV-2-smittede personer ble ENV(80)-GAG(419)-ENV(60)-polypeptidet eksprimert i E.coli, deretter rengjort og testet med egnede sera i enzymimmuno-assay (EIA).

Ekspresjon av ENV( 80)- GAG( 419)- ENV( 60)- polvpeptidet i E. coli

E.coli W3110-celler som inneholdt plasmidet pDMI,l, ble

transformert med plasmidet pRBSII-env(80)-gag-(419)-env(60)-6xHis og fikk vokse i LB-medium [Maniatis et al., supra] som inneholdt 100 pg/ml ampicillin og 25 pg/ml kanamycin. Ved en optisk tetthet av OD600=1,0 Dle kulturen indusert med IPTG

(2 mM sluttkonsentrasjon) og fikk vokse i ytterlig 2 timer. Så ble cellene høstet ved hjelp av sentrifugering. C) Rengjøring av det E. coli- uttrykte ENVf80)- GAGf419)-ENV( 60 )- polvpeptidet

De høstede cellene ble resuspendert i PBS-buffer (0,2 g/l KC1, 8,0 g/l NaCl, 0,2 g/l KH2P04, 1,144 g/l Na2HP04, pH 7,0) og lysert ved hjelp av en høytrykkshomogenisator. Cellehomogenisatet som man da fikk, ble sentrifugert , og pelleten ble ekstrahert med 0,1M natriumfosfatbuffer, pH 8,0

inneholdende 6M guanidin*HCl.

Uløst material ble fjernet ved sentrifugering og hvis nødvendig filtrering. Den klare løsningen ble satt på en NTA-søyle (hvis struktur og fremstilling er beskrevet i den européiske paténtmeldingen, publikasjonsnr. 253 303). Søylen ble deretter først vasket med 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 8,0 inneholdende 6M guanidin*HCl og så med 0,1M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, inneholdende 8M urinstoff. Elueringen av ENV(80)-GAG(419)-ENV(60)-polypeptidet ble gjort med natriumfosfatbuffer, pH 4,0 inneholdende 8M urinstoff.

ENV(80)-GAG(419)-ENV(60)-eluatet som man fikk ved hjelp av NTA-søylen, ble deretter kromatografert to ganger på en Sephacryl S-200-søyle (Pharmacia, løpebuffer: 50mM Tris-HCl, pH 7,0, inneholdende 5mM EDTA og 1% hhv. 0,1% SDS). Ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese og aminosyreana-lyse kunne man påvise en renhet på 89% i det oppnådde ENV(80)-GAG(419)-ENV(60)-polypept idet.

D. Reaktivitet hos det rencriorte ENV f 80) - GAG ( 419) -

ENV( 60)- polypeptidet med HIV- positive sera.

Det rengjorte ENV(80)-GAG(419)-ENV(60)-polypeptid ble - som beskrevet i den européiske patentmelding, publikasjonsnr. 270 114 - bundet på polysterolkuler og testet på sin reaktivitet med HIV-1- og HIV-2-positive sera i enzym-immunoassay (EIA). EIA-verdiene som man fikk med det rengjorte ENV(80)-GAG(419)-ENV(60)-polypeptid og det rengjorte DHFR-ENV(60)-polypeptid (positiv HIV-2-kontroll), gav følgende bilde:

Som man kan se, blir alle positive HIV-1- og HIV-2-sera gjenkjent av ENV(80)-GAG(419)-ENV(60)-polypeptidet.

Claims (9)

1. Polypeptid, karakterisert vedat det har aminosyresekvensen

eller funksjonelle ekvivalenter derav, hvilken sekvens overenstemmer med minst én antigen og/eller immunogen gruppe i HIV-2-env(60)-polypeptidet.

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert vedat det er kovalent koblet med et affinitetspeptid og et bærerpeptid eller kovalent koblet med et affinitetspeptid og et polypeptid hvis aminosyresekvens overensstemmer med minst én antigen og/eller immunogen determinant gruppe i HIV-l-kappeproteinet (env) og/eller i HIV-l-strukturproteinet (gag).

3. Polypeptid ifølge krav 2, karakterisert veden av de følgende formler:

eller med følgende formel:

4. Polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-3,karakterisert vedat polypeptidet omfatter en i og for seg kjent og påviselig markør til bruk ved påvisning av antistoffer i sera.

5. DNA-sekvens, som koder for et polypeptid ifølge et av kravene 1-4, karakterisert vedat DNA-sekvensen omfatter nukleotidsekvensen

eller funksjonelle ekvivalenter av disse nukleotidsekvensene.

6. Ekspresjonsvektor egnet for fremstilling av et polypeptid ifølge et av kravene 1-4, omfattende en ekspresjonskontroll-sekvens som kan replikere i E. coli,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en dertil operativt bundet DNA-sekvens ifølge krav 5 og spesielt en ekspresjonsvektor som plasmidet penv(60)- DHFR, pDHFR-env(60) eller pRBSII-env(80)-gag(419)- env(60)-6xHis.

7. E.coli-stamme, spesielt en E.coli M15-stamme,karakterisert vedat den er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 6.

8. Anvendelse av DNA-sekvens ifølge krav 5 ved fremstilling av polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 - 3 ved transformering av en bakterie med en ekspresjonsvektor ifølge krav 6 samt dyrking av bakterien under egnede vekstbe-tingelser og isolering og eventuelt rensing av det ønskede polypeptid.

9. Anvendelsen av polypeptid ifølge et av kravene 1-4 for å påvise HIV-antistoffer i humane sera eller andre biologiske sekreter.